KR20100046528A

KR20100046528A - 속단 추출물을 함유하는 항산화효과 및 항염효과를 가지는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20100046528A
Application number: KR1020080105394A
Authority: KR
Inventors: 도정룡; 임상동; 김인호; 한대석; 이진태; 김태훈; 전동하; 장영아
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2008-10-27
Filing date: 2008-10-27
Publication date: 2010-05-07

Abstract

본 발명은 속단 추출물을 함유하는 항산화효과 및 항염효과를 가지는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 속단 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화효과 및 항염효과를 가지는 화장료 조성물과 상기의 화장료 조성물을 포함하는 크림, 로션, 스킨, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 유액, 젤, 화장수, 미용액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 화장료에 관한 것이다.

본 발명의 속단 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 전자공여능, ABTS radical cation 저해, 잔틴 옥시다아제 저해 및 아질산염 소거능의 항산화효과를 가질 뿐만 아니라, NO 저해의 항염효과를 나타내어 건강한 피부의 유지와 개선에 도움을 준다.

속단, 항산화, 항염, 전자공여능, ABTS radical cation 저해, 잔틴 옥시다아제 저해, 아질산염 소거능, NO 저해 활성

Description

속단 추출물을 함유하는 항산화효과 및 항염효과를 가지는 화장료 조성물{Composition for anti-oxidative and anti-inflammatory activity comprising the extract and fraction of Phlomis Radix}

모든 생명의 수명은 유한하다. 인간 역시 나이가 들어감에 따라 자연적으로 노화과정을 겪게 되며 결국은 죽음을 맞이하게 된다. 노화는 해부학적, 생화학적, 생리적, 행동적인 면을 포함한 모든 측면의 신체변화를 말한다. 이러한 신체의 변화는 두뇌, 소화기계, 골격 등 모든 신체에서 일어나며(김숙희, 김화영, 노화, 민음사, 1997) 특히 피부는 기능적, 구조적으로 변화되어 노화를 시각적으로 나타내 어준다.

피부는 노화과정에서 피부탄력의 저하, 피지생성의 감소, 수분손실의 증가, 각질세포의 응집력 강화, 주름생성 등의 특징을 보인다(김기연, 고혜정 외 피부관리학, 수문사1997). 이러한 피부의 노화를 지연시키거나 억제시켜 아름다움과 젊음을 유지하고자 하는 인간의 욕구는 기본적인 의식주에 대한 욕구가 해결된 지금 더욱 커지고 있다. 또한 아름다움에 대한 인간의 욕구는 역사와 함께 계속하여 다양한 형태로 발달하였다. 그 방법으로는 생체 내 대사기전 등을 억제하거나 이를 조절하는 방법, 화장품 등을 이용하는 방법 등이 있다. 생체 내 대사기전의 조절은 결국 노화의 과정과 밀접하게 연관되는 활성산소 및 세포 손상 등을 조절함으로써 노화를 방지하고자하는 것이다(M.K.Yang, J. Kor. Soc. Cosm., 9, p78-82, 2003).

생체 내에서 문제가 되는 대표적 활성산소는 자연계에 널리 존재하는 안정한 분자상태인 기저 삼중항 산소로부터 효소계, 환원대사과정, 화학적 약품, 공해물질 및 광화학적 반응 등에 의하여 생성된다. 그 생성물로는 슈퍼옥사이드(superoxide), 과산화수소(hydrogen peroxide), 수산화 라디칼(hydroxyl radical), 일중항 산소(singlet oxygen) 등이 있으며, 활성산소는 생체 내에서 대식세포의 살균작용, 오래된 단백질의 제거 등에 이용되는 필수적인 물질이나, 반응성이 커서 생체 내에서 유해한 작용을 나타낼 수 있다(A. E. Favier, J. Cadet, et al., Birkhauser Verlag, 83, pp118, 1995). 활성산소가 지나치게 증가되었을 경우에는 활성산소가 생체내의 각 부위에 치명적인 손상을 일으키기도 한다(L. T. Churchill, British Medical Bulletin., 49(3), pp481-193, 1993). 이로 인해 암을 비롯한 뇌졸중, 심장질환, 피부질환, 소화기 질환, 염증, 류마티스, 자기면역질환 등의 각종 질병 및 노화를 일으키는 것으로 알려져 있다(김창진 外, 신 물질 탐색, 자유아카데미, pp325-350, 1996; 안봉전, 이진태, 피부노화와 화장품, 광문각, 4장, 2000). 활성산소를 제거하거나 억제하는 항산화물질들은 각종 질병 치료 및 피부노화억제제로 사용될 수 있으며, 현재 이에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다.

아름다움을 추구하는 인간의 욕구는 미용을 발달시켰으며, 피부를 보호하고 노화를 방지하기 위해 오래전부터 얼굴에 무엇인가를 바르기 시작하였다. 화장품의 시초는 문헌에 기록되지 않았으나, 기원전 3000년경 고대 이집트 무덤에서 지방에 향기를 첨가한 화장연고와 화장도구 등이 발견되어 오래전부터 화장품을 이용하여 화장을 했던 것으로 짐작할 수 있다(황정원, 화장품학, 현문사, pp13-16, 1995). 이처럼, 화장품은 역사이전부터 세계 각지에서 사용되었으며 인류의 문화와 경제가 발전함에 따라 인간의 미적 본능을 만족시키는 양식이 되고 있다.

예전에는 화장품이 색조화장품, 기초 화장품, 두발용 향료 등으로 주로 피부보호와 메이크업을 위주로 생산되었으나, 최근에는 피부 상태를 적극적으로 개선시키려는 목적을 가진 미백, 주름개선 등의 특정한 기능을 가진 기능성 화장품이 개발?생산되고 있다. 또한 각 개인의 개성이 강조되고 다양성의 추구로 인해 화장품도 소품종 대량생산에서 다품종 소량생산으로, 박리다매의 형태에서 고부가가치를 가진 제품의 생산으로 그 형태가 바뀌고 있다(하병조, 기능성 화장품, 신광출판사, pp10-12, 2002). 2001년 7월 식품의약품안전청에서는 기능성화장품 기준 및 시험방법 등을 고시하였다. 미백에 도움을 주는 물질로는 닥나무추출물, 유용성 감초추출 물을 고시성분으로 등재하였고, 피부의 주름개선에 도움을 주는 물질로는 레티놀, 아데노신을 등재하였다(화장품 관련 정책 종합설명회, 식품의약안전청, pp243-250, 2003). 이외에도 녹차, 상백피, 빈랑자, 황금, 산삼 등의 천연물을 화장품의 성분으로 사용하고 있다(김영중, 천연물연구의 최근 동향, 대한화장품학회지, 29, pp1-15, 2003; 안덕균, 피부미용의 한의학적 이론, 대한화장품학회지, 29, pp79-87, 2003)

이처럼 최근에 화장품 소재로 많은 천연물들이 연구되고 있으며, 특히 한의학에서 사용되는 한약재들을 응용한 한방화장품이 다양하게 연구, 생산되고 있다. 특히, 한방재로 사용되고 있는 생약, 야채, 과일, 꽃 등의 식물 추출물 가운데 안정성이 뛰어난 속단은 한국, 중국, 일본 등에서 오래전부터 여성의 질환과 퇴행성질환 등에 사용되었으며(R. Y. Ge, C. H. Zhou, et al., J. Tra. Chinese. Med., 3, pp23-26, 1983; S. Sakamoto, H. Kudo, et al., J. Ethnophamacol., 23, pp151-158, 1988; D. Wang, Z. Wang, et al., J. Trad. Chine. Med., 18, pp7-11, 1998), 최근 항암 프로모터, 항 어혈작용(T.Okuyama, M.Matsuda, et al., Natural Medicines, 49, pp261-265, 1995; T.Kosuge, H.Ishida, M.Ishii, Chem. Pharm. Bull., 33, pp1496-1498, 1985) 등에 대한 많은 보고가 있다.

속단(Phlomis Radix)은 꿀풀과(Labiatae)에 속하며, 열매는 수과로 넓은 달걀모양이며 꽃받침으로 싸여 있다. 어린 순을 나물로 하고 굵은 뿌리는 금창(金瘡)과 부인병에 사용하며, 한국·중국 등지에 분포한다(생약학연구회, 현대생약학, 학창사, pp322, 1997).

본 발명의 목적은 속단을 이용하여 그 생리 활성능을 측정하고, 항산화정도 및 항염증 활성을 확인함으로써 기능성 화장품 소재로서의 효율성과 안정성을 확보하여 피부개선에 효능을 가지는 화장료 조성물을 제공하고자 함이다.

상기의 과제를 해결하고자,

본 발명은 속단 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화효과 및 항염효과를 가지는 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 화장료 조성물을 포함하는 크림, 로션, 스킨, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 유액, 젤, 화장수, 미용액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 화장료를 제공한다.

본 발명은 속단(Phlomis radix) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화효과 및 항염효과를 가지는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 속단 추출물은 화장료 조성물 전체 중량%대비, 0.001~20중량%일 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 속단 추출물은 정제수, 알코올, 정제수와 알코올 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매를 사용하여 추출될 수 있다.

본 발명은 상기의 화장료 조성물을 포함하는 크림, 로션, 스킨, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 유액, 젤, 화장수, 미용액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 화장료를 제공한다.

이하 본 발명인 속단 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화효과 및 항염효과를 가지는 화장료 조성물에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명은 기능성 성분인 속단 추출물을 함유한, 피부미용개선을 위한 조성물 및 이를 포함한 일체의 화장품 제형에 관한 것으로, 속단이 가지고 있는 항산화능력과 항염작용으로 피부의 노화가 방지되고, 보다 건강하고 깨끗한 피부를 유지시킬 수 있도록 한다. 항산화효과를 입증하기 위한 4가지 실험예와 항염작용을 입증하기 위한 2가지 실험예는, 본 발명이 기존의 기능성 화장료 조성물과 다르며 보 다 효과적이라는 것을 보여준다.

본 발명에서 상기 속단 추출물은 화장료 조성물 전체 중량%대비, 0.001~20중량%일 수 있고, 바람직하게는 0.01~2중량%일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1중량%일 수 있다. 이 함량은 속단 추출물의 농도가 0.001중량% 미만이 될 때는 제 기능을 발휘하지 못할 정도의 미량이며, 20중량% 초과의 경우는 함량증강에 대한 향상된 효능이 없으며, 경제성을 고려한 수치이다.

또한 본 발명에서 상기 속단 추출물은 정제수, 알코올, 정제수와 알코올 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매를 사용하여 추출될 수 있으며, 바람직하게는 정제수, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에서 가용한 추출물을 포함한다. 혼합용매는 정제수와 알코올비가 1:99~99:1일 수 있다.

이들 용매들을 이용하여 속단으로부터 속단 추출물을 얻는 방법은 냉각 추출법, 초음파 추출법, 환류냉각 추출법, 초임계 추출법을 이용할 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니며, 이 해당분야의 당업자라면 적의 실시 가능한 범위에서의 모든 추출법을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 속단 추출물 뿐만 아니라, 추출후의 잔사를 걸러내어 건조시켜 분쇄하여 화장료 조성물에 첨가할 수도 있다. 추출물 이외의 잔사에도 속단의 유효성분이 잔존하며, 이를 이용시 경제성의 측면에서도 유리하기 때문이다.

본 발명의 속단 추출물은 건조한 속단을 세척 후, 속단 부피의 1~30배의 정제수에 침지한 후 30~150℃에서 0.5~10시간 추출하며, 바람직하게는 속단 부피의 5~15배 정제수에 침지한 후 80~120℃에서 1~5시간 추출하며, 더욱 바람직하게는 속단 부피의 10배 정제수에 침지한 후 100℃에서 3시간 추출한다.

구체적인 추출방법으론, 냉각 추출법, 초음파 추출법, 환류냉각 추출법, 초임계 추출법을 이용할 수 있고, 바람직하게는 환류냉각 추출법으로 추출할 수 있다.

환류냉각 추출법을 이용하는 경우에는 속단 부피의 1~30배 에탄올과 물의 혼합용매를, 10~50℃의 추출 온도에서, 10~60 시간동안 추출하며,

바람직하게는 속단 부피의 5~15배 에탄올과 물의 혼합용매를, 20~30℃의 추출온도에서, 20~30시간동안 추출할 수 있다. 추출한 후 추출액을 원심분리 및 여과, 농축하여 본 발명의 추출물을 수득한다.

본 발명은 상기의 화장료 조성물을 포함하는 크림, 로션, 스킨, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 유액, 젤, 화장수, 미용액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 화장료에 이용될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항산화 및 항염증 효과를 갖는 속단 추출물을 함유하는 화장품소재를 제공한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 피부의 노화방지, 암예방 및 항염증 효과를 위한 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 항산화, 항암 및 항염증용 기능성 화장료 조성물은 당업계에서 통 상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 정제수를 이용한 속단 추출물의 제조

본 실험에 사용된 속단(Phlomis Radix)은 경북 영천시 (주)동우당 제약에서 한국산을 구입하여 물로 세척하고 음건 후 사용하였다. 상기 속단에 속단 전체 중량의 10배의 증류수를 가하여 100℃에서 3시간 환류냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리하는 방법으로, 3회 반복 추출하여 추출물을 수득한 후, 상등액을 원심분리, 여과 및 농축하여 동결건조 후 냉장실에 보관하며 본 실험의 시료로 사용하였다(이하 PRW라 명명함). 또한 침전물을 건조시켜 곱게 분쇄하여 화장료 조성물로써 이용할 수도 있었다.

<실시예 2> 에탄올을 이용한 속단 추출물의 제조

실시예 1의 방법으로 구입한 속단에, 속단 전체 중량의 10배의 70％ 에탄올을 가하여 실온에서 24시간 환류냉각 추출하였다. 상기 추출을 3회 반복 추출하여 추출물을 수득한 후, 상등액을 원심분리, 여과 및 농축하여 동결건조 후 냉장실에 보관하며 본 실험의 시료로 사용하였다(이하 PRE라 명명함). 또한 침전물을 건조시켜 곱게 분쇄하여 화장료 조성물로써 이용할 수도 있었다.

상기의 실시예 이외에도 정제수와 에탄올의 혼합용매를 이용한 추출방법은 해당분야의 기술자가 적의 선택하여 실시할 수 있는 것이므로, 이하 그에 관한 더 이상의 실시예는 생략한다.

<실시예 3> 속단 추출물을 이용한 미용액의 제조

95% 에탄올 60g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 15g, 키툴로오즈 3g, 히얄론산나트륨 2g, 비타민 E 2g, 파라옥시안식향산에스테르 1g, 실시예 1에서 얻은 속단 추출물 10g 및 색소(청색 204호) 1g을 혼합하여 항염증 및 항산화 효과가 있는 미용액을 제조하였다.

<실시예 4> 속단 추출물을 이용한 화장수의 제조

95% 에탄올 80g에 올레이랄콜 0.5g, 향료 1g, 파라옥시안식향산에스테르 1g 실시예 1에서 얻은 속단 추출물 0.1g 및 색소(청색 204호) 1g을 혼합하여 항염증 및 항산화 효과가 있는 화장수를 제조하였다.

이하 상기의 실시예 1 및 실시예 2를 이용하여 제조한 속단 추출물을 이용하여 본 발명의 효과인 항산화효과 및 항염효과를 증명한 실험예들에 대하여 설명한다.

<참고예 1> 기기 및 기구

본 실험에 사용된 기기 및 기구는 다음과 같다. 분광 측정시 UV/vis 분광광도계 (Hitachi 200-10, Japan), ELISA 판독기 (Bio rad, Co., Japan)를 사용하였다.

<참고예 2> 실험시약

항산화 관련 실험에는 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl; Sigma chemical Co., USA), ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline- 6-sulphonic acid); Sigma chemical Co., USA), 피로갈롤(Pyrogallol; Sigma chemical Co., USA), 잔틴 (Xanthine; Sigma chemical Co., USA), 잔틴옥시다아제(Xanthine oxidase; Sigma chemical Co., USA), BHA(Butylated hydroxyanisole; Sigma chemical Co., USA)등을 사용하였으며, Raw 264.7 배양 및 성장억제는 측정에는 소태아혈청 (Gibco BRL Co., USA), 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/Streptomycin; Gibco BRL Co., USA), 트립신(Trypsin; Gibco BRL Co., USA), PBS (Gibco BRL Co., USA), 트리판 블루 염색약(Trypan blue stain; Gibco BRL Co., USA), MMT (Thiazolyl Blue Tetrazolium; Sigma chemical Co., USA)등을 사용하였다.

<실험예 1> 항산화효과 측정

1. 전자공여능 확인 실험

1) 최근 항산화작용을 가진 각종 천연물 및 화학물질을 건강식품 또는 의약품으로 개발하려는 노력이 증대되고 있다. 그동안 항산화활성 측정 방법이 다양하게 개발되었는데, 예를 들어 ORAC(Oxygen radical absorbance capacity)법이나 LDL(Low density lipoprotein)법, β-카로틴 블리칭(carotene bleaching)법, ESR(Electron spin resonance)법 (C. Wiliianm, E. D. Waggoner, Cosmetic Science and Technology Series, 8, 1996)등이 있다. 그러나 이러한 측정방법은 실험 기기의 사용이 복잡하거나 측정하는 시간과 노력이 상대적으로 많이 요구되는 등의 번거러움이 있다. 한편 1958년에 처음 소개된 DPPH 자유라디칼 소거활성 측정법(M. S. Blois, Nature., 181, pp1199-1200, 1958)은 색상의 변화정도를 이용하여 항산화활성을 측정하는 아주 간편한 방법으로 지금도 많은 연구자들이 이 방법을 이용한 항산화활성을 측정하고 있다.

2) DPPH는 라디칼을 갖는 물질 중에서 비교적 안정한 화합물로 EtOH에서 보라색으로 발색된다. 그러나 항산화 활성을 갖는 물질을 만나면 항산화 활성 물질이 DPPH의 라디칼을 소거시켜 보라색을 잃어 탈색되며 UV측정시 그 수치도 낮아진다(H. Matsumura, K. Oka, et al., Contact Dermatitis, 33, pp231, 1995). 또한 실제 항산화활성과도 연관성이 매우 높은 장점이 있는 방법이며 전자공여작용은 활 성 라디칼에 전자를 공여하여 지방질 산화를 억제시키는 척도로 사용되고 있고, 활성 라디칼에 의한 노화를 억제하는 작용의 척도로도 이용되고 있다(W. Aberer, K. E. Anderson, et al., Contact Dermatitis, 28, p1, 1993).

3) 표준물질로 사용한 BHA는 BHT와 더불어 일반적으로 많이 사용되는 페놀계 합성 항산화제이다. 그 효과와 경제성 때문에 많이 사용되어왔지만 합성 식품첨가물의 기피 현상뿐만 아니라 과량 섭취시 간, 위장점막, 폐, 신장, 순환계 등에 심각한 독성을 일으키는 것으로 알려져(T. T. Hatano, T. Yasuhara, et al., Chem. Pharm. Bull., 37, pp1005, 1989),안전한 새로운 항산화제의 개발이 요구되고 있다. 이에 천연물에서 유래한 항산화제를 개발하고자 속단의 항산화 효과를 측정하였다.

4) 속단 추출물의 전자공여능(electron donating ability: EDA)은 Blois의 방법을 변형하여 실시하였다(Blois MS, Nature, 26, pp1199-1120, 1958). 시료용액 2.0㎖에 0.2mM의 DPPH (α-α-diphenyl-β-picrylhydrazyl ) 1.0㎖ 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료용액의 실험구와 대조구의 흡광도 감소율을 측정하여 확인하였다.

5) 실험결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 같은 조건하에서 1,000ppm의 BHA처리군에서는 92%의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었으며, PRW(정제수 이용 속단 추출물)는 83%, PRE(에탄올 이용 속단 추출물)는 88%의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었다. 이를 통해 속단 추출물이 표준물질인 BHA와 유사한 전자 공여능을 보이 는 것을 확인할 수 있었다.

2. ABTS radical cation 저해 실험

1) ABTS radical cation 저해 실험은 total antioxidant activity(TAC)의 측정방법 중의 한 가지로 무색의 환원된 ABTS가 산화되며서 특징적인 청록색을 띄는 ABTS^O+(ABTS radical cation)가 형성되는 것을 이용한 방법이다. 이 청록색 ABTS^O+는 산화될 수 있는 물질과 반응하면 본래의 무색 ABTS로 환원되고 그와 반응한 물질의 산화가 일어나게되어 흡광도의 감소가 일어나게 되고 항산화 능력을 측정할 수 있다.(Carola. H., Carolina. A. and Eduardo. L. : Formation and Decay of the ABTS Derived Radical Cation : A comparison of Different Preparation Procedures. Facultad de Quimica Biologia, Universidad de Santiago Chile, Santiago, Chile ; 2002)

2) 7mM ABTS 5mL와 140mM K2S2O8 88㎕을 섞어 어두운 곳에 12시간 방치시킨후, 이를 absolute ethanol과 약 1:88 비율로 섞어 734nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7±0.002가 되도록 조절한 ABTS solution을 사용하였다. 시료용액 50㎕와 ABTS solution 1mL를 혼합하여 30초간 진탕한 후 2.5분간 반응시키고 734nm에서 흡광도를 측정하여 이하의 수학식 1에 이용하여 라디칼 소거활성을 계산하였다.

[수학식 1]

Radical scavenging activity(%)=( 1- 반응구 OD₇₃₄ / 대조구 OD₇₃₄ )× 100

3) 실험결과 도 2에서 보이는 바와 같이, 같은 실험 조건하에서 1,000ppm의 Arscorbic acid는 100%의 ABTS활성을 나타내었고 PRE에서는 90%, PRW에서는 94%의 ABTS활성을 나타내어 Arscorbic acid와 유사한 활성을 나타내었다.

3. 잔틴 옥시다아제(xanthine oxidase)저해 활성 측정

1) 잔틴 옥세다아제는 모든 퓨린(purine)의 최종산화에서 속도조절 효소로 작용하며 산소종 라디칼이나 과산화수소와 같은 산화제의 근원으로서 작용하는 효소이다(S. Marklund, G. Marklund, Eur. J. Biochem. 47, pp468-474, 1974; T .P .Kennedy, N. V. Rao, et al., J. Clin. Invest., 83, pp1326-1335, 1989). 잔틴 옥시다아제 분자는 네 개의 산화환원반응 활성부위를 포함하고 있으며, 여기에는 Mo, FAD (flavin adenosine dinucleotide), 한 쌍의 4Fe (ferridoxin)형의 4Fe-4S (iron-sulfur) 중심이 있다. NADH를 제외한 퓨린은 잔틴 옥시다제의 Mo 부위에서 작용하고, 반면에 산소는 플라빈 부위에 작용한다(T. P. Kennedy, N. V. Rao, et al., J. Clin. Invest., 83, pp1326-1335, 1989). 분자상의 산소를 수소수용체로 이용하여 잔틴을 요산염으로 산화하는 반응을 촉매하며, 요산염은 통풍의 원인이 되기도 한다(F. Strip and C. E. Della, J. Biol. Chem., 244, pp3855-3863, 1969; W. N. Kelly and J. B. Wyngaarden, Adv. Enzymol. 41, pp23-28, 1974).

2) 통풍은 퓨린의 대사산물인 요산염(uric acid)이 관절낭에 축적되어 염증 반응을 일으키는 것으로 요산 축적과 더불어 이를 탐식한 과립백혈구의 침윤을 동 반하며, 고요산혈증, 관절내 요산결정에 의해 유발되는 반복적인 급성관절염과 만성결절성 통풍으로 주로 관절주위에서 요산의 응집을 볼 수 있고, 결국은 만성적으로 악화와 호전을 거듭하는 통풍성 관절염으로 진행되는 질병이다(T. P. Kennedy, N. V. Rao, et al., J. Clin. Invest., 83, pp1326-1335, 1989). 잔틴 옥시다아제 저해는 통풍억제 및 유리라디칼의 생성억제를 통해 생물학적으로 중요한 의미를 가진다고 할 수 있다.

3) 0.1M 포스패이트 버퍼(phosphate buffer) (pH 7.5) 0.6mL에 속단 추출물 0.1mL과 1mM의 잔틴 0.2mL를 넣는다. 0.2Unit/mL의 잔틴 옥시다아제를 0.2mL를 넣어 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 20% TCA를 넣어 반응을 종료하였다. 이를 원심분리하여 단백질을 제거한 후, 반응액 중에 생성된 요산을 292nm에서 흡광도로 측정하였다. 잔틴 옥시다아제(Xanthine oxidase) 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율인 하기의 이하의 수학식 2를 이용하여 계산하였다.

[수학식 2]

잔틴 옥시다아제 저해율(%)=( 대조군 OD₂₉₂ - 시료 OD₂₉₂ ) / 대조군 OD₂₉₂× 100

4) 실험결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 속단 추출물의 잔틴 옥시다아제 저해활성은 PRW의 경우는 저해활성을 전혀 나타내지 않았으나, 250ppm에서 PRE는 20%의 잔틴 옥시다아제 저해활성을 나타내었다. 같은 조건하에서 BHA 250ppm은 38%의 효과를 나타내었으므로 속단 추출물이 BHA에 유사한 잔틴 옥시다아제 저해활성을 나 타냄을 알 수 있었다.

4. 아질산염 소거능 측정

1) 육가공품이나 수산가공품에 사용되는 질산염이나 아질산염은 육색소인 미오글로빈 및 헤모글로빈과 작용함으로써 니트로소 미오글로빈과 니트로소헤모글로빈을 생성하여 육제품의 발색 및 육색의 안정화에 기여하며 독특한 풍미를 향상 시킨다( Y. H. Choi, Y. K. Park, et al., Korean J. Envion. Biol., 14(1), pp101-107, 1996). 또 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)의 성장을 억제하여 식중독을 예방하고, 산패를 방지함으로써 저장 중 산패취 발생을 감소시킨다 (J. B., jr. Fox and J. S. Thomson, Biochm., 2, pp465, 1964; C. L. Duncan and E. M. Foster, App. Microbiol., 16, pp406, 1968; T. A. Roherts, J. Sci. Food. Agric., 26, pp1755, 1975). 그러나 아질산염이 니트로사민의 전구체인 N₂O₃와 같은 활성 니트로소화 물질을 생성하고, N₂O₃가 2차 아민과 결합하여 발암물질인 N-니트로사민을 생성하는 것으로 보고되고 있으며(L. N. Chrisitiansen, R. B. ompkin, et al., Appl. Microbiol., 27, pp733-737, 1974; Wolf, I. A. and Wasserman, A. E., Science, 177, pp15, 1972), 니트로사민은 체내에서 C_nH_2nN₂으로 변화하여 핵산이나 단백질 또는 세포내의 성분을 알킬화함으로써 암을 유발한다고 보고되고 있다(R. C. Shank, Toxicol. Appl. Pharmacal, 31, pp361, 1975). 또한 아질산염은 그 자신이 독성을 갖고 있기 때문에 일정한 농도 이상 계속 섭취 시 혈액중의 헤모 글로빈을 산화시켜 메트로 헤모글로빈증을 유발하는 것(H. Bartsh, H. Ohshima, et al., Mutes. 202, pp307-324, 1988)으로 알려진 이후, 니트로사민 생성억제인자에 대한 연구가 진행되고 있다.

2) 아질산염 소거능 측정은 Gray와 Dugan(J. Grayand, Jr. L. R. Dugan, J. Food. Sci., 40, pp981-985, 1975) 의 방법으로 측정하였다. 시료 1mL과 1mM NaNO₂ 1mL에 0.1N HCl로 pH 1.2로 보정하여 반응용액의 부피를 10mL로 하였다. 이 반응용액을 37℃에서 1시간 반응한 다음 각 반응액 1mL을 취하여 2% 초산용액 5mL로 반응정지 시킨 후, 그리스 시약 0.4mL을 첨가하였다. 이를 교반 후, 실온에서 15분간 방치하고 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염양을 측정하였다. 대조군는 그리스 시약대신 증류수를 첨가하여 측정하였으며, 아질산염 소거능은 대조구에 대한 시료구의 흡광도의 감소율로 나타내었다.

3) 실험결과 도 4에 보는 바와 같이, 양성대조군인 BHA의 1,000ppm 처리군은 32%의 아질산염 소거능을 보였다. 같은 조건하에서 PRW는 50%, PRE는 48%의 아질산염 소거능을 나타내어 속단 추출물이 표준물질인 BHA에 비해 아질산염소거능이 우수함을 알 수 있었다.

<실험예 2>

1. 염증은 신체 국소에 일어나는 상해에 대하여 생체조직의 방어반응이라 정의할 수 있다. 즉 각종 유해한 자극에 응답하여, 자극에 의한 상해를 제거하여 원 래의 상태로 회복하려는 생체방어반응이다. 염증에 관여하는 화학적 매개체는 히스타민과 같은 혈관 작동성 아민, 키닌류와 보체계 등과 같은 단백질 분해 연쇄반응으로 크게 나눌 수 있다. 이중 단백질분해 연쇄반응은 키닌류와 C3a, C5a와 같은 보체계, COX-2와 같은 아라키돈산 대사산물, 혈소판활성화인자(platelet activiating factor), 사이토카인, 니트릭 옥사이드(Nitiric oxide)등이 있다. NO는 무기 저분자 라디칼로서 과거에는 대기오염에 관계하는 오염 물질정도로 인식되었다(약품생화학분과위원회 편, 분자약품생화학, pp59, 2003).

그러나 현재는 EDRF(endothelium-derived relaxing factor)로서 혈관평활근의 이완작용뿐만 아니라 중추, 말초 신경계에도 신경정보를 전달하는 물질로 밝혀짐으로써 그 기능이 다각도로 연구되어지고 있다(G. D. Lee, H. G. Chang, Korean.J. Food. Sci. Technol., 29, pp432-436, 1997). 최근에는 혈액응고 및 혈압조절기능, 암세포에 대항하는 면역기능, 세포사에 영향 등이 밝혀졌다(S. Monocada, A. Higgs, NEng. J. Med., 329, pp2002-2012, 1993; H. T. Chung, H .O. Pae, et al., Biochem biophys res commum, 282, pp1075-1079, 2001). 염증부위의 활성화된 대식세포는 사이토카인 뿐 아니라 아라키돈산 대사체 그리고 NO등을 대량 생산함으로써 염증 매개에 큰 역할을 한다.

NO는 물리 화학적 성상에 따라 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 형의 3종류의 동종 효소로 나누어진다. Type Ⅰ (neuronal NOS, nNOS)와 type Ⅲ (endothelial NOS, eNOS)는 세포 속에 계속적으로 존재하기 때문에 구성 NOS (constitutive cNOS)라고 하며, 일부 세포에서 LPS, 사이토카인 및 박테리아 독소 같은 특수한 자극제들에 노출되는 경 우에만 발현되는 Ⅱ형인 유도형 NOS (iNOS)로 나눈다(Y. M. Kim, C. A. Bombeck, Circ res., 1(4), pp253-256, 1999).

cNOS는 일정하게 발현되어 물리적 기능을 매개하는 NO를 낮은 수치로 생성한다. 반면 iNOS는 LPS, 사이토카인같은 자극에 의해 급격하게 유도되어, 과량의 NO를 생성하는 것으로 알려져 있다. 염증 반응에서의 NO 생성은 거의 iNOS에 의한 것이라 할 수 있다(C. Nathan, RASEB. J., 6, pp3051-3064, 1992; Y. C. Huang, J. H. Guh, et al., Eur. J. Pharmacol., 418, pp133-139, 2001). 특히 iNOS에 의해 생성된 NO는 병리적인 혈관확장, 세포독성, 조직 손상 등 생체에 유해한 작용을 나타낸다. 또한 염증상태에서 iNOS에 의해 생성된 NO가 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐 아니라, 사이클로 옥시다아제를 활성화하여 프로스타글란딘과 같은 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다.

따라서 iNOS에 의한 NO 생성을 저해하는 새로운 염증치료제를 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이에 천연물인 속단을 이용하여 속단이 NO 를 나타내는 것을 확인함으로써 항염증효과를 살펴보았다.

2. NO(Nitric oxide) 저해활성 측정

1) NO 저해활성은 Ding(A. J. Ding, C. F. Nathan, and D. J. Stuehr, J. Immunol., 144, pp2407-2413, 1988)등의 방법을 통하여 다음과 같이 실험하였다. 쥐의 대식세포인 Raw 264.7 세포주에 LPS(lipopolysaccharide)와 속단 추출물을 각 각 처리하고, 12시간마다 NO양을 측정하였다. 세포 배양액 중에 존재하는 NO^2-를 그리에스 시약을 이용하여 측정하였다. 세포배양 상등액 100㎕와 그리에스 시약 100㎕을 혼합하여 반응하여 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO^2-의 양은 NaNO₂의 표준곡선을 이용하여 정량하였다.

2) 실험 결과 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, LPS 처리시 대조군에 비교하여 NO 생성량이 증가하였다. PRW와 PRE의 경우 모든 농도에서 24시간과 36시간 처리시 유의한 NO의 생성저해가 나타나지 않았다. 이를 통해 속단 추출물이 NO생성을 저해한다는 것을 확인 할 수 있었다.

3. 세포 생존률 측정

1) 속단 추출물의 처리시 LPS로 유도된 NO의 생성 감소가 추출물의 세포독성으로 인한 세포농도의 저하에서 기인하는 것인지 관찰하기위해 MTT 어세이를 통해 세포의 생존율을 Carmichael (J. Carmichael, W. G. Degraff et al.., Cancer Res., 47, pp936, 1987)등의 MTT 어세이를 통해 평가하였다. 96 웰 플래이트에 5×10⁴세포/웰로 분주한 후 속단 추출물을 농도별로 처치하였다. 배양 후 생존세포에 MTT (5mg/mL)을 4시간 처리 한 후 배지를 제거하고 생성된 포르마잔 결정을 DMSO에 녹여 그 흡광도를 540nm에서 측정하였다. 대조군에 대한 백분율로 대식세포의 생존률을 나타내었다.

2) 실험결과 도 7 및 도 8과 같이 PRW와 PRE의 경우 대조군에 비해 세포독성이 나타나지 않아 NO 생성자체를 저해한 것을 확인 할 수 있었다.

본 발명은 천연물질인 속단을 이용하여 화장료 조성물을 제공함으로써, 수요자들이 안심하고 효과적으로 기능성 화장료를 사용할 수 있도록 하고, 공급자의 화장료 응용의 범위를 넓혀주어 이윤창출에도 기여하며, 궁극적으로 국가의 산업발전에 이바지 할 것으로 기대된다.

도 1은 속단의 물 추출물과 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 2는 속단의 물 추출물과 에탄올 추출물의 ABTS 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 3은 속단의 물 추출물과 에탄올 추출물의 잔틴 옥시다아제 저해활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 4는 속단의 물 추출물과 에탄올 추출물의 아질산염 소거능 저해활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 5는 속단의 물 추출물의 NO 생성 억제율을 농도 및 시간별로 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 6은 속단의 에탄올 추출물의 NO 생성 억제율을 농도 및 시간별로 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 7은 속단의 물 추출물의 세포독성을 MTT 에세이를 통해 나타낸 그래프이다.

도 8은 속단의 에탄올 추출물의 세포독성을 MTT 에세이를 통해 나타낸 그래프이다.

Claims

속단 추출물을 유효성분으로 함유하되, 상기 속단 추출물은 화장료 조성물 전체 중량%대비, 0.001~20중량%인 것을 특징으로 하는 항산화효과 및 항염효과를 가지는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 속단 추출물은 정제수, 알코올, 정제수와 알코올 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매를 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는 항산화효과 및 항염효과를 가지는 화장료 조성물.
제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 화장료 조성물을 포함하는 크림, 로션, 스킨, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 유액, 젤, 화장수, 미용액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 화장료.