KR20100029232A - 사멸세포 표적용 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아포토시스(apoptosis)가 진행되고 있는 사멸세포(apoptotic cells)를 특이적으로 표적할 수 있는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며 사멸세포를 표적하는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 사멸세포 검출용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 영상화용 조성물 등에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 종양, 심근경색, 뇌졸중 및 동맥경화 등의 조직에 발생하는 아포토시스를 효과적으로 표적한다. 따라서 본 발명의 펩타이드는 치료물질과 결합하여 상기 질환조직에 약물을 선택적으로 전달하는 질환 예방 및 치료용 조성물 등의 목적으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 영상물질과 결합하여 상기 질환의 진단 및 치료약물에 대한 반응의 영상화 등에 다양하게 사용될 수 있다.

Description

사멸세포 표적용 펩타이드 및 이의 용도 {Peptides for targeting apoptotic cells and uses thereof}
본 발명은 아포토시스(apoptosis)가 진행되고 있는 사멸세포(apoptotic cells)를 특이적으로 표적할 수 있는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 서열로 표시되는 아미노산 서열을 가지며 사멸세포를 표적하는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 사멸세포 검출용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 영상화용 조성물 등에 관한 것이다.
아포토시스란 개체의 생명 유지를 위해서 불필요한 세포 혹은 위험한 세포를 스스로 죽게 하도록 하는 현상을 말한다. 아포토시스는 그리스어로 “떨어지다”를 뜻하며 세포가 소실되어 가는 과정을 꽃에서 잎들이 떨어지는 것에 비유하여 붙여진 이름으로, 1972년 Kerr 등에 의해 처음으로 관찰되었다(Kerr et al., Br J Cancer, 1972, 26:239-257). 아포토시스는 세포의 발생, 분화, 면역 등의 생리학적 현상에 중요한 역할을 한다(Meier et al., Nature, 2000, 407:796-801). 한편, 여러 가지 병리학적 환경 및 질환에서도 아포토시스는 중요하다. 예를 들어, 항암제로 성공적 치료를 하는 경우 다량의 아포토시스가 종양조직 내 발생한다(Thomson, Science, 1995, 267:1456-1462). 반면, 종양의 발생에는 아포토시스의 감소가 원인으로 관여한다. 또 다른 예로, 뇌졸중 및 심근경색에서 뇌 및 심장으로 가는 혈액 공급의 부족으로 뇌세포 및 심근세포가 각각 손상을 받아 아포토시스가 발생한다(Du et al, J Cereb Blood Flow Metab, 1996, 16:195-201; Narula et al., New Engl J Med, 1996, 335:1182-1189). 또한 장기 이식 후 거부반응, 자가면역질환, 퇴행성 뇌신경질환, 동맥경화 및 바이러스 감염 등의 질환에서도 아포토시스가 흔히 발생한다(Thomson, Science, 1995, 267:1456-1462; Kageyama et al., Ann Thorac Surg, 1998, 65:1604-1609).
이러한 아포토시스는 임상적으로 진단 및 치료적 측면에서 매우 중요한 의미를 가진다. 즉, 아포토시스의 영상화는 이의 과도한 증가와 연관된 퇴행성 뇌신경질환(알츠하이머 병 및 파킨슨 병 등)의 조기 진단, 심근경색 및 뇌졸중에서 병의 진행 정도 모니터링, 항암제 처리에 의한 암 치료효과 모니터링, 동맥경화에서 동맥경화반의 파열 가능성 판단 등의 경우에 매우 큰 도움이 될 것이다. 또한 아포토시스가 왕성한 부위에 이를 표적으로 치료제나 세포를 보호하는 제제를 선택적으로 전달하게 되면 부작용을 줄이면서 치료효과를 훨씬 높일 수 있을 것이다.
사멸세포에서 일어나는 초기 사건의 하나는 세포막을 구성하는 인지질(phospholipid)의 분포 변화이다. 이 중 가장 특징적인 것으로 포스파티딜세린(phosphatidylserine)의 세포막 바깥쪽으로의 노출이다. 정상적으로 포스파티딜세린은 세포막의 내부에 존재하나 세포가 사멸신호를 받거나 적혈구가 노화되면 세포막의 외부로 노출된다(Fadeel, B. et al., Cell Mol Life Sci, 2003, 60:2575-2585). 이러한 포스파티딜세린을 대식세포가 세포표면의 수용체를 통해서 인식하여 사멸세포에 대한 탐식작용을 일으킨다(Fadok, V.A. et al., J immunol 1992, 148:2207-2216; Fadok, V. A. et al., Nature 2000, 405:85-90; Park, S.Y. et. al., Cell Death Differ, 2008, 15:192-201). 특히, 많은 종양세포들이 세포막의 외부로 포스파티딜세린의 발현 증가를 나타낸다(Utsugi, T. et al., Cancer Res. 1991, 15:3062-3066; Ran, S. et al., Cancer Res. 2002, 62:6132-6140; Woehlecke, H. et al., Biochem J. 2003, 376:489-495). 또한 종양조직 내 소혈관의 혈관내피세포는 포스파티딜세린을 세포막의 외부로 노출하고 있다(Ran, S. et al., Cancer Res. 2002, 62:6132-6140; Zwaal, R.F.A. et al., Blood. 1997, 89:1121-1132). 따라서, 이러한 포스파티딜세린의 역할들로 인해 특히 종양을 비롯한 여러 상황에서 포스파티딜세린은 진단, 치료, 및 치료추적을 위한 표적 물질로 제시되고 있다.
현재 사멸세포 표면의 포스파티딜세린을 검출하는데 주로 사용되는 것은 아넥신 V(annexin V) 단백질이다. 이는 분자량 36 kDa 짜리 단백질로서 포스파디딜세린과 강한 친화도(affinity)로서 결합한다(Vermes, I. et al., Immunol Methods. 1995, 184:39-51). 한편, 아넥신 V는 시험관(in vitro) 내에서는 아주 유용한 표적 물질 또는 프로브(probe)이나, 큰 분자량 때문에 체외로의 제거가 늦게 되는 등의 문제로 생체(in vivo) 내 사용은 제한적이라 보고되었다(Vermeersch, H., et al., Nucl Med Commun. 2004, 25:259-263; Belhocine, T.Z. et al., J Proteome Res. 2004, 3:345-349).
이에 본 발명자들은 사멸세포를 특이적으로 그리고 초기에 생체 내 표적화 할 수 있는 새로운 단백질 또는 그 단편을 탐색하고자 연구한 결과, 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 서열로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 사멸세포를 특이적으로 표적할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 사멸세포를 특이적으로 표적하는 펩타이드 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 10 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 서열로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는, 사멸세포를 특이적으로 표적하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 사멸세포 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드 및 이와 결합된 항-종양성 질환 제제를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 부위의 영상화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드 및 이와 결합된 신경세포 보호 제제를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 부위의 영상화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드 및 이와 결합된 심근세포 보호 제제를 유효성분으로 포함하는 심근경색 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심근경색 부위의 영상화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드 및 이와 결합된 동맥경화 치료제를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 부위의 영상화용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 서열로 표시되는 아미노산을 가지는 폴리펩타이드가 아포토시스가 진행되고 있는 사멸세포에 특이적으로 결합한다는 점에 착안하여 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 서열로 표시되는 아미노산을 가지는, 새로운 서열의 폴리펩타이드와 이의 용도로서 상기 폴리펩타이드를 포함하는 사멸세포(apoptotic cell) 검출용 조성물 등을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 펩타이드는 아포토시스가 진행되고 있는 사멸세포에 특이적으로 결합하며, 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 서열로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 말한다. 본 발명의 펩타이드 단편은 모든 종류의 펩타이드, 단백질, 펩타이드 모조물, 화합물 및 생물제제를 포함하며, 사멸세포에 특이적으로 결합할 수 있는 활성을 갖는 것을 말한다. 본 발명의 펩타이드는 천연으로부터 유래될 수도 있으며, 공지의 펩타이드 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 천연형 아미노산 서열을 갖는 펩티드 뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 펩타이드의 변이체란 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산 유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 펩타이드를 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
경우에 따라서, 본 발명의 펩타이드는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 결과적으로 본 발명의 펩타이드를 암호화할 수 있는 어떤 조합의 염기서열도 가능하다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 벡터는 통상의 클로닝 벡터 또는 발현벡터일 수 있으며, 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
상기 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method)를 이용할 수 있으며, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스 ( Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 사멸세포에 특이적으로 결합하는 것으로 선별된 상기 펩타이드의 기능을 확인하고자 다양한 실험을 수행한 결과, 본 발명의 펩타이드가 아포토시스 과정에 있는 배양상태의 종양세포, 정상상피세포 및 마크로파지를 특이적으로 인식함으로써 상기 세포에 결합한다는 사실을 확인하였다. 또한, 본 발명의 펩타이드가 종양조직 내 사멸세포를 표적하여 이에 대한 생체 내 영상(in vivo imaging) 및 모니터링이 가능함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 펩타이드를 사멸세포의 검출용 조성물로 이용할 수 있음을 알 수 있었으며, 더 나아가 종양조직 내에 아포토시스를 인식하는 진단 또는 치료추적용 제제, 또는 별도의 종양 치료용 제제와 더불어 종양성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 등으로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
보다 구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 상용의 T7 파지 라이브러리를 이용하여 종양조직에서 분리한 마크로파지 및 혈관내피세포와 특이적으로 결합하는 파지를 각각 스크리닝하였다. 그 결과, 총 3 라운드의 스크리닝을 통해 상기 세포와 특이적으로 결합하는 파지를 각각 선별할 수 있었으며, 이의 서열을 분석한 결과 서열번호 1로 표시되는 CQRPPR, 서열번호 2로 표시되는 CSVAPR, 서열번호 3으로 표시되는 CNRPPR, 서열번호 4로 표시되는 CQKPPR, 서열번호 5로 표시되는 CQRPPK, 서열번호 6으로 표시되는 CNKPPR, 서열번호 7로 표시되는 CNRPPK, 서열번호 8로 표시되는 CQKPPK, 서열번호 9로 표시되는 CNKPPK, 서열번호 10으로 표시되는 CTVAPR, 서열번호 11로 표시되는 CSVAPK 및 서열번호 12로 표시되는 CTVAPK의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 각각의 세포에 대해 주로 선별됨을 알 수 있었다. 이러한 본 발명의 펩타이드는 무작위로 CX7C 펩타이드를 코딩하는 본 발명의 파지 라이브러리에서 각각 5개의 아미노산 이후에 종결코돈이 삽입된 것에 의해서 생성된 것으로 보인다.
본 발명의 다른 실시예에서는 누드 마우스 피부하에 이종이식된 종양 부위에 본 발명의 펩타이드가 표적되는지 여부 및 어떤 종류의 세포에 결합하는지를 확인하였다. 그 결과, 혈액 내로 주입한 본 발명의 펩타이드는 조직염색을 통한 관찰에서 종양조직 내에 표적되며, 이때 마크로파지 및 혈관내피세포가 아닌 아포토시스가 진행되고 있는 종양세포에 주로 결합함을 알 수 있었다.
본 발명의 또다른 실시예에서는 약제 처리로 아포토시스가 유도된 세포에 대한 상기 선별된 펩타이드의 결합 특이성을 확인하였다. 그 결과, 약제를 처리하지 않은 세포에는 펩타이드가 거의 결합하지 않는 데에 비해서 약제를 처리한 사멸세포에는 강하게 결합함을 알 수 있었다. 아울러, 선별된 펩타이드는 아넥신 V를 고농도로 먼저 처리하여도 사멸세포에 대한 펩타이드의 결합이 저해되지 않음을 알 수 있었다. 또한, 아포토시스의 초기뿐만 아니라 후기 단계에 있는 세포를 인식하여 결합함을 알 수 있었다.
본 발명의 또다른 실시예에서는 누드 마우스 피부하에 이종이식된 종양 부위에 본 발명의 펩타이드가 표적되고, 이를 영상화할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, 독소루비신을 처리한 후 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 주입한 군에서는 종양조직에 본 발명의 펩타이드가 표적되었고, 이를 형광표지를 통해 영상을 확인할 수 있었다. 반면 약제를 처리하지 않은 군에 본 발명의 펩타이드를 주입한 군 및 약제를 처리한 후 대조군 펩타이드를 주입한 군에서는 펩타이드의 표적을 관찰할 수 없었다.
본 발명의 또다른 실시예에서는 누드 마우스 피부하에 이종이식된 종양 부위에 방사성 동위원소가 표지된 본 발명의 펩타이드가 표적되고, 이를 양전자방출 단층촬영(positron emission tomography, PET)으로 영상화할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, 독소루비신을 처리한 후 I-123이 표지된 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 주입한 군에서는 종양부위에 PET 영상신호가 증가함을 통해 본 발명의 펩타이드가 표적되는 것을 확인할 수 있었다. 반면 현재 PET에 많이 사용되고 있는 F-18이 표지된 플루오로데옥시글루코스(fluorodeoxyglucose, FDG)를 주입한 군에서는 약제 처리 후 종양부위에 PET 영상신호가 감소하였다.
본 발명의 또다른 실시예에서는 동맥경화를 유도시킨 마우스의 대동맥에 본 발명의 펩타이드가 표적되고, 이를 영상화할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, 동맥경화 마우스에 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 주입한 군에서는 대동맥에 본 발명의 펩타이드가 표적되었고, 이를 형광표지를 통해 영상을 확인할 수 있었다. 반면 동맥경화 마우스에 대조군 펩타이드를 주입한 군 및 정상 마우스에 본 발명의 펩타이드를 주입한 군에서는 펩타이드의 표적을 관찰할 수 없었다.
본 발명의 또다른 실시예에서는 뇌졸중을 유도시킨 래트의 뇌조직에 본 발명의 펩타이드가 표적되고, 이를 영상화할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, 뇌졸중 유도 래트에 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 주입한 군에서는 손상된 뇌조직에 본 발명의 펩타이드가 표적되었고, 이를 형광표지를 통해 영상을 확인할 수 있었다. 반면 뇌졸중 유도 래트에 대조군 펩타이드를 주입한 군 및 정상 래트에 본 발명의 펩타이드를 주입한 군에서는 펩타이드의 표적을 관찰할 수 없었다.
본 발명의 또다른 실시예에서는 심근허혈(myocardial ischemia) 또는 심근경색(myocardial infarction)을 유도시킨 래트의 심근조직에 본 발명의 펩타이드가 표적되고, 이를 영상화할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, 심근허혈 유도 래트에 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 주입한 군에서는 손상된 심근조직에 본 발명의 펩타이드가 표적되었고, 이를 형광표지를 통해 영상을 확인할 수 있었다. 반면 대조군 래트에 본 발명의 펩타이드를 주입한 군에서는 펩타이드의 표적을 관찰할 수 없었다.
결론적으로, 본 발명의 펩타이드가 사멸세포와 특이적으로 결합하여 생체 내에서 아포토시스 인식 및 종양 표적을 할 수 있음을 알 수 있었다.
참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오타이드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).
따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 서열을 가지는 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 사멸세포 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 펩타이드의 사멸세포 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제), 방사성 동위원소(예: 18F, 124I, 125I, 32P, 35S), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 형광단백질(GFP(Green Fluorescent Protein); EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein); DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), Cy3, Cy5 및 Cy7.5), 상자성입자(super paramagnetic particles) 또는 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)일 수 있다.
표지에 따른 검출 방법은 당업계에 널리 알려져 있으나, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법을 이용할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 시료와 반응시키고 미결합 또는 비특이적인 결합 산물을 제거한 다음 형광현미경 하에서 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 또한 검출가능한 표지로 효소를 이용하는 경우에는 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 수행할 수 있다. 아울러, 검출된 결과는 검출표지에 따른 공지된 영상화 방법에 따라 영상화될 수도 있다.
또한, 본 발명은 (a) 본 발명의 폴리펩타이드를 시료와 혼합하는 단계; (b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩타이드를 제거하는 단계; 및 (c) 상기 폴리펩타이드의 결합 여부 및 위치를 확인하는 단계를 포함하는 사멸 세포의 검출 방법을 제공한다. 이 때, 본 발명의 폴리펩타이드 및 사멸세포와 결합된 본 발명의 폴리펩타이드의 검출 방법은 상기에서 기재한 바 또는 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.
또한 본 발명의 펩타이드는 사멸세포와 특이적으로 결합할 수 있으므로 약물을 상기 세포에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
상기한 바와 같이, 아포토시스는 여러 종류의 종양세포 뿐만아니라, 뇌졸중, 심근경색 및 동맥경화가 진행되는 세포에서 나타난다(Thomson, Science, 1995, 67:1456-1462; Du et al, J Cereb Blood Flow Metab, 1996, 16:195-201; Narula et al., New Engl J Med, 1996, 335:1182-1189). 따라서, 상기 약물 전달용 조성물은 종양성 질환, 뇌졸중, 심근경색 또는 동맥경화에 특이적일 수 있다. 종양성 질환이란 악성 종양에 의해 병리적 증상을 보이는 질환으로서, 그 예로는 이에 한정되지는 않으나, 대장암, 폐암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 피부암, 간암, 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 복합 골수종(multiple myeloma), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 신경아종(neuroblastoma), 재생불량성 빈혈일 수 있다.
본 발명의 약물 전달용 조성물에 포함되는 본 발명의 펩타이드를 종래 항-종양성 질환 제제. 심근경색 치료제, 뇌졸중 치료제 및 동맥경화 치료제 등의 약제와 연결하여 치료에 이용한다면 본 발명의 펩타이드에 의해 상기 제제가 종양세포, 심근경색 부위, 뇌졸중 부위, 동맥경화 부위 등의 질환 부위에만 선택적으로 전달되기 때문에 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 현저히 줄일 수 있다.
본 발명의 펩타이드에 연결될 수 있는 항-종양성 질환 제제는 종래 종양 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴(cisplatin), 5-플로오우라실(5-fluorouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard), 니트로소우레아(nitrosourea) 등이 있다. 아울러, 심근경색 치료제, 뇌졸중 치료제 및 동맥경화 치료제는 종래 이들 질환의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예컨대, 상기 뇌졸중 및 심근경색 질환에서 혈관을 막고 있는 혈전을 제거하기 위해 사용되고 있는 혈전용해제(thrombolytic drug)인 스트렙토키나제(streptokinase), 유로키나제(urokinase), 알테플라제(alteplase) 등의 약물이 있다. 또한 심근세포 보호제인 안지오텐신(angiotensin) II 억제제, 알도스테론(aldosterone) 수용체 억제제 및 에리트로포이에틴(erythropoietin) 등이 있다. 또한 뇌신경세포 보호제인 NMDA (N-methyl-d-aspartate) 수용체 억제제 등이 있다. 또한 콜레스테롤 합성 억제 및 혈중 콜레스테롤 농도를 낮추는 약물인 로바스타틴(Lovastatin), 혈관평활근세포의 증식을 줄이는 약물인 라파마이신(Rapamycin), 항염증약물인 셀레브렉스(Celebrex), 혈소판 응집 억제 약물인 티클로핀(Ticlopin) 및 기질금속단백질분해효소(matrix metalloprotease) 억제 약물인 마리마스타트(Marimastat) 및 트로케이드(Trocade) 등이 있다. 상기 제제와 본 발명의 펩타이드의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 펩타이드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 펩타이드의 양은 결합되는 항암제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있다.
한편, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 및 이와 결합된 항-종양성 질환 제제를 유효성분으로 종양성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이 때, 상기 약학적 조성물에서 항-종양성 질환 제제, 결합 방법 및 종양성 질환에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 펩타이드의 순수한 형태 또는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화함으로써 제공될 수 있다. “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀, 생분해성 나노입자 등이 포함된다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 적합한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 안정화제(아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산) 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제(벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올)를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 진단 또는 치료 효과의 추적을 가능하게 하는 화합물 또는 추출물의 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 대상 질환 및 이의 중증정도, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 할 때 1회 투여시 10 ㎍ 내지 10 ㎎의 유효용량으로 하루에 수 차례 반복 투여될 수 있다.
아울러, 본 발명의 펩타이드는 사멸세포와 특이적으로 결합하므로 종양성 질환의 발병 부위의 영상화 및 진단에도 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환의 영상화 및 진단용 조성물을 제공한다. 이 때, 종양성 질환의 영상화 및 진단은, 이에 한정되지는 않으나, 종양성 질환의 초진 목적 뿐만아니라, 진행 경과, 종양 치료에 대한 치료 경과, 치료제에 대한 반응 모니터링 등을 포괄하여 사용할 수 있다. 상기 펩타이드는 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 표지된 상태로 제공될 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 기술한 바와 같다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 사멸세포와 특이적으로 결합하므로 종양에만 국한되지 않고 아포토시스가 크게 증가해 있는 뇌졸중, 심근경색 및 동맥경화에서 본 발명의 펩타이드는 약물 전달을 할 수 있다. 즉, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 및 이와 결합된 뇌졸중 치료제를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 아울러, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 및 이와 결합된 심근경색 치료제를 유효성분으로 포함하는 심근경색 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 아울러, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 및 이와 결합된 동맥경화 치료제를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 펩타이드를 종래 뇌졸중 치료제, 심근경색 치료제 및 동맥경화 치료제와 연결하여 치료에 이용한다면 본 발명의 펩타이드에 의해 상기 제제가 질병 부위의 세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 현저히 줄일 수 있다.
본 발명의 펩타이드에 연결될 수 있는 심근경색 치료제, 뇌졸중 치료제 및 동맥경화 치료제는 종래 이들 질환의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 상기에서 언급한 스트렙토키나제(streptokinase), 유로키나제(urokinase), 알테플라제(alteplase), 안지오텐신(angiotensin) II 억제제, 알도스테론(aldosterone) 수용체 억제제, 에리트로포이에틴(erythropoietin), NMDA (N-methyl-d-aspartate) 수용체 억제제, 로바스타틴(Lovastatin), 라파마이신(Rapamycin), 셀레브렉스(Celebrex), 티클로핀(Ticlopin), 마리마스타트(Marimastat) 및 트로케이드(Trocade) 등이 이용될 수 있다. 상기 제제와 본 발명의 펩타이드의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 펩타이드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 펩타이드의 양은 결합되는 상기 치료제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있다.
아울러, 본 발명의 펩타이드는 사멸세포와 특이적으로 결합하므로 뇌졸중, 심근경색 및 동맥경화의 발병 부위의 영상화 및 진단에도 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 부위의 영상화용 조성물을 제공한다. 아울러, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심근경색 부위의 영상화용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 부위의 영상화용 조성물을 제공한다.
이 때, 질환의 영상화 및 진단은, 이에 한정되지는 않으나, 질환의 초진 목적 뿐만아니라, 진행 경과, 치료에 대한 치료 경과, 치료제에 대한 반응 모니터링 등을 포괄하여 사용할 수 있다. 상기 펩타이드는 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 표지된 상태로 제공될 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 기술한 바와 같다.
본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 서열을 가지는 펩타이드는 사멸세포와 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 사멸세포의 검출, 더 나아가 종양조직 내 사멸세포, 심근경색 조직 내 사멸심근세포, 뇌졸중 조직 내 사멸신경세포 및 동맥경화 부위의 검출과 영상진단 및 표적 약물전달 등에 다양하게 사용될 수 있다.
도 1은 사람의 일차 폐암조직에서 유래한 여러 종류의 세포(종양세포, 혈관내피세포, 마크로파지, 섬유아세포)에 각각 특이적으로 결합하는 파지를 탐색하는 과정에 대한 모식도이다.
도 2는 A549 종양세포를 피부하에 이종이식한 누드마우스의 꼬리 정맥으로 형광을 붙여 합성한 서열번호 1로 표시되는 본 발명의 펩타이드(ApoPep-1)를 주입한 후, 종양조직에 대한 H&E 염색(A), 펩타이드의 형광(B,D,G,J), TUNEL 염색(E,H), 피브리노전 염색(K) 및 컴퓨터를 통한 각각의 영상합성(F는 D와 E, I는 G와 H, L은 J와 K)을 보인 것이다. (C)는 대조군 펩타이드의 형광영상이다. (D-F)는 (A)의 별표 표시 부위이고, (G-I)는 (A)의 삼각형 표시 부위에 해당된다. 또한 서열번호 2로 표시되는 본 발명의 펩타이드(ApoPep-2)를 대상으로 동일한 방식으로 실험을 진행한 후, 펩타이드의 형광(M), TUNEL 염색(N) 및 이의 영상합성(O)을 보인 것이다.
도 3은 에토포사이드를 처리하여 아포토시스가 유도된 각종 세포(A549, H460, HeLa, L132, RAW)에 대한 본 발명의 펩타이드(ApoPep-1)의 결합에 따른 형광(B, F, J, N, R), 각각의 세포에 대한 아넥신 V 염색(C, G, K, O, S) 및 각각의 영상합성(D, H, L, P, T)을 보인 것이다. (A, E, I, M, Q)는 대조군으로 아포토시스를 유도하는 약물을 처리하지 않은 세포에 대한 본 발명의 펩타이드(ApoPep-1)의 결합과 아넥신 V 결합에 대한 영상을 합성한 것이다.
도 4는 A549 종양세포에 에토포사이드를 처리하여 아포토시스를 유도하고 형광 표지가 없는 아넥신 V를 0 μM(A), 200 μM(B) 및 1000 μM(C)의 농도로 전처리 한 후, 붉은색의 형광이 표지된 아넥신 V의 결합을 나타낸 것이다. 또한 상기 아넥신 V를 1000 μM 농도로 전처리 한 후, 본 발명의 펩타이드(ApoPep-1)의 결합(E), 핵염색(D) 및 이의 영상합성(F)을 나타낸 것이다.
도 5는 A549 종양세포에 에토포사이드를 처리하지 않거나 처리한 후, 아넥신 V의 결합(A) 및 본 발명의 펩타이드(ApoPep-1) 또는 대조군 펩타이드(Control)의 결합(B)을 FACS로 분석한 것이다. 이때, 가로축은 아넥신 V 및 펩타이드 결합 정도를 나타내고, 세로축은 PI(propodim iodide) 염색 정도를 나타낸 것이다. 또한 (C)는 상기 세포에 대한 본 발명의 펩타이드(ApoPep-2) 및 대조군 펩타이드의 결합을 4oC 및 37oC에서 각각 수행한 후, 그 결합을 FACS로 분석하여 퍼센트로 나타낸 것이다(A549 : 에토소사이드 미처리 군; Etoposide : 에토포사이드 처리군).
도 6은 종양이 이종이식된 누드마우스를 독소루비신으로 처리하지 않거나 처리한 24 시간 후에, 형광이 표지된 서열번호 1의 펩타이드(ApoPep-1)(A) 및 서열번호 2의 펩타이드(ApoPep-2)(B)를 혈관 내로 주입하고 이들의 생체 내 표적을 시간대별로 형광을 이용해 영상화한 것이다.
도 7은 종양이 이종이식된 누드마우스를 독소루비신으로 처리한 24 시간 후에, 방사성동위원소 F-18이 표지된 FDG 및 I-124가 표지된 서열번호 1의 펩타이드(ApoPep-1)를 혈관 내로 주입하고 이들의 생체 내 아포토시스 표적을 마이크로 PET을 이용해 영상화한 것이다.
도 8은 저밀도지질단백질(LDL) 수용체를 유전적으로 결핍(Ldlr(-/-))시킨 동맥경화 모델 마우스 및 정상 마우스에 Cy7.5 근적외선형광이 표지된 서열번호 1의 펩타이드(ApoPep-1)를 정맥 주사한 1 시간 후, 근적외선을 등에서 촬영(A) 또는 복부를 열고 대동맥을 노출한 상태에서 촬영(C)한 것이다. (B)는 (A)의 근적외선의 강도를 수치로 나타낸 것이다. 또한 (D)는 각각의 마우스에서 대동맥을 격리하여 근적외선을 촬영한 것이다(ApoPep-1-Cy7.5 : Cy7.5 표지된 ApoPep-1; NSSSVDK-Cy7.5 : Cy7.5 표지된 대조군 펩타이드).
도 9는 중간대뇌동맥(middle cerebral artery)를 2 시간 동안 결찰 뒤 혈류를 재순환 시킨 뇌졸중 래트(rat) 모델 및 정상 래트에 Cy7.5 근적외선형광이 표지된 서열번호 1의 펩타이드(ApoPep-1)를 정맥 주사한 1 시간 및 3 시간 후, 머리 부위의 근적외선을 촬영하고(A), 3 시간 그룹의 래트에서 각각 뇌를 격리하여 근적외선을 촬영한(B) 것이다(ApoPep-1-Cy7.5 : Cy7.5 표지된 ApoPep-1; NSSSVDK-Cy7.5 : Cy7.5 표지된 대조군 펩타이드).
도 10은 심근허혈(myocardial ischemia) 및 대조군(Sham) 래트에 Cy7.5 근적외선형광이 표지된 서열번호 1의 펩타이드(ApoPep-1)를 정맥 주사한 2 시간 후, 심장 부위의 근적외선을 촬영하고(A), 각각의 심장을 격리하여 근적외선을 촬영한(B) 것이다.
이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
종양조직의 세포에 대한 결합 특이성을 가진 펩타이드의 탐색
<1-1> 파지 펩타이드 라이브러리의 제조
본 발명자들은 종양조직을 구성하는 각종 세포에 특이적인 펩타이드를 찾아내기 위하여, 파지 펩타이드 디스플레이 기술을 이용하였다(Smith, Science, 228:1315-1317, 1985). 파지 펩타이드 디스플레이는 수 개 내지 수 십 개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 박테리오파지 표면에 디스플레이 하는 것이다. 최대 109 종류의 펩타이드를 가진 파지 라이브러리를 만들 수 있기 때문에 한꺼번에 많은 종류의 펩타이드를 탐색하여 원하는 조직 또는 종양에 표적되는 펩타이드를 찾는 데 유용한 기술이다.
본 발명에 사용한 파지 펩타이드 라이브러리는 다음과 같은 방법에 의해 제조하였다: 먼저 양 말단에 시스테인이 있고 그 사이에 임의의 7개 아미노산을 포함하는 CX7C 펩타이드를 코딩(coding)하는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 무작위로 합성하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드의 합성은 마크로젠사(대한민국)에 의뢰하여 수행하였다. 이후, 합성된 올리고뉴클레오타이드를 노바젠(Novagen, 미국)사의 T7Select 파지 클로닝 키트를 이용하여 제조사의 지침에 따라서 상기 합성된 올리고뉴클레오타이드를 T7 415-1b 파지의 표면을 구성하는 캡시드(capsid) 단백질 유전자 내로 클로닝하여 파지 펩타이드 라이브러리를 제조하였다. 제조된 파지 펩타이드 라이브러리의 다양성은 약 5 x 108 pfu 정도로 측정되었다.
<1-2> 파지 펩타이드 라이브러리의 탐색
종양치료의 목적으로 시행된 수술적 절제의 결과로 나온 종양조직 및 종양 주변 부위의 정상조직을 각각 칼로 잘게 자르고 조직 분쇄기를 이용해 갈아 세포 현탁액(cell suspension)을 만들었다. 상기 실시예 <1-1>에서 제작한 파지 라이브러리를 정상조직 유래 세포 현탁액와 섞은 다음 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 상층액만을 취하여 정상세포에 결합하지 않은 파지를 회수한 다음,숙주인 BL21 대장균을 이용하여 타이터를 증폭하였다. 그 다음 종양조직 유래 세포 현탁액과 동일한 조건으로 반응시켰다. 종양세포에 비특이적으로 약하게 붙어 있는 파지를 1%의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA)이 포함된 DMEM용액(Dulbeco's modified Eagle's medium) 1ml로 실온에서 5분간 총 3회 세척하여 제거하였다. 세척 후 마크로파지에 대한 항체(항-CD14 항체, Dynal사) 또는 혈관내피세포에 대한 항체(항-CD31 항체, Dynal사)가 표면에 붙어 있는 자성입자를 세포 현탁액과 4℃에서 30분간 반응시키고 자석을 이용하여 각각의 자성입자에 결합한 세포를 분리하였다. 분리된 마크로파지 또는 혈관내피세포에 1% NP-40가 포함된 DMEM 용액 100μl를 4℃에서 10분간 처리한 다음, 숙주인 BL21 대장균 배양액 900μl를 첨가하여 세포에 결합된 파지를 검출하였다. 검출된 파지의 일부는 당업계에 공지된 방법 (Phage display, Clackson T and Lowman HB, p.171, 2004, Oxford University Press, New York).에 따라 타이터를 측정하고, 나머지는 증폭하여 수를 불린 후 각각의 세포에 결합하는 파지를 탐색하는 과정을 상기 방법에 따라 총 3 회 반복 실시하였다. 그 결과, 종양조직에서 유래한 마크로파지 및 내피세포에 결합한 파지 타이터가 순차적으로 크게 증가하여 전체적으로 성공적인 탐색이 이루어졌음을 알 수 있었다. 상기 탐색과정의 모식도를 도 1로 나타내었다.
<1-3> 파지 클론의 염기서열 판독 및 아미노산 서열 분석
상기 실시예 <1-2>를 통하여 탐색한 파지에 어떤 펩타이드가 디스플레이 되었는지 조사하기 위해 각각의 세포에 대해 무작위로 30 개의 파지 클론을 선택하고 파지에 삽입된 DNA를 PCR로 증폭한 후 서열분석(sequencing)을 하셨다. 이 때 5’-프라이머로서 올리고뉴클레오타이드(AGCGGACCAGATTATCGCTA, 서열번호 13) 및 3’-프라이머로서 올리고뉴클레오타이드(AACCCCTCAAGACCCGTTTA, 서열번호 14)를 각각 사용하였다. PCR은 95℃에서 5분 동안 가열하여 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 50초; 50℃에서 1분; 및 72℃에서 1분을 1 사이클로 하여 총 35회 반복 수행한 다음, 72℃에서 6분 동안 최종적으로 반응시켜 수행하였다.
이후, PCR 반응 산물의 염기서열을 염기서열 분석 회사(바이오니아사)에 의뢰하여 판독하였다. 판독된 염기서열을 바탕으로 아미노산 서열을 추정하였다. 추정된 아미노산 서열을 ClustalW 프로그램으로 분석한 결과, 마크로파지 및 내피세포에 대해 각각 가장 흔한 빈도로 나타난 대표적인 파지 클론의 펩타이드를 얻었으며, 서열번호 1(ApoPep-1로 명칭, CQRPPR, 마크로파지로 선별), 서열번호 2(ApoPep-2로 명칭, CSVAPR, 내피세포로 선별), 서열번호 3(CNRPPR), 서열번호 4(CQKPPR), 서열번호 5(CQRPPK), 서열번호 6(CNKPPR), 서열번호 7(CNRPPK), 서열번호 8(CQKPPK), 서열번호 9(CNKPPK), 서열번호 10(CTVAPR), 서열번호 11(CSVAPK) 및 서열번호 12(CTVAPK)로 각각 나타내었다.
< 실시예 2>
본 발명의 펩타이드의 생체 내 종양 표적에 대한 조직학적 평가
<2-1> 종양 이종이식 모델 누드 마우스의 제조
모든 동물실험은 소속 기관의 동물실험 윤리위원회의 가이드라인에 따라 수행되었다. 종양 이종이식(tumor xenografts)을 하기 위하여, 6주령 BALB/c 수컷 누드 마우스(효창사이언스사)에 RMPI-1640 배지에 부유시킨 A549 사람 폐암 세포주(1 x 107 개)를 오른쪽 상지 또는 하지 부위에 피하 주사하였다. 그런 다음 3주간 종양세포가 0.5 내지 1cm의 크기로 자랄 수 있도록 하였다. 본 실험에 사용한 A549 세포주는 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신)가 첨가된 10% 우태아혈청(FBS, Fetal bovine serum)을 포함하는 RMPI-1640 배지에서 배양하였으며, 3 내지 4일마다 개대배양하였다.
<2-2> 종양 표적에 대한 조직학적 분석
본 발명에서 사용된 펩타이드는 N-말단에 플루오레신(fluorescein)이 결합된 형태로서, 표준 Fmoc 방법에 따라 합성한 후 HPLC 기기로 분리하였다. 본 펩타이드의 합성은 전문회사(Peptron사)에 의뢰하여 시행하였다.
플루오레신이 표지된 본 발명의 펩타이드(ApoPep-1) 또는 대조군 펩타이드(아미노산 서열, NSSSVDK)를 이소플루란 마취(isoflurane anesthesia)하에서 마우스 꼬리 정맥을 통해 최종 50 농도로 투입한 후, 2시간 동안 순환시켰다.
조직학적 시험을 위하여, 상기 마우스를 마취한 다음 개복하였다. 심장을 통해 phosphate-buffered saline(PBS) 세척액 및 4% 파라포름알데히드 고정액을 순차적으로 관류시키고, 종양 조직 및 기관을 제거하였다. 각 조직을 동결절단(Cryosections)한 다음 형광현미경(fluorescence microscopy, Zeiss사)으로 본 발명의 펩타이드를 관찰하였다. 종양 조직에서의 아포토시스는 제조회사(Chemicon사)의 지침에 따라 TUNEL(in vitro terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) 분석법으로 확인하였다. 피브리노전(fibrinogen) 염색은 이에 대한 항체(Abcam사) 및 붉은 색 형광시약인 알렉사 568로 표지된 2차 항체를 이용하여 면역조직화학법(immunohistochemistry)으로 시행하였다.
그 결과, 도 2에서 보듯이, H&E 염색을 통하여 종양이 확인되었으며(도 2A), 본 발명의 펩타이드(ApoPep-1)를 주입한 경우 종양조직에서 펩타이드가 관찰되나(도 2B), 대조군 펩타이드의 경우 거의 관찰되지 않음을 알 수 있었다(도 2C). 한편, 도 2A에서 별표로 표시한 부위에 대한 펩타이드 형광(도 2D), TUNEL 염색(도 2E) 및 이의 영상합성(도 2F)을 함으로써 TUNEL 염색이 되는 세포, 즉 사멸세포에 펩타이드가 결합하는 것을 알 수 있었다. 또한 도 2A에서 삼각형으로 표시한 부위에 대한 펩타이드 형광(도 2G), TUNEL 염색(도 2H) 및 이의 영상합성(도 2I)을 함으로써 TUNEL 염색이 되지 않는 세포에도 펩타이드가 결합하였으며, 이 부위에 대한 펩타이드 형광(도 2J), 피브리노전 염색(도 2K) 및 이의 영상합성(도 2L)을 통해 세포의 응고괴사(coagulation necrosis) 부위임을 알 수 있었다.
아울러, 서열번호 2의 펩타이드(ApoPep-2)를 사용하여 상기와 유사한 실험을 하여 펩타이드 형광(도 2M), TUNEL 염색(도 2N) 및 이의 영상합성(도 2O)을 함으로써, 종양조직 내 사멸세포에 펩타이드가 결합함을 알 수 있었다.
< 실시예 3>
배양상태의 사멸세포에 대한 본 발명의 펩타이드의 결합
<3-1> 사멸세포에 대한 펩타이드 결합의 현미경적 관찰
세포를 챔버 슬라이드(Nalgen Nunc사)에서 배양하고, 50 μM 농도의 에토포사이드(etoposide, Sigma사)를 정해진 시간 동안 처리하여 아포토시스를 유도하였다(A549 및 HeLa 세포 15시간, H460 세포 24시간, L132 세포 3시간, RAW 세포 6시간). 상기 세포는 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신)와 10% 우태아혈청을 포함하는 RMPI-1640 배지(A549 및 H460 세포) 및 DMEM 배지(HeLa, L132 및 RAW 세포)에서 배양하였다. 한편, 모든 세포는 3 내지 4일마다 개대배양하였다. 아포토시스가 유도된 사멸세포를 PBS로 세척한 다음, 1% BSA로 37oC에서 30분간 블로킹(blocking)을 하고 10 μM의 플루오레신으로 표지된 펩타이드와 세포를 4oC에서 1시간 반응시켰다. 세포를 세척한 다음, 알렉사594 형광시약으로 표지된 아넥신 V(Molecular Probes사)를 첨가한 아넥신 V 반응완충액과 세포를 실온에서 15분간 반응시켰다. 세포를 PBS로 세척한 다음 4% 파라포름알데히드로 5분간 고정하였다. 이후, 핵 염색제인 4‘6’-디아미디노-2-페닐인돌(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)로 대응염색(counterstain)한 다음 마운팅액(Molecular Probes사)을 처리하고 형광 현미경(Zeiss사)으로 촬영하였다.
그 결과, 도 3에서 보듯이, 에토포사이드를 처리하지 않은 정상세포에 본 발명의 펩타이드(ApoPep-1) 및 아넥신 V를 처리한 경우 표지가 되지 않았다(왼쪽에서 첫 번째 열, 도 3의 A, E, I, M, O). 이에 비해서 에토포사이드를 처리한 사멸세포에 본 발명의 펩타이드(ApoPep-1)(왼쪽에서 두 번째 열, 도 3의 B, F, J, N, R) 또는 아넥신 V(왼쪽에서 세 번째 열, 도 3의 C, G, K, O, S)를 처리한 경우 두 경우 모두에서 표지가 되었고, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 사진을 합성한 결과 본 발명의 펩타이드와 아넥신 V가 서로 동일한 부위에 결합함을 알 수 있었다(왼쪽에서 네 번째 열, 도 3의 D, H, L, P, T).
<3-2> 아넥신 V의 처리에 따른 사멸세포에 대한 펩타이드 결합의 경쟁적 저해 시험
사멸세포에 대한 본 발명의 펩타이드(ApoPep-1)의 결합 특성을 더욱 더 조사하기 위하여 아넥신 V와의 경쟁적 저해 여부를 측정하였다. 이를 위하여 먼저, A549 사멸세포에 형광이 표지되지 않은 아넥신 V를 0, 200 및 1000 의 농도로 전처리한 다음, 형광 표지된 아넥신 V를 상기 실시예 <3-1>에 기재한 바와 같은 조건으로 세포와 반응시키고 그 결합 여부를 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 4A 내지 C에서 보듯이, 형광이 표지되지 않은 아넥신 V를 고농도로 전처리한 경우 형광이 표지된 아넥신 V의 결합이 경쟁적으로 저해되어 이에 의한 형광이 크게 감소함을 알 수 있었다.
한편, A549 사멸세포에 형광이 표지되지 않은 아넥신 V를 1000 의 농도로 전처리한 다음, 형광 표지된 펩타이드를 상기 실시예 <3-1>에 기재한 바와 같은 조건으로 세포와 반응시키고 그 결합 여부를 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 4D 내지 F에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드(ApoPep-1)의 결합은 고농도의 아넥신 V를 전처리 하더라도 저해되지 않았다.
<3-3> FACS 분석을 통한 사멸세포에 대한 본 발명의 펩타이드의 결합 확인
사멸세포에 대한 본 발명의 펩타이드 결합을 확인하기 위한 또다른 방법으로 사멸세포에 플루오레신이 표지된 본 발명의 펩타이드를 처리한 다음, 결합 여부를 FACS 분석으로 확인하였다. 먼저 50 μM 농도의 에토포사이드를 A549 세포에 6 내지 15시간 처리하여 아포토시스를 유도하였다. 플루오레신 표지된 본 발명의 ApoPep-1 펩타이드(5 ) 또는 ApoPep-2 펩타이드(10 ) 및 동일 농도의 대조군 펩타이드를 정상 또는 사멸세포와 4oC에서 1시간 반응하였다. 한편 플루오레신 표지된 아넥신 V는 실온에서 15분간 세포와 반응하였다. 상기 세포를 propodium iodide (PI)로 동시 염색한 후 PBS로 세척한 다음, FACS 기기(Becton Dickinson사)를 사용하여 FACS 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 5에서 보듯이, 에토포사이드를 처리한 A549 사멸세포에 아넥신 V와 PI를 염색한 경우, 아넥신 V 염색만이 되는 세포(Q4 분획, 아포토시스 초기단계) 및 아넥신 V와 PI가 둘 다 동시에 염색되는 세포(Q2 분획, 아포토시스 후기단계)의 퍼센트는 15시간의 경우에 각각 64.3%와 9.4%로 6시간 처리한 경우에 비해 많아진 것을 알 수 있었다(도 5A). 한편, 15시간 에토포사이드 처리한 세포에 본 발명의 ApoPep-1 펩타이드를 처리한 경우, 아포토시스 초기단계와 후기단계의 세포에 펩타이드가 각각 90.3%와 7.2% 퍼센트로 결합함을 알 수 있었다(도 5B). 반면, 사멸세포에 대조군 펩타이드를 처리한 경우 및 정상세포에 본 발명의 펩타이드(ApoPep-1)를 처리한 경우는 결합하는 세포가 거의 없었다.
아울러, 20시간 에토포사이드 처리한 A549 사멸세포에 본 발명의 ApoPep-2 펩타이드를 4oC 및 37oC의 온도 조건에서 1시간 동안 처리하였을 경우에도, 정상세포에 비해 사멸세포에 더 잘 결합함을 알 수 있었다(도 5C).
< 실시예 4>
본 발명의 펩타이드의 종양 내 사멸세포 표적 검증 및 영상화
<4-1> 펩타이드의 종양 내 사멸세포 표적 검증 및 영상화
상기 실시예 <2-1>에서와 같이 A549 폐암세포주로 종양이 이종이식된 누드 마우스를 준비한다. 이들 마우스를 각각 항암제인 독소루비신(doxorubicin, Sigma사) 처리군(+Dox) 및 미처리군(-Dox)으로 나눈 다음, 처리군에는 펩타이드 주입 일주일 전에 48시간 간격으로 3회 독소루비신(10 mg/kg)을 처리하였다. 그런 다음 각각의 마우스에 플루오레신이 표지된 본 발명의 펩타이드 또는 대조군 펩타이드를 이소플루란 마취하에서 꼬리 정맥을 통해 최종 50 μM 농도로 주입하였다. 주입 후 1시간부터 6시간까지 매 시간 마다 Optix exPlore 기기(GE Healthcare사)를 사용하여 생체 형광영상을 촬영하였다. 또한 기기 자체의 소프트웨어를 사용하여 각 영상을 표준화하였다.
아울러, 종양이 상당히 자란 경우(지름 1 cm 이상)에는 독소루비신을 처리하지 않은 상태에서 본 발명의 펩타이드를 상기와 같은 농도로 주입하고 일정 시간 마다 IVIS 형광영상시스템(Chemipro사)을 사용하여 생체 형광영상을 촬영하였다.
그 결과, 도 6A에서 보듯이, 독소루비신 처리군에 본 발명의 ApoPep-1 펩타이드를 주입한 경우에 종양 조직에서 플루오레신으로 인한 형광 신호가 2시간째 가장 강하게 측정되었고 5시간까지 측정됨을 알 수 있었다. 반면, 독소루비신 미처리군에 본 발명의 펩타이드를 주입하거나, 독소루비신 처리군에 대조군 펩타이드를 주입한 경우 형광 신호가 미약하게 검출되거나 거의 검출되지 않음을 알 수 있었다.
또한 도 6B에서 보듯이, 본 발명의 ApoPep-2 펩타이드를 지름 1 cm 이상의 큰 종양이 있는 마우스에 주입한 경우 2시간째부터 종양에서 형광이 발견되고 5시간째 강한 형광영상이 측정되었다. 이는 크기가 큰 종양의 경우 약제를 처리하지 않더라도 종양조직 내 상당 부분 아포토시스가 일어났음을 시사하는 것이다.
<4-2> 펩타이드의 종양 내 사멸세포 표적에 대한 핵의학 영상
상기 실시예<2-1>에서와 같이 H460 폐암세포주로 종양이 이종이식된 누드 마우스를 준비한다. 이들 마우스를 각각 항암제인 독소루비신 처리군 및 비처리군으로 나눈 다음, 처리군에는 펩타이드 주입 일주일 전에 48시간 간격으로 3회 독소루비신(10 mg/kg)을 처리하였다. 그런 다음 각각의 마우스에 방사성동위원소 I-124 표지된 본 발명의 펩타이드(ApoPep-1)를 이소플루란 마취하에서 꼬리 정맥을 통해 주입하였다(처리군, 91 μCi; 비처리군, 93 μCi). 한편, 현재 양전자방출단층촬영(PET)에 주로 사용되는 F-18 표지된 FDG를 독소루비신 처리군 및 비처리군에 각각 300 μCi 및 304 μCi 주입하였다. [124I]ApoPep-1 펩타이드 주입 후 5 시간 및 [18F]FDG 주입 후 1 시간 후에 micro PET 기기(Concorde MicroSystems사)를 사용하여 핵의학 영상을 각각 촬영하였다.
그 결과, 도 7에서 보듯이, [124I]ApoPep-1 펩타이드를 주입한 경우 독소루비신 처리군에서 비처리군에 비해 더욱 강해진 영상신호가 종양 부위에서 관찰되었다. 반면, [18F]FDG의 경우는 독소루비신 처리군에서 비처리군에 비해 더욱 약해진 영상신호가 관찰되었다. 이는 항암제 처리에 의해 종양세포의 아포토시스가 유도된 것을 본 발명의 펩타이드가 인식하여 모니터링 할 수 있음을 시사한다.
< 실시예 5>
본 발명의 펩타이드를 이용한 동맥경화의 분자영상
동맥경화 동물모델은 저밀도 지질단백질(low density lipoprotein, LDL)에 대한 수용체를 유전적으로 결핍(Ldlr(-/-))시킨 마우스에 고콜레스테롤 식이를 8주간 실시하여 유도하였다. 동맥경화 및 정상 마우스에 Cy7.5 근적외선 형광이 표지된 서열번호 1의 펩타이드(ApoPep-1) 또는 대조군 펩타이드를 이소플루란 마취하에서 꼬리 정맥을 통해 최종 50 μM 농도로 주입하였다. 2 시간 후에 마우스를 마취시킨 상태에서 근적외선 형광을 Optix exPlore 기기를 사용하여 생체 촬영하였다. 생체 촬영 후에는 대동맥을 격리하여 체외에서 근적외선 형광을 측정하였다.
그 결과, 등에서 촬영했을 때, ApoPep-1 펩타이드를 주입한 동맥경화 마우스에서 대조군 펩타이드에 비해 더 강한 근적외선 형광이 관찰되었고, 정상 마우스에는 ApoPep-1 펩타이드를 주입하더라도 형광이 거의 관찰되지 않았다 (도 8A). 이때 형광의 강도를 수치로 환산하면 본 발명의 펩타이드의 형광이 대조군 펩타이드의 약 2 배 정도였다 (도 8B). 한편, 복부를 열고 대동맥을 노출한 상태에서 촬영했을 때에는, ApoPep-1 펩타이드를 주입한 동맥경화 마우스에서의 근적외선 형광신호가 대조군 펩타이드에 비해 훨씬 강하였다 (도 8C). 또한 대동맥을 격리하여 체외에서 형광을 측정하여도 유사한 결과를 보였다 (도 8D).
< 실시예 6>
본 발명의 펩타이드를 이용한 뇌졸중의 분자영상
뇌졸중 모델은 래트(rat)의 좌측 중간대뇌동맥(middle cerebral artery)를 2 시간 동안 결찰 뒤 혈류를 재순환 시켜 유도하였다. 혈류를 재순환시킨 2 시간 후에, 뇌졸중 래트 및 정상 래트에 Cy7.5 근적외선형광이 표지된 서열번호 1의 펩타이드(ApoPep-1) 및 대조군 펩타이드를 이소플루란 마취하에서 꼬리 정맥을 통해 최종 50 μM 농도로 주입하였다. 정맥 주사한 1 시간 및 3 시간 후, 머리 부위의 근적외선 형광을 촬영하였다. 한편, 3 시간 그룹의 래트에서 각각 뇌를 격리하여 체외에서 뇌의 근적외선 형광을 촬영하였다.
그 결과, 본 발명의 펩타이드(ApoPep-1)를 주입한 뇌졸중 래트에서 1 시간째부터 머리 부위에 근적외선 형광이 관찰되었으며 3 시간째는 매우 강한 형광이 관찰되었다. 반면, 대조군 펩타이드(NSSSVDK)를 주입한 뇌졸중 래트 및 ApoPep-1 펩타이드를 주입한 정상 래트에서는 형광이 거의 관찰되지 않았다 (도 9A). 또한 각각의 래트에서 뇌를 격리하여 체외에서 형광을 측정하였을 때도 유사한 결과를 보였고, 특히 좌측 뇌혈관을 결찰하였으므로 뇌졸중 래트의 좌측 반구(hemisphere)에서 형광이 관찰되었다 (도 9B).
< 실시예 7>
본 발명의 펩타이드를 이용한 심근허혈의 분자영상
심근허혈(myocardial ischemia)은 래트의 관상동맥을 결찰하고 혈류를 재순환시키는 허혈/재순환(ischemia/reperfusion) 모델을 이용하여 유도하였다. 상기 시술을 위해 래트를 페노바비탈(phenobarbital) 10 mg을 복강 내 주입하여 마취시킨 상태에서 기관지 삽관 및 인공호흡기(ventilator)를 연결하였다. 그 다음 흉곽을 절개하여 심장을 노출하고 좌전하방 관상동맥(left anterior descending coronary artery)를 봉합사로 30 분간 결찰한 후 다시 풀어주어 혈류를 재순환시켰다. 대조군(Sham)은 동일한 시술을 하였으나 혈관을 결찰하지 않은 경우이다. 혈류을 재순환시킨 2 시간 후에, 심근손상 및 대조군 래트에 Cy7.5 근적외선형광이 표지된 서열번호 1의 펩타이드(ApoPep-1)를 정맥 주사하였다. 펩타이드를 주입한 2 시간 후, 심장 부위의 근적외선을 촬영하고, 각각의 심장을 격리하여 근적외선을 촬영하였다.
그 결과, 심근허혈이 일어난 래트의 심장 부위에서 대조군 래트에 비해 훨씬 더 강한 근적외선 형광이 관찰되었으며 (도 10A), 각각의 심장을 격리하여 체외에서 형광을 측정한 경우에도 유사한 결과를 보였다(도 10B).
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 서열을 가지는 펩타이드는 사멸세포와 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 사멸세포의 검출, 더 나아가 종양조직 내 사멸세포, 심근경색 조직 내 사멸심근세포, 뇌졸중 조직 내 사멸신경세포 및 동맥경화 부위의 검출과 영상진단 및 표적 약물전달 등에 다양하게 사용될 수 있다.
<110> Kyungpook national university industry-academic cooperation foundation <120> Peptides for targeting apoptotic cells and uses thereof <130> N <150> KR10-2008-44410 <151> 2008-05-14 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 1 for targeting apoptotic cells <400> 1 Cys Gln Arg Pro Pro Arg 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 2 for targeting apoptotic cells <400> 2 Cys Ser Val Ala Pro Arg 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 3 for targeting apoptotic cells <400> 3 Cys Asn Arg Pro Pro Arg 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 4 for targeting apoptotic cells <400> 4 Cys Gln Lys Pro Pro Arg 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 5 for targeting apoptotic cells <400> 5 Cys Gln Arg Pro Pro Lys 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 6 for targeting apoptotic cells <400> 6 Cys Asn Lys Pro Pro Arg 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 7 for targeting apoptotic cells <400> 7 Cys Asn Arg Pro Pro Lys 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 8 for targeting apoptotic cells <400> 8 Cys Gln Lys Pro Pro Lys 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 9 for targeting apoptotic cells <400> 9 Cys Asn Lys Pro Pro Lys 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 10 for targeting apoptotic cells <400> 10 Cys Thr Val Ala Pro Arg 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 11 for targeting apoptotic cells <400> 11 Cys Ser Val Ala Pro Lys 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 12 for targeting apoptotic cells <400> 12 Cys Thr Val Ala Pro Lys 1 5 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 13 agcggaccag attatcgcta 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 14 aacccctcaa gacccgttta 20

Claims (21)

  1. 서열번호 2 및 서열번호 10 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 서열로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는, 사멸 세포(apoptotic cell)와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드.
  2. 제1항의 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제2항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  4. 제3항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  5. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 사멸 세포 검출용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. (a) 제1항의 폴리펩타이드를 시료와 혼합하는 단계;
    (b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩타이드를 제거하는 단계; 및
    (c) 상기 폴리펩타이드의 결합 여부 및 위치를 확인하는 단계를 포함하는 사멸 세포의 검출 방법.
  8. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 종양성 질환, 뇌졸중, 심근경색 및 동맥경화로 이루어진 군에서 선택된 질환에 특이적인 것임을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 종양성 질환은 대장암, 폐암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 피부암, 간암, 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 복합 골수종(multiple myeloma), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 신경아종(neuroblastoma), 재생불량성 빈혈로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴(cisplain), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard), 니트로소우레아(nitrosourea), 스트렙토키나제(streptokinase), 유로키나제(urokinase), 알테플라제(alteplase), 안지오텐신(angiotensin) II 억제제, 알도스테론(aldosterone) 수용체 억제제, 에리트로포이에틴(erythropoietin), NMDA (N-methyl-d-aspartate) 수용체 억제제, 로바스타틴(Lovastatin), 라파마이신(Rapamycin), 셀레브렉스(Celebrex), 티클로핀(Ticlopin) 마리마스타트(Marimastat) 및 트로케이드(Trocade)로 이루어진 군에서 선택된 약제와 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제1항의 폴리펩타이드 및 이와 결합된 항-종양성 질환 제제를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항-종양성 질환 제제는 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴(cisplatin), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아(nitrosourea)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 부위의 영상화용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제1항의 폴리펩타이드 및 이와 결합된 뇌졸중 치료제를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  17. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 부위의 영상화용 조성물.
  18. 제1항의 폴리펩타이드 및 이와 결합된 심근경색 치료제를 유효성분으로 포함하는 심근경색 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  19. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심근경색 부위의 영상화용 조성물.
  20. 제1항의 폴리펩타이드 및 이와 결합된 동맥경화 치료제를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  21. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 부위의 영상화용 조성물.
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