KR20100038429A

KR20100038429A - 상이한 표적 유전자들을 간섭하는 선형 이중가닥 ｒｎａ 분자

Info

Publication number: KR20100038429A
Application number: KR1020107002576A
Authority: KR
Inventors: 김미현; 신덕향; 현 이; 김수인; 엽 윤
Original assignee: 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 2007-07-06
Filing date: 2008-07-07
Publication date: 2010-04-14
Also published as: US20110008885A1; WO2009008645A3; WO2009008645A2

Abstract

상이한 표적 유전자들의 발현을 각각 감소시키는, 연속적으로 또는 수렴적으로 연결된 2개 이상의 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 포함하는 선형 이중가닥 RNA 분자, 및 상기 선형 이중가닥 RNA 분자를 발현하는 이중가닥 DNA 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터가 제공된다. 상기 선형 이중가닥 RNA 분자 또는 재조합 발현 벡터는 세포 내 표적 유전자들의 발현을 감소시키는 방법에 있어 유용하며, 상기 방법은 선형 이중가닥 RNA 분자 또는 재조합 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하며, 이로써 암호화된 siRNA가 상이한 유전자를 표적으로 하고 표적 유전자들의 발현을 감소시킨다. 또한 상기 선형 이중가닥 RNA 분자 내의 각 siRNA 단위가 18 내지 24개의 뉴클레오티드를 가질 때 효과적인 유전자 침묵 활성이 유도될 수 있으며, 나아가 상기 유전자 침묵 활성은 siRNA의 역위 배향에 의해 영향을 받지 않음이 입증되었다.

Description

상이한 표적 유전자들을 간섭하는 선형 이중가닥 ＲＮＡ 분자 {LINEAR DOUBLE-STRANDED RNA MOLECULE INTERFERING WITH DIFFERENT TARGET GENES}

본 발명은 상이한 표적 유전자들을 간섭하는 선형 이중가닥 RNA 분자, 이를 위한 재조합 발현 벡터 및 상기 선형 이중가닥 RNA 분자 또는 재조합 발현 벡터를 이용하여 세포 내에 표적 유전자들의 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

C형 간염 바이러스(HCV)는 플라비비리대(Flaviviridae) 과(family)에 속하며, 측부에 5'- 및 3'-비번역영역(UTR)이 있는 약 9.6 kb의 양성 가닥 RNA 게놈을 가지고 있고, 이들은 적어도 10개의 바이러스 구조 및 비구조 단백질을 암호화한다(Grakoui, A. et al., 1993, J Virol 67:1385-1395; Bartenschlager, R. et al., 2000, J Gen Virol 81:1631-1648). 전 세계적으로 1억 7천만 명의 사람들이 만성적으로 이 바이러스에 감염된 것으로 추정된다. 또한 상기 바이러스는 간염, 간경변 및 간암을 일으키는 주된 원인으로 알려져 있다(Alter, M. J. et al., 1997, Hepatology 26:62S-65S). 하지만, 아직까지 HCV에 대한 예방 또는 치료 백신은 상업화되지 않고 있다. 인터페론(IFN)-α 및 리바비린(ribavirin)과의 조합 치료법이 임상학적 적용에서 주목할만한 결과를 보였음에도 불구하고, HCV 감염 환자 중 약 절반만이 이 치료법에 의한 효과를 보고 있다(Chander, G. et al., 2002, Hepatology 36:S135-144). 따라서, HCV 감염을 제어하는 대체 치료제의 개발이 시급하다.

RNA 간섭(RNA interference; RNAi)은 전사후 유전자 침묵 과정(post-transcriptional gene silencing process)으로, 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)과 같은 식물 및 동물에서 진화적으로 보존되어 있다(Bosher, J. M. et al., 2000, Nat Cell Biol 2:E31-36; Dykxhoorn, D. M. et al., 2003, Nat Rev Mol Cell Biol 4:457-467). 포유류 세포에서, 다이서(Dicer)라고 명명된 RNase III-유사 리보뉴클레아제가 긴 이중가닥 RNA(dsRNA)를 인식하고, 이를 세포의 세포질에서 21-25개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 보다 짧은 이중체(duplex) RNA인 작은 간섭 RNA(siRNA)로 잘라낸다(Dorsett, Y. et al., 2004, Nat Rev Drug Discov 3:318-329). 이전 연구들은 RNAi-기반 기술이 특히 인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1) 및 HCV를 포함하는 RNA 바이러스-유래 질병을 치료하는데 매우 유망하다는 것을 보여주었다(Capodici, J. et al., 2002, J Immunol 169:5196-5201; Kapadia, S. B. et al., 2003, Proc Natl Acad Sci USA 100:2014-2018; Kim, M. et al., 2006, Virus Res 122:1-10). 바이러스의 RNA 전사체(transcript)들은 세포질에서 생성되거나 복제되는데, RNAi 기전(machinery) 작용 또한 세포질에서 일어나기 때문에, 이러한 RNA 바이러스들은 siRNA-매개 치료법에 의해 효과적으로 제어될 것으로 예상되어왔다. 하지만, 바이러스 RNA 폴리머라아제의 교정활성(proofreading activity)은 비교적 정확하지 못하기 때문에 복제과정 동안 바이러스의 돌연변이 비율이 높아 RNAi로부터의 회피 변형체(escape variant)의 급속한 출현을 야기한다(Das, A. T. et al., 2004, J Virol 78:2601-2605; Wilson, J. A. et al., 2005, J Virol 79:7050-7058).

최근 보고들에서 이러한 문제점은 몇 가지 서열을 갖는 합성 siRNA 혼합물, 긴 dsRNA로부터 다이서(Dicer)에 의해 생성된 생체 외(in vitro) siRNA 생성물, 또는 세포내에 발현된 긴 헤어핀 RNA(lhRNA)의 사용에 의해 해결될 수 있음이 시사되어왔다(Wilson, J. A. et al., 2005, J Virol 79:7050-7058; Watanabe, T. et al., 2006, Gene Ther 13:883-892; Liu, Y. P. et al., 2007, Nucleic Acids Res 35:5683-5693; Sano, M. et al., 2008, Mol Ther 16:170-177). shRNA 표적 서열의 연속적 확장에 의해 또는 다중 표적의 구성(constitutive) 조합에 의해 RNA Pol III 프로모터로부터 lhRNA를 암호화하는 플라스미드가 구축되었다. 이들은 HIV-1, HBV 및 HCV를 포함하는 인간 병원성 바이러스들의 발현 또는 복제의 효과적 억제를 나타내었고, 또한 바이러스 회피 가능성의 감소를 나타내었다. 특히, 다중-표적 접근법에서, 발현된 lhRNA로부터 HIV-1에 대한 두 가지 기능적 siRNA가 만들어지고 세포 내 서로 다른 유전자인 pol 및 nef를 동시에 침묵(silencing)시켰다. 더욱이, lhRNA의 헤어핀 스템(stem)에 G:U 워블(wobble) 쌍을 삽입하고 역위 반복 서열(inverted repeat sequence) 내의 완벽한 상보성을 제거하는 것이 클로닝/서열분석을 용이하게 할 뿐만 아니라 비특이적 IFN 반응을 피하게 하였다. 하지만, 본 발명자들은 RNAi 활성이 shRNA에서조차 G:U 염기쌍의 함량에 영향을 받으며, 그 허용가능한 수는 표적 서열에 따라 달라진다는 것을 관찰하였는데, 이는 G:U 워블을 갖는 각각의 shRNA의 RNAi 활성이 유지되는지를 이들이 단일 발현 카세트로 조합되기 전에 확인하여야 함을 의미한다. lhRNA 이용에 있어 또 다른 잠재적 한계점은, 다이서-매개 절단(cleavage)이 헤어핀의 기저부(base)로부터 루프까지 순차적으로 진행됨으로써, 다이서의 효소 활성의 포화 또는 감소로 인해 상이한 종류의 siRNA의 불균일한 생산 수율이 야기되고, 따라서 아마도 불충분한 다중 침묵 효과가 야기된다는 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 다른 종류의 siRNA를 같은 수율로 생성하는 RNA 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 RNA 분자를 생산하기 위한 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 RNA 분자 또는 이를 위한 발현 벡터를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 RNA 분자 또는 재조합 발현 벡터를 사용하여 세포 내 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따라, 각각 상이한 표적 유전자의 발현을 감소시키는, 연속적으로 또는 수렴적으로 연결된 둘 이상의 siRNA를 포함하는 선형 이중가닥 RNA(liRNA) 분자가 제공된다.

본 발명은 또한 상기 liRNA 분자를 발현하는 이중가닥 DNA 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 liRNA 또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 liRNA 분자 또는 재조합 발현 벡터를 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는, 세포 내 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기에서, 암호화된 siRNA는 상이한 유전자를 표적으로 하여 상기 표적 유전자의 발현을 감소시킨다.

상기 선형 이중가닥 RNA 분자(liRNA) 또는 재조합 발현 벡터는 세포 내 표적 유전자들의 발현을 감소시키는 방법에 있어 유용하며, 상기 방법은 선형 이중가닥 RNA 분자 또는 재조합 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하며, 이로써 암호화된 siRNA가 상이한 유전자를 표적으로 하고 표적 유전자들의 발현을 감소시킨다. 또한 상기 선형 이중가닥 RNA 분자 내의 각 siRNA 단위가 18 내지 24개의 뉴클레오티드를 가질 때 효과적인 유전자 침묵 활성이 유도될 수 있으며, 나아가 상기 유전자 침묵 활성은 siRNA의 역위 방향성에 의해 영향을 받지 않는다.

도 1a 내지 도 1d는 수렴적으로 대치하고 있는 Pol III 프로모터들로부터의 이중체 RNA의 전사 및 이들의 세포 내 유전자 침묵을 나타낸 것이다. 도 1a는 대조구 siRNA를 발현하는 이중가닥 DNA 서열(서열번호 1 및 2)을 포함하는, 대조구 이중체 siRNA-발현 플라스미드의 구조물(construct)을 나타낸다. 혼성화된 합성 올리고뉴클레오티드가 상기 벡터의 HindIII 및 BamHI 부위 내에 삽입될 수 있다. 3' 말단에 poly(U)를 갖는 RNA는 인간 H1 및 U6 프로모터로부터 합성된다. +1은 전사 개시 부위이다. 도 1b는 siRNA(서열번호 3 내지 12) 및 liRNA(서열번호 13 내지 16)의 RNA 서열을 나타낸다. siC, siE 및 siR은 각각 대조구 siRNA, 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)-특이적 siRNA 및 레닐라(renilla) 루시퍼라아제-특이적 siRNA를 나타낸다. s 및 a는 각각 H1 프로모터로부터의 센스 및 안티센스 가닥 전사체를 의미한다. liC 및 liER은 EGFP 및 루시퍼라아제와 무관하거나 이들 모두를 표적으로 하는 긴 간섭 RNA(liRNA)를 나타낸다. 21 또는 25는 표적 mRNA에 상보적인 핵산의 수이다. 회색 박스는 이중체 RNA 내의 안티센스 서열의 위치를 나타낸다. 도 1c는 이중 루시퍼라아제(FLuc 및 RLuc) 분석에 의해 측정된, 대조군 siRNA인 siC 대비 siE(s21), siE(a21), siR(s21) 및 siR(a21)-발현 플라스미드들의 RNAi 활성을 나타낸다. 도 1d는 무관한 liRNA인 siC와 비교시 liER(s25s25)의 상대적 RNAi 활성을 나타낸다. 모든 값은 세번 반복하여 측정하였다.
도 2a 내지 도 2c는 연속적으로 정렬된 두 개의 siRNA 구성요소를 갖는 liRNA의 RNAi 활성을 나타낸 것이다. 도 2a는 EGFP 및 RLuc 모두를 표적으로 하는 다른 길이의 liER RNA의 서열(서열번호 17 내지 22)을 나타낸다. 이들의 센스 가닥은 H1 프로모터로부터 전사된다. 회색 박스는 긴 간섭 RNA 내의 안티센스 서열의 위치를 나타낸다. 또한, 하기의 노던 블롯팅을 위한 siE 및 siR 프로브의 프로브 서열이 나타나 있다. 도 2b는 이중 루시퍼라아제 분석에 의해 측정된 liRNA의 다중 유전자 넉다운(knockdown) 활성을 나타낸다. 대조구 liRNA인 liC를 암호화하는 플라스미드에 의한 루시퍼라아제 발현량을 100으로 정하였다. 분석은 세 번 반복하여 수행하였다. 도 2c는 Huh 7 세포에서 보다 긴 RNA 기질로부터 siRNA 가공의 효율 및 정확성을 보여주는 노던 블롯 분석을 나타낸다. 21-23 nt siRNA로 가공된 생성물들을 화살표로 표시하였다. U6 핵내 소분자 RNA(small nuclear RNA)를 위한 프로브 서열을 로딩 대조구로서 혼성화하였다.
도 3a 내지 도 3c는 수렴적으로 정렬된 두 개의 siRNA 구성요소를 갖는 liRNA의 RNAi 활성을 나타낸 것이다. 도 3a는 EGFP 및 RLuc 모두를 표적으로 하는 다른 길이의 liER RNA의 서열(서열번호 23 내지 28)을 나타낸다. EGFP 및 RLuc siRNA의 센스 가닥은 각각 H1 및 U6 프로모터로부터 전사된다. 회색 박스는 긴 간섭 RNA 내의 안티센스 서열의 위치를 나타낸다. 또한 하기의 노던 블롯팅을 위한 siE 및 siR 프로브의 프로브 서열이 나타나 있다. 도 3b는 이중 루시퍼라아제 분석에 의해 측정된 liRNA의 다중 유전자 넉다운(knockdown) 활성을 나타낸다. 대조구 liRNA인 liC를 암호화하는 플라스미드에 의한 루시퍼라아제 발현량을 100으로 정하였다. 분석은 세 번 반복하여 수행하였다. 도 3c는 Huh 7 세포에서 보다 긴 RNA 기질로부터 siRNA 가공의 효율 및 정확성을 보여주는 노던 블롯 분석을 나타낸다. 21-23 nt siRNA로 가공된 생성물을 화살표로 표시하였다. U6 핵내 소분자 RNA를 위한 프로브 서열을 로딩 대조구로서 혼성화하였다.
도 4a 내지 도 4c는 HCV 레플리콘(replicon) 세포인 FK-R2AN에서의 liRNA의 항바이러스 활성을 나타낸 것이다. 도 4a는 HCV 코어 및 NS3을 표적으로 하는 다양한 길이의 siRNA의 서열(서열번호 29 내지 32) 및 liRNA의 서열(서열번호 33 내지 40)을 나타낸다. 회색 박스는 긴 간섭 RNA 내의 안티센스 서열의 위치를 나타낸다. 도 4b는 레닐라 루시퍼라아제 분석에 의해 측정된 HCV RNA 복제 효율을 나타낸다. 대조구 liRNA인 liC를 암호화하는 플라스미드에 의한 루시퍼라아제 발현량을 100으로 정하였다. 분석은 세 번 반복하여 수행하였다. 도 4c는 상이한 siRNA- 또는 liRNA-발현 벡터로 형질감염된 레플리콘 세포에서의 HCV 코어 발현을 검출하기 위한 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸다. β-액틴을 내부 로딩 대조구로 사용하였다.
도 5a 내지 5c는 liRNA에 의한 HCV 레플리콘 RNA 내의 절단 부위를 결정하기 위한 RACE(Rapid amplification of cDNA ends)를 나타낸 것이다. 도 5a는 liRNA 절단 부위의 5' 말단을 결정하는 RACE 실험을 도식화하여 나타낸 것이다. siHCV-U 및 siHCV-N의 화살표는 레플리콘 RNA 게놈에서의 이들의 표적 부위를 나타낸다. 도 5b는 RACE 생성물을 무작위 올리고머로 역전사(reverse transcription) 후 5' UTR (위) 및 NS3(중간) 특이적 프라이머로 PCR 증폭한 결과를 나타낸다. β-액틴 유전자의 증폭을 내부 대조구로 사용하였다. 도 5c는 RACE로부터의 RT-PCR 생성물의 서열 분석 결과를 나타낸다. 회색 막대는 5' 말단에서 RNA 어댑터(adaptor)에 연결된 바이러스 RNA 서열의 cDNA를 나타낸다. 점선 화살표 및 진한 화살표는 각각 siRNA(siHCV-U 및 siHCV-N) 또는 liRNA(liHCV-UN)에 의해 절단된 HCV 표적 서열(서열번호 41 및 42) 내 예측 부위 및 실제 부위를 나타낸다.
도 6은 세포에서 liRNA에 대한 비특이적 인터페론 반응을 확인하기 위한, siRNA 또는 liRNA를 발현하는 표시된 플라스미드로 형질전환된 FK/R2AN 세포에서의 IFN-β, OAS1 및 MxA의 반-정량적 RT-PCR의 결과를 나타낸 것이다. Poly(I:C)를 양성 대조구로 사용하였다. β-액틴을 내부 로딩 대조구로 사용하였다.

본 발명을 설명하기 위해 사용된 용어들은 다음과 같이 정의된다.

"작은 간섭 RNA" 또는 "짧은 간섭 RNA" 또는 siRNA는 목적하는 유전자("표적 유전자" 또는 "표적 암호화 서열")를 표적으로 하는 뉴클레오티드의 RNA 이중체이다. "RNA 이중체(duplex)"는 RNA 분자의 두 영역 사이에 상보적 짝짓기(쌍형성, paring)에 의해 형성된 구조를 의미한다. siRNA는 상기 siRNA의 이중체 부분의 뉴클레오티드 서열이 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 유전자를 "표적으로" 한다. 본 명세서에 사용된 용어 "선형 이중가닥 RNA", "긴 간섭 RNA", "liRNA", "긴 선형 RNA", 또는 "선형 이중체 RNA" 등은 상호 교환적으로 사용될 수 있고, siRNA와 달리 두개 이상의 유전자들의 발현을 억제할 수 있는 RNA를 말하는 것으로서, 선형 구조인 것을 특징으로 한다.

본 명세서에 사용된 용어 "조절 요소(regulatory element)"는 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer), 폴리아데닐레이션 신호(polyadenylation signal), 종결자(terminator) 및 단백질 분해 신호(protein degradation signal) 등과 같이 세포 내 암호화 서열의 발현을 제공 및/또는 조절하는 전사 및 번역 제어 서열을 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 이에 연결된 또 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 한 가지 형태의 벡터는 숙주 세포의 염색체 DNA로 삽입(integration)될 수 있는 게놈 삽입 벡터 또는 "삽입 벡터(integrated vector)"이다. 또 다른 형태의 벡터는 에피솜 벡터(episomal vector), 즉 진핵 또는 원핵 숙주 세포와 같은 적절한 숙주에서 염색체 밖에서 복제(extra-chromosomal replication)할 수 있는 핵산이다. 작동가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터를 본 명세서에서는 "발현 벡터"로 지칭한다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 달리 문맥으로부터 명확하지 않는 한 상호교환적으로 사용된다.

유전자 서열과 관련하여 용어 "발현"은 유전자의 전사 및, 적절한 경우, 얻어진 mRNA 전사체의 단백질로의 번역을 의미한다.

"유전자 발현의 억제(침묵)"는 표적 유전자로부터의 단백질 및/또는 mRNA 생성물의 양이 없음(또는 관찰될 수 있을 정도로 감소)을 의미한다.

문구 "siRNA에 의해 세포내 유전자의 발현을 억제하는 것"은 특정 mRNA의 분해를 특징으로 하는, 작은 간섭 RNA 분자(siRNA)에 의한 유전적 발현의 서열 특이적 억제를 의미한다. 상기 과정은 또한 RNA 간섭 또는 RNAi로 언급된다.

원하는 핵산 서열에 "작동가능하게 연결된" 프로모터, 종결자 및 조절요소들은 원하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 상기 조절요소들은 코딩 서열의 발현을 지시하도록 작동하는 한 상기 서열에 인접할 필요가 없다. 따라서, 예를 들어 프로모터 또는 종결자는 코딩 서열의 전사에 영향을 미치면 상기 서열에 "작동가능하게 연결"된 것이다다. "프로모터"는 핵산의 직접적 전사를 지시하는 핵산 조절 서열의 배열을 의미한다. 용어 "프로모터"는 세포 유형-특이적, 조직-특이적 외부 신호 또는 제제에 의해 조절될 수 있거나 외부 신호 또는 제제에 의해 유도될 수 있는 프로모터-의존적 유전자 발현을 일으키기에 충분한 프로모터 부분을 포함한다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "프로모터"는 용어 "조절 요소"와 상호교환적으로 사용된다.

달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.

본 발명에 있어서, 각각 상이한 표적 유전자의 발현을 억제하는, 연속적으로 또는 수렴적으로 연결된 둘 이상의 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 포함하는 선형 이중가닥 RNA(liRNA) 분자가 제공된다.

필요할 경우, 상기 liRNA 분자는 2 내지 10, 바람직하게는 2 내지 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 상기 liRNA 내에 함유된 siRNA 각각은 18 내지 24개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 21개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 liRNA 분자는 두개의 연속적인 또는 수렴적인 siRNA를 포함할 수 있으며, 상기 liRNA 분자의 한 가닥의 40개의 뉴클레오티드는 다른 가닥의 상보적인 40개의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루며, 각 가닥은 염기쌍을 이루지 않는 두 개의 3' 말단의 뉴클레오티드를 포함한다.

상기 liRNA 분자의 표적 유전자는 세포로부터 유래한 유전자, 내재 유전자, 암 유발 유전자와 같이 병리학적으로 돌연변이된 유전자, 이의 발현이 심장병, 폐병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 당뇨병, 관절염 등을 야기하거나 이와 연관된 하나 이상의 유전자; 트랜스진(transgene); 또는 바이러스나 박테리아 병원균과 같이 감염 후 세포 내에 존재하는 병원균의 유전자일 수 있다. 바이러스 유전자의 예에는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 단순포진 바이러스(Herpes simplex) 1형 및 2형, 수두 대상포진 바이러스(Varicella Zoster virus), 및 리노바이러스(Rhinovirus)의 유전자들이 포함된다.

일부 실시예에 있어서, 상기 liRNA 분자는 서열번호 37과 38 또는 서열번호 39와 40의 뉴클레오티드 서열의 세트로 구성되며, 여기서 표적 서열들은 각각 HCV 5' UTR 및 NS3 유전자로부터 유래한 서열들이다.

하지만, 본 명세서에 제공된 지침을 고려할 때 당해 기술분야에서의 숙련자라면 기술분야에서 잘 알려진 방법에 따라 다양한 임의의 표적 유전자의 발현을 감소시키는 작용을 하는 다른 siRNA-암호화 liRNA 분자를 손쉽게 생성할 수 있을 것이다.

본 발명의 liRNA 분자는 세포나 생물 내 내재 유전자의 기능장애 또는 감염성 병원균에 의해 야기되는 질병을 치료하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 liRNA 분자는 임의의 표적 유전자들의 기능 분석을 위해 사용될 수 있다.

본 발명은, 본 발명의 liRNA 분자에 상보적인 이중가닥 DNA 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 추가로 제공한다. 상기 재조합 발현 벡터가 세포 내로 도입되면, 초기의 긴 간섭 RNA(liRNA)의 효율적 전사가 일어나고 상기 liRNA 분자가 세포 내 RNAi 기구(machinery)에 의하여 상이한 표적 서열을 표적으로 하는 자기접합된(self-annealed) siRNA 분자로 가공된다. 유익하게도, 하나의 플라스미드 백본(backbone) 내에 역위 반복(inverted repeats)을 갖는 헤어핀 RNA-발현 구조물과 비교하여 볼 때, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 시퀀싱 반응의 성공 확률 및 유전적 안정성을 증가시킨다.

상기 재조합 발현 벡터는 바람직하게는 이중가닥 DNA의 양 말단에 작동가능하게 연결된 2개의 수렴성 프로모터를 포함하며, 각 프로모터는 이중가닥 DNA 서열의 각 가닥의 전사가 일어나게 한다.

상기 프로모터는 인간 RNA 폴리머라아제 III일 수 있으며, 각각은 이중가닥 DNA의 5' 말단 각각에 인접한다.

인간 RNA 폴리머라아제 III 프로모터의 예에는 인간 H1, U6, 5S rRNA, 7SK 및 tRNA 프로모터를 포함하며, 인간 H1 및 U6 프로모터가 바람직하다.

상기 인간 RNA 폴리머라아제 III 프로모터는 일부 실시예에서 "야생형" 또는 "자연적으로 발생하는(naturally occurring)" 프로모터이다. 다른 실시예에 있어서, 상기 인간 RNA 폴리머라아제 III 프로모터는 자연적으로 발생하는 프로모터와 비교할 때 뉴클레오티드 서열이 하나 이상 다를 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 인간 RNA 폴리머라아제 III 프로모터는 합성 프로모터이며, 예를 들면 상기 프로모터는 표준 재조합 및/또는 합성 방법을 이용하여 합성된다.

발현 벡터는 긴 선형 RNA 분자(liRNA)의 cDNA의 발현을 조절하기 위하여 인핸서(enhancer), 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal), 종결자(terminator) 등과 같은 다른 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은, 본 발명의 liRNA 또는 본 발명의 재조합 발현 벡터를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 본 발명의 조성물은 세포나 생물 내 내재 유전자의 기능장애 또는 감염성 병원균에 의해 야기되는 질병을 치료하기 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

더욱이, 본 발명은 세포 내 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 liRNA 분자 또는 본 발명의 재조합 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 암호화된 siRNA는 상이한 유전자를 표적으로 하여 표적 유전자의 발현을 억제한다.

일부 실시예에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포이다. 일부 실시예에 있어서, 상기 세포는 in vitro 세포(예를 들면, 단일 세포 현탁액에서 배양된 진핵 세포 또는 in vitro 세포층으로서의 진핵 세포)이다. 일부 실시예에 있어서, 상기 표적 세포는 in vivo 세포(예를 들면, 다세포 생물의 일부인 진핵 세포)이다.

일부 실시예에 있어서, 상기 표적 유전자는 내재(endogenous) 유전자이다. 일부 실시예에 있어서, 상기 표적 유전자는 외재(exogenous) 유전자이다. 일부 실시예에 있어서, 상기 표적 유전자는 세포 내 병원균의 유전자이다. 일부 실시예에 있어서, 상기 표적 유전자는 바이러스 유전자이다.

발현을 감소시키는 것은 표적 유전자의 발현량이 비처리 대조구와 비교시 적어도 약 10% 이상, 바람직하게는 약 20% 이상 감소되거나 억제된 것을 의미한다. 특정 실시예에 있어서, 표적 유전자의 발현은 표적 유전자의 발현이 효과적으로 억제될 정도까지 감소되어 발현이 감지되지 않는다.

상기 억제 결과는 RNA 용액 혼성화, 뉴클레아제 보호(nuclease protection), 노던 혼성화(northern hybridization), 역전사, 마이크로어레이로 유전자 발현 추적(monitoring), 항체 결합, 효소 면역 측정법(ELISA), 웨스턴 블롯팅, 방사면역분석법(radioimmunoassay), 기타 면역분석법, 및 형광활성 세포 분석법(FACS)과 같은 생화학적 기법에 의해 확인될 수 있다. 세포주 또는 생물 전체에서의 RNA-매개 억제의 경우, 유전자 발현은 단백질 생성물이 쉽게 분석되는 리포터 또는 약물 내성 유전자를 사용하여 간편하게 분석된다. 상기 리포터 유전자들에는 아세토하이드록시산 합성효소(acetohydroxyacid synthase; AHAS), 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase; AP), 베타 갈락토시다제(LacZ), 베타 글루쿠로니다제(beta glucurocidase; GUS), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 녹색 형광 단백질(GFP), 호스래디쉬 퍼옥시다아제(HRP), 루시퍼라아제(Luc), 노팔린 합성효소(nophaline synthase; NOS), 옥토핀 합성효소(octopine synthase; OCS), 및 이의 유도체를 포함한다.

본 발명의 방법은 다양한 질환을 치료하는데 사용될 수 있으며, 상기 방법은 일반적으로 본 발명의 liRNA 분자 또는 본 발명의 재조합 발현 벡터를 개체에 투여하는 단계를 포함하며, 이로써 상기 RNA 분자나 발현 벡터가 개체의 세포로 들어가고, 상기 발현 벡터에 의해 암호화된 siRNA가 세포 내에서 생산되며, siRNA가 세포 내 표적 유전자의 발현을 감소시킨다.

치료되는 상태의 특성에 따라, 표적 유전자는 세포로부터 유래한 유전자, 내재 유전자, 암 유발 유전자와 같은 병리학적으로 돌연변이된 유전자, 이의 발현이 심장병, 폐병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 당뇨병, 관절염 등을 야기하거나 이와 연관된 하나 이상의 유전자; 트랜스진(transgene); 또는 바이러스나 박테리아 병원균과 같은 병원균의 감염 후 세포 내에 존재하는 병원균의 유전자일 수 있다.

본 발명의 liRNA 분자 또는 재조합 발현 벡터("활성 제제")는 수많은 다른 프로토콜이 기술분야에 알려져 있는 경우 임의의 간편한 프로토콜을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 활성 제제는 바이러스 감염, 미량주사(microinjection), 또는 소포(vesicle) 융합을 포함하는 수많은 경로에 의해 조직이나 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. Furth 등(Anal Biochem 205:365-368(1992))에 의해 기재된 바와 같이 근육 내 투여를 위해 분사식 주사(jet injection)가 또한 사용될 수 있다. 활성 제제 분자를 도입하는 물리적 방법에는 세포로의 직접 주사 또는 RNA 용액의 생물로의 세포외 주사(extracellular injection)가 포함된다. 활성 제제의 특성에 따라, 상기 활성 제제는 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 임의의 간편한 수단을 이용하여 숙주에 투여될 수 있다. 따라서, 상기 활성 제제는 치료 투여를 위한 다양한 제형에 포함될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 활성 제제는 적절한 약리학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 조합된 약리학적 조성물로 제형화될 수 있고, 정제, 캡슐제, 분말제, 과립제, 연고, 용액, 좌제, 주사제, 흡입제 및 에어로졸과 같은 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태의 조제물로 제형화될 수 있다. 상기 제제의 투여는 경구, 구강, 직장, 비경구, 복강내, 근육내, 종양내, 피하내, 안내(intraocular), 피내(intradermal), 기관내(intracheal) 등의 투여를 포함하는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명자들은 trans mRNA 발현 시스템에서 EGFP 및 RLuc 리포터 유전자의 2개의 상이한 부위를 표적으로 함으로써 일차적으로 선형 이중체 RNA(liRNA)를 설계하기 위한 법칙을 알아내고자 하였다. 본 발명의 liRNA 벡터 구조물(도 1a 참조)에서, 두 개의 상보적 RNA 가닥이 각각 수렴성 H1 및 U6 RNA Pol III 프로모터로부터 전사되고 나서, 단일 RNA 분자로 자기접합된다. 긴 헤어핀 RNA에서 요구되었던 G:U 와블쌍의 첨가 없이도 대장균(E.coli)에서의 플라스미드 증폭과 서열 분석에 있어 문제가 없었다.

특히, 포유류 세포에서 RNAi를 유도하기 위해 요구되는 최소 길이를 알아보는 실험으로부터, 40 bp 줄기(stem) 및 3' 오버행(overhang)을 갖는 선형 dsRNA(21 nt + 21 nt)에 의해 가장 분명한 넉다운(knockdown)이 검출되었다(도 2b 참조). 하지만, 보다 길거나(44 bp stem) 보다 짧은(34 bp stem) 이중체 RNA-발현 플라스미드가 형질감염되었을 때, 다중-침묵 효율이 급격히 감소하였다(도 2b 참조). 이러한 결과들은 siRNA 노던 블롯 분석과 연관성이 있었다(도 2c 참조). 이러한 관찰과는 대조적으로, lhRNA의 최적 길이의 요구조건에 대한 이전 보고(Liu Y. P et al., Nucleic Acids Research 35:5683-5693(2007))는 두 표적 및 서열 사이 루프에 인접한 줄기의 말단에 추가의 서열을 함유하며 43 또는 44 bp 줄기를 갖는 헤어핀이 40 또는 41 bp 줄기를 갖는 동족체(cognate)보다 훨씬 기능적임을 제시하였다. 이러한 lhRNA 및 liRNA 간의 최적 이중체 길이의 차이는 상이한 siRNA 가공 기작, 즉, lhRNA 줄기의 기저부로부터 다이서에 의한 단방향 절단과 대비되는, liRNA의 두 개의 노출된 줄기-말단으로부터 일어날 수 있는 단방향 및 양방향 가공에 의해 야기되는 것으로 보인다.

추가로, liER RNA 내의 RLuc siRNA 단위의 배향(orientation)을 바꾸어 EGFP 및 RLuc 서열의 각 안티센스 가닥이 shRNA의 줄기 기저부의 특성과 유사한 3' 오버행 구조를 갖게 함으로써 가닥 선택성을 조사하였다. H1 프로모터 하에 센스+센스 또는 센스+안티센스 중 하나의 구조를 갖는 임의의 liRNA는 유사한 유전자 침묵 효과를 나타내었고(도 2b 및 도 3b 참조), 이는 RLuc siRNA의 말단 염기쌍 간의 유사한 열역학적 안정성을 반영한다. 이러한 발견은 가이드/안티센스 가닥의 RISC 내로의 혼입 효율이 liRNA 내의 siRNA의 최적 배열로 인공적으로 조정될 수 있음을 제공한다.

나아가, 이러한 결과들을 바탕으로, 센스+센스 및 센스+안티센스 배향을 갖는 21 nt+21 nt의 40 bp liRNA의 다중-표적 활성을 HCV 레플리콘 세포에서 확인하였다. 루시퍼라아제 분석 시스템과 일치하게, 이러한 liRNA-발현 벡터의 처리에 의해 각각의 단일 siRNA-발현 벡터만큼 효율적으로 현저한 항바이러스 RNAi가 유도되었다(도 4b 및 4c 참조). 중요하게도, 5' RACE 및 PCR 데이터는 5' UTR 및 NS3 표적 부위들 모두가 단일 siRNA에 의한 것만큼 특이적으로 liHCV-UN(s21s21) 또는 liHCV-UN(s21a21)에 의해 동시에 절단될 수 있다는 증거를 제공한다(도 5b 및 5c 참조). 또한, 본 발명의 발현 벡터-유래의 liRNA는 IFN 활성이 매우 약화된 Huh 7-기반의 세포주인 FK-R2AN에서 비-특이적 IFN 반응을 유도하지 않았는데, 이는 IFN 반응이 아니라 서열-특이적 RNAi 기전이 본 연구에서 항-HCV 활성에 대한 주요 인자임을 나타낸다(도 6 참조).

요약하면, 본 발명은 상이한 종류의 siRNA가 벡터-기반의 구성적으로 설계된 liRNA로부터 가공된 후 표적 유전자의 정확한 절단을 유도함을 보여준다. 본 발명의 liRNA는 높은 돌연변이 확률을 갖는 바이러스 RNA를 산발성으로 절단하는데 적용될 수 있고, 기능적으로 연관된 단백질의 병원성 RNA 및 이의 숙주 mRNA 모두를 동시에 넉다운시키는데 적용될 수 있다.

하기 실시예들은 본 발명을 보다 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

나아가, 고상 혼합물 중의 고체, 액상 중의 액체, 및 액상 중의 고체를 위해 하기에 주어진 백분율은 각각 wt/wt, vol/vol 및 wt/vol 기준이며, 모든 반응은 특히 달리 언급하지 않는 한 상온에서 수행되었다.

실시예 1: 두 개의 수렴성 RNA 폴리머라아제 III 프로모터로부터 발현된 이중가닥 RNA의 유전자 침묵 활성

(단계 1) DNA 플라스미드의 구축

두 개의 수렴성 RNA 폴리머라아제 III 프로모터인 인간 H1 및 U6 프로모터와 또한 이들 사이에 종결 신호를 함유하는 dsRNA 발현 벡터를 이전 보고(Shin D. et al., Virus Research 119:146-153(2006))에 따라 하기와 같이 제조하였다.

구체적으로, pRNAiDu(Shin D. et al., supra)로부터 수렴성 인간 RNA 폴리머라아제 III U6 및 H1 프로모터를 이들의 각각의 정방향(f) 프라이머, U6f, 5'-CGGAATTCCCCAGTGGAAAGAC-3'(서열번호 43) 및 H1f, 5'-CGGAATTCATATTTGCATGTCGC-3'(서열번호 44)로 PCR 증폭하여 선형 dsRNA 발현 카세트를 제조하였다. 상기 PCR 생성물(~470bp)을 3% 아가로스 젤로부터 정제하고 pGEM-T Easy Vector System(Promega, Madison, WI)을 이용하여 pGEM-T 벡터로 클로닝하고, 얻어진 플라스미드를 pGD-siC로 명명하였다(도 1a).

이중체 siRNA를 발현하는 상기 이중 프로모터-기반의 벡터의 활성을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 대조구 DNA 서열 대신에 기능적으로 입증된 EGFP- 및 RLuc-특이적 21-머 siRNA 서열, 즉 도 1b에 나타나 있는 siRNA siE(s21) 및 siR(s21)에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드를 pGD-siC 벡터로 클로닝하고, 얻어진 벡터를 각각 pGD-siE(s21) 및 pGD-siR(s21)로 명명하였다. 또한, siE(s21) 및 siR(s21)의 역 대응체(inverted correspondent)를 함유하는 기타 벡터들을 제조하고 pGD-siE(a21) 및 pGD-siR(a21)로 명명하였다. 얻어진 벡터에서, 센스 및 안티센스 가닥들은 각각 U6 및 H1 프로모터로부터 전사되었다.

모든 서열들은 BigDye 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트(BigDye Terminator Cycle Sequencing kit(ABI, Foster City, CA, USA))를 이용하여 확인하였다.

(단계 2) 세포 배양 및 형질감염

인간 간암 세포주 Huh7(ATCC CCL-185) 및 전립선암 세포주 PC-3(ATCC CRL-1435)을 10% 우태아혈청(FCS HyClone)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM; Hyclone, Logan, UT, USA)에 유지하였다. 형질감염 하루 전날에, Huh7 또는 PC-3 세포를 12-웰 플레이트에 각각 1.5×10⁵ 또는 2.0×10⁵ 세포/웰의 밀도로 분주하였다. siRNA- 또는 liRNA-암호화 플라스미드로부터 비롯된 유전자 침묵 효과를 결정하기 위하여, Huh7 세포를 제조사의 지시에 따라 리포펙타민 2000(Invitrogen Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 10 ng의 pEGFPLuc(EGFP 및 FLuc 융합 단백질 암호화; BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA, USA), 1 ng의 phRL-CMV(RLuc 단백질 암호화; Promega) 및 1 μg의 PGD 계열과 함께 공동-형질감염시켰다.

(단계 3) 루시퍼라아제 분석

1, 2 및 3일째에, 각각의 pGD 벡터의 존재하에 표적 플라스미드로서 pEGFPLuc(BD Bioscience Clontech) 및 phRL-CMV(Promega)로 감염된 Huh7 세포를 250 μL의 1×패시브 용해 완충액(Promega) 중에서 상온에서 30분 동안 교반하여 용해시켰다. 제조사의 지시에 따라 이중-루시퍼라아제 리포터 분석 시스템(Promega)을 이용하여 반딧불(firefly) 및 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제 발현량 모두를 결정하였다.

그 결과, 2일째에 모든 암호화된 siRNA에서 이들의 발현 카세트 내 DNA 서열 배향(orientation)에 관계없이 평균 80%까지의 현저한 유전자 넉다운이 관찰되었으며, 이는 RNA 폴리머라아제 III 프로모터가 유사한 전사 효율을 갖는 RNA 분자를 생산한다는 것과 조립된 선형 이중체 RNA들이 RNAi를 작동시키는 작용을 한다는 것을 나타낸다(도 1c 참조).

(단계 4) 보다 긴 이중체 RNA 서열들의 유전자 침묵 활성

21-머 표적 부위의 3'까지 확장된 두 개의 25-머 삽입체 서열인 siE(s25) 및 siR(s25)를 융합하여, 결국 3' 말단에 5 nt U 서열을 갖는 48 bp의 선형 RNA 이중체를 생성함으로써 긴 간섭 RNA(liRNA)-발현 플라스미드 pGD-liER(s25s25)를 구축하였다(도 1b). 2 단계 및 3 단계의 방법에 따라 세포의 형질감염 및 루시퍼라아제 분석을 수행하였다.

흥미롭게도, pGD-liER(s25s25)로 형질감염시, 이중 루시퍼라아제 분석은 EGFP-Fluc 융합 발현이 효과적으로 억제되었음을 밝혀내었다(도 1d). 반면, RLuc siRNA에 대한 표적 부위는 pGD-liER(s25s25) 플라스미드 처리 후 단지 조금만 억제되었다. 이러한 데이터는 확장된 선형 이중체 RNA 내의 각 siRNA 구성요소의 길이 또는 배향이 다이서에 의한 liRNA의 정확한 절단을 유도하기 위하여, 처리된 siRNA의 잠재적인 안티센스 가이드 가닥의 RISC로의 통합을 향상시키고 이로써 상이한 표적 유전자 발현을 보다 동시에 효과적으로 감소시키기 위하여, 추가로 최적화되어야 함을 입증한다.

실시예 2: 연속적으로 연결된 두 개의 siRNA 서열을 갖는 긴 간섭 RNA(liRNA) 의 길이의 최적화

(단계 1) 루시퍼라아제 분석

실시예 1에서 입증된 바와 같이 liER(s25s25) RNA가 특히 RLuc 유전자에 대하여 낮은 활성을 갖기 때문에, RLuc에 대응하는 siRNA 서열들의 길이를 pliER(s25s21)의 클로닝에 의하여 21-머까지 감소시켰다(도 2a). 상기 플라스미드를 표적 벡터들인 pEGFPLuc 및 pCMV-hRL과 함께 Huh7 세포로 공동형질감염한 후, 2일째에 이중 유전자 넉다운 활성을 실시예 1의 단계 2 및 3의 방법에 따라 루시퍼라아제 분석에 의해 측정하였다. 흥미롭게도, 도 2b에 나타낸 바와 같이 EGFPLuc 유전자는 60% 감소하였는데 반해 RLuc 발현의 억제(20% 넉다운)는 여전히 적었다. 따라서, 25 nt siE RNA 서열을 추가로 21 및 15 nt로 감소시켜 각각 pliER(s21s21) 및 pliER(s15s21)을 생성하였다(도 2a). FLuc 및 RLuc 발현 모두는 pliER(s21s21)에 의해 가장 효과적으로 침묵되었다. siE 서열을 15 nt으로 축소시켰을 때, 상기 서열이 RLuc 유전자에 대해 RNAi 활성을 가지고 있음에도 불구하고 EGFP 유전자 침묵이 완전히 사라졌다(도 2b).

(단계 2) 노던 블롯 분석

배양 세포에서 liRNA의 정확한 siRNA 생성물로의 가공 효율을 비교하기 위하여, 노던 블롯 분석을 다음과 같이 수행하였다.

pGD 벡터(pGD-liER(s25s21), pGD-liER(s21s21), pGD-liER(s15s21) 및 liC)로 형질감염된 Huh 세포들로부터 2일째에 트리졸(Trizol) 시약(Invitrogen)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 7M 요소/15% 폴리아크릴아마이드 젤 상에 레인 당 5 μg의 총 RNA를 로딩하고 Hybond N⁺ 나일론막(Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)으로 이전시켰다. 상기 막을 ExpressHyb 혼성화 용액(Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA, USA) 중에서 siRNA 안티센스 가닥 또는 U6 작은 핵 RNA에 상보적인 [γ-³²P]-라벨링된 DNA 프로브와 혼성화시켰다. 프로브 서열들은 다음과 같다: EGFP siRNA 프로브, 5'-GCAGCACGACTTCTTCAAG-3'(서열번호 45); RLuc siRNA 프로브, 5'-GGGCGAGGTTAGACGGCCT-3'(서열번호 46); 및 U6 RNA 프로브, 5'-TAGTATATGTGCTGCCGAAGCGAGCA-3'(서열번호 47). RNA 마커로서 방사성표지된 디케이드 마커 시스템(Decade Marker System(Ambion, Austin, TX, USA))을 사용하였다.

안티센스 가닥을 혼성화하는 각각의 siE 및 siR 프로브를 이용한 노던 블롯 데이터들은 21-22 nt의 siE 및 siR 생성물 모두가 pliER(s21s21)-형질감염된 세포들에서만 생성됨을 밝혀내었다(도 2c). 하지만, pliER(s25s21) 및 pliER(s15s21)에 의해 부분적이거나 비효과적인 siRNA 생산이 검출되었다. 이 결과는 루시퍼라아제 분석과 상당히 연관성이 있었다(도 2b). 이러한 결과들은 포유류 세포에서 RNAi 활성 및 siRNA 생성과 관련하여 liRNA 내에 연속적으로 연결되는 가장 적합한 siRNA의 길이 단위가 21 nt임을 증명한다.

실시예 3: 수렴적으로 연결된 두 개의 siRNA 서열을 갖는 liRNA 의 길이의 최적화

RNA pol III-유래 발현 카세트의 사용에 의한 대부분의 siRNA 설계 프로그램들은 개시 뉴클레오티드로서 퓨린 서열을 선호한다. 하지만, 두 개의 siRNA들은 liRNA 발현 벡터 내에서 연속적으로 연결되고, 상기 안티센스 서열의 첫 번째 뉴클레오티드가 피리미딘 서열일 수 있으며, 이는 센스 가닥에 비해 상기 가닥의 전사 효율을 낮출 수 있다. 이로 인해 높은 전사 효율을 갖는 liRNA 발현 벡터의 제조가 제한될 수 있다. 따라서, 선형 liRNA를 광범위하게 적용하기 위해서, 본 발명자들은 다른 길이를 갖는 수렴적으로 연결된 두 개의 siRNA를 함유하는 liRNA 발현 계열(liER(s25a21), liER(s15a21) 및 liER(s25a21))을 제조하였다(도 3a). EGFPLuc 및 RLuc 유전자 발현 모두를 억제하는 이들의 능력은, 실시예 1의 단계 2의 방법에 따라 Huh7 세포로 표적 DNA와 함께 공동형질감염한 후 실시예 1의 단계 3에서와 같이 이중 루시퍼라아제 분석에 의해 평가하였다.

주목할만하게도, pliER(s21a21)의 사용에 의해 동시적인 유전자 침묵이 이뤄진 반면, pliER(s25a21) 및 pliER(s15a21)로부터 단지 부분적이고 현저하지 않은 활성이 나타났다(도 3b). 이러한 관찰과 일치하게, 정확한 크기(21-22 nt)를 갖는 두개의 기능적 siE 및 siR 생성물의 가이드 가닥이 pliER(s21a21)-형질감염된 세포에서 검출되었다(도 3c). 상기 데이터는 각 RNA pol III 프로모터로부터 전사된 두 개의 21 nt의 siRNA의 배열이 또한 연속적으로 연결된 것만큼 효율적으로 기능하였음을 나타낸다.

실시예 4: 긴 간섭 RNA 에 의한 HCV 복제의 억제

(단계 1) HCV 레플리콘 세포주의 제조

본래의 R2AN 레플리콘(Genbank Accession No: AJ238799) 내의 네오마이신 저항성 카세트의 상류에, 융합된 Renilla 루시퍼라아제 및 FMDV 2A 유전자를 삽입하여 HCV 유전자형(genotype) 1b 레플리콘 세포주 FK/R2AN을 제조하였다. 세포를 10% FBS(HyClone) 및 0.6 mg/mL G418(Calbiochem, La Jolla, CA, USA)을 함유한 DMEM(HyClone)에 유지하였다. 형질감염 전에, 앞서 기재된 바와 같이 루시퍼라아제 분석, 웨스턴 블롯 분석 또는 실시간 RT-PCR에 의해 레플리콘 세포 내 바이러스 복제를 평가하였다. 발현된 siRNA 또는 liRNA의 RNAi 활성을 시험하기 위하여, 2.0×10⁵ 세포를 12-웰 플레이트의 웰에 분주하고 리포펙타민 2000(Invitogen)을 이용하여 1 μg의 pGD-유래 플라스미드로 형질감염시키고 나서, 37℃에서 2일 동안 배양하였다.

(단계 2) 루시퍼라아제 분석

pGD 벡터 백본에 클로닝하여, HCV-특이적 siRNA인 21 nt의 HCV 5'UTR을 표적으로 하는 siHCV-U 및 21 nt의 HCV NS3을 표적으로 하는 siHCV-N을 발현하는 플라스미드들을 제조하였다(도 4a). 상기 플라스미드-유래 siRNA들은 무관한 siRNA 또는 liRNA(liC)에 비해, 형질감염 2일째에 전장 HCV 레플리콘 세포 FK/R2AN에서 Renilla 루시퍼라아제 발현량을 각각 60 및 80%까지 감소시켰다(도 4b). 레플리콘 세포에서, 루시퍼라아제는 리포터로서 바이러스 복제 또는 유전자 발현량을 반영한다.

추가로, siHCV-U 및 siHCV-N 표적 서열을 함유하는 다른 길이의 이중 siRNA(liRNA) 벡터들을 구축하였고, 이들은 liHCV-UV(s17s21), liHCV-UN(s17a21), liHCV-UN(s21s21), 및 liHCV-UN(s21a21)을 발현하였다(도 4a). 루시퍼라아제 분석은 후자의 두 개의 21+21 구조물이 in vitro에서 효과적으로 HCV 복제를 억제한 반면, 전자의 두 개의 liHCV-UN(s17s21) 및 liHCV-UN(s17a21)은 단일 siRNA와 비교하여 볼 때 그렇게 강력하지 않음을 보여준다(도 4b).

(단계 3) 웨스턴 블롯 분석

HCV 단백질 발현을 측정하기 위하여, FK/R2AN 레플리콘 세포 단독 또는 pGD 벡터로 형질감염된 세포를 M-PER 포유류 단백질 추출 시약(Pierce, Rockford, IL, USA)을 이용하여 용해시켰다. 총 세포 용해물(30 μg)을 12% SDS 폴리아크릴아마이드 젤로 분해하고 이모빌론(Immobilon)-P PVDF 막(Millipore, Bedford, MA, USA)으로 이전하였다. HCV 코어는 어피니티 바이오리에이전츠(Affinity Bioreagents(Golden, CO, USA))로부터 구입한 이들의 특이적 일차 항체를 이용하여 확인하였다. 세포의 β-액틴 단백질은 항-인간 β-액틴 항체(Sigma, St Louis, MO, USA)를 이용하여 탐지하였다. 밴드 강도는 미국의 국립보건원으로부터 제공되는 ImageJ 공공 도메인 소프트웨어로 정량하였다.

루시퍼라아제 분석 결과와 일치하게, 바이러스 코어 단백질 발현은 21+21 liRNA에 의해 급격히 감소하였지만, 17+21 liRNA에 의해서는 감소하지 않았다(도 4c). 이러한 결과들은 확장된 다-기능 이중체 RNA(liRNA) 내의 각 표적 서열의 가장 적합한 길이가 21-머이고, 이 경우 이들의 배향이 중요한 인자가 아님을 입증한다. 더욱이, cis 표적 발현 시스템에서는 하나의 표적의 유전자를 억제하는 것이 나머지 21-머 siRNA의 RNAi 활성 및 전체 항바이러스 효능에 더 큰 효과를 미칠 수 있는 장점이 있다.

실시예 5: liRNA 에 의한 HCV RNA 내의 절단 부위의 확인

발현된 liRNA에 의한 바이러스 RNA 절단을 평가하고 절단부위의 5'-말단을 결정하기 위하여, siRNA- 또는 liRNA-발현 벡터로 형질감염된 FK/R2AN 레플리콘 세포로부터 총 RNA 1.5 μg 각각을 제조사의 지시에 따라 FirstChoice RLM-RACE 키트(Ambion)를 사용하여 5' RACE RNA 어댑터와 접합(ligation)시켰다. 이들을 다음과 같이 두 가지 세트의 아우터(outer) 프라이머로 증폭하였다: 5' UTR의 일차 증폭의 경우, Ambion의 RACE 키트로부터의 5' RACE 아우터 프라이머 및 5' UTR 아우터 프라이머, 5'-ACTAGGCCGAGAGCCACGGG-3'(서열번호 48); 및 NS3 일차 증폭의 경우, 동일한 5' RACE 아우터 프라이머 및 NS3 아우터 프라이머, 5'-TTGGTCCAGGACTGTGCCGAT-3'(서열번호 49). 그리고 나서, 상기 DNA를 다음과 같이 두 가지 세트의 이너(inner) 프라이머로 재증폭하였다: 5' UTR의 이차 증폭의 경우, Ambion의 RACE 키트로부터의 5' RACE 이너 프라이머 및 5' UTR 이너 프라이머, 5'-TCCACGAGGTTGCGACCGCT-3'(서열번호 50); 및 NS3의 이차 증폭의 경우, 동일한 5' RACE 이너 프라이머 및 NS3 이너 프라이머, 5'-GTCAGTTGAGTGGCACTCAT-3'(서열번호 51). 상기 증폭된 생성물을 3% 아가로스 젤에서 분해하여, 5' UTR 밴드(220 bp) 및 NS3 밴드(177 bp)를 각각 용출하였다. 상기 증폭된 DNA를 pGEM-T 벡터(Promega)로 클로닝한 후, 서열분석에 의해 이들의 절단 부위를 결정하였다.

PCR 생성물의 젤 전기영동에 나타난 바와 같이, 레플리콘 세포에서 siHCV-U 및 siHCV-N의 플라스미드-유래 발현은 이들 자체의 PCR 생성물을 생성하였다(도 5b). 대응하는 크기를 갖는 증폭된 PCR 밴드는 형질감염되지 않은 세포나 대조구 liC-발현 플라스미드로 처리된 세포에서는 전혀 검출되지 않았다. 주목할만하게도, 5' UTR 및 NS3 RACE 생성물들 liHCV-UN(s21s21) 및 liHCV-UN(s21a21) RNA-발현 세포에서 모두 검출되었다. 하지만, liHCV-UN(s17s21) 및 liHCV-UN(s17a21)의 경우에는 NS3 RACE-유래 PCR 증폭만 이뤄졌는데, 이는 이 두 개의 liRNA들은 기능적으로 활성을 지닌 siRNA는 siHCV-U가 아니라 siHCV-N만 제대로 가공될 수 있음을 나타낸다.

나아가, 바이러스 RNA 내의 절단 부위를 결정하기 위하여, 상기 PCR 산물 각각을 pGEM-T 벡터로 직접 삽입하였다. 서열 분석 결과는 siHCV-U가 주로 예측된 부위(안티센스 siRNA의 염기들 10 및 11에 짝지은 뉴클레오티드 사이)보다도 3'-말단에 하나의 염기가 이동된 부위(안티센스 siRNA의 염기들 9 및 10에 짝지은 뉴클레오티드 사이)에 있는 HCV 5'UTR을 절단하는 반면, siHCV-N은 NS3-암호화 영역 내 예측된 절단 부위를 인식한다는 것을 보여준다(도 5C). 중요하게도, 이러한 서열 데이터는 21+21 liRNA들, liHCV-UN(s21s21) 및 liHCV-UN(s21a21)이 단일 siRNA처럼 정확하게 5'UTR 및 NS3 부위를 모두 표적으로 하고 절단할 수 있다는 증거를 제공한다. 이를 고려시, 상기 결과들은 liRNA 내 siRNA 단위의 최적 길이가 기능적 siRNA 성분을 생성하고 세포 RNAi 기전에 의해 상이한 타겟을 동시에 넉다운하는 약 21-머임을 지지한다.

실시예 6: 포유류 세포에서 liRNA 에 대한 인터페론 반응

30 bp보다 긴 dsRNA가 IFN 신호전달경로(IFN signaling pathway)의 활성화에 의해 중재되는 비특이적 유전자 침묵을 유도할 수 있다고 보고되어 왔다. 하지만, Huh 7은 이러한 dsRNA-관련 IFN 자극에 내성을 갖는 대표적인 포유류 세포주이다. 관찰된 liRNA의 항-HCV 효과가 부분적으로 긴 dsRNA에 의한 인터페론 반응의 유도로 인한 것인지를 살펴보기 위하여, 각 siRNA 또는 liRNA 발현 플라스미드를 FK/R2AN 세포로 형질감염한 후 IFN-β, OAS1 및 MxA의 mRNA 발현 수준을 반-정량적 RT-PCR에 의하여 측정하였다.

구체적으로, 1 μg의 합성 siRNA 또는 다른 pGD 벡터로 형질감염한 후 2일째에 FK/R2AN 세포로부터 분리한 총 RNA를 cDNA로 역전사하였다. IFN 반응을 유도하기 위한 양성 대조구로서 Poly(I):poly(C) dsRNA를 사용하였다. 인간 IFN-β, OAS 및 MxA cDNA를 각각의 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 사용된 정방향 및 역방향 프라이머들은 다음과 같다: IFN-β 유전자의 경우 5'-ATGACCAACAAGTGTCTCCT-3'(서열번호 52) 및 5'-TCAGTTTCGGAGGTAACCTG-3'(서열번호 53); OAS 유전자의 경우 5'-TCAGAAGAGAAGCCAACGTGA-3'(서열번호 54) 및 5'-CGGAGACAGCGAGGGTAAAT-3'(서열번호 55); 및 MxA 유전자의 경우 5'-AGTATGGTGTCGACATACCGGA-3'(서열번호 56) 및 5'-GAGTCTGGTAAACAGCCGAATG-3'(서열번호 57). 상기 PCR 생성물을 2% 아가로스 젤 상에서 분석하였다. 동시에, 동일한 시료 양을 확인하기 위하여 총 RNA의 전기영동 및 에티디움 브로마이드-염색을 수행하여 18S 및 28S RNA 밴드를 시각화하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 21-머 siRNA나 liRNA(17+21 또는 21+21)는 높은 자극성 poly(I:C)를 제외하고 IFN 경로를 활성화하지 않았으며, 이는 HCV에 대한 in vitro 유전자 침묵 활성이 서열-특이적 RNAi 활성에 의한 것임을 보여주는 것이다.

본 발명은 상기 특정 실시예와 관련하여 설명되었지만, 당해 분야의 숙련자에 의해 다양한 변형과 변화가 이루어질 수 있으며, 이 역시 첨부된 청구항에 의해 정의된 본 발명의 범주에 속하는 것으로 인식되어야 한다.

<110> MOGAM BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE <120> LINEAR DOUBLE-STRANDED RNA MOLECULE INTERFERING WITH DIFFERENT TARGET GENES <130> 200912-0120 <160> 57 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of synthetic cDNA sequence for expressing control siRNA <400> 1 agcttaaaaa actaccgttg ttataggtgc tttttg 36 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of synthetic cDNA sequence for expressing control siRNA <400> 2 gatccaaaaa gcacctataa caacggtagt ttttta 36 <210> 3 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sense strand of control siRNA <400> 3 acuaccguug uuauaggugc uuuuu 25 <210> 4 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic antisense strand of control siRNA <400> 4 gcaccuauaa caacgguagu uuuuu 25 <210> 5 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of EGFP-specific siRNA, siE(s21) <400> 5 gcagcacgac uucuucaagc uuuuu 25 <210> 6 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of EGFP-specific siRNA, siE(s21) <400> 6 gcuugaagaa gucgugcugc uuuuu 25 <210> 7 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of EGFP-specific siRNA, siE(a21) <400> 7 gcuugaagaa gucgugcugc uuuuu 25 <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of EGFP-specific siRNA, siE(a21) <400> 8 gcagcacgac uucuucaagc uuuuu 25 <210> 9 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of renilla luciferase-specific siRNA, siR(s21) <400> 9 gggcgagguu agacggccuu uuuu 24 <210> 10 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of renilla luciferase-specific siRNA, siR(s21) <400> 10 aggccgucua accucgcccu uuuu 24 <210> 11 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of renilla luciferase-specific siRNA, siR(a21) <400> 11 aggccgucua accucgcccu uuuu 24 <210> 12 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of renilla luciferase-specific siRNA, siR(a21) <400> 12 gggcgagguu agacggccuu uuuu 24 <210> 13 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of synthetic RNA sequence liC comprising consecutive two 21-mer control siRNAs <400> 13 acuaccguug uuauaggugc aagaggacuc uuggacucuc acuuuuu 47 <210> 14 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of synthetic RNA sequence liC comprising consecutive two 21-mer control siRNAs <400> 14 gugagagucc aagaguccuc uugcaccuau aacaacggua guuuuuu 47 <210> 15 <211> 53 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of synthetic RNA sequence liER(s25s25) comprising consecutive EGFR and renilla luciferase-specific siRNAs <400> 15 gcagcacgac uucuucaagu ccgaagggcg agguuagacg gccuacccuu uuu 53 <210> 16 <211> 53 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of synthetic RNA sequence liER(s25s25) comprising consecutive EGFR and renilla luciferase-specific siRNAs <400> 16 ggguaggccg ucuaaccucg cccuucggac uugaagaagu cgugcugcuu uuu 53 <210> 17 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of synthetic RNA sequence liER(s25s21) comprising consecutive EGFR and renilla luciferase-specific siRNAs <400> 17 gcagcacgac uucuucaagu ccgaagggcg agguuagacg gccuuuuuu 49 <210> 18 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of synthetic RNA sequence liER(s25s21) comprising consecutive EGFR and renilla luciferase-specific siRNAs <400> 18 aggccgucua accucgcccu ucggacuuga agaagucgug cugcuuuuu 49 <210> 19 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of synthetic RNA sequence liER(s21s21) comprising consecutive EGFR and renilla luciferase-specific siRNAs <400> 19 gcagcacgac uucuucaaga agggcgaggu uagacggccu uuuuu 45 <210> 20 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of synthetic RNA sequence liER(s21s21) comprising consecutive EGFR and renilla luciferase-specific siRNAs <400> 20 aggccgucua accucgcccu ucuugaagaa gucgugcugc uuuuu 45 <210> 21 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of synthetic RNA sequence liER(s15s21) comprising consecutive EGFR and renilla luciferase-specific siRNAs <400> 21 gcagcacgac uucaagggcg agguuagacg gccuuuuuu 39 <210> 22 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of synthetic RNA sequence liER(s15s21) comprising consecutive EGFR and renilla luciferase-specific siRNAs <400> 22 aggccgucua accucgcccu ugaagucgug cugcuuuuu 39 <210> 23 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of synthetic RNA sequence liER(s25a21) comprising consecutive EGFR and renilla luciferase-specific siRNAs <400> 23 gcagcacgac uucuucaagu ccguuaggcc gucuaaccuc gcccuuuuu 49 <210> 24 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of synthetic RNA sequence liER(s25a21) comprising consecutive EGFR and renilla luciferase-specific siRNAs <400> 24 gggcgagguu agacggccua acggacuuga agaagucgug cugcuuuuu 49 <210> 25 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of synthetic RNA sequence liER(s21a21) comprising consecutive EGFR and renilla luciferase-specific siRNAs <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> siE probe <400> 25 gcagcacgac uucuucaagu uaggccgucu aaccucgccc uuuuu 45 <210> 26 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of synthetic RNA sequence liER(s21a21) comprising consecutive EGFR and renilla luciferase-specific siRNAs <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> siR probe <400> 26 gggcgagguu agacggccua acuugaagaa gucgugcugc uuuuu 45 <210> 27 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of synthetic RNA sequence liER(s15a21) comprising consecutive EGFR and renilla luciferase-specific siRNAs <400> 27 gcagcacgac uucuuaggcc gucuaaccuc gcccuuuuu 39 <210> 28 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of synthetic RNA sequence liER(s15a21) comprising consecutive EGFR and renilla luciferase-specific siRNAs <400> 28 gggcgagguu agacggccua agaagucgug cugcuuuuu 39 <210> 29 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of HCV 5'UTR-specific siRNA, siHCV-U <400> 29 gucucguaga ccgugcaccu uuuu 24 <210> 30 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of HCV 5'UTR-specific siRNA, siHCV-U <400> 30 ggugcacggu cuacgagacu uuuu 24 <210> 31 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of HCV NS3-specfic siRNA, siHCV-N <400> 31 ggcacauggu aucgacccuu uuuu 24 <210> 32 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of HCV NS3-specfic siRNA, siHCV-N <400> 32 agggucgaua ccaugugccu uuuu 24 <210> 33 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of synthetic RNA sequence liHCV-UN(s17s21) comprising consecutive 5'UTR and NS3-specific siRNAs <400> 33 gucucguaga ccgugaaggc acaugguauc gacccuuuuu u 41 <210> 34 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of synthetic RNA sequence liHCV-UN(s17s21) comprising consecutive 5'UTR and NS3-specific siRNAs <400> 34 agggucgaua ccaugugccu ucacggucua cgagacuuuu u 41 <210> 35 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of synthetic RNA sequence liHCV-UN(s17a21) comprising consecutive 5'UTR and NS3-specific siRNAs <400> 35 gucucguaga ccguguuagg gucgauacca ugugccuuuu u 41 <210> 36 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of synthetic RNA sequence liHCV-UN(s17a21) comprising consecutive 5'UTR and NS3-specific siRNAs <400> 36 ggcacauggu aucgacccua acacggucua cgagacuuuu u 41 <210> 37 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of synthetic RNA sequence liHCV-UN(s21s21) comprising consecutive 5'UTR and NS3-specific siRNAs <400> 37 gucucguaga ccgugcacca aggcacaugg uaucgacccu uuuuu 45 <210> 38 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of synthetic RNA sequence liHCV-UN(s21s21) comprising consecutive 5'UTR and NS3-specific siRNAs <400> 38 agggucgaua ccaugugccu uggugcacgg ucuacgagac uuuuu 45 <210> 39 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of synthetic RNA sequence liHCV-UN(s21a21) comprising consecutive 5'UTR and NS3-specific siRNAs <400> 39 gucucguaga ccgugcaccu uagggucgau accaugugcc uuuuu 45 <210> 40 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of synthetic RNA sequence liHCV-UN(s21a21) comprising consecutive 5'UTR and NS3-specific siRNAs <400> 40 ggcacauggu aucgacccua aggugcacgg ucuacgagac uuuuu 45 <210> 41 <211> 21 <212> RNA <213> Hepatitis C virus <400> 41 aagucucgua gaccgugcac c 21 <210> 42 <211> 21 <212> RNA <213> Hepatitis C virus <400> 42 aaggcacaug guaucgaccc u 21 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer, U6f <400> 43 cggaattccc cagtggaaag ac 22 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer, H1f <400> 44 cggaattcat atttgcatgt cgc 23 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP siRNA probe <400> 45 gcagcacgac ttcttcaag 19 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RLuc siRNA probe <400> 46 gggcgaggtt agacggcct 19 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U6 RNA probe <400> 47 tagtatatgt gctgccgaag cgagca 26 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR outer primer <400> 48 actaggccga gagccacggg 20 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NS3 outer primer <400> 49 ttggtccagg actgtgccga t 21 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR inner primer <400> 50 tccacgaggt tgcgaccgct 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NS3 inner primer <400> 51 gtcagttgag tggcactcat 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for IFN-beta gene <400> 52 atgaccaaca agtgtctcct 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for IFN-beta gene <400> 53 tcagtttcgg aggtaacctg 20 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for OAS gene <400> 54 tcagaagaga agccaacgtg a 21 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for OAS gene <400> 55 cggagacagc gagggtaaat 20 <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MxA gene <400> 56 agtatggtgt cgacataccg ga 22 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MxA gene <400> 57 gagtctggta aacagccgaa tg 22

Claims

상이한 표적 유전자들의 발현을 각각 억제하는, 연속적으로 또는 수렴적으로 연결된 2 내지 10개의 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 포함하는 선형 이중가닥 RNA 분자.
제1항에 있어서,
상기 siRNA 각각이 18 내지 24개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 선형 이중가닥 RNA 분자.
제1항에 있어서,
상기 siRNA 각각이 21개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 선형 이중가닥 RNA 분자.
제1항에 있어서,
두 개의 연속적이거나 수렴적인 siRNA로 이루어지며, 상기 RNA 분자의 한 가닥의 40개의 뉴클레오티드가 다른 가닥의 상보적인 40개의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루고, 각 가닥은 염기쌍을 이루지 않은 2개의 3' 말단 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 선형 이중가닥 RNA 분자.
제1항에 있어서,
상기 표적 유전자가 바이러스 유전자인 것을 특징으로 하는, 선형 이중가닥 RNA 분자.
제1항의 선형 이중가닥 RNA 분자를 발현하는 이중가닥 DNA 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
제6항에 있어서,
이중가닥 DNA의 양 말단에 작동가능하게 연결된 두 개의 수렴성 프로모터를 포함하며, 각 프로모터는 상기 이중가닥 DNA 서열의 각 가닥의 전사가 일어나게 하는 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
제6항에 있어서,
상기 프로모터가 인간 RNA 폴리머라아제 III 프로모터이며, 상기 프로모터 각각이 상기 이중가닥 DNA의 각각의 5' 말단과 인접하는 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
제8항에 있어서,
상기 인간 RNA 폴리머라아제 III 프로모터가 인간 H1, U6, 5S rRNA, 7SK 및 tRNA 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
제6항에 있어서,
상기 선형 이중가닥 RNA 분자 내에 함유된 siRNA 각각이 18 내지 24개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
제6항에 있어서,
상기 선형 이중가닥 RNA 분자 내에 함유된 siRNA 각각이 21개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
제6항에 있어서,
상기 선형 이중가닥 RNA 분자가 두 개의 연속적 또는 수렴적 siRNA로 이루어지며, 한 가닥의 40개의 뉴클레오티드가 다른 가닥의 상보적인 40개의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루며, RNA 분자의 각 가닥이 염기쌍을 이루지 않은 2개의 3' 말단 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
제1항의 선형 이중가닥 RNA 분자 또는 제6항의 재조합 발현 벡터를 포함하는 조성물.
제1항의 선형 이중가닥 RNA 분자 또는 제6항의 재조합 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 코드화된 siRNA는 상이한 유전자를 표적으로 하여 표적 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 세포 내 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법.
제14항에 있어서,
상기 세포가 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서,
상기 세포가 생체외 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서,
상기 표적 유전자가 내재(endogenous) 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서,
상기 표적 유전자가 외재(exogenous) 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,
상기 표적 유전자가 세포 내 병원균의 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서,
상기 표적 유전자가 바이러스 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서,
상기 바이러스 유전자가 C형 간염 바이러스(HCV) 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제21항에 있어서,
선형 이중가닥 RNA 분자가 서열번호 37과 38 또는 서열번호 39와 40의 뉴클레오티드 서열 세트로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.