KR20100042459A - 미량 원소 함량이 증가된 벼 품종 및 이를 이용한 기능성 식품 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 벼의 OsNAS3 유전자의 활성화에 의해 미량 원소의 함량이 야생형에 비해 증가된 형질전환 식물체 및 상기 형질전환 식물체로부터 생성된 산물을 함유하는 기능성 식품에 관한 것이다.
벼, OsNAS3, 철
Description
본 발명은 벼의 OsNAS3 유전자의 활성화에 의해 미량 원소의 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 상기 형질전환 식물체로부터 생성된 산물을 함유하는 기능성 식품에 관한 것이다.
철은 지구상에 존재하는 원소들 중에서 4번째로 많은 양을 차지하고 있으나, 식물에 의해 쉽게 이용되지 못한다. 왜냐하면, 토양에서 철은 대부분 옥시히드레이트 (oxyhydrate) 형태로 존재하고, 용해도도 매우 낮기 때문이다. 또한, 전 세계 토양의 약 30%는 염기성을 나타낸다. 이러한 성질을 갖는 토양에서 철은 용해도가 극히 낮은 Fe2O3 형태로 존재하여, 식물의 생장을 어렵게 만든다 (Mori, Curr Opin Plant Biol 2:250-253, 1999). 이렇게 철의 부족은 식물에 치명적인 영향을 미친다. 특히, 철의 부족은 엽록소의 합성과 엽록체의 발달에 영향을 미쳐 식물의 생산량을 감소시킨다.
철은 인간 건강에도 중요한 의미를 갖는다. 철은 세포 내 여러 가지 기능에 필요한 필수 불가결한 미량의 금속 원소 중의 하나이다. 세계 보건 기구 (WHO)에 따르면, 전 세계 인구의 30% 정도는 철 부족으로 인한 빈혈에 걸려 있고, 이들 대부분은 저개발 국가에 집중되어 있다.
식물은 두 가지 방법으로 철 부족을 극복한다고 알려져 있다 (Marschner et al., J. Plant Nutr 9:3-7, 1986). 대부분의 식물은 Fe3+를 Fe2+로 환원시킨 후 흡수하는 반면, 벼나 보리와 같은 벼과 식물은 철이 부족할 때 파이토시데로포어 (phytosiderophore)라는 철 결합 물질을 토양에 분비하여 Fe3+를 결합시켜 용해도를 높혀, 철과 파이토시데로포어의 복합체 (complex)를 흡수한다.
벼는 인류에게 중요한 주식으로, 다량의 철을 함유하는 벼 품종의 개발은 인간의 건강 증진을 위해 중요한 의미를 갖는다. 따라서, 유전 공학에 의해 철이 많은 벼 품종을 육성하는 것은 전통적인 육종 방법의 한계를 극복하고 철 부족으로 인한 인류의 건강 문제를 해결하기 위한 대안으로 제시되고 있다 (Qu et al., Planta 222:225-233, 2005).
이러한 노력의 일환으로, 식물에 원래 존재하는 철 저장 단백질인 페리틴 (ferritin)의 양을 증가시켜 철 함량을 높이는 방법이 제시되었다 (Theil et al., Annu Rev Biochem 56:289-315, 1997). 이 방법은 콩의 페리틴 유전자를 배유 특이적 발현 (endosperm-specific expression)을 보이는 벼의 글루텔린 (glutelin) 프로모터를 이용하여 형질전환시킨 것으로, 생성된 벼 종자는 대조군에 비하여 철 함량이 3배 증가하였다 (Goto et al., Nat Biotech 17:282-286, 1999). 또한, 강남콩 (Phaseolus vulgaris)의 페리틴 유전자를 벼 종자에서 과발현시킨 결과, 철 함량이 2배 증가하였다 (Lucca et al., Theor Appl Genet 102:392-397, 2001).
대한민국 등록특허 제10-471679호에 따르면, 콩과 벼로부터 페리틴을 발현하는 유전자를 분리한 다음, 벼와 옥수수의 종자 저장 단백질인 글로불린, 글루텔린 및 제인으로부터 분리된 배유 특이 프로모터와 결합하여 배유에서만 특이적으로 발현하는 발현 벡터를 제조하고, 이 발현 벡터로 형질전환시켜 고농도로 철 생산 능력을 가진 벼에 대해 기술하고 있다. 그러나, 이 방법은 벼 이외의 작물인 콩, 옥수수 등으로부터 유래된 유전자를 이용하는 것이다.
대한민국 등록특허 제10-454083호에 따르면, 뮤지네이산류 생합성 경로 중의 효소인 니코티아나민 아미노그룹 전이효소 (nicotianamine aminotransferse: NAAT)를 코딩하는 유전자를 벼과 식물에 도입하여, 철 흡수성이 개선된 벼과 식물을 기술하고 있다. 그러나, 이 방법은 니코티아나민 아미노그룹 전이효소를 코딩하는 유전자를 이용하는 것이다.
대한민국 공개특허 제10-2003-84892에 따르면, 니코티아나민의 케토체를 2'-데옥시뮤지네이산으로 환원하는 환원효소를 코딩하는 유전자를 도입하여 철 결핍 내성이 강화된 식물을 제조하는 것을 기술하고 있다. 그러나, 이 방법은 니코티아나민의 케토체를 2'-데옥시뮤지네이산으로 환원하는 환원효소를 코딩하는 유전자를 이용한 것이다.
한편, 니코티아나민 (nicotianamine, NA)은 식물체 내에 존재하는 금속 원소 들과 결합하는 킬레이터 (chelator)로서, 금속 원소들의 흡수와 항상성 유지에 중요한 역할을 한다 (Douchkov et al., Plant Cell Environ 28:365-374, 2005). NA는 식물에 존재하는 니코티아나민 합성효소 (Nicotianamine synthase, NAS) 유전자에 의해 3 개의 S-아데노실 분자로부터 만들어진다.
본 발명자는 벼에 원래 존재하는 OsNAS3 유전자를 활성화시켰을 때 미량 원소의 함량을 증가되었음을 밝혀 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 벼 자체에 존재하는 유전자의 활성화에 의해 미량 원소의 함량이 야생형에 비하여 증가된 형질전환 식물체 및 상기 형질전환 식물체로부터 생성된 산물을 함유하는 기능성 식품을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 예시적 구체예는 미량 원소의 함량이 증가된 식물체를 제공한다.
상기 식물체는 철, 아연 및 구리로부터 선택되는 하나 이상의 금속 함량이 야생형 식물체에 비하여 증가되어 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 식물체는, 철 및/또는 아연이 야생형 식물체에 비하여 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 금속 함량의 증가된 정도는, 30%이상, 50%이상, 70%이상일 수 있다.
상기 식물체는 OsNAS3 유전자의 발현이 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 OsNAS3 유전자는 서열번호 2 (GenBank 허가번호 : AB023819)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자일 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 그러나, 상기 OsNAS3 유전자는 OsNAS3 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것은 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, OsNAS3 단백질 활성을 갖는, 상기 서열번호 2와 같은 단백질의 변이체가 포함될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물체는 단자엽 식물일 수 있다. 예를 들면, 벼, 보리 및 옥수수일 수 있다. 상기 식물체는, 식물체 전체, 뿌리, 잎, 종자, 및 상기 식물체로부터 분리된 세포일 수 있다. 또한, 상기 식물체에는 식물체로부터 생산된 종자도 포함한다.
상기 식물체에 있어서, OsNAS3 유전자의 발현을 증가시키는 것은, 세포 내에 존재하는 내재적 유전자의 발현을 증가시키는 것과 관련된 분야에서 알려진 임의의 방법에 의하여 이루어진 것일 수 있다. 예를 들면, 트란스포존 요소 (transposable element: TE)나 T-DNA와 같은 삽입 요소 (insertion element)를 식물체의 게놈 내에 도입하는 삽입 돌연변이 법이 사용될 수 있다. 삽입 돌연변이 법은 삽입된 요소가 유전자 확인을 위한 태그 (tag)로서 작용한다는 잇점이 있다. 또한, 변형된 삽입 돌연변이 법이 사용될 수 있다. 변형된 삽입 돌연변이 법의 일 예는, 상기 태그되는 유전자와 β-글루쿠로니다제 (gus) 또는 녹색형광단백질 (gfp)와 같은 리포터 유전자 사이를 융합시키는 것을 포함하는 유전자 포획 시스템 (gene trap system)이다. 이 시스템에 의하면, 발현 양상에 근거하여 유전자를 확인할 수 있다. 프로모터 없는 리포터의 삽입은 정상 유전자 기능을 파괴할뿐만 아니라, 삽입된 리포터 유전자의 방향이 맞으면, 리포터가 발현되어 삽입된 유전자의 발현을 반영함으로 유용한 프로모터 분리도 가능하다. 변형된 삽입 돌연변이 법의 다른 예는, 활성화 태그시스템 (activation tagging system)이다. 이 시스템은 멀티머화된 CaMV 35S 인핸서를 포함하는 T-DNA 또는 TE를 사용한다. 인핸서는 방향에 무관하게 코딩 영역으로부터 상당한 거리에서도 기능을 하기 때문에, 인접하는 유전자의 전사활성화를 야기시켜, 우성 기능획득 돌연변이체 (dominant gain-of-function mutations)를 형성시킬 수 있다. 상기 방법들에 의하여 형성된 돌연변이체 중에서 OsNAS3 유전자의 발현을 증가된 개체를 선발함으로써, 상기 식물체를 얻을 수 있다 (Jung et al., Plant Physiology 130: 1636-1644). 상기 식물체는, 예를 들면, 상기 OsNAS3 유전자의 발현을 증가시키기 위하여 인핸서가 도입된 것, 또는 상기 유전자의 카피 수가 증폭된 것일 수 있다. 상기 인핸서의 예에는, CaMV 35S 인핸서 (Cauliflower mosaic virus 35S enhancer) 또는 이들의 연결체 (예를 들면, 4개의 연결체)일 수 있으며, 이들 인핸서는 벡터, 예를 들면, pGA2715 (Jung et al., Plant Physiology 130: 1636-1644) 및 pGA2772 ( Jung et al., Plant J 45:123-132, 2006)와 같은 활성화 태그 벡터 (activation tagging vector)에 의하여 식물체의 게놈 내로 도입되는 것일 수 있다. 상기 인핸서는 선택된 인핸서의 특성에 따라, 상기 OsNAS3 유전자와 적절한 위치에 배치될 수 있다. 예를 들면, 상기 OsNAS3 유전자의 5', 3' 또는 5' 및 3'말단에 인접하거나, 이격되어 위치할 수 있다. 예를 들면, 상기 인핸서는 CaMV 35S 인핸서이며, 상기 OsNAS3 유전자의 하류 (downstream), 예를 들면, 유전자의 중지 코돈으로부터의 하류로 10kb 이내, 예를 들면, 1.5kb 및/또는 1.9kb에 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 인핸서는 CaMV 35S 인핸서이며, 상기 OsNAS3 유전자의 상류 (upstream), 예를 들면, 유전자의 시작 코돈으로부터 상류로 10kb 이내, 예를 들면, 1.5kb 및/또는 1.9kb에 도입된 것일 수 있다. 상기 인핸서는 단독 또는 복수 개가 연결되어 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 인핸서는 4개 카피의 CaMV 35S 인핸서가 연속하여 연결되어 있는 것일 수 있다.
식물체에 외래 핵산 구조체, 예를 들면, 인핸서를 도입하는 방법은 알려져 있다. 예를 들면, 상기 구조체의 도입은 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) Ti 플라미스미드, 전기천공 (electroporation) 및 충 격법 (bombardment)을 통하여 도입될 수 있다. 또한, 식물체에 외래 핵산 구조체를 도입하는 것은, 특정한 위치에 위치 특이적으로 도입하거나, 무작위적으로 도입한 후 특정한 형질을 갖는 식물체를 선발함으로써 이루어질 수 있다.
상기 식물체의 일 예는, 종자 수탁번호: KACC 98004P 또는 KACC 98005P로 기탁된 벼가 될 수 있다. 상기 벼는 철 및 아연 함량이 야생형 벼에 비하여, 증가되어 있다. 또한, 상기 벼는 아연, 구리 또는 니켈이 증가된 조건에서 내성을 가지고 생육할 수 있다.
본 발명의 다른 예시적 구체예는, 중금속에 대하여 내성을 갖는 식물체를 제공한다. 상기 식물체에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 중금속은 아연, 구리, 및 니켈로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 내성의 정도는 5mM 이상의 아연, 0.3mM 이상의 구리, 또는 0.5mM 이상의 니켈에서 생육할 수 있다..
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본 발명의 다른 예시적 구체예는, 상기한 본 발명의 예시적 구체예에 따른 식물체를 철 및 아연으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상이 부족한 조건에 생육시키는 단계를 포함하는, 식물체를 생육시키는 방법을 제공한다. 상기 철 및 아연의 농도는 예를 들면, 철 및 아연이 포함되어 있지 않은 MS 배지 또는 그와 유사한 조건에서 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 예시적 구체예는, 상기한 본 발명의 예시적 구체예에 따른 식물체를 과량의 중금속이 존재하는 조건에 생육시키는 단계를 포함하는, 식물체를 생육시키는 방법을 제공한다. 상기 중금속은 5mM 이상의 아연, 0.3mM 이상의 구리, 또는 0.5mM 이상의 니켈인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 예시적 구체예는, 상기한 본 발명의 예시적 구체예에 따른 식물체를 높은 pH 조건에 생육시키는 단계를 포함하는, 식물체를 생육시키는 방법을 제공한다. 상기 pH는 7.5이상, 8.0이상, 또는 8.5 이상인 것일 수 있다. 상기 pH는 6.0 내지 10, 6.0 내지 9, 또는 7.0 내지 9일 수 있으나 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 식물체를 pH 8.5의 MS 배지 또는 그와 유사한 조건에서 배양하는 것일 수 있다. 통상적으로 벼는 pH 5.6 내지 5.8에서 배양한다.
본 발명의 다른 예시적 구체예는, 상기 식물체를 포함하거나 그로부터 생성된 산물을 함유하는 기능성 식품을 제공한다. 상기 기능성 식품은 철, 아연 및 구리로부터 선택된 하나 이상이 증가되어 있는 것이다. 상기 기능성 식품은 상기 식물체의 종자, 예를 들면, 쌀을 포함하거나 그로부터 가공된 산물일 수 있다.
본 발명의 다른 예시적 구체예는, 미량 원소 함량이 증가된 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법의 일 예는, 외래 인핸서를 포함하는 구조체를 식물체에 도입하여, OsNAS3 유전자의 발현이 증가된 식물체를 얻는 단계를 포함한다. 인핸서, 식물체, 상기 구조체를 식물체에 도입하는 방법 및 OsNAS3 유전자에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 OsNAS3 유전자의 발현이 증가되었는지 여부는, 당업계에 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 직접적인 효소 활성 측정, 핵산 증폭 방법에 의한 OsNAS3 유전자의 mRNA 수준의 측정, 또는 발현된 단백질의 양을 측정함으로써 이루어질 수 있다. 상기 핵산 증폭 방법에는 RT-PCR 등을 포함한 PCR이 포함된다. 상기 단백질의 양 측정에는, ELISA, 웨스턴 블롯팅 등과 같은 면역학적 방법이 사용될 수 있다. 상기 방법은, 상기 OsNAS3 유전자의 발현이 증가 여부와 함께, 철, 아연 및 구리로부터 선택된 하나 이상이 야생형에 비하여 증가되었는지 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 철, 아연 및/또는 구리의 함량을 측정하는 방법은 알려져 있다.
예를 들면, 상기 방법은, 꽃양배추 모자이크 바이러스의 프로모터로부터 유래한 35S 인핸서가 삽입된 Ti 플라스미드를 식물체 도입하는 단계; 상기 35S 인핸서가 OsNAS3 활성을 코딩하는 유전자의 상류 및 하류 중 하나 이상의 위치에 삽입된 식물체를 선발하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 Ti 플라스미드는 아그로박테리움 투메파시엔스에 포함된 원형 플라스미드로서, 식물체에 유전 물질을 도입하기 위하여 사용된다. 상기 35S 인핸서를 Ti 플라스미드에 도입하는 것은, 적절한 제한효소 및 리가제 등을 사용하여 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 상기 35S 인핸서는 Ti 플라스미드의 T-DNA의 좌측 및/또는 우측 경계 (border)에 위치할 수 있다. 상기 35S 인핸서는 하나 이상, 예를 들면, 4개가 인접되어 있는 것일 수 있다. 예를 들면 pGA2715 벡터 또는 pGA2772 벡터에 의해 삽입될 수 있다. 상기 Ti 플라스미드를 식물체에 도입하는 것은, Ti 플라스미드를 아그로박테리움 투메파시엔스에 도입하고, Ti 플라스미드가 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스를 식물체에 감염시킴으로써 이루어질 수 있다. 일반적 으로, Ti 플라스미드의 T-DNA 영역이 식물체의 염색체에 삽입된다.
상기 방법은 상기 35S 인핸서가 OsNAS3 활성을 코딩하는 유전자의 상류 및 하류 중 하나 이상의 위치에 삽입된 식물체를 선발하는 단계를 포함한다. "OsNAS3 활성"이란 3분자의 S-아데노실-L-메티오닌을 3 S-메틸-5'-티오아데노신 + 니코니아나민으로 전환시키거나 그 역으로 전환시키는 반응 촉매하는 활성을 의미한다. 바람직하게는, 상기 OsNAS3 활성은 서열번호 2의 아미노산을 갖는 단백질에 의한 것일 수 있다. 상기 OsNAS3 활성을 코딩하는 유전자에는 서열번호 2의 아미노산을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자, 예를 들면, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 35S 인핸서가 OsNAS3을 코딩하는 유전자 상류 및 하류 중 하나 이상의 위치에 삽입되었는지 여부는, 서열분석 또는 핵산 증폭에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 식물체는 바람직하게는 벼 (Oryza sativa)이다. 예를 들면, 상기 35S 인핸서는 OsNAS3 활성을 코딩하는 서열번호 1의 염기 서열의 하류 약 1.5 kb 또는 약 1.9 kb에 삽입될 수 있다.
도 1은 T-DNA가 삽입된 DNA 구조체의 일 형태를 나타낸 것이다. 도 1에서 ATG에서 TGA까지의 박스로 표시된 부분은 OsNAS3 유전자의 엑손을 나타낸다. T-DNA는 OsNAS3 유전자의 TGA 종결코돈 뒤 약 1.5kb에 삽입될 수 있다 (OsNAS3-D1 형질전환 식물체). 또한, T-DNA는 OsNAS3 유전자의 TGA 종결코돈 뒤 약 1.9kb에 삽입될 수 있다 (OsNAS3-D2 형질전환 식물체).
본 발명은 벼에 원래 존재하는 유전자를 더욱 활성화시켜 야생형 (WT)에 비하여 미량 원소의 함량을 증가시켰다.
또한, 본 발명은 벼 종자에서 미량 원소 특히 철분의 함량을 증가시켜 농업적, 영양학적 이익을 증가시켰다.
또한, 본 발명은 철, 아연 등의 미량 원소가 부족한 생육 조건에서 더 잘 견디는 벼 품종을 제공하였다.
또한, 본 발명은 과량의 중금속이 포함된 생육 조건에서 더 잘 견디는 벼 품종을 제공하였다.
또한, 본 발명은 철의 용해도가 낮아 식물이 제대로 이용할 수 없는 높은 pH 조건에서 더 잘 견디는 벼 품종을 제공하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예1:
OsNAS3
유전자의 발현이 활성화된 형질전환 식물체의 분리
(1) 벼에 존재하는 3개의
니코티아나민
합성효소 유전자의 발현 분석
벼에는 3개의 니코니아나민 신타제 (Nicotianamine synthase) (OsNAS1, OsNAS2, OsNAS3)가 존재하고, 효소로서의 활성이 있음이 보고되었다 (Inoue et al., Plant J 36:366-381, 2003). 미량 원소의 유무에 따른 위 3개의 유전자의 발현 정도를 알아보았다. 벼의 종자를, MS (Murashige and Skoog) 배지 (0.1μM CuSO4, 100μM Fe(III)-EDTA, 30μM ZnSO4, 10μM MnSO4를 포함함)에서 발아시키고, 7일 동안 길렀다. 동일한 방법으로 0.1μM CuSO4, 100μM Fe(III)-EDTA, 30μM ZnSO4, 또는 10μM MnSO4이 없는 MS 배지에서 벼 종자를 발아시키고, 7일 동안 길렀다. 벼의 뿌리와 잎으로부터 RNA를 준비하였고, 그 발현 정도를 정량적 실시간 RT-PCR로 분석하였다. PCR 조건은, 95℃에서 1 분을 유지한 후, 94℃에서 15초, 56℃에서 10초 및 72℃에서 10초를 45회 반복하였다. 사용한 프라이머는 다음과 같다. 발현 대조군으로서, 벼 액틴 1 유전자를 증폭하였다.
프라이머 서열
OsNAS1-정방향 프라이머: 5'-ACTCCATTTGGTTGTCATTTT-3'(서열번호 4)
OsNAS1-역방향 프라이머: 5'-GGTTGACGTAGTTGCCGTAGTA-3'(서열번호 5)
OsNAS2-정방향 프라이머: 5'-GTGATCAACTCCGTCATCGT-3'(서열번호 6)
OsNAS2-역방향 프라이머: 5'-TGACAAACACCTCTTGCTTTC-3'(서열번호 7)
OsNAS3-정방향 프라이머: 5'-GTGATCAACTCCGTCATCATC-3'(서열번호 8)
OsNAS3-역방향 프라이머: 5'-TCAGTCTCATCATGGGAAAAA-3'(서열번호 9)
OsAct1-정방향 프라이머: 5'-TGGAAGCTGCGGGTATCCAT-3' (서열번호 15)
OsAct1-역방향 프라이머:5'-TACTCAGCCTTGGCAATCCACA-3'(서열번호 16)
그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서, 세로축은 벼 액틴 1 유전자의 발현 양을 기준으로 발현 정도를 나타낸다.
도 2에 나타낸 바와 같이, OsNAS1과 OsNAS2 유전자는 벼가 철을 포함하지 않는 배지에서 자라는 경우, 철을 충분히 포함하는 배지에서 자란 경우에 비하여, 상대적으로 잎에서 강하게 발현이 유도되었으며, 뿌리에서는 그 유도 정도가 약하게 증가하였다. 반면, OsNAS3 유전자는 벼가 철을 포함하지 않는 배지에서 자라는 경우, 철을 충분히 포함하는 배지에서 자란 경우에 비하여, 뿌리에서 약 2배 정도 강하게 발현이 유도되었으나, 잎에서는 철이 부족한 조건에서는 발현이 오히려 감소하였다. 이는 OsNAS3이 OsNAS1과 OsNAS2와는 다른 역할을 하는 것으로 추측되어, OsNAS3을 표적 유전자로 선택하였다. 도 2에서 사용되는 벼는 동진 벼이다.
(2)
OsNAS3
유전자의 발현이 활성화된 형질전환 식물체의 제조와 분리
형질전환 벼를 제조하기 위한 구조체로서 T-DNA 벡터인 pGA2715 벡터를 이용하였다 (Jeong et al., Plant Physiol 130:1636-1644,2002). 상기 벡터는 우측 경계에 인접하여 β-글루쿠로니다제 (GUS) 리포터 유전자를 포함하고 있고, 좌측 경계에 인접하여 CaMV 35S 프로모터 유래 테트라머화된 전사 인핸서를 포함한다. 상기 pGA2715 벡터를 Agrobacterium에 형질 전환시키고, 형질 전환된 Agrobacterium을 이용하여 양생형인 동진 벼에 형질전환하여, pGA2715가 형질 도입된 벼 식물체 집단을 제조하였다 (Lee et al, J Plant Biol 42:310-316, 1999; Jeong et al., Plant Physiol 130:1636-1644, 2002).
형질도입된 벼 식물체로부터 분리된 게놈 DNA에 대하여 역전-PCR (inverse PCR)을 통하여 pGA2715 벡터 중의 T-DNA가 삽입된 위치를 확인하였다. 그 결과 T- DNA가 OsNAS3 유전자의 주변에 삽입된 두 개의 형질전환 식물체를 분리하였다.
그 중 OsNAS3-D1 형질전환 식물체는 OsNAS3 유전자의 하류 약 1.5 kb에 35S 인핸서를 좌측 경계 부위에 포함하는 T-DNA가 삽입되어 있고, OsNAS3-D2 형질전환 식물체는 하류 약 1.9 kb에 35S 인핸서를 좌측 경계 부위에 포함하는 T-DNA가 삽입되어 있는 것이다. 도 1은 OsNAS3-D1과 OsNAS3-D2에서 T-DNA의 삽입 위치를 나타낸 것이다.
실시예 2: 형질전환 식물체에서
OsNAS3
의 발현 증가
상기 실시예1에서 선별된 OsNAS3-D1과 OsNAS3-D2의 유전형을 PCR을 통해 결정하였다. OsNAS3-D1과 OsNAS3-D2의 T2 세대 개체들의 잎에서 게놈 DNA를 추출하였고 이를 PCR의 주형 DNA로 사용하였다. OsNAS3-D1에 대해서는, 2개의 유전자-특이적 프라이머 F2 (5'-TTTAGGGGAAATGGAGGTTACT-3', 서열번호 10)와 R2 (5'-CTGTAACACTTTAACGCACCAA-3', 서열번호 11) 및 T-DNA 특이적 프라이머 RB (5'-CAAGTTAGTCATGTAATTAGCCAC-3', 서열번호 12)를 사용하였다. OsNAS3-D2에 대해서는, 2개의 유전자-특이적 프라이머 F2 (서열번호 10)와 R3 (5'-GGCTTGCTCTTGTCATAGGC-3', 서열번호 13) 및 T-DNA 특이적 프라이머 RB (서열번호 12)를 사용하였다.
발현량을 알아보기 위하여, OsNAS3-D1과 OsNAS3-D2의 동형접합체 및 각각의 야생형 벼, 즉 동진 벼(WT)의 10일령의 잎으로부터 RNA를 분리하고, 역전사 효소를 이용하여 각각의 cDNA를 제조하였다. 제조한 cDNA를 주형으로 하고 서열번호 8과 9의 프라이머를 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행하여, OsNAS3 유전자 전사량을 비교 하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 세로축은 벼 액틴 1 유전자 전사량에 대한 상대적인 전사량을 나타낸 것이다.
도 3에서와 같이, OsNAS3 유전자의 발현은 OsNAS3-D1에서는 야생형 (WT)에 비해 약 60배 증가하였고, OsNAS3-D2에서는 야생형 (WT)에 비해 약 30배 증가하였다.
실시예 3: 형질전환 식물체에서 미량 원소 함량의 측정
OsNAS3 유전자의 활성화가 벼의 미량 원소 축적에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 야생형 (WT), 형질전환 식물체인 OsNAS3-D1과 OsNAS-D2에서 미량 원소를 측정하였다. 야생형과 형질전환 식물체의 성숙한 종자 및 지엽 (flag leaves)을 시료로 사용하였고, 미량 원소 측정 방법은 Kim et al., Physiol Plant 116:368-372, 2002에 기재된 방법을 참고하였다. 시료를 70℃에서 2일 동안 건조시키고, 건조량을 기록하고, 얻은 시료를 11N HNO3 1 ml에서 3일 동안 180℃ 오븐에서 분해시켰다. 희석한 다음, 원자 흡수 분광분석법 (atomic absorption spectroscopy: AAS) (Solaar 989, Unicam Atomic Abosorption, Cambridge, UK)에 의해 시료 내 미량 원소 철, 아연, 구리, 망간의 함량을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1.
| 조직 | 표현형 | 유전형 | Fe (㎍/g-Dw) | Zn (㎍/g-Dw) | Cu (㎍/g-Dw) | Mn (㎍/g-Dw) |
| 지엽 | OsNAS3-D1 | W/W | 92.26±5.98 | 20.37±3.55 | 3.93±0.84 | 652.69±66.43 |
| T/T | 135.57±19.53 | 28.57±4.73 | 4.58±0.02 | 682.95±75.03 | ||
| OsNAS-D2 | W/W | 88.43±4.38 | 21.43±2.77 | 3.78±0.73 | 700.46±88.34 | |
| T/T | 108.90±10.43 | 25.42±1.90 | 4.35±0.88 | 711.43±66.32 | ||
| 성숙한 종자 | OsNAS3-D1 | W/W | 11.58±0.25 | 19.88±0.52 | 1.25±0.15 | 30.63±0.83 |
| T/T | 33.92±1.82 | 44.16±3.48 | 2.14±0.14 | 33.62±0.75 | ||
| OsNAS-D2 | W/W | 9.53±0.09 | 22.22±1.36 | 1.32±0.20 | 29.30±3.82 | |
| T/T | 16.55±2.44 | 32.55±3.41 | 1.68±0.16 | 33.73±1.46 |
표 1에서와 같이, 구리와 망간의 양은 큰 변화를 보이지 않았다. OsNAS3-D1의 경우 야생형(WT)에 비하여 철은 1.5배, 아연은 1.4배 증가 하였으며, OsNAS3-D2의 철과 아연이 야생형(WT) 대비 1.2배 증가 하였다. 성숙한 종자에서, OsNAS3-D1과 OsNAS3-D2의 지엽에서는 철과 아연의 양이 뚜렷하게 증가하였다. 종자에서는 OsNAS3-D1의 경우, 야생형 (WT)에 비하여 철은 2.9배, 아연은 2.2배, 구리는 1.7배 증가하였다. 종자에서는 OsNAS3-D2의 경우, 야생형에 비하여 철은 1.7배, 아연은 1.5배, 구리는 1.3배 증가하였다.
실시예 4: 철과 아연이 부족한 조건에서 형질전환 식물체의 유묘 표현형 분석
철과 아연이 부족한 조건에서 OsNAS3 유전자의 활성화가 미치는 영향을 알아보았다. 철과 아연을 모두 함유하는 MS 고체 배지, 철을 함유하지 않는 MS 고체 배지, 아연을 함유하지 않는 MS 고체 배지에서 야생형(WT)과 OsNAS3-D1을 발아시키고 8일동안 길러 유묘 표현형을 관찰하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 또한, 표현형의 신장과 엽록소의 함량을 측정하여 하기 표 2에 나타내었다. 엽록소의 측정 은 잎을 채취하여, 무게를 측정하고, 80% 아세톤을 이용하여 추출하였다. 액체 질소를 이용하여 얼린 후, 잘게 부순 잎과 80% 아세톤을 잘 섞어 (잎 100mg당 1ml 80% 아세톤 첨가), 얼음에 15분 방치 후, 15000g로 원심 분리하여, 상등액을 분주하여, 666nm및 646nm에서 흡광도를 측정한 후 Arnon, Plant Physiol 24:1-15, 1949에 기재된 방법으로 엽록소a와 염록소b를 포함하는 염록소의 양을 측정하였다.
표 2.
| 배지 | 유전형 | 표현형 신장(cm) | 엽록소의 함량 (㎍/ml-추출액) |
| MS | WT | 16.6±1.2 | 146.89±19.57 |
| OsNAS3-D1 | 16.9±1.4 | 150.64±3.07 | |
| Fe- | WT | 11.3±1.3 | 71.23±6.56 |
| OsNAS3-D1 | 14.3±0.8 | 106.95±6.95 | |
| Zn- | WT | 15.2±0.9 | 120.44±10.23 |
| OsNAS3-D1 | 16.4±1.1 | 130.66±5.55 |
도 4와 표 2에서와 같이, 철과 아연을 모두 함유하는 배지(MS) 조건에서는 식물체의 크기도 비슷하여, 표현형의 차이를 보이지 않았다. 그러나, 철을 함유하지 않는 배지 (Fe-) 조건에서는 OsNAS3-D1은 야생형(WT)에 비하여 키도 크고, 엽록소도 야생형(WT)에 비하여 50% 이상 증가하여 철 부족의 대표적 증상인 백화 현상 (chlorosis)도 덜 진행되었다. 따라서, OsNAS3-D1은 야생형에 비하여 철이 부족한 생육 조건에서 더 잘 견디는 것을 알 수 있다. 아연을 함유하지 않는 배지 조건 (Zn-)에서도 OsNAS3-D1은 야생형(WT)에 비하여 생장 속도가 빨랐다. 따라서, OsNAS3-D1은 야생형(WT)에 비하여 아연이 부족한 생육 조건에서도 더 잘 자라는 것을 알 수 있다.
상기 실험 결과를 검증하기 위하여, 각각의 조건에서 유묘 시기의 야생 형(WT)과 OsNAS3-D1의 줄기와 뿌리를 채취하고 철과 아연의 농도를 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
표 3.
| 배지 | 조직 | 유전형 | Fe(㎍/g-Dw) | Zn(㎍/g-Dw) |
| MS | 줄기 | WT | 242.33±10.23 | 67.43±12.38 |
| OsNAS3-D1 | 420.44±13.24 | 133.76±12.64 | ||
| 뿌리 | WT | 330.13±13.65 | 116.28±12.98 | |
| OsNAS3-D1 | 540.22±23.88 | 189.43±23.11 | ||
| Fe- | 줄기 | WT | 65.43±12.98 | nt＊ |
| OsNAS3-D1 | 143.66±22.59 | nt | ||
| 뿌리 | WT | 102.43±12.65 | nt | |
| OsNAS3-D1 | 203.66±28.76 | nt | ||
| Zn- | 줄기 | WT | nt | 48.57±2.56 |
| OsNAS3-D1 | nt | 68.77±3.89 | ||
| 뿌리 | WT | nt | 32.18±6.77 | |
| OsNAS3-D1 | nt | 45.77±3.49 |
*: 측정하지 않음.
표 3에서와 같이, 철과 아연을 모두 함유하는 배지(MS) 조건에서는 상기에서 살핀 바와 같이 표현형의 차이는 없었다. 그러나, OsNAS3-D1은 야생형(WT)에 비하여 철의 농도가 줄기와 뿌리에서 각각 1.7배, 1.6배 증가하였고, 아연의 농도는 줄기와 뿌리에서 각각 2배, 1.6배 증가하였다. 또한, 철을 함유하지 않는 배지 조건에서는 OsNAS3-D1은 야생형(WT)에 비하여 철의 농도가 줄기와 뿌리에서 각각 2.2배, 2배 증가하였다. 또한, 아연을 함유하지 않는 배지 조건에서도 OsNAS3-D1은 야생형(WT)에 비하여 아연의 농도가 줄기와 뿌리에서 모두 1.4배 증가하였다. 따라서, OsNAS3-D1은 철 또는 아연이 부족한 생육 조건에서 더 잘 견디는 것을 알 수 있다.
실시예 5: 과량의 중금속이 함유된 조건에서 형질전환 식물체의 표현형 분석
OsNAS3 활성화가 과량의 중금속 처리시 발생되는 독성에 어떤 영향을 주는지 알아보았다. 과량의 아연 (5 mM), 구리 (0.3 mM) 또는 니켈 (0.5 mM)이 각각 첨가된 고체 MS 배지에서 야생형(WT)과 OsNAS3-D1을 발아시키고 10일 동안 길러 유묘 표현형을 관찰하였다. 표현형과 식물체의 신장을 도 5에 나타내었다.
도 5에서와 같이, OsNAS3-D1은 야생형에 비하여 키도 크고, 백화 현상이 덜 진행되었다. 이러한 결과는 OsNAS3-D1이 야생형(WT)에 비하여 과량의 중금속에 의한 독성에 대한 내성이 향상되었음을 나타낸다. 특히, 과량의 아연을 함유하는 고체 MS 배지에서 길렀을 때, 줄기와 뿌리의 아연 농도를 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
표 4.
| 조직 | 유전형 | Zn(㎍/g-DW) |
| 줄기 | WT | 2.05±0.23 |
| OsNAS3-D1 | 4.77±0.89 | |
| 뿌리 | WT | 10.21±2.10 |
| OsNAS3-D1 | 9.77±0.36 |
표 4에서와 같이, OsNAS3-D1은 야생형(WT)에 비하여 2.3배 높은 아연 농도를 보였다.
실시예 6: pH가 높은 조건에서 형질전환 식물체의 표현형 관찰
토양의 pH는 식물에 필요한 원소의 용해도에 많은 영향을 미친다. 예를 들어, pH가 8 이상이면, 철은 용해도가 낮은 Fe2O3 형태로 변화되어, 식물이 제대로 이용 및 흡수할 수 없는 상태가 된다. 그 결과 철 부족 현상을 일으키게 된다.
pH 8.5로 맞춘 MS 배지 (MS)에서 야생형(WT)과 OsNAS3-D1을 발아시키고 10일 동안 길러 표현형을 관찰하였다. 또한, 철을 함유하지 않는 MS 배지 (Fe-)(pH 8.5)에서도 동일한 방법을 실시하여 표현형을 관찰하였다. 표현형과 식물체의 신장을 도 6에 나타내었다.
도 6에서와 같이, pH 8.5로 맞춘 MS 배지 (MS/pH8.5)에서 OsNAS3-D1이 야생형(WT)에 비하여 신장도 크고 더 잘 견디는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 철을 함유하지 않는 MS 배지 (Fe-/pH8.5)에서 더 분명하게 나타났다.
실시예 7: 생물학적 이용도 (bioavailability) 조사
OsNAS3-D1의 종자의 철 증가는 흡수되어 이용되는 철의 생물학적 이용도를 증가시키는지를 마우스 식이 분석 (mouse feeding assay)으로 알아보았다.
생후 3주된 암컷 Balb/c 마우스에, 철이 충분한 사료 (AIN-93G Purified Diet-45 mgFe/kg 사료)와 철이 부족한 사료 (modified AIN-93G diet containing iron 3 mg/kg 사료)를 공급하였다. 2주 후, 이 두 그룹의 쥐들로부터 혈액을 채취하였다. 이것은 빈혈을 유발함과 동시에, 빈혈의 정도를 알아보기 위하여 혈액의 헤모글로빈 (Hb)과 헤마토크릿 (Hct)를 측정하기 위함이다. 측정 결과 철이 부족한 사료를 먹인 쥐들의 헤모글로빈 (Hb)과 헤마토크릿 (Hct) 수치가, 철이 충분한 사료를 먹인 쥐들에 비해서 각각 77% 및 79% 감소하였다 (표5). 이것은 철이 부족한 사료를 먹였을 때 빈혈이 유발됨을 알 수 있었다.
이 후, 철분이 부족한 사료를 먹인 쥐들을 두 그룹으로 나누어서, 제 1그룹 (야생형, WT, n=10)은 야생형(WT) 종자로부터 나온 쌀을 먹였고, 제 2그룹 (OsNAS3-D1, n=9)은 OsNAS3-D1의 종자로부터 나온 쌀을 먹였다. 2주 경과 후 혈액을 채취하여 Hb와 Hct를 측정하였다. 동일한 방법으로 쌀을 먹이고 다시 2주 더 경과 후 혈액을 채취하여 Hb와 Hct를 측정하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.
표 6에서와 같이, 야생형(WT) 또는 OsNAS3-D1의 종자로부터 나온 쌀을 먹이기 전까지 마우스의 Hb와 Hct는 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 2주 경과 후 두 그룹의 Hb와 Hct를 측정 한 결과, 제2 그룹은 제1 그룹에 비해 Hb와 Hct의 현저한 증가를 보여주었다. 다시 2주 경과 후 Hb와 Hct를 측정 한 결과, 이 경우에도 제2 그룹은 제1 그룹에 비해 Hb와 Hct의 현저한 증가를 보여주었다.
표 5.
| 철분이 충분한 사료를 먹인 쥐 그룹 | 철분이 부족한 사료를 먹인 쥐 그룹 | |
| Hb(g/L) | 16.10±0.25 | 12.50±0.48 |
| Hct(%) | 54.00±0.73 | 42.6±1.62 |
표 6.
| 그룹 명 | 측정 시기1 | |||
| 0주 | 2주 | 5주 | ||
| Hb(g/L) | WT | 12.80±0.53 | 13.70±0.55 | 15.50±0.66 |
| OsNAS3-D1 | 12.10±0.84 | 16.50±0.46 | 16.70±0.69 | |
| Hct(%) | WT | 43.70±1.80 | 46.20±1.44 | 47.70±2.46 |
| OsNAS3-D1 | 41.20±2.83 | 52.50±1.79 | 50.40±2.68 | |
1: 태어난 지 3주된, 마우스에 2주간 철이 부족한 사료를 먹인 후, 두 그룹으로 나누어, 철이 부족한 사료를 대신하여, WT 또는 OsNAS3-D1 종자로 바꿔 먹이기 시작할 때부터 경과한 시간.
본 발명자들은 상기한 실시예에서 얻어진 미량 금속의 함량이 증가된 벼 품 종 OsNAS3-D1과 OsNAS3-D2를 2008년 7월 14일자로 농업생명공학연구원에 특허종자를 기탁하였으며, 각각 종자 수탁번호 KACC 98004P 및 KACC 98005P를 부여받았다.
도 1은 T-DNA가 삽입된 DNA 구조체의 일 형태를 나타낸 것이다.
도 2A, 2B와 2C는 MS 배지 및 MS 배지에서 Fe, Zn, Cu 또는 Mn을 포함하지 않는 배지에서 자란 벼의 잎 또는 뿌리에서 OsNAS1, OsNAS2 또는 OsNAS3 유전자의 발현 양상을 정량적 실시간 RT-PCR을 이용하여 분석한 것이다.
도 3은 OsNAS3-D1과 그의 야생형(WT), OsNAS3-D2와 그의 야생형(WT)에서 OsNAS3의 발현량을 비교한 것이다.
도 4는 철과 아연을 모두 함유하는 MS 고체 배지(MS), 철을 함유하지 않는 MS 고체 배지(Fe-), 아연을 함유하지 않는 MS 고체 배지(Zn)에서 기른 야생형(WT)과 OsNAS3-D1의 표현형 및 백화 현상을 알아보기 위한 잎을 나타낸 것이다.
도 5는 과량의 아연(5 mM), 구리(0.3 mM) 또는 니켈(0.5 mM)이 첨가된 각각의 고체 MS 배지에서 기른 야생형(WT)과 OsNAS3-D1의 표현형과 신장을 나타낸 것이다.
도 6은 pH 8.5로 맞춘 MS 배지(MS/pH 8.5), pH 8.5로 철을 함유하지 않는 MS 배지(Fe-/pH 8.5)에서 기른 야생형(WT)과 OsNAS3-D1의 표현형과 신장을 나타낸 것이다.
<110> POSTECH FOUNDATION
<120> Rice cultivar with enhanced metal contents and functional foods
<130> PN080478
<160> 17
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1482
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<220>
<221> CDS
<222> (71)..(1099)
<223> osnas3
<400> 1
atcaagcaaa gcagctcgat cgagtgttcg actgatcacc agttggagct aatcgatcga 60
gagagagagt atg acg gtg gaa gtg gag gcg gtg acc atg gcg aag gag gag 112
Met Thr Val Glu Val Glu Ala Val Thr Met Ala Lys Glu Glu
1 5 10
cag ccg gag gag gag gag gtg atc gag aag ttg gtt gag aag atc acc 160
Gln Pro Glu Glu Glu Glu Val Ile Glu Lys Leu Val Glu Lys Ile Thr
15 20 25 30
ggg ctg gcg gcg gcc atc ggc aag ctg ccg tcg ctg agc ccg tcg ccg 208
Gly Leu Ala Ala Ala Ile Gly Lys Leu Pro Ser Leu Ser Pro Ser Pro
35 40 45
gag gtg aac gcg ctg ttc acg gag ctg gtg atg acc tgc atc ccg ccc 256
Glu Val Asn Ala Leu Phe Thr Glu Leu Val Met Thr Cys Ile Pro Pro
50 55 60
agc agc gtg gac gtg gag cag ctg ggg gcg gag gcg cag gac atg cgc 304
Ser Ser Val Asp Val Glu Gln Leu Gly Ala Glu Ala Gln Asp Met Arg
65 70 75
ggc cgc ctc atc cgc ctc tgc gcc gac gcc gag ggc cac ctc gag gcg 352
Gly Arg Leu Ile Arg Leu Cys Ala Asp Ala Glu Gly His Leu Glu Ala
80 85 90
cac tac tcc gac gtc ctc gcc gcc cac gac aac ccg ctc gac cac ctc 400
His Tyr Ser Asp Val Leu Ala Ala His Asp Asn Pro Leu Asp His Leu
95 100 105 110
gcc ctc ttc ccc tac ttc aac aac tac atc cag ctc gcc cag ctc gag 448
Ala Leu Phe Pro Tyr Phe Asn Asn Tyr Ile Gln Leu Ala Gln Leu Glu
115 120 125
tac gcc ctc ctc gcc cgc cac ctc ccc gcc gcc ccg ccg ccc tcc cgc 496
Tyr Ala Leu Leu Ala Arg His Leu Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ser Arg
130 135 140
ctc gcc ttc ctc ggc tcc ggc ccg ctc ccg ctc agc tcc ctc gtc ctc 544
Leu Ala Phe Leu Gly Ser Gly Pro Leu Pro Leu Ser Ser Leu Val Leu
145 150 155
gcc gcc cgc cac ctc ccc gcc gcc tcc ttc cac aac tac gac atc tgc 592
Ala Ala Arg His Leu Pro Ala Ala Ser Phe His Asn Tyr Asp Ile Cys
160 165 170
gcc gac gcc aac cgc cgc gcc agc cgc ctc gtc cgc gcc gac cgc gac 640
Ala Asp Ala Asn Arg Arg Ala Ser Arg Leu Val Arg Ala Asp Arg Asp
175 180 185 190
ctg tcc gcg cgc atg gcc ttc cac acc tcc gac gtc gcc cac gtc acc 688
Leu Ser Ala Arg Met Ala Phe His Thr Ser Asp Val Ala His Val Thr
195 200 205
acc gac ctc gcc gcc tac gac gtc gtg ttc ctg gcg gcg ctg gtg ggt 736
Thr Asp Leu Ala Ala Tyr Asp Val Val Phe Leu Ala Ala Leu Val Gly
210 215 220
atg gcc gcc gag gag aag gcg cgc atg gtg gag cac ctc ggg aag cac 784
Met Ala Ala Glu Glu Lys Ala Arg Met Val Glu His Leu Gly Lys His
225 230 235
atg gcg ccc ggc gcc gcc ctg gtg gtg cgg acg gcg cac ggc gcc cgg 832
Met Ala Pro Gly Ala Ala Leu Val Val Arg Thr Ala His Gly Ala Arg
240 245 250
gga ttc ctg tac ccc gtg gtg gac ccg gag gag atc cgc cgc ggc ggc 880
Gly Phe Leu Tyr Pro Val Val Asp Pro Glu Glu Ile Arg Arg Gly Gly
255 260 265 270
ttc gac gtg ctc gcc gtg cac cac ccg gag ggc gag gtg atc aac tcc 928
Phe Asp Val Leu Ala Val His His Pro Glu Gly Glu Val Ile Asn Ser
275 280 285
gtc atc atc gcg cgc aac cgc ccg tgg ccg ggg ccg gcg ttg gag gga 976
Val Ile Ile Ala Arg Asn Arg Pro Trp Pro Gly Pro Ala Leu Glu Gly
290 295 300
gga gac gcg cac gcg cac ggc cat ggc gcc gtg gtg agc cgt cca tgc 1024
Gly Asp Ala His Ala His Gly His Gly Ala Val Val Ser Arg Pro Cys
305 310 315
cag cgc tgc gag atg gag gcg agg gcg cac cag aag atg gag gac atg 1072
Gln Arg Cys Glu Met Glu Ala Arg Ala His Gln Lys Met Glu Asp Met
320 325 330
tcc gcc atg gag aag ctg ccc tcc tcg t aggcaggcat cgatgactgc 1120
Ser Ala Met Glu Lys Leu Pro Ser Ser
335 340
ttccatcgct tgctacctca ccagctcacc tgataaatca cctcagttac tatcgattaa 1180
tcatttacca tgcattaatt aagaagaaaa catatatacc ataattatct accagtaaaa 1240
caaatctaat agtagtattt aataatctcg ttggtaatta actgcagtca tgcatgaatg 1300
catgccatat tgcgtcgcta tctttttttc ccatgatgag actgatgaga gagagagaga 1360
atatatgtcg ctattgagtg ttactgcttg attactgtac tagtagctta ttacaatcaa 1420
ccattgtctc tgttgcgtat ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1480
aa 1482
<210> 2
<211> 343
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 2
Met Thr Val Glu Val Glu Ala Val Thr Met Ala Lys Glu Glu Gln Pro
1 5 10 15
Glu Glu Glu Glu Val Ile Glu Lys Leu Val Glu Lys Ile Thr Gly Leu
20 25 30
Ala Ala Ala Ile Gly Lys Leu Pro Ser Leu Ser Pro Ser Pro Glu Val
35 40 45
Asn Ala Leu Phe Thr Glu Leu Val Met Thr Cys Ile Pro Pro Ser Ser
50 55 60
Val Asp Val Glu Gln Leu Gly Ala Glu Ala Gln Asp Met Arg Gly Arg
65 70 75 80
Leu Ile Arg Leu Cys Ala Asp Ala Glu Gly His Leu Glu Ala His Tyr
85 90 95
Ser Asp Val Leu Ala Ala His Asp Asn Pro Leu Asp His Leu Ala Leu
100 105 110
Phe Pro Tyr Phe Asn Asn Tyr Ile Gln Leu Ala Gln Leu Glu Tyr Ala
115 120 125
Leu Leu Ala Arg His Leu Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ser Arg Leu Ala
130 135 140
Phe Leu Gly Ser Gly Pro Leu Pro Leu Ser Ser Leu Val Leu Ala Ala
145 150 155 160
Arg His Leu Pro Ala Ala Ser Phe His Asn Tyr Asp Ile Cys Ala Asp
165 170 175
Ala Asn Arg Arg Ala Ser Arg Leu Val Arg Ala Asp Arg Asp Leu Ser
180 185 190
Ala Arg Met Ala Phe His Thr Ser Asp Val Ala His Val Thr Thr Asp
195 200 205
Leu Ala Ala Tyr Asp Val Val Phe Leu Ala Ala Leu Val Gly Met Ala
210 215 220
Ala Glu Glu Lys Ala Arg Met Val Glu His Leu Gly Lys His Met Ala
225 230 235 240
Pro Gly Ala Ala Leu Val Val Arg Thr Ala His Gly Ala Arg Gly Phe
245 250 255
Leu Tyr Pro Val Val Asp Pro Glu Glu Ile Arg Arg Gly Gly Phe Asp
260 265 270
Val Leu Ala Val His His Pro Glu Gly Glu Val Ile Asn Ser Val Ile
275 280 285
Ile Ala Arg Asn Arg Pro Trp Pro Gly Pro Ala Leu Glu Gly Gly Asp
290 295 300
Ala His Ala His Gly His Gly Ala Val Val Ser Arg Pro Cys Gln Arg
305 310 315 320
Cys Glu Met Glu Ala Arg Ala His Gln Lys Met Glu Asp Met Ser Ala
325 330 335
Met Glu Lys Leu Pro Ser Ser
340
<210> 3
<211> 339
<212> DNA
<213> Cauliflower mosaic virus
<400> 3
gatccccaac atggtggagc acgacactct cgtctactcc aagaatatca aagatacagt 60
ctcagaagac cagagggcta ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatcgg gaaacctcct 120
cggattccat tgcccagcta tctgtcactt catcgaaagg acagtagaaa aggaagatgg 180
cttctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggctatc gttcaagatg cctctaccga 240
cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggaacatc gtggaaaaag aagacgttcc 300
aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatcta 339
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
actccatttg gttgtcattt t 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
ggttgacgta gttgccgtag ta 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> primer
<400> 6
gtgatcaact ccgtcatcgt 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
tgacaaacac ctcttgcttt c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
gtgatcaact ccgtcatcat c 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
tcagtctcat catgggaaaa a 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
tttaggggaa atggaggtta ct 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
ctgtaacact ttaacgcacc aa 22
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
caagttagtc atgtaattag ccac 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
ggcttgctct tgtcataggc 20
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
aaaagcttat caccagttgg agctaatcga 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
aaggtaccca tcagtctcat catgggaaaa 30
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forwrad primer for OsAct1
<400> 16
tggaagctgc gggtatccat 20
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for OsAct1
<400> 17
tactcagcct tggcaatcca ca 22
Claims (20)
- 미량 원소의 함량이 증가되어 있는 식물체.
- 제1항에 있어서, 상기 미량 원소는 철, 아연 및 구리로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 식물체
- 제1항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 보리 또는 옥수수인 것인 식물체.
- 제1항에 있어서, 상기 식물체는 OsNAS3 유전자의 발현이 증가된 것인 식물체.
- 제2항에 있어서, 상기 OsNAS3 유전자의 발현 증가는 OsNAS3 유전자의 상류 및 하류로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 인해서의 삽입에 의하여 이루어진 것인 식물체.
- 제5항에 있어서, 4개의 CaMV 35S 인핸서가 연결된 구조체가 OsNAS3 유전자의 하류 1.5kb 또는 1.9kb 위치에 삽입되어 있는 것인 식물체.
- 제1항에 있어서, 상기 식물체는 종자 수탁번호 KACC 98004P 또는 KACC 98005P로 기탁된 벼인 것인 식물체.
- 제1항의 식물체로부터 생산된 산물을 함유하는 기능성 식품.
- 외래 인핸서를 포함하는 구조체를 식물체에 도입하여, OsNAS3 유전자의 발현이 증가된 식물체를 얻는 단계를 포함하는, 미량 원소 함량이 증가된 식물체를 제조하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 구조체를 식물체에 도입하는 단계는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 프로모터로부터 유래한 35S 인핸서가 삽입된 Ti 플라스미드를 식물체에 도입하는 단계이고, 상기 식물체를 얻는 단계는 상기 35S 인핸서가 OsNAS3 활성을 코딩하는 유전자의 상류 및 하류 중 하나 이상의 위치에 삽입된 식물체를 선발하는 단계인 것인, 미량 원소 함량이 증가된 식물체를 제조하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 35S 인핸서는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자의 하류 1.5 kb 또는 1.9 kb에 삽입되는 것인 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 35S 인핸서는 4카피가 연결된 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 식물체는 벼 (Oryza sativa)인 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 미량 원소는 철, 아연 및 구리로부터 선택되는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 식물체는 종자 수탁번호 KACC 98004P 또는 KACC 98005P로 기탁된 벼인 것인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 식물체를 철 및 아연으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 부족한 조건에 생육시키는 단계를 포함하는, 식물체를 생육시키는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 식물체를 과량의 중금속이 존재하는조건에 생육시키는 단계를 포함하는, 식물체를 생육시키는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 중금속은 5mM 이상의 아연, 0.3mM 이상의 구리, 또는 0.5mM 이상의 니켈인 것인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 식물체를 높은 pH 조건에 생육시키는 단계를 포함하는, 식물체를 생육시키는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 pH는 8.5 이상인 것인 방법.
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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2008
- 2008-10-16 KR KR1020080101614A patent/KR101156572B1/ko not_active IP Right Cessation
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