KR100852864B1

KR100852864B1 - 초록입 홍합(ＰｅｒｎａＣａｎａｌｉｃｕｌｕｓ.)추출물을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR100852864B1
Application number: KR1020070036488A
Authority: KR
Inventors: 설장호; 백남용; 김동호; 고재건; 김동현; 이호준; 김학철; 김서환; 김기호; 김영희; 고강일; 박수진
Original assignee: 보령메디앙스 주식회사; 주식회사 바이오랜드
Priority date: 2007-04-13
Filing date: 2007-04-13
Publication date: 2008-08-18

Abstract

본 발명은 초록입 홍합 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 염증, 알레르기, 부종, 홍반 등의 예방 및 완화 효과가 있고, 세포무독성이므로 화장품의 유효성분으로 사용될 수 있다.

초록입 홍합 추출물, 화장료 조성물, 자극 완화

Description

초록입 홍합(ＰｅｒｎａＣａｎａｌｉｃｕｌｕｓ.) 추출물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing extracts of perna canaliculus}

본 발명은 초록입 홍합 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부표면은 피지선에서 분비된 피지와 땀샘에서 나온 수분이 자연적으로 잘 혼합되어 형성된 피지막이 각질층을 덮고 있어, 매끄럽고 윤기가 있으며 촉촉한 상태로 유지된다. 이러한 피부 각질층의 수분 함량이 20% 정도 일 때 피부는 가장 이상적이고 아름다운 상태가 되며 피부 각질층의 수분 함량이 10% 이하로 떨어지면 피부에서 각질이 떨어져 나가게 되고 이물질의 침투가 용이하게 되어 각종 염증 및 알러지가 유발되기 쉬워진다. 특히, 나이가 들어감에 따라 피부의 신진대사가 원활하지 못하므로 각종 염증 및 알러지는 가중된다. 또한, 건조한 실내환경, 공해, 자외선, 바람, 오용된 화장품이나 세제류 등 외부자극에 의해 피부가 민감해져가는 사람들이 늘어나고 있다. 외부 자극에 의해 민감해진 피부는 홍반과 같이 단순히 가시적인 경우도 있으며, 또한, 가려움, 따가움 등과 같이 격심하고 불 쾌한 염증반응을 나타내는 경우가 있다.

화장품은 피부를 보호하고 미화 청결을 위해 사용되는 제품이지만 화장품 조성물에는 본래의 피부 보호 목적과는 무관한 성분들이 제품형성에 필수 불가결하게 사용된다. 예를 들면 가용화제 및 유화제, 방부제, 향료, 자외선 차단제 등이 기타 효능 및 효과를 부여하기 위해 쓰여지나, 이러한 성분들은 일반적으로 피부에 염증이나 알러지, 뾰루지, 부종 등을 유발하는 주원인으로 알려져있다.

염증은 세포나 조직이 어떠한 원인에 의해 손상을 받으면 그 반응을 최소화하고 손상된 부위를 원상으로 회복시키려는 일련의 방어목적으로 나타나는 것이다. 염증을 유발하는 요인은 외상, 화상, 동상, 방사능 등에 의한 물리적 요인과 산이나 염기와 같은 화학물질에 의한 화학적 요인, 항체반응에 의한 면역학적 요인, 및 혈관이나 호르몬 불균형에 의한 요인이 있다.

히스타민은 가려움과 통증을 매개하는 가장 잘 알려진 물질이다. 지금까지 밝혀진바에 의하면, 가려움증을 감지하는 특정한 수용체(receptor)는 없으며, 국부적인 통증과 같이 상피세포나 진피와 표피사이의 간극에 존재하는 불특정한 자율신경 말단에 의한 것으로 알려져 있다. 또한,히스타민은 FCε RIα 수용체와는 별도로 기질 P, 간세포인자, 혈관작용성 장 펩티드 등의 염증 매개체에 의해서도 피부 비만 세포로부터 유리될 수 있다. 또 다른 가려움증과 통증을 매개하는 물질은 주 로 비만세포로부터 유리되며 FCε RIα 수용체의 교차결합에 의해 유리된다.

현재까지 홍반이나 부종 같은 자극완화 및 염증 완화 목적으로 이용되고 있는 물질은 비스테로이드계로 프루폐나믹산(flufenamic acid), 이부프로펜(ibuprofen), 벤지다민(benzydamine), 인도메타신(indomethacin)등이 있고 스테로이드계통으로 프레드니솔론(prednisolone), 덱사메타손(dexamethasone)등이 있으며(김창종, 병태생리학, 한림상사, p61-69, 1988) 알란토인, 아즈렌, ε-아미노키프론산, 하이드로코티존(ⅴ), 감초산 및 그 유도체(β-글리칠레친산, 글리칠레친산유도체)등이 있다(광정무부, 신화장품학, 남산당, p162, 1993).

초록입 홍합(Perna Canaliculus .)은 뉴질랜드 해안에 서식하는 홍합의 일종으로 녹색홍합(Green-lipped Mussel)으로 불리며 학명은 Perna Canaliculus 이다. 초록입 홍합은, 강렬한 자외선에 대항할 수 있도록 진화된 플랑크톤을 주 먹이로 하므로, 다른 지역에서 자생하는 홍합에서는 볼 수 없는 독특한 성분 즉, 항산화와 항염에 관련된 오메가 불포화 지방산을 함유하고 있다고 보고 되었다. 이는 뉴질랜드의 원주민인 마오리족이 생활지역과 식이에 따라 관절염의 발생빈도에 차이를 보인다는 사실에 착안하여 연구된 결과이다.

초록입 홍합에서 발견된 불포화 지방산은 오메가-3 지방산을 함유하는 물고 기 기름, 아마인유, 달맞이꽃 오일 등보다도 200배 이상의 강한 염증 억제효과가 있는 것으로 임상실험을 통해 알려졌다. 오메가-3계열의 지방산은 오메가-6계열의 리놀레산과 경쟁적으로 작용함으로써 오메가-6 계열 지방산으로부터 만들어지는 염증매개 물질의 생성을 방해하여 동맥 경화증과 류머티스 관절염 등의 염증성질환 발생을 억제하는 것으로 규명된 바 있다[Int . J. Dermatol 1990;29(8):591-595, Nut Res. 2001;21:309-341, Inflammopharmacology. 5:237-246 (1997), Allerg Immunol (Paris). 2000 Sep;32(7):272-8].

그러나, 초록입 홍합 추출물을 이용한 선행발명에는 국제특허 WO96/05164( ANTI-INFLAMMATORY PREPARATION) 및 미국특허 US 6,346,287(Lipid extract having anti-inflammatory activity)등이 있으나, 이들은 관절염 약학 조성물에 관한 것만 개시되어 있다.

그러나, 지금까지 알려진 자극완화 및 염증 완화 목적은 모두 의료용으로 제조되어 왔다.그리고, 상기에서 살펴본 바와 같이, 화장품에 있어서 피부 부작용 유발요인은 항상 잠재되어 있다. 따라서, 이를 해결 하고자 다양한 연구가 진행되어 왔으나, 항염제로 쓰이는 인도메타신(indomethacin)은 화장료에는 사용할 수 없는 물질이고, 하이드로코티존은 사용량이 제한되어 있으며 감초산 및 그 유도체는 안정화시키기 어렵거나 용해도가 좋지 않아 실제 적용시 농도의 제한으로 실질적인 효과가 없다. 그리하여, 지금까지 알려진 항염제는 피부안전성 면이나 화장료 배합 시 안정성 면에서 대부분 문제점을 가지고 있기 때문에 그 사용이 제한되고 있다.

이에 본 발명자들은 예의 연구한 결과 초록입 홍합추출물이 피부에 안전하며, 화장료 배합시 보존안정화가 쉽고, 우수한 자극완화효과가 있음을 알아내어 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 초록입 홍합추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

이하 구체적으로 본 발명을 설명한다.

본 발명에 사용되는, 초록입 홍합추출물은 주로 뉴질랜드 해안에 서식하는 홍합의 일종으로 녹색홍합(Green-lipped Mussel)으로 불리며 학명은 Perna Canaliculus 이다.

본 발명의 조성물 중, 초록입 홍합추출물은 당업자에게 알려진 추출방법에 의해 제조된다. 예를 들어, 살아있는 홍합을 세척하여 동결건조 한 후, 동결건조된 초록입 홍합을 파우더로 제조한 후 용매로 추출한 후 활성탄을 이용하여 화장품에 첨가시 문제가 될 수 있는 특유의 취와 피부에 자극을 줄 수 있는 염 등을 제거하고, 추출물을 마이크로 플루다이저를 통하여 더욱 피부에 흡수되기 좋게 균질화하여, 본 발명의 초록입 홍합추출물을 제조할 수 있다.

본 발명의 추출물 제조에 사용되는 용매는 당업자에게 알려진 추출용매면 어느 것이든 가능하다. 예를 들어, 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올와 같은 1~4의 저급알콜, 또는 함수 저급할콜, 부틸렌글리콜과 같은 탄소수 1~6의 저급글리콜, 함수 저급글리콜, 에틸아세테이트, 에테르(ether), 헥산 등이 있다. 바람직한 추출용매는 탄소수 1~6의 저급글리콜, 함수 저급글리콜, 탄소수 1~4의 저급알콜, 또는 함수 저급알콜이다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 초록입 홍합추출물의 함량은 사용목적 및 사용자의 대상에 따라 다양하게 함유될 수 있다. 바람직한 초록입홍합추출물의 함량은 화장료 조성물 총중량에 대하여 0.1 내지 5.0 중량% 이다.

본 발명의 화장료 조성물은 항염증용, 항알러지용, 또는 자극완화 효과가 있으므로, 항염증용, 항알러지용 또는 자극완화용의 기능성 화장품으로 사용가능하다.

또한 본 발명의 화장료 조성물은 현재 시판되는 화장품, 화장용비누, 화장용 세안제의 제형을 가진다. 예를 들어, 본 발명의 화장료 조성물은 화장수(스킨로션), 영양로션, 영양크림, 맛사지 크림, 영양에센스 또는 유화형 화운데이션와 같은 화장품제형일 수 있다. 또한, 본발명의 화장료 조성물은 유아전용 화장수(스킨 로션), 로션, 크림, 자외선차단 로션 또는 자외선차단 크림과 같은 화장품일 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 유아전용 목욕 세정제, 샴푸 또는 비누 와 같은 화장용 세정제 일 수 있다.

아래의 실시 예는 본 발명의 내용을 설명하나, 본 발명의 보호범위가 이로 한정되지는 않는다.

< 제조예 1> 70% 에탄올을 이용한 초록입 홍합 추출물 제조

살아있는 홍합을 세척하여 동결건조한다. 동결건조된 초록입 홍합을 볼밀을 사용하여 파우더로 제조한다. 파우더 100g에 70%에탄올 1kg을 넣어 24시간 동안 교반 추출한 후 일차로 250메쉬 여과포로 여과한 다음 와트만 여과지로 여과시켜 초록입 홍합 추출물을 얻었다. 초록입 홍합 추출물을 활성탄과 섞어 3시간 동안 교반한 다음 10,000 rpm에서 원심분리 후 0.8um, 0.4um, 0.2um, 0.1um 입자 크기의 여과지를 사용하여 순서대로 여과하였다. 여과된 초록입 홍합 추출물은 마이크로플루다이저를 사용하여 1,000bar의 압력으로 3회 반복하여 균질화시킨 초록입 홍합 추출물 453g 을 얻었다.

< 제조예 2> 30% 에탄올을 이용한 초록입 홍합 추출물 제조.

제조예 1 제조방법 중, 70%에탄올 대신에, 30%에탄올을 사용한 것을 제외하고는 제조예1의 제조방법과 동일한 방법으로 초록입 홍합을 추출, 여과, 활성탄 처 리 한후, 마이크로플루다이저를 사용하여 1,000bar의 압력으로 3회 반복하여 균질화시킨 초록입 홍합 추출물 446g 을 얻었다.

< 제조예 3> 50% 부틸렌글리콜을 이용한 홍합 추출물 제조

제조예 1 제조방법 중, 70%에탄올 대신에, 50% 부틸렌글리콜을 사용한 것을 제외하고는 제조예1의 제조방법과 동일한 방법으로 초록입 홍합을 추출, 여과, 활성탄 처리 후 마이크로플루다이저를 사용하여 1,000bar의 압력으로 3회 반복하여 균질화시킨 초록입 홍합 추출물 449g 을 얻었다.

< 제조예 4> 30% 부틸렌글리콜을 이용한 홍합 추출물 제조

제조예 1 제조방법 중, 70%에탄올 대신에, 30% 부틸렌글리콜을 사용한 것을 제외하고는 제조예1의 제조방법과 동일한 방법으로 초록입 홍합을 추출, 여과, 활성탄 처리 후 마이크로플루다이저를 사용하여 1,000bar의 압력으로 3회 반복하여 균질화시킨 초록입 홍합 추출물 439g 을 얻었다.

< 제조예 5> 물을 이용한 홍합 추출물 제조

제조예 1 제조방법 중, 70%에탄올 대신에, 물을 사용한 것을 제외하고는 제조예1의 제조방법과 동일한 방법으로 초록입 홍합을 추출, 여과, 활성탄 처리 후 마이크로플루다이저를 사용하여 1,000bar의 압력으로 3회 반복하여 균질화시킨 초록입 홍합 추출물 427g 을 얻었다.

< 실시예 1> 초록입 홍합추출물을 함유한 화장수 제조

제조예 1의 초록입 홍합추출물을 함유한 화장수(스킨로션)를 하기 표 1의 조성비로 제조하였다.

[표1]

번호	원 료	함량(중량%)
1	초록입 홍합추출물 (제조예 1)	3.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌 글리콜	2.0
4	프로필렌 글리콜	2.0
5	폴리옥시에칠렌 경화피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	트리에탄올아민	0.1
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향료	미량
11	정제수	잔량

상기 표1의 화합물 11번에 2,3,4,8번을 순서대로 투입하고 교반하여 용해시킨다. 다른 용기에 5번을 60℃ 정도 가열하여 용해시키고, 10번을 투입시킨 후, 이 용액을 11번이 포함되어 있는 용기에 투입한다. 마지막으로 1,6,7,9번을 투입하여 충분히 교반한 뒤 숙성시켜 표제의 화장수를 제조하였다.

<실시예 2> 초록입 홍합추출물을 함유한 영양로션 제조

제조예 1의 초록입 홍합추출물을 함유한 영양로션을 하기 표2의 조성비로 제조하였다.

[표2]

번호	원 료	함량(중량%)
1	초록입 홍합추출물 (제조예 1)	5.0
2	밀납	1.0
3	폴리솔베이트 60	1.5
4	솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
5	유동 파라핀	10.0
6	소르비탄 스테아레이트	1.0
7	친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5
8	스테아린산	1.5
9	글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	카르복시폴리머	0.1
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	미량
14	색소	미량
15	향료	미량
16	정제수	잔량

상기 표2의 화합물 10, 11, 13, 16번을 혼합교반하면서 80 ~ 85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 화합물 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12를 80 ~ 85℃사이로 가열하여 투입한 뒤 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 열 냉각한 뒤 15번을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 14번을 투입하고 35℃에 1번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켜 표제의 영양로션을 제조하였다.

< 실시예 3> 초록입 홍합추출물을 함유하는 영양크림 제조

제조예 1의 초록입 홍합추출물을 함유하고 그 함량이 다른 영양크림을 하기 표3의 조성비에 따라 2개 제조하였다.

[표3]

번호	원 료	실시예3-A (중량%)	실시예 3-B (중량%)
1	초록입 홍합추출물 (제조예 1)	5.0	10.0
2	스테아린산	2.0	2.0
3	세틸알콜	2.0	2.0
4	글리세릴모노스테아레이트	2.0	2.0
5	폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트	0.5	0.5
6	솔비탄세스퀴올레이트	0.5	0.5
7	글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트 /폴리옥시에틸렌스테아레이트	1.0	1.0
8	왁스	1.0	1.0
9	유동파라핀	4.0	4.0
10	스쿠알란	4.0	4.0
11	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0	4.0
12	카르복시비닐폴리머	0.3	0.3
13	부틸렌글리콜	5.0	5.0
14	글리세린	3.0	3.0
15	트리에탄올아민	0.5	0.5
16	정제수	잔량	잔량
17	물	-	-

상기 표3의 화합물 12, 13, 14, 16번을 혼합교반하면서 80 ~ 85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 화합물 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11번을 80 ~ 85℃사이로 가열하여 투입한 뒤 15를 투입하여 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각하고 1번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켜, 표제의 영양크림을 실시예3-A 및 실시예3-B로 제조하였다.

< 실시예 4> 초록입 홍합추출물을 함유한 에센스 제조

제조예 1의 초록입 홍합추출물을 함유한 에센스를 하기 표 4의 조성비로 제조하였다.

[표4]

번호	원 료	함량(중량%)
1	초록입 홍합추출물 (제조예 1)	5.0
2	시토 스테롤	1.7
3	폴리글리세릴 2-올레이트	1.5
4	세라마이드	0.7
5	스테아레스-4	1.2
6	콜레스테롤	1.5
7	디세틸포스페이트	0.4
8	농글리세린	5.0
9	마카다미아 오일	15.0
10	카르복시비닐폴리머	0.2
11	산탄검	0.2
12	방부제	미량
13	향료	미량
14	정제수	잔량

상기 표4의 화합물 2, 3, 4, 5 및 6번을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질을 형성시킨다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 화합물 1, 7, 8 및 14번를 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루이다이져를 통과하고 이어 9번을 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루이다이져에 재차 통과시켰다. 그 후, 10, 11, 12, 13번을 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시켜 표제의 에센스를 제조하였다.

< 비교예 1> 영양크림 제조

하기 표5의 조성비를 갖는 영양크림을 제조하였다.

[표5]

번호	원 료	함량 (중량%)
2	스테아린산	2.0
3	세틸알콜	2.0
4	글리세릴모노스테아레이트	2.0
5	폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트	0.5
6	솔비탄세스퀴올레이트	0.5
7	글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트 /폴리옥시에틸렌스테아레이트	1.0
8	왁스	1.0
9	유동파라핀	4.0
10	스쿠알란	4.0
11	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
12	카르복시비닐폴리머	0.3
13	부틸렌글리콜	5.0
14	글리세린	3.0
15	트리에탄올아민	0.5
16	정제수	잔량
17	물	10.0

실시예3의 제조방법에서 초록입 홍합추출물을 투입한것을 제외하고는 동일한 방법으로 영양크림을 제조하였다.

< 실험예1 > 알러지 비유발 확인( LLNA assay )

초록입 홍합 추출물에 대한 알러지 유발여부를 확인하기 위하여 3일 동안 하루 한번씩 시료를 마우스 귀에 25㎕씩 도포한 후, 4일째 되는 날 임파절을 떼어내어 임파구를 분리후 5% 이산화탄소 배양기에서 24 - 48시간 배양한 후 증폭정도를 방사선 동위원소 [³H]-메칠티미딘(methyl thymidine)의 삽입량으로 측정하였다. 국부임파절평가 (LLNA:local lymph node assay)결과는 대조군에 비해 시료군의 임파 구 증폭정도로 나타내며 한 가지 농도에서라도 시료의 자극지수(S.I:stimulation index)가 3이상이고 농도별로 증가하는 경향을 보일 경우 알러젠으로 간주한다. 그 결과는 표6과 같다.

[표6] 초록입 홍합 추출물의 알러지 평가 결과

시료	반응액중에 함유시킨 초록입 홍합 추출물의 최종농도(㎍/ml)	평균 cpm	증폭정도(S.I)
에탄올(50%)	100	2246 ± 117	―
제조예 1	100	3107 ± 125	1.30
제조예 2	100	3327 ± 239	1.23
제조예 3	100	3187 ±218	1.42
제조예 4	100	2993 ±231	1.61
제조예 5	100	3732 ± 215	1.56

※-cpm(counter per minute) : [³H]-메칠티미딘(methyl thymidine)이 세포 내로 삽입되는양

-S.I (stimulation index): 시료의 평균 cpm을 대조군의 평균 cpm으로 나눈값

상기 표 6에서 보는 바와 같이 본 발명의 추출물은, 자극지수(S.I)가 3이하의 값을 가지므로 알러지 유발 가능성이 거의 없다.

< 실험예 2> 항알러지 효과 확인 (β- hexosaminidase 방출량 측정)

β-헥소사미니다제(β-hexosaminidase)는 비만세포(mast cell)에 함유되어 있는 효소로 비만세포가 면역반응에 의해 활성화되면 히스타민(histamine)과 함께 방출된다. 그러므로, β-헥소사미니다제는 거대세포의 탈과립 지표로 사용할 수 있다[Planta Med. 64, 577-578 (1998)].

RBL-2H3 cell을 10% FBS(송아지 혈청)과 글루타민을 함유하고 있는 EMEM로 배양한다. 24well plate에 세포를 well당 5x10⁵ 개로 분주한다. 이 때 사용 배지는 EMEM 에 0.5㎍/㎖의 mouse monoclonal IgE 함유된 것을 사용하고, 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기(incubator)에서 배양한다. 세포를 well 당 siraganian buffer I 500㎕를 사용하여 헹구어 내고, siraganian buffer II 160㎕ 첨가 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 10분 동안 배양하였다. 초록입 홍합 추출물을 처리한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 20분 동안 배양하고 10분간 antigen(1㎍/㎖, DNP-BSA)을 처리하였다. 10분간 빙조에 처리하여 반응을 정지시키고 원심분리하였다. 상층액에 substrate(1mM ρ-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide) 20㎕ 처리 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1시간 인큐베이션 한 후 0.1M Na₂CO₃/NaHCO₃를 넣어 반응을 정지시킨다. ELISA reader를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 표7과 같다.

[표7] 초록입 홍합 추출물의 항알러지 평가 결과

시 료	반응액중에 함유시킨 초록입 홍합 추출물의 최종농도(㎍/ml)	β-hexosaminidase 방출 저해율(%)
Indomethacin*	50	75.2
제조예 1.	100	32.1
제조예 2.	100	25.3
제조예 3.	100	19.4
제조예 4.	100	20.5
제조예 5.	100	13.2

*인도메타신(indomethacin)은 염증완화 및 통증치료제로 알려진 치료제이다.

※ 억제율(%) =(B-C-D)/(A-C-D)

-A(control) : test material 첨가하지 않은 것 (allergen IgE 반응 측정)

-B(treated) : test material 첨가 (allergen IgE 반응 측정)

-C(blank) : test material 과 substrate 만 ELISA plate에 첨가

-D(spontaneous) : antigen, IgE , test material 첨가하지 않은 것

< 실험예3 > 마우스 귀부종에 대한 항염증 효과 확인

초록입 홍합 추출물에 대한 항염증 효과를 알아보기 위하여 마우스 귀부종법을 실시하였다. 일주일간의 순화기간을 거친 후 한 개의 시료당 3마리의 마우스를 사용하였다. 마우스 좌측귀를 대조부위, 우측귀를 시험부위로 하여 시료 적용 전에 에탄올로 귀를 깨끗하게 세척하고 시료 20㎕를 1일 1회 4일간 지속적으로 도포하였다. 그 후, 마지막 도포 1시간 후에 좌측귀에 에탄올을 우측귀에는 아라키돈산(Arachidonic acid)을 2㎎/ear을 도포하여 1시간 후 귀의 부종(ear edema)정도를 마이크로미터로 양쪽귀를 3회씩 반복 측정하였다. 항염효과는 아라키돈산(Arachidonic acid) 처리군을 기준으로 부종억제 정도로 판정하였으며 그 결과를 표8에 나타내었다.

[표8] 국소적용에 의한 귀두께 및 염증억제율

시료	반응액 중에 함유시킨 최종농도(㎍/ ml )	용매	귀두께 평균(㎛)		염증 억제율(%)
시료	반응액 중에 함유시킨 최종농도(㎍/ ml )	용매	시료처리전	시료처리후
Indomethacin	1.0	에탄올	268	416	40.8
아라키돈산	2㎎/ear	에탄올	295	545	-
제조예 1	10	에탄올	290	489	21.6
제조예 2	10	에탄올	265	452	25.2
제조예 3	10	에탄올	284	471	25.0
제조예 4	10	에탄올	299	472	31.2
제조예 5	10	에탄올	305	482	29.2

※ 염증 억제율(%) = (A―B) / A × 100

A : 대조군귀의 평균두께(아라키돈산 처리귀의 두께-비처리 귀의 두께)

B : 시료도포군 귀의 두께(시료 처리귀의 두께-비처리귀의 두께)

상기 표8에서 본 바와 같이, 본 발명의 초록입 홍합 추출물은, 아리키돈산을 처리했을 때 보다 염증을 21.6% 내지 31.2%억제하므로 염증억제에 효과가 있다.

< 실험예4 > 3차원 생인공피부에서의 항염증 효과 확인( IL -1α 방출량 측정)

IL-1α(interleukin-1α)는 전염증 작용인자 (pre-inflammatory mediator)이며, 작용하는 세포간 신호물질 (cytokine)로 염증, 감염 등에 의한 자극에 의해 골형성세포, 단핵세포, 대식세포, 각질형성세포, 간세포, 섬유아세포 등이 일시적으로 증가 시킨다. 또한 IL-1α는 상처(wound)의 재상피화(re-epithelialization)의 잠재적인 유도체로서 작용할 뿐만 아니라 알레르기 반응과 염증성 반응 조절인자로서 백혈구 운동을 촉진시키는 leukotriene B4, 5-, 12-, 15 HETE 같은 arachidonic acid) lipoxygenase metabolites 생산을 증진시키는 것으로 알려져 있다. 3차원 인공피부를 배양하여 자극을 유발시킨 후 초록입 홍합 추출물의 IL-1α의 방출양을 알아보았다.

TypeⅠ collagen matrix (Bioland, Korea)와 5배로 농축된 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle Medium, GIBCO BRL, USA), 그리고 2.2% NaHCO₃와 200mM HEPES, 0.05N NaOH로 제조된 완충용액을 7:2:1로 섞어 만든 human fibroblasts cell line(ATCC, American Type Culture Collection, Cat. No. CRL-2076) 을 density 1×10⁵ cells/ml로 혼합하여 직경 10mm의 insert에 각 각 200ul의 fibroblasts가 혼합된 collagen solution을 넣어 진피를 제조하였다. 진피 제조 후 10% FBS를 함유하는 DMEM를 2일마다 교체하여 7일간 배양하였다. 배양된 진피위에 normal keratinocyte를 3×10⁵ cells/insert로 접종하였다. DMEM (10% FBS)와 K-SFM (Keratinocyte Serum Free Medium, GIBCO, USA) (supplemented with EGF (epidermal growth factor) and BPE(bovine pituitary extract)를 1:1로 섞은 배지를 넣고 7일간의 submerge culture 후 기액 계면에서 배양 (air-liquid interface culture)하기 위하여 insert안의 배지는 제거하고 insert 밖에만 submerge culture시 사용한 배지를 사용하여 14일 동안 air-liquid interface culture 하였다. 배양된 인공피부의 배양배지를 모두 제거한 다음 새 배지를 조직 배양 용기밖에 1.5 ㎖을 넣었다. Insert 내에 10 ㎕의 피부자극물질 (SLS : sodium lauryl sulfate)을 투여하고 4 시간 뒤 각 농도의 초록입 홍합 추출물을 적용한 후 37 ℃, 5% CO₂에서 24 시간 동안 배양한다. 시료의 농도는 용액에 대한 독성 물질의 무게 퍼센트로 하 였다. IL-1α는 배지 표본을 취하여 Human IL-1α assay kit (Endogen Inc. Boston, MA, USA)을 이용하였으며 ELISA-reader (enzyme-linked immunosorbent assay)로 450 nm에서 측정하였다. 그 결과는 표9에 나타내었다.

[표9] 3차원 생인공 피부에서의 항염증 효과

시 료	반응액중에 함유시킨 초록입 홍합 추출물의 최종농도(㎍/ml)	IL -1α 방출량( pg / ml )
SLS	0.5%	127
제조예 1.	50	92
제조예 2.	50	98
제조예 3.	50	95
제조예 4.	50	103
제조예 5.	50	117

상기 표9에 본 바와 같이, 본 발명의 초록입 홍합 추출물은 IL-1α 방출량을 저해하므로 항염증에 효과가 있다.

<실험예5> 세포 무독성 확인

초록입 홍합 추출물에 대하여 단층 세포 배양에서의 세포독성을 측정 하였다(MTT assay, J. Immunological Methods 65 , 55(1983) ).

MTT assay는 살아있는 세포의 수를 측정함으로서 세포 증식이나 독성에 많이 사용되는 실험법으로 살아있는 세포는 미토콘드리아내에서 수용성이고 노란색의 염인 MTT(3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)가 숙신산탈수소효소에 의해 수불용성인 파란색의 formazan 유도체로 환원되는 원리 를 이용하는 것이다. 생성된 formazan 유도체는 용해제를 넣고 용해시킨 후 흡광도를 측정한다. 좀 더 자세히 설명하면, human fibroblasts cell line (ATCC, CRL-2076)을 1x10⁵ cells/ml의 농도로 하여 24well plate에 접종하였다. 배지는 소혈청 10%를 함유한 DMEM (Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL, USA)를 사용하였다. 접종 후 24시간 후 소혈청 2%를 함유한 DMEM를 교체하고, 초록입 홍합 추출물을 10㎕ 첨가 한 후 3일 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 상등액을 제거 하고 MTT 용액을 well당 1.0㎖씩 가한 후 4시간 후에 MTT를 제거하고 DMSO를 well당 1.0㎖씩 가한 후 하룻밤 37℃에서 인큐베이션 후 570nm에서 흡광도를 측정 하였다. 이때 초록입 홍합 추출물의 추출 용매를 음성 대조군, 피부자극물질로 음이온 계면활성제인 소디움라우릴설페이트를 양성 대조군으로 같은 방법으로 실험을 진행하여 상대적인 흡광도의 차이로부터 세포증식 효과를 비교하였다. 각각의 물질에 대한 세포 생존율에 대한 결과를 표 10에 나타내었다.

[표10] 초록입 홍합 추출물의 단층 세포배양에서의 세포생존율 측정

시 료	반응액중에 함유시킨 초록입 홍합 추출물의 최종농도 (㎍/ml)	cell viability (%)
SLS	0.25%	43.5
제조예 1.	100	103.6
제조예 2.	100	101.7
제조예 3.	100	100.2
제조예 4.	100	103
제조예 5.	100	98.4

상기 표10에서 본 바와 같이, 본 발명의 초록입 홍합추출물은 세포무독성이다.

<실험예 6> 피부1차 자극 후 홍반 완화 효과 확인(폐쇄첩포실험)

실시예 3-A, 실시예 3-B와 비교예 1의 영양크림에 피부자극제인 소디움라우릴설페이트(Sodium Laurly Sulfate)이 0.5% 되도록 넣고 피부 도포시 자극 완화효과를 확인하기 위해서 다음과 같은 임상 확인 실험을 하였다. 아토피 피부염과 다른 습진의 현병력 및 과거력이 없는 현재 피부질환이 없다고 판단된 3세 이상의 건강한 남, 여 소아 및 어린이 20명(연령분포: 3-8세, 평균연령:5세, 남자 15명, 여자 5명)을 대상으로 하였다.

피검자의 양측 전완부 내측 부위에 시료를 도포하기 전에 홍반지수(erythema index: E-index)를 측정하고 large finn chamber(Epitest, Hyryla Finland)와 여과지를 이용하여 각 시료의 일정량(0.2g)을 24시간 동안 첩포를 부착하였다. 첩포를 제거하고 홍반지수측정은 공기의 이동이 없고 직사광선이 없는 공간에서 피검자가 검사 부위를 노출시킨 다음 30분 동안 안정을 취한 후 시행하였다. Dermaspectometer(Cortex Technology, Hadsund, Denmark)를 이용하여 측정 후 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다. 실내온도는 22℃, 습도는 43% 였다.

[표11] 피부1차 자극성 완화 시험결과

시 료	BL	D0	D1	D2	W1
비교예 1	9.3	11.9	12.8	11.7	10.3
실시예 3-A	9.5	12.4	11.1	10.9	10.2
실시예 3-B	9.6	11.7	10.5	10.0	10

*상기 표에서, BL은 크림제형을 도포하기 전 측정값을 의미하고, D0는 크림 제형을 도포 24시간 후 첩포를 제거한 즉시 측정값을 의미하며, D1은 첩포 제거 24시간 후 측정값을 의미한다. 또한, D2는 첩포 제거 48시간 후 측정값을 의미하며, W1은 첩포 제거 1주일 경과 후 측정값을 의미한다.

상기 표11과와 같이 초록입 홍합 추출물을 첨가하여 제조한 실시예 3-A의 화장료가 첨가되지 않고 제조한 비교예 1보다 피부 자극 완화 효과가 우수하다는 것을 알 수 있다.

< 실험예 7> 피부 자극완화 효과 확인( stinging test )

젖산에 민감한 자극을 보이는 피실험자를 먼저 비누 세안을 시킨 후 항온 항습실(21℃, 47% 상대습도)에서 15분간 적용시켰다.

실시예 3-A, 실시예 3-B와 비교예 1의 영양크림에 피부자극제인 젖산(Sodium Laurly Sulfate)이 6.0% 되도록 넣고 피부 도포시 자극 완화효과를 확인하기 위해서 다음과 같은 임상 확인 실험을 하였다. 젖산에 민감한 반응을 보이는 남, 여 소아 및 어린이 15명(연령분포: 5-8세, 평균연령:7세, 남자 12명, 여자 3명)을 대상으로 하였다.

부직포에 각각 400ul 씩 도포한 후 따가움과 가려움을 잘 느낀다고 보고된 코 주변과 뺨에 부직포를 붙인 후 20초 경과 후에 제거하였다. 부직포 제거 후 경과 시간대 별로 (10초, 2분 30초, 5분, 8분) 하기 표12의 기준에 의거하여 피시험자의 주관적 판정으로 따가움, 가려움 정도를 측정하여 하기 표 13에 나타내고 이 들로부터 항자극율을 구하여 표 14에 정리하였다.

[표12] 따가움, 가려움의 자극지수

따가움, 가려움 지수	판단기준
0	아무런 느낌이 없다
1	미약하게 따끔거리거나 가렵다
2	따끔거리거나 가렵다
3	심하게 따끔거리거나 가렵다

*항자극율= (비교실시예의 자극지수-실시예의 자극지수)/비교실시예의 자극지수x100

[표 13] 각 제형의 젖산에 대한 자극 지수

구분	비교예 1				실시예 3-A				실시예 3-B
시간	10초	2.5분	5분	8분	10초	2.5분	5분	8분	10초	2.5분	5분	8분
시간별 자극지수	1.2	2.0	1.4	1.0	1.0	1.3	1.0	0.6	1.0	1.1	0.6	0.1
평균지수	1.4				0.975				0.7

* 젖산 6.0% 자극 지수 : 1.81

[표 14] 각 제형의 젖산에 대한 항자극율

시 료	항자극율 (%)
실시예 3-A	30.36
실시예 3-B	50

본 발명의 초록입 홍합 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 피 부에 도포시 염증, 알러지, 부종, 홍반 등과 같은 자극을 완화시키거나 예방하는 효과가 우수하다.

Claims

초록입 홍합 추출물을 함유하는 피부 자극 완화용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 초록입 홍합추출물이 탄소수 1~6의 저급글리콜, 함수 저급글리콜, 탄소수 1~4의 저급알콜, 또는 함수 저급알콜로 추출된 것인 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 초록입 홍합추출물이 화장료 조성물 총중량에 대하여 0.1 내지 5.0 중량% 함유하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 화장료 조성물이 화장수, 영양로션, 영양크림, 맛사지 크림, 영양에센스, 유화형 화운데이션, 유아전용 화장수, 유아전용 로션, 유아전용 크림, 유아전용 자외선차단 로션, 유아전용 자외선차단 크림, 유아전용 목욕 세정제, 유아 전용 샴푸 또는 유아전용 비누 제형인 화장료 조성물.