KR20100048969A - 저 자극 효과를 갖는 여주 추출물을 함유하는 화장료조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 여주( Momordica charantia L.)열매의 추출물을 함유하는 화장료용 피부 자극 완화제에 관한 것이다.본 발명에 따른 여주 열매 추출물은 항염증 작용 및 항알레르기 작용에 의한 피부 진정효과를 갖으며, 피부에 도포 시 염증, 알레르기, 부종, 홍반 등과 같은 자극의 완화와 예방 효과가 우수하여 화장료로 사용가능하다.

Description

저 자극 효과를 갖는 여주 추출물을 함유하는 화장료조성물{The cosmetic composition including Momordica charantia L.extract showing low irritation effect on the skin}

본 발명은 여주( Momordica charantia L.)열매의 추출물을 함유하는 화장료용 피부 자극 완화제에 관한 것이다. 보다 상세하게는 항염증작용, 항알레르기 작용을 하며 피부에 도포 시에 발생될 수 있는 염증, 알레르기, 부종, 홍반 등과 같은 피부자극의 예방 및 완화 효과가 우수하고, 부작용이 매우 적은 여주 열매 추출물을 함유하는 화장료에 관한 것이다.

사람의 피부표면은 피지선에서 분비되는 피지와 땀샘에서 나오는 수분이 자연적으로 잘 혼합된 피지막이 각질층을 덮고 있어서, 매끄럽고 윤기 있으며 촉촉한 상태로 유지된다. 이러한 피부 각질층의 수분 함량이 약 20% 일 때 피부는 가장 이상적이고 아름다운 상태가 된다. 그러나 신지대사 작용의 이상으로 인해 피부 각질층의 수분 함량이 10% 이하로 떨어지게 되면 피부에서 각질이 떨어져 나가게 되고 이물질의 침투가 용이하게 되어 각종 염증 및 알레르기가 유발되기 쉬워진다. 특히, 노화가 진행됨에 따라 피부의 신진대사가 원활하지 못하므로 피부에 대한 각종 염증 및 알레르기는 가중되게 된다.

또한, 건조한 실내환경, 공해, 자외선, 바람, 오용된 화장품이나 세제류 등 피부자극에 의해 피부가 민감해져가는 사람들이 증가하고 있다. 외부 자극에 의해 민감해진 피부는 홍반과 같이 단순히 가시적인 경우도 있으며, 또한, 가려움, 따가움 등과 같이 몹시 심하고 불쾌한 염증반응을 나타내는 경우가 있으므로 대중적인 피부 화장료 조성물을 사용하기에는 약간 부담스럽고 지속적으로 사용하는 것을 자제하게 된다.

화장품은 피부를 보호하고 미화 청결을 위해 사용하는 제품이지만 화장품 조성물을 구체적으로 살펴보면, 본래의 피부 보호 목적과는 상이한 성분들이 제품형성에 필수 불가결한 존재로써 사용되고 있다. 예를 들면 가용화제, 유화제, 방부제, 향료, 자외선 차단제 및 기타 효능, 효과를 부여하기 위해 사용되는 여러 가지 부가물들을 들 수 있는데, 일반적으로 이러한 성분들이 피부에 염증, 알레르기, 뾰루지 또는 부종 등을 유발하는 주원인 물질로 알려져 있다.

염증은 세포나 조직이 어떠한 원인에 의해 손상을 받으면 그 반응을 최소화하고 손상된 부위를 원상으로 회복시키려는 일련의 방어목적으로 나타나는 것이며 염증을 유발하는 원인으로 외상, 화상, 동상, 방사능 등에 의한 물리적 요인과 산이나 염기와 같은 화학물질에 의한 화학적 요인, 항체반응에 의한 면역학적 요인들이 있으며 그 외에 혈관이나 호르몬 불균형에 의해서도 일어난다.

히스타민은 가려움과 통증을 매개하는 물질로서 가장 잘 알려진 물질이다. 지금까지 밝혀진 바에 의하면 가려움증을 감지하는 특정한 수용기는 없으며, 국부적인 통증과 같이 상피세포나 진피와 표피사이의 간극에 존재하는 불특정한 자율신경 말단에 의한 것으로 추측되고 있다. 가려움증과 통증을 매개하는 물질들은 주로 비만세포로부터 유리되며 Fcε RIα 수용체의 교차결합에 의해 유리된다. 또한, 히스타민은 Fcε RIα 수용체와는 별도로 기질 P, 간세포인자, 혈관 작용성 장 펩티드 등의 염증 매개체에 의해서도 피부 비만 세포로부터 유리될 수 있다.

이에 대하여 현재까지 홍반이나 부종 같은 자극 및 염증을 완화시키는 목적으로 사용될 수 있는 화학물질로는 비스테로이드계 물질로서 프루페나믹산(flufenamic acid), 이부프로펜(ibuprofen), 벤지다민(benzydamine), 인도메타신 (indomethacin)등이 있으며 스테로이드계 물질로서는 프레드니솔론(prednisolone), 덱사메타손(dexamethasone)등이 있고(김창종, 병태생리학, 한림상사, p61-69, 1988), 그 외에 알란토인, 아즈렌, ε-아미노카프론산, 하이드로코티존(ⅴ), 감초산 및 그 유도체(β-글리칠레친산, 글리칠레친산유도체)등도 항염증에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(광정무부, 신화장품학, 남산당, p162, 1993).

그러나 화장품에 있어서 피부 부작용 유발요인은 항상 잠재되어 있는 것이므로 이를 해결하기 위해 여러 가지 연구가 진행되어 왔는데, 그 결과 항염증제로 사용되고 있는 인도메타신은 화장료에는 사용할 수 없는 물질이고 히이드로코티존은 장기간 사용 시 피부위축, 혈관확장, 탈색, 자반 등이 생기고 피부의 약화가 일어나고 약화된 피부로 인해 모세혈관이 드러날 수 있다. 또한, 내성이 생겨 사용할수록 효과가 떨어지게 되며 특히 사용중단에 따른 요요현상이 나타난다. 이러한 부작용이 발생하기 때문에 사용이 제한되어 있다. 감초산 및 그 유도체는 안정화시키기 어렵거나 용해도가 좋지 않아 실제 제품화를 하는 경우 한정된 농도로 인해 실질적인 효과를 거두기가 어려운 점이 있는 등 지금까지 알려진 항염증제들은 피부안전성 면이나 화장료 배합시의 안정성 면에서 대부분 문제점을 가지고 있어서 그 사용이 제한되고 있다.

최근에는 소비자들의 욕구에 부응하기 위하여 자극 및 염증을 완화시키는 목적으로 사용될 수 있는 천연 원료를 이용한 화장료에 대한 연구개발이 활발히 진행되고 있다.

본 발명의 목적은 여주(Momordica charantia L.) 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료용 피부자극 완화제를 제공하는 것이다. 보다 상세하게는 차란틴(Charantin)성분을 함유하는 여주 열매 추출물을 피부에 도포하였을 때 항염증작용, 항알레르기 작용에 의한 피부 진정효과를 나타내며 이에 따른 피부자극의 예방 및 완화 효과가 우수하며, 부작용이 매우 적은 안전한 화장료를 제공하는 것이다.

특히 본 발명의 여주 열매 추출물 성분인 차란틴(Charantin)은 그 화학적 구조를 살펴 볼 때 유사 스테로이드 구조가 사포닌에 결함되어 있어 여주 열매 추출물을 피부에 지속적으로 도포할 경우 나타나는 효과 및 효능이 있을 것으로 예상하여 본 발명자들은 연구를 하게 되었으며 그 결과 피부 자극 완화 작용이 있음을 발견하여 본 발명이 이루어지게 되었다.

본 발명의 여주 열매는 Bitter Melon이라고 불리며 학명은 Momordica charantia L. 이다. 열대지방이 주산지이며 오래전부터 채소로서 상식되어 왔다.

매우 쓴 맛을 지니고 있으며 중의학에서는 이 열매가 열을 다스리고 구갈을 없애며 혈당을 떨어뜨리는 약효를 가졌다고 알려져 있다. 특히 혈당을 떨어뜨리는 약효가 있어 당뇨병 치료를 하는 민간 약재로 많은 주목을 받고 있다.

주요 성분으로 사포닌 성분인 차란틴(Charantin), 인슐린 작용을 하는 펩타이드, 알칼로이드 류가 알려져 있으며 비타민 C와 무기질이 풍부한 건강식품으로 인정받고 있다.

본 발명자는 여주 열매 추출물의 용도에 대하여 계속 연구한 결과 상당한 수준의 피부자극완화 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 여주( Momordica charantia L.)열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료용 피부 자극 완화제에 관한 것으로서, 특히 여주열매 추출물은 항염증작용, 항알레르기 작용을 하며 피부 진정효과를 가지며 따라서 피부에 도포 시 염증, 알레르기, 부종, 홍반 등과 같은 피부자극의 완화와 예방 효과가 우수하고, 또한, 부작용이 매우 적어 성인뿐만 아니라 유아의 피부에 있어서도 안전하게 피부자극을 완화 시킬 수 있는 화장료를 제공하는 매우 유용한 발명이다.

아래 실시 예들의 효능 및 효과를 알기 위한 실험방법들은 대한민국 특허 제 10-0702327의 실시 예에 준하였으며 본 발명의 내용이 아래 실시 예에만 국한되지는 않는다.

본 발명은 여주(Momordica charantia L.) 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료용 피부 자극 완화제에 관한 것이다. 보다 상세하게는 항염증작용, 항알레르기 작용을 하며 피부 진정효과를 갖는 여주 열매 추출물을 함유함으로써 피부에 도포를 하게 되면 염증, 알레르기, 부종, 홍반 등과 같은 피부자극의 예방 및 완화 효과가 우수하며, 부작용이 매우 적어 성인뿐만 아니라 유소아에게도 적용가능한 안전한 화장료에 관한 것이다.

본 발명의 여주 열매 추출물은 다음과 같은 방법으로 제조한다.

1) 건조된 여주 열매를 중량에 대하여, 추출 용매로서 물이나 무수 또는 함수 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 벤젠, 클로로포름, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나이상의 용매를 5~20배 부피량을 가한다. 추출 방법으로는 냉각 콘덴서가 장치되어 용매가 증발되는 것을 방지한 상태에서 50~100℃, 3~20시간 가열하여 추출하거나 5~37℃에서 1~15일간 침적시켜 유효성분을 추출하는 방법을 사용할 수 있으며 두 추출방법을 모두 활용할 수도 있다. 이렇게 추출한 여주 열매 추출물을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 완전히 감압 농축한 후 동결건조나 분무 건조하여 건조 추출물을 얻는다.

2) 얻어진 추출물을 증류수에 현탁을 시킨 다음 헥산과 메틸렌클로라이드, n-부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하였으며 n-부탄올 분획의 용매를 감압 농축한 후 동결건조 또는 분무 건조하여 건조 추출물을 얻는다.

여주 열매 추출물은 고형분 환산으로 0.01 내지 10.0 중량%의 넓은 범위에서 적절히 선택하여 사용할 수 있으며 바람직하게는 3.0 내지 10.0 중량%를 사용한다.

3) 얻어진 추출물은 차란틴(Charantin) 표준품을 지표 물질로 하여 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정량 분석을 하였을 때 고형분 환산으로 하여 적어도 1%(w/v) 이상의 차란틴(Charantin)이 함유된 것으로 한다.

본 발명의 화장료에는 이외에도 제제학적으로 알려져 있는 통상의 여러 가지 첨가제를 함유할 수 있으며 착색제, 착향제,현탁화제, 유화제, 용해보조제, 안정제, 등장제, pH조절제, 점도조절제, 용제 등을 포함한다.

또한, 본 발명의 화장료는 사용 용도와 사용방법에 따라 적절한 첨가제를 함유하여 여러 가지 종류의 화장료 조성물로 제조될 수 있다. 마사지 크림, 영양 에센스,

유화형 파운데이션 등으로 제조하여 사용할 수 있으며, 유아전용 화장수(스킨로션), 로션, 크림, 자외선차단 로션, 자외선 차단 크림 등으로 제조하여 사용할 수 있고, 또한, 유아전용 목욕 세정제, 샴푸, 비누 등으로 제조하여 사용할 수 있다.

상기 언급한 화장료의 종류만으로 본 발명을 한정하지 않으며 다양한 제형의 화장료에도 본 발명의 여주열매 추출물의 적용이 가능하다.

실시 예 1: 여주 열매 추출물의 항염증 실험(IL-1α 방출량 측정)

여주 열매 추출물의 항염증 효과를 알아보기 위해 95% 에탄올로 추출하여 여과한 후 감압 농축 후 시료로 사용하였다. 진피를 배양하여 자극을 유발시킨 후 각 부위별 추출물의 IL-1α의 방출량을 알아보았다.

IL-1α(interleukin-1α)는 염증 작용인자 전단계 물질(pre-inflammatory mediator)로 작용하는 세포간 신호물질(cytokine)로서 염증, 감염 등에 의한 자극에 골형성세포, 단핵세포, 대식세포, 각질형성세포, 간세포, 섬유아세포 등이 일시적으로 증식되게 한다.

또한 IL-1α는 상처의 재-상피화(re-epithelialization)의 잠재적인 유도체로서 작용할 뿐만 아니라 알레르기 반응과 염증성 반응 조절인자로서 백혈구 운동을 촉진시키는 류코트리엔 B4, 5-, 12-, 15 HETE와 같은 아라키돈산 리폭시게나제 대사산물의 생산을 증진시키는 것으로 알려져 있다.

실험 순서는 TypeⅠ 콜라겐 매트릭스(Bioland, Korea)와 5배로 농축된 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle Medium, GIBCO BRL, USA), 그리고 2.2% 탄산수소나트륨과 200mM HEPES, 0.05N 수산화나트륨으로 제조된 완충용액을 7:2:1로 섞어 만든 인간 섬유아세포 cell line(ATCC, Cat. No. CRL-2076) 을 밀도 1×105 cells/㎖로 혼합하여 직경 10mm의 인써트에 각각 200㎕의 섬유아세포가 혼합된 콜라겐용액을 넣어 진피를 제조한다.

진피 제조 후 10% FBS를 함유하는 DMEM를 2일마다 교체하여 7일간 배양한다. 배양된 진피위에 10 ㎕의 피부자극물질인 SLS(sodium lauryl sulfate)를 투여하고 4 시간 뒤 각각의 추출물을 10 ㎕ 적용한 후 37 ℃, 5% CO2에서 24 시간 동안 배양한다. SLS 와 추출물의 용매는 DMSO를 사용했으며 농도는 용액에 대한 독성 물질의 중량 퍼센트로 하였다. IL-1α는 배지 표본을 취하여 Human IL-1α assay kit(Endogen Inc. Boston, MA, USA)을 이용하였으며 ELISA-reader (enzyme-linked immunosorbent assay)로 450 nm에서 측정하였다. 그 결과는 표1에 나타내었다.

진피에서의 항염증 효과

시료	추출물 농도(μg/ml)	IL-1α방출량(ρg/ml)
SLS	0.07	82
여주열매추출물	100	52

표 1의 실험결과, IL-1α 방출량이 감소한 수치를 보여 항염증효과가 있는 것으로 나타났다.

실시예 2

완전 건조시킨 여주열매 추출물 500g 을 95% 에탄올 10kg에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 5시간 동안 끓여서 추출한 후, 400 메쉬 여과포로 여과하고 상온으로 냉각하였다. 냉각한 후 15℃에서 7일간 방치하여 숙성시킨 후 와트만 2번 여과지로 여과 하였다.

이 추출물을 0.45㎛ 의 필터로 다시 여과한 후 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압 농축하여 여주 열매 추출물 20.2g(건조중량)을 얻었다.

실시예 3

실시예 1의 감압농축물을 증류수에 현탁을 시켜 헥산 1kg을 사용하여 헥산 분획물을 제거한 다음 수층을 메틸렌클로라이드 1kg으로 현탁시켜 메틸렌클로라이드 층을 제거하고 수층을 수득하였다. 상기 수득된 수층에 n-부탄올 1kg을 현탁시켜 수층을 제거하고 n-부탄올 층을 취하여 이를 감압 농축하여 여주 열매 추출물 8.6g(건조중량)을 얻었다.

실시예 4~10

하기 표 2의 용매를 사용하여 실시 예 1과 동일한 방법으로 추출한 결과를 하기 표 2에 기재하였다.

실시예 4~10

하기 표 2의 용매를 사용하여 실시 예 1과 동일한 방법으로 추출한 결과를 하기 표 2에 기재하였다.

실시예 4~10의 실험조건

	용매	건조중량(g)
실시예 4	정제수	13
실시예 5	30% 에탄올	20
실시예 6	30% 글리세린	15
실시예 7	30% 부틸렌글리콜	13
실시예 8	80% 메탄올	19.5
실시예 9	80% 아세톤	15
실시예 10	에틸아세테이트	3

상기 여주 열매 추출물에 대하여 알레르기 및 염증으로 인한 손상으로부터의 피부보호 효과 측정을 위하여 다음과 같이 실험을 하였다.

실험 1. 알레르기 유발 여부 평가(LLNA assay)

여주열매 추출물에 대한 알레르기 유발여부를 확인하기 위하여 국부임파절평가 (LLNA:local lymph node assay)를 실시하였다. 일주일간의 순화기간을 거친 마우스를 사용하여 3일 동안 하루 한번씩 여주열매 추출물을 마우스 귀에 25㎕씩 도포하였으며, 4일째에 임파절을 떼어내어 임파구를 분리한 후 5% 이산화탄소 배양기에서 24~48시간 배양을 하고 그 후에 증폭정도를 방사선 동위원소 [3H]-메칠티미딘 의 삽입량으로 측정하고 그 결과를 표 3에 나타내었다. 국부임파절평가(LLNA)결과는 대조군에 대한 시료군의 임파구 증폭정도로 나타내며 시료의 자극지수(S.I : stimulation index)가 3 이상일 경우 항원으로 간주한다.

여주열매 추출물의 알레르기 유발 여부 평가 결과

시 료	여주 열매 추출물의 최종농도(㎍/ml)	평균 cpm	자극지수(S.I)
에탄올(60%)	100	2261 ± 121	-
실시 예 2	100	2993 ± 231	1.32
실시 예 3	100	4238 ± 241	1.87
실시 예 4	100	4548 ± 331	2.01
실시 예 5	100	4522 ± 135	2.00
실시 예 6	100	4002 ± 195	1.77
실시 예 7	100	3566 ± 301	1.58
실시 예 8	100	4577 ± 302	2.02
실시 예 9	100	4321 ± 125	1.91
실시 예 10	100	1200 ± 120	1.01

※ cpm(counter per minute) : [3H]-메칠티미딘 이 세포 내로 삽입되는 양

※ S.I : 시료의 평균 cpm을 대조군의 평균 cpm으로 나눈 값

표 3에서 보는 바와 같이 모든 여주 열매 추출물의 자극지수(S.I)가 3 이하로서

알레르기 유발 가능성이 거의 없는 것으로 나타났다.

실험 2. 항알레르기 실험 (β-hexosaminidase 방출량 측정)

β-헥소사미니다제(β-hexosaminidase)는 비만세포(mast cell)에 함유되어 있는 효소로서 비만세포가 면역반응에 의해 활성화되면 히스타민과 함께 방출된다. 그러므로, β-헥소사미니다제를 비만세포의 탈과립 지표로 사용할 수 있다(Planta Med. 64, 577-578 (1998)).

RBL-2H3 cell을 10% FBS과 글루타민을 함유하고 있는 EMEM(Eagle's Minimum Essential Medium)배지로 배양한다.

24well plate에 세포를 well당 5x105 개로 분주하며 이 때 사용되는 배지는 EMEM배지에 0.5㎍/㎖의 마우스 단일클론 면역글로불린 E(mouse monoclonal IgE)가 함유된 것을 사용하고, 24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양한다.

세포를 well 당 시라가니안버퍼 I(siraganian buffer I)(pH 7.2, 염화나트륨 119 mM, 염화칼륨 5 mM, 염화마그네슘 0.4mM, PIPES 25mM 및 수산화나트륨 40 mM 함유) 500㎕를 사용하여 헹구어 내고, 시라가니안 버퍼 II(글루코오스 5.6mM, 염화칼륨 1 mM 및 0.1% BSA가 추가됨) 160㎕를 첨가한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 10분 동안 배양한다.

여주 열매 추출물을 처리한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 20분 동안 배양하고 10분간 항원(1㎍/㎖, DNP-BSA)을 처리한다. 10분간 빙욕(ice bath)을 시켜 반응을 정지시키고 원심분리를 한다.

상층액에 기질(1mM ρ-니트로페닐-N-아세틸-β-D-글루코사미니드) 20㎕를 처리한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 배양하고 0.1M Na2CO3/NaHCO3를 넣어 반응을 정지시킨다. ELISA reader를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하고 그 억제율을 다음과 같이 계산하였으며 그 결과는 표 4와 같다.

시 료	반응액중에 함유시킨 여주 열매 추출물의 최종농도(㎍/ml)	억제율(%)
실시예 2	200	21.3
실시예 3	200	27.1
실시예 4	200	34.8
실시예 5	200	20.1
실시예 6	200	15.3
실시예 7	200	37.2
실시예 8	200	39.5
실시예 9	200	28,3
실시 예 10	200	26.5

※ 억제율(%) = S1-(B-C-D)/(A-C-D) i×100

A(대조군) : 여주 열매 추출물을 첨가하지 않은 것 (항원 IgE 반응 측정)

B(처치군) : 여주 열매 추출물을 첨가한 것 (항원 IgE 반응 측정)

C(blank) : 여주 열매 추출물과 기질만 ELISA plate에 첨가한 것

D(무처치군) : 항원, IgE 및 여주 열매 추출물을 첨가하지 않은 것

실험3. 마우스 귀 부종에 대한 항염증 실험

여주열매 추출물에 대한 항염증 효과를 알아보기 위하여 마우스 귀 부종법을 실시하였다.

일주일간의 순화기간을 거친 마우스를 대상으로 하여 한 개의 시료 당 3마리의 마우스를 사용하였다. 마우스 좌측 귀를 대조부위, 우측귀를 시험부위로 하였으며 먼저 양쪽 귀의 두께를 측정하였다. 시료를 적용하기 전에 에탄올로 귀를 깨끗하게 세척하였으며 시료 20㎕/ear를 1일 1회 4일간 지속적으로 도포하였다.

마지막 도포 1시간 후에는, 좌측 귀에는 에탄올을 우측 귀에는 리키돈산(Arachidonic acid)을 2㎎/ear을 도포하였으며 1시간 후에 귀의 부종(ear edema)정도를 마이크로 미터로 양쪽 귀를 3회씩 반복하여 측정하였다.

항염효과는 아라키돈산 처리군을 기준으로 부종억제 정도로 판정하였으며 그 결과를 표 5에 나타내었다.

국소적용에 의한 귀 두께 및 염증 억제율

시 료	반응액중에 함유시킨 추출물의 농도(㎍/ml)	용매	귀두께 평균(㎛)		억제율(%)
			시료처리전	시료처리후	45.6
인도메타신	1.0	에탄올	284	421	-
아라키돈산	2mg/ear	에탄올	299	551	21.4
실시예 2	10	에탄올	279	477	25.0
실시예 3	10	에탄올	283	472	14.3
실시예 4	10	에탄올	279	495	16.4
실시예 5	10	에탄올	288	499	12.4
실시예 6	10	에탄올	284	505	13.8
실시예 7	10	에탄올	294	511	19.6
실시예 8	10	에탄올	295	498	15.3
실시예 9	10	에탄올	293	506	17.4
실시예 10	10	에탄올	295	503

※ 억제율(%) = (A―B) / A × 100

A : 대조군 귀의 평균두께(아라키돈산 처리 귀의 두께-비처리 귀의 두께)

B : 시료도포군 귀의 두께(에탄올 처리 귀의 두께-비처리 귀의 두께)

표 5에 의하면 인도메타신보다는 낮지만 모든 시료에 있어서 12.4~25%의 항염증 억제효과가 있어 여주열매 추출물이 항염증에 대한 예방 및 치료 효과가 있음을 알 수 있으며 특히 실시예 3에서 25%의 높은 억제효과가 있음을 알 수 있다.

실험4. 3차원 인공피부에서의 항염증 효과(IL-1α 방출량 측정)

IL-1α(interleukin-1α)는 전-염증 작용인자 (pre-inflammatory mediator)로 작용하는 세포간 신호물질(cytokine)로서 염증, 감염 등에 의한 자극에 의해 골형성세포, 단핵세포, 대식세포, 각질형성세포, 간세포, 섬유아세포 등이 일시적으로 증가함으로써 생산되는 물질이다. 또한 IL-1α는 상처의 재-상피화(re-epithelialization)의 잠재적인 유도체로서 작용할 뿐만 아니라 알레르기 반응과 염증성 반응 조절인자로서 백혈구 운동을 촉진시키는 류코트리엔 B4(leukotriene B4), 5-, 12-, 15 HETE와 같은 아라키돈산 리폭시게나제 대사산물의 생산을 증진시키는 것으로 알려져 있다. 3차원 인공피부를 배양하여 자극을 유발시킨 후 여주열매 추출물에 의한 IL-1α방출량의 변화를 알아보았다.

TypeⅠ 콜라겐 매트릭스(Bioland, Korea)와 5배로 농축된 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle Medium, GIBCO BRL, USA), 그리고 2.2% 탄산수소나트륨과 200mM HEPES, 0.05N 수산화나트륨으로 제조된 완충용액을 7:2:1로 섞어 만든 인간 섬유아세포 cell line(ATCC, Cat. No. CRL-2076)을 밀도 1×105 cells/ml로 혼합하여 직경 10mm의 인써트(insert)에 각각 200㎕의 섬유아세포가 혼합된 콜라겐 용액을 넣어 진피를 제조한다. 진피 제조 후 10% FBS를 함유하는 DMEM배지를 2일마다 교체하여 7일간 배양한다. 배양된 진피위에 정상 각질세포를 3×105 세포/인써트로 접종한다.

DMEM (10% FBS)와 K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium, GIBCO, USA) (이것은 EGF(epidermal growth factor) 및 BPE(bovine pituitary extract)와 함께 제공됨)를 1:1로 섞은 배지를 넣고 7일간의 잠수배양(submerge culture)을 한 후에 기체-액체 계면배양(air-liquid interface culture)을 하기 위하여 인써트 안의 배지는 제거하고 인써트 밖에만 잠수배양시 사용한 배지를 사용하여 14일 동안 기체-액체 계면배양을 하였다. 배양된 인공피부의 배양배지를 모두 제거한 다음 새 배지를 조직 배양 용기밖에 1.5 ㎖을 넣는다. 인써트 내에 피부자극물질로서 10 ㎕의 라우릴황산나트륨(SLS : Sodium Lauryl Sulfate)을 투여하고 4 시간 뒤 여주열매 추출물을 10 ㎕ 적용한 후 37 ℃, 5% CO2에서 24 시간 동안 배양한다. SLS 와 여주열매 추출물의 용매는 DMSO를 사용했으며 농도는 용액에 대한 물질의 무게 퍼센트로 하였다. IL-1α방출량 측정을 위해 배지 표본을 취하여 Human IL-1α assay kit(Endogen Inc. Boston, MA, USA)을 이용하였으며,

ELISA-reader(enzyme-linked immunosorbent assay)로 450 nm에서 측정하였고 그 결과는 표 6에 나타내었다.

3차원 인공 피부에서의 항염증 효과

시 료	반응액중에 함유시킨 여주열매 추출물의 최종농도(㎍/ml)	IL-1α 방출량(pg/ml)
SLS	0.05%	67
실시예 2	50	61
실시예 3	50	53
실시예 4	50	66
실시예 5	50	62
실시예 6	50	58
실시예 7	50	55
실시예 8	50	56
실시예 9	50	59
실시예 10	50	60

표 6에 의하면 실시예 3에서는 IL-1α의 방출량이 20% 이상 감소한 것으로 나타나는 등 모든 실시예에서 IL-1α의 방출량이 감소하였음을 알 수 있어 여주열매 추출물이 염증에 대한 자극을 억제하고 있음을 알 수 있다.

실험5. 세포독성시험

여주열매 추출물에 대하여 단층 세포 배양에서의 세포독성을 측정 하였다.(MTT assay, J. Immunological Methods65, 55(1983) )

MTT 검사법은 살아있는 세포의 수를 측정함으로서 세포 증식이나 독성에 많이 사용되는 실험법으로서 살아있는 세포는 미토콘드리아내에서 수용성이고 노란색의 염인 MTT(3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium

bromide)가 숙신산탈수소효소에 의해 수불용성인 파란색의 포르마잔(formazan) 유도체로 환원되는 원리를 이용하는 것이며 생성된 포르마잔 유도체가 생성되면 용해제를 넣고 용해시킨 후 흡광도를 측정하게 되는데 이 수치는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다.

실험을 위하여, 인간 섬유아세포 cell line (ATCC, CRL-2076)을 1x105 cells/ml의 농도로 하여 24well plate에 접종하였다. 배지는 소혈청 10%를 함유한 DMEM (Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL, USA)를 사용하였다.

접종 후 24시간이 경과되면 소혈청 2%를 함유한 DMEM로 교체하고, 여주열매 추출물을 10㎕ 첨가 한 후 3일 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 상등액을 제거 하고 MTT 용액을 well당 1.0㎖씩 가하고 난 후 4시간이 경과되면 MTT를 제거하고 DMSO를 well당 1.0㎖씩 가한 후 하룻밤 37℃에서 인큐베이션시키고 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

이때 여주열매 추출물의 용해 용매를 음성 대조군, 피부자극물질로 음이온 계면활성제인 소디움라우릴설페이트를 양성 대조군으로 하여, 같은 방법으로 실험을 진행하여 상대적인 흡광도의 차이로부터 세포증식 효과를 비교하였다. 각각의 물질에 대한 세포 생존율에 대한 결과를 표 7에 나타내었다.

단층 세포배양에서의 여주열매 추출물의 세포독성 측정

시료	반응액중에 함유시킨 여주열매 추출물의 최종농도(㎍/ml)	세포생존율(%)
SLS	0.0025%	50
실시예2	100	98
실시예3	100	103
실시예4	100	99
실시예5	100	101
실시예6	100	101
실시예7	100	96
실시예8	100	102
실시예9	100	64
실시예10	100	85

그 결과 실시예 3에서 100%이상의 세포생존율을 보여 주는 등 모든 실시예에서 향상된 세포생존율을 보여주고 있어 여주열매 추출물은 세포독성이 매우 적은 안전한 물질임을 나타내고 있다.

상기와 같이 여주열매 추출물은 안전하고 알레르기 유발을 하지 않으면서도 알레르기 및 염증으로 손상된 피부로부터 피부보호 효과가 있음을 확인하게 되었다. 따라서 여주열매 추출물을 함유하는 처방을 다음과 같이 하고 그 처방에 의한 효과 실험을 하였다.

처방예 1

실시예 3의 여주열매 추출물을 함유한 화장료 중에서 화장수(스킨로션)의 처방 예는 다음과 같다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	여주열매 추출물	3.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌 글리콜	2.0
4	프로필렌 글리콜	2.0
5	폴리옥시에칠렌 경화피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	메칠파라벤	0.2
8	색소	0.002
9	향료	0.03
10	정제수	78.768
11	합 계	100

처방예 2

실시예 3의 여주열매 추출물을 함유한 화장료 중에서 영양크림의 처방 예는 다음과 같다.

번호	원 료	A	B	비교처방
1	여주열매 추출물	3.0	6.0	0
2	밀납	3.0	3.0	3.0
3	폴리솔베이트 60	1.5	1.5	1.5
4	솔비탄 세스퀴올레이트	2.0	2.0	2.0
5	유동 파라핀	5.0	5.0	5.0
6	친유형 모노스테아린산 글리세린	10.0	10.0	10.0
7	스테아린산	1.0	1.0	1.0
8	세토스테아릴알코올	5.0	5.0	5.0
9	카보머	0.2	0.2	0.2
10	트리에탄올아민	0.2	0.2	0.2
11	부칠렌글리콜	5.0	5.0	5.0
12	글리세린	10.0	10.0	10.0
13	메칠파라벤	0.2	0.2	0.2
14	색소	0.002	0.002	0.002
15	향료	0.03	0.03	0.03
16	정제수	53.868	50.868	56.868
17	합 계	100	100	100

처방예 3.

실시예 3의 여주열매 추출물을 함유한 화장료 중에서 에센스의 처방 예는 다음과 같다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	여주열매 추출물	3.0
2	시토스테롤	1.7
3	폴리글리세릴 2-올레이트	1.5
4	세라마이드	0.7
5	스테아레스-4	1.2
6	콜레스테롤	1.5
7	디세틸포스페이트	0.4
8	세토스테아릴알코올	3.0
9	카보머	0.1
10	트리에탄올아민	0.1
11	부칠렌글리콜	5.0
12	글리세린	5.0
13	메칠파라벤	0.2
14	색소	0.002
15	향료	0.03
16	정제수	76.568
17	합 계	100

실험예 1. 피부1차 자극 후 홍반 완화 효과

영양 크림 처방 예 2의 A, B 및 비교처방에 피부자극제인 소디움라우릴설페이트(Sodium Laurly Sulfate)가 0.5%가 되도록 넣고 피부 도포 시 피부자극 완화 수준을 확인하기 위해서 다음과 같은 임상 확인 실험을 하였다. 아토피 피부염과 현재 및 과거 병력에서 습진이 없는 현재 피부질환이 없다고 판단된 3세 이상의 건강한 남, 여 소아 및 어린이 20명(연령분포: 3~8세, 평균연령:5세, 남자 15명, 여자 5명)을 대상으로 하였다.

피검자의 양측 아래팔 내측 부위에 시료를 도포하기 전에 홍반지수(erythema index: E-index)를 측정하고 큰 핀-챔버(large finn chamber; Epitest, Hyryla Finland)와 여과지를 이용하여 각 시료의 일정량(0.2g)을 24시간 동안 첩포 하였다.

홍반지수 측정은 공기의 이동이 없고 직사광선이 없는 공간에서 첩포를 제거하고 피검자가 검사 부위를 노출시킨 다음 30분 동안 안정을 취한 후 시행하였으며 첩포 제거 후 1일, 2일 및 1주일 경과 후의 결과도 측정하였다.

홍반 지수의 측정은 피부 분광계(Dermaspectrometer; Cortex Technology, Hadsund, Denmark)를 이용하였으며 그 결과를 다음 표 11과 같이 나타내었다.

피부 자극성 완화 시험 결과

시료	BL	D0	D1	D2	W1
처방예 2의 비교처방	9.7	11.8	12.6	12.3	10.5
처방예 2의 A	9.0	8.9	10.5	9.5	9.5
처방예 2의 B	8.5	8.7	8.8	8.9	8.9

*BL : 기준(baseline)

*D0 : 패치 제거 후 30분 경과 후 자극성 수치

*D1 : 패치 제거 후 1일 경과 후 자극성 수치

*D2 : 패치 제거 후 2일 경과 후 자극성 수치

*W1 : 패치 제거 후 1주일 경과 후 자극성 수치

상기 표 11의 조사결과로부터 여주열매 추출물이 첨가되지 않은 비교처방보다, 여두열매가 첨가된 처방 예 2의 A와 B가 염증생성 유발 피부자극 물질로부터의 피부 자극 완화 효과가 더 우수하다는 것을 알 수 있다.

실험예 2. 피부 자극 실험 (stinging test)

락틱애씨드에 민감한 자극을 보이는 피실험자를 선정하여 먼저 비누 세안을 시킨 후 항온 항습실(21℃, 47% 상대습도)에서 15분간 적응시켰다.

처방예 2의 A, B와 비교처방의 영양크림에 피부자극제인 락틱애씨드을 6.0% 까지 첨가하고 피부 도포 시 피부자극 완화효과를 확인하기 위해서 락틱애씨드에 민감한 반응을 보이는 남, 여 소아 및 어린이 15명(연령분포: 5~8세, 평균연령:7세, 남자 12명, 여자 3명)을 대상으로 하여 다음과 같은 임상 확인 실험을 하였다.

부직포에 각각 400㎕씩 도포한 후 따가움과 가려움을 잘 느낀다고 보고 된 코 주변과 뺨에 부직포를 붙인 후 20초 경과 후에 제거하였다. 부직포 제거 후 경과 시간대 별(10초, 2분 30초, 5분, 8분)로 하기 표 9의 기준에 의거하여 피시험자의 주관적 판정으로 따가움, 가려움 정도를 측정하였으며 이를 하기 표 10에 나타내고 이들로부터 항자극율을 구하여 표 14에 정리하였다.

* 항자극율=(대조예의 자극지수-처방예의 자극지수)x100/대조예의 자극지수

따가움, 가려움의 자극지수

따가움, 가려움 지수	판단기준
0	아무런 느낌이 없다
1	미약하게 따끔거리거나 가렵다
2	따끔거리거나 가렵다
3	심하게 따끔거리거나 가렵다

락틱애씨드에 대한 각 처방의 자극 지수

구분	비교처방				처방예 2의 A				처방예 2의 B
시간	10초	2.5분	5분	8분	10초	2.5분	5분	8분	10초	2.5분	5분	8분
시간별 자극지수	1.2	2.0	1.4	1.0	1.0	1.3	1.1	0.5	1.0	1.1	1.0	0.2
평균지수	1.4				0.98				0.83

* 대조 예(락틱애씨드 6.0%)의 자극 지수 : 1.81

락틱애씨드에 대한 각 처방의 항자극율

시 료	항자극율 (%)
비교 처방	22.6
처방예 2의 A	45.9
처방예 2의 B	54.1

이와 같이 여주열매 추출물이 함유된 처방 예는 자극지수가 0.98 및 0.83으로서 함유되지 아니한 처방예의 1.4보다 자극지수가 낮음을 알 수 있으며, 시간별 자극지수에 있어서도 여주열매 추출물이 함유된 처방예가 함유되지 아니한 처방예에 비해 10초 후부터 8분까지 항상 자극지수가 낮음을 알 수 있고, 따라서, 항자극율에 있어서도 여주열매 추출물이 함유된 처방예가 함유되지 아니한 처방예보다 2배 이상 큰 것을 알 수 있다. 특히 함유량이 많은 처방예 2의 B는 그 효과가 더 큰 것임을 알 수 있어 이는 여주열매 추출물에 의한 효과라고 할 수 있다. 또한, 항자극율이 높아 성인뿐만 아니라 유소아에게도 적용 가능한 것이라 할 수 있다.

Claims (8)

1. 여주 열매 추출물을 함유하는 화장료용 피부자극완화제
   
2. 제 1 항에 있어서, 여주 열매 추출물은 건조된 여주 열매에 5~20배 부피량의 용매를 가하고 50~100℃에서 3~20시간 가열하여 추출하는 방법 및 건조된 여주 열매를 5 내지 37℃에서 1 내지 15일간 용매에 침적시켜 추출하는 방법 중에서 선택된 한 가지 이상의 방법으로 추출한 것임을 특징으로 하는 화장료용 피부자극완화제
   
3. 제 2 항에 있어서, 제2항에 기재된 방법으로 얻은 추출물을 추가로 에탄올, 물을 이용하여 순차적으로 분획한 후, 수득한 에탄올 분획물 임을 특징으로 하는 화장료용 피부자극완화제
   
4. 제 3 항에 있어서 수득한 에탄올 분획물을 농축, 건조하였을 때 얻어진 고형 성분에서 차란틴(Charantin)성분이 최소 0.5~1.0%(w/v) 이상 함유됨을 특징으로 한다.
   
5. 제 1 항에 있어서, 피부자극완화는 피부에서의 항염증임을 특징으로 하는 화장료용 피부자극완화제
   
6. 제 1 항에 있어서, 피부자극완화는 피부에서의 항알레르기 임을 특징으로 하는 화장료용 피부자극완화제
   
7. 제 1 항에 있어서, 피부자극 완화제는 화장수, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 영양에센스, 유화형 화운데이션, 자외선차단 로션, 자외선차단 크림, 유아전용 목욕 세정제, 샴푸 및 비누로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 화장료용 피부자극완화제
   
8. 제 1 항에 있어서, 여주 열매 추출물은 건조 중량으로서 0.01 - 20.0 %(w/v) 함유한 것임을 특징으로 하는 화장료용 피부자극완화제