KR20100051640A - 광학 조영제 - Google Patents

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KR20100051640A
KR20100051640A KR1020107002106A KR20107002106A KR20100051640A KR 20100051640 A KR20100051640 A KR 20100051640A KR 1020107002106 A KR1020107002106 A KR 1020107002106A KR 20107002106 A KR20107002106 A KR 20107002106A KR 20100051640 A KR20100051640 A KR 20100051640A
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로버트 제임스 도메트 네언
앤드류 존 힐리
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지이 헬쓰케어 리미티드
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Abstract

본 발명은 펩티드와 같은 생물학적 표적 잔기와 벤조피릴륨 염료의 접합체를 포함하는, 생체내 광학 영상화에 적합한 조영제에 관한 것이다. 또한, 제약 조성물 및 키트 뿐만 아니라 생체내 영상화 방법이 개시되어 있다.

Description

광학 조영제{OPTICAL IMAGING AGENTS}
본 발명은, 벤조피릴륨 염료와 펩티드와 같은 생물학적 표적 잔기와의 접합체를 포함하는, 생체내 광학 영상화에 적합한 조영제에 관한 것이다. 또한, 제약 조성물 및 키트뿐만 아니라 생체내 영상화 방법이 개시되어 있다.
US 6750346은 하기 화학식 A, B 또는 C의 레이저-상용가능한 근적외선(NIR) 마커 염료를 개시하고 있다.
<화학식 A>
Figure pct00001
<화학식 B>
Figure pct00002
<화학식 C>
Figure pct00003
상기 식에서,
n은 1, 2 또는 3이고;
R1 내지 R14은 동일하거나 상이하고, H, Cl, Br, 및 C 및 H에 추가로 치환된 기로서 4개 이하의 산소 원자 및 0, 1 또는 2개의 질소 원자 또는 황 원자 또는 황 및 질소 원자를 함유할 수도 있는 12개 이하의 탄소 원자의 지방족 또는 단핵 방향족 기로부터 선택되거나, 또는 H 또는 8개 이하의 탄소 원자를 가진 하나 이상의 치환기가 결합되어진 질소 원자를 갖는 아미노 작용기를 나타내며, 상기 치환기는 C, H 및 2개 이하의 술폰산 기로 구성된 군에서 선택된다.
US 6750346의 염료는 바람직하게는 R1 내지 R14의 적어도 하나가 가용화 또는 이온화가능한 기를 함유하도록 선택된다. 이러한 기는 시클로덱스트린, 당, SO3 -, PO3 2-, CO2 - 또는 NR3 +을 포함하는 것으로 언급된다. US 6750346은 염료 뿐만 아니라 그로부터 유래된 계 (접합체)가 세포 성질의 진단을 위한 광학적, 특히 형광 광학적 정성 및 정량 결정 방법, 바이오센서 (치료 지점 측정), 게놈의 탐구, 및 소형화 기술에서 사용될 수 있음을 교시하고 있다. 전형적인 응용은 세포분석, 세포 분류, 형광 상관 분광법(FCS), 초-대용량 스크리닝(UHTS), 다색 형광 동일반응계 하이브리드형성(FISH) 및 마이크로어레이 (유전자 및 단백질 칩)의 분야이다.
US 6924372는 화학식 D 또는 E의 비대칭 폴리메틴 염료를 개시하고 있다:
<화학식 D>
Figure pct00004
<화학식 E>
Figure pct00005
상기 식에서,
n은 0, 1, 2 또는 3이고;
R1 내지 R9은 동일하거나 상이하고, H, 알킬-, tert-알킬, 아릴-, 카르복시아릴-, 디카르복시아릴, 헤테로아릴-, 시클로알킬-, 헤테로시클로알킬-, 알킬옥시-, 알킬머캡토 ("알킬" 및 "시클로알킬"은 또한 올레핀 연결 잔기를 포함한다), 아릴옥시-, 아릴머캡토-, 헤테로아릴옥시-, 헤테로아릴머캡토-, 히드록시-, 니트로- 또는 시아노 잔기일 수 있고, R1 및 R2, R2 및 R3, R3 및 R4, R5 및 R7은 하나 이상의 지방족, 헤테로지방족 또는 방향족 고리를 형성할 수 있다.
US 6924372의 R1 내지 R9 치환기의 적어도 하나는 임의로 가용화 또는 이온화 치환기 (예를 들어, SO3 -, PO3 2 -, CO2H, OH, NR3 +, 시클로덱스트린 또는 당)일 수도 있거나, 또는 임의로 염료를 다른 분자에 공유 결합시킬 수 있는 반응성 기 (예를 들어, 이소티오시아네이트, 히드라진, 활성 에스테르, 말레이미드 또는 요오드아세트아미드)일 수도 있다. 화학식 D 및 E의 염료는 세포 특징을 진단하거나 바이오센서, 전형적으로 세포분석 및 세포 분류에서 유용한 것으로 언급된다.
문헌 [Lisy et al., J.Biomed.Optics, 11(6) 064014 (2006)]은 근적외선 광학 영상화 및 표지화된 단핵구 또는 대식세포를 사용하여 복막염을 진단하는 방법을 개시하고 있다. 단핵구-대식세포는 염료 DY-676 (디오믹스 GmbH)에 의해 시험관내 표지화될 수 있다. 복막염 동물 모델에서 염료 DY-676 자체를 생체내 투여하면 복막염 부위에서 형광성의 증가가 유도된다. 상기 저자는 단핵구-대식세포 표지화가 생체내에서 발생한 것으로 결론내렸다.
문헌 [Lisy et al., Invest.Radiol., 42(4) 235-241 (2007)]은 형광 마그네토솜으로 표지화된 나노입자를 포함하는 이정점 (MRI 및 광학) 조영제를 개시하고 있다. 포식작용 과정에 의해 대식세포를 표지화하기 위하여 형광 마그네토솜 나노입자가 사용되었다. 마그네토솜을 표지화하기 위해 사용된 염료는 DY-676이다.
디오믹스 GmbH 웹사이트 (www.dyomics.com)는 "관절에서 DY-676의 축적에 의한 래트에서의 관절염 가시화 (Visualisation of Arthritis in a Rat by Accumulation of DY-676 in Joints)"를 명칭으로 하는 I.Hilger (FSU Jena)의 영상 코티시(image courtesy)를 포함한다. 추가의 세부사항은 주어져 있지 않다.
WO 2007/139815는 기원 세포와 연관된 영상화 및 치료 방법을 개시하고 있다. 하기 나타낸 화학식의 접합체가 개시되어있다:
Figure pct00006
상기 식에서,
AB는 CD133+ Flk1+ 내피 기원 세포에 결합하는 비타민 또는 유사체를 포함하고; X는 정량화가능한 마커이다.
정량화가능한 마커는 예를 들어 방사능 프로브 또는 형광 프로브일 수 있다. 적합한 형광 프로브는 플루오레세인, 로다민, 텍사스 레드, 피코에리트린, 오레곤 그린, 알렉사 플루오르 488..., Cy3, Cy5, Cy7 등인 것으로 언급된다. WO 2007/139815의 실시예 30은 5량체 펩티드 링커 (Asp-Arg-Asp-Asp-Cys)를 통하여 엽산에 접합된 단일 벤조피릴륨 염료 (딜라이트(DyLight)TM 680)를 개시하고 있다.
본 발명은, 생물학적 표적 잔기(BTM)에 접합된 특정한 부류의 벤조피릴륨 염료를 포함하는, 생체내 광학 영상화에 적합한 조영제를 제공한다. 본 발명자들은 이러한 공유-결합된 BTM 접합체의 일부로서 생체내 광학 영상화 응용을 위해 적합한 술폰화 벤조피릴륨 염료를 확인하였다.
본 발명의 벤조피릴륨 염료(BzpM)는 이것을 생체내 광학 영상화 응용을 위해 유용하게 만드는 성질들의 조합을 갖고 있다:
(i) 생물학적 표적화 분자(BTM)에 대한 접합 가능성;
(ii) 수용성;
(iii) 전자기 스펙트럼의 적, 적외 또는 근적외선 부위에서의 흡수 및 방출;
(iv) 높은 흡광 계수;
(v) 낮은 혈장 단백질 결합;
(vi) 높은 광안정성 및 휘도;
(vii) 혈액에서 염료 및 염료-BTM 접합체의 높은 안정성;
(viii) 생체내에서 혈액으로부터의 빠른 제거율;
(ix) 잠재적으로 위험한 대사물질의 결여 (메테오르/데렉(Meteor/Derek) 분석에 의함).
첫 번째 측면에서, 본 발명은 생체친화성 담체와 함께 포유동물 신체의 생체내 광학 영상화에 적합한 조영제를 포함하고 포유동물 투여에 적합한 형태의 제약 조성물을 제공하며, 여기에서 상기 조영제는 하기 화학식 I의 접합체를 포함한다.
<화학식 I>
Figure pct00007
상기 식에서,
BTM은 생물학적 표적 잔기이고;
n은 0 또는 1의 정수이고;
L은 화학식 -(A)m-의 합성 링커 기이고, 여기에서 m은 1 내지 20의 정수이고 각각의 A는 독립적으로 -CR2-, -CR=CR-, -C≡C-, -CR2CO2-, -CO2CR2-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO2NR-, -NRSO2-, -CR2OCR2-, -CR2SCR2-, -CR2NRCR2-, C4 -8 시클로헤테로알킬렌 기, C4 -8 시클로알킬렌 기, C5 -12 아릴렌 기, 또는 C3 -12 헤테로아릴렌 기, 아미노산, 당 또는 단분산 폴리에틸렌글리콜(PEG) 구성 블록이고; 여기에서 각각의 R은 독립적으로 H, C1-4 알킬, C2-4 알케닐, C2-4 알키닐, C1-4 알콕시알킬 또는 C1-4 히드록시알킬로부터 선택되고;
BzpM는 하기 화학식 II의 벤조피릴륨 염료이며
<화학식 II>
Figure pct00008
;
여기서, Y1는 하기 화학식 Ya 또는 Yb의 기이고
<화학식 Ya>
Figure pct00009
<화학식 Yb>
Figure pct00010
;
R1 내지 R4 및 R9 내지 R13은 독립적으로 H, -SO3M1, Hal, Ra 또는 C3 -12 아릴로부터 선택되고, 각각의 M1은 독립적으로 H 또는 Bc이고, Bc는 생체친화성 양이온이고;
R5은 H, C1 -4 알킬, C1 -6 카르복시알킬, C3 -12 아릴술포닐, Cl이거나, 또는 R5은 임의로 R6, R14, R15 또는 R16 중 하나와 함께 5-원 또는 6-원 불포화 지방족, 불포화 헤테로지방족 또는 방향족 고리를 형성할 수 있고;
R6 및 R16은 독립적으로 Ra 기이고;
R7 및 R8은 독립적으로 C1 -4 알킬, C1 -4 술포알킬 또는 C1 -6 히드록시알킬 또는 임의로 R9 및/또는 R10 중 하나 또는 둘다와 함께 5-원 또는 6-원 N-함유 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴 고리를 형성할 수 있고;
X는 -CR14R15-, -O-, -S-, -Se-, -NR16- 또는 -CH=CH-이고, 여기에서 R14 내지 R16은 독립적으로 Ra기이고;
Ra은 C1 -4 알킬, C1 -4 술포알킬, C1 -6 카르복시알킬 또는 C1 -6 히드록시알킬이고;
w는 1 또는 2이고;
J는 생체친화성 음이온이며;
단 BzpM는 R1 내지 R16 기로부터 선택된 하나 이상의 술폰산 치환기를 포함한다.
용어 "조영제"란 생체내에서 완전 (즉, 원상태) 포유동물 신체의 관심있는 부위의 광학 영상화에 적합한 화합물을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다. 영상화는 침투성 (예를 들어 수술중 또는 내시경) 또는 비-침투성일 수도 있다. 생검 (예를 들어, 내시경 장치에서 생검 채널을 통해) 또는 종양 절제 (예를 들어, 종양 가장자리 확인을 통하여 수술중 절차 동안에)를 수월하게 하기 위하여 영상화가 임의로 사용될 수도 있다.
용어 "광학 영상화"란, 녹색 내지 근 적외선 영역의 광 (파장 500-1200 nm)과의 상호작용을 기초로 하여, 질병의 검출, 단계결정 또는 진단, 질병 발생의 모니터링조사, 또는 질병 치료의 모니터링 조사를 위해 영상을 형성하는 어떠한 방법을 의미한다. 광학 영상화는, 어떠한 기구도 사용하지 않는 직접적인 가시화 및 다양한 스코프, 카테터 및 광학 영상화 장치, 예를 들어, 단층촬영 표시를 위한 컴퓨터-보조 하드웨어와 같은 기구의 사용을 포함한 모든 방법을 더욱 포함한다. 형식 및 측정 기술은 이에 한정되지 않지만 발광 영상화; 내시경; 형광 내시경; 광학적 간섭성 단층촬영; 투과 영상화; 시간차 투과 영상화; 공촛점 영상화; 비선형 현미경; 광음향 영상화; 음향-광학 영상화; 분광법; 반사 분광법; 간섭법; 결맞춤 간섭법; 확산 광학 단층촬영법 및 형광 매개 확산 광학 단층촬영법 (연속 파, 시간 도메인 및 주파수 도메인 시스템), 및 광 산란, 흡수, 편광, 발광, 형광 수명, 양자 수율 및 소광의 측정을 포함한다. 이러한 기술의 추가의 세부사항은 문헌 ([Tuan Vo-Dinh (편집자): "Biomedical Photonics Handbook" (2003), CRC Press LCC]; [Mycek & Pogue (편집자): "Handbook of Biomedical Fluorescence" (2003), Marcel Dekker, Inc.]; [Splinter & Hopper: "An Introduction to Biomedical Optics" (2007), CRC Press LCC])에 의해 제공된다.
녹색 내지 근-적외 선 영역 광은 적합하게는 파장 500-1200 nm, 바람직하게는 파장 550-1000 nm, 가장 바람직하게는 600-800 nm이다. 광학 영상화 방법은 바람직하게는 형광 내시경이다. 여섯 번째 측면의 포유동물 신체는 바람직하게는 인간 신체이다. 조영제의 바람직한 구현양태는 첫 번째 측면 (상기)을 위해 설명된 것과 같다. 특히, 사용된 BzpM 염료는 형광성인 것이 바람직하다.
용어 "생체친화성 담체"란, 조성물이 생리학적으로 허용될 수 있도록, 다시 말해서 독성 또는 과도한 불쾌감 없이 포유동물 신체에 투여될 수 있도록, 조영제가 현탁되거나 용해될 수 있는 유체, 특히 액체를 의미한다. 생체적합성 담체는 적합하게는 무균, 비-발열성 주사용 수와 같은 주사가능한 담체 액체; 염수와 같은 수용액 (주사용 최종 제품이 등장성이 되도록 유리하게 균형을 맞출 수 있음); 하나 이상의 긴장-조절 물질의 수용액 (예를 들어 생체친화성 반대이온과 혈장 양이온의 염), 당류 (예를 들어, 글루코스 또는 슈크로스), 당 알콜 (예를 들어, 소르비톨 또는 만니톨), 글리콜 (예를 들어, 글리세롤), 또는 기타 비이온성 폴리올 물질 (예를 들어, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 등)이다. 바람직하게는, 생체친화성 담체는 비-발열성 주사용 수 또는 등장성 염수이다.
용어 "접합체"란 BTM, (L)n 기 및 BzpM 염료가 공유 결합에 의해 연결됨을 의미한다.
화학식 I의 접합체는 생체내 영상화에 적합하긴 하지만, 시험관내 응용을 가질 수도 있다 (예를 들어, 생물학적 샘플에서 BTM을 정량화하는 분석 또는 조직 샘플에서 BTM의 가시화 분석). 바람직하게는, 생체내 영상화를 위하여 조영제가 사용된다.
용어 "술폰산 치환기"란 화학식 -SO3M1 (식중, M1은 H 또는 Bc이고, Bc는 생체친화성 양이온이다)의 치환기를 의미한다. -SO3M1 치환기는 탄소 원자에 공유 결합되고, 탄소 원자는 아릴 (즉, R1 또는 R2이 -SO3M1일 때 술포아릴 또는 알킬 (즉, 술포알킬 기))일 수도 있다. 용어 "생체친화성 양이온"(Bc)은 이온화된 음 전하 기와 염을 형성하는 양 전하 반대이온을 의미하고 (이 경우에 술포네이트 기), 여기에서 상기 양 전하 반대이온은 비-독성이며 따라서 포유동물 신체, 특히 인간 신체에 투여하기 위해 적합하다. 적합한 생체친화성 양이온의 예는 알칼리 금속 나트륨 또는 칼륨; 알칼리 토금속 칼슘 및 마그네슘; 및 암모늄 이온을 포함한다. 바람직한 생체친화성 양이온은 나트륨 및 칼륨, 가장 바람직하게는 나트륨이다.
용어 "생체친화성 음이온" (J)이란 이온화된 양 전하 기 (이러한 경우에 인돌리늄 기)와 염을 형성하는 음 전하 반대이온을 의미하고, 여기에서 상기 음 전하 반대이온은 또한 비-독성이며 포유동물 신체, 특히 인간 신체에 투여하기 위해 적합하다. 반대이온(J-)은 몰 균등 량으로 존재하는 음이온을 나타내고, 따라서 BzpM 염료 위의 양 전하와 균형을 이룬다. 음이온(J)은 전하-균형 양이 존재하는 이상 적합하게는 단일- 또는 다중-하전된다. 음이온은 무기 또는 유기 산으로부터 적합하게 유래된다. 적합한 음이온의 예는 할라이드 이온, 예컨대 클로라이드 또는 브로마이드; 설페이트; 니트레이트; 시트레이트; 아세테이트; 포스페이트 및 보레이트를 포함한다. 바람직한 음이온은 클로라이드이다.
용어 "생물학적 표적 잔기"(BTM)는 포유동물 신체에 생체내 투여된 후에 상기 포유동물 신체의 특정한 위치에서 선택적으로 흡수되거나 집중되는 화합물을 의미한다. 이러한 부위는 예를 들어 특정한 질병 상태에 연루될 수 있고 기관 또는 대사 과정이 어떻게 작용하는지를 표시한다. 생물학적 표적 잔기는 바람직하게는 선형 펩티드 또는 고리형 펩티드 또는 이들의 조합일 수도 있는 3-100량체 펩티드, 펩티드 유사체, 펩토이드 또는 펩티드 모방체; 또는 효소 기질, 효소 길항질 또는 효소 억제제; 합성 수용체-결합 화합물; 올리고뉴클레오티드; 또는 올리고-DNA 또는 올리고-RNA 단편을 포함한다.
용어 "펩티드"는, 펩티드 결합 (즉, 하나의 아미노산의 아민을 다른 아미노 산의 카르복실에 연결시키는 아미드 결합)에 의해 연결되는, 하기 정의된 것과 같은 2 이상의 아미노 산을 포함하는 화합물을 의미한다. 용어 "펩티드 모방체" 또는 "모방체"란 펩티드 또는 단백질의 생물학적 활성을 모방하지만 더 이상 화학적 성질에서 펩티드가 아닌, 다시 말해서 더 이상 펩티드 결합 (즉, 아미노산 사이의 아미드 결합)을 함유하지 않는 생물학적 활성 화합물을 가리킨다. 여기에서, 용어 펩티드 모방체는 넓은 의미에서 더 이상 완전히 펩티드 성질이 아닌 분자, 예컨대 슈도-펩티드, 세미-펩티드 및 펩토이드를 포함하기 위해 사용된다. 용어 "펩티드 유사체"란 하기 기재된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 유사체를 포함하는 펩티드를 가리킨다. 문헌 ["Synthesis of Peptides and Peptidomimetics", M.Goodman et al., Houben-Weyl E22c, Thieme] 참조.
용어 "아미노산"이란, 자연 발생이거나 순수한 합성 기원일 수 있고 광학적으로 순수, 다시 말해서 단일 거울상이성질체 및 키랄 또는 거울상이성질체의 혼합물일 수도 있는 L- 또는 D-아미노산, 아미노산 유사체 (예를 들어 나프틸알라닌) 또는 아미노산 모방체를 의미한다. 아미노산에 대하여 통상적인 3-문자 또는 단일 문자 약어가 여기에서 사용된다. 바람직하게는, 본 발명의 아미노산은 광학적으로 순수하다. 용어 "아미노산 모방체"는 등가물인 자연 발생 아미노산의 합성 유사체, 다시 말해서 천연 화합물의 입체 및 전자 구조를 모방하도록 설계된 유사체를 의미한다. 이러한 등가물은 당업자에게 공지되어 있고 이에 한정되지는 않지만 데프시펩티드, 레트로-인버스(retro-inverso) 펩티드, 티오아미드, 시클로알칸 또는 1,5-이치환된 테트라졸을 포함한다 [M.Goodman, Biopolymers, 24, 137, (1985)] 참조.
적합한 효소 기질, 길항질 또는 억제제는 글루코스 및 글루코스 유사체, 예컨대 플루오로데옥시글루코스; 지방산 또는 엘라스타제, 안기오텐신 II 또는 메탈로프로테인아제 억제제를 포함한다. 바람직한 비-펩티드 안기오텐신 II 길항제는 로사르탄이다. 적합한 합성 수용체-결합 화합물은 에스트라디올, 에스트로겐, 프로게스틴, 프로게스테론 및 기타 스테로이드 호르몬; 도파민 D-1 또는 D-2 수용체에 대한 리간드. 또는 도파민 전달체, 예컨대 트로판; 및 세로토닌 수용체에 대한 리간드를 포함한다. 수용체-결합 화합물이 엽산일 때, 링커 기는 바람직하게는 5-량체 펩티드 Asp-Arg-Asp-Asp-Cys를 포함하지 않는다. 가장 바람직하게는, 수용체-결합 화합물은 엽산이 아니다.
화학식 II의 벤조피릴륨 염료(BzpM)는 녹색 내지 근-적외선 파장 (500-1200 nm, 바람직하게는 550-1000 nm, 더욱 바람직하게는 600-800 nm)의 광을 사용한 광학 영상화 절차에서 직접적 또는 간접적으로 검출될 수 있는 형광 염료 또는 발색단이다. 바람직하게는, BzpM는 형광 성질을 갖는다.
화학식 I의 링커 기 -(A)m-의 역할 중 하나는 BTM의 결합 부위로부터 BzpM를 멀리하는 것으로 생각된다. 이것은 BzpM가 비교적 부피가 크기 때문에 역 입체 상호작용이 가능하므로 특히 중요하다. 이것은 유연성 (예를 들어, 단순한 알킬 사슬)의 조합에 의해 달성될 수 있고, 그 결과 BzpM는 결합 부위로부터 자신을 멀리 위치시킬 자유 및/또는 결합 부위로부터 BzpM를 멀리 배향시키는 시클로알킬 또는 아릴 스페이서와 같은 경직성을 갖는다. 조영제의 생체분포를 변형시키기 위하여 링커 기의 성질이 또한 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 링커에 에테르 기를 도입하는 것은 혈장 단백질 결합을 최소화하는데 도움이 될 것이다. -(A)m-이 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 구성 블록 또는 1 내지 10개 아미노산 잔기의 펩티드 사슬을 포함할 때, 링커 기는 생체내에서 조영제의 약동학 및 혈액 제거율을 변형시키는 기능을 할 수도 있다. 이러한 "생체변형제" 링커 기는 배경 조직, 예컨대 근육 또는 간으로부터 및/또는 혈액으로부터 조영제의 제거를 가속화할 수도 있으며, 따라서 낮은 배경 간섭에 기인하여 더욱 양호한 진단 영상을 제공한다. 특별한 분비 경로, 예를 들어 간을 통하는 것과는 반대로 신장을 통하는 경로를 촉진하기 위해 생체변형제 링커 기가 또한 사용될 수도 있다.
용어 "당"은 일-, 이- 또는 삼-당류를 의미한다. 적합한 당류는 글루코스, 갈락토스, 말토스, 만노스 및 락토스를 포함한다. 임의로, 당은 아미노산으로의 용이한 결합이 가능하도록 작용기화될 수도 있다. 따라서, 예를 들어 아미노산의 글루코사민 유도체가 펩티드 결합을 통해 다른 아미노산에 접합될 수 있다. 아스파라긴의 글루코사민 유도체 (노바바이오켐으로부터 통상적으로 입수가능함)가 이것의 일례이다.
Figure pct00011
화학식 I은 -(L)n[BzpM] 잔기가 BTM의 적합한 위치에 부착될 수 있음을 의미한다. -(L)n[BzpM] 잔기의 적합한 위치는, 생체내에서 활성 부위에 결합하기 위한 책임이 있는 BTM 부분으로부터 멀리 위치하도록 선택된다. 화학식 I의 [BTM]-(L)n- 잔기는 화학식 II의 BzpM의 적합한 위치에 부착될 수 있다. [BTM]-(L)n- 잔기는 기존의 치환기 (예를 들어 R1 내지 R16 기의 하나)의 위치를 취하거나, 또는 BzpM의 기존의 치환기에 공유 결합된다. [BTM]-(L)n- 잔기는 바람직하게는 BzpM의 카르복시알킬 치환기를 통해 부착된다.
본 발명의 적합한 조영제는 BzpM가 화학식 IIa 또는 IIb인 것이다.
<화학식 IIa>
Figure pct00012
<화학식 IIb>
Figure pct00013
상기 식에서,
X, w, J 및 R1 - R13은 화학식 II에 대해 정의된 것과 같다.
R6/R14 내지 R16의 하나와 함께 R5가 5-원 또는 6-원 불포화 지방족, 불포화 헤테로지방족 또는 방향족 고리를 형성할 때, 이러한 적합한 방향족 고리는 페닐, 푸란, 티아졸, 피리딜, 피롤 또는 피라졸 고리를 포함한다. 적합한 불포화 고리는 R5가 부착된 C=C를 적어도 포함한다.
R9 및/또는 R10의 하나 또는 양쪽과 함께 R7 및/또는 R8가 5-원 또는 6-원 N-함유 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴 고리를 형성할 때, 이러한 적합한 고리는 티아졸, 피리딜, 피롤 또는 피라졸 고리, 또는 그의 부분 수소화된 변형체, 바람직하게는 피리딜 또는 디히드로피리딜을 포함한다.
대안적인 구현양태에서, R1 내지 R4의 적어도 하나가 F 또는 -(CF2)f-F (식중, f는 1 내지 4의 정수이다)가 되도록, 화학식 IIb의 염료를 임의로 선택할 수도 있다.
제약 조성물은, 주사기 또는 카눌라에 의해 용액을 첨가하거나 회수할 수 있으면서, 완전 무균성을 유지할 수 있는 밀봉된 용기 및 임의로 불활성 윗공간 기체 (예, 질소 또는 아르곤)를 포함하는 적합한 바이알 또는 용기로 공급된다. 바람직한 용기는 격막-밀봉된 바이알이고, 여기에서 가스가 새지 않는 마개를 오버실(전형적으로 알루미늄)로 그 위에 주름을 잡는다. 마개는 완전 무균성을 유지하면서 피하 주사침으로 한번 또는 여러번 뚫기에 적합하다 (예를 들어, 주름잡은 격막 밀봉 마개). 이러한 용기는 원한다면 마개가 진공을 견딜 수 있고 (예를 들어 윗공간 기체 또는 가스제거 용액을 바꾸기 위해), 외부 대기 기체, 예컨대 산소 또는 수 증기의 진입을 허용하지 않으면서 압력 감소와 같은 압력 변화를 견딜 수 있다는 추가의 장점을 갖고 있다.
바람직한 다회 용량 용기는 다회 분의 환자 용량을 함유하는 단일 벌크 바이알 (예를 들어, 10 내지 30 cm3 부피)을 포함하고, 이에 의해 임상 상황에 적합하도록 제제의 실행가능한 수명 동안에 1회 환자 용량을 다양한 시간 간격으로 임상 등급 주사기 내에 뽑아낼 수 있다. 예비-충진된 주사기는 1회 인간 용량 또는 "단위 용량"을 함유하도록 설계되고, 따라서 바람직하게는 임상 사용을 위해 적합한 일회용 또는 기타 주사기이다. 본 발명의 제약 조성물은 바람직하게는 한 명의 환자에 적합한 투여량을 갖고, 상기 기재된 바와 같이 적합한 주사기 또는 용기에 제공된다.
제약 조성물은 임의로 항균 보존제, pH-조절제, 충진제, 안정화제 또는 삼투압 조절제와 같은 추가의 부형제를 함유할 수도 있다. 용어 "항균 보존제"는 세균, 효모 또는 곰팡이와 같은 잠재적으로 유해한 미생물의 생육을 억제하는 약제를 의미한다. 항균 보존제는 사용된 용량에 의존하여 일부 살균 성질을 나타낼 수도 있다. 본 발명의 항균 보존제(들)의 주된 역할은 제약 조성물에서 이러한 미생물의 생육을 억제하는 것이다. 그러나, 투여 전에 상기 조성물을 제조하기 위해 사용되는 키트의 하나 이상의 성분에서 잠재적으로 유해한 미생물의 생육을 억제하기 위하여 항균 보존제가 임의로 사용될 수도 있다. 이러한 키트는 두 번째 측면(하기)에서 설명된다. 적합한 항균 보존제(들)는 파라벤, 다시 말해서 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸 파라벤 또는 이들의 혼합물; 벤질 알콜; 페놀; 크레졸; 세트리미드; 및 티오머살을 포함한다. 바람직한 항균 보존제(들)는 파라벤이다.
용어 "pH-조절제"는 조성물의 pH가 인간 또는 포유동물 투여를 위해 허용가능한 한계 (대략 pH 4.0 내지 10.5) 이내가 되도록 보장하는데 유용한 화합물 또는 화합물의 혼합물을 의미한다. 적합한 pH-조절제는 제약학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대 트리신, 포스페이트 또는 TRIS [즉, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄] 및 제약학적으로 허용가능한 염기, 예컨대 탄산나트륨, 중탄산나트륨 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 조성물이 키트 형태로 사용될 때, pH 조절제는 임의로 별도의 바이알 또는 용기에 제공될 수 있고, 그 결과 키트의 사용자가 다단계 절차의 일부로서 pH를 조절할 수 있다.
용어 "충진제"는 제조 및 동결건조 동안에 재료 취급을 쉽게 할 수 있는 제약학적으로 허용가능한 팽화제를 의미한다. 적합한 충진제는 무기 염, 예컨대 염화나트륨 및 수용성 당류 또는 당 알콜, 예컨대 슈크로스, 말토스, 만니톨 또는 트레할로스를 포함한다.
첫 번째 측면의 제약 조성물은 바람직한 무균 비-발열성 제품을 제공하기 위하여 무균 제조 조건 (즉, 청정실) 하에서 제조될 수도 있다. 주 성분, 특히 관련된 시약 및 조영제와 접촉되는 장치의 일부 (예를 들어, 바이알)가 무균성인 것이 바람직하다. 성분 및 시약은 무균 여과, 예를 들어 감마선 조사를 사용한 최종 살균, 오토클레이브처리, 건열 또는 화학 처리 (예를 들어 에틸렌 옥사이드 사용)를 포함하여 당 기술분야에 공지된 방법에 의해 살균될 수 있다. 최소의 조작을 수행하는 것이 필요하도록 미리 일부 성분들을 살균하는 것이 바람직하다. 그러나, 예방책으로서, 제약 조성물의 제조에서 최종 단계로서 적어도 무균 여과 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
첫 번째 측면의 제약 조성물은 하기 두 번째 측면을 위해 설명된 바와 같이 키트로부터 바람직하게 제조된다.
바람직한 특징
조영제의 분자량은 적합하게는 30,000 달톤 이하이다. 바람직하게는, 분자량은 1,000 내지 20,000 달톤, 가장 바람직하게는 2000 내지 18,000 달톤의 범위이고, 2,500 내지 16,000 달톤이 특히 바람직하다.
BTM은 합성 또는 천연 유래일 수도 있지만 바람직하게는 합성이다. 용어 "합성"은 통상적인 의미, 다시 말해서 예를 들어 포유동물 신체로부터의 자연 원료로부터 단리되는 것과 반대로 인간이 만들어냄을 의미한다. 이러한 화합물은 제조 및 순도 프로파일이 충분히 조절될 수 있다는 장점을 갖고 있다. 따라서, 천연 유래의 단클론성 항체 및 그의 단편은 여기에서 사용된 용어 "합성"의 범위 밖에 있다.
BTM은 바람직하게는 3-100량체 펩티드, 효소 기질, 효소 길항질 또는 효소 억제제로부터 선택된다. BTM은 가장 바람직하게는 3-100량체 펩티드 또는 펩티드 유사체이다. BTM이 펩티드일 때, 이것은 바람직하게는 4-30량체 펩티드, 가장 바람직하게는 5-28 량체 펩티드이다.
화학식 I의 [BTM]-(L)n- 잔기는 바람직하게는 화학식 II의 BzpM의 위치 R5, R6, R14, R15 또는 R16, 더욱 바람직하게는 R6, R14, R15 또는 R16, 가장 바람직하게는 R6, R14 또는 R15에서 부착된다. 부착을 수월하게 하기 위하여 관련된 R5, R6, R14, R15 또는 R16 치환기는 바람직하게는 C1-6 카르복시알킬, 더욱 바람직하게는 C3-6 카르복시알킬이고, 카르복시 기가 활성 에스테르로서 사용된다.
벤조피릴륨 염료(BzpM)는 바람직하게는 적어도 2개의 술폰산 치환기, 더욱 바람직하게는 2 내지 6개 술폰산 치환기, 가장 바람직하게는 2 내지 4개 술폰산 치환기를 갖는다. 바람직하게는, 술폰산 치환기의 적어도 하나는 C1-4 술포알킬 기이다. 이러한 술포알킬 기는 바람직하게는 위치 R6, R7, R8, R14, R15 또는 R16, 더욱 바람직하게는 R6, R7, R8, R14 또는 R15; 가장 바람직하게는 화학식 II의 R7 및 R8의 하나 또는 양쪽 모두와 함께 R6에 위치한다. 화학식 II의 술포알킬 기는 바람직하게는 화학식 -(CH2)kSO3M1 (식에서, M1은 H 또는 Bc이고, k는 1 내지 4의 정수이고, Bc는 생체친화성 양이온 (상기 정의됨)이다)이다. k는 바람직하게는 3 또는 4이다.
화학식 II에서, w는 바람직하게는 1이다. R5는 바람직하게는 H 또는 C1-4 카르복시알킬이고, 가장 바람직하게는 H이다. X는 바람직하게는 -CR14R15- 또는 -NR16-이고, 가장 바람직하게는 -CR14R15-이다.
바람직한 BzpM 염료는 화학식 III이다.
<화학식 III>
Figure pct00014
상기 식에서, Y1, R1 - R4, R6, R14, R15 및 J는 화학식 II에 대해 정의된 것과 같다.
화학식 III의 적합한 염료는 화학식 IIIa 또는 IIIb이다.
<화학식 IIIa>
Figure pct00015
<화학식 IIIb>
Figure pct00016
화학식 III, IIIa 및 IIIb의 바람직한 R1 내지 R4 및 R6 내지 R13 기는 화학식 IIa 및 IIb에 대해 상기 기재된 바와 같다. 화학식 III, IIIa 및 IIIb에서, 하나가 Rb 기이고 다른 기가 Rc 기가 되도록 R14 및 R15가 바람직하게 선택된다. Rb은 C1 -2 알킬, 가장 바람직하게는 메틸이다. Rc은 C1-4 알킬, C1-6 카르복시알킬 또는 C1-4 술포알킬, 바람직하게는 C3-6 카르복시알킬 또는 -(CH2)kSO3M1 (여기에서 k는 3 또는 4가 되도록 선택된다)이다.
바람직하게는, 화학식 III의 염료는 BTM에 용이한 공유 부착이 가능하도록 C1-6 카르복시알킬 치환기를 갖는다.
화학식 II 또는 III에서, R7 및/또는 R8이 R9 및/또는 R10 중 하나 또는 둘다와 함께 5-원 또는 6-원 N-함유 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴 고리를 형성할 때, 바람직한 고리는 피리딜 또는 디히드로피리딜이다. R8 기가 R10과 고리화되는 바람직한 Y1 기는 화학식 Yc이다.
<화학식 Yc>
Figure pct00017
R7 및 R8 기 양쪽 모두가 고리화되는 바람직한 Y1 기는 화학식 Yd이다.
<화학식 Yd>
Figure pct00018
상기 식에서,
R7, R9 및 R11 - R13은 상기 정의된 바와 같고;
각각의 X1는 독립적으로 H 또는 C1 -4 알킬이다.
화학식 Yc에서,
각각의 X1는 CH3이고;
R9=R11=H;
R12는 H이고;
R12는 CH3 또는 -C(CH3)3, 더욱 바람직하게는 -C(CH3)3인 것이 바람직하다.
화학식 Yd에서,
R9는 H이고;
R12는 H이고;
R12는 바람직하게는 CH3 또는 -C(CH3)3, 더욱 바람직하게는 -C(CH3)3인 것이 바람직하다.
화학식 III의 -NR7R8 기가
(i) 열린 사슬 형태이고, 다시 말해서 R7/R8 기가 R9/R10의 하나 또는 양쪽과 고리화되지 않거나 (바람직한 R7 및 R8 기는 독립적으로 C1-4 알킬 또는 C1-4 술포알킬, 가장 바람직하게는 에틸 또는 C3-4 술포알킬로부터 선택된다.) 또는
(ii) 고리화되어 화학식 Yc 또는 Yd, 더욱 바람직하게는 화학식 Yc의 고리형 Y1 치환기를 제공하는 것이 바람직하다.
열린 사슬 형태(i)가 가장 바람직하다.
화학식 III의 특히 바람직한 염료는 화학식 IIIc, IIId 또는 IIIe이다.
<화학식 IIIc>
Figure pct00019
<화학식 IIId>
Figure pct00020
<화학식 IIIe>
Figure pct00021
상기 식에서,
M1 및 J는 상기 정의된 바와 같고;
R17 및 R18은 독립적으로 C1-4 알킬 또는 C1-4 술포알킬로부터 선택되고;
R19은 H 또는 C1-4 알킬이고;
R20은 C1-4 알킬, C1-4 술포알킬 또는 C1-6 카르복시알킬이고;
R21은 C1-4 술포알킬 또는 C1-6 카르복시알킬이고;
R22은 C1-4 알킬, C1-4 술포알킬 또는 C1-6 카르복시알킬이고;
X2, X3 및 X4는 독립적으로 H 또는 C1 -4 알킬이다.
화학식 IIId, IIIe 및 IIIf의 염료는 바람직하게는 R20 내지 R22의 하나 이상이 C1 -4 술포알킬이 되도록 선택된다.
화학식 IIId의 바람직한 특정한 염료는 DY-631 및 DY-633이다.
Figure pct00022
화학식 IIIe의 바람직한 특정한 염료는 DY-652이다.
Figure pct00023
바람직한 특정한 염료는 DY-631 및 DY-652이고, DY-652가 가장 바람직하다.
BTM이 펩티드일 때, 이러한 바람직한 펩티드는 다음을 포함한다:
- 소마토스타틴, 옥트레오티드 및 유사체,
- ST 수용체에 결합된 펩티드, 여기에서 ST는 이.콜리 및 기타 미생물에 의해 생성된 열-안정성 독소를 가리킨다,
- 라미닌 단편, 예를 들어 YIGSR, PDSGR, IKVAV, LRE 및 KCQAGTFALRGDPQG,
- 백혈구 축적 부위를 표적화하기 위한 N-포르밀 펩티드,
- 혈소판 인자 4 (PF4) 및 그의 단편,
- 예를 들어 혈관신생을 표적으로 할 수 있는 RGD (Arg-Gly-Asp)-함유 펩티드 [R.Pasqualini et al., Nat Biotechnol. 1997 Jun; 15(6): 542-6]; [E.Ruoslahti, Kidney Int. 1997 May; 51(5): 1413-7].
- α2-안티플라스민, 피브로넥틴 또는 베타-카제인, 피브리노겐 또는 트롬보스폰딘의 펩티드 단편. α2-안티플라스민, 피브로넥틴, 베타-카제인, 피브리노겐 또는 트롬보스폰딘의 아미노산 서열은 하기 문헌에서 찾아볼 수 있다: α2-안티플라스민 전구체 [M. Tone et al., J Biochem, 102, 1033, (1987)]; 베타-카제인 [L. Hansson et al., Gene, 139, 193, (1994)]; 피브로넥틴 [A. Gutman et al., FEBS Lett., 207, 145, (1996)]; 트롬보스폰딘-1 전구체 [V. Dixit et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83, 5449, (1986)]; [R. F. Doolittle, Ann. Rev. Biochem., 53, 195, (1984)],
- 안기오텐신의 기질 또는 억제제인 펩티드, 예컨대 안기오텐신 II Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (E. C. Jorgensen et al, J. Med. Chem., 1979, Vol 22, 9, 1038- 1044) [Sar , Ile] 안기오텐신 II: Sar-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pio-Ile (R. K. Turker et al., Science, 1972, 177, 1203);
- 안기오텐신 I: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu.
BTM이 펩티드일 때, 펩티드의 한쪽 또는 양쪽 말단, 바람직하게는 양쪽 말단이 물질대사 억제 기 (MIG)에 접합된다. 이러한 방식으로 보호된 양쪽 펩티드 말단을 갖는 것이 생체내 영상화 응용을 위해 중요한데, 그 이유는 그렇지 않은 경우에 빠른 물질대사가 BTM 펩티드에 대한 선택적 결합 친화력을 소실할 것으로 예상되기 때문이다. 용어 "물질대사 억제 기" (MIG)는 효소, 특히 카르복시펩티다제와 같은 펩티다제, 아미노 말단 또는 카르복시 말단에서 BTM 펩티드의 물질 대사를 억제하거나 저지하는 생체친화성 기를 의미한다. 이러한 기는 생체내 응용을 위해 특히 중요하고, 당업자에게 잘 알려져 있으며, 펩티드 아민 말단을 위하여 다음 중에서 적합히 선택된다: N-아실화 기 -NH(C=O)RG, 여기에서 아실 기 -(C=O)RG는 C1 -6 알킬, C3-10 아릴 기로부터 선택된 RG를 갖거나 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 구성 블록을 포함한다. 적합한 PEG 기는 하기 링커 기(L)에 대해 설명된다. 이러한 바람직한 PEG 기는 화학식 Bio1 또는 Bio2 (하기)의 생체변형제이다. 바람직한 아미노 말단 MIG 기는 아세틸, 벤질옥시카르보닐 또는 트리플루오로아세틸, 가장 바람직하게는 아세틸이다.
펩티드 카르복실 말단에 대해 적합한 물질대사 억제 기는 카르복사미드, tert-부틸 에스테르, 벤질 에스테르, 시클로헥실 에스테르, 아미노 알콜 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 구성 블록을 포함한다. BTM 펩티드의 카르복시 말단 아미노산 잔기에 대해 적합한 MIG 기는 아미노산 잔기의 말단 아민이 C1-4 알킬기, 바람직하게는 메틸 기로 N-알킬화되는 것이다. 바람직한 MIG 기는 카르복사미드 또는 PEG이고, 가장 바람직한 기는 카르복사미드이다.
펩티드 말단의 어느 하나 또는 양쪽 모두가 MIG 기로 보호될 때, -(L)n[BzpM] 잔기가 임의로 MIG 기에 부착될 수도 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 펩티드 말단은 MIG 기를 갖지 않고, 그 결과 그 위치에 -(L)n[BzpM] 잔기가 부착되면 각각 화학식 IVa 또는 IVb의 화합물을 제공한다.
<화학식 IVa>
Figure pct00024
<화학식 IVb>
Figure pct00025
상기 식에서,
Z1은 BTM 펩티드의 N-말단에 부착되고 H 또는 MIG이며;
Z2는 BTM 펩티드의 C-말단에 부착되고, OH, OBc 또는 MIG이고,
여기에서 Bc는 생체친화성 양이온 (상기 정의됨)이다.
화학식 IVa 및 IVb에서, Z1 및 Z2는 바람직하게는 양쪽 모두 독립적으로 MIG이다. Z1 및 Z2에 대해 바람직한 MIG 기는 펩티드 말단에 대해 상기 기재된 것과 같다. 펩티드 말단에서 BTM 펩티드의 대사 억제가 이러한 방식으로 -(L)n[BzpM] 잔기의 부착에 의해 달성될 수도 있긴 하지만, -(L)n[BzpM] 자체는 본 발명의 MIG의 정의 밖에 있다.
BTM 펩티드가 BzpM의 용이한 접합을 위해 적합한 측쇄를 가진 하나 이상의 추가의 아미노산 잔기를 임의로 포함할 수 있고, 링커 기(L)의 A 잔기의 일부를 형성한다. 적합한 아미노산 잔기는 아민-작용기화 BzpM 염료와의 접합을 위해 Asp 또는 Glu 잔기를 포함하거나 또는 카르복시- 또는 활성 에스테르-작용기화 BzpM 염료와의 접합을 위해 Lys 잔기를 포함한다. BzpM의 접합을 위한 추가의 아미노산 잔기(들)는 BTM 펩티드의 결합 영역으로부터 멀리 떨어져 위치하고, 바람직하게는 C- 또는 N-말단에 위치한다. 바람직하게는, 접합을 위한 아미노산 잔기는 Lys 잔기이다.
합성 링커 기(L)가 존재할 때, 이것은 바람직하게는 [BTM] 및 BzpM로의 접합을 수월하게 하는 말단 작용 기를 포함한다. 이러한 적합한 기(Qa)는 하기에 기재된다. L이 1 내지 10개 아미노산 잔기의 펩티드 사슬을 포함할 때, 아미노산 잔기는 바람직하게는 글리신, 리신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산 또는 세린으로부터 선택된다. L이 PEG 잔기를 포함할 때, 이것은 바람직하게는 화학식 Bio1 또는 Bio2의 단분산 PEG-유사 구조의 올리고머화로부터 유래된 단위를 포함한다:
<화학식 Bio1>
Figure pct00026
화학식 Bio1의 17-아미노-5-옥소-6-아자-3,9,12,15-테트라옥사헵타데카논산.
식에서, p는 1 내지 10의 정수이다. 대안적으로, 화학식 Bio2의 프로피온산 유도체를 기재로 한 PEG-유사 구조가 사용될 수 있다:
<화학식 Bio2>
Figure pct00027
식에서, p는 화학식 Bio1에 대해 정의되고 q는 3 내지 15의 정수이다.
화학식 Bio2에서, p는 바람직하게는 1 또는 2이고, q는 바람직하게는 5 내지 12이다.
링커 기가 PEG 또는 펩티드 사슬을 포함하지 않을 때, 바람직한 L 기는 2 내지 10개 원자, 가장 바람직하게는 2 내지 5개 원자, 특히 바람직하게는 2 또는 3개 원자의 -(A)m- 잔기를 형성하는 연결된 원자의 주쇄를 갖는다. 2개 원자의 최소의 링커 기 주쇄는, 바람직하지 못한 상호작용이 최소화되도록 BzpM가 잘 분리된다는 장점을 부여한다.
통상적으로 입수될 수 없는 BTM 펩티드는 문헌 [P.Lloyd-Williams, F.Albericio and E.Girald; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, 1997]에 기재된 것과 같은 고체상 펩티드 합성에 의해 합성될 수 있다
조영제는 다음과 같이 제조될 수 있다:
BzpM의 BTM로의 접합을 수월하게 하기 위하여, BzpM는 적합하게는 그것에 부착된 반응성 작용기(Qa)를 갖는다. Qa 기는 BTM의 상보적 작용기와 반응하도록 설계되고, 따라서 BzpM와 BTM 사이에 공유 결합을 형성한다. BTM의 상보적 작용기는 BTM의 고유 부분일 수도 있거나, 또는 당 기술분야에 공지된 바와 같이 이작용성 기와의 유도체화를 사용하여 도입될 수 있다. 표 1은 반응기와 그들의 상보적 대응물의 예를 나타낸다.
반응기 및 그와 반응하는 상보적 기
반응기 (Qa) 상보적 기
활성화 에스테르 1차 아미노, 2차 아미노
산 안히드라이드, 산 할라이드 1차 아미노, 2차 아미노, 히드록실
이소티오시아네이트 아미노기
비닐술폰 아미노기
디클로로트리아진 아미노기
할로아세트아미드, 말레이미드 티올, 이미다졸, 히드록실, 아민, 티오포스페이트
카르보디이미드 카르복실산
히드라진, 히드라지드 알데히드 및 케톤을 포함한 카르보닐
포스포르아미디트 히드록실 기
용어 "활성화 에스테르" 또는 "활성 에스테르"는 더욱 양호한 이탈 기가 되고 따라서 친핵기, 예컨대 아민과의 더욱 용이한 반응을 가능하게 하도록 설계된 카르복실산의 에스테르 유도체를 의미한다. 적합한 활성 에스테르의 예는 N-히드록시숙신이미드(NHS), 펜타플루오로페놀, 펜타플루오로티오페놀, 파라-니트로페놀 및 히드록시벤조트리아졸이다. 바람직한 활성 에스테르는 N-히드록시숙신이미드 또는 펜타플루오로페놀 에스테르이다.
단백질, 펩티드, 핵산 탄수화물 등과 같은 BTM에 존재하는 작용기의 예는 히드록시, 아미노, 술피드릴, 카르보닐 (알데히드 및 케톤 포함), 및 티오프소페이트를 포함한다. 적합한 Qa 기는 카르복실; 활성화 에스테르; 이소티오시아네이트; 말레이미드; 할로아세트아미드; 히드라지드; 비닐술폰; 디클로로트리아진 및 포스포르아미디트로부터 선택될 수도 있다. 바람직하게는, Qa는 카르복실산의 활성화 에스테르, 이소티오시아네이트, 말레이미드 또는 할로아세트아미드이다.
상보적 기가 아민 또는 히드록실일 때, Qa는 바람직하게는 활성화 에스테르이고, 바람직한 에스테르는 상기 기재되어 있다. BzpM 위의 바람직한 치환기는 5-카르복시펜틸 기의 활성화 에스테르이다. 상보적 기가 티올일 때, Qa는 바람직하게는 말레이미드 또는 요오도아세트아미드 기이다.
염료를 생물학적 분자에 접합하기 위해 일반적인 방법은 문헌 [Licha et al, Topics Curr.Chem., 222, 1-29 (2002)]; [Adv.Drug Deliv.Rev., 57, 1087-1108 (2005)]에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 펩티드, 단백질 및 올리고뉴클레오티드 기질은 말단 위치에서 또는 대안적으로 하나 이상의 내부 위치에서 표지화될 수 있다. 형광 염료 표지화 시약을 사용하는 단백질 표지화의 검토 및 예에 관하여, 문헌 ["Non-Radioactive Labelling, a Practical Introduction", Garman, A.J.Academic Press, 1997]; ["Bioconjugation - Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", Aslam, M. and Dent, A., Macmillan Reference Ltd. (1998)]을 참조한다. 합성된 펩티드에서 부위 특이적 표지화를 얻기 위해 프로토콜이 이용될 수 있고, 예를 들어 문헌 [Hermanson, G.T., "Bioconjugate Techniques", Academic Press (1996)]을 참조한다.
바람직하게는, 조영제의 제조 방법은
(i) BTM의 아민 작용기와 화학식 J1-(L)n-[BzpM]의 화합물과의 반응; 또는
(ii) BTM의 카르복실산 또는 활성화 에스테르 작용기와 화학식 J2-(L)n-[BzpM]의 화합물과의 반응;
(iii) BTM의 티올 기와 화학식 J3-(L)n-[BzpM]의 화합물과의 반응.
상기 식에서, BTM, MIG, L, n 및 BzpM는 상기 정의된 바와 같고,
J1는 카르복실산, 활성화 에스테르, 이소티오시아네이트 또는 티오시아네이트 기이고;
J2는 아민 기이고;
J3는 말레이미드 기이다.
J2는 바람직하게는 1차 또는 2차 아민 기, 가장 바람직하게는 1차 아민 기이다. 단계 (iii)에서, BTM의 티올 기는 바람직하게는 시스테인 잔기로부터 유래된다.
단계 (i) 내지 (iii)에서, BTM은, 화학 반응이 단지 원하는 부위에서만 선택적으로 일어나도록 적합한 보호 기로 보호된, BzpM 유도체와 잠재적으로 반응할 수 있는 다른 작용기를 임의로 가질 수도 있다. 용어 "보호기"는, 바람직하지 않은 화학 반응을 억제하거나 저지하지만, 분자의 나머지 부분을 변형시키지 않는 충분히 온화한 조건 하에서 당해 작용기로부터 분해될 수도 있기에 충분히 반응성이 되도록 설계된 기를 의미한다. 탈보호 후에 원하는 생성물이 수득된다. 아민 보호기는 당업자에게 잘 알려져 있고 Boc (여기에서 Boc는 tert-부틸옥시카르보닐이다), Fmoc (여기에서 Fmoc는 플루오레닐메톡시카르보닐이다), 트리플루오로아세틸, 알릴옥시카르보닐, Dde [즉, 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)에틸] 또는 Npys (즉, 3-니트로-2-피리딘 술페닐)로부터 적합히 선택된다. 적합한 티올 보호 기는 Trt (트리틸), Acm (아세트아미도메틸), t-Bu (tert-부틸), tert-부틸티오, 메톡시벤질, 메틸벤질 또는 Npys (3-니트로-2-피리딘 술페닐)이다. 추가의 보호기의 사용은 문헌 ['Protective Groups in Organic Synthesis', Theodora W. Greene and Peter G.M.Wuts, (John Wiley & Sons, 1991)]에 기재되어 있다. 바람직한 아민 보호기는 Boc 및 Fmoc이고, 가장 바람직하게는 Boc이다. 바람직한 아민 보호기는 Trt 및 Acm이다.
BTM에 접합하기 위해 적합한 작용기화된 벤조피릴륨 염료 (BzpM)는 디오믹스로부터 통상적으로 입수가능하고 (Dyomics GmbH, Winzerlaer Str.2A, D-07745 Jena, Germany; www.dyomics.com), 여기에서 반응성 작용기 (Qa)는 NHS 에스테르, 말레이미드, 아미노 또는 카르복실산이다. 벤조피릴륨 염료의 합성을 위해 적합한 전구체는 US 5405976에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 광학 리포터 염료를 아미노산 및 펩티드에 접합하는 방법은 상기 Licha의 문헌뿐만 아니라 문헌 [Flanagan et al., Bioconj.Chem., 8, 751-756 (1997)]; [Lin et al., 상동, 13, 605-610 (2002)] 및 [Zaheer, Mol.Imaging, 1(4), 354-364 (2002)]에 기재되어 있다. BTM에 링커 기(L)를 접합하는 방법은 염료 단독 (상기 참조)과 유사한 화학을 사용하고 당 기술분야에 공지되어 있다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 첫 번째 측면의 제약 조성물을 제조하기 위한 키트를 제공하고, 여기에서 상기 키트는 화학식 I의 접합체를 무균 고체 형태로 포함하고, 생체친화성 담체의 무균 공급으로 재구성할 때 용해가 발생하여 원하는 제약 조성물을 수득할 수 있다. "접합체" 및 "생체친화성 담체"는 그의 바람직한 구현양태와 함께 첫 번째 측면에 기재된 바와 같다.
키트를 위하여, 접합체는 상기 기재된 것과 같은 기타 임의의 부형제와 함께 적합한 바이알 또는 용기에서 동결건조된 분말로서 제공될 수 있다. 이어서, 분말은 원하는 생체친화성 담체와 함께 재구성되어 제약 조성물을 무균 비발열성 형태로 수득하도록 설계되고, 이것은 포유동물 투여를 위해 즉시 사용되도록 준비된다.
접합체의 바람직한 무균 고체 형태는 동결건조된 고체이다. 무균 고체 형태는 바람직하게는 제약 조성물(상기)에 대해 기재된 것과 같이 제약 등급 용기에 공급된다. 키트가 동결건조될 때, 제형은 당류, 바람직하게는 만니톨, 말토스 또는 트리신으로부터 선택된 동결방지제를 임의로 포함할 수도 있다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 접합체를 제공한다.
<화학식 I>
Figure pct00028
상기 식에서, L 및 n은 첫 번째 측면에서 정의된 바와 같고, BzpM는 상기 정의된 것과 같은 화학식 II이고, BTM'는 첫 번째 측면에서 정의된 것과 같은 BTM이고, 이것은 합성이며 다음 중에서 선택된다:
(i) 3 - 100량체 펩티드;
(ii) 효소 기질, 효소 길항질 또는 효소 억제제;
(iii) 수용체-결합 화합물;
(iv) 올리고뉴클레오티드;
(v) 올리고-DNA 또는 올리고-RNA 단편.
용어 '합성'은 상기 주어진 정의를 갖는다. 접합체에서 화학식 II의 BzpM의 바람직한 구현양태는 상기 첫 번째 측면에 기재된 것과 같다. (i) 내지 (v)의 BTM'의 바람직한 측면은 BTM의 유형에 대해 첫 번째 측면에 기재된 것과 같다. BTM'는 바람직하게는 3-100량체 펩티드이다.
세 번째 측면의 접합체는 본 발명의 조영제 제약 조성물의 제조에서 유용하다. 접합체는 첫 번째 측면에 기재된 것과 같이 제조될 수 있다.
네 번째 측면에서, 본 발명은, 생체내에서 BTM 국소화 부위의 영상을 얻기 위하여 첫 번째 측면의 제약 조성물을 사용하는 것을 포함하는, 포유동물 신체의 생체내 광학 영상화 방법을 제공한다.
용어 "광학 영상화"는 첫 번째 측면 (상기)에 정의된 바와 같다.
네 번째 측면의 방법에서, 조영제 제약 조성물을 상기 포유동물 신체에 미리 투여하는 것이 바람직하다. "미리 투여"란 조영제를 예를 들어 정맥 주사로서 환자에게 제공하는 임상 단계를 영상화에 앞서서 수행함을 의미한다. 이 구현양태는, BTM이 관련된 포유동물 신체의 질병 상태를 생체내 광학 영상화하기 위하여, 진단 시약의 제조에서 첫 번째 측면에 정의된 것과 같은 접합체의 사용을 포함한다.
네 번째 측면의 바람직한 광학 영상화 방법은 형광 반사 영상화(FRI)이다. FRI에서, 본 발명의 조영제를 진단하고자 하는 피험자에게 투여하고, 이어서 피험자의 조직 표면을 여기 광 - 보통 연속 파(CW) 여기로 조사한다. 광은 조영제의 BzpM 염료를 여기시킨다. 여기 광에 의해 발생되는 조영제으로부터의 형광을 형광 검출기를 사용하여 검출한다. 복귀하는 광을 바람직하게 여과하여 형광 성분을 (단독으로 또는 부분적으로) 분리한다. 형광성 광으로부터 영상을 형성한다. 보통, 최소의 처리를 수행하고 (수명, 양자 수율 등과 같은 광학 매개변수를 계산하기 위한 프로세서 없음), 영상이 형광 강도를 상세히 나타낸다. 질병 부위에 집중되어 더 높은 형광 강도를 생성하도록 조영제를 설계한다. 따라서, 질병 부위는 형광 강도 영상에서 포지티브 대조를 생성한다. CCD 카메라 또는 칩을 사용하여 영상을 바람직하게 수득하고, 그 결과 실시간 영상처리가 가능하다.
여기 파장은 사용된 특정한 BzpM에 의존하여 변하지만, 전형적으로 본 발명의 염료에 대해 범위 500 내지 1200 nm이다. 여기 광을 발생하기 위한 장치는 통상적인 여기 광원, 예컨대 레이저 (예를 들어, 이온 레이저, 염료 레이저 또는 반도체 레이저); 할로겐 광원 또는 제논 광원일 수 있다. 최적의 여기 파장을 얻기 위하여 다양한 광학 필터가 임의로 사용될 수도 있다. 바람직한 FRI 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다:
(i) 포유동물 신체 내의 관심있는 조직 표면을 여기 광으로 조사하는 단계;
(ii) BzpM의 여기에 의해 발생되는, 조영제로부터의 형광을 형광 검출기를 사용하여 검출하는 단계;
(iii) 형광 검출기에 의해 검출된 광을 임의로 여과하여 형광 성분을 분리해 내고;
(iv) 상기 관심있는 조직 표면의 영상을 단계 (ii) 또는 (iii)의 형광 광으로부터 형성한다.
단계 (i)에서, 여기 광은 바람직하게는 연속 파(CW) 성질이다. 단계 (iii)에서, 검출된 광을 바람직하게 여과한다. 특히 바람직한 FRI 방법은 형광 내시경이다.
여섯 번째 측면의 대안적인 영상화 방법은 FDPM (형광-도메인 광양자 이동)을 사용한다. 이것은, 조직 내에서 염료의 더욱 깊은 검출 깊이가 중요한 연속 파(CW) 방법에 비해 장점을 갖는다 [Sevick-Muraca et al., Curr.Opin.Chem.Biol., 6, 642-650 (2002)]. 이러한 주파수/시간 도메인 영상화를 위하여, BzpM가 영상화되는 병소의 조직 깊이 및 사용된 기계의 유형에 의존하여 변조될 수 있는 형광 성질을 갖는 것이 유리하다.
FDPM 방법은 다음과 같다:
(a) 불균질 조성을 가진 포유동물 신체의 광-산란 생물학적 조직을, 조영제를 여기시키기 위하여 강도를 변화시키면서, 미리 결정된 시간 동안 광원으로부터의 광에 노출시키고, 조직은 여기 광을 다중-산란시키며;
(b) 상기 노출에 반응하는 조직으로부터 다중-산란된 광 여기를 검출하는 단계;
(c) 프로세서로 다수의 값을 설정함으로써 방출로부터 조직 전체에 걸쳐서 형광 특징을 정량화하고, 각각의 값은 조직 내의 상이한 위치에서 형광 특징의 수준에 상응하며, 형광 특징의 수준은 조직의 불균질 조성에 따라 변하고;
(d) 단계 (c)의 값에 따라서 조직의 불균질 조성을 매핑(mapping)함으로써 조직의 영상을 생성한다.
단계 (c)의 형광 특징은 바람직하게는 조영제의 흡수에 상응하며, 바람직하게는 조영제를 투여하기 전에 조직의 흡착 및 산란 계수에 상응하는 많은 양을 상세히 나타내는 것을 더욱 포함한다. 단계 (c)의 형광 특징은 바람직하게는 형광 수명, 형광 양자 효율, 형광 수율 및 조영제 흡수의 적어도 하나에 상응한다. 형광 특징은 바람직하게는 방출 강도에 무관하고 조영제 농도에 무관하다.
단계 (c)의 정량화는 바람직하게는 (i) 어림값을 설정하고, (ii) 어림값의 함수로서 계산된 방출을 결정하고, (iii) 오차를 결정하기 위하여 계산된 방출을 상기 검출된 방출과 비교하고, (iv) 오차의 함수로서 형광 특징의 수정된 어림값을 제공하는 것을 포함한다. 정량화는 바람직하게는 조직의 다수의 광-산란 거동을 모형화하는 수학적 관계로부터 값을 결정하는 것을 포함한다. 첫 번째 선택사항의 방법은 상기 형광 특징의 편차를 검출함으로써 생체내에서 조직의 물질대사 성질을 모니터링하는 것을 더욱 포함한다.
포유동물 신체의 질병 상태를 수월하게 관리하는데 도움이 되도록 네 번째 측면의 광학 영상화가 바람직하게 사용된다. 용어 "관리"는 검출, 단계결정, 진단, 질병 진행의 모니터링 또는 치료의 모니터링에서 사용됨을 의미한다. 질병 상태는 적합하게는 조영제의 BTM이 연루되는 것이다. 영상화 응용은 바람직하게는 카메라-기초 표면 영상화, 내시경 및 외과적 지시를 포함한다. 적합한 광학 영상화 방법의 추가의 세부사항은 문헌 [Sevick-Muraca et al., Curr.Opin.Chem.Biol., 6, 642-650 (2002)]에서 검토된다.
다섯 번째 측면에서, 본 발명은 네 번째 측면의 생체내 광학 영상화 방법을 포함하는 포유동물 신체의 질병 상태를 검출하거나, 단계결정하거나, 진단하거나, 질병 진행을 모니터링하거나 또는 치료를 모니터링하는 방법을 제공한다.
본 발명은 하기 기재된 비-제한적 예에 의해 예증된다. 실시예 1은 생물학적 표적 펩티드 (펩티드 1)의 합성을 제공하고, 이것은 cMet에 결합된다. 실시예 2는 본 발명의 BzpM 염료를 펩티드, 특히 펩티드 1에 접합하는 방법을 제공한다. 실시예 3은 본 발명의 펩티드 1의 펩티드 접합체가 cMet에 대한 친화력을 보유하고, 다시 말해서 접합된 염료가 생물학적 결합 및 선택성을 방해하지 않는다는 것을 증명하는 데이터를 제공한다. 인간 혈청 알부민에 대해 적합히 낮은 결합 및 높은 혈장 안정성이 증명되었다. 실시예 4는, 본 발명의 펩티드 접합체가 직결장 암의 동물 모형에서 유용한 종양:배경 비율을 나타냄을 보여준다. 실시예 5는 본 발명의 염료에 대한 예측 소프트웨어의 사용을 설명하고 있으며, 본 발명의 염료가 생체내에서 잠재적으로 위험한 대사산물을 결여시킨다는 것을 증명한다. 실시예 6은 화합물 6의 독성 시험을 설명하며, 부작용에 관련된 약물 물질 없이 기대된 임상 투여량이 잘 허용됨을 보여준다.
Figure pct00029
DY-752는 DY-652와 동일한 고리 및 치환기 패턴을 갖지만, DY-652의 트리메틴 결합 대신에 펜타메틴 결합 (즉, w=2 및 R5=H)을 갖는다.
약어
통상적인 3-문자 및 단일 문자 아미노산 약어가 사용된다.
Acm: 아세트아미도메틸
ACN: 아세토니트릴
Boc: tert-부틸옥시카르보닐
DMF: N,N'-디메틸포름아미드
DMSO: 디메틸술폭시드
Fmoc: 9-플루오레닐메톡시카르보닐
HCl: 염산
HPLC: 고 성능 액체 크로마토그래피
HSPyU: O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸렌우로늄 헥사플루오로포스페이트
Ile: 이소류신
LC-MS: 액체 크로마토그래피 질량 분광법
NHS: N-히드록시-숙신이미드
NMM: N-메틸모르폴린
NMP: 1-메틸-2-피롤리디논
Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐
PBS: 포스페이트-완충 염수
TFA: 트리플루오로아세트산
Trt: 트리틸
TSTU: O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트
<실시예>
실시예 1: 펩티드 1의 합성
하기 서열을 가진 2개의 Cys-Cys 결합 (Cys4-16 및 6-14)을 갖는 26-량체 이고리형 펩티드를 사용하였다:
Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys-Trp-Cys-Tyr -Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2 ("펩티드 1")
Figure pct00030
단계 (a): 펩티드 1의 보호된 선형 전구체의 합성
전구체 선형 펩티드는 하기 서열을 갖는다.
Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2
펩티딜 수지 H-Ala-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Gly- Pro-Pro-Arg(Pbf)-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(ψMe , Mepro)-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Gly-Gly-Gly-Lys(Boc)-중합체는, 0.1 밀리몰 링크 아미드 노바겔 수지로 출발하여 Fmoc 화학을 사용하는 어플라이드 바이오시스템스 433A 펩티드 합성장치에서 조립되었다. 과량의 1 밀리몰 예비-활성화 아미노산 (HBTU 사용)을 결합 단계에서 적용하였다. Glu-Thr 슈도프롤린 (노바바이오켐 05-20-1122)을 서열에 혼입하였다. 수지를 질소 기포화장치로 옮기고, DCM (5 mL)에 용해된 아세트 안히드라이드 (1 밀리몰) 및 NMM (1 밀리몰)의 용액으로 60분 동안 처리하였다. 안히드라이드 용액을 여과에 의해 제거하고 수지를 DCM으로 세척하고 질소 흐름 하에 건조시켰다.
2.5％ TIS, 2.5％ 4-티오크레졸 및 2.5％ 물을 함유하는 TFA (10 mL) 중에서 2시간 30분 동안 측쇄 보호기의 제거와 수지로부터 펩티드의 분해를 동시에 수행하였다. 여과에 의해 수지를 제거하고, TFA를 진공 하에 제거하고 잔류물에 디에틸 에테르를 첨가하였다. 형성된 침전물을 디에틸 에테르로 세척하고 통기-건조하여 264 mg의 조 펩티드를 수득하였다.
조 펩티드를 조제 HPLC (구배: 40분에 걸쳐 20-30％ B, 여기에서 A=H2O/0.1％ TFA 및 B = ACN/0.1％ TFA, 유량: 10 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나 5μ C18 (2) 250×21.20 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 30분)에 의해 정제하여 100 mg의 순수한 펩티드 1 선형 전구체를 수득하였다. 분석 HPLC (구배: 10분에 걸쳐 10-40％ B, 여기에서 A=H2O/0.1％ TFA 및 B = ACN/0.1％ TFA, 유량: 0.3 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나 3μ C18 (2) 50×2 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 6.54분)에 의하여 순수한 생성물을 분석하였다. 전자분무 질량 분광법 (MH2 2+ 계산치: 1464.6, MH2 2+ 실측치: 1465.1)을 사용하여 추가의 생성물 특징결정을 수행하였다.
단계 (b): Cys4-16 디설파이드 다리결합의 형성
Cys4-16; Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu- Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2
단계 (a)로부터의 선형 전구체 (100 mg)을 5％ DMSO/물 (200 mL)에 용해시키고, 암모니아를 사용하여 용액을 pH 6으로 조절하였다. 반응 혼합물을 5일 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 TFA를 사용하여 pH 2로 조절하고, 대부분의 용매를 진공 하에 증발 제거하였다. 생성물 정제를 위하여 잔류물(40 mL)을 조제 HPLC 컬럼 위에 소량씩 주입하였다.
잔류물을 조제 HPLC (구배: 10분 동안 0％ B, 이어서 40분 동안 0-40％ B, 여기에서 A=H2O/0.1％ TFA 및 B=ACN/0.1％ TFA, 유량: 10 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나 5μ C18 (2) 250×21.20 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 44분)에 의해 정제하여 72 mg의 순수한 펩티드 1 일고리형 전구체를 수득하였다.
순수한 생성물 (이성질체 P1 내지 P3의 혼합물)을 분석 HPLC (구배: 10분에 걸쳐서 10-40％ B, 여기에서 A=H2O/0.1％ TFA 및 B=ACN/0.1％ TFA, 유량: 0.3 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나 3μ C18 (2) 50×2 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 5.37 분 (P1); 5.61 분 (P2); 6.05 분 (P3))에 의해 분석하였다. 전자분무 질량 분광법 (MH2 2+ 계산치: 1463.6, MH2 2+ 실측치: 1464.1 (P1); 1464.4 (P2); 1464.3 (P3))을 사용하여 추가의 생성물 특징결정을 수행하였다.
단계 (c): Cys6-14 디설파이드 다리결합의 형성 (펩티드 1)
단계 (b)로부터의 일고리형 전구체 (72 mg)을 질소 블랭킷 하에서 75％ AcOH/물 (72 mL)에 용해시켰다. AcOH (4.8 mL) 중의 1M HCl (7.2 mL) 및 0.05M I2을 그 순서대로 첨가하고 혼합물을 45분 동안 교반하였다. 1M 아스코르브산 (1 mL)을 첨가하여 무색 혼합물을 제공하였다. 대부분의 용매를 진공 하에 증발시키고 잔류물 (18 mL)을 물/0.1％ TFA (4 mL)로 희석하고 조제 HPLC를 사용하여 생성물을 정제하였다. 잔류물을 조제 HPLC (구배: 10분 동안 0％ B, 이어서 40분에 걸쳐서 20-30％ B, 여기에서 A=H2O/0.1％ TFA 및 B=ACN/0.1％ TFA, 유량: 10 mL/분, 컬럼:페노메넥스 루나 5μ C18 (2) 250×21.20 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 43-53 분)에 의해 정제하여 52 mg의 순수한 펩티드 1을 수득하였다. 분석 HPLC (구배: 10분 동안 10-40％ B, 여기에서 A=H2O/0.1％ TFA 및 B=ACN/0.1％ TFA, 유량: 0.3 mL/분, 컬럼:페노메넥스 루나 3μ C18 (2) 50×2 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 6.54 분)에 의하여 순수한 생성물을 분석하였다. 전자분무 질량 분광법 (MH2 2+ 계산치: 1391.5, MH2 2+ 실측치: 1392.5)을 사용하여 추가의 생성물 특징결정을 수행하였다.
실시예 2: 벤조피릴륨 염료의 펩티드 접합체의 합성
일반적 접합 방법
DMF (0.5 mL) 중의 펩티드 1 (실시예 1; 4 mg, 1.4 μ몰)의 용액에 DMF (0.5 mL) 중의 BzpM NHS 에스테르 (1 mg, 1 μ몰) 및 sym-콜리딘 (8 ㎕, 60 μ몰)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 60 ℃에서 1시간 동안 가열 (마이크로파 보조)한 다음, RT에서 밤새 건조하였다. 이어서, 반응 혼합물을 20％ ACN/물/0.1％ TFA (7 mL)로 희석하고, 조제 HPLC를 사용하여 생성물을 정제하였다.
정제 및 특징결정
조 펩티드를 조제 HPLC (구배: 40분에 걸쳐서 20-40％ B, 여기에서 A=H2O/0.1％ TFA 및 B=ACN/0.1％ TFA, 유량: 10 mL/분, 컬럼:페노메넥스 루나 5μ C18 (2) 250×21.2 mm, 검출: UV 214 nm)에 의해 정제하여 순수한 [펩티드 1]-BzpM 접합체를 수득하였다. 분석 HPLC (구배: 5분 동안 10-40％ B, 여기에서 A=H2O/0.1％ TFA 및 B=ACN/0.1％ TFA, 유량: 0.6 mL/분, 컬럼:페노메넥스 루나 3μ C18 (2) 20×2 mm, 검출: UV 214 nm)에 의하여 순수한 생성물을 분석하였다. 전자분무 질량 분광법을 사용하여 추가의 생성물 특징결정을 수행하였다.
제조된 화합물을 표 3에 제공한다:
Figure pct00031
실시예 3: 시험관내 형광 편광 분석
cMet 표적에 대한 조영제의 친화성 결합뿐만 아니라 혈장 단백질에 관련된 결합 성질을 검사하기 위하여 형광 편광 분석을 사용하였다. 형광 편광 방법의 원리는 다음과 같이 간략하게 설명될 수 있다:
단색 광이 수평 편광 필터를 통해 통과하고 샘플에서 형광 분자를 여기시킨다. 단지 수직 편광면에서 적합히 배향되는 분자들 만이 광을 흡착하고 여기되고, 이어서 광을 방출한다. 방출된 광을 수평 및 수직 면 양쪽 모두에서 측정한다. 이방성 값(A)은 하기 식에 따른 광 강도 간의 비율이다.
A = (수평 편광자에서의 강도 - 수직 편광자에서의 강도)/(수평 편광자에서의 강도 + 2*수직 편광자에서의 강도)
테칸 사파이어 형광 편광 평판 판독기 (미국, 테칸)를 사용하여 Ex 635/Em 678 nm에서, 384-웰 마이크로평판에서 결합 완충액 (PBS, 0.01％ 트윈-20, pH 7.5) 중의 10 ㎕의 부피로 형광 이방성 측정을 수행하였다. 염료-표지화 펩티드의 농도를 일정하게 유지하고 (5 nM), 인간 c-Met/Fc 키메라 (R&D 시스템스)의 농도를 0-250 nM로 변화시켰다. 결합 혼합물을 마이크로평판에서 30 ℃에서 10분 동안 평형화시켰다. 이방성에서의 관찰된 변화는 하기 수학식에 합치하였다:
Figure pct00032
상기 식에서, robs는 관찰된 이방성이고, rfree는 자유 펩티드의 이방성이고, rbound는 결합된 펩티드의 이방성이고, Kd는 해리 상수이다. cMet는 총 c-Met 농도이고, P는 총 염료-표지화 펩티드 농도이다. 상기 수학식은, 합성 펩티드 및 수용체가 용액에서 1:1 화학양론으로 가역적 착물을 형성하는 것을 가정한다. 시그마플롯(SigmaPlot) 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀곡선을 통해 데이터 조정을 수행하여 Kd 값을 수득하였다 (1-부위 결합).
인간 c-Met에 대한 결합에 관하여 화합물 1 내지 6을 시험하였다 (Fc 키메라). 결과 (표 4 참조)는 인간 c-Met에 대해 시험된 모든 화합물의 결합에 관하여 nM의 Kd를 나타내었다.
편광 값의 적은 변화는 생체내 사용을 위해 적합한 낮은 결합에 관련되기 때문에, 인간 혈청 알부민에 대한 화합물의 결합을 평가하기 위하여 편광 값의 변화를 사용하였다. 혈장 단백질 결합(PPB)을 비아코어(Biacore) 측정에 의해 확인하였다. 마우스 혈장에서 37 ℃에서 2시간 동안 배양한 후에 남아있는 화합물의 양을 측정함으로써 혈장 내에서 조영제의 안정성을 확인하였다.
Figure pct00033
실시예 4: 화합물 2 내지 6의 생체내 시험
(a) 동물 모형
암컷 BALB c/A 누드 (Bom) 마우스를 연구에서 사용하였다. 동물의 사용은 지역 윤리 위원회의 승인을 받았다. BALC c/A 누드는 다른 누드 마우스 종족에 비하여 인간 종양에 대해 높은 취득 비율을 가진 동종번식 면역절충된 마우스이다. 마우스는 입하 시에 8주령이었고 연구 시작 시에 대략 20그램의 체중을 가졌다. 동물을 HEPA 여과된 공기로 개별적으로 통기되는 우리 (IVC, 스캔버 BK)에 수용하였다. 동물들은 "래트 및 마우스 nr.3 사육" 식이 (스캔버 BK) 및 HCl의 첨가에 의하여 1 mM (pH 3.0)의 몰 농도까지 산성화된 수돗물에 무제한으로 접근하도록 하였다.
결장 암 세포 HT-29가 인간 결장 암종으로부터 유래되며 문헌 [Zeng et al., Clin.Exp.Metastasis, 21, 409-417 (2004)]에 따라 c-Met를 발현하는 것으로 보고된다. 세포 주는 누드 마우스에 피하 접종될 때 발암성인 것으로 입증되었다 [Flatmark et al., Eur.J.Cancer 40, 1593-1598 (2004)].
HT-29 세포를 10％ 태아 소 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 맥코이 5a 배지 (시그마 # M8403)에서 생육시켰다. 계대 수 4 (P4)로 군체를 만들고 5％ DMSO를 함유하는 각각의 배양 배지에서 107 세포/바이알로 액체 질소에서 저장하기 위해 동결시켰다. 조직 이식 일에, 세포를 37 ℃ 수욕에서 급속 (대략 2분) 해동시키고, 세척하고, PBS/2％ 혈청 (1200 rpm에서 10분 동안 원심분리)에 재현탁시켰다. 바이알에서 세포의 완전한 혼합은 매회 세포가 투여 주사기 내로 흡출되도록 보장하였다. 미세 구멍 바늘 (25 G)을 사용하여 0.1 ml 부피의 세포 현탁액을 어깨와 등에 피하 주사하였다. 이어서, 동물을 우리로 옮기고 종양을 13 내지 17일 동안 생육시켰다. 동물을 접종 절차 전에 적어도 5일의 기간 동안 순응시켰다.
(b) 절차
모든 시험 물질을 동결건조된 분말로부터 PBS로 재구성하였다. 백색 프린터 종이의 작은 더미를 영상화하여 평면(flat-field) 영상을 수득하고 이것을 조명 불균질성을 보정하기 위해 사용하였다.
광학 영상화 절차 동안의 고정화를 위하여, 담체 기체로서 산소를 사용하여 이소플루란 (전형적으로 1.3 내지 2％)에 의해 경미한 수술 수준 마취상태까지 동축 개방 마스크로 동물을 마취시켰다. 동물을 마취시키면서 수술용 겸자 및 미세한 가위를 사용하여 종양 일부 및 인접한 근육 위에서 작은 피부 조각 (3-5 mm)을 제거하였다. 겹쳐진 피부 조직으로부터의 간섭 없이 종양 및 근육으로부터 시그널을 측정하기 위하여 이것을 수행하였다. 액체, 비-형광성 붕대 스프레이 (3M, 미국 MN)를 도포함으로써 상처를 덮었다.
동물 및 직장 온도 탐침 아래에서 공기 센서를 사용하여 바이오벳 시스템 (m2m 이미징 코포레이션, 미국 NJ)에 의해 동물의 호흡 및 체온을 모니터링하였다. 바이오벳 시스템은, 영상화 절차 기간 (2시간) 동안 정상적인 체온을 유지하면서, 40 ℃로 설정된 가열 매트를 사용하여 외부 가열을 공급하였다. 대비 시약 투여를 위하여벤플론 카테터를 꼬리 정맥에 놓았다. 각각의 동물에 1회 대조 시약 주사를 제공하였다. 주입된 부피는 0.1 ml의 시험 화합물이고, 그 직후에 0.2 ml 염수로 씻어내었다. 주입 직전, 이어서 2시간 동안 매 30초 마다 형광 영상을 획득하였다.
(c) 영상화
형광 성분을 추출하기 위하여 리포터 및 여과 시스템을 여기시키기 위해 광원을 사용하는데 적합한 임상 복강경을 통해 영상화를 수행하였다. 리포터 분자의 여기를 위하여 635 nm 레이저를 사용하였다. 검출기로서 하마마쓰 ORCA ERG CCD 카메라를 사용하였다. 카메라를 0 게인에서 2×2 비닝(binning) 방식으로 작동시켰다. 결장 영상화를 위해 표준 노출 시간은 4초였다. 시스템 검정 데이터를 통해 조명 불균질성에 대하여 영상에서의 강도 분포를 보정하였다. 노출된 종양 및 정상 근육 배경 위에 놓여진 관심있는 영역으로부터 표적 대 배경 비율을 계산하였다.
(d) 결과
시험 화합물은 하기 평균 종양:근육 비율을 가졌다 (표 5):
Figure pct00034
실시예 5: 물질대사 및 독성 예측
Lhasa Ltd (22-23 브렌하임 테라스, 리드 LS2 9HD, UK)로부터 소프트웨어 도구 데렉(Derek) 및 메테오르(Meteor)를 수득하였다. 공지된 구조-의존적 독성을 기초로 하여 새로운 화학물질의 독성을 예측하기 위하여 데렉을 사용하였다. 유사하게, 메테오르는 신규 화학물질의 대사물을 예측하였다. 양쪽 도구는 화학 화합물에 대하여 공개 및 비공개 (그러나, 입증된) 데이터를 기준으로 한다. 염료 DY-652의 화학 구조를 입력하였다. 생체내에서 잠재적으로 위험한 대사물질은 예측되지 않았다.
실시예 6: 화합물 6의 독성 시험
예비임상 조영제 용량 (50 nmol/kg 체중)의 100배에서 화합물 6의 내성을 조사하기 위하여 제한된 급성 투여 독성 연구를 수행하였다.
화합물을 수컷 래트에 정맥내 주사하였으며, 주사 후 (p.i.) 1일, 14일, 21일 및 28일에 동물을 희생시켰다. 부검 시에, 전체 병변에 대하여 관심있는 기관을 조사하였으며, 이후의 조직형태학 평가를 위하여 중성 완충 포르말린에 신장을 넣었다. 주사 직후에 피부의 약한 청색 착색 및 뇨의 약간의 청색 착색이 관찰되었으며, p.i. 1일 내에 사라졌다. 부검 시에, 신장이 p.i. 1일에 녹색으로 확산되었다. 광 현미경은 신장에서 화합물 6-관련 결과를 나타내지 않았다. 보여지는 다른 작은 변화는 부수적인 것이고 젊은 실험용 래트에서 일반적이다. 신장 혈관의 강한 형광 염색이 p.i. 1일에 관찰되었다. p.i. 14일까지 염색이 감소되었으며 p.i. 21일에 대조로부터 구별될 수 없었다.
처리된 동물의 어느 것에서도 변성, 괴사 또는 염증의 증거가 관찰되지 않았으며, 이는 화합물의 콩팥독성이 낮음을 시사한다. 기대된 임상 용량의 100배에서 수컷 래트에 화합물 6을 1회 정맥내 투여하는 것은 부작용에 관련된 어떠한 약물 물질 없이 잘 허용되는 것으로 결론내려졌다.

Claims (27)

  1. 하기 화학식 I의 접합체를 포함하는 포유동물 신체의 생체내 광학 영상화에 적합한 조영제를 생체친화성 담체와 함께 포함하는, 포유동물 투여에 적합한 형태의 제약 조성물.
    <화학식 I>
    Figure pct00035

    상기 식에서,
    BTM은 생물학적 표적 잔기이고;
    n은 0 또는 1의 정수이고;
    L은 화학식 -(A)m-의 합성 링커 기이고, 여기에서 m은 1 내지 20의 정수이고 각각의 A는 독립적으로 -CR2-, -CR=CR-, -C≡C-, -CR2CO2-, -CO2CR2-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO2NR-, -NRSO2-, -CR2OCR2-, -CR2SCR2-, -CR2NRCR2-, C4-8 시클로헤테로알킬렌 기, C4-8 시클로알킬렌 기, C5-12 아릴렌 기, 또는 C3-12 헤테로아릴렌 기, 아미노산, 당 또는 단분산 폴리에틸렌글리콜(PEG) 구성 블록이고; 여기에서 각각의 R은 독립적으로 H, C1-4 알킬, C2-4 알케닐, C2-4 알키닐, C1-4 알콕시알킬 또는 C1-4 히드록시알킬로부터 선택되고;
    BzpM는 하기 화학식 II의 벤조피릴륨 염료이며
    <화학식 II>
    Figure pct00036
    ;
    여기에서, Y1는 하기 화학식 Ya 또는 Yb의 기이고
    <화학식 Ya>
    Figure pct00037

    <화학식 Yb>
    Figure pct00038
    ;
    R1 내지 R4 및 R9 내지 R13은 독립적으로 H, -SO3M1, Hal, Ra 또는 C3 -12 아릴로부터 선택되고, 각각의 M1은 독립적으로 H 또는 Bc이고, Bc는 생체친화성 양이온이고;
    R5은 H, C1 -4 알킬, C1 -6 카르복시알킬, C3 -12 아릴술포닐, Cl이거나, 또는 R5은 임의로 R6, R14, R15 또는 R16 중 하나와 함께 5-원 또는 6-원 불포화 지방족, 불포화 헤테로지방족 또는 방향족 고리를 형성할 수 있고;
    R6 및 R16은 독립적으로 Ra 기이고;
    R7 및 R8은 독립적으로 C1 -4 알킬, C1 -4 술포알킬 또는 C1 -6 히드록시알킬 또는 임의로 R9 및/또는 R10 중 하나 또는 둘다와 함께 5-원 또는 6-원 N-함유 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴 고리를 형성할 수 있고;
    X는 -CR14R15-, -O-, -S-, -Se-, -NR16- 또는 -CH=CH-이고, 여기에서 R14 내지 R16은 독립적으로 Ra기이며;
    Ra은 C1-4 알킬, C1-4 술포알킬, C1-6 카르복시알킬 또는 C1 -6 히드록시알킬이고;
    w는 1 또는 2이고;
    J는 생체친화성 음이온이며;
    단 BzpM는 R1 내지 R16 기로부터 선택된 하나 이상의 술폰산 치환기를 포함한다.
  2. 제1항에 있어서, BzpM가 하기 화학식 IIa인 조성물.
    <화학식 IIa>
    Figure pct00039
  3. 제1항에 있어서, BzpM가 하기 화학식 IIb인 조성물.
    <화학식 IIb>
    Figure pct00040
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, BzpM가 2 내지 4개의 술폰산 치환기를 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, BzpM가 하나 이상의 C1-4 술포알킬 치환기를 포함하는 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 술포알킬 치환기가 화학식 -(CH2)kSO3M1 (여기에서, M1은 H 또는 Bc이고, k는 1 내지 4의 정수임)인 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, w가 1인 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R5가 H인 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, X가 -CR14R15-인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, BzpM가 하기 화학식 III인 조성물.
    <화학식 III>
    Figure pct00041

    상기 식에서, Y1, R1 내지 R4, R6, R14, R15 및 J는 제1항에 정의된 것과 같다.
  11. 제10항에 있어서, 하기 화학식 IIIc, IIId 또는 IIIe인 조성물.
    <화학식 IIIc>
    Figure pct00042

    <화학식 IIId>
    Figure pct00043

    <화학식 IIIe>
    Figure pct00044

    상기 식에서,
    M1은 제1항에 정의된 바와 같고;
    R17 및 R18은 독립적으로 C1-4 알킬 또는 C1-4 술포알킬로부터 선택되고;
    R19은 H 또는 C1 -4 알킬이고;
    R20은 C1-4 알킬, C1-4 술포알킬 또는 C1-6 카르복시알킬이고;
    R21은 C1-4 술포알킬 또는 C1-6 카르복시알킬이고;
    R22은 C1-4 알킬, C1-4 술포알킬 또는 C1-6 카르복시알킬이고;
    X2, X3 및 X4는 독립적으로 H 또는 C1 -4 알킬이다.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, BTM이
    (i) 3 - 100량체 펩티드;
    (ii) 효소 기질, 효소 길항질 또는 효소 억제제;
    (iii) 수용체-결합 화합물;
    (iv) 올리고뉴클레오티드;
    (v) 올리고-DNA 또는 올리고-RNA 단편으로부터 선택되는 것인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, BTM이 3-100량체 펩티드인 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 화학식 IVa 또는 IVb인 조성물.
    <화학식 IVa>
    Figure pct00045

    <화학식 IVb>
    Figure pct00046

    상기 식에서,
    Z1은 BTM 펩티드의 N-말단에 부착되고, H 또는 MIG이며;
    Z2는 BTM 펩티드의 C-말단에 부착되고, OH, OBc 또는 MIG이고,
    여기에서 Bc는 제1항에 정의된 바와 같고,
    MIG은 BTM 펩티드의 효소 물질대사를 억제하거나 저지하는 생체친화성 기인 물질대사 억제기이다.
  15. 제14항에 있어서, Z1 및 Z2가 각각 독립적으로 MIG인 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명의 환자에 적합한 용량을 갖고 적합한 주사기 또는 용기에 제공되는 조성물.
  17. 생체친화성 담체의 무균 공급에 의해 재구성될 때 용해가 일어나서 원하는 제약 조성물을 수득하도록, 제1항 내지 제15항에 정의된 화학식 I의 접합체를 무균 고체 형태로 포함하는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 제조하기 위한 키트.
  18. 제17항에 있어서, 무균 고체 형태가 동결건조된 고체인 키트.
  19. 하기 화학식 I의 접합체.
    <화학식 I>
    Figure pct00047

    상기 식에서, L 및 n은 제1항에 정의된 것과 같고, BzpM는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같고, BTM'는 제12항 또는 제13항에 정의된 BTM이고, 또한 합성된 것이다.
  20. 생체내에서 BTM의 국재화 부위의 영상을 얻기 위하여 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 사용하는 것을 포함하는, 포유동물 신체의 생체내 광학 영상화 방법.
  21. 제20항에 있어서, 제약 조성물이 상기 포유동물 신체에 미리 투여되는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    (i) 포유동물 신체 내의 관심있는 조직 표면을 여기 광으로 조사하는 단계;
    (ii) BzpM의 여기에 의해 발생되는 조영제로부터의 형광을 형광 검출기를 사용하여 검출하는 단계;
    (iii) 형광 검출기에 의해 검출된 광을 임의로 여과하여 형광 성분을 분리하는 단계; 및
    (iv) 단계 (ii) 또는 (iii)의 형광 광으로부터 관심있는 조직 표면의 영상을 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 단계 (i)의 여기 광이 연속 파(CW) 성질인 방법.
  24. 제21항에 있어서,
    (a) 불균질 조성을 가진 포유동물 신체의 광-산란 생물학적 조직을, 조영제를 여기시키기 위하여 강도를 변화시키면서, 미리 결정된 시간 동안 광원으로부터의 광에 노출시키고, 여기서 조직은 여기 광을 다중-산란시키는 것인 단계;
    (b) 상기 노출에 반응하는 조직으로부터 다중-산란된 광 여기를 검출하는 단계;
    (c) 프로세서로 다수의 값을 설정함으로써 방출로부터 조직 전체에 걸쳐서 형광 특징을 정량화하고, 여기서 각각의 값은 조직 내의 상이한 위치에서 형광 특징의 수준에 상응하며, 형광 특징의 수준은 조직의 불균질 조성에 따라 변하는 것인 단계; 및
    (d) 단계 (c)의 값에 따라서 조직의 불균질 조성을 매핑(mapping)함으로써 조직의 영상을 생성하는 것을 포함하는 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 영상화 방법이 형광 내시경을 포함하는 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 신체의 질병 상태를 검출하거나, 단계결정하거나, 진단하거나, 질병 진행을 모니터링하거나 또는 치료를 모니터링하는 것을 돕기 위하여 생체내 광학 영상화가 사용되는 방법.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항의 생체내 광학 영상화 방법을 포함하는, 포유동물 신체의 질병 상태를 검출하거나, 단계결정하거나, 진단하거나, 질병 진행을 모니터링하거나 또는 치료를 모니터링하는 방법.
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