KR20100028167A - 활성화 내피세포 및 동맥경화 표적용 펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

활성화 내피세포 및 동맥경화 표적용 펩티드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 TNF-α로 활성화된 대동맥 내피세포를 특이적으로 표적하여, 동맥경화에 특이적으로 표적할 수 있는 펩티드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드 및 이를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 진단, 예방 및 치료용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 영상화용 조성물 등에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드는 동맥경화 부위와 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 동맥경화 부위로의 약물 전달, 동맥경화 부위의 진단, 탐색 및 영상화 등에 다양하게 사용될 수 있다.
동맥경화, 영상화, 약물전달, 펩티드, 내피세포, TNF-α

Description

활성화 내피세포 및 동맥경화 표적용 펩티드 및 이의 용도 {Peptides for targeting activated endothelial cells and atherosclerosis and uses thereof}
본 발명은 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)로 활성화된 대동맥 내피세포를 특이적으로 표적하여, 동맥경화에 특이적으로 표적할 수 있는 펩티드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드 및 이를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 진단, 예방 및 치료용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 영상화용 조성물 등에 관한 것이다.
동맥경화는 오랜 기간에 걸쳐 혈관의 벽에 지방이 축적되고 또한 혈관 벽이 두꺼워지는 질환이다. 주로 고지질혈증 특히, 고콜레스테롤혈증이 주요 위험인자이며 또한 고혈압 및 당뇨병 등도 위험인자로 알려져 있다. 최근 서구화된 식사 및 인구의 고령화에 따라 동맥경화의 발병 및 이와 관련된 뇌심혈관계 질환이 크게 증가하고 있다. 동맥경화의 진행과정을 보면, 산화지질, 높은 혈압과 빠른 혈류 등에 의해 혈관 내면을 구성하고 있는 혈관내피세포에 손상이 먼저 일어나고, 점차 혈관 벽에 지방이 축적되며 대식세포 및 T 세포 등의 침윤과 염증반응이 진행되고 혈관평활근세포의 증식으로 인해 혈관 벽이 두꺼워진다. 그 결과 혈관이 좁아지게 되어 혈액의 흐름이 원활하지 못하게 된다. 심장의 관상동맥이 좁아진 경우 무리한 운동 등에 의해 심장으로 혈액 공급이 부족하여 통증을 느끼게 되는 협심증의 증상을 보이게 된다. 한편 두꺼워진 혈관 벽(이 부분을 동맥경화 병변이라 함)내 대식세포에 의해 생성되는 단백질분해효소의 활성이 왕성한 경우 병변을 덮고 있는 조직의 일부가 터지게 된다. 이때 병변 안에 있던 지방 및 주변 단백질 등이 혈관 내로 나와 혈전을 형성하며 흔히 심장의 관상동맥 또는 뇌의 혈관 등을 막아버려 심근경색 또는 뇌졸중을 야기하게 된다.
기존의 동맥경화 진단은 초음파 및 혈관조영술을이용하여 혈관 벽이 좁아진 것이나 석회화 등의 관찰을 통해 이루어진다. 그러나 기존의 진단은 동맥경화가 상당히 진행되어 육안으로 구별이 가능할 만큼 혈관이 좁아졌을 때 가능하다. 또한 혈관이 좁아진 소견만을 갖고는 병변이 안정한 병변(stable plaque)인지 아니면 조만간 터질 가능성이 큰 불안정한 병변(vulnerable plaque 또는 rupturable plaque)인지를 판단하는데 전혀 도움이 되지 않는다. 따라서 이러한 종래의 동맥경화 병변 진단의 단점을 보완하여 혈관이 저명하게 좁아지기 이전의 동맥경화를 조기에 발견하고 진단하거나 병변의 안정성 여부를 판단하는데 도움이 되는 새로운 진단법 및 이에 사용될 수 있는 진단 제제의 개발이 필요한 실정이다.
한편, 약물을 질병 조직에 선택적으로 전달하는 약물전달체계 또는 표적 치료는 많은 관심을 받아온 기술이다. 왜냐하면 동일 양의 약제를 사용하더라도 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 크게 줄일 수 있기 때문이다. 예를 들어 동맥경화 병변에 표적되는 물질(예, 펩티드)을 동맥경화 치료약물과 연결하게 되면 병변에 선택적으로 약물을 전달하는 지능형 약물전달체로 활용될 수 있을 것이다. 기존의 동맥경화 치료는 고지혈증을 낮추는 약물을 오랜 기간 복용하거나 증상이 심할 경우 수술적 요법으로 병변을 제거하고 금속성 스텐트를 삽입하여 혈관이 다시 좁아지는 것을 막는 등의 방법을 사용하고 있다. 병변에 대한 선택적 약물전달체와 동맥경화 치료약물로서 혈관평활근세포의 증식을 줄이는 약물 및 대식세포의 활동 또는 단백질분해효소의 작용을 방해하는 약물을 연결하게 되면 병변이 심하게 성장하거나 터지는 것을 막는데 유용할 것이다.
이에 본 발명자들은 동맥경화 병변 진단에 사용될 수 있는 동맥경화 병변 표적용 펩티드를 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 파지 펩티드 디스플레이 기술을 이용하여 동맥경화 병변 조직에 특이적인 펩티드를 탐색하고, 상기 펩티드가 동맥경화 병변의 진단 및 지능형 약물 전달체로서 유용하게 사용될 수 있어 동맥경화 진단, 예방 및 치료를 위하여 유용하게 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 동맥경화 진단, 예방 및 치료용 펩티드 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩티드 및 이와 결합된 동맥경화 치료 제제를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩티드를 포함하는 동맥경화 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩티드를 개체내에 주입하는 단계 및 상기 펩티드의 개체내 위치를 탐색하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동맥경화 병변 탐색방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩티드를 펩티드를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 부위의 영상화용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 TNF-α로 활성화된 대동맥 내피세포를 특이적으로 표적하여 동맥경화 병변을 표적하는 신규 펩티드를 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 펩티드는 9개의 아미노산으로 이루어진 CLWTVGGGC(서열번호 1) 또는 CMLDYTAGC(서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 동맥경화 병변 조직에 특이적으로 결합하는 특징이 있다. 본 발명의 펩티드는 모든 종류의 펩티드, 단백질, 펩티드 모조물, 화합물 및 생물제제를 포함하며, TNF-α로 활성화된 대동맥 내피세포를 특이적으로 표적하여 동맥경화 병변을 표적하는 것을 말한다.
본 발명의 펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).
또한 본 발명의 펩티드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상 기에서 '실질적으로 순수한 펩티드'라 함은 본 발명에 따른 펩티드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
한편, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 벡터는 통상의 클로닝 벡터 또는 발현벡터일 수 있으며, 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
형질전환체는 상기 벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다. 바람직하게는 형질전환체는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 숙주세포에 도입하여 수득할 수 있으며, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스( Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 TNF-α에 의해 활성화된 소 대동맥 내피세포에 특이적으로 결합하는 펩티드를 선별하고, 이들의 기능을 확인하고자 다양한 실험을 수행한 결과, 본 발명의 펩티드가 생체내에서 동맥경화 병변에 특이적으로 유도됨을 확인하여 이 에 대한 생체 내 영상(in vivo imaging) 및 모니터링이 가능함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 펩티드를 동맥경화 부위 검출을 위하여 이용할 수 있음을 알 수 있었으며, 더 나아가 약물 전달용 조성물이나 동맥경화 제제와 더불어 동맥경화 예방 및 치료용 약학적 조성물 등으로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
보다 구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 TNF-α에 의해 활성화된 소 대동맥 내피세포(Bovine aortic endothelial cells, BAECs)와 특이적으로 결합하는 파지를 각각 스크리닝하였다. 그 결과, 총 5 라운드의 스크리닝을 통해 상기 세포와 특이적으로 결합하는 파지를 각각 선별할 수 있었으며, 이의 서열을 분석한 결과 서열번호 1로 표시되는 CLWTVGGGC 및 서열번호 2로 표시되는 CMLDYTAGC의 아미노산 서열을 가지는 펩티드가 주로 선별됨을 알 수 있었다. 이들 선별된 펩티드들은 싸이토카인을 처리하지 않은 세포 대비 TNF-α로 활성화된 BAECs에 특이적으로 결합하였으며, 다른 싸이토카인인 IL-1β(interleukin-1β) 및 IL-4를 처리한 세포들에는 특이적으로 결합하지는 않았다. 아울러, 이들 선별된 펩티드들은 정맥 내피 세포나 림프성 내피세포와는 특이적으로 결합하지는 않았으며, HeLa, MCF-7, A549, 및 L132 세포 등과 같은 상피세포와 최소한의 결합만을 보였다. 따라서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 펩티드가 TNF-α에 의해 활성화된 대동맥 내피세포에 특이적으로 결합함을 알 수 있었다.
본 발명의 다른 실시예에서는 상기 선별된 펩티드가 생체내에서 동맥경화 병 변으로 유도되는지를 식이 조절로 동맥경화 병변이 유도된 Ldlr -/- 생쥐에 본 발명의 펩티드를 주입하고, 1시간동안 순환시켜 결합되도록 하였다. 그 결과, 본 발명의 펩티드는 동맥경화 병변의 내피세포에 유도되었으며, 반면 대조군 펩티드는 거의 유도되지 않았다.
결론적으로, 본 발명의 펩티드가 동맥경과 병변과 특이적으로 결합하여 생체 내에서 동맥경화 부위의 인식 및 표적을 할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 펩티드는 동맥경화 부위(동맥경화 병변)에 특이적으로 결합할 수 있으므로 약물을 상기 부위에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다. 이 때, 상기 약물 전달용 조성물은 동맥경화 병변에 특이적일 수 있다.
본 발명의 약물 전달용 조성물에 포함되는 본 발명의 펩티드를 종래 동맥경화 질환 제제와 연결하여 치료에 이용한다면 본 발명의 펩티드에 의해 상기 제제가 동맥경화 부위에만 선택적으로 전달되기 때문에 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 현저히 줄일 수 있다.
본 발명의 펩티드에 연결될 수 있는 동맥경화 질환 제제는 종래 동맥경화의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, 혈관평활근세포의 증식을 줄이는 약물인 라파마이신(Rapamycin), 콜레스테롤 합성 억제 및 혈중 콜레스테롤 농도를 낮추는 약물인 로바스타틴(Lovastatin), 항염증약물인 세레브렉스(Celebrex), 혈소판 응집 억제 약물인 티클로핀(Ticlopin) 등일 수 있다. 본 발명의 펩티드와 동맥경화 치료 제제의 결합은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있으며, 본 발명의 펩티드와 동맥경화 치료 제제가 직접적으로 결합되거나 또는 매개체를 통하여 간접적으로 결합될 수도 있다. 아울러, 상기 결합은 생체외에서 수행될 수도 있으나, 본 발명의 펩티드 및 동맥경화 치료 제제는 개별적으로 투여되어 생체내에서 결합될 수도 있다. 이를 위해 본 발명의 펩티드 또는 동맥경화 치료 제제는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 펩티드의 양은 결합되는 동맥경화 질환 제제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 펩티드 및 이와 결합하는 동맥경화 치료 제제를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 이 때, 상기 약학적 조성물에서 동맥경화 치료 제제 및 결합 방법에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 펩티드 단독 또는 펩티드 및 이와 결합하는 동맥경화 치료 제제를 포함할 수 있다. 상기에서 “약학적으로 유효한 양”이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 동맥경화를 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 펩티드 및 이와 결합되는 동맥경화 치료 제제의 양은 결합되는 약제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하게는 동맥경화 병변 조직에 충분히 전달되어, 유효한 효과를 보이는 양일 수 있다. 그러나, 약물은 그 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩티드를 약제와 결합시켜 동맥경화 병변을 치료하기 위한 용도에 따른 본 발명의 펩티드의 적절한 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 펩티드를 포함하는 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 할 때 1회 투여시 10 ng 내지 10 ㎎의 유효용량으로 하루에 수 차례 반복 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 펩티드를 포함하는 약학적 조성물은 본 발명에 의한 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. 예컨대, 본 발명의 펩티드는 경구 투여 또는 비경구 투여될 수 있다. 경구 투여 시에는 위장관 내 소화효소에 의한 분해를 방지하기 위하여 본 발명의 펩티드를 D형 아미노 산으로 구성하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 비경구 투여로는 피하 주사, 근육내 주사, 정맥 주사 등이 있는데, 바람직하게는 정맥 주사일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다
또한, 본 발명의 약학적 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 예를 들면, 주사제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예 를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
이외에도 본 발명의 조성물에는 일반적인 약학적 조성물에 통상적으로 첨가되는 약학적으로 허용되는 담체가 추가로 포함될 수 있다. 상기 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 사람이나 동물에 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체는 주사제의 경우에는, 예컨대 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 및/또는 안정화제를 사용할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 펩티드를 포함하는 조성물의 제형은 상술한 바와 같이 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 펩티드를 포함하는 약물 전달용 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 약물 투여 방법으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 진단용 키트를 제공한다. 이 때, 본 발명에서 "진단"이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 동맥경화의 존재 또는 특징을 확인하는 것이다. 본 발명의 진단용 키트에 포함되는 펩티드는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 상기 기재한 바와 같이 화학적 또는 유전공학적 방법에 의해 수득된 것일 수 있다. 본 발명의 펩티드는 동맥경화 병변에 대해서 유용하게 표적되므로 동맥경화 진단을 위하여 유용하게 사용될 수 있다. 상기 진단용 조성물에는 본 발명의 펩티드 이외에도 펩티드 구조 또는 생리활성을 안정하게 유지시켜 주는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있으며, 또한, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태 또는 4℃가 유지된 상태로 제공될 수 있다.
본 발명의 펩티드가 동맥경화 병변 조직에 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 펩티드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)), 방사성 동위원소(예: 124I, 125I, 111In, 99 mTc, 32P, 35S), 크로모포어(chromophore), 비오틴(biotin), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots), 형광단백질(GFP(Green Fluorescent Protein); EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein); DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), Cy3, Cy5 및 Cy7.5)), 자기공명영상조영제(예: 수퍼파라마그네틱 산화철(superparamagnetic iron oxides, SPIO), 울트라수퍼파라마그네틱 산화철(ultrasuperparamagnetic iron oxides, USPIO)), 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles) 등 일 수 있다. 유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩티드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩티드에 추가로 수행될 수도 있다.
만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 동맥경화를 진단할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩티드를 혈액 내로 순환시키고 형광단층촬영으로 펩티드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 형광이 관찰된다면, 동맥경화로 진단된다. 또한 검출가능한 표지로 방사선 물질을 이용하는 경우에는 양전자단층촬영(Positron emission tomography:PET)으로 펩티드에 의한 방사능을 관찰하여 동맥경화를 진단할 수 있다. 이 경우에는 보다 민감하게 동맥경화의 진단 및 분자 영상이 가능할 것이다. 아울러, 검출된 결과는 검출표지에 따른 공지된 영상화 방법에 따라 영상화될 수도 있다.
한편, 본 발명의 펩티드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명의 동맥경화 진단용 키트는 본 발명의 펩티드의 시험관 내 또는 생체내에서 동맥경화 부위, 특히 동맥경화 병변과 결합여부 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 펩티드의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩티드에 대한 항체 또는 이들에 대한 이차항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다. 이 때, 본 발명의 펩티드의 표지 및 이와 관련된 화합물은 상기에서 기재한 바와 같다.
또한, 항원항체반응에 이용되는 이차항체(secondary antibody)는 랫트, 마우스, 토끼, 소, 돼지, 염소 등에서 생산된 항-인간 IgG 항체일 수 있으며, 검출을 위한 시약으로는 발색제 및 완충액 등을 들 수 있다. 상기 이차항체는 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase, AP)가 결합된 것을 사용할 수 있고, 방사성 동위원소(예: 125I, 32P, 35S), 크로모포어(chromophore), 비오틴(biotin)이 결합된 것을 사용할 수 있고, FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin) 등의 형광물질이 결합된 것을 사용할 수도 있다. 상기 효소반응 및 형광반응의 검출은 공지의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 키트는 필요에 따라 각 성분들을 혼합하는데 사용될 튜브, 웰 플레이트, 사용방법을 기재한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법들에서 이용될 수 있는 실험과정, 시약 및 반응 조건은 종래 당업계에서 통상적으로 알려져 있는 것들을 이용할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명한 일이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 개체내에 주입하는 단계 및 상기 펩티드의 개체내 위치를 탐색하는 방법을 포함하는 동맥경화 병변 탐색방법을 제공한다.
본 발명의 펩티드를 개체내에 주입하는 단계는 이에 한정되지는 않으나, 예를 들면, 상기에서 기재한 바와 같이 주사제 형태로 제형화된 본 발명의 펩티드를 정맥 주사를 통하여 개체에 주입하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 펩티드의 개체내 위치의 탐색은 상기에서 기재한 바와 같이 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography:FMT)을 통하여 수행될 수 있으며, 검출가능한 표지로 방사선 물질을 이용하는 경우에는 양전자단층촬영(Positron emission tomography:PET)으로 펩티드에 의한 방사능을 관찰하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 아울러, 이를 위하여, 본 발명의 펩티드는 상기에서 기재한 바와 같이 표지된 상태로 제공될 수 있다.
아울러, 본 발명의 펩티드는 동맥경화 부위에 특이적으로 결합하므로 동맥경화 부위의 영상화에도 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 부위의 영상화용 조성물을 제공한다. 이 때, 동맥 경화 부위의 영상화는, 이에 한정되지는 않으나, 초진 목적 뿐만아니라, 진행 경과, 치료에 대한 치료 경과, 치료제에 대한 반응 모니터링 등을 포괄하여 사용할 수 있다. 상기 펩티드는 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 표지된 상태로 제공될 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 기술한 바와 같다.
본 발명의 도면에 대해서는 다음의 기술을 참조할 수 있다.
도 1 내지 도 4는 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리의 스크리닝을 나타낸 것이다. 도 1에서는 10 ng/ml의 TNF-α를 6시간동안 처리하기 전 및 후의 BAECs에 대한 현미경 분석(상측 패널: 200배) 및 VCAM-1 발현에 대한 면역형광 염색(하측 패널: 400배)을 나타낸 것이다. 도 2에서는 TNF-α를 표시된 시간 처리한 BAECs에 의한 VCAM-1 발현에 대한 면역 블롯팅을 나타낸 것이다. 도 3에서는 스크리닝 전략에 대한 모식도를 나타낸 것으로, 각각의 선별 라운드(round)에서 파지는 무처리 BAECs(음성 선택) 과 함께 배양된 후, TNF-α로 활성화된 세포(양성 선택)와 배양되었다. 총 5회의 바이오패닝을 반복하여 파지 클론을 선택하였다. 도 4에서는 각 선별 라운드(round)에서의 파지 농축을 나타낸 것으로, 막대는 각 선별 라운드(round)에 있어서 TNF-α 처리 또는 무처리 세포에 결합한 파지의 역가를 나타낸다.
도 5 내지 도 11은 개별 파지 클론의 확인(Validation)에 대한 것이다. 도 5에서는 각각의 파지 클론은 10 ng/ml의 TNF-α로 6시간동안 처리되었거나 또는 무 처리된 BAECs에서 시험되었다. 도 6에서는 TNF-α(10 ng/ml), IL-1β (40 ng/ml), LPS (40 ng/ml) 및 IL-4 (40 ng/ml)에 6시간동안 처리된 BAECs에 결합된 CLWTVGGGC-파지 및 CMLDYTAGC-파지를 나타낸다. * 표시는 One-Way ANOVA test에서 P < 0.05인 것을 나타낸다. 도 7에서는 특정 싸이토카인들을 처리한 BAECs에 의한 VCAM-1 발현에 대한 면역 블롯팅을 나타낸다. 도 8에서는 10 ng/ml의 TNF-α에 6시간동안 처리하거나 무처리한 HUVECs 및 HLECs에 결합한 파지를 나타낸다. 도 9에서는 10 ng/ml의 TNF-α에 6시간동안 처리한 HUVECs 및 HLECs에 의한 VCAM-1 발현에 대한 면역 블롯팅을 나타낸다. 도 10에서는 상피세포주에 결합한 파지를 나타낸다. 도 11에서는 상응하는 합성 펩티드 및 대조군 펩티드와 함께 TNF-α에 의해 활성화된 BAECs에 결합된 CLWTVGGGC-파지 및 CMLDYTAGC-파지의 경쟁 어세이를 나타낸다. 막대는 3회 반복실험에서 평균±표준분포로 표시되는 파지 역가를 나타낸다.
도 12 및 도 13은 TNF-α에 의해 활성화된 BAECs와의 펩티드 결합을 나타낸다. 도 12에서는 10 ng/ml의 TNF-α로 6시간동안 처리된 BAECs를 형광표지된 5 mM 농도의 CLWTVGGGC (좌측 패널), CMLDYTAGC (중간 패널), 및 대조군 펩티드 (우측 패널)과 4℃에서 1시간동안 배양하고, DAPI로 핵염색을 실시하였다(200배). 도 13에서는 유세포 분석을 수행하였으며, BAECs를 10 ng/ml의 TNF-α로 6시간동안 처리하여 형광표지된 2.5 mM 농도의 CLWTVGGGC 펩티드(좌측 패널) 및 CMLDYTAGC (우측 패널)와 30분동안 실온에서 반응시켜 유세포 분석기로 분석하였다.
도 14 및 도 15는 동맥경화 병변에서의 파지 및 펩티드의 in vivo 유도를 나타낸 것이다. 도 14에서는 CLWTVGGGC-파지 (2 x 1011 pfu)를 Ldlr -/- 생쥐 (3마리) 및 C57BL/6j 대조군 생쥐(3마리)에 주사하였다. 1시간동안 순환시킨 후, 동맥을 분리하여 조직에 결합한 파지의 역가를 측정하였다. 파지 라이브러리의 풀을 대조군으로 사용하였다. * 표시는 One-Way ANOVA test에서 P < 0.05를 나타낸다. 도 15에서는 형광표지된 최종농도50 mM의 CLWTVGGGC 및 대조군 펩티드를 Ldlr -/- 생쥐의 꼬리정맥으로 주사하고 1시간 동안 순환시켰다. 심장을 통한 관류 고정 후, 동맥 및 기타 조직을 제거하여 동결절편(cryosection)을 수행하였다. CLWTVGGGC 및 대조군 펩티드(녹색)의 동맥의 동맥경화 플라크로의 유도 및 vWF를 이용한 내피세포 공염색(적색) 및 융합 이미지이다. 동맥경화 플라크 위의 내피세포층에서의 유도 펩티드(흰색 화살표) 및 플라크 위의 신장성 섬유질층의 강한 자가형광(적색 화살표)을 주목하라. CLWTVGGGC 펩티드가 주사된 폐, 간, 및 신장(하측 패널)를 나타내며, 3회 반복실험중 대표적인 결과를 나타낸다(200배)
참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드는 동맥경화 부위와 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 동맥경화 부위로의 약물 전달, 동맥경화 부위의 진단, 탐색 및 영상화 등에 다양하게 사용될 수 있다.
이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법>
1. 세포배양
소 대동맥 내피세포(Bovine aortic endothelial cells, BAECs)는 Cambrex 사(East Rutherford, NJ)에서 구입하여 DMEM (Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium)에 10% 우태아 혈청을 첨가하여 배양하였다. 인간 림프 내피세포(Human lymphatic endothelial cells, HLECs)는 ScienCell사(Carlsbad, CA)로부터 구입하여 EGM 배지에서 유지시켰다. 인간 탯줄 정맥 내피세포(Primary human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)는 0.2%의 젤라틴이 코팅된 배양 플레이트에 20% 우태아혈청이 첨가된 M199 배지에서 배양하였다. HeLa (난소암 세포주), MCF-7 (유방암 세포주), 및 L132 (정상 폐상피세포)는 10% 우태아혈청이 첨가된 DMEM 배지에 배양하였다. A549 (폐암 세포주)는 10% 우태아혈청이 첨가된 RPMI 배지에 배양하였다.
2. 면역 블롯팅( Immunoblotting )
재조합 인간 TNF-α, IL-1β, 리포폴리사카라이드 (LPS), 및 IL-4는 R & D systems사 (Minneapolis, MN)로부터 구입하였다. BAECs를 6-웰 배양 플레이트에 심고 (웰당 2 x 105 개), 다음날 세포를 TNF-α (10 ng/ml) 또는 다른 사이토카인을 무혈청 배지에 혼합하여 지정된 시간동안 처리하였다. 이에, 세포를 얼음에 차갑게 식힌 인산완충 식염수(PBS, phosphate-buffered saline)로 세척하고, 용해완충액(50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 1% 트리톤 X-100, 150 mM NaCl, 1mM 페닐메틸설포닐 플루오리드, 10 /ml 펩스타틴, 10 /ml 류펩틴, 10 ug/ml 아프로틴)으로 용해시켰다. 세포 용해액은 4℃, 12,000x에서 15분간 원심분리시켰다. 동량의 단백질(25 )을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 분리하고, 폴리비닐리딘 디플루오리드(polyvinylidine difluoride) 멤브레인으로 이동시켰다. 멤브레인을 5% 스킴밀크(skim milk)가 첨가된 트리스-완충 식염수(TBS)를 이용하여 1 시간동안 실온에서 반응정지 시켰고, TBS-T (0.05% 트윈 20이 함유된 TBS(Tris-buffered saline))에 1:1000으로 희석시킨 토끼 다항체인 VCAM-1 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)와 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 이후, 멤브레인은 호스레디쉬 페록시데이즈(horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항-토끼 IgG (Santa Cruz Biotechnology)와 배양되고, 이어서 화학발광제제(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)와 반응시킨후 필름에 노출시켰다. 로딩 대조군으로는 항 β-튜블린 항체(Chemicon, Temecula, CA)를 사용하였다.
3. 파지 라이브러리의 바이오패닝( biopanning )
pIII 단백질에 융합하여 CX7C (C, cysteine, X, any amino acid) 무작위 펩티드를 디스플레이하는 M13 파지 라이브러리는 뉴잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs, Ipswich, MA)에서 구입하여 바이오패닝을위해 사용하였다. BAECs를 6-웰 배양 플레이트에 심고, 그 다음날 70-80% 정도 차도록(70-80% confluence) 하였다. 세포를 TNF-α (10 ng/ml)를 무혈청 배지에 혼합하여 6시간동안 처리하였다. 2 x 1011 플라크-형성 유닛(pfu)의 파지 라이브러리를 TNF-α를 처리하지 않은 BAECs와 4℃에서 2시간 동안 반응한 후 상층액을 회수하여(음성 선택(negative selection) 또는 or 공제(subtraction)), TNF-α를 처리한 BAECs와 1시간 동안 4℃ 에서 가볍게 진탕하면서 반응하였다. 세포와 결합하지 못한 파지들은 10 mg/ml 우혈청 알부민(BSA)이 함유된 DMEM으로 세척하여 제거하였다. 세포에 결합한 파지들은 1 mg/ml의 우혈청 알부민이 함유된 1 ml의 0.2 mol/L 글리신-HCl (pH 2.2)을 실온에서 처 리하여 분리하였다. 분리물은 제조자의 메뉴얼에 따라, 즉시 1M 트리스-HCl (pH 9.1)로 중화시켰고, 20 ml의 ER2738 박테리아(생장 초기 단계)로 증폭시켰다. 배양 상층액의 파지는 폴리에틸렌 글리콜/NaCl로 침전시켰다. 파지의 역가는 이소프로필 티오갈락토피라노시드(IPTG), X-gal 및 테트라사이클린이 함유된 LB 배지에서 37℃로 하룻밤동안 배양한 다단계 희석액을 플레이팅한 후 콜로니의 수를 계수하여 조사하였다. 추가적인 선택을 위하여 동일한 양의 파지 (2 x 1011 pfu of phages)를 첨가하여 유지시켰다. TNF-α에 의해 활성화된 BAECs에 특이적으로 파지가 풍부하게 하도록 하기 위하여, 공제단계(substraction step)를 각 선택단계에 포함시켰다.
4. DNA 및 아미노산 서열 분석
총 5회의 바이오패닝을 통해 선택된 파지 클론에서 무작위로 30종을 골라 DNA를 분리한 다음, 펩티드에 해당하는 DNA 인서트를 제조사에서 제공하는 -96 pIII 프라이머(New England Biolabs)를 이용하여 DNA 서열 자동분석기(Genotech Inc., Daegeon, Korea)를 통하여 서열분석하였다. 도출된 아미노산 서열은 클러스탈 W 프로그램을 사용하여 일차되는 서열 또는 펩티드 간에 공유되는 아미노산 모티프를 찾기 위해 정렬하였다. NCBI BLAST 프로그램을 이용하여 펩티드 서열과 두드러진 상동성을 가진 단백질을 조사하였다.
5. 각 파지 클론들의 배양세포에 대한 In vitro 바인딩
세포를 6-웰 배양 플레이트에 심고(웰당 2 x 105개) 80-90% 차도록(80-90% confluence) 배양한다. 세포를 무혈청 배지에 혼합한 특정 사이토카인과 6시간동안 반응하고 각 파지 클론과 배양한다(웰당 1 x 109 pfu). 파지 라이브러리 풀은 대조군으로 사용하였다. 10 mg/ml의 우혈청 알부민이 첨가된 DMEM으로 세척한 후, 세포에 결한한 파지는 1 mg/ml 의 우혈청 알부민이 포함된 1 ml 의 0.2 mol/L 글리신-HCl (pH 2.2)으로 분리되었다. 합성 펩티드에 의한 파지 결합의 경쟁적 억제를 조사하기 위하여 세포를 파지와 배양하기 전에 PBS/1% BSA 에 50 /L의 농도로 펩티드들과 먼저 반응시키는 전처리를 수행하였다.
6. 유세포 분석기 및 면역형광염색법을 이용한 펩티드 결합 어세이
펩티드들은 N-말단에 플루오레신이 부착되고, 질량분석기 (Peptron Co, Daegeon, Korea)로 정제하는 스텐다드 Fmoc법을 통하여 제조되었다. 유세포 분석을 위하여, 세포를 TNF-α와 반응시키고, 트립신 처리하여 수확하였다. 이후, 2.5 /L 농도의 펩티드를 포함한 PBS/1% BSA 용액에 세포를 부유하여 4℃에서 30분간 반응하였다. 세포를 PBS/1% BSA 용액으로 2회 세척한 후 FACScan (Becton Dickinson)을 이용하여 분석하였다.
면역형광염색을 위해서, 세포를 8-웰 챔버 슬라이드에서배양하고, TNF-α를 상기와 같이 처리하였다. PBS/1% BSA 용액에 5 mmol/L 농도로 희석된 플루오레신이 표지된 펩티드와 세포를 실온에서 30분간 배양하였다. 이후, 세포를 4% 포름알데히드에서 5분간 고정하였다. 세포의 핵 염색을 위하여 4’,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)로 염색하고, 마운트하여 형광 현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany) 하에서 관찰하였다. VCAM-1 단백질의 동시 염색을 위하여 세포를 고정하고 1% BSA/20% 염소혈청으로 37℃에서 1시간동안 블로킹(block)시키고, VCAM-1 항체로 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 세포들은 알렉사 568-부착 항 염소-토끼 IgG를 2차 항체(Molecular Probe, Eugene, OR)로 반응한 후 마운팅 전에 DAPI로 염색되었다.
7. 파지 및 펩티드의 동맥경화 병변으로의 In vivo 유도
모든 동물 실험은 경북대학교 동물 윤리 위원회의 지침에 의해 수행되었다. C57BL/6 종에서 유래한 6주령 수컷 저밀도 리포프로테인수용체 결여(Ldlr -/-) 생쥐(B6.129-Ldlr tm1Her )를 15% 지방, 1.25% 콜레스테롤 및 0.5% Na-콜레이트 (Oriental Yeast Co. Ltd., Tokyo, Japan)로 구성된 고콜레스테롤 동맥경화 식이로 사육하였다. Ldlr -/- 생쥐에 있어서 동맥경화 병변은 기존에 알려진 바와 같이 잘 유도되었다. 대조군으로 수컷 C57BL/6j 생쥐를 4%의 동물지방과 0.04% 이하의 콜레스테롤을 함유하는 일반적인 급식을 동일기간동안 하여 사용하였다.
파지의 동맥내 동맥경화 병변으로의 유도를 확인하기 위하여, 파지(2 x 1011 pfu) 를 마취상태에서 생쥐의 꼬리정맥에 주사하고 1시간동안 체내 순환하도록 하였다. 이후, 생쥐의 심장을 인산완충 식염수로 관류하고 대동맥을 분리하고, 잘게 썰고(mince) 1%의 우혈청 알부민이 함유된 DMEM으로 3회 세척하였다. 결합된 파지는 1 mg/ml 우혈청 알부민이 함유된 0.2 mol/L 글리신-HCl (pH 2.2)으로 실온에서 10분간 반응시켜 분리해냈다. 파지 역가는 대동맥 조직 10mg당 pfu로 조사하였다.
펩티드의 동맥내 동맥경화 병변으로의 유도를 확인하기 위하여, 최종농도 50 /L 의 펩티드를 생쥐의 꼬리정맥에 주사하고 1시간동안 체내 순환하도록 하였다. 이후, 생쥐의 심장을 인산완충 식염수로 관류하고, 대동맥 및 기타 기관을 제거하여 냉동 절편을 준비하였다. 5 간격으로 연속 절편된 조직을 준비하고, 절편을 von Willebrand Factor (vWF) 항체(Abcam, Cambridge, UK) 로 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 알렉사 568-부착 항 염소-토끼 IgG를 2차 항체(Molecular Probe, Eugene, OR)로 하여 1시간동안 반응시켰다. 이후, DAPI로 대조염색하고, 절편을 마운트하여 형광현미경하에서 관찰하였다.
<실험결과>
1. 파지 라이브러리 스크리닝
본 발명자들은 TNF-α가 BAECs를 활성화 시키고, 활성화된 내피세포의 마커로 잘 알려진 VCAM-1의 발현 증가를 유도하는지를 알아보았다. TNF-α를 6시간 동안 처리한 결과 세포의 모양 변화 없이(도 1, 위) 세포 표면의 VCAM-1 발현을 유도 하였다(도 1, 아래). 시간의 흐름에 따른 분석결과, BAECs 에 의한 VCAM-1의 발현은 TNF-α 처리 3시간 후부터 12시간까지 점진적으로 증가하였다(도 2).
TNF-α에 의한 BAECs의 활성을 확인하고, 본 발명자들은 BAECs를 이용하여 파지 라이브러리 스크리닝을 수행하였다. 바이오패닝 방법의 개요도는 도 3에 서 보는 바와 같다. 활성화된 내피세포에 특이적인 파지를 선택할 가능성을 높이기 위해, 본 발명자들은 파지 라이브러리를 TNF-α로 활성화된 세포와 배양하기 전에 TNF-α를 처리하지 않은 무처리 세포와 반응시키는 음성 선택(또는 공제)단계를 포함시켰다. TNF-α로 활성된 BAECs에 결합한 파지의 역가는 4회 및 5회 스크리닝 반복공정 시에 확연히 증가하였다(도 4). TNF-α로 활성된 BAECs에 결합한 파지는 바이오패닝의 각 반복마다 파지 선별의 특이성을 모니터하기 위하여 사용하였던 무처리 대조군 세포와 비교하여 약 10배 가량 높았다. 4회 및 5회 스크리닝 반복공정으로부터 30종의 파지 콜로니를 서열분석 하였다. CLWTVGGGC 펩티드 서열을 가진 파지 클론이 73%로 가장 우세하였고, CMLDYTAGC 펩티드 서열을 가진 파지클론이 그 뒤를 따랐다(표 1). 이들 펩티드 서열들은 NCBI BLAST의 단백질 데이터 베이스를 이용하여 서열 상동성을 찾는데 사용되었고, 공지의 생쥐, 사람 또는 소 유래 단백질에 존재하는 5-7잔기의 아미노산 서열과 일치함이 밝혀졌다(표 1).
펩티드 서열 빈도 (퍼센트) 상동성 단백질의 예 상동성 모티프 Accession No.
CLWTVGGGC 22/30 (73%) Secretory leukocyte protease inhibitor (m) 21WTVEGG26 NP035544
Transmembrane protein 20 (m) 343WTVGG347 Q8BY79
Proline-rich protein 10 (h) 40LWTVGGG46 Q8N7Y1
Chemokine-like factor (h) 107TVGGG111 Q9UBR5
Proline-rich protein 14 (b) 363TVGGG281 QOVBZ8
Siderophilin (b) 278TVGG281 Q29443
CMLDYTAGC 2/30 (6%) ABC transporter 9 protein (m) 745LDYTA749 Q9JJ59
Fibrillin-2 precursor (m) 2197LDYT2200 Q61555
Olfactomedin-2 (h) 419MLDY422 O95897
Angiopoietin-1 precursor (b) 461YTAG464 O18920
Ectodysplasin-A (b) 347YTAG350 Q9BEG5
상기 표 1은 펩티드 서열 및 상동성 모티프를 포함한 단백질들의 예를 나타낸 것으로, 상기에서, 펩티드들은 상동성 아미노산 서열 또는 모티프를 가진 단백질들을 확인하고자, NCBI BLAST 단백질 데이터 베이스 검색을 이용하여 분석하였다. 빈도는 동일 서열/총 단백질을 가진 펩티드의 수를 말한다. 상기 표 1에서 괄호안의 숫자는 백분율을 의미하며, 상동성 단백질의 예에서 h는 사람, m은 생쥐, b는 소를 나타낸다.
2. 개별 파지 클론의 검증
개별 파지 클론들의 무처리 세포 대비 TNF-α로 활성된 BAECs에 대한 상대적 결합도를 조사하였다. 7개의 클론중 6개가 무처리 세포에 비해 TNF-α로 활성된 BAECs에 더 높은 결합도를 보였다(도 5). 대조군으로 사용한 파지 라이브러리 풀은 최소한의 결합도를 보였다. 이들 중 CLWTVGGGC 및 CMLDYTAGC 펩티드 서열을 가진 2종의 파지 클론들을 선택하여 추후 실험을 진행하였는데, 이는 이들이 여타 파지 클론에 비하여 무처리 세포 대비 TNF-α로 활성된 BAECs에 상대적 결합도가 상대적으로 높았기 때문이다.
이들 두 파지 클론은 TNF-α 외에도 IL-1β, LPS, and IL-4와 같은 여타 염증성 사이토카인에 의해 활성화된 BAECs과 결합하는지를 조사하였다. 이들 두 클론들은 TNF-α를 처리한 세포와 확연히 증가된 결합도를 보이는 반면, IL-1β 및 IL-4를 처리한 세포들과는 유의할 만한 증가된 결합도를 보이지 않았다(도 6). 다만, LPS를 처리한 세포만이 CLWTVGGGC-파지와 결합도가 증가되었다(도 6). 더욱이, 이러한 사이토카인의 처리는 BAECs가 VCAM-1 발현을 유도하도록 하지는 않았다(도 7).
이후, CLWTVGGGC-파지 및 CMLDYTAGC-파지를 HUVECs 및 HLECs와 같은 내피세포들과 결합정도를 조사하였다. TNF-α 처리와는 무관하게, HUVECs(정맥 내피 세포) 및 HLECs(림프성 내피세포)에 대한 파지 결합은 확연히 낮거나 대조군인 파지 라이브러리 풀과 다르지 않았다(도 8). 반면, 상기 세포들에서 VCAM-1의 발현은 TNF-α 처리에 의하여 유도되었다(도 9). 게다가, 파지 클론들은 BAECs와 비교하여 볼 때, HeLa, MCF-7, A549, 및 L132 세포 등과 같은 상피세포에는 최소한의 결합도를 보였다(도 5 대비 도 10). 이러한 결과는 CLWTVGGGC 및 CMLDYTAGC 펩티드 서열을 가진 파지의 결합이 TNF-α 에 의해 활성화된 대동맥 내피세포에 특이적임을 시사한다.
TNF-α에 활성화된 BAECs에 파지가 결합하는 것이 표면에 노출된 펩티드에 의해서 실제로 매개되는 것인지 확인하기 위하여, 합성 펩티드와 결합하는 파지의 경쟁 분석(competition assay)을 수행하였다. CLWTVGGGC 및 CMLDYTAGC 펩티드는 활성화된 BAECs에 상응하는 파지가 결합하는 것을 저해하였으나, 대조군 펩티드는 그러하지 않았다(도 11).
3. 펩티드의 활성화된 세포와 결합
플루오레신이 표지된 CLWTVGGGC 및 CMLDYTAGC 펩티드를 TNF-α가 활성화된 BAECs의 결합도 실험에 사용하였다. 형광 현미경과 유세포 분석기를 통한 결과, CLWTVGGGC 펩티드의 TNF-α가 활성화된 BAECs에로의 결합이 무처리 세포보다 훨씬 더 높았다(각각 도 12 및 도 13). CMLDYTAGC 펩티드 또한 형광 현미경을 이용하여 관찰하였을 때, 무처리 세포보다 활성화된 세포에서의 더 높은 결합도를 보였으나(도 12) 유세포 분석기를 이용하였을 때에는 활성화된 세포나 무처리 세포 양쪽에서 특별한 결합을 보이지 않았다(도 13). 반면, 대조군인 NSSSVDK 펩티드는 활성화된 세포 및 무처리 세포 양쪽 모두에서 형광 현미경 상으로나(도 12) 유세포 분석기 상으로도(도 13) 무시할 만한 결합을 보였다. 또한, CLWTVGGGC 펩티드의 HUVECs과의 결합은 최소치였다(결과미도시).
4. 동맥경과 병변으로의 파지 및 펩티드의 in vivo 유도
CLWTVGGGC 펩티드 서열을 가진 파지 및 플루오레신이 표지된 CLWTVGGGC 펩티드를 이용하여 in vivo 유도 실험을 수행하였다. 먼저 Ldlr -/- 생쥐의 동맥경화 병변을 오일 레드 O 염색을 통하여 병변 내 지질 축적을 확인하였다. CLWTVGGGC 펩티드 서열을 가진 파지를 정맥주사하고 1시간동안 순환시켜 이들이 동맥경화 병변이 과도한 내피세포와 결합하도록 하였다. CLWTVGGGC-파지는 Ldlr -/- 생쥐에 있어서 정상 생쥐대비 약 5배 높은 대동맥 조직으로의 유도능을 보였고, 파지 라이브러리 풀에 비하여 약 2배의 유도능을 보였다(도 14).
Ldlr -/- 생쥐의 대동맥 조직으로 유도된 플루오레신이 표지된 CLWTVGGGC 펩티드의 위치는 동맥경화 병변 조직을 내피세포 항체로 염색해 보면 내피세포의 위치와 일치되었다.(도 15 상 패널). 게다가 펩티드의 형광 시그널은 동맥경화 병변의 내부에서 나타나는 경우도 있었다. 대조군 펩티드의 유도는 이에 반해, Ldlr -/- 생쥐의 동맥경화 병변에서 거의 보이지 않았다.(도 15 중간 패널). 혈관내 탄력성 층의 강한 자가 형광이 관찰되었는데, 이는 이전에 알려진 바와 일치한다. 게다가, CLWTVGGGC-파지의 폐, 간 등 대조 기관으로의 유도는 최소인 반면 신장의 사구체는 유의한 형광을 보였는데 이는 아마도 신장이 펩티드 배출의 주된 경로이기 때문일 것이다(도 15 하 패널). 이들 결과는 TNF-α로 활성화된 BAECs에서 유도된 분자 에피톱이 Ldlr -/- 생쥐의 동맥경화 병변이 과도한 내피세포에서도 존재함을 시사한다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드는 동맥경화 부위와 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 동맥경화 부위로의 약물 전달, 동맥경화 부위의 진단, 탐색 및 영상화 등에 다양하게 사용될 수 있다.
도 1은 TNF-α를 처리하기 전 및 후의 BAECs에 대한 현미경 분석(상측 패널) 및 VCAM-1 발현에 대한 면역형광 염색(하측 패널)을 나타낸 것이다.
도 2는 TNF-α가 처리된 BAECs에서 VCAM-1 발현을 면역 블롯팅으로 확인한 것이다.
도 3은 스크리닝 전략에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 각 선별 라운드에서의 파지 농축 정도를 나타낸 것이다.(Untreated : TNF-α 무처리, Treated : TNF-α 처리)
도 5는 선별된 개별 파지클론의 결합능을 확인한 것이다.
도 6은 TNF-α, IL-1β, LPS 및 IL-4으로 처리된 BAECs에의 본 발명의 펩티드를 가지는 파지의 결합능을 나타낸 것이다.
도 7은 TNF-α, IL-1β, LPS 및 IL-4으로 처리된 BAECs에서 VCAM-1 발현을 면역 블롯팅으로 확인한 것이다.(β-tubulin : loading control)
도 8은 TNF-α에 처리 또는 무처리된 HUVECs 및 HLECs에 결합한 파지를 확인한 것이다.
도 9는 TNF-α에 처리(TNF-α) 또는 무처리(Con)된 HUVECs 및 HLECs에서 VCAM-1 발현을 면역 블롯팅으로 확인한 것이다.
도 10은 상피세포주에 파지의 결합을 확인한 것이다.
도 11은 TNF-α에 의해 활성화된 BAECs에 결합된 CLWTVGGGC-파지 및 CMLDYTAGC-파지의 경쟁 어세이 결과를 나타낸다.
도 12는 TNF-α에 의해 활성화된 BAECs와의 결합을 DAPI 염색으로 확인한 것이다.
도 13은 TNF-α에 의해 활성화된 BAECs와의 펩티드 결합을 유세포 분석으로 확인한 것이다.
도 14는 동맥경화 병변으로의 본 발명의 펩티드의 유도를 확인한 것이다.
도 15는 동맥경화 병변으로의 형광표지된 본 발명의 펩티드의 유도를 세포 조직에서 확인한 것이다.
<110> Kyungpook national university industry-academic cooperation foundation <120> Peptides for targeting activated endothelial cells atherosclerosis and uses thereof <130> NP08-0081 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> homing peptide 1 <400> 1 Cys Leu Trp Thr Val Gly Gly Gly Cys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> homing peptide 2 <400> 2 Cys Met Leu Asp Tyr Thr Ala Gly Cys 1 5

Claims (15)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드.
  2. 제1항의 펩티드를 암호화하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  4. 제3항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  5. 제1항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 동맥경화에 특이적인 것임을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 펩티드는 라파마이신(Rapamycin), 로바스타틴(Lovastatin), 세레브렉스(Celebrex), 티클로핀(Ticlopin)으로 이루어진 군에서 선택된 동맥경화 치료 제제와 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항의 펩티드 및 이와 결합하는 동맥경화 치료 제제를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 동맥경화 치료 제제는 라파마이신(Rapamycin), 로바스타틴(Lovastatin), 세레브렉스(Celebrex), 티클로핀(Ticlopin)으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 동맥경화 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 진단용 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 펩티드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 비오틴, 발광물질, 형광물질(fluorescer), 자기공명영상조영제, 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 키트.
  12. (a) 제1항의 펩티드를 개체내에 주입하는 단계; 및
    (b) 제1항의 펩티드의 개체내 위치를 탐색하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동맥경화 병변 탐색방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 펩티드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 비오틴, 발광물질, 형광물질(fluorescer), 자기공명영상조영제, 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 동맥경화 병변 탐색방법.
  14. 제1항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 부위의 영상화용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 펩티드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 비오틴, 발광물질, 형광물질(fluorescer), 자기공명영상조영제, 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
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