JP2010536921A - 加熱処理による第vii因子ポリペプチド組成物中の二量体含有量の低減 - Google Patents
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Abstract
Description
第VII因子ポリペプチドを商業的に製造する間、関心あるポリペプチドの二量体及びオリゴマー等の凝集体の形成を回避することは、難しい課題である。このような生成物に関連した不純物は、それらの潜在的抗原性の故に、所望されないものである。典型的には、生成中の凝集体/二量体の形成を制御するために、極度のpH及び高温が回避される。
特に、本発明は、第VII因子ポリペプチドを含有する組成物における、二量体の含有量を低減する方法を提供するものであって、該方法は、
(a)必要に応じて、(5℃で測定して)4.5−10.0の範囲の値に、組成物のpHを調節し;
(b)少なくとも5分の期間、20−50℃の範囲の温度まで組成物を加熱し;
(c)続いて、高くとも10℃の温度まで、組成物を冷却する;
工程を含む。
(a)必要に応じて、(5℃で測定して)4.5-10.0の範囲の値に、組成物のpHを調節し;
(b)少なくとも5分の期間、20−50℃の範囲の温度まで組成物を加熱し;
(c)続いて、高くとも10℃の温度まで、組成物を冷却する;
工程を含む。
緩衝剤の濃度は、組成物が好ましいpHを維持できるように選択される。種々の実施態様において、緩衝剤の濃度は、1-100mM;1-50mM;1-25mM;又は2-20mMである。
pH値が参照される場合、約5℃で測定された値が適用される。
一実施態様において、少なくとも一の浸透圧調節剤は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、及びマグネシウム塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、カルシウムラエブラート(laevulate)、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、及びマグネシウムラエブラートからなる群から選択される中性塩である。
好ましい一実施態様において、浸透圧調節剤には、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、塩化マグネシウム、及び酢酸マグネシウムからなる群から選択される少なくとも一と組合せて、塩化ナトリウムを含有する。
他の好ましい実施態様において、浸透圧調節剤は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、スクロース、グルコース、及びマンニトールからなる群から選択される少なくとも一である。
一連の実施態様において、浸透圧調節剤は、5−2200mM、例えば25−2200mM、50−2200mM、100−2200mM、200−2200mM、400−2200mM、600−2200mM、800−2200mM、1000−2200mM、1200−2200mM、1400−2200mM、1600−2200mM、1800−2200mM、又は2000−2200mM;5−1800mM、25−1800mM、50−1800mM、100−1800mM、200−1800mM、400−1800mM、600−1800mM、800−1800mM、1000−1800mM、1200−1800mM、1400−1800mM、1600−1800mM;5−1500mM、25−1400mM、50−1500mM、100−1500mM、200−1500mM、400−1500mM、600−1500mM、800−1500mM、1000−1500mM、1200−1500mM;5−1200mM、25−1200mM、50−1200mM、100−1200mM、200−1200mM、400−1200mM、600−1200mM、又は800−1200mMの濃度で存在している。
ここで使用される場合「第VII因子ポリペプチド」又は「FVIIポリペプチド」なる用語は、野生型ヒト第VIIa因子(すなわち、米国特許第4,784,950号に開示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド)のアミノ酸配列1-406を含有する任意のタンパク質、その変異体、並びに第VII因子関連ポリペプチド、第VII因子誘導体、及び第VII因子コンジュゲートを意味する。これには、第VII因子変異体、第VII因子誘導体、及び第VII因子コンジュゲートで、野生型ヒト第VIIa因子に対して、実質的に同等又は改善された生物活性を示すものが含まれる。
ここで使用される場合、「野生型ヒトFVIIa」とは、米国特許第4,784,950号に開示されているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
「システイン-ペグ化されたヒト第VIIa因子」なる用語は、ヒト第VIIa因子に導入されたシステインのスルフヒドリル基にコンジュゲートしたPEG分子を有する第VIIa因子を意味する。
II、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、S52A-第VII因子、S60A-第VII因子;R152E-第VII因子、S344A-第VII因子、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、K143N/N145T/R315N/V317T-FVII;及び233Thrから240Asnのアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するFVII;304Argから329Cysのアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するFVII;153Ileから223Argのアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するFVIIが含まれる。
本発明の目的について、第VII因子ポリペプチドの生物活性は、例えばここに記載されるアッセイ4等、血液凝固を促進させる調製物の能力を測定するアッセイにより定量化されてよい。このアッセイにおいて、生物活性は対照サンプルに対する凝固時間の低減度合いとして表され、1単位/mLの第VII因子活性を有するプールされたヒト血清標準体と比較することにより、「第VII因子単位」に転換される。また、第VIIa因子の生物活性は、(i)第X因子、及び脂質膜に包埋したTFを含む系において、活性化した第X因子(第xa因子)を生成する、第VIIa因子又は第VII因子関連ポリペプチドの能力を測定し(Perssonら, J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997);(ii)水系における第X因子の加水分解度を測定し(「インビトロタンパク質分解アッセイ」、以下のアッセイ2を参照);(iii)表面プラズモン共鳴をベースにした装置を使用し、TFに対する第VIIa因子又は第VII関連ポリペプチドの物理的結合度を測定し(Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997);(iv)第VIIa因子及び/又は第VII関連ポリペプチドによる合成基質の加水分解度を測定し(「インビトロ加水分解アッセイ」、以下のアッセイ1を参照);又は(v)インビトロ系における、TF-非依存性での、トロンビン生成度を測定する(以下のアッセイ3を参照)ことにより定量化されてよい。
最初の必須ではない工程(a)において、必要に応じて、組成物のpHを、4.5-10.0の範囲に値に調節する。上述したように、このことは、一又は複数の緩衝剤を添加することにより典型的には達成される。既に特定の範囲のpHを有している組成物は−もちろん−pHに関して調節する必要はないが、例えば任意の後続する活性化及び形成工程に関し、pHを調節することが所望されるかもしれない。
また、組成物のpHを調節する工程には、組成物の希釈又は濃縮(例えば、溶媒の蒸発)も含まれてよい。
工程(a)中、組成物は、好ましくは最大で10℃、特に最大で5℃、さらには0℃近傍の温度で保持される。
加熱処理は、組成物の二量体含有量を低減させる方法において極めて重要な工程である。
加熱温度は、二量体含有量の低減を生じさせるために、少なくとも20℃、少なくとも適当な時間枠の範囲内、例えば72時間内とすべきことが見出されている。他方、50℃以上の加熱温度では、第VII因子ポリペプチドの変性(よって、不活性化)の危険性が引き起こされると考えられている。
所望の温度までの加熱は、温度制御槽、例えば油浴又は水浴、もしくはオーブンに、組成物を収容する容器を配することにより達成可能である。所望の温度に達するまでに必要な時間は、容器対周囲媒体の熱伝達係数に依存するであろう。多くの場合、所望の温度に可能な限り素早く達すること、又は少なくとも20℃の温度、もしくはセットポイントの約5℃下の温度に、可能な限り素早く達することが所望されている。
加熱処理に所望される温度及び必要な時間は、例えば以下の実施態様2に記載されているような、モデル実施例で決定することができる。加熱処理の最小必要時間は、典型的には約5分、例えば10分であるが、原則上、最大時間は、数日又は多くの日数、例えば168時間であってよい。実施理由により、処理時間は、10分〜72時間が好ましい。
30−45℃での加熱処理にとって好ましい時間は、典型的には10−600分であると言われている。20−30℃での加熱処理にとって好ましい時間は、典型的には5−72時間、35−50℃での加熱処理にとって好ましい時間は、典型的には10−300分である。現在、最も好ましい実施態様において、加熱処理は、約37℃で10−120分でなされる。
本発明の方法を最適化すると、一定温度を必ずしも含まない加熱処理に至るかも知れないが、20−50℃の全体的な温度範囲内で、温度の徐々の又は段階的な増加、及び/又は温度の徐々の段階的な減少を利用することが有利となるかも知れないことが理解されなければならない。
二量体含有量は、5%以下のレベル、特に4%以下のレベル、好ましくは3%以下のレベル、又は2%以下のレベル、さらに好ましくは1.5%以下のレベルまで低減可能であると予想される。
続いて、組成物は、最大で10℃、特に最大で5℃の温度まで冷却される。例えば氷浴(約0℃)で冷却、又は組成物に氷を添加することにより、極めて急速に冷却することが有利である。また上述したように、流通式反応器において、冷却を実施してもよい。急速冷却により、二量体が再形成される条件(例えば5-15℃の温度)が長時間存在することが回避できるようになる。
冷却後、組成物はさらなるプロセス工程を受けてもよい。このようなプロセス工程は、好ましくは、二量体の任意の有意な再形成の原因とならないように考慮される。好ましい実施態様において、第VII因子ポリペプチドは、工程(b)に続く工程で活性化され、すなわち、第VII因子ポリペプチドは、組成物の冷却の前後で活性化されると言われている。加熱中に活性化を制御することは困難であるため、第VII因子ポリペプチドは、加熱プロセスの後の工程で活性化されることが好ましい。
特に好ましい一実施態様において、本発明は、第VII因子変異体を含有する組成物における二量体含有量を低減させる方法に関し、該方法は:
(a)必要に応じて、5.0-6.5の範囲の値に、組成物のpHを調節し;
(b)20-600分の範囲の期間、30-45℃の範囲の温度まで組成物を加熱し;
(c)続いて、最大5℃の温度まで、組成物を冷却する;
工程を含む。
特に好ましい第2の実施態様において、本発明は、第VII因子変異体を含有する組成物における二量体含有量を低減させる方法に関し、該方法は:
(a)必要に応じて、9.0-10.0の範囲の値に、組成物のpHを調節し;
(b)20-600分の範囲の期間、30-45℃の範囲の温度まで組成物を加熱し;
(c)続いて、最大5℃の温度まで、組成物を冷却する;
工程を含む。
本発明の方法に適用される精製されたヒト第VII因子は、好ましくは、例えばHagenら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83: 2412-2416, 1986に記載されたような、又は欧州特許第0200421号(ZymoGenetics, Inc.)に記載されたような、DNA組換え技術により作製される。
ついで、得られた活性化第VII因子は、以下に記載するように処方され、投与されてよい。
以下の実施例は本発明の実施を例証するものである。これらの実施例は、例証することのみを目的としており、請求される本発明の範囲を何ら制限するものではない。
二量体含有量の測定−HMWP GPC法
非解離条件下で、FVIIaサンプルを分析するために、SE-HPLC、サイズ排除クロマトグラフィー法を使用した。HMWP(高分子量タンパク質)、すなわち二量体形態のFVIIa凝集体、オリゴマー及びポリマーの含有量を、単量体標的生成物のピークに対する領域%として測定した。
使用されるカラムを、ウォーターズ(Waters)タンパク質パックSW(7.5*300mmで、13.25mLのカラム容量に相当)、又は同様の仕様を有するカラムとした。一般的な分析条件を以下の通りにした:
温度:RT(21-25℃);検出:215nmでのカラム流出のUV検出;流速:2.25CV/時間に相当する0.5ml/分。
次の組成:0.2Mの硫酸アンモニウム、5%のイソプロパノールを含有する操作用バッファー、pH7.0に調節、を使用して、分析を実施した。
カラムの平衡化の後、0.5CVの操作用バッファーを使用し、約1mgのFVIIa/mlを含有するFVIIaサンプルを解凍し、25マイクロリットル(カラム容量に対して0.2%のサンプル容量に相当)のサンプル容量を注入することにより、濃縮分析した。
ついで、サンプルを1.5CV溶出させた。
クロマトグラムは、典型的には、図3に例証されているように、2つの大きなピークと、2つの小さなピークからなる。左から見て、2つの小さなピークが、HMWP(ポリマーと二量体/オリゴマーのピーク)を表すと観察される。最初の大きなピークがFVIIaの単量体を表し、第2の大きなピークが塩のピークを表す。
15mMのCaCl2、30mMのNaCl、10mMのヒスチジン、pH6.0(5℃)中に1.5mg/mLのFVIIa変異体溶液を、700mLのHDPEボトルにおいて、0.22ミクロンのフィルターを通して濾過した。1MのHCl又は1MのNaOHを使用し、pHを5.8(5℃)に調節した。ボトルを37℃の温度の水浴に配した。HDPEボトルの温度を37℃まで上昇させるのに、約20分かかった。溶液が37℃に達して45分後、ボトルを氷に配することにより、反応を停止させた。
最初の二量体含有量はGPCにより7.3%と測定され、加熱処理後には2.8%まで低減した。よって、二量体含有量は2倍以上低減するため、37℃で45分の加熱処理で十分であることが明らかとなった。
全体で120分実施した、同様の実験についての、二量体含有量の低減度合いの変化を、図1に例証する。サンプルを頻繁に収集することにより、実験をモニターし;サンプルを−80℃まで急速冷凍し;続いて分析した(以下参照)。
15mMのCaCl2、30mMのNaCl、10mMのヒスチジン、pH6.0(5℃)中に1.5mg/mLのFVIIa変異体溶液を、700mLのHDPEボトルにおいて、0.22ミクロンのフィルターを通して濾過した。1MのHCl又は1MのNaOHを使用し、pHを5.8(5℃)に調節した。ボトルを5-8℃の温度の水浴に配した。60分後、ボトルを氷に配することにより、反応を停止させた。
最初の二量体含有量は7.7%であった−処理後は7.9%であった。
本質的に、実施例1(pH5.7)に記載されたような、37℃での加熱処理実験を、全体で48時間実施し、23℃での同様の実験を、全体で48時間実施した。双方の実験をサンプルを頻繁に収集することによりモニターし;サンプルを−80℃まで急速冷凍し;続いて分析した(以下参照)。2つの異なる温度を使用する、二量体含有量の低減度合いの変化を、図2に例証する。37℃では、二量体含有量の急速な低下が観察されたが、23℃のサンプルでの二量体含有量の低減度合いはゆっくりであり、48時間後でも、二量体含有量は、その可能な最小値に達することができなかった。この種の実験は、他の第VII因子ポリペプチド及び他の選択された温度についての最適条件(加熱処理に十分な時間)を決定するのに使用することができる。
比較すると、サンプル(比較例1と同様;pH5.7)を、5-8℃で、全体で48時間放置した。この例においては、二量体含有量の僅かな増加が観察された(図2を参照;上部曲線)
本質的に、実施例1に記載されたような加熱処理実験を、全体で168時間実施した;しかしながら、最初のpH調節は、pH5.8からpH9.5に高めた。サンプルを頻繁に収集することにより、実験をモニターし;サンプルを−80℃まで急速冷凍し;続いて分析した。高pHでの二量体含有量の低減度合いの変化を、図4に例証する。pH9.5では、二量体含有量の同様の急速な低下が観察され、その後、ゆっくりとした二量体形成がなされた。
Claims (8)
- 第VII因子ポリペプチドを含有する組成物中における二量体の含有量を低減する方法であって、
(a)必要に応じて、該組成物のpHを(5℃で測定して)5.0−10.0の範囲の値に調節し;
(b)少なくとも5分の期間、20−50℃の範囲の温度まで組成物を加熱し;
(c)続いて、組成物を高くとも10℃の温度まで冷却する
工程を含む方法。 - 工程(b)における温度が30−45℃の範囲であり、工程(b)における加熱期間が10−600分の範囲にある請求項1に記載の方法。
- 工程(a)において、pHが5.0−6.5の値に調節される請求項1又は2に記載の方法。
- 第VII因子ポリペプチドが第VII因子変異体である請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物がカルシウム塩を含有している請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 第VII因子ポリペプチドの全プールに対する%-ポイントとして表される前記組成物中の二量体レベルが、少なくとも2倍、低減している請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 第VII因子ポリペプチドが、工程(b)に続く工程で活性化される請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 陰イオン交換クロマトグラフィー工程が工程(a)に先行する請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
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