KR20100031102A - 에스. 하브로차이테스로부터 유래된 단위결실 유전 요소 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4, 5 및/또는 12로부터의 유전자 영역을 상기 식물로 유전자이입하는 것을 포함하며, 여기서 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4로부터의 유전자 영역이 마커 CD59, RFLP 마커 CT229 및 COS 마커 T1068로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함하며, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 5로부터의 유전자 영역이 COS 마커 T1181, RFLP 마커 TG441 및/또는 RFLP 마커 CD31(A)로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함하는 것인 단위결실, 및 임의로 웅성 중성 토마토 식물 (이의 대표적인 씨 샘플이 NCIMB에 기탁 번호 41517로 2007년 11월 13일에 기탁됨)의 생산 방법에 관한 것이다.
씨없는 토마토, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78, 유전자이입, 단위결실,
Description
본 출원은 씨없는 (seedless) 토마토, 씨없는 토마토를 얻기 위한 방법, 및 씨없는 토마토를 제품, 특히 식품으로 가공하기 위한 방법에 관한 것이다.
현재 시판 중인 여러 과일 및 채소는 씨 (seed)를 포함한다는 단점을 갖는다. 이들 씨의 존재는 많은 소비자에게 과일이 덜 매력적이도록 할 수 있다. 또한, 이들 과일을 기초로 하는 여러 제품, 예컨대 및 특히 토마토에 기초한 식품의 제조에서, 씨는 임의로 사전 퓨레화 (pureeing), 용융 또는 매쉬 (mashing) 이후에 예를 들어 체질 (sieving)에 의해 제거되어야 하며, 이는 추가의 가공 단계를 수반한다. 이는, 이들 과일을 기초로 하는 산업 규모의 제품, 예컨대 퓨레, 수프, 주스 또는 소스의 제조, 및 음식 또는 식품의 가정 제조 (household preparation) 모두에 대해 그러하다.
이에 따라, 씨없는 특성 (seedlessness)은 단단한 씨를 갖는 식용 과일, 예컨대 파인애플, 바나나, 오렌지, 그레이프프루트, 여름 호박 (summer squash) 및 멜론, 및 또한 일반적으로 채소로 여겨지는 과일, 예컨대 토마토, 고추, 오이 및 가지에서 매우 바람직한 형질이다. 일부 식물, 예컨대 파인애플은 단일 품종을 성 장시킨 경우 씨없는 과일을 생산하는데, 이들은 자가-생식불능 (self-infertile)이기 때문이다. 일부 오이는 화분매개자를 배재하는 경우 씨없는 과일을 생산한다. 이러한 식물이 과일을 생산한다는 사실은 단위결실 (parthenocarpy)로 불리는 형질의 결과이다. 단위결실 (글자 그대로 단성 (virgin) 과일을 의미함)은 배주의 수정 없이 자연적 또는 인공적으로 유래된 과일 생산물이다. 이에 따라 과일은 씨가 없다. 때때로, 단위결실은 자연에서 돌연변이로서 일어나지만, 보통 결손 (defect)으로서 여겨지는데, 그 이유는 식물이 더이상 유성생식할 수 없게 되고, 무성 방법에 의해 증식할 수 있기 때문이다. 원예가는 무화과, 선인장 배 (cactus pear; 부채선인장), 빵나무 및 가지를 비롯한 여러 식물의 단위결실 품종을 선별하여 증식시켜 왔다.
그러나, 식물에서의 일부 과일의 단위결실은 가치 있을 수 있다. 일부 식물, 예컨대 씨없는 수박에서, 수분 또는 다른 자극이 단위결실에 필요하다. 이는 자극성 단위결실로 지칭한다. 바나나는 자극성 단위결실을 나타내는데, 이는 3배체 (이는 이배체 및 사배체 양친의 결과라는 것을 의미함)이기 때문이고, 이에 따라 씨를 생성하지 못한다. 단위결실 과일을 생산하기 위해 수분 또는 다른 자극을 필요로 하지 않는 식물은 무성 단위결실을 갖는다. 오이는 무성 단위결실의 예이다.
꽃 상에서 분무되는 경우, 임의의 식물 호르몬, 지베렐린, 옥신 및 시토키닌은 종종 단위결실 과일의 발생을 자극할 수 있다. 이는 인공 단위결실로 지칭한다. 식물 호르몬은 단위결실 과일을 생성하기 위해 상업적으로 거의 사용되지 않 는데, 이는 변형된 과일을 유발할 수 있기 때문이다.
자연에서, 이중 열성 단위결실 및 이중 열성 기능적 중성 (functional sterility)의 유전자형 조합은 (씨가 형성되지 않기 때문에) 생존의 기회가 없어, 유전자는 다음 세대로 전달되지 않는다.
몇몇 단위결실 품종을 유전자 변형 유기체로서 개발하여 왔다. 그러나, 상기 방법은 또한 하기 기재되는 것과 같은 선택적 번식을 포함할 수 있다.
토마토 꽃은 난소로 구성되며, 그 위에 암술 (화주 (style) + 주두 (stigma))이 있다. 암술 주위에, 여러 수술 (stamen; 꽃실 (filament) + 꽃밥 (anther))이 있으며, 화분을 생산한다. 난소에서, (화분과의 수분 이후) 씨로 발생하는 여러 전-배아/배아가 있다.
토마토 식물은 "절대적 (obligatory) 자가-화분매개자"로 여겨지는데, 이는 거의 배타적으로 그의 자신의 화분만이 동일한 식물의 꽃의 수술에서 종결되며, 이에 따라 전-배아를 수분시킨다는 것을 의미한다. 수분된 전-배아가 난소에서 형성되는 대로, 난소는 토마토 (과일)로 성장하기 시작하는데, 그 내부에는 동시에 발생중인 씨가 함유된다. 원칙적으로, 씨가 난소에서 발생하지 않는 경우 과일은 형성되지 않을 것이다 (예를 들어, 비-수분된 전-배아의 결과).
씨없는 토마토에 대한 문헌 (예를 들어, WO98/24301)은 토마토 내에서 PK 유전자로 불리는 유전자의 존재를 언급하며, 이는 단위결실의 특성을 코딩한다. 추측컨대, 이 유전자는 이중 열성 (pk,pk; 즉 동종접합체 열성 유전자형)으로서 존재하는 경우 씨의 발생을 동반하지 않고 과일 (과육)의 발생을 유발한다.
자연에서 또는 온실에서, 단위결실(의 표현형)은 오직 부분적일 것이며, 씨의 부재 또는 부분적 존재를 유발하는 인자는 대립유전자 (allele)에 존재한다. 부분적 단위결실에서, 씨는 과일의 (또다른) 부분에서 형성되며, 그 결과 과일은 불규칙적으로 성장할 것이며, 이는 바람직하지 않다. 이에 따라, 부분적인 단위결실은 과일의 불규칙적인 형태를 유발하며, 과일은 변형된다.
과일이 총 단위결실을 기초로 형성되는 경우, 씨는 과일 내에서 발생하지 않으며, 결과적으로 단위결실을 코딩하는 유전자는 다음 세대로 전달되지 않아, 세대 계통 (generational line)이 종결된다.
이 때문에, 상기 유전자는 자연에서 극단적으로 희귀하다. 또한, 총 단위결실(의 표현형)은 씨가 없는 과일을 유발하며, 이는 씨의 생성을 불가능하게 한다.
단위결실의 특성은 여러 대립유전자에 존재한다. "모체 (mother)" (즉, 그의 꽃이 화분으로 수분된 토마토 식물) 및 "부체 (father)" (즉, 화분을 제공하는 토마토 식물) 모두 PK 유전자에 대해 이중 열성인 경우에만 총 단위결실의 표현형이 일어날 수 있다. 이는 "탄생의 상태에서의" 과일에 발생중인 여러 씨가 있으며, 양친 중 하나가 이종접합체인 경우 상기 씨들 중 하나 이상이 동종접합체 열성이 되지 않을 수 있기 때문이다.
부분 단위결실 (발생중인 토마토에서, PK 유전자에 관하여 이중 열성이 아닌 하나 이상의 씨의 결과)은 변형된 방식으로 과일이 발생되도록 한다.
토마토에서 PK 유전자 이외에, 기능성 중성 (FS)의 특성을 코딩하는 유전자가 알려져 있다. FS에 관한 이중 열성 식물 (fs,fs)은 완전히 근접된 화분관을 갖 는 토마토 식물을 유발하여, 완전 및 수정 화분 (complete and fertile pollen)은 진동 또는 다른 기계적 영향 (뒝벌 (bumble bees), 곤충 또는 진동기) 하에서도 화분관을 떠날 수 없다.
이중 열성 (fs,fs) 표현형을 갖는 토마토 식물의 화분은 오직 손에 의한 (절단 또는 가위질에 의한) 화분관의 물리적 개방에 의해서만 방출될 수 있으며, 그 후, 실제적으로, 화분은 개방된 화분관으로부터 손으로, 즉 스크래핑 (scraping)에 의해 제거되어야 한다.
동일한 또는 또 다른 토마토 식물의 수정에 대하여, 이후 화분을 꽃의 암술에 적용하여야 하며, 이는 실제적으로 수동으로 수행되어야 한다.
임의의 다른 "자연적" 방식 (즉, 상기 언급된 인간 개입 없는 방식)으로 기능적 중성 꽃의 화분은 방출되지 않으며, 이에 따라 전-배아의 수정에 이용가능하지 않다. 이에 따라, 이중 열성 기능적 중성 식물 (fs,fs)은 전-배아를 수정하지 않으며, 이는 세대 계통을 종결시켜 기능적 중성에 대한 열성 유전자가 다음 세대로 전달되지 않는다. 자연에서, 기능적 중성에 대한 이중 열성 표현형 (fs,fs)과 함께, 전-배아의 수정이 일어나지 않으면, 과일 (토마토)이 형성되지 않을 것이다.
WO98/24301은 열성 단위결실 표현형 (이중 열성 유전자 pk 기초; 즉, pk,pk)을 열성 기능적 중성 표현형 (이중 열성 유전자 fs 기초; 즉, fs,fs)과 조합한 토마토 식물을 사용하여 씨/종자 (pip) 없는 토마토를 유리하게 생산할 수 있다고 기재한다. 완전한 (absolute) 씨없는 과일은 정상적인 선택을 제외하고는 물리적인 인간 개입에 의해서만 생산할 수 있다. (양친의) 화분관은 손에 의해 개방되어야 하며, 이후에 화분은 개방 화분관으로부터 스크래핑에 의해 제거되어야 하고, 이후 수정되도록 손에 의해 토마토 식물의 암술에 적용된다. 특히, 상기 언급된 3가지 단계 중 처음 2개는 수행하기에 장황하다. fs 및 pk 유전자의 유전적 기초 또는 식물 공급원은 WO98/24301에 개시되어 있지 않다.
에이치. 조르지오브 (H. Georgiev) 등 (문헌 [Eucarpia Tomato-90, Proceedings of the XI Eucarpia Meeting on Tomato Genetics and Breeding, Malaga, Spain, March 1990: "Breeding of Seedless Tomatoes"])은 한 품종에서 단위결실에 대한 동종접합 유전자 pat-2 및 꽃의 자가중성에 대한 동종접합 유전자 ps-2를 조합하여 완전히 씨없는 토마토 과일을 갖는 토마토 식물을 얻기 위한 방법을 기재한다. 이에 따라 얻어진 pat-2, ps-2 품종은 완전히 씨없는 토마토 과일을 갖는다 (조르지오브 참고문헌의 표 1 및 2에서 나타낸 것과 같음). 추가적으로, 조르지오브 등은 이러한 2개 품종의 교배에 의해 완전히 씨없는 표준 과일을 갖는 F1 잡종을 생성할 수 있다는 것을 기재한다.
그러나, 조르지오브에 의해 기재된 계통으로의 WO98/24301의 출원인에 의한 광범위한 연구는 단위결실 특성 및 자가중성 특성을 조합하여 양친 계통을 제공하는 경우, 및 이들 양친 계통들 중 2가지로부터 (즉, 하기 기재되는 것과 같은 인간 개입에 의해) 잡종 씨를 얻는 경우, 이중 열성 pat-2 유전자 단독 및 이중 열성 ps-2 유전자 단독의 존재는 원칙적으로 모든 성장 조건 하에서 안정적이고 신뢰성있게 씨없는 토마토를 형성하도록 하는 잡종을 제공하기에 충분하지 않다는 것을 나타내었다. 따라서, 식물이 항상 및 모든 상황 하에서 잘 형성된 토마토를 제공 하지는 않을 것이기 때문에, 이중 열성 유전자만을 함유하는 2개 양친 계통 (pat-2, pat-2) 및 (ps-2, ps-2)의 교배는 상업적으로 허용가능한 씨없는 잡종을 유발하지 않을 것이다.
따라서, WO98/24301의 교시 내용에 대한 개선의 필요가 있으며, 특히 열대 및 온대 기후 모두에서 널리 퍼질 수 있도록 상이한 빛 및 온도 조건을 비롯한 모든 환경 조건 하에 씨없는 토마토의 신뢰성 있는 생산을 가능하도록 하는 잡종 (및 이를 위한 씨)에 대한 요구가 있다. 이는 성공적으로 상업화할 수 있으며, 세계 모든 나라에서 성장하도록 할 수 있는 잡종 및 이를 위한 씨를 제공하기 위해 필수적이다.
WO00/74468는 WO98/24301에 비해 상기 개선점을 기재하지만, 예컨대 "pk-복합체" 및 "fs-복합체"를 포함하는 토마토 계통의 씨의 부다페스트 조약 (Budapest Treaty) 하의 기탁물과 같은 식물 공급원을 개시하지는 않는다. EP1428425는 씨가 2001년 12월 5일에 어메리칸 타입 컬처 컬렉션 (American Type Culture Collection (ATCC); 미국 20110-2209 버지니아주 만나사스 (Manassas, VA 20110-2209, USA))에 기탁된 토마토 계통과 같은 기탁물을 개시한다. 기탁된 씨는 ATCC 기탁 번호 PTA-3907를 부여받았다. ATCC 번호 PTA-3907은 EP1428425에 기재된 방법으로 얻어진 것과 같은 단위결실 (pat-2 유전자를 기초로 함) 및 기능적 중성 표현형 (ps-2 유전자를 기초로 함)의 양호한 발현을 나타내는 "제1 F3 세대"로부터의 식물이다. 이러한 토마토 계통은 pat-2에 의한 단위결실 및 ps-2에 의한 위치적 중성의 강한 발현에 대한 모든 유전 정보를 함유하는 pk/fs 복합체에 대한 동종접합이다. 따라 서, 추측컨대, ATCC PTA-3907로부터 출발하여, ATCC PTA-3907과 원하는 비-씨없는 양친의 교배 및 후속적으로 수동 자화-수분에 의한 반복된 자가수정 (selfing)에 의해 단위결실 및 위치적 중성의 강한 발현을 임의의 원하는 토마토 변종으로 도입하는 것이 가능하다.
그러나, 유전자 공급원을 제공하는 ATCC PTA-3907 기탁물의 이용 가능성에도 불구하고, 단위결실의 유전적 특징은 현재 알려져 있지 않다. 그럼에도 불구하고, 형질의 염색체 위치의 지식, 및 식물에서 형질의 존재를 추적하기 위한 방법 및 식물 간의 교배는 단위결실 식물의 생산을 증가시키는데 매우 가치있을 것이다. 사실, EP1428425는 10년 이상의 기간에 걸친 광범위한 연구가 ATCC 번호 PTA-3907 기탁물에 함유된 pk,fs 복합체를 구성하는데 요구되는 유전자, 대립유전자 또는 다른 유전 인자의 수 및/또는 특성을 명확하게 할 수 있거나, 또는 원래 씨없는 양친 및 비-씨없는 양친으로부터 얻어진 F1, F2, F3 및 심지어 F4에서 씨없는 (또는 심지어 기능적 중성) 표현형의 매우 낮은 발생 또는 때때로 심지어 완전한 부재를 설명할 수 있는 만족스러운 모델을 제공하지 못하였음을 언급하였다. EP1428425는 이것이 본 발명의 순종 씨없는 표현형을 결정하는 인자가 상기 선행기술에서 제안된 것에 비해 훨씬 더 복잡하다는 것 (즉, (1+1), (2+1) 또는 심지어 (3+1) 개별 유전자의 조합에 의해 결정되지 않음)을 나타내며, 또한 선행 기술이 안정적이고 신뢰성 있는 방식으로 모든 환경 조건 하에서 씨없는 잡종을 생산하는데 사용할 수 있는 토마토 식물 또는 계통을 제공할 수 있지 못하는 이유를 설명한다고 언급한다.
본 발명의 목적은 상기 언급된 문제점을 해소하기 위한 것이다. 단위결실 식물을 제조하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 본 발명의 또 다른 목적은 단위결실의 유전적 기초에 보다 통찰하도록 하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 번식 및 선별 과정 동안, 특히 채소 및 과일 식물의 상업적 변종의 생성에서 식물에서의 단위결실-부여 유전 요소의 존재를 성공적으로 모니터링할 수 있는 게놈 마커를 제공하기 위한 것이다.
<발명의 개요>
본 발명자들은 공여체로서의 솔라눔 하브로차이테스 (Solanum habrochaites) LYC4/78 및 반복 양친 식물로서의 솔라눔 라이코페르시쿰 시브이. 머니메이커 (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker) 간의 이종 교배에 의해 생성된 특정 유전자이입 계통이 씨를 형성하는데 실패하되, 동시에 이들 식물은 증가된 과일 중량을 나타낸다는 것을 발견하였으며, 이들 식물이 총 단위결실 표현형을 나타낸다는 것을 발견하였다. 이종 교배는 본 출원인의 WO2006/046861에서 이미 기재하였다. 총 단위결실 표현형은 염색체 5에서의 유전자이입에 대한 동종접합 공여체 양친 (솔라눔 하브로차이테스 LYC4/78)이 되도록 선택된 식물에 의해 나타났으며, 이러한 계통은 IL5-1을 의미하였다. 또한, 이러한 계통은 본원에서 DRS5.1로도 지칭된다. 솔라눔 하브로차이테스 LYC4/78의 대표적인 씨 샘플은 부다페스트 조약 규정 6.1(iv)의 취지 내에서 기탁 번호 NCIMB 415217 하에 2007년 11월 13일에 NCIMB에 기탁되었다.
IL 계통 DRS5.1, 및 또한 염색체 5에서의 유전자이입을 함유하는 또 다른 IL 계통 (씨를 형성하지 못하며, 증가된 과일 중량을 나타내지는 않고, 허용가능한 크 기의 과일을 생산하는, 본원에서 기재된 것과 같은 계통 IL5-2)을 유지하기 위해, 이종접합 상태에서 유지되어야 한다. 형태학 조사시 이들 식물이 기능적 중성 (긴 화주, 짧은 꽃실)이었음을 발견하였다.
또한, 염색체 12에서의 유전자이입을 갖는 한 계통은 허용가능한 크기의 씨없는 과일을 나타내었으며, 단위결실로서 지칭할 수 있다. 또한, 상기 계통은 염색체 4에서의 이종접합 유전자이입을 함유하였다. 철저한 분석에 의해, 본 발명자들은 에스. 하브로차이테스로부터의 유전자이입이 에스. 라이코페르시쿰 (S. lycopersicum)의 상업적 토마토 변종에서 단위결실 표현형을 증가시킬 수 있음을 발견하였다.
제1 측면에서, 본 발명은 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4, 5 및/또는 12로부터의 유전자 영역을 상기 식물에 유전자이입하는 것을 포함하며,
- 여기서, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4로부터의 유전자 영역은 마커 CD59 및 TG272 사이의 영역이며;
- 여기서, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 5로부터의 유전자 영역은 COS 마커 T1181 및 RFLP 마커 CD31(A) 사이의 영역인, 단위결실 및 임의로 웅성 중성인 토마토 식물 (이의 각각의 대표적인 씨 샘플이 NCIMB에 기탁 번호 41517로 2007년 11월 13일에 기탁됨)을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4로부터의 유전자 영역은 마커 CD59, RFLP 마커 CT229 및 COS 마커 T1068로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함한다.
본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 5로부터의 유전자 영역은 COS 마커 T1181, RFLP 마커 TG441 및/또는 RFLP 마커 CD31(A)로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함한다.
본원에서 기재된 것과 같은 단위결실 토마토 식물은 임의로 (및 바람직하게는) 웅성 중성이다.
바람직한 실시양태에서, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4로부터의 유전자 영역은 마커 TG272, TG264, TG62, T1405 및/또는 CT50을 포함하지 않는다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 5로부터의 유전자 영역은 RFLP 마커 TG318 또는 보다 다운스트림 마커 (downstream marker), 예컨대 TG538, TG60 및/또는 CT138을 포함하지 않는다.
식물이 단위결실이 되도록 하기 위해 본원에서 정의된 유전자 영역, 예컨대 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4, 5 및 12로부터의 본원에서 정의된 영역, 및 염색체 4 및 5, 또는 5 및 12, 또는 4 및 12로부터의 본원에서 정의된 영역의 임의의 조합을 토마토 식물에 유전자이입할 수 있다는 것을 당업자들은 이해할 것이다.
한 바람직한 실시양태에서 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 12로부터의 유전자 영역은 필수적으로 도 3에 도시된 것과 같다. 바람직하게는, 상기 영역은 에스. 라이코페르시쿰 LA925 × 에스. 펜넬리 (S. pennellii) LA716 형 F2의 토마토-EXPEN 2000 지도에 위치된 것과 같은 RFLP 마커 TG296 (96.00 cM)을 포함하지 않는다. 특히, 바람직한 유전자 영역은 도 1에서 어두운 영역에 의해 나타낸 것과 같다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 씨-함유 토마토 식물을 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 식물과 교배하는 단계, 및 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4, 5 및/또는 12의 유전자 영역의 유전자이입의 존재에 대해 씨 또는 상기 씨로부터 성장된 식물을 선별하는 단계를 포함하며,
- 여기서, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4로부터의 유전자 영역은 마커 CD59, RFLP 마커 CT229 및 COS 마커 T1068로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하고,
- 여기서, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 5로부터의 유전자 영역은 COS 마커 T1181, RFLP 마커 TG441 및/또는 RFLP 마커 CD31(A)로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하는 것인, 단위결실 (및 임의로 웅성 중성) 토마토 식물을 선별하는 방법에 관한 것이다.
단위결실 식물 생산의 측면에 대해 상기 기재된 바람직한 실시양태는 또한 식물을 선별하는 본 방법에 적용가능하다.
단위결실 식물을 생산하거나 또는 선별하는 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 단위결실 식물은 솔라눔 라이코페르시쿰 식물, 보다 바람직하게는 솔라눔 라이코페르시쿰의 경작 식물이다. 바람직하게는, 상기 식물은 솔라눔 라이코페르시쿰 시브이. 머니메이커가 아니다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 식물 생산을 위한 상기 기재된 것과 같은 방법에 의해 얻을 수 있거나, 또는 상기 기재된 것과 같은 방법에 의해 선별된 토마토 식물, 또는 그의 부분에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
a) 상기 기재된 것과 같이 에스. 하브로차이테스 LYC4/78로부터의 유전자 영역을 유전자이입하여 단위결실 식물을 생산하는 방법에 의해 단위결실 토마토 식물을 생산하는 단계;
b) 상기 단위결실 토마토 식물을 그 자체 또는 또 다른 토마토 식물과 교배하여 자손 토마토 씨를 수득하는 단계;
c) 상기 단계의 자손 토마토 씨를 성장시켜 추가의 단위결실 토마토 식물을 수득하는 단계;
d) 상기 교배 및 성장 단계를 0 내지 7회 반복하여, 단위결실 내성 동종번식 토마토 식물을 생성하는 단계
를 포함하는, 단위결실 동종번식 토마토 식물의 생산 방법에 관한 것이다.
상기 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 단계 c)는 단위결실 표현형을 나타내며 상업적으로 바람직한 특성을 갖는 식물을 확인하는 단계를 더 포함한다.
상기 방법의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 동종접합체 동종번식 토마토 식물을 선별하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 단위결실 동종번식 토마토 식물 또는 그의 부분에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단위결실 표현형을 나타내는 잡종 토마토 식물 또는 그의 부분에 관한 것이며, 여기서 상기 잡종 토마토 식물은 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 단위결실 동종번식 토마토 식물을 상업적으로 바람직한 특성을 나타내는 동종번식 토마토 식물과 교배하여 얻을 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 것과 같은 토마토 식물의 재생가능한 세포의 조직 배양에 관한 것이며, 바람직하게는 상기 재생가능한 세포는 잎, 화분, 배아, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥, 꽃, 과일, 및 줄기 및 씨로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직으로부터 단리된 세포 또는 원형질체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 에스. 하브로차이테스 LYC4/78로부터 유래된 단위결실 유전 요소의 검출 및/또는 단위결실 토마토 식물의 검출을 위한 표 30, 31 또는 32의 유전자 마커로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 마커의 용도에 관한 것이다.
적합한 마커에는 본원에서 기재된 것과 같은 마커의 단편, 예를 들어 표 32에서 언급된 것과 같은 하브로차이테스 LYC4/78 및 에스. 라이코페르시쿰 시브이. 머니메이커 사이의 특성화 뉴클레오티드 다형체를 갖는 단편이 포함된다. 당업자들은 상기 다형체를 검출할 수 있는 방법에 대해 잘 안다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 것과 같이 유래된 단위결실 유전 요소로서 정의된 에스. 하브로차이테스 LYC4/78로부터의 유전자이입을 포함하는 단위결실 식물에 관한 것이다. 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, 상기 식물은 에스. 라이코페르시쿰 종의 식물이고, 보다 바람직하게는 상기 식물은 품종 에스. 라이코페르시쿰 시브이. 머니메이커의 식물이 아니다.
적합하게는, 마커에 의한 선별은 표 32에서 언급된 것과 같은 공여체 (에스. 하브로차이테스 LYC4/78) 또는 수용체 (예를 들어, 에스. 라이코페르시쿰 시브이. 머니메이커)-특이적 뉴클레오티드 다형체의 선택에 따를 수 있으며, 여기서 다형체는 [에스. 하브로차이테스 LYC4/78 위치 / 에스. 라이코페르시쿰 시브이. 머니메이커]로서 주어지는 염기 변형에 의해 나타난다.
도 1은 본원에서 언급된 것과 같은 마커 위치를 나타내는 토마토의 염색체 12의 유전자 지도를 도시한다.
도 2는 에스. 라이코페르시쿰 시브이. 머니메이커 (SL)의 유전적 배경에서의 에스. 하브로차이테스 LYC4/78 (SH)의 유전자이입 계통 (IL) 집단의 발생에 대한 교배 계획을 도시한다. MAS를 사용하여, 2개 확인된 단위결실-부여 유전 요소 중 하나를 함유하는 BC2, BC3 및 BC4 유전자형을 선택하였으며, 일부 BC2를 자화-수분시켜, BC2S1 씨를 생산하였다.
도 3은 실시예에서 기재된 것과 같은 30개 IL의 핵심 세트를 도시한다. 상기 핵심 세트는 가능한 한 적은 IL에서의 SH 게놈의 최대 범위를 나타낸다 (바닥에 주어진 계통 표시). 핵심 세트는 단일 유전자이입을 갖는 15개의 IL, 2개 유전자이입을 함유하는 10개의 IL, 3개 유전자이입을 함유하는 4개의 IL로 이루어지지만, 반면 1개 IL은 여전히 4개의 동종접합 유전자이입을 함유한다. 모든 12개의 염색체는 에스. 하브로차이테스 LYC4, 에스. 라이코페르코손 (S. lycopersocon) 및 참조 DRS5을 기준으로 표시한다.
도 4는 본원에서 언급된 것과 같은 마커 위치를 나타내는 토마토의 염색체 4 및 5의 유전자 지도를 나타낸다.
정의
본원에서 사용되는 용어 "단위결실"은 수분 및/또는 수정의 부재 하에 발생하는 씨없는 과일의 생산을 나타낸다. 달리 언급하지 않는다면, 상기 용어는 유전적 단위결실을 나타낸다. 달리 언급되지 않는다면, 상기 용어는 총 단위결실 (total parthenocarpy)을 나타내며, 과일이 완전히 씨없는 특성이고, 비-변형되되, 정상적인 표준 모양을 갖는 것을 의미한다. 단위결실 식물은 더이상 유성 생식을 할 수 없으며, 무성 방식에 의해 증식할 수 있다. 특히, 용어 "단위결실성 (parthenocarpic)" 또는 관련된 용어 "단위결실 (parthenocarpy)"은 식물의 표현형을 정의하기 위해 본원에서 사용되며, 여기서 식물은 표준 크기가 아닌 씨없는 과일을 생산한다. 상대적으로 작은 과일을 생산하는 씨없는 과일은 본원에서 사용되는 용어와 같은 단위결실로 여겨지지 않는다. 불량한 씨 세트를 갖는 식물은 물론 단위결실이 아니다. 사실, 상기 용어는 완전히 씨없는 식물을 나타낸다. 본 명세서에서, 용어 "단위결실 식물"은 본원에서 정의된 것과 같은 에스. 하브로차이테스 LYC4/78로부터의 유전 요소를 포함하는 식물을 나타내며, 이는 원래 수용체 양친과 크기가 실질적으로 동일하며 비-변형된 씨없는 과일을 생산한다.
본원에서 사용되는 용어 "대립유전자"는 임의의 하나 이상의 또 다른 유전자 형태를 의미하며, 이들 대립유전자 모두는 하나 이상의 형질 또는 특징에 관한 것이다. 이배체 세포 또는 유기체에서, 2개의 주어진 유전자의 대립유전자는 동종 염색체 쌍에서 상응하는 좌위 (locus)를 점유한다. 본 발명이 QTL, 즉 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있는 게놈 영역, 및 또한 조절 서열에 관한 것이기 때문에, "대립유전자" 대신 "일배체형" (haplotype; 즉, 염색체 단편의 대립유전자)을 나타내는 것이 일부 경우에서 보다 정확하나, 이 경우에서 용어 "대립유전자"는 용어 "일배체형"을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서, "유전자"는 염색체에서 특정 위치를 점유하며 유기체에서 특정 특징 또는 형질에 대한 유전적 지시를 포함하는 DNA 서열로 이루어진 유전 단위로서 정의된다.
본원에서, "좌위"는 주어진 유전자가 주어진 종의 염색체 상에서 점유하는 위치로서 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "이종접합"은 상이한 대립유전자가 동종 염색체 상의 상응하는 좌위에 있는 경우 나타나는 유전적 상태를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "동종접합"은 동일한 대립유전자가 동종 염색체 상의 상응하는 좌위에 있는 경우 나타나는 유전적 상태를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "잡종"은 2개 동종번식 계통 사이의 교배를 비롯한 (이에 제한되지는 않음) 2개의 유전적으로 다른 개체 사이의 교배의 임의의 자손을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "동종번식"은 실질적으로 동종접합인 개체 또는 계통을 의미한다.
본 출원에서 "재조합 이벤트"는 감수분열 교차를 의미하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자이입", "유전자이입된" 및 "유전자이입화 (introgressing)"는 천연 및 인공적 방법 모두를 의미하며, 이에 의해 한 종, 변종 또는 품종의 유전자가 또 다른 종, 변종 또는 품종의 게놈으로 이들 종의 교배에 의해 이동된다. 상기 방법은 임의로 반복친 (recurrent parent)으로의 역교배에 의해 완료될 수 있다.
"유전 공학", "형질전환" 및 "유전자 변형"은 모두 본원에서 단리 및 클로닝된 유전자의 또 다른 유기체의 DNA, 보통 염색체 DNA 또는 게놈으로의 전달에 대해 유의어로서 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "분자 마커"는 핵산 서열의 특성화에서의 차이를 시각화하기 위한 방법에서 사용되는 지표를 의미한다. 이러한 지표의 예로는 제한 단편 길이 다형체 (RFLP) 마커, 증폭된 단편 길이 다형체 (AFLP) 마커, 단일 뉴클레오티드 다형체 (SNP), 초위성 마커 (예를 들어, SSR), 서열-특성화 증폭 영역 (SCAR) 마커, 절단 증폭 다형적 서열 (CAPS) 마커 또는 동질효소 마커, 또는 특정 유전자 및 염색체 위치를 정의하는 본원에서 기재된 마커의 조합물이 있다.
본원에서 사용되는 용어 "식물 부분"은 단일 세포 및 세포 조직, 예컨대 식물에서 손상되지 않은 (intact) 식물 세포, 세포 덩어리 및 조직 배양물을 비롯한 토마토 식물의 부분을 의미하며, 이로부터 토마토 식물을 재생할 수 있다. 식물 부분의 예에는 화분, 배주, 잎, 배아, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥, 꽃, 과일, 줄기, 가지로부터의 단일 세포 및 조직, 및 화분, 배주, 잎, 배아, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥, 꽃, 과일, 줄기, 가지, 접순, 근경, 씨, 원형질체, 캘러스 (callus) 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "집단"은 공통의 유전적 기원을 공유하는 식물의 유전적으로 이종인 집합체를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "토마토"는 라이코페르시콘 케라시포르메 (Lycopersicon cerasiforme), 라이코페르시콘 체스마니 (Lycopersicon cheesmanii), 라이코페르시콘 칠렌스 (Lycopersicon chilense), 라이코페르시콘 츠밀레우스키 (Lycopersicon chmielewskii), 라이코페르시콘 에스쿨렌툼 (Lycopersicon esculentum; 현재는 솔라눔 라이코페르시쿰), 라이코페르시콘 히르수툼 (Lycopersicon hirsutum), 라이코페르시콘 파르비플로룸 (Lycopersicon parviflorum), 라이코페르시콘 펜넬리 (Lycopersicon pennellii), 라이코페르시콘 페루비아눔 (Lycopersicon peruvianum), 라이코페르시콘 핌피넬리폴리움 (Lycopersicon pimpinellifolium) 또는 솔라눔 라이코페르시코이드 (Solanum lycopersicoide)를 비롯한 (이로 제한되지는 않음) 라이코페르시콘의 속명 하에 이전에 알려진 임의의 식물, 계통 또는 집단을 의미한다. 라이코페르시콘 에스쿨렌툼에 대한 새로 제안된 학명은 솔라눔 라이코페르시쿰이다. 유사하게, 야생형 종의 명칭은 변경될 수 있다. 엘. 펜넬리 (L. pennellii)는 솔라눔 펜넬리 (Solanum pennellii)가 될 수 있으며, 엘. 히르수툼 (L. hirsutum)은 에스. 하브로차이테스가 될 수 있고, 엘. 페루비아눔 (L. peruvianum)은 에스. '엔 페루비아눔' (S. 'N peruvianum'), 및 에스. '칼레존 데 후알레스' (S. 'Callejon de Huayles'), 에스. 페루비아눔 (S. peruvianum) 및 에스. 코르넬리뮐레리 (S. corneliomuelleri)로 분할할 수 있고, 엘. 파르비플로룸 (L. parviflorum)은 에스. 네오릭키 (S. neorickii)가 될 수 있고, 엘 츠밀레우스키 (L. chmielewskii)는 에스. 츠밀레우스키 (S. chmielewskii)가 될 수 있고, 엘. 칠렌스 (L. chilense)는 에스. 칠렌스 (S. chilense)가 될 수 있고, 엘. 체스마니아 (L. cheesmaniae)는 에스. 체스마니아 (S. cheesmaniae) 또는 에스. 칼라파겐스 (S. galapagense)가 될 수 있고, 엘. 핌피넬리폴리움 (L. pimpinellifolium)은 에스. 핌피넬리폴리움 (S. pimpinellifolium)이 될 수 있다 (문헌 [Solanacea Genome Network (2005) Spooner and Knapp] 및 http://www.sgn.cornell.edu/help/about/solanum_nomenclature.html 참조)
특히, 에스. 하브로차이테스는 털이 많은 과일을 산출하는 토마토 종으로 정의될 수 있으며, 반면 에스. 라이코페르시쿰는 털이 없는 과일을 산출하는 토마토 종이라는 점을 주목한다.
본원에서 사용되는 용어 "변종" 또는 품종"은 구조적 또는 유전적 특성 및/또는 성능이 동일한 종 내의 다른 변종과 구분될 수 있는 것인 유사한 식물의 군을 의미한다.
본원에서, "경작 식물"은 농경법적으로 바람직한 특성을 나타내는 식물로서 정의된다. 상기 용어는 용어 "야생"과 반대로 사용되며, 이는 바람직하지 않은 형질로 인해 즉각적인 상업적 이득이 없는 변종을 의미한다. 에스. 하브로차이테스는 바람직하지 않은 형질 (털 있는 과일)로 인해 즉각적인 상업적 이득이 없는 토마토 종으로서 정의할 수 있다.
본원에서 정의된 것과 같은 에스. 하브로차이테스로부터 유래된 단위결실을 부여하는 유전자 영역을 식물에서 청구하며, 여기서 상기 영역은 그의 유전적 배경 내에 있지 않다. 본원에서, 용어 "천연 유전적 배경"은 유전 요소의 최초 유전적 배경을 나타내기 위해 사용된다. 이러한 배경은 예를 들어 씨-함유 야생형 토마토의 게놈일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단위결실-부여 유전 요소는 솔라눔 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4, 5 및/또는 12상의 특정 위치에서 발견되었다. 예로서, 솔라눔 하브로차이테스 LYC4/78은 솔라눔 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4, 5 및/또는 12 상의 QTL의 천연 유전적 배경을 나타낸다. 솔라눔 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4로부터의 단위결실-부여 유전 요소 또는 그의 단위결실-부여 부분을 포함하는 DNA를 또 다른 토마토 종, 가장 특히 에스. 라이코페르시쿰의 염색체 4 상의 동일한 위치에 전달하는 것을 포함하는 방법은 단위결실-부여 유전 요소 또는 그의 단위결실-부여 유전자 부분이 그의 천연 유전적 배경에 있지 않게 되도록 할 것이다.
본원에서, 용어 "기능적 중성"은 당업계에 공지된 의미로 사용된다. 기능적 중성은 자가-중성으로 불리는 토마토에서 일어나는 보다 일반적인 특성의 형태로 여겨지며, 이는 아래 2가지 형태로 일어날 수 있다:
- 웅성 중성: 자화-수분이 가능하지 않는데, 이는 활동성 화분 (ms)의 부재 또는 퇴화된 수술 (sl, 무-수술) 때문이다. 웅성 중성이 상업적 씨 잡종 토마토 (씨)에 도입된 것인 경우, 재배자는 씨의 양을 2배로 뿌려야 하며, ms에 대한 마커 유전자에 의해 인식할 수 있는 이종접합 ms pk 식물의 50％를 심기 전에 제거해야 한다. 이는 과-교배 문제점에 의해 완전히 가능하지는 않다.
- 기능적 중성: 활동성 화분이 존재하지만, 꽃의 일부 형태학적 편향으로 인해 암술에 도달할 수 없다. 또한, 기능적 중성 (fs) 자체는 또한 아래 4가지 상이한 형태로 구별할 수 있다:
· ps-형: 수술의 강한 꼬임 및 단축 (shorting)의 결과로서의 나타난 화주 현상; 상기 특성은 일반적으로 화주의 쉬운 자화-수분 및 보다 낮은 수용성을 제공하며, 이는 잡종 씨 생산에 매우 적합하지 않도록 한다;
· ps-2-형 : 잡종 씨 생산에 성공적으로 사용되는 비 개방 꽃밥 백 형;
· ex-형 : 쉽게 자화-수분하며 주두의 낮은 수용성인 수술 상에서 나타난 화주는 잡종 씨 생산에 덜 적합하도록 한다;
· 짧은 화주-형 : 주두가 꽃밥 밑에 위치하며, 주요 단점은 그의 높은 자화-수분 수준이다.
잡종은 유전적으로 다른 양친 사이의 교배의 생산물이다. 일반적으로, 식물 번식 프로그램에서의 잡종의 발생은 동종접합 동종번식 계통의 발생, 이들 계통의 교배 및 교배의 평가를 요구한다. 대부분의 식물 번식 프로그램은 2개 이상의 동종번식 계통 또는 여러 다른 광범위한-기반의 공급원으로부터의 유전적 배경을 번식 풀에 합하며, 이로부터 새로운 동종번식 계통이 자가수정 및 원하는 표현형의 선별에 의해 발생된다. 또한, 잡종은 식물 번식 물질 공급원 또는 공급원 집단으로서 사용될 수 있으며, 이로부터 새로운 식물 계통이 발생하거나 또는 유래될 수 있다. 잡종에서의 형질의 발현은 2개 양친에 의해 발현된 양의 중간을 초과할 수 있으며, 이는 잡종 강세 (hybrid vigor)로서 알려져 있다.
당업계에 알려진 식물 번식 기법에는 반복 선택, 혈통 번식, 제한 길이 다형체 개선된 선택, 유전자 마커 개선된 선택 및 형질전환이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 동종번식 계통은 혈통 번식 및 반복 선택 번식과 같은 상기 방법을 사용하여 잡종으로부터 유래할 수 있다. 새롭게 발생된 동종번식을 다른 동종번식 계통과 교배하고, 이들 교배로부터의 잡종을 평가하여 상업적 가능성을 갖는지를 결정한다.
혈통 번식은 번식 시스템이며, 여기서 개체 식물을 각각 판단된 그의 바람직함 및 혈통 기록을 기준으로 교배로부터의 분리 세대 중에서 선별한다.
반복 선택은 선택된 개체의 이종교배, 이어서 선택 및 이종교배 사이클을 계속하여 집단에서 원하는 대립유전자의 빈도를 증가시키는 것을 기초로 하는 번식 방법이다.
반복 선택은 예를 들어 번식 시스템을 포함하는 역교배 번식에 의해 수행될 수 있으며, 이에 의해 반복 역교배가 특정 특징에 대한 선택이 수반된, 잡종의 양친 중 하나로 만들어진다. 역교배는 잡종과 그의 양친 중 하나와의 교배이다. 예를 들어, 역교배는 공여체 식물 계통에 존재하는 특정 바람직한 형질을 그 형질이 결여된 또 다른 우수한 식물 계통 (예를 들어, 동종번식 계통)에 전달하는데 사용할 수 있다. 상기 방법의 제1 단계는 우수한 식물 계통 (반복친)을 해당 형질에 대한 적절한 유전자를 갖는 공여체 식물 계통 (비-반복친)과 교배하는 것을 포함한다. 이후, 이들 교배의 자손을 우수한 반복친과 역으로 짝짓기시키고, 이어서 비-반복친으로부터 전달되는 원하는 형질에 대해 얻어진 자손 중에서 선택한다. 원하는 형질에 대한 선택 및 반복친으로부터 유전된 유전자원에 대한 선택을 갖는 5회 이상의 역교배 세대 이후, 자손은 전달되는 특성을 조절하는 좌위에 대해 동종접합이 될 것이나, 본질적으로 모든 다른 유전자에 대한 우월한 양친과 같을 것이다. 이후, 최후 역교배 세대를 자가수정하여, 전달되는 유전자에 대한 순수한 번식 자손을 얻는다. 전달된 유전자를 함유하는 동종교배로부터 발생된 잡종은 전달된 유전자 없는 동일한 동종교배로부터 발생된 잡종과 본질적으로 같다.
토마토를 비롯한 다양한 작물에서 상이한 형질을 얻기 위해 통상적으로 사용되는 번식 방법의 일반적 기재는 예를 들어 문헌 [Allard, R. W. (1960) Principles of Plant Breeding]; [Simmonds, N. W. (1979) Principles of Crop Improvement]; [Sneep, J. et al., (1979) Tomato breeding (p. 135-171) in: Breeding of Vegetable Crops, Mark J. Basset, (1986, editor), The Tomato crop: a scientific basis for improvement, by Atherton, J. G. & J. Rudich, (1986, editors)]; [Plant Breeding Perspectives; Fehr, (1987) Principles of Cultivar Development Theory and Technique)]과 같은 참고문헌에서 찾아볼 수 있다.
농작물은 식물의 수분 방법을 이용하는 기법을 통해 번식된다. 한 꽃으로부터의 화분이 동일한 식물의 동일하거나 또는 또 다른 꽃에 전달되는 경우 식물은 자화-수분된다. 화분이 상이한 식물의 꽃으로부터 비롯된 경우 식물은 타화-수분된다. 자화-수분되고 여러 세대에 대한 형태에 대해 선택된 식물은 거의 대부분의 모든 유전자 좌위에서 동종접합이 되며, 순종 번식 자손의 동형 집단 (uniform population)을 생산한다. 2개 상이한 동종접합 계통 사이의 교배는 여러 유전자 좌위에 대해 이종접합일 수 있는 잡종 식물의 동형 집단을 생산한다. 여러 유전자 좌위에서 각각 이종접합인 2개 식물의 교배는 유전적으로 상이한 잡종 식물의 집단을 생산할 것이며, 동형이 아닐 것이다.
토마토 (라이코페르시콘 에스쿨렌툼 엘. (Lycopersicon esculentum L.) 또는 가든 토마토)는 솔라나세아 (solanaceae) (나이트쉐이드 (nightshade)) 과, 솔라눔 속, 라이코페르시콘 아속에 속한다. 다른 중요한 솔라나세아에는 감자 (솔라눔 투베로숨 (Solanum tuberosum)) 및 오베르진 (aubergine) 또는 가지 (솔라눔 멜론게나 (Solanum melongena))가 포함된다. 엘. 에스쿨렌툼 (L. esculentum) 종에서의 모든 변종은 자화-수분한다. 라이코페르시콘 (Lycopersicon) 아속에서의 대부분의 다른 종, 예컨대 엘. 핌피넬리폴리움 (L. pimpinellifolium; 방울 토마토), 엘. 히르수툼 (L. hirsutum; 털 있는 토마토) 및 엘. 페루비아눔 (L. peruvianum; 페루산 토마토)은 타화-수분한다. 바람직하게는, 엘. 에스쿨레툼 (L. esculentum)의 동종번식 번식자 계통은 이에 따라 원치않는 자화-수분으로 인한 유전자 변화를 막기 위해 웅성 중성이다. 유리하게는, 씨 생산의 비용이 이러한 웅성 중성 식물에서 감소된다.
일반적으로, 토마토 식물 번식 프로그램에서의 잡종 토마토 변종의 발생은 다음의 3가지 단계를 포함한다: (1) 초기 번식 교배를 위한 여러 유전자원 풀로부터 식물을 선택하는 단계; (2) 여러 세대 동안 번식 교배로부터의 선택된 식물을 자가수정하여, 비록 서로 상이하지만 순종 번식하며 고도로 동형인 동종교배 계통 부류를 생산하는 단계; 및 (3) 선택된 동종교배 계통을 토마토의 관련되지 않은 동종교배 계통 또는 야생형 종과 교배하여 잡종 자손 (F1)을 생산하는 단계. 토마토에서의 동종번식 과정 동안, 계통의 강세가 점차 감소된다. 동종교배 계통을 또 다른 토마토 식물 (예를 들어 또 다른 동종교배 또는 야생 변종)과 교배하여 잡종 자손 (F1)을 생산하는 경우 강세는 회복된다. 동종교배 계통의 동종접합성 및 동질성의 중요한 결과는 정의된 동종교배 쌍의 교배에 의해 생성된 잡종이 항상 동일할 것이라는 것이다. 일단 우수한 잡종을 생산하는 동종교배가 확인되면, 잡종 씨의 계속적 공급은 이들 동종교배 양친을 사용하여 생성할 수 있으며, 이후 잡종 토마토 식물을 상기 잡종 씨 공급으로부터 발생시킬 수 있다.
식물 번식 분야에서 고려되는 많은 중요한 인자, 예컨대 중요한 형태학 및 생리학적 특성을 인식하는 능력, 흥미있는 유전자형 및 표현형 형질에 대한 평가 기법을 설계하는 능력, 및 신규 또는 개선된 조합에서의 원하는 형질에 대한 유전자를 탐색 및 개발하는 능력이 있다.
토마토 식물 번식 프로그램으로부터 생성된 시판 토마토 잡종 계통 발생의 목적은 새로운 동종번식 계통을 발생하여 높은 산출 및 우수한 농경법적 성능의 생성을 겸비하는 잡종을 생산하기 위한 것이다. 비록 주요 형질 번식자가 추구하는 것은 산출이지만, 여러 다른 주요 농경법적 형질이 잡종 조합에서 중요하며, 산출에 대한 영향을 갖거나 또는 달리 잡종 조합에서 우수한 성능을 제공한다. 이러한 형질에는 높은 작물 잠재력, 해충을 비롯한 질환에 대한 내성, 스트레스, 예컨대 가뭄 및 열 스트레스에 대한 내성, 토마토 과일의 풍미, 색상 모양 및 저장 수명이 포함된다. 추가적으로, 계통 자체는 양친 형질에 대한 허용가능한 성능, 예컨대 씨 산출 및 화분 생산을 가져야 하며, 이는 잡종화에 대한 충분한 양 및 질로 양친 계통을 제공하기 위한 능력에 영향을 미친다. 이러한 형질은 유전자 조절 하에 있으며, 모든 형질이 복수 유전자에 의해 영향을 받지 않는 것인 여러 경우 나타났다.
잡종 토마토 식물의 생산에 대하여, 연속 자가수정 및 여러 번식 계통을 선택하여 동종접합 계통에서의 이들 계통의 유전자를 합하는 것을 포함하는 통상적인 번식 방법에 의해 임의의 동종번식 라이코페르시콘 에스쿨레툼 (Lycopersicon esculentum) 계통을 발생시킬 수 있다. 이후, 과일의 토양-전염성 병원체, 및 뿌리 및 줄기 질환에 대한 내성, 큰 크기, 견뢰도 및 색, 및 또한 유리한 뿌리 및 줄기 발생을 기준으로 한 혈통 선택을 여러 후속 세대에 적용하여 언급된 동종번식 양친 계통을 수득할 수 있다. 이후, 동종번식 계통을 바람직하게는 자화-수분하고, 충분한 수의 세대 동안 심어, 그의 동종접합 유전자형의 형질 특성의 동형성 및 표현형 안정성을 보장한다. 변형체 형질이 관찰되지 않는 경우, 특징은 안정하다.
솔라눔 (Solanum) 내에서, 솔라눔 펜넬리 (Solanum pennellii) LA716 (문헌 [Eshed et al. 1994]), 에스. 하브로차이테스 LA1777 (문헌 [Monforte et al. 2000a]) 및 솔라눔 라이코페르시코이드 (Solanum lycopersicoide) LA2951 (문헌 [Canady et al. 2005])에 대한 IL이 발생되어 왔다. 이러한 집단은 양적 형질의 확인 (문헌 [Eshed et al. 1995]; [Rousseaux et al. 2005]), QTL의 정밀 맵핑 (문헌 [Fridman et al. 2004]; [Monforte et al. 2001]; [Monforte et al. 2000b]), 및 QTL 클로닝 (문헌 [Frary et al. 2000]; [Fridman et al. 2000]; [Ku et al. 2001])에서 매우 유용한 것으로 나타났다.
현재, 에스. 하브로차이테스 LA1777 IL 집단은 유한 성장 에스. 라이코페르시쿰 E6203에서 존재한다 (문헌 [Monforte et al. 2000a]).
본원에서, 본 발명자들은 무한 성장 경작된 토마토 에스. 라이코페르시쿰 시브이. 머니메이커의 배경에서의 에스. 하브로차이테스 LYC4/78으로부터의 유전자이입을 기초로 한 에스. 하브로차이테스의 제2 IL 집단의 발생, 및 씨없는 단위결실 토마토 식물의 집단에서의 계통의 용도를 기재한다.
바람직하게는, 본 발명의 식물은 웅성 중성이다. 웅성 중성은 특정 교배, 예컨대 계통 DRS 5.1에서 발견되는 기능적 웅성 중성에 존재할 수 있다. 별법으로, 웅성 중성은 공여체 식물로서 기능적 웅성 중성을 부여하는 ps-2 유전자를 함유하는 계통을 사용하며, 원하는 식물 계통으로의 유전자를 유전자이입하여 도입할 수 있다.
기능적 웅성 중성은 잡종 씨의 생산에 대한 중요한 형질이다. 토마토에서의 기능적 웅성 중성을 코딩하는 유전자 중 하나는 위치적 중성 유전자 ps-2이다. ps-2는 단일유전자 열성이며, 비-열개성 (dehiscent) 꽃밥을 부여하고, 실제 사용에 가장 적합하다. 분자-보조 선택 (MAS)을 위한 마커가 개발되어 왔다 (문헌 [Gorguet et al., 2006. Theor. Appl. Genet, 113(8):1437-1448]). 이는 기능적 웅성 중성 계통 (ps-2/ps-2; 솔라눔 라이코페르시쿰) 및 기능적 웅성 수정 계통 (에스. 핌피넬리폴리움 (S. pimpinellifolium)) 간의 이종 교배로부터 유래된 F2 분리 집단에서 수행되었다. ps-2 좌위는 염색체 4의 단완 상에서 마커 T0958 및 T0635에 의해 범위가 정해진 1.65 cM 간격으로 존재하는 것으로 발견되었다. 또한, 이 영역은 여러 COS 마커를 포함하며, 이는 MAS에서 유용할 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들어 EP1428425에서 상세하게 기재된 것과 같은 씨없는 식물을 생산하기 위한 방법을 사용하도록 할 수 있으며, 여기서 아래 추가로 논의되는 단계를 포함하는 방법에 의해 fs/pk-복합체 식물을 생산할 수 있다:
a. 본원에서 정의된 것과 같은 "최초 씨없는 양친"을 본원에서 정의된 것과 같은 "최초 비-씨없는 양친"과 교배하여 비-씨없는 F1 세대를 제공하는 단계;
b. 이에 따라 얻어진 F1 세대를 자화-수분시켜, 본원에서 F2 세대로도 지칭되는 추가의 세대를 제공하는 단계;
c1. 이에 따라 얻어진 씨없는 표현형을 갖는 임의의 F2 식물을 선택하고, 이들 씨없는 식물을 자화-수분 유발시켜, 제1 F3 세대를 제공하는 단계; 및 또한
c2. 이에 따라 얻어진 기능적 중성 표현형을 갖는 임의의 F2 식물을 선택하고, 이들 식물을 자화-수분 유발시켜 제2 F3 세대를 제공하는 단계;
d. 씨없는 표현형을 갖는 임의의 제1 또는 제2 F3 세대 식물을 선택하는 단계;
e. 씨없는 표현형을 갖는 제1 또는 제2 F3 세대의 식물을 자화-수분 유발시키켜 F4 세대를 제공하는 단계;
f. 이에 따라 얻어진 씨없는 표현형을 갖는 F4 세대의 식물을 자화-수분 유발시켜 F5 세대를 제공하고, 임의로 이에 따라 얻어진 씨없는 표현형을 갖는 F5 세대의 식물을 자화-수분 유발시켜 F6 세대를 제공하는 단계.
보통 F5 세대에 의해, 및 특히 단계 e)에서 얻어진 F6 세대에 의해, 이에 따라 얻어진 식물에서의 pk,fs 복합체는 충분히 안정화된다는, 즉 본 발명에서 pk,fs 양친으로서 사용되거나 또는 즉 추가 특성에서의 교배 또는 역교배에 의해 다른 pk,fs 양친 (계통)을 얻기 위한 출발 식물 또는 계통으로서 사용되는 토마토 식물에 대하여 "정착"된다는 것이 EP1428425에서 보고되었다. F3, F4, F5, F6 및 추가 세대가 씨없는 표현형 (또는 "제2 F3 세대"의 경우에서 적어도 하나의 기능적 중성 표현형)을 가지기 때문에, F4, F5, F6 및 추가 세대를 얻는 것, 및 씨없는 잡종의 생산을 위한 pk,fs 양친 계통의 유지는 하기 정의되는 것과 같은 인간 개입을 요구할 것이다. 또한, 추가 세대를 제공하기 위한 인간 개입에 대한 이러한 요건은 일반적으로 본원에서 "자화-수분 유발"로 불린다. F2가 보통 100개 F2 식물 중 오직 최대 약 1개 또는 2개 씨없는 식물을 포함할 것이지만, 사용되는 최초 씨없는 양친 및 특히 최초 비-씨없는 양친에 따라 비-씨없는 식물을 제공할 수도 있다는 것이 EP1428425에서 보고되었다. 비록 씨없는 F2 식물을 얻는 경우에도, 이중 열성 pat-2 및 ps-2의 존재가 그 자체로 씨없는 표현형을 제공하기에 충분한 경우 그의 양 (즉, 1 내지 5％)은 멘델 법칙에 따라 예상되는 것인 8.25％ (즉, 16개 중 1개 식물)에 비해 실질적으로 적다는 것이 발견되었다. 이는 초기 비-씨없는 양친과의 교배가 F2에서 씨없는 표현형의 출현에 음으로 영향을 미치는 몇몇 (아마도 우성) 유전자, 대립유전자 또는 다른 유전 인자를 명백히 도입한다는 것을 나타낸다. F2는 최초 씨없는 양친 및 특히 최초 비-씨없는 양친에 따라 몇몇 기능적 중성 식물, 즉 보통 100개 중 약 10개 내지 15개 식물을 포함하는 것을 발견하였다. 이는 또한 이중 열성 ps-2의 존재 자체가 기능적 중성 표현형을 제공하기에 충분한 경우 멘델 법칙에 따라 예상되는 것인 25％에 비해 적다. 또한, 이는 원하는 기능적 중성 표현형의 존재가 유전 인자의 복합체에 의해 결정된다는 것을 나타낸다.
추가적으로, EP1428425에 기재된 방법은 F2로부터의 씨없는 식물을 선택하고, 자화-수분을 유발시켜, 본원에서 "제1 F3 세대"로도 지칭되는 F3을 제공하도록 하는 것을 포함한다. F2 식물의 씨없는 표현형에도 불구하고, 때때로 이에 따라 얻어진 F3 식물 모두에서 F2 식물의 씨없는 표현형을 나타내지는 않을 것이며, 0 내지 100％, 보다 종종 약 10 내지 20％의 F3 식물을 형성할 수 있다고 보고되었다. 추측컨대, 이는 상기 F2 식물에서의 씨없는 표현형이 유전자 복합체 (즉, 본 발명의 pk,fs 복합체)에 의해 유발되며, 최초 씨없는 양친에서와 같이 동종접합체 열성 pat-2 및 ps-2 유전자 단독에 의해 유발되지 않는다는 것을 확인하였다. 또한, 추측컨대 F2에서 pk,fs 복합체가 완전한 씨없는 자손을 제공하기에 충분히 고정되지 않는다는, 즉 유전적으로 충분히 균질하지 않다는 것을 나타내었다.
이로 인해, 상기와 같이 얻어진 씨없는 F2 식물은 또한 EP1428425에서 기재된 발명에서의 pk,fs 양친으로서의 사용에 적합하지 않았다. 씨없는 표현형을 나타내는 제1 F3 세대의 식물을 선택하고, 자화-수분을 유발시켜, F4를 제공하도록 하였다. 다시, 씨없는 F3 식물로부터 얻어진 모든 F4 식물이 씨없는 표현형을 나타내지는 않는다는 것이 보통 발견되었으며, 씨없는 F4 식물의 양은 모든 F4 식물의 0 내지 100％로 변할 수 있고, 보통 약 10 내지 20％이다. 또한, 모든 F4 식물에서 모든 환경 조건 하에 씨없는 식물이 되는 것으로 발견되지는 않았다. 추측컨대, 이는 또한 pk,fs 복합체가 EP1428425에서 기재된 본 발명에서의 pk,fs 양친으로서 사용되는 이들에 대하여 F4 식물의 상기 F3에서 아직 충분히 정착되지 않았음을 나타내었다. 이후, F4로부터의 씨없는 식물을 다시 자화-수분 유발시켜 F5를 제공하며, 상기 F5로부터의 씨없는 식물을 자화-수분 유발시켜 F6을 생산한다. 다시, F5 및 때때로 F6에서, 일부 비-씨없는 식물을 얻었는데, 추측컨대 pk,fs 복합체가 씨없는 F4 또는 F5에서 각각 아직 충분히 정착되지 않았기 때문이다. 보통, F6 세대에 의해, 씨없는 F6 식물에서의 pk,fs 복합체는 충분히 안정하게 되는 것으로 고려되어, 모든 씨없는 F6 식물은 자화-수분 유발되는 경우 씨없는 F7 식물을 배타적으로 제공한다. 추측컨대, 이는 이에 따라 얻어진 F6 동종번식이 EP1428425에서 기재된 본 발명에서의 pk,fs 양친으로서 사용할 수 있다는 것도 언급한다. F7이 일부 비-씨없는 식물을 제공하는 경우, F7을 다시 자화-수분 유발시켜, 세대를 얻을 때까지 F8 등을 제공할 수 있으며, 여기서 pk,fs 복합체는 충분히 정착된다. 그러나, 보통 상기 사항은 필요하지 않으며, 바람직하지도 않다. 또한, F9 및 특히 F10 세대에 의해 pk,fs 복합체가 여전히 충분히 정착되지 않은 경우, 보통 이러한 동종번식 계통을 EP1428425에서 기재된 본 발명에서의 pk,fs 양친 계통으로서 사용할 수 없다고 추정될 것이다.
일반적으로, 최초 씨없는 양친, 특히 사용되는 최초 비-씨없는 양친에 따라 오직 소량의 씨없는 F2 식물이 F6으로 "나타날" 것이다. 또한, F6의 발생에서, 모든 환경 조건 하에서 씨없는 표현형의 안정성 및 신뢰도를 시험하기 위해 일부 선택압을 적용할 수 있다. 예를 들어, 빛, 온도와 같은 인자를 사용하여 F3, F4, F5 또는 F6의 씨없는 표현형의 안정성을 "시험"하고/거나 정착시킬 수 있다. 씨없는 F2 식물 이외에, 기능적 중성의 표현형만을 나타내는 F2 식물 또한 자화-수분 유발시켜, 본원에서 "제2 F3 세대"로도 지칭되는 F3 세대를 제공한다. 보통, 상기 제2 F3 세대는 필수적으로 모든 기능적 중성 식물을 포함할 것이며, 일부 씨없는 식물, 즉 40개 F3 식물 중 약 1 내지 3개를 포함할 수 있다 (이는 쉽게 이해하고 선택할 수 있는데, 이들이 과일로 성장하는 제2 F3 중 오직 하나이기 때문이다). 만일 그렇다면, 이러한 씨없는 F3 식물을 자화-수분 유발시켜, 필수적으로 제1 F3 세대에 대해 기재된 것과 같이 F4, 이어서 F5 및 F6, 및 임의로 F7 및 F8 등을 제공한다. 다시, 사용된 최초 씨없는 양친 및 특히 최초 비-씨없는 양친에 따라 제2 F3 세대의 모든 씨없는 식물이 F6으로 나타나지는 않을 것이다.
상기 방법론에서, 최초 씨없는 양친 및 최초 비-씨없는 양친의 주어진 조합에 대하여, F2 및 오직 일부의 기능적 중성 식물에서 씨없는 식물을 얻지 않는 것이 가능하다. 이후, 이러한 기능적 중성 F2 식물을 자화-수분 유발시킨다. 그러나, 이에 따라 얻어진 F3에서, 씨없는 식물이 다시 발견되지 않는 경우, 본 발명에 따른 pk,fs 양친을 제공하기 위해 최초 씨없는 양친 및 최초 비-씨없는 양친의 특정 조합을 사용할 수 없다고 추측될 것이다. 이에 대한 가능한 설명은 사용되는 최초 비-씨없는 양친이 사용되는 최초 씨없는 양친에서 이미 존재하는 유전자에 비해 pk,fs 복합체를 "완성"하는데 필요한 모든 유전적 인자 (즉, 유전자, 대립유전자 또는 다른 인자)를 함유하지 않았다는 것일 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가의 측면에서 토마토에 대한 경작 물질 (cultivation material), 예컨대 씨 또는 묘목 (임의로 컨테이너 내), 및 또한 상기 기재된 것과 같이 얻고/거나 얻을 수 있고/거나, 본원에서 기재된 방법에서 사용하기에 적합한 씨없는 토마토에 관한 것이다.
또한, 본 발명에 따른 단위결실 토마토는 공지된 방식으로 토마토 제품, 특히 식품으로 추가로 가공할 수 있으며, 이는 최종 사용에 용이하거나 또는 적합한 형태이거나 또는 아닐 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명에 따른 토마토는 제조 과정에서 씨/종자를 제거하기 위한 추가의 단계 없이 바로 가공될 수 있다는 이점을 갖는다.
따라서, 본 발명은 추가의 측면에서 본 발명에 따른 씨없는 토마토로부터 얻어진 제품, 특히 식품, 및 또한 상기 식품을 얻기 위한 방법에 관한 것이며, 여기서 토마토는 씨를 제거하기 위한 별도의 단계 없이 이들 제품으로 가공된다. 따라서, 이러한 방법은 특히 토마토를 다른 방식으로 퓨레화 또는 매쉬하는 단계, 임의로 이어서 추가의 원하는 성분을 도입 또는 첨가하는 단계, 이에 따라 얻어진 씨 또는 그의 잔류물이 없는 토마토 제품을 보관, 운반 또는 판매에 적합한 컨테이너에 패키징하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 방법은 토마토의 매쉬 및 제품의 패키징 사이에 임의의 종자/씨를 제거하기 위한 단계를 포함하지 않는다.
본원에서 개시된 것과 같은 유전 요소는 웅성 중성을 제공하며, 그 결과 씨 세트의 수정은 없다.
본 발명의 방법 및 식물은 단위결실이 되는 것 이외에 또한 바람직하게는 웅성 중성, 가장 바람직하게는 기능적 중성, 예컨대 위치적 중성이다. 게다가, 본원에서 개시된 것과 같은 유전 요소는 이에 의해 과일 세트가 수정 없이 일어나는 현상인 단위결실을 제공한다.
단위결실 및/또는 웅성 중성을 제공하는 것 이외에, 본원에서 개시된 것과 같은 유전 요소는 과일 수율에서 증가를 제공한다. 본 발명의 단위결실 식물의 이점은 상응하는 시간에 수확된 비-씨없는 토마토에 비해 보다 높은, 즉 토마토의 총 중량을 기준으로 1, 2, 5, 10, 25 또는 35％ 이상의 과육 함량 (건조 중량으로 표현됨)을 갖는 과일을 생산한다는 점이다 (즉, 약 110 내지 120 그램의 수확시의 총 중량에 대하여 비-씨없는 토마토에 대한 약 4.5 내지 5.5 그램의 건조 물질에 비해 씨없는 토마토에 대한 평균 약 5.5 내지 6.5 그램의 건조 물질). 건조 물질 수율에 있어서, 이는 약 20％ 이상의 증가를 의미한다 (여기서 추가로 비-씨없는 토마토의 건조 물질은 여전히 종자를 포함할 것이다).
웅성 중성의 사용에 의해, 당업자들은 식물에서 단위결실을 이제 발견할 수 있다. 보통, 단위결실은 씨 세트가 발견되는 경우 여전히 검출되지 않을 수 있다 (차폐됨). 단위결실 식물 및 숨겨진 단위결실을 갖는 식물 간의 교배의 자손을 교배하고, 씨 없는 과일 세트에 대한 교배를 시험하여 이러한 숨겨진 단위결실을 발견할 수 있다.
바람직하게는, 본원에서 정의된 것과 같은 유전자이입은 동종접합 형태에 존재한다.
또한, 본 발명은 이제 에스. 하브로차이테스 LYC4/78로부터 유래된 단위결실 표현형을 유발하는 유전자를 클로닝하기 위한 방법을 제공하는 가능성을 제공한다.
실시예 1
적합한 유전적 구성을 갖는 후보 양친 식물의 선택을 포함하는 보다 효과적인 번식 과정을 이루기 위해, 하나 이상의 후보 양친 식물 중 유전적 구성의 존재를 나타내는 하나 이상의 유전자 마커를 그의 배치에서 갖는 것이 필요하다. 선택된 식물의 교배를 포함하며, 마커 보조 선택 (MAS)으로 지칭되는 상기 방법은 유리한 양친 대립유전자를 공여체로부터 수용체 집단으로 효과적으로 전달하며, 번식이 더이상 동시발생에 의존적이지 않으며 발생 비용의 관점에서 보다 더 효과적이도록 보장한다.
재료 & 방법
식물 물질 및 IL의 발생
식물 유전자 및 작물 식물 연구소 (Institute for Plant Genetics and Crop Plant Research; 독일 가테르슬레벤 (Gatersleben, Germany))에 위치한 유전자 은행으로부터 솔라눔 하브로차이테스 LYC4/78의 씨 (이후 LYC4/78로 지칭함; 1978년의 씨 배치)를 얻었다.
드 루이터 시즈 알앤디 비브이 (De Ruiter Seeds R&D BV; 네덜란드 베르크쉐엔후크 (Bergschenhoek, The Netherlands)의 씨 은행으로부터 솔라눔 라이코페르시 쿰 시브이. 머니메이커 (이후 머니메이커로 지칭함)의 씨를 얻었다.
머니메이커 및 LYC4/78 간의 이종 교배를 달성하여 F1 씨를 생산하였다. F1 씨를 F1 식물로 성장시켰다. 한 F1 식물의 자가수정으로부터 유래된 F2 씨를 뿌려 174 개체의 F2 집단을 얻었다. 반복 및 자성 양친으로서 머니메이커와의 2회 역교배에 의해 59 개체의 BC2 (역교배 2) 집단을 발생시켰다. MAS를 사용하여, 2가지 확인된 단위결실-부여 유전 요소 중 하나를 포함하는 BC2, BC3 및 BC4 유전자형을 선택하였으며, 일부 BC2를 자화-수분하여 BC2S1 씨를 생산하였다 (도 2 참조). 상기 언급된 것과 같이, 하나의 F1 식물을 자화-수분하여 F2 씨를 얻었으며, SL로 역교배하여 BC1 씨를 얻었다. 먼저, F2 씨를 유전 연관 지도의 작성에 사용하였다. BC1 씨를 사용하여 IL을 발생시켰다 (도 3).
DNA 단리 및 마커 분석
게놈 DNA를 문헌 [Steward and Via (1993)]에 따른 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB) 계 프로토콜을 사용하여 2개 어린 (말린) 잎으로부터 단리시키고, 고효율 DNA 단리를 위해 1 ml 마이크로 튜브 (마이크로닉 비브이 (Micronic BV; 네덜란드 렐리스타드 (Lelystad, The Netherlands)))를 사용하여 조절하고, 레치 (Retsch) 300 mm 진탕기 (레치 비브이 (Retsch BV; 네덜란드 옥텐 (Ochten, The Netherlands)))를 사용하여 최대 속도에서 분쇄하였다. 필수적으로 마이벅 (Myburg; 문헌 [Myburg et al. 2001])에 의해 공개된 방법에 따라서 F2, BC2, BC3, BC4 및 BC2S1 집단의 AFLP 분석 (문헌 [Vos et al., 1995])을 수행하고, AFLP 단편을 LI-COR 4200 DNA 시퀀서에서 분리하였다. 선택적 Pst 프라이머를 IRD 700 또는 IRD 800 형광 표지로 표지하였다. AFLP-퀀타르 프로 (Quantar Pro) 소프트웨어 패키지 (케이겐 비브이 (Keygene BV; 네덜란드 바게닝겐 (Wageningen, The Netherlands)))를 사용하여 AFLP 겔 이미지를 스코어링하였다. 다음의 10가지 프라이머 조합 및 어댑터 서열 (adapter sequence)을 유전자형 분석 (genotyping)에 사용하였다: P14M48, P14M49, P14M50, P14M60, P14M61, P15M48, P18M50, P18M51, P22M50 및 P22M51 (문헌 [Bai et al. (2003)]에 의해 기재된 것과 같음).
F
2
집단의 표현형 분석
과일 크기 (산출, 과일 중량, 과일 높이, 과일 지름) 및 씨 세트 (SS)에서의 변화를 머니메이커 × LYC4/78 사이의 교배로부터 유래된 F2 집단의 교배 개체로부터 얻어진 식물에서 측정하였다 (표 1 참조). 대조군 (머니메이커 [SL] 바닥 줄)에 비해 씨없는 (SS-) 식물이며, 표준 과일 크기를 나타내는 식물을 단위결실로서 고려하였다.
a 던넷 (Dunnett) 검정을 사용하여 측정된 것과 같은 SL로부터의 유의 편차를 각각의 평균값 옆에 제시한다. P < 0.05 (*) 또는 P < 0.01 (**)의 확률을 나타낸다.
산출 (Kg)
FW: 과일 중량 (그램)
FH: 과일 높이 (mm)
FD: 과일 지름 (mm)
SS: 씨 세트
분자 마커 & 유전 연관 지도
머니메이커 × LYC4/78의 교배로부터 유래된 F2 집단 (n = 174)에 대해 유전 연관 지도를 계산하였다. 10개 프라이머 조합을 사용하여 F2 집단 (n = 174)에서 218개 증폭된 단편 길이 다형체 (AFLP) 마커를 얻었다. 총 69개 마커 (31.7％)를 공동-우세하게 (co-dominatly) 쉽게 스코어링할 수 있었으며, 따라서 통합된 F2 유전 연관 지도를 계산하도록 한다. BC2, BC3 및 BC2S1 유전자형에서 수행된 마커 분석은 추가의 145개 AFLP 마커를 추가하도록 한다. 이들 145개 추가 AFLP 중 총 102개를 먼저 스코어링하지는 않았는데, F2 겔의 복잡성 때문이다. 총 유전 연관 지도는 14개 연관 군의 315개 AFLP 마커로 구성되며, 958 cM의 총 길이를 갖는다. 종 내의 공동-이동 AFLP 마커가 일반적으로 대립유전자 특이적이기 때문에, 다른 AFLP 연관 지도와의 공동-선형성을 사용하여 연관 군을 염색체에 할당하였다. 몇몇 머니메이커 특이적 AFLP 마커는 출판된 문헌 (문헌 [Haanstra et al. 1999]; [Bai et al. 2003])과 같은 유전 연관 지도와 함께 통용되었으며, 이에 따라 일부 연관 군을 확인된 단위결실-부여 유전 요소를 갖는 연관 군을 비롯한 염색체에 할당할 수 있었다. 단위결실-부여 유전 요소 간격에서의 연관 지도를 개선하기 위해, 진단 CAPS 마커를 출판된 에스. 라이코페르시쿰 × 엘. 펜넬리 (L. pennellii) 지도를 기초로 이들 영역에 추가하였다 (문헌 [Tanksley et al. 1992]; [Haanstra et al. 1999]).
마커 분석
게놈 DNA를 문헌 [Steward et al. (1993)]에 따른 CTAB 계 프로토콜을 사용하여 2개 어린 (말린) 잎으로부터 단리하고, 고효율 DNA 단리를 위해 1 ml 마이크로 튜브 (마이크로닉 비브이 (네덜란드 렐리스타드))를 사용하여 조절하고, 레치 300 mm 진탕기 (레치 비브이 (네덜란드 옥텐))를 사용하여 최대 속도에서 분쇄하였다.
필수적으로 문헌 [Myburg (2001)]에 의해 출판된 방법에 따라서, 각 역교배 및 IR의 AFLPTM 분석 (문헌 [Vos et al. 1995])을 수행하고, AFLP 단편을 LI-COR 4200 DNA 시퀀서에서 분리하였다. 선택성 Pst 프라이머를 IRD 700 또는 IRD 800 형광 표지로 표지하였다. AFLP 겔 이미지를 AFLP-퀀타르TM 프로 소프트웨어 패키지 (http://www.keygene-products.com)를 사용하여 스코어링하였다. 프라이머 및 어댑터 서열은 문헌 [Bai et al (2003)]에 의해 기재되어 있다.
CAPS 프라이머 세트는 "솔라나세아 게노믹스 웹사이트 (Solanaceae Genomics Website)" (http://sgn.cornell.edu)로부터 얻거나, 또는 동일한 공급원으로부터 이용가능한 게놈 또는 cDNA 클론의 서열에서 설계하였다. 문헌 [Brugmans et al (2003)]에 의해 기재된 CAPS 분해 방법을 사용하여 에스. 하브로차이테스 및 에스. 라이코페르시쿰 사이의 다형체를 측정하였다. 유전자형에 사용되는 마커 서얼, PCR 조건 및 특정 제한 엔도뉴클레아제를 표 30에 도시한다. 일반적으로 2.5％ 아가로스 겔을 사용하여 PCT 생성물을 분리하였다. 표 31에서, 에스. 라이코페르시쿰 및 에스. 하브로차이테스 사이를 구분하는 상이한 분해 생성물을 흥미있는 QTL에서 발견된 표 30의 각 마커에 대해 언급하였다.
결과
IL 집단
에스. 라이코페르시쿰 시브이. 머니메이커 (SL)의 유전적 배경에서의 에스. 하브로차이테스 LYC4/78 (SH)의 유전자이입 계통 (IL) 집단을 발생시켰다. SL 및 SH 간의 교배로부터 유래된 한 F1 식물을 SL로 역교배하였다 (도 2). 후속적으로, 14개 BC1 식물의 무작위 세트를 SL로 역교배하여, BC2 자손 (n = 59)을 얻었다. 모든 BC2 식물의 유전자형을 분석하고, 선택된 세트를 SL로 역교배하였다. 상기 세트는 합쳐진 유전자이입이 가능한 한 많은 SH 게놈을 커버하도록 선택하고, 재조합체의 선택은 각각의 외래 염색체가 3가지 IL로 표현되도록 하였다. 이러한 선택 및 역교배 과정을 BC5까지 반복하였다. 주로 1개 또는 2개의 유전자이입을 포함하는 31개 선택된 BC5 식물을 자화-수분하였다. 31개 BC5S1 계열 중 각각의 12개 식물까지 자화-수분하고, AFLP 마커로 스크리닝하여, 유전자이입을 위한 BC5S2 자손 (n = 44) 동종접합을 얻었다. 44개 IL의 마커를 1회 더 스크리닝하고, 30개 IL의 핵심 세트를 선택하였다. 상기 핵심 세트는 가능한 한 적은 IL에서 SH 게놈의 최대 범위를 나타낸다 (도 3). 핵심 세트는 단일 유전자이입을 갖는 15개 IL, 2개 유전자이입을 포함하는 10개 IL, 3개 유전자이입을 포함하는 4개 IL로 구성되되, 1개 IL은 여전히 4개 동종접합 유전자이입을 포함하였다. 평균적으로, 각 IL은 60 cM (= 5.2％)의 SH 게놈을 포함하며, 유전자이입의 길이는 20 (1.7％) 내지 122 cM (10.6％)에서 변하였다. 본 발명의 IL 집단은 95％의 최초 F2 연관 지도의 길이를 커버한다. 그러나, 본 발명자들은 이러한 F2 연관 맵이 게놈을 완전히 커버하지는 않는다는 것을 이해한다. 이는 염색체 3 (단완의 상부), 4 (단완의 상부), 5 (장완) 및 9 (단완의 상부)에서의 추가의 CAPS 분석에 의해 예시되며, 여기서 CAPS 마커는 AFLP계 F2 연관 지도에서 마커가 없는 유전자이입을 나타내었다. 이들 유전자이입의 크기를 고 밀도 RFLP 지도를 기준으로 평가하였다 (문헌 [Tanksley et al. 1992]; http://www.sgn.cornell.edu). 이전의 스크리닝을 염색체 3의 상부에 적용하지 않았기 때문에, 이 영역에 대한 IL은 이종접합이다. IL5-1 및 5-2에 대한 동종접합 SH가 되도록 선택된 식물은 씨를 맺는데 실패하여, 이에 따라 이들 계통은 그의 이종접합 상태를 유지하였다. 염색체 8의 단완의 상부 및 염색체 2의 장완의 하부를 포함하는 IL은 존재하지 않았다. 염색체 7 및 9의 단완의 상부에서의 유전자이입은 다중 IL에서 존재한다. 염색체 9의 상부에 대한 선택은 이들 영역에 특이적인 CAPS 마커의 발생 이후에만 가능하였다. 상기 본 설명에서, IL5-1을 DRS5.1로 지칭한다.
본원에서 사용된 것과 같은 마커 서열
하기 표는 여러 연관 지도에서 언급된 것과 같으며, 본 발명의 QTL과 관련하여 언급된 것과 같은 여러 RFLP 및 COS-II 마커에 대한 상세한 정보를 제공한다. 표 10 내지 29는 코넬 대학 (Cornell University)에서 호스팅된 SOL 게노믹 네트워크 (SOL Genomic Network; SGN) 데이터베이스 (2005년 10월 7일자 버전)로부터 직접 복사하였다.
본원에서 기재된 것과 같은 IL 라이버리 스크리닝을 통한 단위결실 형질과 관련된 것으로 발견된 여러 마커의 서열을 시퀀싱하고, 본원에서 개시된 단위결실-부여 요소의 영역에서의 에스. 하브로차이테스 LYC4/78 서열에 대한 상세한 정보를 제공하였다.
SL = 솔라눔 라이코페르시쿰, SH = 솔라눔 하브로차이테스.
이종접합체 식물에서, SL 및 SH 모두의 분해된 생성물이 발견된다. 표 30 및 표 31 모두에서, 측정된 PCR 생성물 길이를 아가로스 겔 밴드로부터 평가하였다.
a: 표 32 참조
참고문헌
SEQUENCE LISTING
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<211> 528
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG609Fd
<400> 1
gagacagctt gcatgcctgc agaggtgata aattcaccaa ggtttcatat ttaggaaaca 60
agaaaattaa aagatcatta acacagatga aaggatatga ctaggaggca atgactgatc 120
tttgactatc aaatacttct cagggaaaca atgtgaatgg gcttttacat gcagagatat 180
tgattgtgat catgttgaag aacttaggaa acatgaaatt aaatgatcat taacactgat 240
gcaaggatat gccaagtagg caagcaaatt aaggttgaac ataaatgtct gtgatctttg 300
actatcaaat atcttctcag aaaaaaaaat gtgaatgctc atttacatgc agagatggct 360
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ccacatgtgt gatcaagcaa cttttttgat gtccacaggg ttataagtag gcaacattta 480
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caagaaaatt aaaagatcat taacacagat gaaaggatat gactagtagg caatgactga 120
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attgattgtg atcatgttga agaacttagg aaacatgaaa ttaaatgatc attaacactg 240
atgcaaggat atgccaagta ggcaagcaaa ttaaggttga acataaatgt ctgtgatctt 300
tgactatcaa atatcttctc agaaaaaaaa atgtgaatgc tcatttacat gcagagatgg 360
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<213> Artificial
<220>
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cttcgaagct caagaagtgt cggtattatc tgaattaaat agtaaagcaa agagatggtt 120
ttatgtttct taagcagcat ttcttagctt aacggccctc cagatatatg gtggacaaaa 180
tagaatccat tagatataac aaatgggatt agtataatga tcttttactt tgttagatga 240
tcatactaac agattgcaag ttaatcatat ccaacatatt ctgtagatat ttcacattgg 300
ctagcatgag gaaaggtcat gtaggaaatt gaatagagtt caattttggg aaaagttgca 360
ttgaagaagg taacttcaac aaacgtgtga aaaaatcaca tttgagttgc ccgctcacca 420
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<212> DNA
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<220>
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ttctcacaag atattcatgc ctagttgcag tgtccgaatt aacataacat gctcaatttt 120
catatcttgc agcaaaattt atcattgaaa ctctctgaga tggaaacaga gaacaaagac 180
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aaggaaattg acaattacac ggaaacagtg gattcactgg agaagcatgt tacagagatt 300
aacaataaat tggaggagaa agatcagctt gttcaggaac ttcaggacaa ggagaagcag 360
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ataaccaata caatgtgttc aagtgactag tgttttgcac cttgttgcag attcaggcat 480
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<213> Artificial
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<223> CT128Fd
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gaacatagca agtctaccgt tcttgatctc ctttaccttg agctcagcaa atgcctctgg 300
gtcttcagca aggcctaatg ggtcgaagct gccaccaggg tagagtgggt cgacaacctc 360
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<223> CT128Rv
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accagactga gacgcacaca aaagtttccc tctattattt ttataatgat gtgaagatgc 180
tacataatga gtacactttg ccttacttta ctgcagatgg acctaccagg cccaaacgga 240
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accagatgca ggggatgaat ccacaccttt cagttgatca tctgaaggga aaactaagaa 420
ttttcatgag aaaatgactg gctattttca actttg 456
<210> 16
<211> 562
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG10Rv
<400> 16
ttcaatgcat ttaagctcaa aaaaacaaag ctgtaggaag gagcatatta gtagcctaac 60
tctgctctgc caataatagt taagcagatc aagatgctca aaattttcta attgaattgt 120
tagcatcaag atgcttctta gcatttattt tagaaagatt aaccatatta tcaaataacc 180
agacagagac gcacacaaaa gtttcaatct attattttta taatgatgtg aaaatgctac 240
ataatgagta cactttccct tactttactg cagatggacc taccaggccc aaacggtcat 300
gtagttatga cagaagaaca acagtatgaa tttctcaaac tgttggccaa ggtgatcagc 360
aaagattatg aatttggaag tacattccaa gaggaaagct ggagcatcgt aactaaccag 420
atgcagggga tgaatccaca cctttcagtt gatcatctga aggcaaaact aagaattttc 480
atgagaaaat actggttatt ttcaactttg ttggccagac gaggagtcca atgggataga 540
aggactaact caatgacgta tg 562
<210> 17
<211> 422
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TM2A
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(12)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 17
cnagctcgan nnaccctcac taaagggaac aaaagctgga gctccaccgc ggtggcggcc 60
gctctagaac tagtggatcc cccgggctgc aggctcctcc attgaaaagg gaatcaagtt 120
tgccaaagaa aactaaaaaa acaaaattat ggtctagttt tctatagtga cagttttgga 180
tctttttggg tcaattgttt ttgtatcctt tgcaagtttc ttgcagccgg aggcttagat 240
ttagctcttt tgatattata cccaacattt ctacaaaata atgtatggca aactgggggc 300
ctatcccatt tgccttagtg tggaggtgtt attctcacat gaatcgtttt ccaattatgg 360
ttagtagcag acaattgatg caaaatgaag aaatgttcat gaccaaaaaa aaaaaaaaaa 420
aa 422
<210> 18
<211> 458
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG551Fd
<400> 18
aatgaagttc agttgataag ctaaatggtg gaaatactaa ttttaattga cagtaacttt 60
gcatttcaag gtccatacca aaacatttgc taacaccagt tgctttgtca acgaaaacct 120
tggcactcaa aaccctacca aaaggctgaa atgcatttgc aagctcttga tcaccaaatt 180
cttgaggaat atggtaaata aatagattag caccaggtgg acctgtaaac agcaaaatcg 240
tttttgataa gtacaggttt atttctacat gttcaactac cactgccaag tacactagtt 300
caagtgacat ctccaccact taattgcata aagctttacc aacgacaaat ataacaaact 360
tgtgcaagta atttgagttc ctgtctatac agtccagaat ctccatatgc tgctcatctc 420
acaatgttgg ttaaggaaat ttgtcaagta aagttcaa 458
<210> 19
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG551Rv
<400> 19
catcttcaag tgtcagctca agtacagggg gtcaggttga aggttgttga acatttattt 60
tgtgaccttt ttagctctag aatttctgta gctaatcaag tacagtccca taacctaggg 120
gctgttaggg ttttctgctg aatgaggctg cttgtcttta ttttggttaa ttattttctg 180
gaaattgttc ctcgtcatag agaatagaag tagaagaaga agaagatagt ataatctatt 240
atatttgttt tttacttaat ttataaagat tccataaatg catgtgatct ttgatcaatg 300
atatcttata caagtgtatc actagaatct attatatttg gatttactta ttttatatag 360
gatttcataa acgcatgtga tc 382
<210> 20
<211> 331
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CT173Fd
<400> 20
tttttttttt taaaaattca aactccaatt atttgcagta taaaactaca gatacaaatc 60
ccagtacatg gtttgaggca cgataataag gtgctgatga aatccaagac atgagttcac 120
aatacattac tgaccaatat atttacaaag attagggtaa tggcagtaaa atcgctgatt 180
acagacaaca ttcttgggat atatttcatc ttaaagatta ggattagtag tatgtgtggc 240
agtcacagta gagaccatgg catcaactcc gcagatattg tgacccctgc agatcttgta 300
atatccgtgt tctccccaag tctttcccca a 331
<210> 21
<211> 331
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CT173Rv
<400> 21
ttggggaaag acttggggag aacacggata ttacaagatc tgcaggggtc acaatatctg 60
cggagttgat gccatggtct ctactgtgac tgccacacat actactaatc ctaatcttta 120
agatgaaata tatcccaaga atgttgtctg taatcagcga ttttactgcc attaccctaa 180
tctttgtaaa tatattggtc agtaatgtat tgtgaactca tgtcttggat ttcatcagca 240
ccttattatc gtgcctcaaa ccatgtactg ggatttgtat ctgtagtttt atactgcaaa 300
taattggagt ttgaattttt aaaaaaaaaa a 331
<210> 22
<211> 478
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG254Fd
<400> 22
ctagttggat tgaaacaatt gggaatatag tgtaggaaga cttcggggca attatctgct 60
ttcttctata tcaaactggg tctattgaag aattacaaac tggaccttaa atcttttgcc 120
agtttttgta aaattgataa acttttgata ttttattatg gaaattcaaa atatatctta 180
atagtagctt gttaatttat ttcaagagac ccttttcatt gttcatagtt cattatcatc 240
cccttatcag tagtgcacca agggtgtgac ctagtggtca attaagtatg aatcatgagt 300
cttagacaga aacactaggt gattttcttc catgtgtcct agcctcttag gcttggtgga 360
tagaggaggt atcctgtctt tcccctttcc agaaattcat agcattattt tctgttcttt 420
attgataaat tattcattag aacagttatt agaaatgtgg aactggttga ggtaggcg 478
<210> 23
<211> 493
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG254Rv
<400> 23
cagaacagag aacatgtaaa gttgttcaac taatgagcat atttagaaaa acttagtggc 60
tatcaatagt tggcaatatg aaaactaaga tagtgtggtc acctgttgat caatttcttc 120
ttcaataggc atcttgtcag cttcctcttg taacaaggct ttcatttgtg acttgagaat 180
atatccagga ggaagtgcat gcctgtaatg gcattcttta ccatttggac aggcccagaa 240
ccaaccgtac tgctttttct ccacagcatc caaaaagaat ttacatacct gcatataaac 300
caaatcataa gcttgattta tgaaacgagc actgcattca tgtttggcaa tatttgactg 360
gaggaggagt tttaaagggg gaaattaaga ctatagacac atacactaaa tatgcataaa 420
acgccaaaag taccctggtt tcctatccag ttaaggcaac agtagcagaa aatgagtgtt 480
gtaatgagtc aat 493
<210> 24
<211> 465
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG223Fd
<400> 24
tattcaagaa aatattgtgt agtgttctcc aatattcaac tatttaagtt caatggatct 60
agacacacaa tattattaat tctcgtcgcc gatgggatgg ttgagtgatt gaagcatagg 120
aataacatcc tggagattct aggtttggac tccagtttga acataagtgt gagcccatct 180
gctttatctt acaagttcaa ttcaaacttg tgtgagtggg ccatagtaga tccatgcaaa 240
atagtggtta tgacgctatg gtgagttcat gagaagaatt attgttcctt aggaacagtg 300
acaggaaatt caatggtcaa ataacatcaa gaagactttt tggattagtt actgagtgat 360
gttcagaaga gggactaaat atctaacatg ccccctcaag ctccagatgg taaagcaact 420
tgagtttgag ttactagaat ttagtaacat aaaaaggttt tccat 465
<210> 25
<211> 393
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG223Rv
<400> 25
tttccacaca cacaaaaaaa acatcttgaa cacactgtaa tccccctctt catcaaattc 60
tcctgtgtca acacaacttc cttagccagt aaccacacaa cttccctctt ctgaacatta 120
caaagtcgct gatccagaaa gtcttgttct tgatgctatt tgaccattga atttcctgtc 180
actatccaac atgaatagtg tttgtaggga ataaattgaa atcagattac aaggatccaa 240
atatccatcc ccaacaatgt actgtttatg cccgaaggtg aggataaaaa gatggaaaac 300
ctttttatgt tactaaattc tagtaactca aactcaagtt gctttaccat ctggagcttg 360
agggggcatg ttagatattt agtccctctt ctg 393
<210> 26
<211> 544
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG47Fd
<400> 26
tgcagttgaa ttcgtcttct taacactatt ctcttatgct gtgcatcaag acaaccaccc 60
tcattgggcg gtcattgctt cttcaggcat gaccctacag ttagtacatt tggttttacc 120
aaatcttctt ctaaggataa atctatttga ctatggttca ctctctaaat cataagctga 180
aacaacatca acataccccg tgtaaatcat aagctaaaac aaactctaga atagccttac 240
ctcatcattc ctaggaccat aattatatct atacttagtc aaaatcatca taaaatttac 300
ctacaagacc atttagatct cacctgatta agatttgttg gttactcgta atcccttgaa 360
ctaaggtgta acatcttaac ccctcctttt gagtatttat accatcatat tttgaaactt 420
ctcgtaggtt catatgtttc ttttggtact tgttagtata gcttggagtg ggacccaagg 480
ggctccagtg agttctagac aagaaaaacg agatttgaac attgcagatt ttatgttttc 540
tggt 544
<210> 27
<211> 484
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG47Rv
<400> 27
ctttgtttgc ttgcaagaca gagatttata cacgctaatg ctatcttttt gtgtcattaa 60
cagctagttt gatttgcttg gttaatacag ttatggtaga tagagaagat agtttcaaaa 120
tagaaagaat gatgtagaca gcattaatga atctttctcc ttacaattgt acctttgaca 180
aggaatccac cttttatagg tagtttggtg agtttgatgg aagattgtgg ttgaatctgg 240
ttgagtcata gacactactt gtacattctt ttatgacact gacttgatgt tgtaagagtg 300
aaatgtatag acttatcaac aaataacaga gtagaaataa aagtaggttg aagatagctt 360
cttgtttggt tctaacttgc tcctttgttg actgatatga taacattgtg tcaatataag 420
atgattcaaa atgttgcctg aatttttatg aaattgatat tcatcgtcca gtttagagag 480
ttct 484
<210> 28
<211> 440
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG393Fd
<400> 28
actgactaag ctgctggatt tgattagccg aaggaattta cttttggtta catcttgctc 60
catcaccttt gtctttatct aggtcaatct tgtaccatag atgcaaataa cactatgaac 120
agattaacaa tgtcttgagg aggattaggc tgtcaacagc ctgcataata acaggaacaa 180
cattggcgtt tgtttgcatc agttactgtg actctgatta aaggagaaaa tgtggcatcc 240
tctgcttata ctgtcagtgt gtatacttgt caggttaagt tggttgctat aatctttaat 300
aattcttgat tttgtggttg tttctgaagt aaattgatat gtgggccttt gagctggagg 360
agatggtact ttagctattc actaacaatc gtttacctta aaaatgttat tctgtaagta 420
tctaaccaaa ttctgatcac 440
<210> 29
<211> 474
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG393Rv
<400> 29
tgcagacacc aaagaaacaa ttggttatat aaaaaacaat ccacaatcat tctctataga 60
agtcacgcaa agacactaca taacctccaa gtgcaatgaa gaggatgcag aataagaagc 120
tcagaacttc caaaagaaaa ggtgactgaa aataagtttg ctgaaaaggt acaaggcaag 180
ttctaattct caactagctt taggtataca ctaaagaaaa ggaaaataaa ttccaaacag 240
aagtttccat cctacctagt acataaaaga aaaaggtaaa aaggaacata tggaagtgtt 300
cccctgttac ctaaactttt ggtgataaac agtaatcatg attaccccca cctcacacac 360
caccactaca gcacaaaaat tagaaatgtt gtatggacca tgatcaacca gccaagaatc 420
ccagaaggag aataaaggag ttctcttaat cacaagagga gaatatcatc tact 474
<210> 30
<211> 182
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CT19Rv
<400> 30
gccccaaaac tcctgctgga ttttactgga tctccacttg ctgcggacat tgcttgcctc 60
cgacaatcat cttcccaact tcttcctttt tgtcttgaaa ttaatccctt gtacccattg 120
ctgcttctaa atgacctcct gcatcccggc ggatccacta ggtctaaagc tgccgccccc 180
gc 182
<210> 31
<211> 521
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG68Fd
<400> 31
ggattttgat gaacttgtat ctgtgcttct agctccacct aggatgagtt tggatttgta 60
cgattaacaa atgtttgagc tgaaagaatt aaatttgatt acacctgcct ttacatattt 120
ttgttgcgta aggattttct atgaagaata tatatgtatg tatgtgtaaa ggatgcacta 180
agcatctcgc attttgataa agaaatgaac tttgggctta actcaactcc aaaagttagc 240
tcatgaagtg aggatatcgc gtaagaccgt ataaggagac ctagaaccca tcccacaaca 300
atgtgtgact ccaacacatt cacgcaagtt ctggggaagg gttgcactcg taagggttgt 360
gatgtaggca gccataattg tgtgtaccca ttcgttagaa aactacactg tgcaagtgga 420
gttaaattgt atcttttttg gttttgtgtg agttgttcaa tccccttgac atgaaaaaaa 480
gaagcaaaat tcaagtataa tggtaaaagg ggattcaaaa t 521
<210> 32
<211> 485
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG68Rv
<400> 32
ttgggtcagc catagtactt cgtgatatat ctctgacaga agatatctgc tcaagaccat 60
gaacaatacg gagacataag aaggaaagaa gttcagtgca gcacaaaatt ttaataagtt 120
aacttaaagg gggataagag gcaaaaccaa tataaaagtt tggacagaca aattttaatt 180
agtatcaaag agtgaatgat gctaaaagaa gagatgctta aatatctgat actataaagt 240
aagccatgac taattggtaa ttatgaatgg catatgatac gactatcagt tttgactgtt 300
gtctacaata atgatttcag aaacatatga tatatttcaa atagaattga ataacaacac 360
ttgttcaaat acctagctct cggaggcaga tccagaattt tagaaagtgg gtgcagtaaa 420
tcacaagagt acacctctgc tagaatgggt gtgtactgta acaaaacctg ttttgatatg 480
catat 485
<210> 33
<211> 475
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG565Fd
<400> 33
actagcatct cttggaggat gctgaggtgt caagtggtgt tgaccactcg ttaccactga 60
ttcacagctg gtgtctttcg aagcaagctt cgtctgcaaa acaagaatca cactttaatc 120
ctctgttacc taaaaacaat agttgtttga tgtaatgaaa gaagaatttt cacttcaatg 180
atggaaagaa aatcttacag tttgagtttg cttgcgaaag tagccatttt catacaccag 240
ttgagaaact tgcttctgca atctatcatt ctcttccatt aatagcttgt tcattgctga 300
cagcttccta ttcacaccct gaagccttga tgactctttc ctctgttttt ccctacatct 360
atacaactca aagaaacaat caattatact tcaaattaat tggggtcgct aaaaatgaat 420
cctttagact aacaacatcc cacaagtcct tacccctacc tcgcagaggt agaga 475
<210> 34
<211> 490
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG565Rv
<400> 34
tcagcaaaat gtcacacaga gagtacagta gtagagcaca gtagagtagg gagaagttgc 60
ctcaaaagag gaaaagaaaa ggtaacgaac cacacatttg acagctcaaa accactttac 120
caatccaaac aaaaaatcat cacattatcc ctcccttctc tcctttctct attactctca 180
ttttccccaa gtttcaggta cctttttcct aacataatcc gcccatagtg ttcatcattc 240
aagatctgtc cttttgagga gacttcattc cttactatgg tcttcttttt ttgatgattt 300
cttatgtgag atgttgaaaa ctggaaagaa gtgataaaga taggaggttt ggtttctggg 360
gtttgtttat tttgctttac aagggttaaa gattggatct tttttagttt tggtagatac 420
ccatgtctaa tcttgtttca gaattcaaaa ggttggtact ttactgtttt gcaagtggat 480
gacagaggag 490
<210> 35
<211> 469
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG296Fd
<400> 35
ttaggttttt gtgtggttca acgtttttgg ttttgatttt tatgtgtttt cttagttcct 60
tgcttcacca ttttgatggt attttgagtt tttgatgttc tgtcggcata aagtagtgat 120
ttttcagaca gtttggtatt atggagtatg tttctttgct cttctctaat ttggattggt 180
tctgatttgt atatgcttgt tttagtttcg atggtttttg agtttttgat gattcattgg 240
cacaaagtag tgatttttca gactgttggg ttttgtgggg ttcccgtgct tgctcttcac 300
taatttggat tggttctgat ttgtatatgt tttagttttg atggtttttg agtttttgat 360
gattcatcgg cacaaagtag tgatctttca gacagttggg ttttgtgggg ttcacgtgct 420
tattcttcac tattctcggt tggtttgatt tgtaggtccg ttttagcat 469
<210> 36
<211> 502
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG296Rv
<400> 36
agaatataac aaaaaagcag ataaatcagt taattatgcc tcaatctcaa caagtgaata 60
acaaatccta tcagaagata tagtagacga taaacagtga aggtagaagc ctaactctat 120
gacattatct tgagacccaa aacacttcat caaagactca aaagaaataa tttgttcacc 180
aagtactatt aactaattat caaaactaga attctcaaaa taaaaaataa caaatcttat 240
cagtcacatg gacattcatt aaacatcatg aagaagacaa caagggaagg tcaaaactgg 300
actccatggc acataagata ataacaaaag gtagtttaag gcctaaaaca cttcaaaaat 360
aaaatttatt caccagatat caataatatt atctgttctt ccttcattca tgaggggcat 420
gcacaagaga caatatacat catttctcct tttacttttt ctttcctgag gaagtaaaag 480
gagcagaaag cagatagaaa ga 502
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CT229Fd (primer)
<400> 37
atgggctggg atcgtagtaa a 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CT229Rv (primer)
<400> 38
aagcttgcga ttcccataac a 21
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> T1068Fd (primer)
<400> 39
caaagcaatg ggcaatggt 19
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> T1068Rv (primer)
<400> 40
acacagcagt ttcagtagga c 21
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG272Fd (primer)
<400> 41
gattttgccc cctctacca 19
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG272Rv (primer)
<400> 42
acatcttttc cttccctctg c 21
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG264Fd (primer)
<400> 43
ggaacaggtc aggacagcat 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG264Rv (primer)
<400> 44
tggctaactg acgaagacga 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG62Fd (primer)
<400> 45
catgcctagt tgcagtgtcc 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG62Rv (primer)
<400> 46
ttcagcagca agcaaagatg 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> T1405Fd (primer)
<400> 47
caccaacaac tagcccttga 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> T1405Rv (primer)
<400> 48
aagcaattcc tccagcttca 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CT50Fd (primer)
<400> 49
gacggcgtat tacgttcaga 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CT50Rv (primer)
<400> 50
ctagcacccc aaaggatgag 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG441Fd (primer)
<400> 51
tgtcagcata ggcttttcca 20
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG441Rv (primer)
<400> 52
cggtcgggaa aaatgaca 18
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD31Fd (primer)
<400> 53
atctcgggat catggttgac 20
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG318Fd (primer)
<400> 54
caagccatag aaattgccgt a 21
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG318Rv (primer)
<400> 55
tgctctctct gtgatggaag c 21
<210> 56
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG358Fd (primer)
<400> 56
caacttttcc aggttcattt tctc 24
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG358Rv (primer)
<400> 57
acacctacat gctactaagg ggtc 24
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG60Fd (primer)
<400> 58
ttggctgaag tgaagaaaag ta 22
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG60Rv (primer)
<400> 59
aagggcattg taatatctgt cc 22
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CT138Fd (primer)
<400> 60
accagccccg gaagatttta 20
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CT138Rv (primer)
<400> 61
gcggtcaact tcagcaacta t 21
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG296Fd (primer)
<400> 62
tgttctgtcg gcataaagt 19
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TG296Rv (primer)
<400> 63
tgctaaaacg gacctacaa 19
<210> 64
<211> 155
<212> DNA
<213> S. habrochaites LYC4/78
<220>
<223> CD31 (marker)
<400> 64
TTCATTTTGT TATTTCCTTT CGCCTTCCTC CACTCAGACT GGAGTTCTTC GTTATCAGCA 60
AACTGTTCGA CAGTTAAATG CATGTATGTT CAGTATAAGT AAAAGGGCAA CCCAAGCTTC 120
CGCTATGCAC GGGGTCTGGA GTAGGGCCGG ACTAT 155
<210> 65
<211> 191
<212> DNA
<213> S. habrochaites LYC4/78
<220>
<223> CT50 (marker)
<400> 65
TGGAAGAGAT TTACTGGATC TATCATCTTC AAGTAGTCCT TCTTCCTCAA TAACATCACA 60
TTCCTTCCAG GGCTTCTGCC CTTTGCGGTG GTGACGGCCG CCTGCGGCGT CGGGTAAAAT 120
CTTCCGAGAT CCAGGCTTGA GGGAGCCGGA GAATCTGGAG GAAGAGGAAT CACGCGAGTG 180
ACGGCCGACC G 191
<210> 66
<211> 250
<212> DNA
<213> S. habrochaites LYC4/78
<220>
<223> CT138 (marker)
<400> 66
CAGAAGTTTA ACATCACAAG CCACTGAAGA CGATGAAAGA TGCTATAGAA ATAGTCACAA 60
CTGATGAAAT CATTACTGAG ATAGCACCAA CCAGGTAGAA TATTTTAACC AATGTGCAGA 120
GCGTTCCAAC TAATACAGCA TTAAAGATGA TAATATCTCA TGACTATTGC TGCTTTTGCA 180
ATGAAAACGG GGTTTGTTTC AAAAAATATG GTGTTTGATT TTTTTTTAAA AAAAGTTCAA 240
CACTTGATGA 250
<210> 67
<211> 175
<212> DNA
<213> S. habrochaites LYC4/78
<220>
<223> CT229 (marker)
<400> 67
GGCTGTGATA TCGGAGTCAG AGCTCTGGCT TCACATCCAA TGAAAGCAAA TAAGAAAGGT 60
ATTGGGGAGA AGCACGTTCC CATAACCATT GCCGGGACTA GAATCTGCGA TGGTGAGTGG 120
CTTTATGCAG ATACTGATGG CATTCTGATT TCTAAAATGG AGCTATGTGT TTGAG 175
<210> 68
<211> 338
<212> DNA
<213> S. habrochaites LYC4/78
<220>
<223> T1405 (marker)
<400> 68
TTTCCAAGGC GAAAACCAAC TCCCTTGCTG TCATTGGTCA TAATGCCAAC AATGCTTATA 60
TTCTTCGTGG GAACTATGAC GGTCCTCCTT GCAAATACAT CGAAATACTC AAGGCGTTGG 120
TTGGTTATGC AAAGTCAGTT CAGTACCAAC AGGGTTGCAA TGCGGCTAAC TGCACGTCTG 180
CTAACATTGA TCAAGCTGTC AACATTGCAA GAAATGCAGA TTATGTTGTT TTAGTCATGG 240
GGTTGGATCA AACTCAAGAG AGGGAACAAT TTGATCGCGA TGACTTAGTG CTCCCGGGGC 300
AGCAAGAAAA TCTTATCAAT AGTGTTGCTA AAGCTGCA 338
<210> 69
<211> 219
<212> DNA
<213> S. habrochaites LYC4/78
<220>
<223> TG60 (marker)
<400> 69
TATAATGGAA CAGTATCAAG GTAAAATATT GTATAACaac TACAAGACTC ACTAGGAATG 60
GTATACAAGT GAAACGTAAA TTAACAACTA CAAGACTCAC TACATAGCTG ATGCGATAAT 120
TGGTAATTAT GAAGGGCGAA ATAGTAAAAT TTCTTTCCAA GAAATCATGT CTTTTGTCCT 180
CATGGCTGAA GCTCAATTGT GTACAAGAAA CAAATGTAC 219
<210> 70
<211> 289
<212> DNA
<213> S. habrochaites LYC4/78
<220>
<223> TG62 (marker)
<400> 70
TTGGTTATAA TAGAATTTGT AGAACTAAAA GTATCCGTAG TAAAAACCTT TTCTCTCTCA 60
GCTTCCAACT GTTTCTCCTT GTCCTGAAGT TCCTGAACAA GCTGATCTTT CTCCTCCAAT 120
TTATTGTTTA TCTCTGTAAC ATGCTTCTCC AGTGAATCCA CTGTTTCCGT GTAATTGTCA 180
ATTTCCTTGC GTAAAACATG AATCTCATCT TCCTTTTTCT GCATGTCTGA TTGAAGCTTT 240
CCAATATGGT CTTTGTTCTC TATTTCCATC TCAGAGAGTT TCAATGATA 289
<210> 71
<211> 157
<212> DNA
<213> S. habrochaites LYC4/78
<220>
<223> TG272 (marker)
<400> 71
GGCTATTCTT GGATGGCTTC TCAAGGAAAA AGAATGTCTT TGTCAATGTT GCAATTCTCG 60
TATTCTTTAT AAATCAAAGT TTCAAGTCGG TGGCTGGGTC ACGAATAAAT AGAGTAGAAG 120
TATGCTCAAC ATCCCTGTGT TACAGTAGTC CCACTCT 157
<210> 72
<211> 194
<212> DNA
<213> S. habrochaites LYC4/78
<220>
<223> TG296 (marker)
<400> 72
TAATTTGGAT TGGTTCTGAT TTGTATATGC TTGTTTTAGT TTCGATGGTT TTTGAGTTTT 60
TGATGATTCA TTGGCACAAA GTAGTGATTT TTCAGACAGT TGGGTTTTAT GGGGTTCCCG 120
TGCTTGCTCT TCACTAATTT GGATTGGTTC TGATTTGTAT ATGTTTGTTT TAGTTTTGAT 180
GGTTTTTGAG TTTT 194
<210> 73
<211> 122
<212> DNA
<213> S. habrochaites LYC4/78
<220>
<223> TG318 (marker)
<400> 73
GATACTCAAA AGGAAGCTTG GTCCAGATGA CCTTCGCACA CAGGTACCTT CTGTCTCATG 60
CACATGTATA CAGCACGAAC AAATGCGCTC TCTTCCCAGA CTGGTGCTGC ATAAAAAATT 120
AC 122
<210> 74
<211> 229
<212> DNA
<213> S. habrochaites LYC4/78
<220>
<223> TG441 (marker)
<400> 74
AGCTGAGGTT TGGATTACTG GGCTGAAAGC AATAATTACG AGGGGACGCT CTCGCAGAGG 60
AAAATATGAT GCAAGAAGTG AAACTATGTT TTCGGATAGT CCACTTGGTC TACGAGTCAC 120
CACATCAACT TCTACTATTG TATGTTGGCA TTTTGTTGTA CCTTCAGTTG TGTGTGTTCA 180
TTCTTCCTCT CCTATGACCT CTTCCCCCTC CAACTGATCC AAAATGTTG 229
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> S. lycopersicum cv. Moneymaker
<220>
<223> CD31 (marker)
<400> 75
TTCATTTTGT TATTTCCTTT TGCCTTCCTC CACTCAGACT GGAGTTCTTC GTTATCAGCA 60 AACTGTTCGA CAGTTAAATG CATGTATGTT CAGTATAAGT AAAAGGGCAA CCCAAGCTTC 60 CACTATGCAC GGAGTCCGGA GTAGGGCCGG ACTAT 60
<210> 76
<211> 200
<212> DNA
<213> S. lycopersicum cv. Moneymaker
<220>
<223> CT50 (marker)
<400> 76
TGGAAGAGAT TTACTGGATC TATCATCTTC AAGTAGTCCT TCTTCCTCAA TAACATCACA 60
TTCCTTCCAG GGCTTCTGCC CTTTGCGGTG GTGACGGCCG CCGACGCCTC CGGCGGCGTC 120
GGGTAAAATC TTCTGAGATC CAGGCTTGAG GGAGCCGGAG AATCTGGAGG AAGAGGAATC 180
ACGGGAGTGA CGGCCGACGG 200
<210> 77
<211> 250
<212> DNA
<213> S. lycopersicum cv. Moneymaker
<220>
<223> CT138 (marker)
<400> 77
CAGAAGTTTA ACTTCACAAG CCACTGAACA CGGTGAAAGA TGCTATAGAA ATAGTCACAA 60
CTGATGAAAT CATTACTGAG ATAGCACCAA CCAGGTAGAA TATTTTAACC AATGTGCAGA 120
GCGTTCCAAC TAACACAGCA TTAAAGATGA TAATATCTCA TGACTATTGC TGCTTTTGCA 180
ATGAAAACGG GGTTTGTTTC AAAAAATATG GTGTTTGATT TTTTTTCAAA AAAAGTTCAA 240
CACTTGATGA 250
<210> 78
<211> 175
<212> DNA
<213> S. lycopersicum cv. Moneymaker
<220>
<223> CT229 (marker)
<400> 78
GGCTGTGATA TCGGAGTCAG AGCTCTGGCT TCACATCCAA TGAAAGCAAA TAAGAAAGGT 60
ATTGGGGAGA AGCACGTTCC CATAACCATT GCCGGGACTA GAATCTGCGA TGGTGAGTGG 120
CTTTATGCAG ATACCGATGG CATTCTGATT TCTAAAATGG AGCTATGTGT TTGAG 175
<210> 79
<211> 338
<212> DNA
<213> S. lycopersicum cv. Moneymaker
<220>
<223> T1405 (marker)
<400> 79
TTTCCAAAGC GAAAACCAAC TCCCTTGCTG TCATCGGTCA TAATGCCAAC AATGCTTATA 60
TTCTTCGTGG GAACTATGAC GGTCCTCCCT GCAAATACAT CGAAATTCTC AAGGCATTGG 120
TTGGTTATGC AAAGTCAGTT CAGTACCAAC AGGGTTGCAA TGCGGCTAAC TGCACGTCTG 180
CTAACATTGA TCAAGCTGTC AACATTGCAA GAAATGCAGA TTATGTTGTT TTAATCATGG 240
GGTTGGATCA AACTCAAGAG AGGGAACAAT TTGATCGCGA TGACTTAGTG CTCCCGGGGC 300
AGCAAGAAAA TCTTATCAAT AGTGTTGCTA AAGCTGCA 338
<210> 80
<211> 219
<212> DNA
<213> S. lycopersicum cv. Moneymaker
<220>
<223> TG60 (marker)
<400> 80
TATAATGGAA CAGTATCAAG GTAAAATATT GTATAACaac TACAAGATTC ACTAGGAATG 60
GTATACAAGT GAAACGTAAA ATAACAACTA CAAGACTCGC TACACAGCTG ATGCGATAAT 120
TGGTAATTAT GAAGGGCGAA ATACTCAAAT TTCTTTCCAA GAAATCATGT CTTTTGTCCT 180
CATGGCTGAA GCTCAATTGT GTCCAAGAAA CAAATGTAC 219
<210> 81
<211> 289
<212> DNA
<213> S. lycopersicum cv. Moneymaker
<220>
<223> TG62 (marker)
<400> 81
TTGGTTATAA TAGAATTTGT AGAACTAAAA GTATCCGTAG TAAAAACCTT TTCTCTGTCA 60
GCTTCCAACT GCTTCTCCTT GTCCTGAAGT TCCTGAACAA GCTGATCTTT CTCCTCCAAT 120
TTATTGTTAA TCTCTGTAAC ATGCTTCTCC AGTGAATCCA CTGTTTCCGT GTAATTGTCA 180
ATTTCCTTGC GTAAAACATG AATCTCATCT TCCTTTTTCT GCATGTCTGA TTGAAGCTTT 240
CCAATATGGT CTTTGTTCTC TGTTTCCATC TCAGAGAGTT TCAATGATA 289
<210> 82
<211> 157
<212> DNA
<213> S. lycopersicum cv. Moneymaker
<220>
<223> TG272 (marker)
<400> 82
GGCTATTCTT GGATGGCTTC TCAAGGAAAA AGAATGTCTA TGTCAATGTC TCAATTCTCG 60
TATTCTTTAT AAATCAAAGT GTCAATTCGG TGGCTGGGTC ACGAATAAAT AGAGTAGAAG 120
TATGCTAAAC ATCCCTGTGT TACAGTAGTC CCACTCT 157
<210> 83
<211> 190
<212> DNA
<213> S. lycopersicum cv. Moneymaker
<220>
<223> TG296 (marker)
<400> 83
TAATTTGGAT TGGTTCTGAT TTGTATATGC TTGTTTTAGT TTCGATGGTT TTTGAGTTTT 60
TGATGATTCA TTGGCACAAA GTAGTGATTT TTCAGACTGT TGGGTTTTGT GGGGTTCCCG 120
TGCTTGCTCT TCACTAATTT GGATTGGTTC TGATTTGTAT ATGTTTTAGT TTTGATGGTT 180
TTTGAGTTTT 190
<210> 84
<211> 123
<212> DNA
<213> S. lycopersicum cv. Moneymaker
<220>
<223> TG318 (marker)
<400> 84
GATACTCAAA AAGAAGCTTG GTCCAGATGA CCTTCGCACA CAGGTACCTT CTGTCTCATG 60
CACATGTATA CAGGCACGAA CAAATGCACT CTCTTCCCAG AGTGGTGCTG TATAAAGAAT 120
TAC 123
<210> 85
<211> 229
<212> DNA
<213> S. lycopersicum cv. Moneymaker
<220>
<223> TG441 (marker)
<400> 85
AGCTGAGGTT TGGATTACTG GGCTGAAAGC AATAATTACG AGGGGACGCT CTCGCAGAGG 60
AAAATATGAT GCAAGAAGTG AAACCATGTT TTCGGATAGT CCACTTGGTC AACGAGTCAC 120
CACATCAACT TCATCTATTG TATGTTGGCA TTTTGTTGTG CCTTCAGTTG TGTGTGTTCA 180
TTCTTCCTCT CCTCTGACCT CTTCCCCCTC CAACTGATAC AAAATGTTG 229
Claims (16)
- 에스. 하브로차이테스 (S. habrochaites) LYC4/78의 염색체 4, 5 및/또는 12로부터의 유전자 영역을 식물로 유전자이입하는 것을 포함하며,- 여기서, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4로부터의 유전자 영역이 마커 CD59 및 TG272 사이의 영역이고,- 여기서, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 5로부터의 유전자 영역이 COS 마커 T1181 및 RFLP 마커 CD31(A) 사이의 영역인,단위결실, 및 임의로 웅성 중성인 토마토 식물 (이의 대표적인 씨 샘플이 NCIMB에 기탁 번호 41517로 2007년 11월 13일에 기탁됨)을 생산하는 방법.
- 제1항에 있어서, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4로부터의 유전자 영역이 마커 TG272, TG264, TG62, T1405 및/또는 CT50를 포함하지 않는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 5로부터의 유전자 영역이 RFLP 마커 TG318, 또는 보다 다운스트림 마커, 예컨대 TG538, TG60 및/또는 CT138을 포함하지 않는 것인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 12로부터의 유전자 영역이 마커 TG296을 포함하지 않는 것인 방법.
- 씨-함유 토마토 식물을 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 식물과 교배하는 단계, 및 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4, 5 및/또는 12의 유전자 영역의 유전자이입의 존재에 대하여 씨 또는 상기 씨로부터 성장된 식물을 선별하는 단계를 포함하며,- 여기서, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4로부터의 유전자 영역이 마커 CD59 및 TG272 사이의 영역이고;- 여기서, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 5로부터의 유전자 영역이 COS 마커 T1181 및 RFLP 마커 CD31(A) 사이의 영역인,단위결실 (및 임의로 웅성 중성) 토마토 식물을 선별하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단위결실 (및 임의로 웅성 중성) 토마토 식물이 솔라눔 라이코페르시쿰 식물, 보다 바람직하게는 경작된 에스. 라이코페르시쿰 식물인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있거나, 또는 제10항의 방법에 의해 선별되며, 여기서 토마토 식물이 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 식물을 에스. 라이코페르시쿰 시브이. 머니메이커의 식물과 교배시켜 얻어진 식물이 아닌 것인 토마토 식물 또는 그의 부분.
- a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 따라 단위결실 토마토 식물을 생산하는 단계;b) 상기 단위결실 토마토 식물을 그 자체 또는 또 다른 토마토 식물과 교배하여 자손 토마토 씨를 수득하는 단계;c) 상기 단계의 자손 토마토 씨를 성장시켜 추가의 단위결실 토마토 식물을 수득하는 단계; 및d) 상기 교배 및 성장 단계를 0 내지 7회 반복하여 단위결실 내성 동종번식 토마토 식물을 발생시키는 단계를 포함하는, 단위결실 (및 임의로 웅성 중성) 동종번식 토마토 식물을 생산하는 방법.
- 제8항에 있어서, 단계 c)가 단위결실 표현형을 나타내며 상업적으로 바람직한 특성을 갖는 식물을 확인하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 방법이 동종접합체 동종번식 토마토 식물을 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 얻을 수 있으며, 여기서 토마토 식물이 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 식물과 에스. 라이코페르시쿰 시브이. 머니메이커의 식물의 교배에 의해 얻어진 식물이 아닌 것인 단위결실 (및 임의 로 웅성 중성) 동종번식 토마토 식물 또는 그의 부분.
- 제11항의 단위결실 동종번식 토마토 식물과 상업적으로 바람직한 특성을 나타내는 동종번식 토마토 식물을 교배하여 얻을 수 있는, 단위결실 (및 임의로 웅성 중성) 표현형을 나타내는 잡종 토마토 식물 또는 그의 부분.
- 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4, 5 및/또는 12로부터의 유전자 영역의 유전자이입을 포함하며,- 여기서, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 4로부터의 유전자 영역이 마커 CD59, RFLP 마커 CT229 및 COS 마커 T1068로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하며,- 여기서, 에스. 하브로차이테스 LYC4/78의 염색체 5로부터의 유전자 영역이 COS 마커 T1181, RFLP 마커 TG441 및/또는 RFLP 마커 CD31(A)로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함하는 것인,단위결실 (및 임의로 웅성 중성) 토마토 식물 (이의 대표적인 씨 샘플이 NCIMB에 기탁 번호 41517로 2007년 11월 13일에 기탁됨).
- 제13항에 있어서, 상기 토마토 식물이 에스. 라이코페르시쿰의 식물이며, 여기서 상기 식물이 에스. 라이코페르시쿰 시브이. 머니메이커가 아닌 것인 식물.
- 제7항 및 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항의 토마토 식물의 재생가능한 세포의 조직 배양물이며, 바람직하게는 상기 재생가능한 세포가 잎, 화분, 배아, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥, 꽃, 과일 및 줄기 및 씨로 이루어진 군으로부터 선택된 조직으로부터 단리된 세포 또는 원형질체를 포함하는 것인, 조직 배양물.
- 에스. 하브로차이테스 LYC4/78로부터 유래된 단위결실 유전 요소의 검출 및/또는 단위결실 (및 임의로 웅성 중성) 토마토 식물의 검출을 위한, 표 30, 31 또는 32의 유전자 마커로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 마커의 용도.
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