KR20100034010A - Ｔｎｆ­ｒ 효능제 치료 요법의 독성을 경감시키기 위한 ｔｌｒ 효능제 및／또는 타입 1 인터페론의 용도 - Google Patents

Ｔｎｆ­ｒ 효능제 치료 요법의 독성을 경감시키기 위한 ｔｌｒ 효능제 및／또는 타입 1 인터페론의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 TNF-R 효능제, 예컨대 CD40 효능제를 이용한 개선된 (보다 안전하고 더욱 효과적인) 치료 요법에 관한 것이다. 이 방법은 TNF-R 효능제가 단일요법으로서 이용된 (타입 1 인터페론 및/또는 TLR 효능제 없이) 일부 피검체에서 달리 초래될 수 있는 독성 (간 독성)을 예방하거나 감소시키기에 효과적인 양의 타입 1 인터페론 및/또는 TLR 효능제의 첨가를 제공한다.

Description

ＴＮＦ­Ｒ 효능제 치료 요법의 독성을 경감시키기 위한 ＴＬＲ 효능제 및／또는 타입 1 인터페론의 용도{USE OF TLR AGONISTS AND/OR TYPE 1 INTERFERONS TO ALLEVIATE TOXICITY OF TNF-R AGONIST THERAPEUTIC REGIMENS}
본 발명은 일반적으로 단일요법으로서 사용할 때 간 독성을 야기하는 TNF/TNF-R 효능제의 투여를 포함하는 치료적 또는 면역 애주번트 요법에 독성, 특히 간 독성을 예방하거나 경감시키기에 충분한 양의 하나 이상의 타입 1 인터페론 및/또는 toll-유사 수용체 (TLR) 효능제를 추가로 투여함에 의해, 상기 독성, 특히 TNF/TNF-R 슈퍼패밀리 효능제, 가장 특히 CD40 효능제의 투여시 관찰된 간 독성을 경감시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 타입 1 인터페론 및/또는 TLR 효능제의 첨가는 TNF-R 효능제가 더 높은 용량으로 투여되게 함으로써 효능을 개선시킨다. 이러한 치료적 요법은 암, 감염성 질병, 자가면역 질병, 알레르기 및 염증 질환을 포함하는 다양한 만성 질환을 치료하기 위한 이들 면역 효능제 및/또는 시토킨 면역자극 조합물의 이용을 예로서 포함한다.
지난 10년간 암 표적 항원의 확인에 있어서의 급격한 성장이 목격되었으나, 이러한 표적에 대해 효과적으로 면역성을 부여하는 인간 애주번트의 개발에 대한 유사한 행보는 뒤처져왔다. Toll-유사 수용체 및 이들의 리간드, 및 적응 면역성을 조절하는 수용체-리간드의 분자 확인은 암에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위해 분자적으로 애주번트를 조합시키는 최초의 논리적인 가설-기재 전략을 제공하였다. 선천 면역 반응을 동원하는데 있어서 TLR의 중요성과 동시에, CD40 및 이의 리간드는 적응 면역 반응의 개발에 주요한 활성화제이다.
아마도 암을 이겨내기 위한 전략에 있어서 가장 약한 측면 중 하나는 암-관련 항원에 대해 강건하고 길게 지속되는 면역성을 유도할 수 있는 애주번트의 부족이다. 과거에 본 발명자들은 염증을 유도하는 것으로 보이는 제제의 이용에 의존해 왔다. 알룸(alum)은 수산화알루미늄 및 포스페이트의 염이고 주로 체액-매개된 면역 반응을 유도한다. 이러한 애주번트는 1926년에 처음 사용되었고 FDA가 1938년에 최초로 약물 허가 권한을 받았을 때 새 규칙의 적용에서 유효하게 제외되었다. 알룸은 유일한 FDA 승인된 애주번트이며, 파상풍 톡소이드와 같은 현재 이용되는 다수의 백신 중의 성분이다. 바실 칼메트-구에린(Bacille Calmette-Guerin) (BCG), 키홀 림펫 헤오시아닌(keyhole limpet hemocyanin) (KLH), 불완전 프로인트 애주번트(incomplete Freund's adjuvant) (IFA)와 같이 암 임상 실험에 적용되어온 많은 다른 애주번트 (비-시토킨)가 존재하며, 이들 모두는 충분하게 이해되지 못한 작용 메커니즘 및 온당한 애주번트 활성을 지닌다. 면역 애주번트에 대한 수용체 (toll-유사 수용체)를 밝히는 최초의 연구가 수면 위로 떠오른 1999년이 되어서야 어떻게 이러한 "비-특이적인" 면역 시스템의 활성화제가 선천 면역성을 촉발시키는지에 대한 분자적 이해가 이루어졌다. TLR은 조혈 및 비-조혈 세포 상에 발현되는 타입 1 막 단백질이다. 현재, TLR 패밀리에는 11개의 구성원이 있다. 이러한 수용체는 병원성 유기체에 의해 발현되는 병원체-관련 분자 패턴(PAMP)를 인식하는 이들의 용량을 특징으로 한다. 통상적인 PAMP는 LPS, DNA (CpG), 지단백질, ssRNA, 및 당지질을 포함한다. TLR2 및 TLR4가 열 쇼크 단백질 패밀리 hsp60 및 hsp70의 구성원을 포함하는 여러 자가-단백질을 인식할 수 있다고 보고되었으나, TLR에 대한 진정한 내인성 리간드가 존재하는지는 여전히 논쟁의 여지가 있다.
일반적으로, TLR을 촉발시키는 것은 개선된 시토킨 생성 (IL12, IL18 등), 케모킨 수용체 발현 (CCR2, CCR5 및 CCR7), 및 공동자극 분자 발현을 통해 충분한 염증 반응을 유도한다. 이와 같이, 선천 면역 시스템에서 이러한 수용체들은 계속되는 후천성 면역 반응의 극성(polarity)에 대해 제어를 발휘한다.
CD40 (CD40L, gp39)에 대한 리간드인 CD154 또는 CD40L은 TNF-α, 림포톡신, FasL, CD30L, CD27L, 4-1BBL, 및 OX-40L을 포함하는 종양 괴사 인자 패밀리의 32-39 kD 구성원이다. 활성화된 CD4 T-세포는 CD154 발현을 책임지는 유력한 세포 유형이다. CD8+ T-세포, 호산구, 비만 세포 및 호염구, NK 세포 및 DC 상에 있는 CD154의 발현도 개시되었다. CD154에 대한 수용체인 CD40은 TNF-RI (p55), TNF-RII (p75), p75 뉴트로핀 수용체, fas, CD30, CD27, 4-1BB, 및 OX-40을 포함하는 종양 괴사 인자 수용체 (TNF-R) 슈퍼패밀리의 구성원이다. 이것은 조직 분포가 원래 B 세포, DC (DC's) 및 기저 상피 세포에 제한된 것으로 고려되는 50-kDa 막 단백질이나, 이후 연구는 단핵구/매크로파지, 미세아교 세포 및 내피 세포 상에서 CD40의 기능적인 발현을 밝혀내었다.
분리된 DC 상에서의 시험관내 연구는 CD40 촉발이 시토킨 (IL12, IL15), 케모킨 (IPlO, MIP-1베타 MIP-1알파 및 IL-8), 공동-자극 분자 발현 (CD80, CD86) 및 케모킨 수용체의 발현을 변경시킴을 나타내었다. 이러한 모든 효과는 개선된 T 세포 증식 및 분화를 자극하기 위한 CD40-활성화된 DC의 능력에 정점을 이룬다. 본 발명자들의 자체 데이터는 CD154가 TNF알파 및 RANKL에 비해 조기 신호전달, 시토킨 생성 및 케모킨 생성에 대해 보다 더욱 충분한 효과를 발휘함을 나타낸다. DC의 CD40 촉발의 한 다른 임상적 영향은 펩티드-MHCII의 턴오버(turnover)에서의 변화이다. 란자벡시아(Lanzavecchia)는 LPS를 이용하는 것으로 나타났고 본 발명자들은 CD40 효능제를 이용한 DC의 성숙이 DC의 표면 상에서 MHCII-펩티드 복합체의 축적을 촉진함을 입증하였다. 본 발명자들의 실험실 등으로부터의 연구는 CD40이 생체내 DC에 대한 중요한 수명 신호로 여겨짐을 지적한다.
CD4+ T 세포의 부재하에 CMI를 유도하는 CD40 효능제의 성과는 암 백신용 애주번트로서 CD40 효능제를 이용하기 위한 실질적인 의욕을 발생시켰다. 글레니 및 공동-연구자들에 의한 일련의 연구는 □CD40을 이용하여 CD40+ 림프종의 종양 억제를 달성할 수 있음을 나타내었으나, 항-CD40 효능제의 용량이 너무 높았고 (250 ㎍/day, 2-5일), 이상하게도 면역화에 요구되는 종양 접종물이 매우 많았다 (5xl07/마우스). 그럼에도 불구하고, 이러한 CD40+ 림프종의 임상적 완화는 인상적이었다. 덜 인상적인 것은 CD40-이었던 조혈 종양에 대한 연구였다. CD40+ 림프종 및 백혈병에서의 성공은 종양에 대한 CD40 효능제의 직접적인 효과 때문인 것 같았다. 림프종 및 백혈병의 경우, CD40은 이들의 APC 활성과, 동시에 이들의 아폽토시스도 개선시킬 수 있다. 그러나 이들 동일 그룹에 대한 후속 연구는 CD40 효능제가 고형 종양에 유리한 치료적 효과를 발휘할 수 있었음을 입증하였다. 고형 종양에서, 다수의 연구는 CD40 활성화가 아폽토틱 치사를 촉진하고 CD40 발현이 종양 세포 제거에 기여하는 종양-특이적인 T-세포 반응의 발생에서 중요한 인자임을 입증하였다. 멜리프(Melief)와 공동-연구자들과 같은 다른 그룹은 CD40 효능제나 TLR 효능제가 단독으로 생체내 (CD40-)종양을 발현시키는 Ad5E1A 상에서 효과적인 치료를 유도할 수 있었음을 나타내었다 (종양 유형은 제시되지 않음). 머피(Murphy)와 공동-연구자들은 신장 세포 암종 모델을 이용하여, 단지 효능제 항-CD40 및 IL-2의 조합물만이 치료된 마우스의 대다수에서 후속하는 재챌린지에 특이적인 면역성 및 전이 종양의 완전한 억제를 유도하였으나, 단독으로 투여된 제제는 그렇지 않았음을 밝혀내었다. 이 시점에 CD40 효능제 단독의 효능은 예측될 수 없다. 종양 상에서 CD40의 발현이 중요한지, 부과된 종양이 중요한지, CD40 단독으로 충분한지 및 액체 또는 고형 종양에서 CD40 효능제 요법의 효능에 분명한 차이가 있는지는 명확하지 않다.
CD40은 종양 보호를 위해 증대된 CMI 반응을 유도하는 타당한 표적이나 문헌상의 데이터는 이것이 광범한 범위의 종양에 적용될 수 없음을 시사하였다. 본 발명자들을 포함하는 당업자는 항-CD40 항체를 단일요법으로서 이용하여 보호 종양 면역성을 개선시키는 일반적인 방법을 개발하고자 다년간 집중적으로 노력하였으나 실패하였다. 항체의 용량, 타이밍, 접종 경로, 종양 유형, 상이한 mab 등의 임의의 모든 파라메터를 이미 광범하게 시험하였으나, 글레니에 의해 보고된 대로 B 림프종 및 백혈병 모델을 제외하고, 이들의 노력은 무익한 것으로 밝혀졌다.
케들(Kedl)과 공동-연구자들의 최근 연구는 CD40 효능제를 사용할 때 보호 CTL의 생성에 영향을 줄 수 있는 중요한 파라메터들 중 일부에 대한 많은 견해를 제공하였다. SIINFYKL-특이적인 CTL, 및 OVA-형질도입된 B16에 대한 사합체 염색을 이용하여, 이들은 항-CD40 항체 효능제가 실제로 SIINFYKL-특이적인 CTL의 손실을 가속시켰음 을 밝혀내었다. 그러나, 면역화가 SIINFYKL 미니겐을 지니는 백시니아 바이러스로 수행된 경우, 개선된 CTL 팽창이 항-CD40 항체 효능제를 이용하여 관찰되었다. 종양 항원에 대한 장기간 면역화는 만약 이러한 종양 항원이 바이러스 벡터 또는 염증과 관련하여 전달되는 경우 CD40 효능제에 의해서만 개선된다고 판단되었다. 따라서, 무수한 종양 모델의 결과물에서의 큰 차이는 항체 CD40 효능제와 상승작용하는 공동-염증 매개체의 우연한 첨가에 의해서일 수 있다.
이러한 생체내 연구는 CD40 효능제에 의한 DC의 활성화를 위해 공동-신호의 요건에 대한 다수의 최근 보고서들을 산출하였다. 공개된 연구들은 CD40 진입기전(engagement)만으로는 시험관내 및 생체내에서 DC에 의한 IL12p70 생성을 유도하기에 충분하지 않음을 보여준다. p40 및 p35에 대한 mRNA를 평가함에 의해, 본 발명자들은 TLR (STAg, 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondi)로부터의 추출물) 및 CD40을 통한 공동-진입기전이 개선된 p35 mRNA 발현 및 IL12p70의 생성에 중요함을 제시하였다. 이러한 연구에 이어 인간 DC를 이용한 연구가 후속되는데, 여기에서는 CpG DNA가 시험관내 IL12p70 생성을 위한 CD40 신호전달과 중요한 공동-자극제임을 나타내었다 (51). 더불어, CD40이 DC 성숙화의 DC 특정 양태를 유도하는데 필수적이나 충분하지 않음을 증명하는 첫 번째 연구가 있었다. 그러나, 이들은 CD40 및 TLR 효능의 조합된 작용이 CMI를 폭발적으로 유도하는데 필수적이라는 강력한 증거를 제공하지 못했다.
따라서 적응 면역 반응의 유효성을 증가시키기 위해, 예컨대 백신화 프로토콜이나 미생물 감염 동안 또는 암에서, 신규하고 보다 효과적이나 불리한 독성 부작용을 일으키지 않는 백신 애주번트를 개발하는 것이 중요한다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키고 또한 다른 이점들도 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 (i) 하나 이상의 TNF-R 효능제, 바람직하게는 단일요법으로서 사용될 때 임상 연구에서 일부 피검체에서 간 독성을 유도하는 용량으로 포함된 CD40 효능제, (ii) 단일요법으로서 투여될 때 상기 TNF-R 효능제 용량의 간 독성을 감소시키거나 제거하기에 통계적으로 효과적인 용량인 소정량의 하나 이상의 타입 1 인터페론 및/또는 하나 이상의 TLR 효능제, 및 (iii) 임의로, 세포 면역 반응이 바람직하게 유도되는 항원 효능제, 예컨대 세균, 바이러스 또는 종양 항원의 조합물을 포함하는 면역 애주번트의 투여를 수반하는 개선된 요법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 그러한 요법의 이용 및 면역 애주번트로서 및 질환을 치료하기 위해 그 안에 이용된 조성물에 관한 것이고, 여기서 T 세포 면역성은 바람직하게 개선되나 요망되지 않는 간 독성의 유도는 없다.
TLR 효능제 및 CD40 효능제 또는/및 임의로 항원을 포함하는 상승적인 애주번트의 이용이 2003년 12월 30일 출원된 US 출원 10/748,010호에 개시되어 있고, 이 출원은 그 전체로서 본원에 참조로서 포함된다. 이 우선권 출원은 다양한 분리된 TLR 효능제 화합물, 및 CD40과 다른 TNF-R 효능제 및 임의로 T 세포 면역성이 이에 대해 바람직하게 유도되어야 하는 요망되는 항원과 조합된 이들의 용도, 및 암, 감염, 자가면역 질병 및 항원 특이적 T 세포 면역성이 요망되는 기타 질환과 같은 질병을 치료하기 위한 면역 애주번트로서 이들의 용도를 예시한다.
본 발명은 타입 1 인터페론 및/또는 TLR 효능제가 TNF-R 효능제 치료 요법의 독성 부작용을 감소시키거나 제거하는데 이용될 수 있다는 발견에 관한 것이므로 그 연장선에 있다. 당해 치료 요법은 하기 수단으로서 이러한 치료가 필요한 숙주에게 투여될 수 있다:
(i) 효능제 단독으로의 면역화에 비해 개선된 (기하급수적으로 양호한) 일차 및 기억 CD8+ T 세포 반응 생성;
(ii) 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 기하급수적인 팽창 유도, 및
(iii) CD4 결핍 또는 고갈된 숙주에서조차 보호 면역성 생성 및
(iv) 상기 TNF-R 효능제를 단일요법으로서 사용했을 때보다 실질적으로 적은 간 독성을 유도하면서 상기 치료 반응 생성.
이전의 몇몇 TNF-R 효능제 치료 섭생과 대조적으로, 본 섭생은 안전하고도 효과적이며, 즉 분명히 간에 임의의 독성을 초래하지 않는다. 이에 의해, 본 발명은 TNF-R 효능제로서의 개선된 효능을 제공하며, 예컨대 CD40 효능제는 간 독성 없이 본 치료 섭생보다 높은 용량, 예컨대 2배 내지 심지어 10배 더 높은 용량으로 이용될 수 있다. 이것은 바이러스에 감염된 세포나 종양 세포와 같은 표적 세포에 대한 이의 효능을 개선시킬 것이다.
본 발명은 특히 세포 및 분자 수준에서 흑색종에 대한 항원-특이적인 면역 반응 및 독성에 미친 단일요법과 함께 조합 요법의 영향을 나타낸다. 하기 실시예에 포함된 이 연구는 암의 뮤린 모델에서 애주번트 플랫폼(platform)으로 조합시 CD40 및 TLR 효능제의 심원한 유용성을 입증한다. 이 데이터는 백신화가 전이 표적 기관을 침윤시키고 종양 성장을 조절하는 일차 및 기억 자가-반응성 CD8+ T 세포의 매우 높은 빈도를 유도함을 보여준다. 조합 요법은 또한 종양 부위에서 CD8+ T 세포에 대한 조절 T 세포 (Tregs)의 비율을 감소시킨다. 마지막으로, CD40 단일요법에 의해 유도된 명백한 간독성은 조합 요법에 의해 제거된다. 이러한 연구는 CD40 및 TLR 효능제의 조합 사용이 제한된 독성과 함께 더 큰 치료 효능을 제공하며 임상 실험에 사용되는 새로운 다원적 애주번트를 구축하기 위한 원리를 제공함을 보여준다.
하기 결과에 기초하여, 임의로 항원을 추가로 함유할 수 있는 이러한 면역 애주번트 조합물을 여하한 질병 또는 질환을 치료하는데 이용할 수 있고, 여기서 상기 언급된 개선된 세포 면역 반응은 특히 감염성 질환, 증식성 질환, 예컨대 암, 알레르기, 자가면역 질병, 염증 질병, 및 개선된 세포 면역성이 요망되는 치료적 성과인 다른 만성 질환에 치료적으로 요망된다. 본 발명의 바람직한 용도는 HIV 감염과 같은 감염성 질병 및 암의 치료를 특히 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1 이 도면은 CD40 및 TLR7을 통한 동반하는 신호전달이 개선된 세포용해 활성을 지니는 자가-항원 특이적인 CD8+ T 세포의 팽창을 유도함을 나타내는 실험을 포함한다. 이 실험 안에서 C57BL/6 마우스를 지시된 대로 100 ㎍의 종양-관련 항원 V, 100 ㎍의 CD40 FGK45, 및 100 ㎍의 S-27609를 조합시켜 정맥내로 면역화시켰다. 7일 후, "방법"에 개시된 대로 마우스를 방혈시키고 세포를 시험관내에서 TRP2(180-188)로 재자극하여 IFN을 생성하고 CD107a를 전위시키는 능력을 평가하였다. 림프구를 전방 및 측방 산란에 의해 확인하고 후속하여 모든 CD8+ 이벤트 위에 게이팅하였다. (A) 백신화된 마우스로부터의 대표적인 도트 플롯. 오른쪽 위 코너에 있는 숫자는 IFN과 CD44 (상부 열) 또는 IFN과 CD107a (하부 열)에 대해 포지티브인 CD8+ T 세포의 빈도를 나타낸다. (B) CD8 항원을 발현시키는 말초혈 림프구의 비율. 일원 ANOVA에 의한 P.001. (C) 펩티드 재자극에 반응하여 탈과립화된 CD8+ 세포의 비율 정량. 모든 경우에, 제시된 데이터는 적어도 3회의 독립적인 실험을 대표한다. 데이터를 평균±SEM (각 그룹에서 n=8)으로서 플롯팅한다. 일원 ANOVA에 의한 P.001.
도 2 이 도면은 CD40 효능제 단일요법과 대조적으로, CD40 효능제/TLR6 효능제 요법이 T 세포 기능을 보호함을 보여주는 실험을 포함한다. 도 2에 도시된 실험에서, 마우스를 지시된 대로 각각 100 ㎍의 V 펩티드, CD40, 및 S-27609의 조합물로 면역시켰다. 기억 CD8+ 기능성을 65일 후에 평가하였다. (A) 백신화된 마우스의 비장과 폐로부터 분리된 기억 CD8+ T 세포에 의한 IFN 분비의 대표적인 도트 플롯. 도트 플롯을 살아 있는 CD8+ 세포 상에 게이팅였고, 수치는 IFN 및 CD44 둘 모두에 포지티브인 세포의 비율을 나타낸다. (B) 기억 CD8+ T-세포 세포용해 활성을 생체내 세포독성 검정을 수행함에 의해 평가하였다. 수치는 항원-특이적인 용해의 비율을 반영한다.(C,D) 비장(C) 및 폐(D)에서 IFN을 발현시키는 기억 CD8+ 세포의 상대값 및 절대값의 정량. 각 세포 집단의 상대 비율에 각 조직으로부터 분리된 세포의 총 수를 곱함에 의해 포지티브 세포의 절대값을 결정하였다. (E) 패널 B에서 제시된 생체내 세포독성 검정의 정량. 일원 ANOVA에 의한 P.001. (F) 백신화된 마우스의 비장 또는 폐로부터 유래된 IFN+-기억 CD8+ T 세포 상에서 CD127 발현. 이소형 대조군을 색칠된 막대그래프로 나타낸다. (G) 기억 CD8+ T 세포에 의한 시토킨 생성. 패널 F로부터의 세포를 TNF 및 IL-2를 생성하는 능력에 대해 분석하였다. 수치는 역시 TNF 또는 IL-2에 포지티브인 CD8+IFN+ 세포의 비율을 반영한다. 모든 경우에, 데이터는 실험 당 한 그룹에 대해 4마리 이상의 마우스를 이용한 적어도 2회의 독립적인 실험으로부터 공동으로 계산되고 평균 (±SEM)으로서 플롯팅된다.
도 3 이 도면은 항-CD40/TLR7 효능제 치료 개입이 전이 흑색종의 진행을 늦춤을 나타내는 실험을 포함한다. 여기에서, C57BL/6 마우스를 105개 전이 B16.F10 흑색종 세포로 정맥내 챌린지하였다. 4일 후, 마우스를 지시된 대로 100 ㎍의 종양-관련 항원 V, 100 ㎍의 CD40 FGK45, 및 100 ㎍의 S-27609의 조합물로 백신화하였다. 24일 후, 마우스를 치사시키고, 폐를 제거하고, 전이 표면 종양 결절을 해부 현미경의 도움으로 계수하였다. (A) 종양 챌린지 24일 후 마우스의 폐 상에서 육안으로 보이는 가시적인 종양 결절의 사진. 폐 아래에 있는 숫자는 치료 효능에 대해 모니터링된 마우스의 평균 생존 시간 및 장기간 생존율을 반영한다. 데이터는 각 실험에서 그룹 당 8마리가 넘는 마우스를 이용한 3 내지 4회의 독립적인 실험으로부터 공동 계산된다. (B) 폐 전이의 계수. 데이터는 2회의 독립적인 실험으로부터 공동 계산되고 평균±SEM (각 그룹에서 n = 16마리 마우스)으로 제시된다. 데이터는 각 그룹에서 적어도 6마리의 마우스를 이용한 4회가 넘는 별개의 실험들을 대표한다. (C) 이펙터 세포 고갈 후 폐 전이의 계수. "방법"에 개시된 대로 종양 챌린지 이전에 이펙터 세포 집단의 고갈 말고는 마우스를 상기대로 처리하였다. 데이터는 평균±SEM (각 그룹에서 n = 8마리 마우스)으로 표시되고 3회의 독립적인 실험들을 대표한다.
도 4 이 도면은 림프구를 침윤시키는 동력학 분석에 관한 실험을 포함한다. 도 4(A)에 실험 설계가 제시되어 있고, 도 4(B)는 종양 챌린지 후 10일 또는 21일에 전이 표적 기관으로부터 분리된 림프구의 대표적인 도트 플롯을 함유한다. 세포를 "방법"에 개시된 대로 종양-함유 폐로부터 분리하고 종양 펩티드로 시험관내에서 재자극하였다. 플롯을 살아있는 CD8+ 세포 상에 게이팅하였다. 사분면의 오른쪽 위에 있는 숫자는 IFN 및 활성화 마커 CD44 둘 모두에 대해 포지티브인 CD8+ T 세포의 빈도를 반영한다. 데이터는 각 실험에서 그룹 당 4마리의 마우스를 이용한 3회의 독립적인 실험을 대표한다.(C,D) 종양 챌린지 후 10일 (C) 또는 21일 (D)에 폐 침윤물의 정량. 데이터는 평균(±SEM)으로 플롯팅되며 각 실험에서 그룹 당 4마리의 마우스를 이용한 2회 (C, n=8마리 마우스/그룹) 또는 3회 (D, n=12마리 마우스/그룹)의 독립적인 실험으로부터 공동 계산된 데이터를 나타낸다. (E) 종양을 접종한 지 10일 또는 21일 후에 종양 항원 및 CD40/TLR7*로 백신접종된 마우스의 폐로부터 분리된 CD8+ T 세포의 이펙터 표현형. 도트 플롯을 먼저 살아 있는 CD8+ 세포 상에 게이팅한 다음 추가로 IFN+CD44+ 집단 상에 게이팅하였다. 데이터는 각 실험에서 그룹 당 4마리의 마우스를 이용한 적어도 2회의 독립적인 실험을 대표한다.
도 5 이 도면은 CD40 단일요법과 관련된 간 독성이 TLR7 효능으로 전도됨을 나타내는 실험을 포함한다. 도 5(A, B)는 혈청 트랜스아미나아제의 동력학 분석을 포함한다. 마우스를 PBS, 100 ㎍의 CD40, 100 ㎍의 TLR7*, 또는 둘 모두로 정맥내 처리하였다. 혈청을 이후 다양한 시점에 분리하고, 알라닌 트랜스아미나아제 (A) 또는 아스파르테이트 트랜스아미나아제 (B)의 혈청 수준을 개시된 대로 측정하였다. 데이터는 시점 당 한 그룹에 대해 n=3 내지 8마리의 마우스를 이용한 3회의 독립적인 실험을 대표한다. (C-F) PBS (C), 100 ㎍의 CD40 (D), 100 ㎍의 TLR7* (E), 또는 100 ㎍의 CD40 및 100 ㎍의 TLR7* (F)로 48시간 동안 처리된 간의 조직 분석. (G) 상기대로 48시간 동안 처리된 마우스로부터의 간에서 조직병리학적 변화의 반정량적 평가. 데이터는 각 처리 그룹에서 n=6마리의 마우스를 이용한 2회의 독립적인 실험으로부터 공동 계산된다. 만-휘트니 비파라메터 테스트에 의한 P=.026.
도 6 도 6(A) 및 6(B)로 구성된 이 도면은 TLR 효능제 또는 타입 1 인터페론 (알파 인터페론)과 항-CD40 항체 효능제의 공동-투여에 의한 간 독성의 감소를 나타내는 추가의 실험을 포함한다. 이 실험에서, 혈청 간 효소 활성을 측정함에 의해 간세포 손상을 생화학적으로 평가하였다. 구체적으로, 마우스는 100 mg의 항-CD40, 100 mg의 S-27609, 또는 둘 모두를 정맥내로 투여받았다. 일부 경우에, 마우스는 다단계 용량의 재조합 인터페론 알파도 수용하였다 (보통은, 마우스 당 일백만 인터내셔널 유닛). 혈청을 24-72시간 후에 회수하여 간 화학 프로필 분석을 위해 찰스 리버 래버러토리스 (Worcester, MA)에 보냈다. 대안적으로, 혈청 샘플을 내셔널 쥬이시 메디컬 센터 코어 랩 (Denver, CO)에 의해 분석하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 독성, 특히 TNF/TNF-R 효능제의 투여를 포함하는 일부 요법에 의해 유도된 간 독성, 예컨대 CD40 효능성 항체 및 가용성 CD40L 폴리펩티드를 포함하는 일부 CD40 효능제의 투여와 관련된 간 독성을 경감시키거나 예방하는 신규한 방법을 제공한다. 놀랍게도 이러한 독성은 상기 치료 요법이 독성을 경감시키거나 예방하기에 충분한 양의 타입 1 인터페론 및/또는 TLR 효능제의 투여를 추가로 포함하는 경우 경감되거나 예방되는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명은 이러한 요법의 부작용을 감소시킬 뿐만 아니라 이러한 요법의 효능을 더 많은 용량의 TNF/TNF-R 효능제만큼 잠재적으로 개선시키며, 예컨대 CD40 효능제는 질병으로 인해 간 기능이 이미 손상될 수 있는 환자에서 해로운 간 반응을 유도시킬 위험 없이 투여될 수 있다. 당해 발명은 특히 투여된 용량의 TNF/TNF-R 효능제에서 달리 초래될 수 있는 간 독성을 감소시키거나 예방하기에 충분한 양의 타입 1 인터페론 및/또는 TLR 효능제와 함께 TNF/TNF-R 효능제를 이용하여 암, 감염성 질병, 자가면역 및 염증 질환을 치료하는 개선된 (안전하고 더욱 효과적인) 방법을 제공한다.
상기와 관련하여, 지난 10년간 암 표적 항원의 확인에 있어서의 급격한 성장이 목격되었으나, 이러한 표적에 대해 효과적으로 면역성을 부여하는 인간 애주번트의 개발에 대한 유사한 행보는 뒤처져왔다. Toll-유사 수용체 및 이들의 리간드, 및 적응 면역성을 조절하는 수용체-리간드의 분자 확인은 암에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위해 분자적으로 애주번트를 조합시키는 최초의 논리적인 가설-기재 전략을 제공하였다. 선천 면역 반응을 동원하는데 있어서 TLR의 중요성과 동시에, CD40 및 이의 리간드는 적응 면역 반응의 개발에 주요한 활성화제이다. 본원의 데이터는 CD40에 대한 효능제의 사용과 조합된, 특이적 TLR를 활성화시키는 잘-정의된 효능제의 이용이, 가장 효능 있는 바이러스 벡터로 보여지며 추가로 간 독성을 감소시키거나 제거함을 충족하거나 초과하는 정의된 펩티드에 대한 충분한 세포-매개된 면역 반응을 유도함을 나타낸다.
상기 논의된 대로, CD40은 종양 보호를 위해 강화된 CMI 반응을 유도시키는 적당한 표적이나 문헌의 데이터는 이것이 광범한 범위의 종양에 적용될 수 없다고 제안하였다. 본 발명자들의 연구소는 효능성 항-CD40 항체를 단일요법으로서 이용하여 보호 종양 면역성을 개선시키는 일반적인 방법을 개발해 내기 위해 다년간 집중적으로 연구하였으나 실패하였다. 항체의 용량, 타이밍, 접종 경로, 종양 유형, 상이한 mab 등의 임의의 모든 파라메터를 이미 광범하게 시험하였으나, 글레니(Glennie)에 의해 보고된 대로 B 림프종 및 백혈병 모델을 제외하고, 이들의 노력은 무익한 것으로 밝혀졌다.
CD40 관련 독성 . 마우스 및 인간 둘 모두에서의 연구는 CD40 효능제만의 투여가 독성을 유도함을 나타내었다. 완전한 마우스에서, CD40 효능제는 간 독성을 유도하는 것으로 나타났다. 면역 결핍 마우스 및 비-치사-조사된(irradiated) 마우스에서, CD40 효능제의 투여는 치사를 야기한다.
하기 제시된 대로, CD40 및 TLR 효능제 (또는 IFNa)를 조합 투여하는 본 발명자들의 연구를 진행하는 동안, CD40 효능제로 치료된 마우스에게 TLR 효능제 또는 IFNa을 생체내 부가하는 것이 독성을 해소하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, IFNa 및/또는 TLR 효능제와 CD40 효능제 (또는 단일요법으로서 사용되는 경우 유사한 독성을 야기하는 다른 TNF-R 효능제)의 공동-투여가 독성 부작용, 특히 간 독성을 유도하는 CD40 효능제 및 다른 TNF/TNF-R 효능제의 임상적 사용에서 관찰된 독성을 해결할 것이다. 그러한 간 독성은 그 안에 논의된 데이터를 함유하는 하기 실시예 및 첨부된 도면에 의해 제시된 대로 제거되거나 최소화된다.
따라서, 일반적으로 본 발명은 단일요법으로서 투여된 TNF/TNF-R 효능제에 의해 유도된 잠재적인 간 독성을 감소시키거나 제거하기에 충분한 양의 하나 이상의 TNR 효능제 및/또는 인터페론의 하나 이상의 유형을 추가로 투여함에 의해, 일부 피검체에서 간 독성을 유도하는 것으로 나타난 용량의 하나 이상의 TNF/TNF-R 효능제를 필요하거나 요망되는 치료적 용량으로 투여하는 것을 포함하는 개선된(더 안전한) 치료 섭생을 포함한다.
본 발명을 더욱 상세하게 논의하기에 앞서, 하기 정의를 제공한다. 다른 모든 점에서, 본원의 기술적 용어는 관련 분야의 당업자에 의해 해석되는 바에 따라 해석되어야 한다.
본원에서 사용된 대로, 하기 용어는 다음의 의미를 지닐 것이다:
"효능제"는 수용체와 함께 세포 반응을 생성할 수 있는 화합물을 언급한다. 효능제는 수용체에 직접 결합할 수 있는 리간드일 수 있다. 대안적으로, 효능제는 예를 들어 (a) 수용체에 직접 결합하는 또 다른 분자와 복합체를 형성하거나 (b) 달리 또 다른 화합물의 변형을 초래함으로써 다른 화합물이 수용체에 직접 결합하도록 함에 의해 간접적으로 수용체와 조합될 수 있다. 효능제는 특정 수용체 또는 수용체 패밀리의 효능제로서 언급될 수 있다 (예컨대, TLR 효능제 또는 TNF/R 효능제).
"항원"은 면역 반응의 표적이 될 수 있는 임의의 물질을 언급한다. 항원은, 예를 들어 해당 유기체에 의해 생성된 세포-매개된 반응 및/또는 체액 면역 반응의 표적일 수 있다. 대안적으로, 항원은 면역 세포와 접촉할 때 세포 면역 반응 (예컨대, 면역 반응 성숙화, 시토킨의 생성, 항체의 생성 등)의 표적일 수 있다.
"공동-투여된"은 조합물의 치료적 또는 예방적 효과가 단독으로 투여된 성분의 치료적 또는 예방적 효과보다 커지도록 투여되는 둘 이상의 성분의 조합물을 언급한다. 두 성분은 동시에 또는 차례로 공동-투여될 수 있다. 동시에 공동-투여된 성분은 하나 이상의 약제학적 조성물로 제공될 수 있다. 둘 이상의 성분의 순차적인 공동-투여는 성분들이 투여되어 각 성분이 동시에 치료 부위에 존재할 수 있는 경우를 포함한다. 대안적으로, 두 성분의 순차적인 공동-투여는 하나 이상의 성분이 치료 부위로부터 청소되었으나 성분을 투여한 하나 이상의 세포 효과 (예컨대 시토킨 생성, 특정 세포 집단의 활성화 등)가 하나 이상의 추가 성분이 치료 부위에 투여될 때까지 치료 부위에 남아있는 경우를 포함할 수 있다. 따라서, 공동-투여된 조합물은, 특정 환경에서, 또 다른 하나와 화학적 혼합물로서 결코 존재하지 않는 성분들을 포함할 수 있다.
"면역자극 조합물"은 치료적 및/또는 예방적 면역자극 효과를 제공하기 위해 공동-투여될 수 있는 성분들의 임의의 조합물을 언급한다. 면역자극 조합물의 성분은 TLR 효능제, TNF/R 효능제, 타입 1 인터페론, 항원, 애주번트 등을 포함할 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
"혼합물"은 둘 이상의 성분을 함유하는 임의의 혼합물, 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 에멀젼, 겔, 크림 등을 언급한다. 성분은, 예를 들어 함께 면역자극 조합물을 제공하는 두 개의 면역자극 성분일 수 있다. 면역자극 성분은 하나 이상의 항원, 하나 이상의 애주번트, 또는 둘 모두의 임의의 조합물일 수 있다. 예를 들어, 혼합물은 혼합물이 애주번트 조합물을 형성하도록 하는 두 애주번트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 혼합물은 애주번트 조합물 및 항원을 포함할 수 있어서 혼합물은 백신을 형성한다.
"상승작용" 및 이의 변형은 개별적으로 투여되는 경우 화합물을 부가한 활성보다 큰 화합물들의 조합물을 투여한 활성 (예컨대, 면역자극 활성)을 언급한다.
"TLR"은 일반적으로 유기체의 임의의 종의 Toll-유사 수용체를 언급한다. 이들은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR1O 및 TLR11을 포함한다. 특정 TLR은 기원의 종 (예컨대, 인간, 뮤린 등), 특정 수용체 (예컨대, TLR6, TLR7, TLR8 등), 또는 둘 모두에 대한 추가 언급으로 확인될 수 있다.
"TLR 효능제"는 TLR의 효능제로서 작용하는 화합물을 언급한다. 이것은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR1O, 및 TLR11 효능제 또는 이들의 조합물을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, TLR 효능제 화합물에 대한 언급은 임의의 이성질체 (예컨대, 부분입체이성질체 또는 거울상이성질체), 염, 용매화물, 다형태 등을 포함하는 임의의 약제학적으로 허용되는 형태의 화합물을 포함할 수 있다. 특히, 화합물이 광학적으로 활성인 경우, 화합물에 대한 언급은 화합물의 거울상이성질체 각각 뿐만 아니라 거울상이성질체의 라세미 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 화합물은 하나 이상의 특정 TLR의 효능제로서 확인될 수 있다 (예컨대, TLR7 효능제, TLR8 효능제, 또는 TLR7/8 효능제). 일부 구체예에서, TLR 효능제는 요망되는 항원을 발현하도록 공학처리될 수 있는 전체 바이러스 또는 미생물을 포함할 것이다. 일부 구체예에서, TLR 효능제로서 기능하는 미생물 또는 바이러스는 CD40 효능제 또는 또 다른 TNF/TNF-R 효능제, 예컨대 4-1BB 효능제 및/또는 요망되는 항원을 발현하도록 유전적으로 공학처리될 수 있어서 TNF/TNF-R 효능제, 예컨대 CD40 또는 4-1BB 효능제, TLR 효능제 및 단일 미생물 또는 바이러스 비히클 중의 임의의 항원을 제공함으로써 개선된 항원 특이적 면역 반응이 바람직하게 유도되는 조건을 지니는 숙주로의 투여를 촉진한다. 특정 화합물에 대한 TLR 효능은 임의의 적합한 방식으로 평가될 수 있다. 예를 들어 시험 화합물의 TLR 효능을 탐지하기 위한 검정이 예를 들어 2002년 12월 11일 출원된 미국 가출원 60/432,650호에 기재되어 있고, 이러한 검정에 사용하기 적합한 재조합 세포주가 본원에 참조로서 포함된 2002년 12월 11일 출원된 미국가출원 60/432,651호에 개시되어 있다.
적용된 특정 검정에도 불구하고, 화합물은 적어도 특정 TLR에 의해 매개된 일부 생물학적 활성의 역치 증가를 초래하는 화합물로 검정을 수행하는 경우, 특정 TLR의 효능제로서 확인될 수 있다. 거꾸로, 화합물은 특정된 TLR에 의해 매개된 생물학적 활성을 탐지하기 위해 설계된 검정의 수행에 이용될 때 화합물이 생물학적 활성의 역치 증가를 유도하는데 실패하는 경우, 특정된 TLR의 효능제로서 작용하지 않는 것으로 확인될 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 생물학적 활성의 증가는 적합한 대조군에서 관찰된 것과 동일한 생물학적 활성의 증가를 언급한다. 검정은 적합한 대조군과 함께 수행되거나 수행되지 않을 수 있다. 경험상, 당업자는 특정 검정과의 충분한 친밀성(familiarity)을 개발할 수 있는데 (예컨대, 특정 검정 조건하에 적합한 대조군에서 관찰되는 값의 범위) 제어를 수행하는 것은 특정 검정에서 화합물의 TLR 효능을 결정하기 위해 항상 필요한 것은 아닐 수 있다.
특정 화합물이 주어진 검정에서 특정 TLR의 효능제인지 아닌지를 결정하기 위한 TLR-매개된 생물학적 활성의 정확한 역치 증가는, 검정의 종말점으로서 관찰된 생물학적 활성, 검정의 종말점을 결정하거나 탐지하기 위해 이용된 방법, 검정의 시그널-대-노이즈 비, 검정의 정밀도, 및 동일한 검정이 다수의 TLR에 대한 화합물의 효능을 결정하는데 사용되는지 여부를 포함하나 이로 제한되지 않는 당 분야에 공지된 인자들에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 화합물이 모든 가능한 검정에 대해 특정 TLR의 효능제인지 효능제가 아닌지를 확인하기 위해 요구되는 TLR-매개된 생물학적 활성의 역치 증가를 일반적으로 설명하는 것은 실용적이지 않다. 그러나, 당업자는 이러한 인자들을 고려하여 적합한 역치를 용이하게 결정할 수 있다.
발현될 수 있는 TLR 구조적 유전자로 트랜스펙션된 HEK293 세포를 적용하는 검정은 화합물을 예를 들어 약 1 .mu.M 내지 약 10 .mu.M의 농도로 제공할 때 세포로 트랜스펙션된 TLR의 효능제로서의 화합물을 확인하기 위해 TLR-매개된 생물학적 활성 (예컨대, NF.카파.B 활성화)에 있어서 적어도 3배 증가된 역치를 이용할 수 있다. 그러나, 상이한 역치 및/또는 상이한 농도 범위가 특정 환경에서 적합할 수 있다. 또한, 상이한 역치가 상이한 검정에 적합할 수 있다.
특정 구체예에서, TLR 효능제는 TLR 또는 합성 IRM 화합물의 천연 효능제일 수 있다. IRM 화합물은 항바이러스 및 항종양 활성을 포함하나 이로 제한되지 않는 효능 있는 면역조절 활성을 소유하는 화합물을 포함한다. 예를 들어, 특정 IRM 화합물은 타입 I 인터페론, TNF-알파, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, MIP-1, 및/또는 MCP-1과 같은 시토킨의 생성 및 분비를 초래한다. 또 다른 예로서, 특정 IRM 화합물은 IL-4 및 IL-5와 같은 특정 TH2 시토킨의 생성 및 분비를 억제할 수 있다. 추가로, 일부 IRM 화합물은 IL-1 및 TNF를 억제한다고 한다 (미국특허 6,518,265).
본 발명의 면역자극 조합물에서 TLR 효능제로서 유용한 특정 IRM은 단백질, 펩티드 등과 같은 큰 생물학적 분자에 비해 소형 유기 분자 (예컨대, 약 1000 돌턴 미만의 분자량, 및 일부 경우에 약 500 돌턴 미만)이다. 특정 소형 유기 분자 IRM 화합물은 예를 들어 미국특허 4,689,338; 4,929,624; 4,988,815; 5,037,986; 5,175,296; 5,238,944; 5,266,575; 5,268,376; 5,346,905; 5,352,784; 5,367,076; 5,389,640; 5,395,937; 5,446,153; 5,482,936; 5,693,811; 5,741,908; 5,756,747; 5,939,090; 6,039,969; 6,083,505; 6,110,929; 6,194,425; 6,245,776; 6,331,539; 6,376,669; 6,451,810; 6,525,064; 6,545,016; 6,545,017; 6,558,951; 및 6,573,273; 유럽특허 0 394 026; 미국특허공개 2002/0055517; 및 국제특허공개 WO 01/74343; WO 02/46188; WO 02/46189; WO 02/46190; WO 02/46191; WO 02/46192; WO 02/46193; WO 02/46749 WO 02/102377; WO 03/020889; WO 03/043572 및 WO 03/045391에 개시되어 있다.
소형 분자 IRM의 추가의 예로는 특정 푸린 유도체 (예컨대 미국특허 6,376,501, 및 6,028,076에 개시된 것들), 특정 이미다조퀴놀린 아미드 유도체 (예컨대 미국특허 6,069,149에 개시된 것들), 특정 벤즈이미다졸 유도체 (예컨대 미국특허 6,387,938에 개시된 것들), 및 5원 질소 함유 헤테로시클릭 고리에 융합된 4-아미노피리미딘의 특정 유도체 (예컨대 미국특허 6,376,501; 6,028,076 및 6,329,381; 및 WO 02/085905에 개시된 아데닌 유도체)가 있다.
다른 IRM은 올리고누클레오티드 서열과 같은 큰 생물학적 분자를 포함한다. 일부 IRM 올리고누클레오티드 서열은 시토신-구아닌 디누클레오티드 (CpG)를 함유하며 예를 들어 미국특허 6,194,388; 6,207,646; 6,239,116; 6,339,068; 및 6,406,705에 개시되어 있다. 일부 CpG-함유 올리고누클레오티드는 예를 들어 미국특허 6,426,334 및 6,476,000에 개시된 것들과 같은 합성 면역자극 구조적 모티프를 포함할 수 있다. 다른 IRM 누클레오티드 서열에는 CpG가 없고 예를 들어 국제특허공개 WO 00/75304에 개시되어 있다.
본 발명의 면역자극 조합물에서 TLR 효능제로서 사용하기 적합한 소형 분자 IRM 화합물은 5원 질소-함유 헤테로시클릭 고리에 융합된 2-아미노피리딘을 지니는 화합물을 포함한다. 이러한 화합물은 예를 들어 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 예컨대 아미노알킬-치환된 이미다조퀴놀린 아민, 아미드-치환된 이미다조퀴놀린 아민, 설폰아미드-치환된 이미다조퀴놀린 아민, 우레아-치환된 이미다조퀴놀린 아민, 아릴 에테르-치환된 이미다조퀴놀린 아민, 헤테로시클릭 에테르-치환된 이미다조퀴놀린 아민, 아미도 에테르-치환된 이미다조퀴놀린 아민, 설폰아미도 에테르-치환된 이미다조퀴놀린 아민, 우레아-치환된 이미다조퀴놀린 에테르, 및 티오에테르-치환된 이미다조퀴놀린 아민을 포함하나 이로 제한되지 않는 이미다조퀴놀린 아민; 아미드-치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 설폰아미드-치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 우레아-치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 아릴 에테르-치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 헤테로시클릭 에테르-치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 아미도 에테르-치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 설폰아미도 에테르-치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 우레아-치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 에테르, 및 티오에테르-치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민을 포함하나 이로 제한되지 않는 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민; 아미드-치환된 이미다조피리딘 아민, 설폰아미도-치환된 이미다조피리딘 아민, 우레아-치환된 이미다조피리딘 아민을 포함하나 이로 제한되지 않는 이미다조피리딘 아민; 아릴 에테르-치환된 이미다조피리딘 아민, 헤테로시클릭 에테르-치환된 이미다조피리딘 아민, 아미도 에테르-치환된 이미다조피리딘 아민, 설폰아미도 에테르-치환된 이미다조피리딘 아민, 우레아-치환된 이미다조피리딘 에테르, 및 티오에테르-치환된 이미다조피리딘 아민; 1,2-브릿징된 이미다조퀴놀린 아민; 6,7-융합된 시클로알킬이미다조피리딘 아민; 이미다조나프티리딘 아민; 테트라히드로이미다조나프티리딘 아민; 옥사졸로퀴놀린 아민; 티아졸로퀴놀린 아민; 옥사졸로피리딘 아민; 티아졸로피리딘 아민; 옥사졸로나프티리딘 아민; 및 티아졸로나프티리딘 아민을 포함한다.
특정 구체예에서, TLR 효능제는 이미다조나프티리딘 아민, 테트라히드로이미다조나프티리딘 아민, 옥사졸로퀴놀린 아민, 티아졸로퀴놀린 아민, 옥사졸로피리딘 아민, 티아졸로피리딘 아민, 옥사졸로나프티리딘 아민 또는 티아졸로나프티리딘 아민일 수 있다.
특정 구체예에서, TLR 효능제는 설폰아미드-치환된 이미다조퀴놀린 아민일 수 있다. 대안적인 구체예에서, TLR 효능제는 우레아-치환된 이미다조퀴놀린 에테르일 수 있다. 또 다른 대안적인 구체예에서, TLR 효능제는 아미노알킬-치환된 이미다조퀴놀린 아민일 수 있다.
특정 일 구체예에서, TLR 길항제는 4-아미노-.알파,.알파,2-트리메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올이다. 대안적인 특정 구체예에서, TLR 효능제는 N-(2-{2-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]에톡시}에틸)-N-메틸모르폴린-4-카르복사미드이다. 또 다른 대안적인 구체예에서, TLR 효능제는 1-(2-아미노-2-메틸프로필)-2-(에톡시메틸-)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민이다. 또 다른 대안적인 구체예에서, TLR 효능제는 N-[4-(4-아미노-2-에틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸]메탄설폰아미드이다. 여전히 또 다른 대안적인 구체예에서, TLR 효능제는 N-[4-(4-아미노-2-프로필-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸]메탄설폰아미드이다.
특정 대안적인 구체예에서, TLR 효능제는 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 이미다조피리딘 아민, 1,2-브릿징된 이미다조퀴놀린 아민, 6,7-융합된 시클로알킬이미다조피리딘 아민, 이미다조나프티리딘 아민, 테트라히드로이미다조나프티리딘 아민, 옥사졸로퀴놀린 아민, 티아졸로퀴놀린 아민, 옥사졸로피리딘 아민, 티아졸로피리딘 아민, 옥사졸로나프티리딘 아민 또는 티아졸로나프티리딘 아민일 수 있다.
본원에서 사용된 대로, 치환된 이미다조퀴놀린 아민은 아미노알킬-치환된 이미다조퀴놀린 아민, 아미드-치환된 이미다조퀴놀린 아민, 설폰아미드-치환된 이미다조퀴놀린 아민, 우레아-치환된 이미다조퀴놀린 아민, 아릴 에테르-치환된 이미다조퀴놀린 아민, 헤테로시클릭 에테르-치환된 이미다조퀴놀린 아민, 아미도 에테르-치환된 이미다조퀴놀린 에테르 또는 설폰아미도 에테르-치환된 이미다조퀴놀린 아민, 우레아-치환된 이미다조퀴놀린 에테르 또는 티오에테르-치환된 이미다조퀴놀린 아민을 언급한다. 본원에서 사용된 대로, 치환된 이미다조퀴놀린 아민은 특히 및 명백히 1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 및 4-아미노-.알파,.알파-디메틸-2-에톡시메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올을 제외한다.
"단일요법으로서 간 독성을 유도하는 TNF-R 효능제의 치료적 유효량"은 면역성에 대해 치료적 이익을 유도하나 적어도 일부 피검체에서 간 독성을 유도하는 것으로 임상 연구에서 관찰된 (타입 1 인터페론 및/또는 TLR 효능제를 공동-투여하지 않고) TNF-R 효능제의 용량을 언급한다.
"TNF/R" 또는 "TNF/TNF-R"은 일반적으로 종양 괴사 인자 인자 (TNF) 슈퍼패밀리 또는 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 슈퍼패밀리의 임의의 구성원을 언급한다. TNF 슈퍼패밀리는, 예를 들어 CD40 리간드, OX40 리간드, 4-1BB 리간드, CD27, CD30 리간드 (CD153), TNF-.알파, TNF-.베타, RANK 리간드, LT-.알파, LT-.베타, GITR 리간드, 및 LIGHT를 포함한다. TNFR 슈퍼패밀리는, 예를 들어 CD40, OX40, 4-1BB, CD70 (CD27 리간드), CD30, TNFR2, RANK, LT-.베타.R, HVEM, GITR, TROY, 및 RELT를 포함한다. "TNF/R 효능제"는 TNF 슈퍼패밀리 또는 TNFR 슈퍼패밀리의 구성원의 효능제로서 작용하는 화합물을 언급한다. 달리 언급되지 않는 한, TNF/R 효능제 화합물에 대한 언급은 임의의 이성질체 (예컨대, 부분입체이성질체 또는 거울상이성질체), 염, 용매화물, 다형태 등을 포함하는 임의의 약제학적으로 허용되는 형태의 화합물을 포함할 수 있다. 특히, 화합물이 광학적으로 활성인 경우, 화합물에 대한 언급은 화합물의 거울상이성질체 각각 뿐만 아니라 거울상이성질체의 라세미 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 화합물은 슈퍼패밀리의 특정 구성원의 효능제로서 확인될 수 있다 (예컨대, CD40 효능제).
본원에서 "TNF-R 효능제" 또는 "TNF/TNF-R 효능제"는 독성, 예컨대 적어도 하나의 TLR 효능제 및/또는 타입 1 인터페론과 함께 이러한 효능제를 투여함에 의해 예방되거나 경감되는 간 독성을 유도하는 TNF 슈퍼패밀리 또는 TNF-R 슈퍼패밀리의 임의의 구성원의 여하한 적합한 효능제를 포함한다. 많은 경우에, 한 슈퍼패밀리의 구성원은 다른 슈퍼패밀리의 상보적인 구성원의 효능제일 수 있다. 예를 들어, CD40 리간드 (TNF 슈퍼패밀리의 구성원)는 CD40의 효능제 (TNFR 슈퍼패밀리의 구성원)로서 작용할 수 있고, CD40은 CD40 리간드의 효능제로서 작용할 수 있다. 따라서, 적합한 TNF/R 효능제는, 예를 들어 CD40 리간드, OX40 리간드, 4-1BB 리간드, CD27, CD30 리간드 (CD153), TNF-.알파, TNF-.베타, RANK 리간드, LT-.알파, LT-.베타, GITR 리간드, LIGHT, CD40, OX40, 4-1BB, CD70 (CD27 리간드), CD30, TNFR2, RANK, LT-.베타.R, HVEM, GITR, TROY, 및 RELT를 포함한다. 추가로, 적합한 TNF/R 효능제는 TNF/R에 대해 생성된 (예컨대, 각각 마우스 CD40에 대해 생성된 IC1O 및 FGK4.5) 특정 효능성 항체를 포함한다.
본원에서 "TNF-R 효능제 단일요법"은 하나 이상의 TNF-R 효능제, 예컨대 TLR 효능제 및/또는 타입 1 인터페론의 동시 투여를 포함하지 않는 CD40 효능제의 투여를 포함하는 치료적 섭생을 언급한다.
"치료 부위"는 특정 치료의 부위를 언급한다. 특정 치료에 따라서, 치료 부위는 전체 유기체 (예컨대, 전신 치료)이거나 유기체의 임의의 부분 (예컨대, 국소 치료)일 수 있다.
"타입 1 인터페론"은 총괄적으로 IFN-.알파, IFN-.베타, IFN-오메가 등이거나 이들의 임의의 혼합물 또는 조합물을 언급한다. 본 발명에서 "타입 1 인터페론"이라는 용어는 TNF-R 효능제, 바람직하게는 CD40 효능제에 가깝게 또는 함께 투여될 때 개선된 CD8+ 면역 반응을 유도하는 임의의 타입 1 인터페론을 포함한다. 이것은 알파 인터페론, 베타 인터페론 및 타입 1 인터페론으로서 분류된 다른 유형의 인터페론을 포함한다. 특히, 이것은 엡실론 인터페론, 제타 인터페론, 및 타우 인터페론, 예컨대 타우 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10을 포함한다; 또한, 이것은 알파 인터페론, 이의 페길화된 버젼, 재조합 발현 또는 돌연변이발생으로 인해 변경된 글리코실화를 지닌 타입 1 인터페론 등과 같이 상이한 유형 1 인터페론 분자의 구조를 모방하는 공통(consensus) 인터페론인, 단편과 같은 이의 변이체를 포함한다. 당업자는 시판되고 치료제로서 사용되는 것들을 포함하는 상이한 유형 1 인터페론을 잘 알고 있다. 바람직하게는, 타입 1 인터페론이 인간 타입 1 인터페론, 가장 바람직하게는 인간 알파 인터페론을 포함할 것이다.
"백신"은 항원을 포함하는 약제학적 조성물을 언급한다. 백신은 항원에 추가하여, 예를 들어 하나 이상의 애주번트, 담체 등과 같은 성분들을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, TLR 효능제는 요망되는 항원을 발현하도록 공학처리될 수 있는 전체 바이러스 또는 미생물을 포함할 것이다. 일부 구체예에서, TLR 효능제로서 기능하는 미생물 또는 바이러스는 CD40 효능제 또는 4-1BB 효능제 및/또는 요망되는 항원을 발현하도록 유전적으로 공학처리될 수 있어서 단일 미생물 또는 바이러스 비히클 중의 CD40 또는 4-1BB 효능제, TLR 효능제 및 임의의 항원을 제공함으로써 개선된 항원 특이적인 세포 면역 반응이 바람직하게 유도되는 조건을 지니는 숙주로의 투여를 촉진한다.
따라서, 본 발명은 TNF-R 효능제 및 임의로 항원의 투여를 포함하는 종양 및 감염성 질환 백신을 포함하는 개선된 (더 안전하고 더욱 효능 있는) 요법을 제공함에 의해, 동일한 용량의 TNF-R 효능제, 예컨대 CD40 효능제를 단일요법으로서 이용하는 경우 달리 초래될 수 있는 유해한 독성을 제거하거나 감소시키기에 충분한 양의 하나 이상의 TLR 효능제 및/또는 타입 1 인터페론과 TNF-R 효능제의 공동-투여에 의한 개선 (감소되거나 제거된 간 독성)이 달성된다. 본 발명자들이 본원에서 TNF-R 효능제의 용량이 특정 용량에서 독성이라고 언급할 때, 이것은 이 용량이 임상 시험에서, 예컨대 단일요법으로서 사용될 때 (TLR 및/또는 타입 1 인터페론 없이) 몇몇 간 효소 (트랜스아미나아제)의 증가에 의해 증명되는 대로, 간 독성을 유도하는 것으로 관찰되었음을 의미하기 위한 것이다. 임상 시험 동안 약물의 간 독성을 측정하는 방법은 널리 공지되어 있는데, 그 이유는 이것이 충분히 현저한 경우 화합물의 치료적 사용을 무용화시킬 수 있는 수많은 잠재적인 치료제의 부작용이기 때문이다.
이러한 요법은 항원 특이적 면역 반응의 유도가 바람직하게 초래되는 특정 질환에 포함될 것이고, 예를 들어 암 또는 상기 조성물을 생성시키는 감염성 또는 알레르기 질환과 같은 만성 질환을 지닌 환자에게 포함될 것이다.
여전히 추가로 본 발명은 일부 피검체에서 (단일요법으로서 이용되는 경우) 간 독성을 유도하는 것으로 밝혀진 양의 상기 TNF-R 효능제, 상기 간 독성을 예방하거나 경감시키기에 충분한 양의 하나 이상의 타입 1 인터페론 및/또는 TLR 효능제, 및 임의로 개선된 항원-특이적 세포 면역 반응의 유도가 치료적으로 보장되는 질환과 같은 질환의 치료에 적합한 항원 (또는 적합한 숙주, 바람직하게는 인간에서 이의 발현을 제공하는 핵산 서열(들))을 포함하는 치료적 조성물을 제공한다.
특히, 본 발명은 당해 효능제 및/또는 시토킨 조합물을 치료가 필요한 숙주에게 투여하여 개선된 항원 특이적 세포 면역 반응을 유도하는 것을 포함하는 개선된 (더 안전하고 더욱 효능 있는) 면역요법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 조성물 또는 폴리펩티드 컨주게이트 또는 이러한 효능제 및 시토킨 조합물을 엔코딩하는 핵산 서열을 암, 감염, 특히 바이러스, 세균 또는 기생충을 수반하는 만성 감염성 질환; 또는 자가면역, 염증 또는 알레르기 질환이 있거나 발생시킬 위험이 있는 피검체에게 투여할 것이다. 예를 들어, 본 발명을 이용하여 HIV, 폐암 또는 흑색종에 대한 항원 특이적인 세포 면역 반응을 유도할 수 있다. HIV는 보호 면역성이 거의 반드시 바이러스에 대한 효능 있고 길게-지속되는 세포 면역 반응의 생성을 요구할 질환의 예로 널리 인식되어 있다. 또한, 폐암 및 흑색종은 둘 모두가 연간 수 천건의 사망을 초래하고 이에 대해 개선되고 안전한 요법이 요망되는 악성 암이다.
따라서, 본 발명은 HIV에 대한 백신 및 바이러스, 세균, 진균 또는 기생충을 수반하는 다른 만성 감염성 질환뿐만 아니라 암과 같은 증식성 질환, 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 염증 질환을 치료하기 위한 조성물과 같은 효능 있고도 안전한 치료용 치료제의 개발을 제공한다.
본 발명의 적용
본 발명은 하나 이상의 TNF-R 효능제, 예컨대 CD40 효능성 항체 또는 가용성 CD40L 폴리펩티드와 같은 CD40 효능제, 이를 함유하는 단편 또는 컨주게이트를 투여하는 것을 포함하여 단일요법으로서 요망되는 치료적 용량으로 사용될 때 이러한 효능제와 관련된 독성 (간 독성)을 유효량의 하나 이상의 TLR 효능제 및/또는 타입 1 인터페론의 추가 투여에 의해 감소시키거나 제거하는 개선된 방법을 제공한다 (본 문맥에서 "유효한"이란 타입 1 인터페론 또는 TLR 효능제가 TNF-R 효능제의 간 독성을 제거하거나 감소시킴을 의미한다). TLR 효능제 및/또는 타입 1 인터페론 및 TNF/R 효능제가 특정 항원에 대한 면역 반응을 증가시키기에 효과적인 양으로 제공된다 (또는 적합한 경우 이러한 부분을 함유하거나 엔코딩하는 면역자극 컨주게이트의 형태로 투여된다). 또한, 언급된 대로, TNF-R 효능제, 예컨대 CD40 효능제의 양은 통상적으로 단일요법으로서 투여될 때 적어도 일부 피검체에서 독성 (간 독성)을 유도하는 용량으로 포함될 것이다. 또한, TLR 효능제 및/또는 타입 1 인터페론의 양은 상기 독성을 예방하거나 경감시키기에 충분한 양일 것이고 TNF-R 효능제 투여 전, 동안 또는 후에 투여될 것이다.
예를 들어, TLR 효능제는 약 100 ng/kg 내지 약 100 mg/kg의 양으로 투여될 것이다. 많은 구체예에서, TLR 효능제는 약 10 .mu.g/kg 내지 약 10 mg/kg의 양으로 투여된다. 일부 구체예에서, TLR 효능제는 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg의 양으로 투여된다. 그러나 특정 항원에 대한 면역 반응을 증가시키기에 효과적인 양을 구성하는 TLR 효능제의 특정 양은 투여되는 특정 TLR 효능제; 투여되는 특정 항원 및 이의 양; 투여되는 특정 TNF-R 효능제 및 이의 양; 면역 시스템의 상태 (예컨대, 억제됨, 약화됨, 자극됨); TLR 효능제, TNF/R 효능제 및 항원의 투여 방법 및 순서; 제형이 투여되는 종; 및 요망되는 치료 결과를 포함하나 이로 제한되지 않는 특정 인자들에 어느 정도 의존한다. 따라서, TLR 효능제의 유효량을 구성하는 양을 일반적으로 기술하는 것은 실용적이지 않다. 그러나 당업자는 이러한 인자들을 고려하여 적합한 양을 용이하게 결정할 수 있다.
타입 1 인터페론의 양은 단일요법으로서 투여될 때 TNF-R 효능제의 독성을 예방하거나 경감시키기에 충분한 양일 것이다. 본원에 제시된, 예컨대 CD40 효능제의 독성은 CD40 효능제를 타입 1 인터페론 또는 TLR 효능제와 함께 투여하는 경우 경감될 수 있다. 이에 의해, 본 발명은 더욱 효과적인 CD40 효능제 요법을 제공하는데, 이는 CD40 효능제가 지금까지 개시된 것보다 높은 용량으로 투여될 수 있기 때문이다. 예를 들어, CD40L 폴리펩티드를 타입 1 인터페론 또는 TLR 효능제와 공동-투여할 때 이의 MTD (최대 관용(tolerated) 용량)은 0.1 mg/kg/일을 적어도 1.5배만큼, 보다 바람직하게는 적어도 2-5배만큼, 또는 심지어 10배 이상 초과할 수 있어서 CD40L 폴리펩티드가 적어도 약 0.15 mg/kg/일 내지 1.0 mg/kg/일 또는 이를 초과하는 범위의 MTD 양으로 투여되게 한다. 이것은 CD40 관련된 악성종양의 치료 및 본원에 개시된 다른 치료에서와 같이 더욱 효과적인 CD40L 요법을 초래할 것이다. 또한, 본 발명은 CD40 효능제 항체 요법의 독성을 감소시키고 지금까지 제안된 것보다 높은 CD40 효능제 항체 용량의 투여를 촉진한 것이다. 특히, 상기 지시된 대로, 문헌[Vonderheide et al., J Clin. Immunol. 25(7):876-883 (2007)]에 보고된 효능성 CD40L 항체에 대한 MTD는 0.3 mg/kg이었고 과량의 용량은 일시적인 간 독성, 정맥 혈전색전증, 3등급 두통 및 시토킨 방출과 관련 독성 및 열 및 오한과 같은 부작용을 초래한 것으로 보고되었다. 타입 1 인터페론 또는 TLR 효능제와 함께 CD40 효능제 항체의 공동-투여는 잠재적으로 MTD 항체양이, 예컨대 부작용 없이 1.5-15배 또는 심지어 5-10배만큼 실질적으로 증가되게 한다. 이에 의해, CD40 효능성 항체에 대한 MTD 양은 약 0.45 mg/kg 내지 약 3.0 mg/kg 또는 심지어 이보다 높게 증가될 수 있다. 따라서, 본 발명은 달리 잠재적으로 특정 CD40 효능제 용량을 초래할, 간 독성과 같은 독성 효과를 감소시키기에 충분한 타입 1 인터페론 또는 TLR 효능제의 양을 CD40 효능제와 공동-투여하는 것을 포함한다.
타입 1 인터페론과 관련하여, 그 양은 약 1.XlO.sup.3 유닛의 활성(U) 내지 약 1.XlO U, 보다 통상적으로 약 10.sup.4 U 내지 약 10.sup.8 U까지 다양할 수 있다.
효능성 항체 또는 CD40L 폴리펩티드의 양은 약 0.00001 그램 내지 약 5 그램, 보다 통상적으로 약 0.001 그램 내지 약 1 그램으로 다양할 수 있다. 상기 지시된 대로, 바람직한 MTD는 0.3 mg/kg을 초과할 것이고 약 0.45 mg/kg 내지 약 3 mg/kg의 범위일 수 있다. 치료적 방법이 항원의 투여를 포함하는 경우, 이것은 약 0.0001 그램 내지 약 50 그램, 보다 통상적으로 약 0.1 그램 내지 약 10 그램의 양으로 투여될 수 있다. 지시된 대로, 이러한 부분들은 동일하거나 상이한 제형으로 투여될 수 있다. 별개로 투여되는 경우, 부분들은 임의의 순서로, 통상적으로 서로에 대해 수 시간 내에, 보다 통상적으로 시간적으로 실제 근접하게 투여될 수 있다.
TNF/R 효능제, 예컨대 CD40 효능제는 약 100 ng/kg 내지 약 100 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, TNF/R 효능제는 약 10 .mu.g/kg 내지 약 10 mg/kg의 양으로 투여된다. 일부 구체예에서, TNF/R 효능제는 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg의 양으로 투여된다. 그러나 특정 항원에 대한 면역 반응을 증가시키기에 효과적인 양을 구성하는 TNF/R 효능제의 특정 양은 투여되는 특정 TNF/R 효능제; 투여되는 특정 TLR 효능제 및 이의 양; 투여되는 특정 항원 및 이의 양; 면역 시스템의 상태; TLR 효능제, TNF/R 효능제 및 항원의 투여 방법 및 순서; 제형이 투여되는 종; 및 요망되는 치료 결과를 포함하나 이로 제한되지 않는 특정 인자들에 어느 정도 의존적이다. 따라서, TNF/R 효능제의 유효량을 구성하는 양을 일반적으로 개시하는 것은 실용적이지 않다. 그러나 당업자는 이러한 인자들을 고려하여 적합한 양을 용이하게 결정할 수 있다.
일부 구체예에서, 면역자극 조합물은 항원을 추가로 포함할 수 있다. 항원이 면역자극 조합물에 존재할 때 항원은 조합물의 다른 성분들과 함께 항원에 대한 면역 반응을 생성하기에 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 항원은 약 100 ng/kg 내지 약 100 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다. 다수의 구체에에서, 항원은 약 10 .mu.g/kg 내지 약 10 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 항원은 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다. 그러나 면역 반응을 생성하기에 효과적인 양을 구성하는 항원의 특정 양은 예를 들어 투여되는 특정 항원; 투여되는 특정 TLR 효능제 및 이의 양; 투여되는 특정 TNF/R 효능제 및 이의 양; 면역 시스템의 상태; TLR 효능제, TNF/R 효능제 및 항원의 투여 방법 및 순서; 제형이 투여되는 종; 및 요망되는 치료 결과와 같은 특정 인자들에 어느 정도 의존적이다. 따라서, 항원의 유효량을 구성하는 양을 일반적으로 개시하는 것은 실용적이지 않다. 그러나 당업자는 이러한 인자들을 고려하여 적합한 양을 용이하게 결정할 수 있다.
항원이 존재할 때, 항원은 면역자극 조합물의 임의의 성분과 동시에 또는 차례로 투여될 수 있다. 따라서, 항원은 단독으로 또는 하나 이상의 애주번트 (에컨대, TLR 효능제, 타입 1 인터페론 및/또는 TNF/R 효능제 포함)와의 혼합물로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 항원은 하나의 애주번트와 관련하여 동시에 투여될 수 있으나 (예컨대, 혼합물로), 하나 이상의 추가의 애주번트와 관련하여 차례로 투여될 수 있다.
면역자극 조합물의 항원 및 다른 성분들의 순차적인 공동-투여는 항원 및 다른 성분이 동시에 투여되지 않을지라도, 면역자극 조합물의 항원 및 하나 이상의 다른 성분을 투여하여 각각이 동시에 치료 부위에 존재하는 경우를 포함할 수 있다. 면역자극 조합물의 항원 및 다른 성분들의 순차적인 공동-투여는 또한 면역자극 조합물의 항원 또는 다른 성분들 중 하나 이상이 치료 부위로부터 청소되었으나 청소된 항원 또는 다른 성분의 하나 이상의 세포 효과가 (예컨대, 시토킨 생성, 특정 세포 집단의 활성화 등) 적어도 조합물의 하나 이상의 추가 성분들이 치료 부위에 투여될 때까지 그 치료 부위에 지속되는 경우를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역자극 조합물은 특정 환경에서 조합물의 또 다른 성분과 결코 혼합물로 존재하지 않는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.
항원은 예를 들어 CD8+ T 세포 반응, NK T 세포 반응, 감마/델타 T 세포 반응, 또는 TH1 항체 반응 중 하나 이상을 포함할 수 있는 TH1 면역 반응을 일으킬 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 적합한 항원은 펩티드; 폴리펩티드; 지질; 당지질; 다당류; 탄수화물; 폴리누클레오티드; 프리온; 살아있거나 비활성화된 세균, 바이러스 또는 진균; 및 세균, 바이러스, 진균, 원충, 종양-유래된 또는 유기체-유래된 항원, 독소 또는 톡소이드를 포함하나 이로 제한되지 않는다.
더욱이, 특정한 현재 실험중인 항원, 특히 강한 면역 반응을 일으키지 않는 재조합 단백질, 당단백질 및 펩티드와 같은 물질을 본 발명의 애주번트 조합물과 함께 이용할 수 있는 것으로 고려된다. 예시적인 실험용 서브유닛 항원으로는 아데노바이러스, AIDS, 수두, 시토메갈로바이러스, 뎅기, 고양이 백혈병, 조류 흑사병, A형 간염, B형 간염, HSV-1, HSV-2, 돼지 콜레라, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 일본 뇌염, 홍역, 파라인플루엔자, 광견병, 호흡기 세포융합 바이러스, 로타바이러스, 사마귀, 및 황열병과 같은 바이러스 질환과 관련된 것들이 있다.
특정 구체예에서, 항원은 암 항원 또는 종양 항원일 수 있다. 암 항원 및 종양 항원이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며 암 세포에 의해 차별적으로 발현되는 항원을 언급한다. 따라서, 암 항원은 암 세포에 대한 면역 반응을 차별적으로 표적화하는데 활용될 수 있다. 따라서 암 항원은 종양-특이적 면역 반응을 잠재적으로 자극할 수 있다. 반드시 발현되는 것은 아니나 특정 암 항원은 정상 세포에 의해 엔코딩된다. 이러한 항원들 중 일부는 정상 세포에서는 정상적으로 침묵 (즉, 발현되지 않음)하는 것을 특징으로 할 수 있고, 이들은 분화의 특정 단계에서만 발현되고 일시적으로 발현된다 (예컨대, 배아 및 태아 항원). 다른 암 항원은 예를 들어 종양유전자 (예컨대 활성화된 ras 종양유전자), 억제 유전자 (예컨대 돌연변이체 p53), 또는 내부 결실 또는 염색체 전위로부터 초래된 융합 단백질과 같은 돌연변이체 세포 유전자에 의해 엔코딩될 수 있다. 또한 다른 암 항원은 RNA 및 DNA 종양 바이러스에 의해 운반되는 것과 같은 바이러스 유전자에 의해 엔코딩될 수 있다.
암 또는 종양 및 이러한 종양과 관련된 특이적 종양 항원 (배타적인 것은 아님)으로는 급성 림프아구성 백혈병 (etv6, aml1, 시클로필린 b), B 세포 림프종 (Ig-유전형), 신경아교종 (E-카드헤린, 알파-카테닌, 베타-카테닌, 감마-카테닌, p120ctn), 방광암 (p21ras), 담관암 (p21ras), 유방암 (MUC 패밀리, HER2/neu, c-erbB-2), 자궁경부암 (p53, p21ras), 결장암 (p21ras, HER2/neu, c-erbB-2, MUC 패밀리), 결장직장암 (항원 (CRC)-CO17-1A/GA733과 관련된 결장직장, APC), 융모막암종 (CEA), 상피세포암 (시클로필린 b), 위암 (HER2/neu, c-erbB-2, ga733 당단백질), 간세포암 (알파-태아단백), 호지킨 림프종 (Imp-1, EBNA-1), 폐암 (CEA, MAGE-3, NY-ESO-1), 림포이드 세포-유래된 백혈병 (시클로필린 b), 흑색종 (p5 단백질, gp75, 종양태아성 항원, GM2 및 GD2 강글리오시드, Melan-A/MART-1, cdc27, MAGE-3, p21ras, gpl00.sup.Pmel117), 골수종 (MUC 패밀리, p21ras), 비-소세포 폐암종 (HER2/neu, c-erbB-2), 비인두암 (Imp-1, EBNA-1), 난소암 (MUC 패밀리, HER2/neu, c-erbB-2), 전립선암 (전립선 특이적 항원 (PSA) 및 이의 항원성 에피토프 PSA-1, PSA-2, 및 PSA-3, PSMA, HER2/neu, c-erbB-2, ga733 당단백질), 신장암 (HER2/neu, c-erbB-2), 자궁경부 및 식도의 편평세포암 (인간 파필로마 바이러스 단백질과 같은 바이러스 생성물), 고환암 (NY-ESO-1), 및 T 세포 백혈병 (HTLV-1 에피토프)이 있다.
항원을 포함하는 본 발명의 면역자극 조합물은 백신을 형성할 수 있다. 이러한 백신은 당업자에게 널리 공지된 추가의 약제학적으로 허용되는 성분, 부형제, 담체 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 면역자극 조합물은 당업자에게 널리 공지된 통상적인 방법에 따라서 (예컨대, 경구, 피하, 비내, 국소) 포유동물 (인간 및 비-인간), 닭 등과 같은 동물에게 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 면역자극 조합물을 피검체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.
특정 투여 순서가 제공되지 않는 한, 면역자극 조합물의 성분들은 항원과 동시에 (혼합물로 함께 또는 경구나 분리된 주입에 의해 따로따로) 또는 면역자극 조합물의 하나 이상의 다른 성분들을 투여한 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, TLR 효능제 또는 타입 1 인터페론 및 TNF/R 효능제는 또 다른 것과 동시에 또는 서로에 대해 차례로 투여될 수 있다. 또한, 항원이 면역자극 조합물의 성분으로서 존재하는 경우, 이것은 조합물의 임의의 다른 성분과 동시에 또는 이에 대해 차례로 투여될 수 있다.
면역자극 조합물의 성분들은 동시에 또는 임의의 순서로 차례대로 투여될 수 있다. 성분들을 동시에 투여하는 경우, 이들은 단일 제형이나 별개의 제형으로 투여될 수 있다. 별개의 제형으로 투여될 때, 성분들은 동시에 투여되든 차례로 투여되든 간에 단일 부위 또는 분리된 부위에 투여될 수 있다. 또한, 별개의 제형으로서 투여될 때, 각 제형은 상이한 경로를 이용하여 투여될 수 있다. 적합한 투여 경로는 경피 또는 경점막 흡수, 주입 (예컨대, 피하, 복막내, 근내, 정맥내 등), 섭취, 흡입 등을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 차례로 투여될 때, 성분들의 투여 사이의 시간은, 예를 들어 전신적으로나 투여 부위에서 특정 성분이 지속되는 시간의 길이; 또는 심지어 성분이 청소된 후에도 전신적으로나 투여 부위에서 성분의 세포 효과가 지속되는 시간의 길이와 같은 특정 인자들에 의해 적어도 부분적으로 결정될 수 있다.
특정 소형 분자 IRM 화합물은 항바이러스 시토킨의 생합성을 유도할 수 있다. 따라서, 살아있는 바이러스 항원 및 소형 분자 IRM 화합물을 면역자극 조합물의 TLR 효능제 성분으로서 포함하는 특정 구체예의 경우, IRM 화합물을 투여하기 전에 항원을 투여하여 바이러스 감염이 확립될 수 있도록 하는 것이 바람직할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 면역자극 조합물을 포함하는 백신을 투여하여 피검체에서 TH1 면역 반응을 유도하는 것을 포함할 수 있다. 상기 언급된 대로, 특정 소형 분자 IRM은 단독으로 백신 애주번트로서 유용할 수 있다. TLR 효능제 (예컨대, 소형 분자 IRM) 및 TNF/R 효능제를 포함하는 면역자극 조합물은 심지어 항원 단독, TLR 효능제와 조합된 항원, 또는 TNF/R 효능제와 조합된 항원에 비해 더 큰 면역 반응을 제공할 수 있다. 일부 경우에, TLR 효능제 및 TNF/R 효능제를 포함하는 면역자극 조합물은 TLR 효능제 또는 TNF/R 효능제에 비해 면역 반응을 상승적으로 증가시킬 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 세포가 생체내인지 생체외인지와 무관하게 면역 시스템의 세포로부터 면역 반응을 유도하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명의 면역자극 조합물은 치료용 백신의 성분, 예방용 백신의 성분 또는 생체외 세포 배양에 이용되는 면역자극 인자로서 유용할 수 있다. 생체외에서 면역 반응을 유도하기 위해 이용하는 경우, 생체외 활성화된 면역 세포를 환자에게 재도입할 수 있다. 대안적으로, 세포 배양에서 활성화된 면역 세포에 의해 분비된 인자들 (예컨대, 항체, 시토킨, 공동-자극 인자 등)을 조사, 예방 또는 치료 용도로 수집할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 생체내에서 항원-특이적인 방식으로 나이브(naive) CD8+ T 세포를 활성화시키는 것을 포함한다. 항원 및 면역자극 조합물의 공동-투여에 반응하여 생성된 활성화된 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 집단은 -항원이 명백하게 면역자극 조합물의 성분이든지 아니든지 간에- 기능적으로 별개인 두 서브-집단으로 나누어질 수 있다. 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 한 집단은 이펙터 T 세포 --세포-매개된 면역 반응을 제공함에 있어서 반응성 있게 고용된 CD8+ T 세포를 포함한다. 항원-특이적 CD8+ T 세포의 두 번째 집단은 그 자체가 면역 반응을 제공하는데 관여하지는 않으나 이후 동일한 항원과 접촉시 항원-특이적 이펙터 세포가 되도록 용이하게 유도될 수 있는 CD8+ T 세포인 기억 T 세포를 포함한다. 하기 방법에 따른 CD8+ T 세포의 활성화는 항원-특이적 CD8+ 이펙터 T 세포의 증식을 유도하거나, 항원-특이적 CD8+ 기억 T 세포를 생성하거나, 둘 모두를 초래할 수 있다.
항원을 포함하는 면역자극 조합물을 피검체에게 투여할 수 있다. 피검체에서의 충분한 인큐베이션 후에, CD8+ T 세포는 면역화에 반응하여 항원-특이적인 CD8+ 이펙터 T 세포로 성숙될 것이다. 더 많은 비율의 CD8+ 이펙터 T 세포는 단순히 항원, 항원과 TNF/R 효능제, 또는 항원과 TLR 효능제로 면역된 피검체에 비해 TLR 효능제 및 TNF/R 효능제를 포함하는 면역자극 조합물로 면역된 피검체에서 항원-특이적일 것이다. 일반적으로, 면역화 및 CD8+ 이펙터 T 세포의 생성간 인큐베이션 시간은 약 4일 내지 약 12일이다. 특정 구체예에서, CD8+ 이펙터 T 세포는 면역화한 지 약 5일 후에 생성될 수 있다. 다른 구체예에서, CD8+ T 이펙터 T 세포는 면역화한 지 약 7일 후에 생성될 수 있다.
항원이 단백질인 경우, 반드시 전체 단백질을 피검체에 투여해야 하는 것은 아닐 수 있다. 따라서, 피검체에게 본 발명의 면역자극 조합물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 피검체의 CD8+ 세포독성 T 림프구 (CTL)에서 항원-특이적인 반응을 유도할 수 있다. 이러한 반응은 예를 들어 종양 및 바이러스-감염된 세포 집단을 포함하는 다수의 조건에 대해 유도될 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 본 발명의 백신을 예방적으로 투여하여 예를 들어 종양 및/또는 바이러스 감염에 대해 유도된 보호성 항원-특이적인 세포-매개된 면역성을 지니는 피검체를 제공할 수 있다.
대안적인 구체예에서, 본 발명의 면역자극 조합물은 생체내 항원-특이적인 CD8+ 기억 T 세포를 발생시키는데 이용될 수 있다. 항원-특이적인 CD8+ 기억 T 세포는 항원에 두 번째 노출시 제2 TH1 면역 반응을 생성할 수 있다. CD8+ 이펙터 T 세포는 2시간 만큼 짧게 항원에 재-노출시 재활성화된 CD8+ 기억 T 세포로부터 생성될 수 있다. 항원으로의 두 번째 노출은 면역화 (즉, 부스터 면역화)나 자연 노출에 의해서일 수 있다.
본 발명의 면역자극 조합물은 세포-매개된 면역 반응에 의해 치료될 수 있는 질환을 치료적으로 처치하는데 이용될 수 있다. 이러한 조합물은 하나 이상의 치료적 유효량의 TLR 효능제 및 치료적 유효량의 TNF/R 효능제를 함유할 수 있다. 많은 구체예에서, 치료적 조합물은 치료적 유효량의 항원을 추가로 포함할 수 있다.
치료적 조합물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 추가로 조합하여 제공될 수 있다. TLR 효능제 및/또는 타입 1 인터페론, TNF/R 효능제, 및 항원 (조합물에 존재하는 경우)이 상이한 부위에 및/또는 상이한 경로에 의해 차례로 공동-투여될 수 있으므로, 치료적 조합물은 둘 이상의 제형으로 제공될 수 있다. 둘 이상의 제형으로 제공될 때, 각 제형은 남아있는 제형에 포함된 담체 또는 담체들과 유사하거나 상이한 담체를 포함할 수 있다. 대안적으로, TLR 효능제, 및/또는 타입 1 인터페론 TNF/R 효능제, 및 항원 (조합물에 존재하는 경우)은 단일 담체나 담체들의 조합물을 포함할 수 있는 단일 제형으로 제공될 수 있다.
각 성분 또는 성분들의 혼합물은, 예를 들어 정제, 로젠지, 비경구 제형, 시럽, 크림, 연고, 에어로졸 제형, 경피 패치, 경점막 패치 등과 같은 임의의 적합한 통상적인 투여 형태로 투여될 수 있다.
치료적 면역자극 조합물을 치료 섭생에서 단일 치료제로서 투여할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 치료적 면역자극 조합물은 본 발명의 또 다른 치료적 조합물, 하나 이상의 약제학적 조성물, 또는 항바이러스제, 항생제, 추가의 IRM 화합물 등과 같은 다른 활성제와 함께 투여될 수 있다.
TH1 면역 반응을 유도하고 CD8+ 이펙터 T 세포의 풀(pool)을 생성하는 능력으로 인해, 본 발명의 특정 면역자극 조합물은 바이러스 질환 및 종양을 치료하는데 특히 유용할 수 있다. 면역조절 활성은 본 발명의 면역자극 조합물 및 백신이 하기를 포함하나 이로 제한되지 않는 질환을 치료하는데 유용함을 제안한다:
(a) 바이러스 질환, 예를 들어 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(예컨대, HSV-I, HSV-II, CMV, 또는 VZV), 폭스바이러스 (예컨대, 바리올라 또는 백시니아와 같은 오르토폭스바이러스, 또는 물사마귀), 피코르나바이러스 (예컨대, 리노바이러스 또는 장바이러스), 오르토믹소바이러스 (예컨대, 인플루엔자바이러스), 파라믹소바이러스 (예컨대, 파라인플루엔자바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 및 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)), 코로나바이러스 (예컨대, SARS), 파포바바이러스 (예컨대, 파필로마바이러스, 예컨대 생식기 사마귀, 심상성 사마귀 또는 족저 사마귀를 야기하는 것들), 헤파드나바이러스 (예컨대, B형 간염 바이러스), 플라비바이러스 (예컨대, C형 간염 바이러스 또는 뎅기 바이러스), 또는 레트로바이러스 (예컨대, HIV와 같은 렌티바이러스)에 의한 감염으로부터 초래된 질환;
(b) 세균 질환, 예를 들어 에스체리치아, 엔테로박터, 살모넬라, 스타필로코커스, 시겔라, 리스테리아, 에어로박터, 헬리코박터, 클렙시엘라, 프로테우스, 슈도모나스, 스트렙토코커스, 클라미디아, 미코플라스마, 뉴모코커스, 네이세리아, 클로스트리디움, 바실러스, 코리네박테리움, 미코박테리움, 캄필로박터, 비브리오, 세라티아, 프로비덴시아, 크로모박테리움, 브루셀라, 예르시니아, 헤모필루스 또는 보르데텔라 속의 세균에 의한 감염으로부터 초래된 질환;
(c) 클라미디아와 같은 기타 감염성 질환, 캔디다증, 아스퍼질러스증, 히스토플라스마증, 효모균성 뇌막염을 포함하나 이로 제한되지 않는 진균 질환, 또는 말라리아, 폐포자충 폐렴, 리슈만편모충증, 와포자충증, 톡소포자충증, 및 파동편모충 감염을 포함하나 이로 제한되지 않는 기생충 질환; 및
(d) 신생물성 질환, 예를 들어 상피내 종양, 자궁목 형성이상, 광선 각화증, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 신장 세포 암종, 카포시 육종, 폐암, 흑색종, 골수 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 다발골수종, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, B-세포 림프종 및 모발상 세포 백혈병을 포함하나 이로 제한되지 않는 백혈병, 및 기타 암 (예컨대, 상기 확인된 암); 및
(e) TH2-매개된 아토피 및 자가면역 질환, 예컨대 아토피 피부염 또는 습진, 호산구증가증, 천식, 알레르기, 알레르기성 비염, 전신 홍반 루푸스, 본태성 혈소판증가증, 다발성경화증, 오멘(Ommen's) 증후군, 원판상 루푸스, 원형 탈모증, 켈로이드 형성과 다른 유형의 흉터형성의 억제, 및 만성 상처(chronic wounds)를 포함하는 상처 치유의 개선.
본 발명의 면역자극 조합물의 일부 구체예는 또한 예를 들어 BCG, 콜레라, 페스트, 장티푸스, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 파라인플루엔자, 폴리오, 광견병, 홍역, 볼거리, 풍진, 황열병, 파상풍, 디프테리아, 헤모필루스 인플루엔자 b, 결핵, 수막구균 및 폐렴구균 백신, 아데노바이러스, HIV, 수두, 시토메갈로바이러스, 뎅기, 고양이 백혈병, 조류 흑사병, HSV-I 및 HSV-2, 돼지 콜레라, 일본 뇌염, 호흡기 세포융합 바이러스, 로타바이러스, 파필로마 바이러스, 황열병, 및 알츠하이머병과 관련하여 사용되는, 체액 및/또는 세포 매개된 면역 반응을 일으키는 임의의 물질, 예컨대 생 바이러스, 세균, 또는 기생충 항원; 비활성화된 바이러스, 종양-유래된, 원충, 유기체-유래된, 진균 또는 세균 항원, 톡소이드, 독소; 자가-항원; 다당류; 단백질; 당단백질; 펩티드; 세포 백신; DNA 백신; 재조합 단백질; 당단백질; 펩티드 등과 함께 이용되는 백신 애주번트로서 유용할 수 있다.
본 발명의 면역자극 조합물은 또한 약화된 면역 기능을 지니는 개체에게 특히 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 화합물 IRM은 예를 들어 이식 환자, 암 환자 및 HIV 환자에서의 세포 매개된 면역성의 억제 후에 발생하는 기회감염 및 종양을 치료하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 치료적 유효량의 본 발명의 면역자극 조합물을 동물에게 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 바이러스 감염을 치료하고 동물에서 신생물성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 바이러스 감염을 치료 또는 억제하는 치료적 유효량은 치료되지 않은 대조 동물에 비해 바이러스 병변, 바이러스 부하, 바이러스 생성속도 및 사망율과 같은 바이러스 감염의 증상들 중 하나 이상의 감소를 야기하는 양이다. 신생물성 질환을 치료하기 위한 조합물의 치료적 유효량은 예를 들어 치료되지 않은 대조군에 비해 종양 크기의 감소, 종양 병소의 수 감소를 야기하거나 종양의 성장을 늦추는 양이다.
특정 일 구체예에서, 본 발명의 면역자극 조합물은 생체내 종양 성장을 억제하는데 이용될 수 있다. 특정 항원을 발현시키는 종양 세포를 지니는 피검체를 TLR 효능제, TNF/R 효능제, 및 임의로 항원을 함유하는 치료적 조합물로 면역시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 요법은 초기 면역화 및 제2 부스터 면역화를 포함할 수 있다. 본 발명의 치료적 조합물로 면역된 피검체로부터 수득된 종양은 일반적으로 (a) 면역되지 않은 피검체, 또는 (b) 항원으로만 면역된 피검체로부터 회수된 종양에 비해 작다.
본 발명에 따른 치료는 1회 또는 1회를 초과하는 면역화를 포함할 수 있다. 치료가 1회를 초과하는 면역화를 포함하는 경우, 치료는 임의의 적합한 빈도로 투여된 여하한 적합한 횟수의 면역화를 포함할 수 있다. 치료 섭생에서 면역화의 횟수 및 빈도는 적어도 부분적으로 치료되는 질환과 이의 단계, 피검체의 면역 시스템의 상태, 투여되는 특정 TLR 효능제 또는 타입 1 인터페론, 투여되는 특정 TNF/R 효능제와 이의 양, 및 투여되는 (존재하는 경우) 특정 항원과 이의 양에 의존적이다.
언급된 대로, 일부 구체예에서, 본 발명의 치료적 조합물은 항원 성분을 요구하지 않을 수 있다. 특정 질환의 경우 (예컨대, B 세포 림프종 또는 만성 세균이나 바이러스 감염), 효과적인 치료는 항원을 포함하지 않는 면역자극 조합물을 이용하여 달성될 수 있다. 이러한 질환은 예를 들어 질환을 치료할 수 있는 세포-매개된 면역 반응을 생성하는 질환-특이적인 항원의 충분한 양 또는 종류를 그 질환이 제공할 수 있으므로 그러한 방식으로 치료될 수 있다.
TLR 효능제 및/또는 타입 1 인터페론 및TNF/R 효능제는 특정 항원에 대한 면역 반응을 증가시키기에 효과적인 양 및 TNF-R 효능제가 단일요법으로서 간 독성을 유도할 수 있는 용량으로 제공된다 (또는 적합한 경우 면역자극 조합물의 형태로 투여된다).
예를 들어, TLR 효능제는 약 100 ng/kg 내지 약 100 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다. 많은 구체예에서, TLR 효능제는 약 10 .mu.g/kg 내지 약 10 mg/kg의 양으로 투여된다. 일부 구체예에서, TLR 효능제는 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg의 양으로 투여된다. 그러나 특정 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는데 효과적인 양을 구성하는 TLR 효능제의 특정 양은 투여되는 특정 TLR 효능제; 투여되는 특정 항원과 이의 양; 투여되는 특정 TNF/R 효능제와 이의 양; 면역 시스템의 상태 (예컨대, 억제됨, 약화됨, 자극됨); TLR 효능제, TNF/R 효능제, 및 항원의 투여 방법 및 순서; 제형이 투여되는 종; 및 요망되는 치료 결과를 포함하나 이로 제한되지 않는 특정 인자에 어느 정도 의존적이다. 따라서, TLR 효능제의 유효량을 구성하는 양을 일반적으로 개시하는 것은 실용적이지 않다. 그러나 당업자는 이러한 인자들을 고려하여 적합한 양을 용이하게 결정할 수 있다.
또한, 예를 들어 TNF/R 효능제는 약 100 ng/kg 내지 약 100 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, TNF/R 효능제는 약 10 .mu.g/kg 내지 약 10 mg/kg의 양으로 투여된다. 일부 구체예에서, TNF/R 효능제는 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg의 양으로 투여된다. 그러나 특정 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는데 효과적인 양을 구성하는 TNF/R 효능제의 특정 양은 투여되는 특정 TNF/R 효능제; 투여되는 TLR 효능제와 이의 양; 투여되는 특정 항원과 이의 양; 면역 시스템의 상태; TLR 효능제, TNF/R 효능제, 및 항원의 투여 방법 및 순서; 제형이 투여되는 종; 및 요망되는 치료 결과를 포함하나 이로 제한되지 않는 특정 인자에 어느 정도 의존적이다. 따라서, TNF/R 효능제의 유효량을 구성하는 양을 일반적으로 개시하는 것은 실용적이지 않다. 그러나 당업자는 이러한 인자들을 고려하여 적합한 양을 용이하게 결정할 수 있다.
대조적으로, 일부 구체예에서, 면역자극 조합물은 항원을 추가로 포함할 수 있다. 항원이 면역자극 조합물에 존재하는 경우, 항원은 조합물의 다른 성분들과 함께 항원에 대한 면역 반응을 생성하기에 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 항원은 약 100 ng/kg 내지 약 100 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다. 다수의 구체예에서, 항원은 약 10 .mu.g/kg 내지 약 10 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 항원은 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다.
그러나 면역 반응을 생성하는데 효과적인 양을 구성하는 항원의 특정 양은 예를 들어 투여되는 특정 항원; 투여되는 특정 TLR 효능제와 이의 양; 투여되는 특정 TNF/R 효능제와 이의 양; 면역 시스템의 상태; TLR 효능제, TNF/R 효능제, 및 항원의 투여 방법 및 순서; 제형이 투여되는 종; 및 요망되는 치료 결과를 포함하나 이로 제한되지 않는 특정 인자에 어느 정도 의존적이다. 따라서, 항원의 유효량을 구성하는 양을 일반적으로 개시하는 것은 실용적이지 않다. 그러나 당업자는 이러한 인자들을 고려하여 적합한 양을 용이하게 결정할 수 있다.
존재하는 경우, 항원은 면역작극 조합물의 임의의 성분과 동시에 또는 차례로 투여될 수 있다. 따라서, 항원은 단독으로 투여되거나 하나 이상의 애주번트 (예컨대, TLR 효능제 및/또는 타입 1 인터페론, TNF/R 효능제, 또는 이들의 조합물)와의 혼합물로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 항원은 하나의 애주번트와 관련하여 동시에 (예컨대, 혼합물로) 투여될 수 있으나, 하나 이상의 추가 애주번트와 관련하여 차례로 투여될 수 있다.
면역자극 조합물의 항원 및 다른 성분들의 순차적인 공동-투여는 항원 및 다른 성분이 동시에 투여되지 않더라도, 면역자극 조합물의 항원 및 하나 이상의 다른 성분을 투여하여 각각이 동시에 치료 부위에 존재하는 경우를 포함할 수 있다. 면역자극 조합물의 항원 및 다른 성분들의 순차적인 공동-투여는 또한 면역자극 조합물의 항원 또는 다른 성분들 중 하나 이상이 치료 부위로부터 청소되었으나 청소된 항원 또는 다른 성분의 하나 이상의 세포 효과가 (예컨대, 시토킨 생성, 특정 세포 집단의 활성화 등) 적어도 조합물의 하나 이상의 추가 성분들이 치료 부위에 투여될 때까지 그 치료 부위에 지속되는 경우를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역자극 조합물은 특정 환경에서 조합물의 또 다른 성분과 결코 혼합물로 존재하지 않는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 면역자극 조합물을 피검체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 방법 및 조성물은 감염성 제제로부터의 항원을 포함시킴에 의해 감염되었거나 감염될 위험이 있는 개체를 치료하는데 이용될 수 있다. 감염은 숙주에 외래 유기체의 존재 또는 숙주 내에서 재생되는 제제에 기인하는 질병 또는 질환을 언급한다. 감염될 위험이 있는 피검체는 감염이 일어나기 쉬운 피검체이다. 이러한 피검체는 예를 들어 감염성 유기체 또는 제제로의 노출이 공지되었거나 의심되는 피검체를 포함할 수 있다. 감염될 위험이 있는 피검체는 또한 감염성 제제 또는 유기체에 대한 면역 반응을 일으키는 능력의 손상과 관련된 질환을 지니는 피검체, 예를 들어 선천성 또는 후천성 면역결핍 피검체, 방사선이나 화학요법을 받고 있는 피검체, 화상을 입은 피검체, 외상성 상해를 입은 피검체, 수술을 받고 있는 피검체, 또는 다른 침습성 의학적 또는 치과 시술, 또는 유사하게 면역약화된 개체를 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물로 치료되거나 예방될 수 있는 감염은 세균, 바이러스, 진균 및 기생충을 포함한다. 감염의 덜 일반적인 기타 유형으로는 또한 리케차, 미코플라스마, 및 면양떨림병, 소 해면 뇌병증 (BSE), 및 프리온 질병 (예를 들어 쿠루 및 크로이츠펠트-야콥병)을 야기하는 제제가 있다. 인간을 감염시키는 세균, 바이러스, 진균, 및 기생충의 예는 널리 알려져 있다. 감염은 급성, 아급성, 만성 또는 잠복기일 수 있고 국소적이거나 전신적일 수 있다. 더욱이, 감염은 숙주에서 감염성 유기체 제제의 라이프 사이클 중 적어도 한 기 동안 우세하게 세포내성(intracellular)이거나 세포외성(extracellular)일 수 있다.
당해 백신 및 방법을 이용할 수 있는 세균 감염은 그램 음성 및 그램 양성 세균 둘 모두를 포함한다. 그램 양성 세균의 예는 파스퇴렐라 종, 스타필로코커스 종, 및 스트렙토코커스 종을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 그램 음성 세균의 예는 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 종, 및 살모넬라 종을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 감염성 세균의 특정 예로는 헬리코박터 파일로리(Heliobacter pyioris), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), 미코박테리아 종(Mycobacteria spp.) (예를 들어, M. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis), M. 아비움(M. avium), M. 인트라셀릴라레(M. intracellilare), M. 칸사이이(M. kansaii), M. 고르도나(M. gordonae)), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 네이세리아 고노르호에아(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노시토게너스(Listeria monocytogeners), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), (그룹 A 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae) (그룹 B 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 (비리단스 그룹), 스트렙토코커스 파에칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코커스 (혐기성 종), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 병원성 캄필로박터 종(Campylobacter spp.), 엔테로코커스 종(Enterococcus spp.), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diptheriae), 코리네박테리움 종(Corynebacterium spp.), 에리시펠로트릭스 루시오파티에(Erysipelothrix rhusiopathie), 클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 박테로이드 종(Bacteroides spp.), 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스(Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 트레포네마 퍼테뉴(Treponema pertenue), 렙토스피라, 리케차, 및 악티오마이세스 이스라엘리이(Actinomyces israelii)가 있으나 이로 제한되지 않는다.
인간에서 감염을 일으키는 바이러스의 예로는 레트로비리대 (예를 들어, 인간 결핍 바이러스, 예컨대 HIV-1 (HTLV-III으로서도 언급됨), HIV-II, LAC 또는 IDLV-III/LAV 또는 HIV-III 및 기타 분리물, 예컨대 HIV-LP, 피코르나비리대 (예를 들어, 폴리오바이러스, A형 간염, 엔테로바이러스, 인간 콕사키에 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스), 칼시비리대 (예를 들어, 위창자염을 야기하는 균주), 토가비리대 (예를 들어, 마뇌염 바이러스, 풍진 바이러스), 플라비비리대 (예를 들어, 뎅기 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열병 바이러스), 코로나비리대 (예를 들어, 코로나바이러스), 라브도비리대 (예를 들어, 소수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스), 필로비리대 (예를 들어, 에볼라 바이러스), 파라믹소비리대 (예를 들어, 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스), 오르토믹소비리대 (예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 분가비리대 (예를 들어, 하탄(Hataan) 바이러스, 분가 바이러스, 플레오보바이러스, 및 나이로 바이러스), 아레나 비리대 (유행출혈열 바이러스), 레오비리대 (예를 들어, 레오바이러스, 오르비바이러스, 로타바이러스), 비마비리대, 헤파드나비리대 (B형 간염 바이러스), 파르보비리대 (파르보바이러스), 파포바비리대 (파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스), 아데노비리대 (아데노바이러스), 헤르페비리대 (예를 들어, 단순헤르페스 바이러스(HSV) I 및 II, 바리셀라 조스터 바이러스, 폭스 바이러스) 및 이리도비리대 (예를 들어, 아프리카 돼지열 바이러스) 및 미분류된 바이러스 (예를 들어, 해면상 뇌병증의 병인체, 델타 간염의 제제, 비-A, 비-B 간염의 제제 (장관으로 보내지는 클래스 1; C형 간염과 같이 비경구로 보내지는 클래스 2); 노르워크 및 관련 바이러스 및 아스트로 바이러스)가 있으나 이로 제한되지 않는다.
진균의 예로는 아스퍼질러스 종(Aspergillus spp.), 코카이도이즈 이미티스(Coccidoides immitis), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 및 기타 캔디다 종(Candida spp.), 블라스토마이세스 더마티디스(Blastomyces dermatidis), 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 노카르디아 종(Nocardia spp.), 및 뉴모사이티스 카리니이(Pneumocytis carinii)가 있다.
기생충으로는 이로 제한되는 것은 아니나 혈액-매개 및/또는 조직 기생충, 예컨대 바베시아 미크로티(Babesia microti), 바베시 디베르간스(Babesi divergans), 엔토모에바 히스톨리티카(Entomoeba histolytica), 지아르다 람블리아(Giarda lamblia), 레이슈마니아 트로피카(Leishmania tropica), 레이슈마니아 종(Leishmania spp.), 레이슈마니아 브라질리엔시스(Leishmania braziliensis), 레이슈마니아 도노브드니(Leishmania donovdni), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모디움 말라리아(Plasmodium malariae), 플라스모디움 오발레(Plasmodium ovale), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii), 트리파노소마 잠비엔세(Trypanosoma gambiense) 및 트리파노소마 로데시엔세(Trypanosoma rhodesiense) (파동편모충증), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi) (차구스병(Chagus' disease)) 및 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii), 편형동물 및 회충이 있다.
지적된 대로 본 발명은 암과 같은 증식성 질환을 치료하는데 있어서 당해 치료적 섭생 및 조성물의 용도를 추가로 포함한다. 암은 신체의 기관 및 시스템의 정상 기능을 방해하는 세포의 제어되지 않은 성장의 질환이다. 암에 걸린 피검체는 피검체의 신체에 존재하는 객관적으로 측정할 수 있는 암 세포를 지니는 개체이다. 암이 발생할 위험이 있는 피검체는 예를 들어 가족력, 유전적 소인, 방사선 또는 다른 암-유발제에 노출된 피검체에 기초하여, 암이 발생하기 쉬운 개체이다. 이들의 원위치에서 이동하여 중추 기관에 퍼진 암은 결국 감염된 기관의 기능성 저하를 통해 개체를 사망에 이르게 할 수 있다. 백혈병과 같은 조혈암은 피검체에서 정상적인 조혈 구획과 초-경쟁(out-compete)할 수 있어서 조혈 실패를 야기하고 (빈혈증, 저혈소판증 및 호중성백혈구감소증), 결국 사망을 야기한다.
전이는 일차 종양으로부터 신체의 다른 부분으로 암 세포가 퍼짐에 의해 초래된 일차 종양 위치와 별개인 암세포 부위이다. 일차 종양 덩어리의 진단시에, 피검체는 전이의 존재에 대해 모니터링될 수 있다. 전이는 종종 특이적 징후의 모니터링에 추가하여 자기 공명 영상(MRI), 컴퓨터 단층촬영법(CT), 스캔, 혈액 및 혈소판 계수, 간기능 연구, 흉부-X-선 및 뼈 스캔을 단독으로 또는 조합하여 사용함에 의해 검출된다.
본 발명에 따른 애주번트 조합물 및 이를 함유하는 조성물은 종양-관련-항원 (TAA)의 포함이나 DNA 엔코딩에 의해 다양한 암 또는 암이 발생할 위험이 있는 개체를 치료하는데 이용될 수 있다. 이것은 종양 세포에서 발현된 항원이다. 이러한 암의 예로는 유방암, 전립선암, 결장암, 백혈병과 같은 혈액암, 만성 림프구 백혈병 등이 있다. 본 발명의 백신화 방법을 이용하여 종양의 성장을 억제하거나 늦추거나 종양 크기를 감소시킴에 의해 종양을 치료하기 위해 면역 반응을 자극할 수 있다. 종양 관련된 항원은 종양 세포에 의해 우세하게 발현되나 배타적이지 않은 항원일 수도 있다.
추가의 암으로는 이로 제한되는 것은 아니나 기저세포 암종, 담관암, 방광암, 뼈암, 뇌 및 중추신경계(CNS) 암, 자궁경부암, 융모막암종, 직장결장암, 결합 조직암, 소화계의 암, 자궁내막암, 식도암, 눈암, 두경부암, 위암, 상피내 신생물, 신장암, 후두암, 간암, 폐암 (소세포, 큰세포), 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종을 포함하는 림프종; 흑색종; 신경모세포종; 경구암 (예를 들어, 입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡기암; 육종; 피부암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁암; 비뇨계암; 뿐만 아니라 기타 암종 및 육종이 있다.
본 발명에 따른 애주번트 조합물 및 이를 함유하는 조성물은 또한 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 타입 1 당뇨병, 건선 또는 다른 자가면역 질병과 같은 자가면역 질환을 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 백신 및 면역 애주번트로 잠재적으로 치료될 수 있는 기타 자가면역 질환으로는 크론병 및 기타 염증성 장 질환, 예컨대 궤양결장염, 전신 홍반 루푸스(SLE), 자가면역 뇌척수염, 중증근육무력증(MG), 하시모토 갑상샘염, 굿패스쳐(Goodpasture's) 증후군, 천포창, 그레이브병, 자가면역 용혈빈혈, 자가면역 혈소판감소자색반, 항-콜라겐 항체를 지니는 피부경화증, 혼합된 결합조직병, 다발근육염, 악성빈혈, 특발 애디슨병, 자가면역 관련된 불임증, 사구체신염 (예를 들어, 반월상 사구체신염, 증식성 사구체신염), 물집 유사천포창, 쇼그렌 증후군, 건선 관절염, 인슐린 내성, 자가면역 당뇨병 (타입 1 당뇨병; 인슐린 의존성 당뇨병), 자가면역 간염, 자가면역 혈우병, 자가면역 림프증식 증후군 (ALPS), 자가면역 포도막염 및 길리안-베어 증후군(Guillain-Bare syndrome)이 있다. 최근에, 동맥경화증 및 알츠하이머병이 자가면역 질환으로서 인식되었다. 따라서, 본 발명의 이러한 구체예에서, 항원은 숙주가 조직 파괴 및 정상 세포의 손상에 기여하는 원치 않는 면역 반응을 유도하는 자가-항원일 것이다
본 발명에 따른 애주번트 조합물 및 이를 함유하는 조성물은 또한 천식 및 알레르기 및 염증 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 천식은 염증과 좁아진 기도 및 흡입된 제제에 대한 기도의 증가된 반응성을 특징으로 하는 호흡 계통의 질병이다. 천식은 배타적인 것은 아니나 아토피(atopic) 또는 알레르기 증상과 종종 관련된다. 알레르기는 물질(알레르겐)에 대한 후천적인 과민감성이다. 알레르기 질환으로는 습진, 알레르기 비염, 또는 코감기, 건초열, 기관지 천식, 두드러기, 및 음식 알레르기 및 기타 아토피 질환이 있다. 알레르겐은 민감할 수 있는 피검체에서 알레르기 또는 천식 반응을 유도할 수 있는 물질이다. 꽃가루, 곤충독, 동물 비듬, 먼지, 진균 포자, 및 약물을 포함하는 수많은 알레르겐이 존재한다.
천연 및 식물 알레르겐의 예는 하기 속들에 특이적인 단백질을 포함한다: 개, 먼지진드기, 고양이, 암브로시아(Ambrosia), 로티움(Lotium), 크립토메리아(Cryptomeria), 알테나리아(Alternaria), 알더(Alder), 알리너스(Alinus), 베툴라(Betula), 케르커스(Quercus), 올레아(Olea), 아르테미시아(Artemisia), 플란타고(Plantago), 파리에타리아(Parietaria), 블라텔라(Blatella), 아피스(Apis), 쿠프레서스(Cupressus), 쥬니퍼루스(Juniperus), 튜야(Thuya), 카마에시파리스(Chamaecyparis), 페리플래닛(Periplanet), 아고피론(Agopyron), 세케일(Secale), 트리티쿰(Triticum), 닥틸리스(Dactylis), 페스투카(Festuca), 포아(Poa), 아베나(Avena), 홀커스(Holcus), 안토크산툼(Anthoxanthum), 아르헤나테룸(Arrhenatherum), 아그로스티스(Agrostis), 플레움(Phleum), 팔라리스(Phalaris), 파스팔룸(Paspalum), 소르굼(Sorghum), 및 브로미스(Bromis).
본 발명에 따른 애주번트 조합물 및 이를 함유하는 조성물은 감염성 질환, 암 또는 자가면역 질환과 같은 특정 질환을 치료하기 위해 다른 요법과 조합될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 암의 경우, 본 발명의 방법은 화학요법 또는 방사선요법과 병용될 수 있다.
일부 경우에, 친화성 정제를 촉진시키는 부분을 애주번트에 포함하는 것이 이로울 수 있다. 이러한 부분들은 애주번트 조합물의 기능을 방해하지 않는 비교적 소형 분자를 포함한다. 대안적으로, 태그는 절단에 의해 제거될 수 있다. 이러한 태그의 예로는 폴리-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, 말타아제 결합 단백질, 렉틴, 글루타치온-S 트랜스퍼라아제, 아비딘 등이 있다. 다른 적합한 친화성 태그로는 FLAG, 그린 형광성 단백질 (GFP), myc 등이 있다.
당해 애주번트 조합물은 생리적 염수와 같은 생리학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 조성물은 완충액, 예컨대 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트 및 비카르보네이트, 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 에틸렌디아민 테트라아세트산, 염화나트륨 또는 기타 염, 리포좀, 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 등과 같은 또 다른 담체나 부형제도 포함할 수 있다. 본 발명의 애주번트는 상응하는 투여 경로에 따라 다양한 방식으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 액체 제형은 섭취 또는 주입을 위해 제조될 수 있고, 겔 또는 절차(procedures)는 섭취, 흡입 또는 국소 적용을 위해 제조될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 방법은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences," 18th Ed., Mack Publishing Company, Easton Pa]을 참조할 수 있다.
본 발명은 또한 DNA 기재 백신을 포함한다. 요망되는 항원 및/또는 CD40 애주번트를 엔코딩할 수 있는 이러한 DNA는 네이키드(naked) DNA로서 투여될 수 있거나 TLR 효능제로서 기능하는 재조합 바이러스와 같은 발현 벡터에 포함될 수 있다. 더욱이, 당해 핵산 서열은 이식편을 이식하기 전에 이식편의 세포로 도입될 수 있다. 이러한 DNA는 인간 개체에서의 발현을 촉진하기 위해 인간화되는 것이 바람직할 것이다.
당해 애주번트 조합물은 "마커" 또는 "리포터(reporter)"를 추가로 포함할 수 있다. 마커 또는 리포터 분자의 예로는 베타 락타마아제, 클로르암페니콜, 아세틸트랜스퍼라아제, 아데노신 데아미나아제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제, 디히드로폴레이트 리덕타아제, 하이그로마이신 B-포스포트랜스퍼라아제, 티미딘 키나아제, lacZ, 및 크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 등이 있다.
당해 애주번트는 항원 또는 TNF-R 효능제 및/또는 타입 1 인터페론 또는 TLR 효능제의 발현을 유도할 수 있는 벡터 또는 벡터들을 포함하는 세포, 예를 들어 벡터로 형질도입된 세포에 의해 발현될 수 있다. 예를 들어, 바쿨로바이러스 벡터를 이용할 수 있다. 이용될 수 있는 다른 벡터로는 세균에 사용하기 위한 T7 기재 벡터, 효모 발현 벡터, 포유동물 발현 벡터, 바이러스 발현 벡터 등이 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 벡터, 헤르페스 바이러스, 시미안 바이러스 40 및 소 파필로마 바이러스 벡터를 포함한다. 또한, 세균 및 효모 발현 벡터를 이용할 수 있다.
당업자는 요망되는 세포 또는 유기체에 적합한 특정 발현 시스템을 위해 발현 벡터, 프로모터, 선택가능한 마커 등을 포함하는 적합한 성분들을 용이하게 선택할 수 있다. 다양한 발현 시스템의 선택 및 사용에 대해서는 예를 들어 문헌[Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, N. Y. (1993); and Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual":, 1985 Suppl. (1987)]을 참조할 수 있다. 또한 당해 DNA 구성물을 함유하고 발현시키는 진핵 세포가 제공된다.
세포 이식체의 경우, 세포는 이식 절차에 의해서나 혈관벽을 통한 카테터-매개된 주입 절차를 이용하여 투여될 수 있다. 일부 경우에, 세포는 혈관구조로의 방출에 의해 투여될 수 있고, 후속하여 세포가 이로부터 혈류에 의해 분배되고/거나 주위 조직으로 이동한다.
TNF-R 효능제로서 CD40 효능제의 경우에, 이러한 효능제는 CD40, 바람직하게는 뮤린 또는 인간 CD40, 또는 CD40L 단백질, 유도체, 중합체, 예컨대 삼합체 CD40L 또는 4-1BB 리간드 컨주게이트에 특이적으로 결합하는 효능성 항-CD40 항체 또는 이의 단편을 바람직하게 포함할 것이다. 본원에서 사용된 "항체"라는 용어는 폴리클로날 및 모노클로날 항체 뿐만 아니라 이의 항원 결합 단편을 포함하는 가장 넓은 의미로 이용된다. 이것은 Fab, F(ab')2, Fd 및 Fv 단편을 포함한다.
이제부터 하기 실시예를 기초로 본 발명을 추가로 기술한다.
재료 및 방법
마우스 및 종양 세포주
수컷 6 내지 8-주령 C57BL/6 마우스를 내셔널 캔서 인스티튜트 (Bethesda, MD)로부터 수득하고 무-병원체 조건하에 유지하였다. 모든 실험은 인스티튜셔널 애니멀 케어 및 유즈 커미티 오브 다트마우스 컬리지에 의해 승인되었다. B16.F10 흑색종 세포는 메리 조 투르크(Mary Jo Turk) (Dartmouth-Hitchcock Medical Center, Lebanon, NH)로부터 제공된 종류이고 이를 완전 배지에서 유지하였다 (10% 우태아 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 2 mM 글루타민, 및 50 μM 2-메르캅토에탄올을 함유하는 RPMI 1640).
세포주, 항체 및 시약
CD8 (53-6.7), CD4 (GKl.5), CD44 (IM7), CD127 (A7R34), CD122 (5H4), IL-2 (JES6-5H4), IFN (XMG1.2), FoxP3 (FJK-16s), Granzyme B (16G6), 및 이소형 대조군 래트 IgG2a에 대한 마우스 모노클로날 항체 (mAb)를 브레펠딘 A 및 모넨신 둘 모두가 그랬듯이 이바이오사이언스(eBioscience, San Diego, CA)로부터 구입하였다. 항-CD107a (1D4B)를 BD 파민겐 (BD Pharmingen, San Jose, CA)으로부터 구입하였다. 항-TNF (MP6-XT22)를 인비트로겐 (Invitrogen, Carlsbad, CA)으로부터 구입하였다. 재조합 인간 IL-2를 페프로테크 (Peprotech, Rocky Hill, NJ)로부터 구입하였다. 항-CD40 (FGK45)을 바이오익스프레스 (BioExpress, Lebanon, NH)로부터 구입하였다. 정량적인 색소 리물러스 유주세포 용해물 키트 (QCL 1000; Cambrex, East Rutherford, NJ)에 의해 측정된 내독소 함량은 1 EU/mg 미만이었다. TLR7 효능제 S-27609를 3M 파마슈티칼스 (Pharmaceuticals, St Paul, MN)로부터 제공받았고 이는 전에 개시되었다. 8 항-CD4 (GKl.5), 항-CD8 (2.43), 및 항-NK1.1 (PK136)을 하이브리도마에 의해 생성하였고 생물반응기 상층액을 표준 방법을 이용하여 정제하였다. H2Kb-제한된 클래스 I 펩티드 Ova(257-264) (SIINFEKL) 및 TRP2(180-188) (SVYDFFVWL) 및 변형된 TRP2 에피토프 V (SIYDFFVWL)를 펩슈티칼스 (Pepceuticals, Nottingham, United Kingdom)로부터 구입하였고 이것은 90% 넘게 순수하였다. 펩티드를 DMSO에 5 mg/mL로 용해시키고 후속하여 면역화를 위해 포스페이트-완충된 염수(PBS)에서 희석하였다.
세포 제조
백신화 후 다양한 시점에, 조직을 분석을 위해 제거하였다. 비장을 단일 세포 현탁액으로 균질화시키고 말초혈을 안와후 출혈 또는 심장 천자를 통해 헤파린 첨가된 튜브로 수집하였다. 적혈구를 ACK 용해 완충제 (BioSource, Rockville, MD)로 용해시켰다. 전이 표적 기관으로부터 림프구를 분리하기 위해, 폐를 제거하고 417.5 ㎍/mL의 리버라아제(Liberase) CI (Roche, Indianapolis, IN) 및 200 ㎍/mL의 DNase I (Roche)를 함유하는 RPMI를 주입하고, 잘게 썰고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후 세포 여과기(strainer)를 통해 통과시켰다. 세포를 세척하고 80% Percoll에 재현탁하고, 40% Percoll를 입히고, 25분 동안 400g에서 원심분리하였다. 80%/40% 계면에 존재하는 세포를 수집하고, 세척하고, 구아바 (Guava, Guava Technologies, Hayward, CA)에 의해 계수하였다.
종양 챌린지 및 백신화
마우스에게 105개 B16.F10 흑색종 종양 세포를 정맥내로 주입하여 폐 전이를 달성하였다. 4일 후, 나이브 또는 종양-함유 마우스를 지시된 대로 100 ㎍의 V 펩티드, 100 ㎍의 항-CD40, 및 100 ㎍의 TLR7 효능제 S-27609를 조합시켜 정맥내 백신화하였다. 폐를 약 20일 후에 회수하고, 해부 현미경으로 전이를 계수하였다. 대안적으로, 이후 90일 넘게 생존하는 마우스를 모니터링하였다.
세포 서브셋의 생체내 고갈
250 ㎍의 항-CD4 (GK1.5), 항-CD8 (2.43), 및 항-NK1.l (PK136)을 복막내 투여함에 의해 림프구 서브셋의 고갈을 달성하였다. 실험을 시작하기 4일 전 및 그 이후 매주에 항체를 가하였다. 흐름세포측정에 의해 고갈을 확인하였고 이것은 95%를 초과하는 관련 세포 유형의 감소를 초래하였다.
흐름세포측정
단일 세포 현탁액을 FITC, PE, PerCP, PC5, 또는 APC로 표지된 항체와 인큐베이션하였다. "세포주, 항체 및 시약"에 열거된 대로 항체는 이바이오사이언스, BD 파민겐, 및 인비트로겐으로부터 얻었다. 변형된 벡톤 디킨슨 FACSCAN 구동 CellQuest 소프트웨어 (BD 바이오사이언스) 상에서 4-색 분석을 수행하였다.
세포내 시토킨 염색 및 탈과립화 검정
폐, 비장 또는 말초혈 (말초혈 림프구 [PBL])로부터의 세포를 1 ㎍/mL의 Ova(257-264) 또는 TRP2(180-188) 펩티드 및 10 U/mL의 IL-2 및 3 ㎍/mL 브레펠딘 A와 완전 배지에서 37℃로 5 내지 18시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PerCp 또는 PC5-표지된 항-CD8 및 FITC-표지된 항-CD44 항체로 염색한 후 고정하고, 투과될 수 있게 하고 나서 PE- 또는 APC-표지된 항-IFN (XMGl.2), PE-표지된 항-TNF (MP6-XT22), PE-표지된 항-IL-2 (JES6-5H4), FITC-표지된 항-CD127 (A7R34), 또는 PE-표지된 항-granzyme B (16G6)로 염색하였다. 무관한 펩티드 대조군으로 관찰된 백그라운드를 공제함에 의해 IFN+ 세포의 비율을 계산하였다. 탈과립화 검정에서, 세포를 상기대로 처리하였으나 초기 5 내지 18시간의 인큐베이션 기간 동안 모넨신 및 2.5 ㎍/mL의 FITC-표지된 항-CD107a (1D4B)를 포함시켰다.
생체내 세포독성 검정
앞서 기술한 대로 생체내 세포독성 활성을 실행하였다.(8) 간단히 말해, 나이브 동계 비장세포를 0.5 μM 또는 5 μM의 카르복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르 (CFSE; 분자 프로브, Eugene, OR)로 10분 동안 37℃에서 차별적으로 표지하고, 세척한 다음, 1시간 동안 20 ㎍/mL의 무관한 Ova(257-264) (SIINFEKL) 또는 항원-특이적인 TRP2(180-188) 펩티드로 각각 펄싱하였다. 표지되고 펄싱된 세포를 후속하여 1:1 비로 혼합시키고, 약 107개 세포를 정맥내 주입하였다. 1일 후, 마우스를 치사시키고, 비장세포를 흐름세포측정에 의해 분석하였다. 특이적인 용해를 먼저, 각 마우스에서 TRP2-표지된 표적의 수에 대한 SIINFEKL-표지된 표적의 수의 비를 결정함에 의해 계산하고, 이어서 항원-특이적인 용해 비율을 다음과 같이 계산하였다: 특이적인 용해% = (1 - [나이브 마우스에서 CFSElo/CFSEhi의 비÷면역된 마우스에서 CFSElo/CFSEhi의 비]) x 100.
혈청 트랜스아미나아제 및 조직 분석
혈청 간 효소 활성을 측정함에 의해 간세포 손상을 생화학적으로 평가하였다. 구체적으로, 마우스는 100 ㎍의 항-CD40, 100 ㎍의 S-27609, 또는 둘 모두를 정맥내로 투여받거나 대조군으로서 PBS를 투여받았다. 24 내지 72시간 후에 혈청을 회수하고 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 (AST)의 수준을 내셔널 쥬이시 메디컬 센터 코어 랩 (Denver, CO)의 표준 임상 검정에 의해 결정하였다. 조직 분석을 위해, 상기대로 처리된 마우스로부터의 간을 완충된 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 매몰시키고, 절개하고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색한 후 코드화하고 맹검 양상으로 0 내지 4 등급으로 점수를 매겼다. 수치 점수는 하기와 같이 지정되었다: 간: 0은 병변이나 간세포 손상이 나타나지 않은 정상 간을 나타낸다; 1, 드물게 문맥과 실질이 침윤되었으나 괴사는 없다; 2, 문맥과 실질이 적당히 침윤되었으나 괴사는 없다; 3, 때로 응고성 괴사의 분리된 섬을 지니며 빈번하고/거나 크게 문맥과 실질이 침윤되었다; 및 4, 응고성 괴사를 잇는 광범한 면적의 염증이 있다. H&E 이미지를 올림푸스 BX41 현미경 (Center Valley, PA)을 통해 올림푸스 DP11 디지털 카메라가 부착된 20x/0.05 비-오일 대물렌즈 및 1Ox 접안렌즈를 이용하여 획득하고 윈도우, 버젼 1.82.2 (Reims, France)용 XnView로 편집하였다.
통계적 분석
데이터를 평균±SEM으로 표시하였고 그룹간 차이는 달리 지시되지 않는 한 일원 ANOVA 및 Tukey 분석에 의해 분석하였다. 종양 생존 실험의 경우, 통계적 타당성을 로그-랭크(log-rank) 비교를 이용하여 결정하였다. 간염 정도를 임의의 규모로 점수매기고, 생성된 비파라메터 데이터를 만-휘트니 테스트를 이용하여 분석하였다. .05 미만의 확률(P) 값을 통계적으로 유의한 것으로 고려하였다.
실시예 1
종양 특이적인 이펙터 CD8 + T 세포의 높은 빈도가 CD40 / TLR7 효능제 및 종양-특이적인 펩티드를 이용하여 유도된다
본 발명자들은 이전에 CD40 및 TLR 효능제의 공동투여가 외래 항원에 대한 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 증식을 상승적으로 개선시킴을 입증하였다.(8) 여기에서 본 발명자들은 유사하게 높은 빈도의 CD8+ T 세포가 자가-항원으로 유도될 수 있음을 추가로 나타낸다. 최근, V (SIYDFFVWL)라 명명된 H2Kb-제한된 흑색종 거부 자가-항원 TRP2(180-188)의 변형된 펩티드 변이체가 고-친화성 TRP2-특이적인 CD8+ T 세포를 유도하는 것으로 나타났다.(17) 본 발명자들은 V 및 효능성 CD40 항체 (CD40)와 TLR7 효능제 (TLR7*)를 이용한 면역화가 결과로서 일어나는 CD8+ 반응을 확대시키고 증가된 이펙터 세포 기능을 야기시킬 것으로 추론한다. 도 1B에 도시된 대로, CD40은 항원, TLR7 효능제, 또는 둘 모두 (V 단독과 비교하여 V/CD40, V/CD40/TLR7*, 및 CD40/TLR7*에 대해 P.001)와 무관하게, 면역된 마우스의 말초혈에서 CD8+ T 세포의 상대적인 수를 증가시켰다. CD40은 폴리클로날 CD8+ 반응을 증가시켰으나, TRP2-특이적인 CD8+ T 세포의 실질적인 집단을 생성하는 데에는 실패하였다 (도 1A,C). 종양 항원, CD40, 및 TLR7 효능제의 조합물만이 TRP2-특이적인 T 세포의 상승적인 증식을 초래하였다. 세포용해 가능성을 측정하기 위해, 본 발명자들은 세포 표면 상에서 CD107a (리소솜-관련 막 단백질-1)의 정체에 의해 측정될 수 있는, 탈과립화시키는 이들 세포의 능력을 측정하였다.(18) CD107a의 세포-표면 발현은 세포용해 활성과 직접 관련된다.(19,20) CD40 또는 TLR7 효능제 단독의 그룹에서 각각 약 4% 및 약 2%의 CD8+ 세포만이 CD107a를 발현시켰다. 그러나, CD40 및 TLR7 효능제 둘 모두로 프라이밍된 CD8+ 세포 중 30%를 초과하는 세포가 이러한 측정에 의해 세포용해 활성을 나타내었다 (V 단독에 비해 P.001). 조합 치료는 또한 생체내 세포독성 검정에서 펩티드-펄싱된 표적의 증가된 용해를 초래하였다 (데이터는 제시되지 않음). 더불어, 이러한 데이터는 CD40 및 TLR7 효능제의 조합이 세포용해 기능을 지니는 높은 빈도 및 높은 총 수의 자가-반응성 CD8+ T 세포를 유도함을 입증한다.
실시예 2
CD40 및 TLR7 을 통한 동반 신호전달은 개선된 세포용해 활성을 지니는 자가-항원-특이적인 CD8 + T 세포의 증식을 초래한다.
C57BL/6 마우스를 지시된 대로 100 ㎍의 종양-관련 항원 V, 100 ㎍의 CD40 FGK45, 및 100 ㎍의 S-27609의 조합물로 정맥내 면역시켰다. 7일 후, 마우스를 방혈시키고 세포를 TRP2(180-188)로 재자극하여, "방법"에 개시된 대로 IFN을 생성하고 CD107을 전위시키는 능력을 평가하였다. 림프구를 전방 및 측방 산란에 의해 확인하고 이어서 모든 CD8+ 이벤트 위에 게이팅하였다. (A) 백신화된 마우스로부터의 대표적인 도트 플롯. 오른쪽 위 코너에 있는 숫자는 IFN과 CD44 (상부 열) 또는 IFN과 CD107a (하부 열)에 대해 포지티브인 CD8+ T 세포의 빈도를 나타낸다. (B) CD8 항원을 발현시키는 말초혈 림프구의 비율. 일원 ANOVA에 의한 P.001. (C) 펩티드 재자극에 반응하여 탈과립화된 CD8+ 세포의 비율 정량. 모든 경우에, 제시된 데이터는 적어도 3회의 독립적인 실험을 대표한다. 데이터를 평균±SEM (각 그룹에서 n=8)으로서 플롯팅한다. 일원 ANOVA에 의한 P.001.
실시예 3
CD40 / TLR7 * 백신화는 효능 있는 CD8 + T-세포 기억을 유도한다.
본 발명자들은 CD40 및 TLR 효능제의 공동투여가 효능성 CD40-기재 단일요법의 해로운 효과를 파기하여 장기간 기억을 초래할 것으로 가정하였다. 종양 항원과 함께 CD40 및 TLR7 효능제의 동반 전달이 CD8+ T-세포 기억을 유도하는지를 측정하기 위해, 본 발명자들은 마우스를 백신화하고 60+일 후에 이펙터 기능을 분석하였다. V 및 CD40으로의 백신화는 제한된 세포용해 가능성을 지니는 폐에서 최소의, 계속되는 CD8+ 이펙터 집단을 프라이밍하였다 (도 2A, B, D). TLR7 단일요법은 계속되는 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 현저한 풀을 유도하는데 실패하였다. 대조적으로, 종양 항원, CD40, 및 TLR7 효능제로의 백신화는 비장 및 폐 둘 모두에 있는 이펙터 세포를 프리이밍하였다 (도 2A, C, D). 보다 중요하게는, CD40 또는 TLR7* 단일요법과 달리, 이러한 섭생으로 백신화된 마우스는 생체내 세포독성 검정시에 펩티드-펄싱된 표적을 효과적으로 용해시켰다 (도 2B, E; V 또는 V/CD40에 비해 P.001). 또한, IFN 염색의 표준 형광성 강도는 CD40 처리로만 보여진 것에 비해 증가되었는데 (비장: 185 ± 30 vs 310 ± 22, P =.0041; 폐: 152 ± 6 vs 253 ± 25, P=.0028), 이는 CD40/TLR7*에 의해 프라이밍된 CD8+ T 세포가 이펙터 시토킨을 생성하는데 보다 효율적임을 입증한다. 마지막으로, 단지 CD40/TLR7* 및 종양 항원은 자가면역 백반증을 유도할 수 있었고, 그 반응은 백신화된 마우스의 약 36%에서 나타났다 (데이터는 제시되지 않음). TRP2-특이적인 기억 T-세포 집단의 확인을 보장하기 위해, 본 발명자들은 이펙터 세포가 기억 세포로 분화될 때 선택적으로 재발현되는 것으로 밝혀진 마커인, CD127 (IL-7R)의 발현에 대해 CD8+ T 세포를 조사하였다.(21) 실제로, 비장과 폐에서 분리된 TRP2-특이적인 CD8+ T 세포가 CD127을 발현시켰다 (도 2F). 세포는 CD127을 발현시킬 뿐만 아니라 충분히 기능성인 채로 남아 있어서 TNF 및 IL-2 둘 모두를 생성할 수 있다. 폐와 비장에서 발견된 IFN+ 세포 중 70%를 초과하는 세포가 TNF를 분비하는 한편 20%를 초과하는 세포가 IL-2를 분비하였다 (도 2G). 더욱이, 이러한 세포들의 분획이 IL-2를 분비하고 CD127을 발현시키는 능력을 획득하였기 때문에, 이는 이러한 백신화 섭생이 이펙터 및 중추 기억 표현형 둘 모두의 기억 세포를 생성하는 것을 나타낸다.(22)
실시예 4
CD40 단일요법과 대조적으로, CD40 / TLR7 * 요법은 CD8 + 기억 T-세포 기능을 보호한다.
마우스를 지시된 대로 각각 100 ㎍의 V 펩티드, CD40, 및 S-27609의 조합물로 면역시켰다. 기억 CD8+ 기능성을 65일 후에 평가하였다. (A) 백신화된 마우스의 비장과 폐로부터 분리된 기억 CD8+ T 세포에 의한 IFN 분비의 대표적인 도트 플롯. 도트 플롯을 살아 있는 CD8+ 세포 상에 게이팅였고, 수치는 IFN 및 CD44 돌 모두에 포지티브인 세포의 비율을 나타낸다. (B) 기억 CD8+ T-세포 세포용해 활성을 생체내 세포독성 검정을 수행함에 의해 평가하였다. 수치는 항원-특이적인 용해의 비율을 반영한다.(C,D) 비장(C) 및 폐(D)에서 IFN을 발현시키는 기억 CD8+ 세포의 상대값 및 절대값의 정량. 각 세포 집단의 상대 비율에 각 조직으로부터 분리된 세포의 총 수를 곱함에 의해 포지티브 세포의 절대값을 결정하였다. (E) 패널 B에서 제시된 생체내 세포독성 검정의 정량. 일원 ANOVA에 의한 P.001. (F) 백신화된 마우스의 비장 또는 폐로부터 유래된 IFN+-기억 CD8+ T 세포 상에서 CD127 발현. 이소형 대조군을 색칠된 막대그래프로 나타낸다. (G) 기억 CD8+ T 세포에 의한 시토킨 생성. 패널 F로부터의 세포를 TNF 및 IL-2를 생성하는 능력에 대해 분석하였다. 수치는 역시 TNF 또는 IL-2에 포지티브인 CD8+IFN+ 세포의 비율을 반영한다. 모든 경우에, 데이터는 실험 당 한 그룹에 대해 4마리 이상의 마우스를 이용한 적어도 2회의 독립적인 실험으로부터 공동으로 계산되고 평균 (±SEM)으로서 플롯팅된다.
실시예 5
전이 흑색종의 조절에 있어서 단일요법에 비해 CD40 / TLR7 * 면역요법의 우수한 치료적 효능.
전이 흑색종의 진행을 변화시키기 위한 상이한 백신화 전략의 능력을 비교하였다. 마우스에게 105개 전이 B16.F10 흑색종 세포를 정맥내 접종하고 4일 후에 치료를 개시하였다. 백신화 24일 후에, 마우스를 치사시키고, 표면 폐 전이를 계수하였다. 종양 항원 또는 종양 항원과 TLR7 효능제로의 치료는 종양 진행을 제어함에 있어서 효과적이지 않았다 (도 3A, B). 종양 항원과 CD40으로의 면역화는 종양 결절의 수를 감소시켰다 (P.001 vs V 단독). 그러나, 이 백신에 TLR7 효능제를 첨가하는 것은 CD40 단독에 비해 전이의 수를 3배 감소시켰다 (도 3B; P.01 vs V/CD40). 더욱이, CD40/TLR7*에 의해 제공된 보호는 항원에 의존적인데, 그 이유는 H2Kb 펩티드, V의 제거가 치료의 효과를 파기시키기 때문이다 (도 3A, B). 이 보호는 동일한 효능이 TLR3 및 TLR9 효능제에서 관찰됨에 따라 TLR7 효능제에 유일한 것은 아니다 (데이터는 제시되지 않음). 또한, 백신화 경로의 변경이 치료 결과를 현저하지 변화시키지 않았다 (도 Sl, Blood 웹사이트에서 이용할 수 있음; 온라인 조항의 상부에 서플리멘탈 머티리얼스 링크 참조). CD40/TLR7* 백신화가 폐 전이의 수를 감소시켰기 때문에, 본 발명자들은 조합 면역요법이 전이성 질병에 대해 장기간 보호를 제공할지에 의문이 생겼다. 종양 항원, 종양 항원과 TLR7 효능제, 또는 종양 항원 없이 CD40/TLR7 효능제로 백신화된 모든 마우스가 폐 실패에 굴복하였다 (도 3A). 평균 생존 시간은 각각 29일, 30일 및 30일이었다. CD40 단일요법은 35일의 평균 생존 시간을 지니며 종양 항원 단독에 비해 생존 시간을 현저하게 증가시켰고 (P.001) 이것은 마우스의 3%가 90일 넘게 생존하게 하였다. 그러나, 종양 항원과 CD40/TLR7*의 조합은 CD40 단독에 비해 생존을 크게 개선시켰다 (P.001). 마우스의 20%가 90일 후에 생존하면서, 평균 생존 기간은 35일에서 47일로 증가되었다 (또한 도 S2의 카플란-메이어 플롯 참조). 세포 서브셋이 이러한 백신화 섭생하에 전이 흑색종의 거부를 매개하는지를 측정하기 위해, 종양 챌린지 이전에 마우스에서 CD8+, CD4+, 및 NK1.1+ 세포를 고갈시켰다. CD8+ T 세포의 고갈은 백신화의 보호 효과를 파기시켰다 (도 3C; 고갈시키지 않은 백신화에 비해 P=.001). CD4+ 및 NK1.1+ 세포는 종양 보호에서 일부 임무를 수행하는데, 이들의 고갈이 비록 현저하진 않더라도 다소 더 빠른 종양 진행을 야기하였기 때문이다 (도 3C). 이러한 데이터는 항원의 존재하에 조합된 면역요법을 이용한 백신화가 CD40- 또는 TLR-기재 단일요법에서 보여진 것보다 큰 항종양 반응을 매개할 수 있는 CD8+ T 세포-의존적인 면역 반응을 초래함을 나타낸다.
실시예 6
CD40 / TLR7 *의 치료적 개입은 전이 흑색종의 진행을 늦춘다.
C57BL/6 마우스를 105개 전이 B16.F10 흑색종 세포로 정맥내 챌린지하였다. 4일 후, 마우스를 지시된 대로 100 ㎍의 종양-관련 항원 V, 100 ㎍의 CD40 FGK45, 및 100 ㎍의 S-27609의 조합물로 백신화하였다. 24일 후, 마우스를 치사시키고, 폐를 제거하고, 전이 표면 종양 결절을 해부 현미경의 도움으로 계수하였다. (A)종양 챌린지 24일 후 마우스의 폐 상에서 육안으로 보이는 가시적인 종양 결절의 사진. 폐 아래에 있는 숫자는 치료 효능에 대해 모니터링된 마우스의 평균 생존 시간 및 장기간 생존율을 반영한다. 데이터는 각 실험에서 그룹 당 8마리가 넘는 마우스를 이용한 3 내지 4회의 독립적인 실험으로부터 공동 계산된다. (B) 폐 전이의 계수. 데이터는 2회의 독립적인 실험으로부터 공동 계산되고 평균±SEM (각 그룹에서 n = 16마리 마우스)으로 제시된다. 데이터는 각 그룹에서 적어도 6마리의 마우스를 이용한 4회가 넘는 별개의 실험들을 대표한다. (C) 이펙터 세포 고갈 후 폐 전이의 계수. "방법"에 개시된 대로 종양 챌린지 이전에 이펙터 세포 집단의 고갈 말고는 마우스를 상기대로 처리하였다. 데이터는 평균±SEM (각 그룹에서 n = 8마리 마우스)으로 표시되고 3회의 독립적인 실험들을 대표한다.
실시예 7
CD40 / TLR7 * 면역요법에 따른 세포용해 가능성을 지닌 폐 침윤물의 증대
CD40/TLR7* 면역요법이 왜 더 양호한 항종양 면역성을 매개하는지를 알기 위해, 본 발명자들은 종양 챌린지 10일 및 21일 후에 폐 침윤물의 동력학 분석을 수행하였다 (도 4A). 종양-함유 폐로부터 분리된 림프구를 생체외 펩티드 재자극 후에 세포내 시토킨 염색하였다. 단지 종양 항원 및 CD40 또는 CD40/TLR7* 백신화는 종양-특이적인 CD8+ T 세포를 프라이밍시켜 전이 표적 기관으로 이동시켰다 (도 4B). V/CD40/TLR7* 백신화된 마우스의 흐름세포측정 분석은 CD40 단일요법에 비해 종양-특이적인 CD8+ T 세포의 상대적인 비율에 있어서 10일에 5배 증가를 나타내었고 21일에 3배 증가를 나타내었다. 절대 눈금(absolute scale) 상에서, CD40은 TLR 자극과 무관하게 백신화된 마우스의 폐로의 폴리클로날 T 세포의 이동을 유도하나, 이 반응은 시간에 따라 약해진다 (도 4C, D). 대조적으로, 항원-특이적인 세포는 CD40/TLR7*이 두 시점 모두에서 더 큰 절대 반응을 유도함에 따라, 여전히 상승한다 (두 시점 모두에서 V/CD40/TLR7* 및 V/CD40간에 P.OOl). 더욱이, CD40/TLR7* 백신화에 의해 생성된 세포는 탈과립화 및 Granzyme B 발현에 의해 측정된 세포용해 가능성을 나타내었다 (도 4E).
실시예 8
폐-침윤성 림프구의 동력학 분석
본 실시예는 도 4의 실험에 관한 것이다. 도 4(A)에 실험 설계가 제시되어 있고, 도 4(B)는 종양 챌린지 후 10일 또는 21일에 전이 표적 기관으로부터 분리된 림프구의 대표적인 도트 플롯을 함유한다. 세포를 "방법"에 개시된 대로 종양-함유 폐로부터 분리하고 종양 펩티드로 시험관내에서 재자극하였다. 플롯을 살아있는 CD8+ 세포 상에 게이팅하였다. 사분면의 오른쪽 위에 있는 숫자는 IFN 및 활성화 마커 CD44 둘 모두에 대해 포지티브인 CD8+ T 세포의 빈도를 반영한다. 데이터는 각 실험에서 그룹 당 4마리의 마우스를 이용한 3회의 독립적인 실험을 대표한다.(C,D) 종양 챌린지 후 10일 (C) 또는 21일 (D)에 폐 침윤물의 정량. 데이터는 평균(±SEM)으로 플롯팅되며 각 실험에서 그룹 당 4마리의 마우스를 이용한 2회 (C, n=8마리 마우스/그룹) 또는 3회 (D, n=12마리 마우스/그룹)의 독립적인 실험으로부터 공동 계산된 데이터를 나타낸다. 종양을 접종한 지 10일 또는 21일 후에 종양 항원 및 CD40/TLR7*로 백신접종된 마우스의 폐로부터 분리된 CD8+ T 세포의 이펙터 표현형. 도트 플롯을 먼저 살아 있는 CD8+ 세포 상에 게이팅한 다음 추가로 IFN+CD44+ 집단 상에 게이팅하였다. 데이터는 각 실험에서 그룹 당 4마리의 마우스를 이용한 적어도 2회의 독립적인 실험을 대표한다.
실시예 9
백신 효능은 조절 T 세포의 효과를 이겨내야 하고, CD8+/FoxP3+ 세포의 비를 프라이밍 강도를 평가하는데 이용하였다.(23) 10일에, 조합 요법은 FoxP3+ 세포에 비해 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 절대 수치에 있어서 10개 증가를 초래한 반면, CD40 단일요법은 3배 증가를 야기하였다 (도 4C). 본 발명자들은 FoxP3<-> "src="/math/rarr.gif" border=0 FoxP3+ T 세포의 전환에 있어서의 최적의 감소가 CD40 및 TLR 효능제 둘 모두를 이용한 DC의 성숙을 요구함을 증명하였다. 이러한 데이터는, 조합 면역요법이 증가된 항종양 면역성을 매개하는 한 가지 방식이 면역억제의 효과를 감소시키면서 CD8+ T 세포 수 및 이펙터 기능을 증폭시킴에 의해서라는 가설을 뒷받침한다.
실시예 10
CD40 -유도된 간세포 손상이 TLR7 효능제의 공동투여에 의해 감소된다 .
CD40 단일요법의 사용과 관련된 현저한 용량-제한적인 안전성 중 하나는 간-독성이다. CD40 효능제를 이용한 몇몇 인간 (24) 및 동물 (24)/l "B25"/1 "B26" (27) 연구는 간 손상을 나타내는, 순환하는 간세포 효소 ALT 및 AST의 상승된 수준을 보고한다. 단일요법 대 조합 요법의 간세포 손상의 경중도를 조사하기 위해, 본 발명자들은 백신화 후 마우스에서 ALT 및 AST의 혈장 수준을 측정하였다 (도 5A, B). 두 트랜스아미나아제 모두는 CD40으로 치료한 마우스에서 치료한 지 48시간 후에 최고점에 도달하며 현저하게 증가되었다. TLR7*은 효소 수준에 아무런 영향을 미치지 않았다. CD40 단일요법과 대조적으로, CD40/TLR7* 치료는 CD40 단독에서 보여진 독성을 완전히 개선시켰다. 간의 현미경 검사는 CD40으로 치료된 마우스에서만 관찰되는 소견인 실질적인 괴사 면적을 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음). 조직 분석으로 간세포 손상의 경중도를 확인하였다 (도 5C-F). 정상 간 구조가 PBS로 처리된 마우스에서 보여진다 (도 5C). CD40으로 처리된 마우스로부터 분리된 간은 만연된 연결 응고성 괴사를 나타낸 반면 (도 5D), TLR7* 치료는 임의의 관찰할 수 있는 응고성 괴사 없이 극미한 염증을 초래하였다 (도 5E). CD40/TLR7*을 투여받은 마우스로부터의 간은 염증의 일부 병소를 지니나 응고성 괴사는 거의 또는 전혀 없다 (도 5F). 후속하여 조직 손상의 정도를 반(semi)정량 점수로 매겼다 (도 5G). 이 데이터는 TLR7*이 CD40 단일요법과 관련된 간 독성을 현저하게 감소시킴을 나타내었다 (P=.026). 비록 TLR7*이 CD40-유도된 독성을 어떻게 감약시켰는지는 명확하지 않지만, 본 발명자들은 독성에서의 이러한 전도가 TLR7 의존적임을 밝혔는데, 그 이유는 MyD88 KO 및 TLR7 KO 마우스 둘 모두가 CD40 또는 CD40/TLR7*으로 처리될 때 유사한 ALT 및 AST 효소 수준을 지녔기 때문이다 (데이터는 제시되지 않음). 마지막으로, 독성을 전도시키는데 있어서 CD40/TLR7* 조합 요법에 대한 분자 및 세포 메커니즘이 여전히 명확하지 않고 추가의 연구를 요구하지만, 그럼에도 불구하고 상기 요법은 양호한 치료적 결과를 제공할 뿐만 아니라 부작용을 최소화한다.
실시예 11
CD40 단일요법과 관련된 간 독성은 TLR7 효능에 의해 전도된다.
본 실시예는 도 5의 실험에 관한 것이다. 도 5(A, B)는 혈청 트랜스아미나아제의 동력학 분석을 포함한다. 마우스를 PBS, 100 ㎍의 CD40, 100 ㎍의 TLR7*, 또는 둘 모두로 정맥내 처리하였다. 혈청을 이후 다양한 시점에 분리하고, 알라닌 트랜스아미나아제 (A) 또는 아스파르테이트 트랜스아미나아제 (B)의 혈청 수준을 개시된 대로 측정하였다. 데이터는 시점 당 한 그룹에 대해 n=3 내지 8마리의 마우스를 이용한 3회의 독립적인 실험을 대표한다. (C-F) PBS (C), 100 ㎍의 CD40 (D), 100 ㎍의 TLR7* (E), 또는 100 ㎍의 CD40 및 100 ㎍의 TLR7* (F)로 48시간 동안 처리된 간의 조직 분석. (G) 상기대로 48시간 동안 처리된 마우스로부터의 간에서 조직병리학적 변화의 반정량적 평가. 데이터는 각 처리 그룹에서 n=6마리의 마우스를 이용한 2회의 독립적인 실험으로부터 공동 계산된다. 만-휘트니 비파라메터 테스트에 의한 P=.026.
실시예 12
TLR 효능제 또는 IFNa 와 CD40 효능제의 공동-투여에 의한 간 독성의 경감.
본 실시예는 도 6 및 7의 실험에 관한 것이다. 여기서 간세포 손상을 간 효소 활성을 측정함에 의해 생화학적으로 평가하였다. 구체적으로 마우스는 100 mg의 항-CD40, 100 mg의 S-27609 또는 둘 모두를 IV 수용하였다. 일부 경우에, 마우스는 다단계 용량의 재조합 인터페론 알파도 수용하였다 (보통은, 마우스 당 일백만 인터내셔널 유닛). 혈청을 24-72시간 후에 회수하여 간 화학 프로필 분석을 위해 찰스 리버 래버러토리스 (Worcester, MA)에 보냈다. 대안적으로, 혈청 샘플을 내셔널 쥬이시 메디컬 센터 코어 랩 (Denver, CO)에 의해 분석하였다.
결론
지난 10년간 암 표적 항원의 확인에 있어서의 급격한 성장이 목격되었으나, 이러한 표적에 대해 효과적으로 면역성을 부여하는 인간 애주번트의 개발에 대한 유사한 행보는 뒤처져왔다. Toll-유사 수용체 및 이들의 리간드, 및 적응 면역성을 조절하는 수용체-리간드의 분자 확인은 암에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위해 분자적으로 애주번트를 조합시키는 최초의 논리적인 가설-기재 전략을 제공하였다. 선천 면역 반응을 동원하는데 있어서 TLR의 중요성과 동시에, CD40 및 이의 리간드는 적응 면역 반응의 개발에 주요한 활성화제이다. 본원의 데이터는 CD40에 대한 효능제의 사용과 조합된, 특이적 TLR를 활성화시키는 잘-정의된 효능제의 이용이, 가장 효능 있는 바이러스 벡터로 보여지며 추가로 간 독성을 감소시키거나 제거함을 충족하거나 초과하는 정의된 펩티드에 대한 충분한 세포-매개된 면역 반응을 유도함을 나타낸다. 이러한 관찰에 기초하여, 본 발명자들은 상기 CD40/TLR 플랫폼을 이용하였고 이것은 흑색종의 치료에 치료적으로 효과적일 수 있는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 이러한 두 효능제가 표적으로서 가지돌기 세포(DC) 상에 충돌하고, 유일하게 DC가 충분한 CMI 반응을 유도할 수 있게 하는 기능적인 특징을 유도한다는 가설을 세웠다. 본 발명자들은 이러한 DC가 CMI를 유도함에 있어서 왜 그토록 효과적인지는 충분히 이해하지 못했으나, TLR* 및 □CD40에 의해 촉발된 DC의 분자 서명(signature)이 생체내 어느 한 제제로 촉발된 DC와 구별됨을 지적한다.
아마도 암을 이겨내기 위한 전략에 있어서 가장 약한 측면 중 하나는 암-관련 항원에 대해 강건하고 길게 지속되는 면역성을 유도할 수 있는 애주번트의 부족이다. 과거에 본 발명자들은 염증을 유도하는 것으로 보이는 제제의 이용에 의존해 왔다. 알룸(alum)은 수산화알루미늄 및 포스페이트의 염이고 주로 체액-매개된 면역 반응을 유도한다. 이러한 애주번트는 1926년에 처음 사용되었고 FDA가 1938년에 최초로 약물 허가 권한을 받았을 때 새 규칙의 적용에서 유효하게 제외되었다. 알룸은 유일한 FDA 승인된 애주번트이며, 파상풍 톡소이드와 같은 현재 이용되는 다수의 백신 중의 성분이다. 바실 칼메트-구에린(Bacille Calmette-Guerin) (BCG), 키홀 림펫 헤오시아닌(keyhole limpet hemocyanin) (KLH), 불완전 프로인트 애주번트(incomplete Freund's adjuvant) (IFA)와 같이 암 임상 실험에 적용되어온 많은 다른 애주번트 (비-시토킨)가 존재하며, 이들 모두는 충분하게 이해되지 못한 작용 메커니즘 및 온당한 애주번트 활성을 지닌다. 면역 애주번트에 대한 수용체 (toll-유사 수용체)를 밝히는 최초의 연구가 수면 위로 떠오른 1999년이 되어서야 어떻게 이러한 "비-특이적인" 면역 시스템의 활성화제가 선천 면역성을 촉발시키는지에 대한 분자적 이해가 이루어졌다.
TLR은 조혈 및 비-조혈 세포 상에 발현되는 타입 1 막 단백질이다. 현재, TLR 패밀리에는 11개의 구성원이 있다. 이러한 수용체는 병원성 유기체에 의해 발현되는 병원체-관련 분자 패턴(PAMP)를 인식하는 이들의 용량을 특징으로 한다. 통상적인 PAMP는 하기 표 I에 상세하게 개시된 대로 LPS, DNA (CpG), 지단백질, ssRNA, 및 당지질을 포함한다. TLR2 및 TLR4가 열 쇼크 단백질 패밀리 hsp60 및 hsp70의 구성원을 포함하는 여러 자가-단백질을 인식할 수 있다고 보고되었으나, TLR에 대한 진정한 내인성 리간드가 존재하는지는 여전히 논쟁의 여지가 있다.
일반적으로, TLR을 촉발시키는 것은 개선된 시토킨 생성 (IL12, IL18 등), 케모킨 수용체 발현 (CCR2, CCR5 및 CCR7), 및 공동자극 분자 발현을 통해 충분한 염증 반응을 유도한다. 이와 같이, 선천 면역 시스템에서 이러한 수용체들은 계속되는 후천성 면역 반응의 극성(polarity)에 대해 제어를 발휘한다.
CD40 (CD40L, gp39)에 대한 리간드인 CD154는 TNF-α, 림포톡신, FasL, CD30L, CD27L, 4-1BBL, 및 OX-40L을 포함하는 종양 괴사 인자 패밀리의 32-39 kD 구성원이다. 활성화된 CD4 T-세포는 CD154 발현을 책임지는 유력한 세포 유형이다. CD8+ T-세포, 호산구, 비만 세포 및 호염구, NK 세포 및 DC 상에 있는 CD154의 발현도 개시되었다. CD154에 대한 수용체인 CD40은 TNF-RI (p55), TNF-RII (p75), p75 뉴트로핀 수용체, fas, CD30, CD27, 4-1BB, 및 OX-40을 포함하는 종양 괴사 인자 수용체 (TNF-R) 슈퍼패밀리의 구성원이다. 이것은 조직 분포가 원래 B 세포, DC (DC's) 및 기저 상피 세포에 제한된 것으로 고려된 50-kDa 막 단백질이나, 이후 연구는 단핵구/매크로파지, 미세아교 세포 및 내피 세포 상에서 CD40의 기능적인 발현을 밝혀내었다.
분리된 DC 상에서의 시험관내 연구는 CD40 촉발이 시토킨 (IL12, IL15), 케모킨 (IPlO, MIP-1알파 MIP-1베타 및 IL-8), 공동-자극 분자 발현 (CD80, CD86) 및 케모킨 수용체의 발현을 변경시킴을 나타내었다. 이러한 모든 효과는 개선된 T 세포 증식 및 분화를 자극하기 위한 CD40-활성화된 DC의 능력에 정점을 이룬다. 본 발명자들의 자체 데이터는 CD154가 TNF□ 및 RANKL에 비해 조기 신호전달, 시토킨 생성 및 케모킨 생성에 대해 보다 더욱 충분한 효과를 발휘함을 나타낸다. DC의 CD40 촉발의 한 다른 임상적 영향은 펩티드-MHCII의 턴오버(turnover)에서의 변화이다. 란자벡시아(Lanzavecchia)는 LPS를 이용하는 것으로 나타났고 본 발명자들은 sCD154를 이용하여 CD40 효능제를 이용한 DC의 성숙이 DC의 표면 상에서 MHCII-펩티드 복합체의 축적을 촉진함을 입증하였다. 본 발명자들의 실험실 등으로부터의 연구는 CD40이 생체내 DC에 대한 중요한 수명 신호로 여겨짐을 지적한다. 본 발명자들은 DC 수명이 CD4+ T 세포 반응의 장기 클로날 팽창에 필수적이라고 가정하였다. 본 발명자들은 DC 수명에 대한 CD40 신호전달의 영향이, TLR 및 CD40 효능제를 조합하여 사용할 때 관찰되고 하기 논의될 상승작용의 중요한 특징임을 깨달았다. 요약해 보면, CD40 효능제가 시험관내 및 생체내에서 DC의 깊은 생물학적 변화를 유도함이 분명하다. 그러나, 본 발명자들은 효과적인 CMI 반응을 확실히 촉발시키는 것으로 DC를 "라이센싱"하기에 이러한 변화는 뒷받침되지 않고, 무력하며 불충분하다고 가정하였다.
CD4+ T 세포의 부재하에 CMI를 유도하는 CD40 효능제의 성과는 암 백신용 애주번트로서 CD40 효능제를 이용하기 위한 실질적인 의욕을 발생시켰다. 글레니 및 공동-연구자들에 의한 일련의 연구는 □CD40을 이용하여 CD40+ 림프종의 종양 억제를 달성할 수 있음을 나타내었으나, CD40 효능제의 용량이 너무 높았고 (250 ㎍/day, 2-5일), 이상하게도 면역화에 요구되는 종양 접종물이 매우 많았다 (5xl07/마우스). 그럼에도 불구하고, 이러한 CD40+ 림프종의 임상적 완화는 인상적이었다. 덜 인상적인 것은 CD40-이었던 조혈 종양에 대한 연구였다. CD40+ 림프종 및 백혈병에서의 성공은 종양에 대한 CD40 효능제의 직접적인 효과 때문인 것 같았다. 림프종 및 백혈병의 경우, □CD40은 이들의 APC 활성과, 동시에 이들의 아폽토시스도 개선시킬 수 있다. 그러나 이들 동일 그룹에 대한 후속 연구는 CD40 효능제가 고형 종양에 유리한 치료적 효과를 발휘할 수 있었음을 입증하였다. 고형 종양에서, 다수의 연구는 CD40 활성화가 아폽토틱 치사를 촉진하고 CD40 발현이 종양 세포 제거에 기여하는 종양-특이적인 T-세포 반응의 발생에서 중요한 인자임을 입증하였다. 멜리프(Melief)와 공동-연구자들과 같은 다른 그룹은 CD40 효능제나 TLR 효능제가 단독으로 생체내 (CD40-)종양을 발현시키는 Ad5E1A 상에서 효과적인 치료를 유도할 수 있었음을 나타내었다 (종양 유형은 제시되지 않음). 머피(Murphy)와 공동-연구자들은 신장 세포 암종 모델을 이용하여, 단지 효능제 □CD40 및 IL-2의 조합물만이 치료된 마우스의 대다수에서 후속하는 재챌린지에 특이적인 면역성 및 전이 종양의 완전한 억제를 유도하였으나, 단독으로 투여된 제제는 그렇지 않았음을 밝혀내었다. 이 시점에 CD40 효능제 단독의 효능은 예측될 수 없다. 종양 상에서 CD40의 발현이 중요한지, 부과된 종양이 중요한지, CD40 단독으로 충분한지 및 액체 또는 고형 종양에서 □CD40 요법의 효능에 분명한 차이가 있는지는 명확하지 않다. 본 발명자들은 TLR 효능제와 함께 이용할 때, CD40 효능제는 높은 수준의 종양-특이적인 면역성을 유도하고 □CD40 단일요법을 이용한 상이한 종양 모델에서 보여진 특이체질을 회피할 것임을 주장할 것이다.
CD40은 종양 보호를 위해 증대된 CMI 반응을 유도하는 타당한 표적이나 문헌상의 데이터는 이것이 광범한 범위의 종양에 적용될 수 없음을 시사하였다. 본 발명자들의 연구소는 □CD40을 단일요법으로서 이용하여 보호 종양 면역성을 개선시키는 일반적인 방법을 개발하고자 다년간 집중적으로 노력하였으나 실패하였다. 항체의 용량, 타이밍, 접종 경로, 종양 유형, 상이한 mab 등의 임의의 모든 파라메터를 이미 광범하게 시험하였으나, 글레니에 의해 보고된 B 림프종 및 백혈병 모델을 제외하고, 이들의 노력은 무익한 것으로 밝혀졌다. 케들(Kedl)과 공동-연구자들의 최근 연구는 CD40 효능제를 사용할 때 보호 CTL의 생성에 영향을 줄 수 있는 중요한 파라메터들 중 일부에 대한 많은 견해를 제공하였다. SIINFYKL-특이적인 CTL, 및 OVA-형질도입된 B16에 대한 사합체 염색을 이용하여, 이들은 □CD40 효능제가 실제로 SIINFYKL-특이적인 CTL의 손실을 가속시켰음 을 밝혀내었다. 그러나, 면역화가 SIINFYKL 미니겐을 지니는 백시니아 바이러스로 수행된 경우, 개선된 CTL 팽창이 □CD40 효능제를 이용하여 관찰되었다. 종양 항원에 대한 장기간 면역화는 만약 이러한 종양 항원이 바이러스 벡터 또는 염증과 관련하여 전달되는 경우 CD40 효능제에 의해서만 개선된다고 판단되었다. 따라서, 무수한 종양 모델의 결과물에서의 큰 차이는 □CD40 효능제와 상승작용하는 공동-염증 매개체의 우연한 첨가에 의해서일 수 있다.
이러한 생체내 연구는 CD40 효능제에 의한 DC의 활성화를 위해 공동-신호의 요건에 대한 다수의 최근 보고서들을 산출하였다. 공개된 연구들뿐만 아니라 예비 데이터 섹션에서 제시된 것들은 CD40 진입기전(engagement)만으로는 시험관내 및 생체내에서 DC에 의한 IL12p70 생성을 유도하기에 충분하지 않음을 보여준다. p40 및 p35에 대한 mRNA를 평가함에 의해, 저자들은 TLR (STAg, 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondi)로부터의 추출물) 및 CD40을 통한 공동-진입기전이 개선된 p35 mRNA 발현 및 IL12p70의 생성에 중요함을 제시하였다. 이러한 연구에 이어 인간 DC를 이용한 연구가 후속되는데, 여기에서는 CpG DNA가 시험관내 IL12p70 생성을 위한 CD40 신호전달과 중요한 공동-자극제임을 나타내었다 (51). 더불어, CD40이 DC 성숙화의 DC 특정 양태를 유도하는데 필수적이나 충분하지 않음을 증명하는 첫 번째 연구가 있었다. 그러나, 이들은 CD40 및 TLR 효능의 조합된 작용이 CMI를 폭발적으로 유도하는데 필수적이라는 강력한 증거를 제공하지 못했다.
CD40 및 TLR 효능간 상승작용에 대한 의문은 생체내 OVA-특이적인 사합체+ 세포의 팽창에 대한 TLR이나 CD40 진입기전 또는 TLR/CD40 진입기전의 영향력을 정량함에 의해 직접 다루어졌다. 본 발명자들은 □CD40, TLR 효능제 (S27609) 및 OVA (단백질 또는 펩티드)의 투여가 OVA-특이적인 CD8+ T 세포의 생성을 유도할 수 있음을 밝혀내었다 (예비 데이터 섹션의 실시예 참조). 항원-특이적인 T 세포는 6일까지 전체의 25%를 초과하는 CD8+ T 세포 집단에 상당할 수 있다. 시험된 모든 TLR 효능제는 항-CD40과 상승작용하고 효능 있는 항원-특이적인 CTL 활성을 유도한다. 이러한 발견은, 선천 및 후천 면역성의 조합된 촉발이 효능 있는 이펙터 T 세포를 유도하고 암 면역요법에서 백신 플랫폼으로서 이 기술을 사용하기 위한 단계를 설정하는 용량을 최대화하였다는 가설을 지지하였다.
마우스 및 인간 둘 모두에서의 연구는 CD40 효능제 단독의 투여가 독성을 유도함을 나타내었다. 완전한 마우스에서, CD40 효능제는 간 독성을 유도하는 것으로 나타났다. 면역 결핍 마우스 및 비-치사-조사된 마우스에서, CD40 효능제의 투여는 치사를 야기한다. □CD40 및 TLR 효능제 (또는 IFNa)의 조합된 투여를 이용한 연구를 진행하는 동안, 본 발명자들은 TLR 효능제 또는 IFNa를 □CD40으로 처리된 마우스에게 생체내 첨가하는 것이 독성을 해소시킴을 발견하였다. 따라서, IFNa 또는 TLR 효능제와 CD40 효능제의 공동-투여는 CD40 효능제의 임상적 사용에서 관찰된 독성을 해소시킬 것이다.
또한, 선천 및 적응 면역성에 대한 분자적 촉발제의 확인은 백신에 대한 애주번트 플랫폼을 변화시킬 것이다. 그러나, 다른 면역 경로의 부재하에 한 면역 경로의 분리된 활성화는 독성이고 쓸모없을 수 있고, 일부 경우에 장기간 보호 면연성의 발생에 유해할 수 있다. 더욱 효과적인 분자적으로 공학처리된 백신은 아마도 다중 면역학적 경로를 촉발시키는 제제들의 조합물을 포함할 것이다.(28,29) 본 발명자들의 연구는 조합물로서의 CD40 및 TLR 효능제가 어느 하나의 애주번트에 비해 (1) 높은 빈도의 자가-반응성 이펙터 CD8+ T 세포, (2) 효능 있는 종양-특이적인 CD8+ 기억, (3) 전이 표적 기관을 효율적으로 침윤시키고 이펙터 기능을 발휘하는 CD8+ T 세포, (4) 양호한 치료적 효능, (5) 종양 부위에서 FoxP3+ T 세포에 대한 CD8+ T 세포의 증가된 비, 및 (6) 감소된 간독성을 유도함을 입증한다.
종양-특이적인 CD8+ T 세포의 증가된 빈도는 다수의 인간 임상 시험에 대한 일차 종말점이었고 (13) 보호 항종양 면역성의 발생에 필수적인 구성요소로 여겨진다. CD40/TLR 효능제 및 항원의 조합된 투여에 의해 유도된 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 빈도는 대체로 임의의 다른 애주번트 또는 세포-기재 백신 플랫폼, 예컨대 항원-펄싱된 DC로 관찰된 것 보다 10배 더 높다.(30)/1 "B31"-(32) 이러한 현저한 반응에 대한 세포 및 분자적 기초가 완전히 이해되어 있지 않으나, 본 발명자들은 DC 상에서 CD70의 발현이 CD8+ T 세포 팽창에 중요하다고 발표하였다.(9) CD8- DC 상에서 CD70의 증가된 발현은 단지 CD40 및 TLR 효능제 둘 모두가 공동투여될 때 유도된다. CD70/CD27을 통해 후속하여 증가된 신호전달은 백신화 후에 보여진 우수한 기억 반응을 설명할 수 있었다.(33) 기타 데이터는 CD8- DC가 CD40 및 TLR을 통해 생체내에서 촉발될 때 가용성 항원을 맞-제시하는(cross-present) 능력을 획득함을 시사하며, 이것은 틀림없이 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 극히 높은 빈도에 기여할 수 있다. 총괄하여, 본 발명자들의 현재 가설은 CD40/TLR7*이 항원 프로세싱 및 맞-제시의 효율을 증가시킴으로써 개선된 CD8+ T-세포 프라이밍 및 기억을 촉진시킨다는 것이다. 본원에 제시된 데이터는 펩티드 항원을 이용하였고, 그 자체로 맞-제시 경로를 우회하였다. 그러나, CD40/TLR 효능이 펩티드 백신화 후 종양 항원에 대안적인 에피토프 확산을 촉진할 수 있음을 추측하는 것이 흥미롭다.
단일의 애주번트로서 항-CD40은 체액 (34) 및 세포-매개된 면역 (16) 반응을 종결시키는 것으로 나타났다. CD40 단일요법이 단기간 면역성의 극미한 개선을 제공할 수 있으나, 연구들은 이것이 CD8+ T-세포 기억의 생성을 단축시킴을 입증하였다.(14) 흥미롭게도, 체액 면역성의 경우조차, CD40 효능제의 사용은 장기간 기억과 길게-생존하는 혈장 세포의 생성을 저지시켰다.(17) 머피 및 공동연구자들의 최근의 연구에서 (Berner et al (14)), CD40 단일요법은 종양-특이적인 CD4+ T 세포의 IFN-의존적인 아폽토시스 및 종양 챌린지에 대한 보호 기억 반응을 개시할 무능력을 초래하였다. 다수의 CD40 모노클로날 항체는 임상에 들어갔고 (2,4,35)/1 "B36"/1 "B37"(38) 이 중 단 하나만이 (2) 본원과 예를 들어 풍부한 다른 뮤린 연구에 사용된 항뮤린 CD40과 유사한 강력한 효능제인 것으로 보고되었다.(39,40) 1상 연구에서, 각각 IV기 흑색종인 4명의 환자가 연구의 끝에 재상연(restaging)에 대한 부분적인 반응을 갖는 것으로 나타났다. 백신 플랫폼으로서 효능성 CD40 단일요법 (2)과 관련하여 임의의 단호한 언급을 하는 것은 시기상조일 수 있으나, 마우스에서의 임상전 연구는 분명히 이것을 선천 면역성의 활성화제와 조합시킬 때 백신으로서 더욱 효과적일 것임을 시사한다. 비록 임상적 효능이 아닐지라도, CD40 단일요법의 독성은 다른 면역 활성화제의 첨가로 개선될 수 있다. 효능성 CD40 단일요법이 적합할 수 있다는 본 발명자들의 지적은 마우스에서 고-용량 단일요법이 매우 효과적인 것으로 나타난 (40,41) B-세포 림프종에서이다.
동물 모델에서의 연구는 유일한 애주번트로서 TLR 효능제가 강건한 염증 반응을 유도하고 광범한 범위의 특이적인 면역 반응을 개선시킬 수 있음을 나타낸다.(42) TLR 효능제를 이용한 임상 연구의 결과를 결합시켰다. (43) FDA-승인된 국소적으로 적용되는 TLR7 효능제인 이미퀴모드가 기저 세포 암종에서 매우 효과적인 것이 입증되었다. 더욱이, TLR4 효능제를 이용하는 2개의 개량된 성인 B형 간염 바이러스(HBV) 백신이 승인되었다. 그러나, 2007년 6월에, 화이자는 다양한 화학요법제와 조합된 2상 및 3상 임상에서의 임상적 효능의 부족으로 인해 TLR9 효능제에 대한 비-소세포 폐암의 임상 프로그램을 중단하였다.(44) 본 발명자들의 데이터는 적어도 암 적응증에서 적응 면역성의 활성화제가 TLR 효능제의 치료적 가능성을 크게 증가시킬 것을 강력하게 시사한다.
TNFR 효능제 및 TLR 효능제의 단일군(single-arm) 시험이 충분히 안전하고 염증 반응을 유도하는 것으로 나타난 것은 충분히 고무적이다. TLR 효능제, TNFR 효능제, 및 다른 면역 활성화제의 혼합물을 이용한 마우스에서의 최근의 임상전 연구에 기초하여, 이러한 혼합물이 임상 시험에서 효능을 크게 개선시킴과 동시에 독성을 감소시킬 것으로 기대된다. 일차 이펙터 T 세포의 개선된 빈도, 효능 있는 장기간 면역학적 기억, 및 감소된 조절 T-세포 기능은 성공적인 치료적 개입을 위해 달성되어야할 것 같은 검증적인 종말점의 일부이다. 상기 연구 및 기타 연구들 (45)의 결과는 인간에서의 암 백신 시험에서 최대 효능을 달성하기 위한 다원적 백신을 생성하는 이론적인 전략들을 제공한다.
참고문헌 목록
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Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
본 발명의 다양한 구체예의 활성에 실질적으로 영향을 주지 않는 변형이 또한 본원에 제공된 본 발명의 정의 내에서 제공되는 것으로 이해된다.
본원에 인용된 다양한 저널, 특허 및 기타 공개문헌에 대한 다양한 언급은 당 분야의 상황을 포함하고 충분히 개시된 대로 참조로서 포함된다.

Claims (27)

  1. 단일요법으로서 투여하는 경우 일부 피검체에서 간 독성을 유도하는 용량으로 하나 이상의 TNF-R 효능제를 투여하는 것을 포함하는 개선된 치료 요법으로서, 상기 개선은 상기 간 독성을 간 효소 수준에 기초하여 측정시 적어도 50%만큼 제거하거나 감소시키기에 충분한 양의 하나 이상의 타입 1 인터페론 및/또는 TLR 효능제를 추가로 투여하는 것을 포함하는 개선된 치료 요법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 TNF-R 효능제가 CD40 효능제인 요법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 CD40 효능제가 효능성 항체나 단편 또는 단량체 또는 중합체 CD40L 폴리펩티드나 CD40 효능성 활성을 지니는 변이체 또는 단편 또는 컨주게이트인 요법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 TLR 효능제가 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR1O, TLR11 및 TLR12로부터 선택된 TLR의 효능제인 요법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 TLR 효능제가 효모나 세균성 스페로플라스트, 세포질체, 막 또는 세포하 입자인 요법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 TNF-R 효능제가 단일요법으로서 간 독성을 유도하는 양의 적어도 2배의 용량으로 투여되는 CD40 효능제인 요법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 TNF-R 효능제가 단일요법으로서 간 독성을 유도하는 양의 적어도 5배의 용량으로 투여되는 CD40 효능제인 요법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 TNF-R 효능제가 단일요법으로서 간 독성을 유도하는 양의 적어도 10배의 용량으로 투여되는 CD40 효능제인 요법.
  9. 제 1항에 있어서, 면역 반응이 유도되어야 하는 항원을 투여하는 것을 추가로 포함하는 요법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 항원이 바이러스, 세균, 진균 또는 기생충 항원인 요법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 항원이 인간 항원인 요법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 인간 항원이 암 항원, 자가항원, 또는 그 항원의 발현이 만성 인간 질환과 관련되거나 이에 수반되는 다른 인간 항원인 요법.
  13. 제 10항에 있어서, 상기 바이러스 항원이 HIV, 헤르페스, 파필로마바이러스, 에볼라, 피코르나, 장바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 조류 플루 바이러스, 광견병 바이러스, VSV, 뎅기 바이러스, 간염 바이러스, 리노(rhino)바이러스, 황열병 바이러스, 분가(bunga) 바이러스, 폴리오마 바이러스, 코로나바이러스, 루벨라 바이러스, 에코바이러스, 폭스 바이러스, 바리셀라 조스터, 아프리카 돼지열 바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 바이러스에 특이적인 요법.
  14. 제 10항에 있어서, 상기 세균 항원이 살모넬라, 에스체리치아, 슈도모나스, 바실러스, 비브리오, 캄필로박터, 헬리코박터, 어위니아(Erwinia), 보렐리아, 펠로박터, 클로스트리디움, 세라티아(Serratia), 크사노토모나스(Xanothomonas), 예르시니아, 버크홀디아(Burkholdia), 리스테리아, 시겔라, 파스퇴렐라, 엔테로박터, 코리네박테리움 및 스트렙토코커스로 구성된 군으로부터 선택된 세균으로부터 유래되는 요법.
  15. 제 10항에 있어서, 상기 기생충 항원이 바베시아, 엔토모에바, 레이슈마니아, 플라스모디움, 트립파노소마, 톡소플라스마, 지아르다, 편형동물 및 회충으로부터 선택된 기생충으로부터 유래되는 요법.
  16. 제 10항에 있어서, 상기 진균 항원이 아스퍼질러스, 코카이도이즈(Coccidoides), 크립토코커스, 캔디다, 노카르디아, 뉴모사이스티스 및 클라미디아로 구성된 군으로부터 선택된 진균으로부터 유래되는 요법.
  17. 제 9항에 있어서, 상기 항원이 전립선암, 췌장암, 뇌암, 폐암 (소세포 또는 큰세포), 뼈암, 위암, 간암, 유방암, 난소암, 고환암, 피부암, 림프종, 백혈병, 결장암, 갑상선암, 자궁경부암, 두경부암, 육종, 신경아교암, 및 담낭암으로 구성된 군으로부터 선택된 인간 암에 의해 발현된 암 항원인 요법.
  18. 제 9항에 있어서, 상기 항원이 자가면역 질환에 상관하여 발현되는 자가항원인 요법.
  19. 제 1항에 있어서, 항원 특이적인 세포 면역 반응을 유도하는 요법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 투여가 하기 중 하나 이상을 초래하는 요법:
    (i) CD40 효능제 또는 TLR 효능제 또는 타입 1 인터페론만을 엔코딩하는 DNA의 투여에 비해 개선된 일차 및 기억 CD8+ T 세포 반응;
    (ii) 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 기하급수적인 팽창 유도, 및
    (iii) CD4 결핍 숙주에서 정상 (비-CD4 결핍) 숙주에 필적하는 보호 면역 반응 생성.
  21. 제 1항에 있어서, 암, 알레르기, 염증 질환, 감염성 질환 및 자가면역 질환으로부터 선택된 질환을 치료하기 위해 이용되는 요법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 감염성 질환이 바이러스, 세균, 진균 또는 기생충에 의해 야기되고, 상기 TLR 효능제가 바이러스, 세균, 진균 또는 기생충 또는 질환을 야기하는 이의 단편이나 부분 또는 그 항원을 발현시키도록 공학처리된 바이러스 또는 미생물을 포함하는 요법.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 바이러스가 HIV인 요법.
  24. 제 1항에 있어서, 흑색종을 치료하기 위해 이용되는 요법.
  25. 제 1항에 있어서, 폐암을 치료하기 위해 이용되는 요법.
  26. 제 1항에 있어서, 림프종 또는 백혈병을 치료하기 위해 이용되는 요법.
  27. 제 27항에 있어서, 상기 림프종 또는 백혈병이 B 세포 림프종 또는 CLL인 요법.
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