KR20100023796A - 신규 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 유전자 - Google Patents

신규 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다. 서열 번호 1, 3, 36 또는 37로 표시되는 염기 서열 또는 그 단편을 포함하는 핵산이다.

Description

신규 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 유전자{NOVEL LYSOPHOSPHATIDATE ACYLTRANSFERASE GENE}
본 출원은 2007년 5월 25일에 출원된 일본국 특허 출원 제2007-139046호 및 2007년 12월 14일에 출원된 일본국 특허 출원 제2007-323965호에 기초하는 우선권을 주장한다.
본 발명은 신규 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 유전자에 관한 것이다.
지방산은 인지질이나 트리아실글리세롤 등 지질을 구성하는 중요한 성분이다. 불포화 결합을 2개소 이상 함유하는 지방산은, 고도 불포화 지방산(PUFA)으로 총칭되고, 아라키돈산이나 디호모γ-리놀렌산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 등이 알려져 있으며, 여러가지 생리 활성이 보고되어 있다(비특허문헌 1).
이 중, 아라키돈산은, 프로스타글란딘이나 류코트리엔 등으로의 중간 대사물로서 주목받아, 기능성 식품이나 의약품의 소재에 적용하는 시도가 많이 이루어지고 있다. 또한, 아라키돈산은, 모유 중에 포함되어 있고 유아의 발육, 특히 태아의 신장이나 뇌의 발육에 있어서 중요하여, 유아의 발육에 필요한 성분으로서, DHA(도코사헥사엔산)와 함께 영양학적 견지에서도 주목받고 있다.
이 고도 불포화 지방산은 여러가지 분야에서의 이용이 기대되고 있지만, 동 물 체내에서 합성할 수 없는 것도 포함되어 있다. 그래서 여러가지 미생물을 배양하여 고도 불포화 지방산을 획득하는 방법이 개발되어 왔다. 또한, 식물에서 고도 불포화 지방산을 생산시키는 시도도 이루어지고 있다. 이러한 경우, 고도 불포화 지방산은, 예컨대 트리아실글리세롤 등의 저장 지질의 구성 성분으로서, 미생물의 균체 내 또는 식물 종자 중에 축적되는 것이 알려져 있다.
보다 상세하게는, 트리아실글리세롤은, 생체 내에서 이하와 같이 생성된다. 즉, 글리세롤-3-인산이 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소에 의해 아실화되어 리소포스파티드산이 되고, 이 리소포스파티드산이 리소포스파티드산 아실기 전이 효소에 의해 아실화되어 포스파티드산이 되며, 이 포스파티드산이 포스파티드산 포스파타아제에 의해 탈인산화되어 디아실글리세롤이 되고, 이 디아실글리세롤이 디아실글리세롤 아실기 전이 효소에 의해 아실화되어 트리아실글리세롤이 된다. 또한, 아실 CoA:콜레스테롤 아실기 전이 효소나 리소포스파티딜콜린 아실기 전이 효소 등이 간접적으로 트리아실글리세롤의 생합성에 관여하는 것이 알려져 있다.
상기한 바와 같이, 리소포스파티드산(lysophosphatidic acid: 이하, 본 명세서에 있어서 「LPA」라고 기재하는 경우도 있음. 또한 「1-아실글리세롤-3-인산」이라고 기재하는 경우도 있음.)이 아실화되어 포스파티드산(phosphatidic acid: 이하, 본 명세서에 있어서 「PA」 또는 「1,2-디아실-sn-글리세롤-3-인산」이라고 기재하는 경우도 있음)을 생성하는 반응에는, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소(이하, 「LPAAT」라고 기재하는 경우도 있음)가 개재되는 것이 알려져 있다.
이 LPAAT는, 1-아실글리세롤-3-인산아실 전이 효소(E.C. 2.3.1.51)로서도 알 려져 있다. LPAAT 유전자는 지금까지 몇 개의 생물에서 보고되어 있다. 대장균(Escherichia coli) 유래의 LPAAT 유전자로서 plsC 유전자가 클론화되어 있다(비특허문헌 2). 이 외에 진균에서는, 맥주 효모균(사카로마이세스 세레비지아; Saccharomyces cerevisiae) 유래의 SLC1 유전자가 클론화되어 있다(비특허문헌 3). 또한, 동물이나 식물로부터도 클론화되어 있다(특허문헌 1).
지질 생산균인 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)(이하, 「M. 알피나」라고 기재하는 경우도 있음)의 LPAAT에 대해서는, 마이크로솜 분획에 리소포스파티드산 아실기 전이 활성이 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 4). 또한, M. 알피나의 LPAAT 유전자로서는, 2가지의 호몰로그가 보고되어 있다(특허문헌 2 및 특허문헌 3).
[특허문헌 1] 국제 특허 출원 공보 제WO2004/076617호
[특허문헌 2] 미국 특허 공보 제2006/174376호
[특허문헌 3] 미국 특허 공보 제2006/0094090호
[비특허문헌 1] Lipids, 39, 1147(2004)
[비특허문헌 2] Mol. Gen. Genet., 232, 295-303, 1992
[비특허문헌 3] J.B.C., 268, 22156-22163, 1993
[비특허문헌 4] Biochemical Society Transactions, 28, 707-709, 2000
[비특허문헌 5] J. Bacteriology, 180, 1425-1430, 1998
[비특허문헌 6] J. Bacteriology, 173, 2026-2034, 1991
(발명의 개시)
(발명이 해결하고자 하는 과제)
그러나, 지금까지 보고된 LPAAT 유전자는, 숙주 세포에 도입하여 발현시키더라도, 그 기질 특이성에 의해, 숙주가 산생하는 지방산 조성물은 한정되어 있었다. 그래서 지금까지와는 다른 조성의 지방산 조성물을 산생할 수 있는, 신규 유전자를 동정하는 것이 요구되고 있다. 특히, 이용 가치가 높은 지방산의 함유량이 높은 지방산 조성물을 생산할 수 있는 단백질의 유전자를 동정(同定)하는 것이 요구되고 있다.
(과제를 해결하기 위한 수단)
본 발명의 목적은 숙주 세포에서 발현 또는 도입함으로써, 목적으로 하는 지방산 조성의 유지를 제조하거나, 목적으로 하는 지방산의 함유량을 증가시킬 수 있는 것과 같은 단백질 및 핵산을 제공하는 것이다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행했다. 우선, 지질 생산균 모르티에렐라 알피나의 EST 해석을 행하여, 그 중에서 기지의 LPAAT 유전자와 동일성이 높은 서열을 추출했다. 또한, LPAAT를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF) 전체 길이를 취득하기 위해, cDNA 라이브러리의 스크리닝 또는 PCR에 의해 유전자를 클로닝했다. 그것을 효모 등의 고증식능을 갖는 숙주 세포에 도입하여 원하는 지방산 조성물의 산생을 시도한 발명자는, 종래의 LPAAT가 발현된 숙주가 산생하는 지방산 조성물과 비교하여, 다른 지방산 조성물을 생성시킬 수 있고, 또한, 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율이, 해당 유전자가 도입되지 않은 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율보다 높은, 기질 특이성이 다른 신규 LPAAT에 관한 유전자의 클로닝에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 이하의 (a)∼(e) 중 어느 하나에 기재한 염기 서열을 포함하는 핵산:
(a) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
(b) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
(c) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 67% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
(d) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 69% 이상인 아미노산 서열을 코딩하고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
(e) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열.
(2) 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나인 염기 서열을 포함하는 (1)에 기재한 핵산:
(a) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
(b) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 이루어지는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
(c) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 코딩하고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열.
(3) 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나에 기재한 염기 서열 또는 그 단편을 포함하는 핵산:
(a) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 표시되는 염기 서열;
(b) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
(c) 서열 번호 1 또는 3으로 표시되는 염기 서열.
(4) 이하의 (a)∼(e) 중 어느 하나에 기재한 염기 서열을 포함하는 핵산:
(a) 이하의 단백질을 코딩하는 염기 서열;
서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)∼iv) 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 것과 같은 활성을 갖는 단백질
i) 올레산 함유량
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율, 및
iv) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율;
(b) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 이루어지는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 이하의 단백질을 코딩하는 염기 서열
상기 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)∼iv) 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 것과 같은 활성을 갖는 단백질
i) 올레산 함유량
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율, 및
iv) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율;
(c) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 67% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 또한, 이하의 단백질을 코딩하는 염기 서열
상기 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)∼iv) 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 것과 같은 활성을 갖는 단백질
i) 올레산 함유량
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율, 및
iv) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율;
(d) 이하의 단백질을 코딩하는 염기 서열
서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 69% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)∼iv) 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 것과 같은 활성을 갖는 단백질
i) 올레산 함유량
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율, 및
iv) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율;
(e) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 이하의 단백질을 코딩하는 염기 서열
상기 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)∼iv) 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 것과 같은 활성을 갖는 단백질
i) 올레산 함유량
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율, 및
iv) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율.
(5) 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나인 염기 서열을 포함하는 (4)에 기재한 핵산:
(a) 이하의 단백질을 코딩하는 염기 서열
서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)∼iv) 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 것과 같은 활성을 갖는 단백질
i) 올레산 함유량
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율, 및
iv) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율;
(b) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 이하의 단백질을 코딩하는 염기 서열
상기 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)∼iv) 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 것과 같은 활성을 갖는 단백질
i) 올레산 함유량
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율, 및
iv) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율;
(c) 이하의 단백질을 코딩하는 염기 서열
서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)∼iv) 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 것과 같은 활성을 갖는 단백질
i) 올레산 함유량
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율, 및
iv) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율.
(6) 이하의 (a)∼(e) 중 어느 하나에 기재한 염기 서열을 포함하는 핵산:
(a) 이하의 단백질을 코딩하는 염기 서열
서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 발현되고 있는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율보다 높은 것과 같은 활성을 갖는 단백질;
(b) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 상기 염기 서열이 코딩하는 단백질이 발현되고 있는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율보다 높은 것과 같은 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
(c) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 67% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 또한, 상기 염기 서열이 코딩하는 단백질이 발현되고 있는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율보다 높은 것과 같은 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
(d) 이하의 단백질을 코딩하는 염기 서열
서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 69% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 발현되고 있는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율보다 높은 것과 같은 활성을 갖는 단백질;
(e) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 상기 단백질이 발현되고 있는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율보다 높은 것과 같은 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열.
(7) 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나인 염기 서열을 포함하는 (6)에 기재한 핵산:
(a) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 발현되고 있는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율보다 높은 것과 같은 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
(b) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 상기 염기 서열이 코딩하는 단백질이 발현되고 있는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율보다 높은 것과 같은 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
(c) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 코딩하고, 또한, 상기 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 발현되고 있는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율보다 높은 것과 같은 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열.
(8) 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나에 기재한 단백질:
(a) 서열 번호 2 또는 4에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질;
(b) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 69% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질.
(9) 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나에 기재한 단백질:
(a) 서열 번호 2 또는 4에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)∼iv) 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 것과 같은 활성을 갖는 단백질
i) 올레산 함유량
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율, 및
iv) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율;
(b) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 69% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)∼iv) 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 것과 같은 활성을 갖는 단백질
i) 올레산 함유량
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율, 및
iv) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율.
(10) 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나에 기재한 단백질:
(a) 서열 번호 2 또는 4에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이 발현되고 있는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율보다 높은 것과 같은 활성을 갖는 단백질;
(b) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 69% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이 발현되고 있는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율보다 높은 것과 같은 활성을 갖는 단백질.
(11) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
(12) (1) 내지 (7) 중 어느 1항에 기재한 핵산을 함유하는 재조합 벡터.
(13) (12)에 기재한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체.
(14) (13)에 기재한 형질전환체를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물로서, 상기 지방산 조성물의 지방산 조성에 있어서, 이하의 i)∼iv) 중 적어도 하나 이상이, (12)의 재조합 벡터로 형질전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물의 상기 비율보다 높은 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물:
i) 올레산 함유량
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율, 및
iv) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율.
(15) (13)에 기재한 형질전환체를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물로서, 상기 지방산 조성물에 있어서의 아라키돈산 함유율이, (12)에 기재한 재조합 벡터로 형질전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물보다 높은 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물.
(16) (13)에 기재한 형질전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터, (14) 또는 (15)에 기재한 지방산 조성물을 채취하는 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물의 제조 방법.
(17) (14) 또는 (15)에 기재한 지방산 조성물을 포함하는 식품.
(발명의 효과)
본 발명의 LPAAT는, 종래의 LPAAT와는 기질 특이성이 달라, 종래의 LPAAT가 발현된 숙주가 산생하는 지방산 조성물과는 조성이 다른 지방산 조성물을 숙주 중에 산생시킬 수 있다. 이에 따라, 원하는 특성이나 효과를 갖는 지질을 제공할 수 있기 때문에, 식품, 화장료, 의약품, 비누 등에 적용할 수 있는 것으로서 유용하다.
본 발명의 LPAAT가 발현된 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율은, 본 발명의 LPAAT가 발현되지 않는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율보다 높아, 해당 세포의 배양물로부터 얻어지는 지방산 조성물은, 영양학적으로도 보다 높은 효과를 기대할 수 있기 때문에, 바람직하다.
또한, 본 발명의 LPAAT는 지방산이나 저장 지질의 생산능의 향상을 도모할 수 있기 때문에, 미생물이나 식물 중에서의 고도 불포화 지방산의 생산성을 향상시키는 것으로서, 바람직하다.
도 1은 본 발명의 2개의 호몰로그 LPAAT3 및 LPAAT4와, 공지의 호몰로그 LPAAT1 및 LPAAT2의 관계를 나타내는 계통수이다.
도 2는 본 발명의 LPAAT3의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3은 LPAAT4의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열을 나타낸다.
도 4는 LPAAT3와 LPAAT4의 CDS 부분의 DNA 서열을 비교한 도면이다.
도 5는 LPAAT3와 LPAAT4의 추정 아미노산 서열을 비교한 도면이다.
도 6은 LPAAT3p 및 LPAAT4p의 추정 아미노산 서열을 기지의 아미노산 서열과 비교한 도면이다.
(발명의 실시를 위한 최량의 형태)
본 발명은 리소포스파티드산을 아실화하여, 포스파티드산을 생성시키는 것을 특징으로 하는, 모르티에렐라속 유래의 신규 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 유전자에 관한 것이다.
본 발명의 리소포스파티드산 아실기 전이 효소(LPAAT)는, 리소포스파티드산을 아실화하여 포스파티드산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 아실기 공여체는, 통상 아실 CoA이지만, 이것에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 단백질이 작용하는 아실기 전이 반응의 아실기 수용체는 LPA에 한정되지 않고, 여러가지 리소인지질이 아실기 수용체가 될 수 있다.
본 발명에 관한 LPA(1-아실-sn-글리세롤-3-인산이라고도 함)는 글리세롤인지질의 1종이다. LPA는, 글리세롤-3-인산(sn-글리세롤-3-인산이라고도 함)의 1위(α위)의 히드록실기의 아실화에 의해 생성하는, 지방산을 1개만 갖는 리소인지질이다. LPA는, 지질 생합성의 중간체일뿐만 아니라, 세포 증식, 혈소판 응집 효과, 평활근 수축 효과, 암의 침윤 촉진 효과 등 매우 다방면에 걸친 생물학적, 약리적 작용을 갖는 지질성의 세포내 및 세포간 매개체이다.
본 발명의 리소포스파티드산 아실기 전이 효소를 코딩하는 핵산
본 발명의 리소포스파티드산 아실기 전이 효소(LPAAT)에는, LPAAT3 및 LPAAT4가 포함된다. LPAAT3 및 LPAAT4를 코딩하는 핵산의 cDNA, CDS, ORF 및 아미노산 서열의 대응 관계를 이하의 표 1에 정리하여 기재했다.
[표 1]
LPAAT3 LPAAT4
서열 번호 서열 번호 1의 대응 영역 서열 번호 서열 번호 3의 대응 영역
cDNA 서열 번호 1 ***** 서열 번호 3 *****
CDS 서열 번호 8 제158-1147번째 서열 번호 23 제55-996번째
ORF 서열 번호 36 제158-1144번째 서열 번호 37 제55-993번째
아미노산 서열 서열 번호 2 ***** 서열 번호 4 *****
즉, 본 발명의 LPAAT3에 관련되는 서열로서는, LPAAT3의 아미노산 서열인 서열 번호 2, LPAAT3의 ORF의 영역을 나타내는 서열인 서열 번호 36, 그리고, 그 CDS의 영역을 나타내는 서열인 서열 번호 8, 및 그 cDNA의 염기 서열인 서열 번호 1을 들 수 있다. 이 중, 서열 번호 8은 서열 번호 1의 제158∼1147번째의 염기 서열에 상당하고, 서열 번호 36은 서열 번호 1의 제158∼1144번째의 염기 서열 및 서열 번호 8의 제1∼987번째의 염기 서열에 상당한다.
마찬가지로, LPAAT4에 관련되는 서열로서는, LPAAT4의 아미노산 서열인 서열 번호 4, LPAAT4의 ORF의 영역을 나타내는 서열인 서열 번호 37, 그리고, 그 CDS의 영역을 나타내는 서열인 서열 번호 23, 및 그 cDNA의 염기 서열인 서열 번호 3을 들 수 있다. 여기서, 서열 번호 23은 서열 번호 3의 제55∼996번째의 염기 서열에 상당하고, 서열 번호 37은 서열 번호 3의 제55∼993번째의 염기 서열 및 서열 번호 23의 제1∼939번째의 염기 서열에 상당한다.
본 발명의 핵산이란, 단일쇄 및 이중쇄의 DNA 외에, 그 RNA 상보체도 포함하고, 천연 유래인 것이나 인공적으로 제작한 것이라도 좋다. DNA에는, 예컨대 게놈 DNA나, 상기 게놈 DNA에 대응하는 cDNA, 화학적으로 합성된 DNA, PCR에 의해 증폭된 DNA, 및 이들의 조합이나, DNA와 RNA의 하이브리드를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 핵산의 바람직한 양태로서는, (a) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 표시되는 염기 서열, (b) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 염기 서열, (c) 서열 번호 1 또는 3으로 표시되는 염기 서열 등을 들 수 있다.
서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 표시되는 염기 서열 및 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 염기 서열, 및, 서열 번호 1 또는 3으로 표시되는 염기 서열은, 표 1에 기재한 바와 같다.
상기 염기 서열을 얻기 위해서는, LPAAT 활성을 갖는 생물의 EST나 게놈 DNA의 염기 서열 데이터로부터, 기지의 LPAAT 활성을 갖는 단백질과 동일성이 높은 단백질을 코딩하는 염기 서열을 탐색할 수도 있다. LPAAT 활성을 갖는 생물로서는, 지질 생산균이 바람직하고, 지질 생산균으로서는 M. 알피나를 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.
EST 해석을 행하는 경우에는, 우선, cDNA 라이브러리를 제작한다. cDNA 라이브러리의 제작 방법에 대해서는, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』[Cold Spring Harbor Press(2001)]를 참조할 수 있다. 또한, 시판의 cDNA 라이브러리 제작 키트를 이용하더라도 좋다. 본 발명에 알맞는 cDNA 라이브러리의 제작 방법으로서는, 예컨대 이하와 같은 방법을 들 수 있다. 즉, 지질 생산균인 M. 알피나의 적당한 주(株)를 적당한 배지에 식균(植菌)하고, 적당한 기간 전(前)배양한다. 이 전배양에 알맞는 배양 조건으로서는, 예컨대 배지 조성으로서는, 1.8% 글루코오스, 1% 효모 엑기스, pH 6.0을 들 수 있고, 배양 기간은 3일간, 배양 온도는 28℃인 조건을 들 수 있다. 그 후, 전배양물을 적당한 조건으로 본 배양한다. 본 배양에 알맞는 배지 조성으로서는, 예컨대 1.8% 글루코오스, 1% 대두분, 0.1% 올리브유, 0.01% 아데카놀, 0.3% KH2PO4, 0.1% Na2SO4, 0.05% CaCl2·2H2O, 0.05% MgCl2·6H2O, pH 6.0을 들 수 있다. 본 배양에 알맞는 배양 조건으로서는, 예컨대 300 rpm, 1 vvm, 26℃로 8일간 통기 교반 배양하는 조건을 들 수 있다. 배양 기간 중에 적당량의 글루코오스를 첨가하더라도 좋다. 본 배양 중에 적시에 배양물을 채취하고, 거기에서 균체를 회수하여, 전체 RNA를 조제한다. 전체 RNA의 조제에는, 염산 구아니딘/CsCl법 등의 공지의 방법을 이용할 수 있다. 얻어진 전체 RNA로부터 시판의 키트를 이용하여 poly(A)+RNA를 정제할 수 있다. 또한, 시판의 키트를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제작할 수 있다. 그 후, 제작한 cDNA 라이브러리의 임의의 클론의 염기 서열을, 벡터 상에 인서트 부분의 염기 서열을 결정할 수 있도록 설계된 프라이머를 이용하여 결정하여, EST를 얻을 수 있다. 예컨대, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)로 cDNA 라이브러리를 제작한 경우는, 디렉셔널 클로닝(Directional Cloning)을 행할 수 있다.
LPAAT3 및 LPAAT4의 ORF간의 염기 서열의 동일성은 66.6%이다. 한편, M. 알피나 유래의 LPAAT로서 공지의 LPAAT1과 LPAAT2가 있다. 이 2개의 호몰로그와 본 발명의 2개의 호몰로그의 관계를 도 1의 계통수에 나타낸다. 본 발명의 LPAAT3와 공지의 LPAAT1 및 LPAAT2와의 ORF의 염기 서열의 동일성은, 각각 34.3%, 47.0%이고, LPAAT4와 공지의 LPAAT1 및 LPAAT2와의 ORF의 염기 서열의 동일성은 각각 34.6%, 47.3%이다. 도 1로부터 분명한 바와 같이, 본 발명의 LPAAT3 및 4는, 진화적 분류로서는 공지의 LPAAT로부터는 꽤 떨어져 있고, 그 기능도 다르다. 즉, 이하에 설명한 바와 같이, 본 발명의 LPAAT3 및 4는, 공지의 LPAAT가 발현된 숙주가 산생하는 지방산 조성물과는 다른 조성의 지방산 조성물을 숙주 중에 산생시킬 수 있고, 또한, 본 발명의 LPAAT가 발현된 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율이, 본 발명의 LPAAT가 발현되지 않는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율보다 높다고 하는, 공지의 LPAAT와는 전혀 다른 기능을 갖는다.
또, 본 발명의 LPAAT3를 코딩하는 염기 서열 및 LPAAT4를 코딩하는 염기 서열을 각각 BLASTX 해석한 결과, 가장 E-value가 낮은 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis) 521 유래의 추정 단백질(도 1)(UM06426.1, GB accession No. EAK87199)을 코딩하는 염기 서열(GB accession No.XM_757480)과의 동일성은 각각 49.2%, 51.3%이다.
마찬가지로, LPAAT3와 LPAAT4 사이의 아미노산 서열의 동일성은 69.1%이고, LPAAT3와 공지의 LPAAT1 및 LPAAT2와의 동일성은 각각 12.3%, 17.3%, LPAAT4와 공지의 LPAAT1 및 LPAAT2와의 동일성은 각각 12.5%, 15.5%이다. 또, 본 발명의 LPAAT3의 아미노산 서열 및 LPAAT4의 아미노산 서열을 각각 BLASTP 해석한 결과, 가장 E-value가 낮은 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis) 521 유래의 추정 단백질(도 1)(UM06426.1, GB accession No. EAK87199)과의 동일성은 각각 36.2%, 36.7%이다.
본 발명은 또한, 상기 서열 번호 36 및 37로 표시되는 염기 서열(「본 발명 의 염기 서열」이라고 기재하는 경우도 있음), 및, 서열 번호 2 및 4로 표시되는 아미노산 서열(「본 발명의 아미노산 서열」이라고 기재하는 경우도 있음)로 이루어지는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산과 동등한 기능을 갖는 핵산을 포함한다. 「동등한 기능을 갖는」이란, 본 발명의 염기 서열이 코딩하는 단백질 및 본 발명의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이, LPAAT 활성을 갖는 것을 의미한다. LPAAT 활성은, 공지의 방법을 이용하여 측정할 수 있지만, 예컨대 이하와 같은 방법을 들 수 있다. 즉, 본 발명의 LPAAT를 발현시킨 효모로부터, J. Bacteriology, 173, 2026-2034(1991)에 기재한 방법 등에 의해 마이크로솜 분획을 조제한다. 그리고, 반응액인 0.44 mM LPA, 0.36 mM 아실-CoA, 0.5 mM DTT, 1 mg/ml BSA, 2 mM MgCl2, Tris-HCl(pH 7.5)에 상기 마이크로솜 분획을 첨가하고, 28℃에서 적당한 시간 반응시키고, 클로로포름:메탄올을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 지질의 추출을 행하고, 얻어진 지질을 박층 크로마토그래피 등에 의해 분획하여, 상기 반응에 의해 생성한 PA량을 정량할 수 있다. 그 결과, 생성한 PA량이 많으면, LPAAT로서의 활성이 높다고 판단할 수 있다. 예컨대, 본 방법에 의해 LPAAT3이나 LPAAT4를 발현시킨 주에서는, 상기 반응에 있어서, 아실-CoA로서 리놀레오일-CoA를 이용한 경우, PA 분획에 받아들이는 리놀레산(18:2) 양이 증가하는 것을 알 수 있다. 그 때문에, LPAAT3 및 LPAAT4는, LPAAT 활성을 갖는다고 할 수 있다.
또한, 이 LPAAT 활성에 더하여, 본 발명의 염기 서열이 코딩하는 단백질, 또는, 본 발명의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이 발현되고 있는 숙주의 지방산 조성에 있어서, 이하의
i) 올레산 함유량
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율, 및
iv) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율 중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주의 지방산 조성보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 것과 같은 활성을 갖는 단백질(이하, 「본 발명의 LPAAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질」이라고 하는 경우도 있음)인 경우도 포함된다.
구체적으로는, 상기 본 발명의 염기 서열 등을 발현 벡터 pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)에 삽입한 것을, 효모 사카로마이세스 세레비지아 EH13-15주(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)를 숙주로서 형질전환시키고, 얻어진 형질전환체를 배양하여 회수한 균체를, 이하의 실시예 7에 기재한 방법으로 지방산 해석을 행한 경우의 상기 본 발명의 LPAAT의 지방산 조성이, 구체적으로, 이하의
i) 올레산 함유량이 52% 이상;
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율이 7.25 이상;
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율이 9.94 이상; 및
iv) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 함유량의 비율이 10.72 이상이라고 하는 수치인 지방산 조성을 형성할 수 있는 것과 같은 활성을 갖 는 단백질을 코딩하고 있는 염기 서열을 포함하는 핵산이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 염기 서열 등은, LPAAT 활성 및 상기 본 발명의 LPAAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산이다. 또, 이들 지방산 조성에 대해서는, 상기 실시예 7에 기재한 방법과는 다른 형질전환체의 배양 조건을 이용하여 배양한 경우에는, 그 조성에 다소의 변화가 발생하는 경우가 있다. 상기 배양 조건이란, 예컨대 온도나 배양 시간을 들 수 있다.
또한, 상기 「동등한 기능을 갖는」에는, 본 발명의 염기 서열이 코딩하는 단백질 및 본 발명의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이 LPAAT 활성 및 본 발명의 LPAAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성에 더하여, 본 발명의 염기 서열이 코딩하는 단백질, 또는, 본 발명의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이 발현되고 있는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율보다 높은 것과 같은 활성을 갖는 단백질(「본 발명의 세포 내 아라키돈산 함유율을 높이는 활성을 갖는 단백질」이라고 하는 경우도 있음)인 경우도 포함된다.
아라키돈산에 대해서는, 「본 발명의 지방산 조성물」의 항에서 설명한다. 그와 같은 핵산은, 구체적으로는, 상기와 마찬가지로, 본 발명의 염기 서열 등을 발현 벡터 pYE22m에 삽입한 것을, 효모 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae) YPH499주에 Δ12지방산 불포화화 효소, Δ6지방산 불포화화 효소, Δ6지방산 쇄 길이 연장 효소 및 Δ5지방산 쇄 길이 연장 효소를 도입하여 발현시킨 아라키돈산을 생산하는 효모, ARA3-1주를 숙주로서 형질전환시키고, 얻어진 형질전 환체를 배양하여 회수한 균체를, 이하의 실시예 7에 기재한 방법으로 지방산 해석을 행한 경우, 세포 내의 아라키돈산 함유율이, 상기 단백질을 발현하지 않는 숙주보다 높은 비율인 지방산 조성을 형성할 수 있는 것과 같은 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 염기 서열 등은, LPAAT 활성 및 본 발명의 세포 내 아라키돈산 함유율을 높이는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산이다.
이러한 본 발명의 핵산과 동등한 기능을 갖는 핵산으로서는, 이하의 (a)∼(e) 중 어느 하나에 기재한 염기 서열을 포함하는 핵산을 들 수 있다. 또, 이하에 예를 드는 염기 서열의 기재에서, 「본 발명의 상기 활성」이란, 상기한 「LPAAT 활성 및/또는 상기 본 발명의 LPAAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성 및/또는 본 발명의 세포 내 아라키돈산 함유율을 높이는 활성」을 의미한다.
(a) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함한다.
구체적으로는,
(i) 서열 번호 2 또는 4에 나타내는 아미노산 서열 중 1개 또는 복수 개[바 람직하게는 1개 또는 수 개(예컨대, 1∼100개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개)]의 아미노산이 결실된 아미노산 서열,
(ii) 서열 번호 2 또는 4에 나타내는 아미노산 서열 중 1개 또는 복수 개[바람직하게는 1개 또는 수 개(예컨대 1∼100개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개)]의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열,
(iii) 서열 번호 2 또는 4에 나타내는 아미노산 서열에서 1개 또는 복수 개[바람직하게는 1개 또는 수 개(예컨대 1∼100개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개)]의 다른 아미노산이 부가된 아미노산 서열, 또는
(iv) 상기 (i)∼(iii)를 조합한 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열이다.
상기 중, 치환은, 바람직하게는 보존적 치환이다. 보존적 치환이란, 특정한 아미노산 잔기를 유사한 물리 화학적 특징을 갖는 잔기로 치환하는 것이지만, 원래의 서열 구조에 관한 특징을 실질적으로 변화시키지 않으면 어떠한 치환이라도 좋고, 예컨대 치환 아미노산이, 원래의 서열에 존재하는 나선를 파괴하거나, 원래의 서열을 특징짓는 다른 종류의 2차 구조를 파괴하지 않으면 어떠한 치환이라도 좋다.
보존적 치환은, 일반적으로는, 생물학적 계합성이나 화학적 펩티드 합성으로 도입되지만, 바람직하게는, 화학적 펩티드 합성에 의한다. 이 경우, 치환기에는, 비천연 아미노산 잔기가 포함되어 있더라도 좋고, 펩티드 모방체나, 아미노산 서열 중, 치환되어 있지 않은 영역이 역전하고 있는 역전형 또는 동 영역이 반전하고 있는 반전형도 포함된다.
이하에, 아미노산 잔기를 치환 가능한 잔기별로 분류하여 예시하지만, 치환 가능한 아미노산 잔기는 이하에 기재되어 있는 것에 한정되는 것이 아니다.
A군: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌 및 시클로헥실알라닌
B군: 아스파라긴산, 글루타민산, 이소아스파라긴산, 이소글루타민산, 2-아미노아디프산 및 2-아미노수베르산
C군: 아스파라긴 및 글루타민
D군: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산 및 2,3-디아미노프로피온산
E군: 프롤린, 3-히드록시프롤린 및 4-히드록시프롤린
F군: 세린, 트레오닌 및 호모세린
G군: 페닐알라닌 및 티로신
비보존적 치환인 경우는, 상기 종류 중, 어느 하나의 멤버와 다른 종류의 멤버를 교환할 수 있지만, 이 경우는, 본 발명의 단백질의 생물학적 기능을 유지하기 위해, 아미노산의 히드로파시(hydropathy) 지수(히드로파시 아미노산 지수)를 고려하는 것이 바람직하다[Kyte 등, J. Mol. Biol., 157:105-131(1982)].
또한, 비보존적 치환인 경우는, 친수성에 기초하여 아미노산의 치환을 행할 수 있다.
본 명세서 및 도면에서, 염기나 아미노산 및 그 약어는, IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature에 따르거나, 또는, 예컨대 Immunology--A Synthesis[제2판, E.S. Golub 및 D.R. Gren 감수, Sinauer Associates, 메사추세츠주 선더랜드(1991)] 등에 기재되어 있는 것과 같은, 당업계에서 관용되고 있는 약어에 기초한다. 또한 아미노산에 관하여 광학 이성체가 있을 수 있는 경우는, 특히 명시하지 않으면 L체를 나타낸다.
D-아미노산 등의 상기한 아미노산의 입체 이성체, α,α-이치환 아미노산 등의 비천연 아미노산, N-알킬아미노산, 젖산, 및 그 밖의 비관용적인 아미노산도 또한, 본 발명의 단백질을 구성하는 요소가 될 수 있다.
또, 본 명세에서 이용하는 단백질의 표기법은, 표준적 용법 및 당업계에서 관용되고 있는 표기법에 기초하여, 좌측 방향은 아미노 말단 방향이고, 우측 방향은 카르복시 말단 방향이다.
마찬가지로, 일반적으로는, 특별히 언급하지 않는 한, 단일쇄 폴리뉴클레오티드 서열의 좌단은 5'단이고, 이중쇄 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향을 5' 방향으로 한다.
당업자라면, 당업계에서 공지의 기술을 이용하여, 본 명세서에 기재한 단백질의 적당한 변이체를 설계하고 제작할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성에 그다지 중요하지 않다고 생각되는 영역을 타겟으로 함으로써, 본 발명 의 단백질의 생물학적 활성을 손상시키지 않고 그 구조를 변화시킬 수 있는 단백질 분자 중의 적절한 영역을 동정할 수 있다. 또한, 유사한 단백질 간에 보존되어 있는 분자의 잔기 및 영역을 동정할 수도 있다. 또한, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성 또는 구조에 중요하다고 생각되는 영역 중에, 생물학적 활성을 손상시키지 않고, 또한, 단백질의 폴리펩티드 구조에 악영향을 미치지 않고서, 보존적 아미노산 치환을 도입할 수도 있다. 특히, 본 발명에서는, 도 6 중에 이중 하선으로 나타낸 바와 같이, 본 발명의 2개의 LPAAT의 아미노산 서열 중에, 보존 모티브인 「HXXXXD(HX4D)」(보존되어 있는 아미노산 잔기를 *로 나타냄)가 존재한다. 본 모티브는, 글리세로인지질 아실기 전이 효소(Glycerolipid acyltransferase)에 필수적인 모티브이고(J. Bacteriology, 180, 1425-1430, 1998), 본 발명의 LPAAT에서도 중요한 모티브이다. 따라서, 본 발명의 변이체는 상기 보존 모티브가 보존되고, 또한, 본 발명의 상기 활성이 손상되지 않는 한, 어떠한 변이체라도 좋다. 또, 상기 보존 모티브 중에서, X는 어떠한 아미노산 잔기라도 좋은 것을 나타내고 있다.
당업자라면, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성 또는 구조에 중요하고, 동 단백질의 펩티드와 유사한 펩티드의 잔기를 동정하고, 이 2개의 펩티드의 아미노산 잔기를 비교하여, 본 발명의 단백질과 유사한 단백질의 어느 잔기가, 생물학적 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기인지를 예측하는, 소위, 구조-기능 연구를 행할 수 있다. 또한, 이와 같이 예측한 아미노산 잔기의 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택함으로써, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성이 유지되어 있는 변이체를 선택할 수도 있다. 또한, 당업자라면, 본 단백질의 변이체의 3차원 구조 및 아미노산 서열을 해석할 수도 있다. 또한, 얻어진 해석 결과로부터, 단백질의 3차원 구조에 관한, 아미노산 잔기의 정렬을 예측할 수도 있다. 단백질 표면 상에 있다고 예측되는 아미노산 잔기는, 다른 분자와의 중요한 상호 작용에 관여할 가능성이 있지만, 당업자라면, 상기한 바와 같은 해석 결과에 기초하여, 이러한 단백질 표면 상에 있다고 예측되는 아미노산 잔기를 변화시키지 않는 것과 같은 변이체를 제작할 수 있다. 또한, 당업자라면, 본 발명의 단백질을 구성하는 각각의 아미노산 잔기 중, 하나의 아미노산 잔기만을 치환하는 것과 같은 변이체를 제작할 수도 있다. 이러한 변이체를 공지의 분석 방법에 의해 스크리닝하여, 개개의 변이체 정보를 수집할 수 있다. 이에 따라, 어느 특정한 아미노산 잔기가 치환된 변이체의 생물학적 활성이, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성에 비해 저하되는 경우, 그와 같은 생물학적 활성을 나타내지 않는 경우, 또는, 본 단백질의 생물학적 활성을 저해하는 것과 같은 부적절한 활성이 발생하는 것과 같은 경우를 비교함으로써, 본 발명의 단백질을 구성하는 개개의 아미노산 잔기의 유용성을 평가할 수 있다. 또한, 당업자라면, 이러한 일상적인 실험에서 수집한 정보에 기초하여, 단독으로, 또는 다른 돌연변이와 조합하여, 본 발명의 단백질의 변이체로서는 바람직하지 않은 아미노산 치환을 용이하게 해석할 수 있다.
상기한 바와 같이, 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질은, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』[Cold Spring Harbor Press (2001)], 『Current Protocols in Molecular Biology』[John Wiley & Sons (1987-1997), Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92, Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6] 등에 기재한 부위 특이적 변이 유발법 등의 방법에 따라 조제할 수 있다. 이러한 아미노산의 결실, 치환 또는 부가 등의 변이가 이루어진 변이체의 제작은, 예컨대 Kunkel법이나 Gapped duplex법 등의 공지 수법에 의해, 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예컨대 QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit[스트라타진사(Stratagene Corporation) 제조], GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System[인비트로겐사(Invitrogen Corporation) 제조], TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System[Mutan-K, Mutan-Super Express Km 등: 타카라 바이오사(Takara Bio Inc) 제조] 등을 이용하여 행할 수 있다.
또, 단백질의 아미노산 서열에, 그 활성을 유지하면서 1 또는 복수 개의 아미노산의 결실, 치환, 또는 부가를 도입하는 방법으로서는, 상기한 부위 특이적 변이 유발 외에도, 유전자를 변이원으로 처리하는 방법, 및 유전자를 선택적으로 개열(開裂)하여 선택된 뉴클레오티드를 제거, 치환 또는 부가한 후에 연결하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 바람직하게는, 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, LPAAT 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열 이다.
또한, 본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열에는, 서열 번호 2 또는 4에서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열도 포함된다.
본 발명의 단백질에서의 아미노산의 변이 또는 수식의 수, 또는 변이 또는 수식의 부위는, LPAAT 활성, 또는 본 발명의 LPAAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성, 또는 본 발명의 세포 내 아라키돈산 함유율을 높이는 활성이 유지되는 한 제한은 없다.
본 발명의 LPAAT 활성, 또는 본 발명의 LPAAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성, 또는 본 발명의 세포 내 아라키돈산 함유율을 높이는 활성은, 공지의 방법을 이용하여 측정하는 것이 가능하다. 예컨대, 이하의 문헌: J.B.C., 265, 17215-17221, 1990을 참조할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 「LPAAT 활성」은 이하와 같이 측정하더라도 좋다. 본 발명의 LPAAT를 발현시킨 효모로부터, J. Bacteriology, 173, 2026-2034(1991)에 기재한 방법 등에 의해 마이크로솜 분획을 조제한다. 그리고, 반응액인 0.44 mM LPA, 0.36 mM 아실-CoA, 0.5 mM DTT, 1 mg/ml BSA, 2 mM MgCl2, 50 mMTris-HCl(pH 7.5)에 상기 마이크로솜 분획을 첨가하고, 28℃에서 적당한 시간 반응시키며, 클로로포름:메탄올을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 지질의 추출을 행하고, 얻어진 지질을 박층 크로마토그래피 등에 의해 분획하여, 생성된 PA량을 정량할 수 있다.
또한, 본 발명의 「LPAAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성」은, 예컨대 이하와 같이 측정하더라도 좋다. 본 발명의 지방산 조성물의 제조 방법에 의해 얻어진 동결 건조된 균체에, 적당한 비율로 조정한 클로로포름:메탄올을 첨가하여 교반한 후, 적당한 시간, 가열 처리를 행한다. 또한 원심 분리에 의해 균체를 분리하여, 용매를 회수하는 것을 수 회 반복한다. 그 후, 적당한 방법을 이용하여 지질을 건고(乾固)시키고 나서, 클로로포름 등의 용매를 첨가하여 지질을 용해한다. 이 시료를 적당량 분취하고, 염산메탄올법에 의해 균체의 지방산을 메틸에스테르로 유도한 후에, 헥산으로 추출하여, 헥산을 유거하고 나서, 가스 크로마토그래피로 분석을 행한다. 또한, 본 발명의 「세포 내 아라키돈산 함유율을 높이는 활성」도 상기 방법으로 아라키돈산의 함유량을 분석함으로써 측정할 수 있다.
(b) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열
본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함한다. 서열 번호 36 또는 서열 번호 37 및 LPAAT 활성에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 염기 서열은, 당업자에게 공지인 방법으로 적당한 단편을 이용하여 프로브를 제작하고, 이 프로브를 이용하여 균주 복제(colony hybridization), 플라크 잡종(plaque hybridization), 서던 블롯(Southern blot) 등의 공지의 하이브리다이제이션법에 의해, cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리 등으로부터 얻을 수 있다.
하이브리다이제이션법의 상세한 순서에 대해서는, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』[Cold Spring Harbor Press (2001); 특히 Section 6-7], 『Current Protocols in Molecular Biology』[John Wiley & Sons (1987-1997); 특히 Section 6.3-6.4], 『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』[Oxford University (1995); 하이브리다이제이션 조건에 대해서는 특히 Section 2.10] 등을 참조할 수 있다.
하이브리다이제이션 조건의 장점은, 주로 하이브리다이제이션 조건, 보다 바람직하게는, 하이브리다이제이션 조건 및 세정 조건에 의해 결정된다. 본 명세서에서의 「엄격한 조건」에는, 중간 정도 또는 고도로 엄격한 조건이 포함된다.
구체적으로는, 중간 정도로 엄격한 조건으로서는, 예컨대 하이브리다이제이션 조건으로서, 1×SSC∼6×SSC, 42℃∼55℃의 조건, 보다 바람직하게는, 1×SSC∼3×SSC, 45℃∼50℃의 조건, 가장 바람직하게는, 2×SSC, 50℃의 조건을 들 수 있다. 하이브리다이제이션 용액 중에, 예컨대 약 50%의 포름아미드를 포함하는 경우에는, 상기 온도보다 5 내지 15℃ 낮은 온도를 채용한다. 세정 조건으로서는, 0.5×SSC∼6×SSC, 40℃∼60℃를 들 수 있다. 하이브리다이제이션 및 세정시에는, 일반적으로, 0.05%∼0.2%, 바람직하게는 약 0.1% SDS를 첨가하더라도 좋다.
고도로 엄격(high stringent)한 조건으로서는, 중간 정도로 엄격한 조건보다 높은 온도 및/또는 낮은 염 농도에서의 하이브리다이제이션 및/또는 세정을 포함한 다. 예컨대, 하이브리다이제이션 조건으로서, 0.1×SSC∼2×SSC, 55℃∼65℃의 조건, 보다 바람직하게는, 0.1×SSC∼1×SSC, 60℃∼65℃의 조건, 가장 바람직하게는, 0.2×SSC, 63℃의 조건을 들 수 있다. 세정 조건으로서, 0.2×SSC∼2×SSC, 50℃∼68℃, 보다 바람직하게는, 0.2×SSC, 60∼65℃를 들 수 있다.
특히 본 발명에 이용되는 하이브리다이제이션 조건으로서는, 예컨대 5×SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) 및 50% 포름아미드 중 42℃의 조건으로 프리 하이브리다이제이션을 행한 후, 프로브를 첨가하고 밤새 42℃로 유지하여 하이브리드를 형성시키고, 그 후, 0.2×SSC, 0.1% SDS 중, 65℃로 20분간의 세정을 3회 행한다고 하는 조건을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 프로브에 방사성 물질을 사용하지 않는 시판의 하이브리다이제이션 키트를 사용할 수도 있다. 구체적으로는, DIG 핵산 검출 키트[로슈 진단사(Roche Diagnostics K.K.)], ECL direct labeling & detection system(Amersham사 제조)을 사용한 하이브리다이제이션 등을 들 수 있다.
본 발명에 포함되는 염기 서열로서는, 바람직하게는, 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건 하에서 혼성화하고, 또한, LPAAT 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 들 수 있다.
(c) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 67% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열
본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 36 또는 37에 나타나는 핵산 서열에 대하여 적어도 67% 이상의 염기 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함한다.
바람직하게는, 서열 번호 36 또는 37에 나타나는 핵산 서열에 대하여 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 75%, 한층 더 바람직하게는 80%(예컨대, 85% 이상, 한층 더 바람직하게는 90% 이상, 나아가서는 95%, 98% 또는 99%)의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 들 수 있다. 상기한 바와 같이, LPAAT3(서열 번호 36) 및 LPAAT4(서열 번호 37)의 동일성은 66.6%이다. 본 발명의 핵산은, 서열 번호 36 또는 37에 나타나는 핵산 서열에 대하여 적어도 67% 이상이고, 양자에 유사한 것을 포함한다.
2개의 핵산 서열의 동일성 %는, 시각적 검사나 수학적 계산에 의해 결정할 수 있지만, 컴퓨터 프로그램을 사용하여 2개의 핵산의 서열 정보를 비교함으로써 결정하는 것이 바람직하다. 서열 비교 컴퓨터 프로그램으로서는, 예컨대 미국 국립 의학 도서관의 웹 사이트: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html에서 이용할 수 있는 BLASTN 프로그램[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10)]: 버전 2.2.7, 또는 WU-BLAST 2.0 알고리즘 등을 들 수 있다. WU-BLAST 2.0에 대한 표준적인 디폴트 파라미터의 설정은, 이하의 인터넷 사이트: http://blast.wustl.edu에 기재되어 있는 것을 이용할 수 있다.
(d) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 69% 이상인 아미노산 서열을 코딩하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열
본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 69% 이상인 아미노산 서열을 코딩하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함한다. 본 발명의 핵산이 코딩하는 단백질은, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질과 동등한 기능을 갖는 한, LPAAT3 또는 LPAAT4의 아미노산 서열과 동일성이 있는 단백질이라도 좋다.
구체적으로는, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 한층 더 바람직하게는, 90%(예컨대, 95%, 나아가서는, 98%) 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 등을 들 수 있다. 상기한 바와 같이, LPAAT3(서열 번호 2)와 LPAAT4(서열 번호 4) 사이의 아미노산 서열의 동일성은 69.1%이다. 본 발명의 핵산이 코딩하는 단백질은, 서열 번호 2 또는 4에 나타나는 아미노산 서열에 대하여 적어도 69% 이상이고, 양자에 유사한 것을 포함한다.
본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 바람직하게는, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 코딩하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열이다. 더욱 바람직하게는, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 코딩하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖 는 단백질을 코딩하는 염기 서열이다.
2개의 아미노산 서열의 동일성 퍼센트는, 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해 결정할 수 있다. 또한, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 동일성 퍼센트를 결정할 수도 있다. 그와 같은 컴퓨터 프로그램으로서는, 예컨대 BLAST, FASTA[Altschul 등, J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)], 및 ClustalW 등을 들 수 있다. 특히, BLAST 프로그램에 의한 동일성 검색의 각종 조건(파라미터)은, Altschul 등(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)에 기재된 것으로, 미국 생물 공학 정보 센터(NCBI)나 DNA Data Bank of Japan(DDBJ)의 웹 사이트에서 공적으로 입수할 수 있다(BLAST 메뉴얼, Altschul 등 NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul 등). 또한, 유전 정보 처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7(제네틱스), DINASIS Pro(히다치 소프트), Vector NTI(Infomax) 등의 프로그램을 이용하여 결정할 수도 있다.
복수의 아미노산 서열을 병렬시키는 특정한 정렬 스킴(alignment scheme)은, 서열 중, 특정한 짧은 영역의 매칭도 나타낼 수 있기 때문에, 이용한 서열의 전체 길이 서열간에 유의한 관계가 없는 경우라도, 그와 같은 영역에 있어서, 특정한 서열 동일성이 매우 높은 영역을 검출할 수도 있다. 또한, BLAST 알고리즘은, BLOSUM62 아미노산 스코어를 붙이는 매트릭스를 이용할 수 있지만, 선택 파라미터로서는, 이하의 것을 이용할 수 있다: (A) 낮은 조성 복잡성을 갖는 쿼리 서열(query sequence)의 세그먼트[Wootton 및 Federhen의 SEG 프로그램(Computers and Chemistry, 1993)에 의해 결정됨; Wootton 및 Federhen, 1996 「서열 데이터 베이스에 있어서의 조성 편중 영역의 해석(Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」 Methods Enzymol., 266: 544-71도 참조하길 바람], 또는, 단주기성의 내부 반복으로 이루어지는 세그먼트[Claverie 및 States(Computers and Chemistry, 1993)의 XNU 프로그램에 의해 결정됨]를 마스크하기 위한 필터를 포함하는 것, 및 (B) 데이터 베이스 서열에 대한 적합을 보고하기 위한 통계학적 유의성(有意性)의 임계치, 또는 E-스코어(Karlin 및 Altschul, 1990)의 통계학적 모델에 따라, 단순히 우연에 의해 발견되는 적합의 기대 확률; 어떤 적합에 기인하는 통계학적 유의차(有意差)가 E-스코어 임계치보다 큰 경우, 이 적합은 보고되지 않는다.
(e) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열
본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함한다.
서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 및 혼성화의 조건은 상기한 바와 같다. 본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열로서는, 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화 하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산에는, 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 이루어지는 염기 서열에서 1 또는 복수 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산도 포함된다. 구체적으로는,
(i) 서열 번호 36 또는 37에 나타내는 염기 서열 중 1개 또는 복수 개[바람직하게는 1개 또는 수 개(예컨대, 1∼300개, 1∼250개, 1∼200개, 1∼150개, 1∼100개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개)]의 염기가 결실된 염기 서열,
(ii) 서열 번호 36 또는 37에 나타내는 염기 서열 중 1개 또는 복수 개[바람직하게는 1개 또는 수 개(예컨대 1∼300개, 1∼250개, 1∼200개, 1∼150개, 1∼100개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개)]의 염기가 다른 염기로 치환된 염기 서열,
(iii) 서열 번호 36 또는 37에 나타내는 염기 서열에서 1개 또는 복수 개[바람직하게는 1개 또는 수 개(예컨대 1∼300개, 1∼250개, 1∼200개, 1∼150개, 1∼100개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개)]의 다른 염기가 부가된 염기 서열, 또는
(iv) 상기 (i)∼(iii)를 조합한 염기 서열로서, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코딩하고 있는 염기 서열을 포함하는 핵산을 이용할 수도 있다.
본 발명의 핵산의 바람직한 양태로서는, 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나에 기재한 염기 서열 또는 그 단편을 포함하는 핵산도 포함된다.
(a) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 표시되는 염기 서열
(b) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 염기 서열
(c) 서열 번호 1 또는 3으로 표시되는 염기 서열
(a) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 표시되는 염기 서열, (b) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 염기 서열, (c) 서열 번호 1 또는 3으로 표시되는 염기 서열에 대해서는, 표 1에 기재한 바와 같다. 상기 서열의 단편이란, 상기 염기 서열에 포함되는 ORF, CDS, 생물학적 활성을 갖는 영역, 이하에 기재하는 것과 같은 프라이머로서 이용한 영역, 프로브가 될 수 있는 영역이 포함되고, 천연 유래인 것이나 인공적으로 제작한 것이라도 좋다.
본 발명의 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 단백질
본 발명의 단백질은, 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 및 상기 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 포함하고, 천연 유래인 것이나 인공적으로 제작한 것이라도 좋다. 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질에 대해서는, 상기한 바와 같다. 「동등한 기능을 갖는 단백질」이란, 상기 『본 발명의 리소포스파티드산 아실기 전이 효소를 코딩하는 핵산』의 항에서 설명한 대로, 「본 발명의 상기 활성」을 갖는 단백질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질로서는, 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나에 기재한 단백질을 들 수 있다.
(a) 서열 번호 2 또는 4에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질
(b) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 69% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질
상기 중, 서열 번호 2 또는 4에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열, 또는, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 69% 이상인 아미노산 서열에 대해서는, 상기 『본 발명의 리소포스파티드산 아실기 전이 효소를 코딩하는 핵산』의 항에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 「본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질」은, 서열 번호 36 또는 서열 번호 37의 염기 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 변이체, 또는, 서열 번호 2 또는 4에 나타나는 아미노산 서열에서 1개 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가 등의 많은 종류의 수식에 의해 변이된 단백질, 또는 아미노산 측쇄 등이 수식되어 있는 수식 단백질, 다른 단백질과의 융합 단백질로서, 또한, LPAAT 활성을 갖는 단백질이거나, 및/또는, 본 발명의 LPAAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질이거나, 및/또는 본 발명의 세포 내 아라키돈산 함유율을 높이는 활성을 갖는 단백질도 포함된다.
또한, 본 발명의 단백질은, 인공적으로 제작한 것이라도 좋고, 그 경우는, Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, 어드밴스드 캠테크사 제조, 퍼킨 엘머사 제조, 파르마시아사 제조, 프로테인 테크놀로지 인스트루먼트사 제조, 신시셀베가사 제조, 퍼셉티브사 제조, 시마즈 제작소사 제조 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.
LPAAT 의 핵산의 클로닝
본 발명의 LPAAT의 핵산은, 예컨대 적절한 프로브를 이용하여 cDNA 라이브러리로부터 스크리닝함으로써, 클로닝할 수 있다. 또한, 적절한 프라이머를 이용하여 PCR 반응에 의해 증폭하고, 적절한 벡터에 연결함으로써 클로닝할 수 있다. 또한, 별도의 벡터에 서브클로닝할 수도 있다.
예컨대, pBlue-ScriptTM SK(+) (Stratagene), pGEM-T (Promega), pAmp (TM: Gibco-BRL), p-Direct (Clontech), pCR2.1-TOPO(Invitrogene) 등의 시판의 플라스미드 벡터를 이용할 수 있다. 또한, PCR 반응으로 증폭하는 경우, 프라이머는, 상기한 서열 번호 1 또는 3 등에 나타나는 염기 서열의 어느 부분도 이용할 수 있지만, 예컨대 서열 번호 1에 대해서는,
상류측용 프라이머로서 I-1:5'-GGATGTCATCAATGTCATCAATAGAG-3'(서열 번호 9)를,
하류측 프라이머로서, I-2:5'-CTAACCCCCTCTTCCTCCACCAC-3'(서열 번호 10)를,
서열 번호 3에 대해서는,
상류측용 프라이머로서 B-1:5'-CCTCGCAAAATGTATCGTGG-3'(서열 번호 15)를,
하류측 프라이머로서, B-2:5'-GATGGGAAGTTGAGCTTGAATG-3'(서열 번호 16) 등을,
각각 이용할 수 있다. 그리고, M. 알피나 균체로부터 조제한 cDNA에, 상기 프라이머 및 내열성 DNA 폴리메라아제 등을 작용시켜 PCR 반응을 행한다. 상기 방법은, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』[Cold Spring Harbor Press (2001)] 등에 따라, 당업자라면 용이하게 행할 수 있지만, 본 발명의 PCR 반응의 조건으로서는, 예컨대 이하의 조건을 들 수 있다.
변성 온도: 90∼95℃
어닐링 온도: 40∼60℃
신장 온도: 60∼75℃,
사이클 수: 10회 이상
얻어진 PCR 산물의 정제에는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, GENECLEAN(후나코시), QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN), ExoSAP-IT(GE 헬스케어 바이오 사이언스) 등의 키트를 이용하는 방법, DEAE-셀룰로오스 여과지를 이용하는 방법, 투석 튜브를 이용하는 방법 등이 있다. 아가로스겔을 이용하는 경우에는, 아가로스겔 전기 영동을 행하고, 염기 서열 단편을 아가로스겔로부터 추출하여, GENECLEAN(후나코시), QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN), 프리즈 & 스 퀴즈법 등에 의해 정제할 수 있다.
클로닝한 핵산의 염기 서열은, 염기 서열 시퀀서를 이용하여 결정할 수 있다.
LPAAT 발현용 벡터 구축 및 형질전환 체의 제작
본 발명은 또한, 본 발명의 LPAAT3 및 4를 코딩하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명은, 또한, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체도 제공한다.
이러한 재조합 벡터 및 형질전환체는 이하와 같이 하여 얻을 수 있다. 즉, 본 발명의 LPAAT를 코딩하는 핵산을 갖는 플라스미드를 제한 효소를 이용하여 소화한다. 이용하는 제한 효소로서는, 예컨대 EcoRI, KpnI, BamHI 및 SalI 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 말단을 T4폴리메라아제 처리함으로써 평활화하더라도 좋다. 소화 후의 염기 서열 단편을 아가로스겔 전기 영동에 의해 정제한다. 이 염기 서열 단편을, 발현용 벡터에 공지의 방법을 이용하여 삽입함으로써, LPAAT 발현용 벡터를 얻을 수 있다. 이 발현 벡터를 숙주에 도입하고 형질전환체를 제작하여, 목적으로 하는 단백질의 발현을 하도록 한다.
이 때, 발현 벡터 및 숙주는, 목적으로 하는 단백질을 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예컨대 숙주로서, 진균이나 세균, 식물, 동물 또는 그들의 세포 등을 들 수 있다. 진균으로서, 지질 생산균인 M. 알피나 등의 실형 균, 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae) 등의 효모 등을 들 수 있다. 또한 세균으로서, 대장균(Escherichia coli)이나 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 또한 식물로서는, 유채씨, 콩, 목화, 홍화, 아마 등의 유량(油糧) 식물을 들 수 있다.
지질 생산균으로서는, 예컨대 MYCOTAXON, Vol.XLIV, NO.2, pp.257-265(1992)에 기재되어 있는 균주를 사용할 수 있고, 구체적으로는, 모르티에렐라(Mortierella)속에 속하는 미생물, 예컨대 모르티에렐라 엘론가타(Mortierella elongata) IFO8570, 모르티에렐라 엑시구아(Mortierella exigua) IFO8571, 모르티에렐라 하이그로필라(Mortierella hygrophila) IFO5941, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS 219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS528.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68 등의 모르티에렐라 아속(subgenus Mortierella)에 속하는 미생물, 또는 모르티에렐라 이사벨리나(Mortierella isabellina) CBS194.28, IFO6336, IFO7824, IFO7873, IFO7874, IFO8286, IFO8308, IFO7884, 모르티에렐라 나나(Mortierella nana) IFO8190, 모르티에렐라 라만니아나(Mortierella ramanniana) IFO5426, IFO8186, CBS112.08, CBS212.72, IFO7825, IFO8184, IFO8185, IFO8287,모르티에렐라 비나세아(Mortierella vinacea) CBS236.82 등의 마이크로뮤코 아속(subgenus Micromucor)에 속하는 미생물 등을 들 수 있다. 특히, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)가 바람직하다.
진균류를 숙주로서 이용하는 경우는, 본 발명의 핵산이 숙주 중에서 자립 복제 가능하거나, 또는 해당 균의 염색체 상에 삽입될 수 있는 구조인 것이 바람직하다. 그와 동시에, 프로모터, 터미네이터를 포함하는 구성인 것이 바람직하다. 숙주 로서 M. 알피나를 사용하는 경우, 발현 벡터로서, 예컨대 pD4, pDuraSC, pDura5 등을 들 수 있다. 프로모터로서는, 숙주 중에서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 프로모터를 이용하더라도 좋고, 예컨대 histonH4.1 유전자 프로모터, GAPDH(글리세르알데히드3-인산데히드로게나아제) 유전자 프로모터, TEF(Translation elongation factor) 유전자 프로모터라고 하는 M. 알피나에 유래하는 프로모터가 이용된다.
M. 알피나 등의 실형 균으로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 예컨대 전기 천공법, 스페로플라스트법, 파티클 딜리버리법 및 핵 내로의 DNA의 직접 마이크로 인젝션 등을 들 수 있다. 영양 요구성의 호스트 주를 이용하는 경우는, 그 영양소를 결핍한 선택 배지 상에서 생육하는 주를 선택함으로써, 형질전환 주를 취득할 수 있다. 또한, 형질전환에 약제 내성 마커 유전자를 이용하는 경우에는, 그 약제를 포함하는 선택 배지에서 배양을 행하여, 약제 내성을 나타내는 세포 콜로니를 얻을 수 있다.
효모를 숙주로서 이용하는 경우는, 발현 벡터로서, 예컨대 pYE22m 등을 들 수 있다. 또한, pYES(Invitrogen), pESC(STRATAGENE) 등의 시판의 효모 발현용 벡터를 이용하더라도 좋다. 또한 본 발명에 알맞는 숙주로서는, 사카로마이세스 세레비지아 EH13-15주(trp1, MATα) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 프로모터로서는, 예컨대 GAPDH 프로모터, gal1 프로모터, gal10 프로모터 등의 효모 등에 유래하는 프로모터가 이용된다.
효모로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 예컨대 초산리튬법, 전기 천공법, 스페로플라스트법, 덱스트란 중개 트랜스펙션, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 중개 트랜스펙션, 프로토 플라스트 융합, 리포좀 중의 폴리뉴클레오티드(단수 또는 복수)의 피포(被包), 및 핵 내로의 DNA의 직접 마이크로 인젝션 등을 들 수 있다.
대장균 등의 세균을 숙주로서 이용하는 경우는, 발현 벡터로서는, 예컨대 파르마시아사의 pGEX, pUC18 등을 들 수 있다. 프로모터로서는, 예컨대 trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 등의 대장균이나 파지(phage) 등에 유래하는 프로모터가 이용된다. 세균으로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 예컨대 전기 천공법이나 염화칼슘법을 이용할 수 있다.
본 발명의 지방산 조성물의 제조 방법
본 발명은, 상기 형질전환체로부터, 지방산 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 즉, 상기 형질전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 지방산 조성물을 제조하는 방법이다. 구체적으로는, 이하의 방법으로 제조할 수 있다. 그러나, 본 제조 방법에 관해서는, 해당 방법에 한정되지 않고, 일반적인 공지의 다른 방법을 이용하여 행할 수도 있다.
LPAAT를 발현시킨 생물의 배양에 이용하는 배지는, 적당한 pH 및 침투압을 가지고, 각 숙주의 증식에 필요한 영양소, 미량 성분, 혈청이나 항생 물질 등의 생물 재료를 포함하고 있는 배양액(배지)이면, 어떠한 배양액도 이용할 수 있다. 예컨대, 효모를 형질전환하여 LPAAT를 발현시킨 경우는, SC-Trp 배지, YPD 배지, YPD5 배지 등을 이용할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 구체적인 배지의 조성으로서 SC-Trp 배지를 예시한다: 1 L당, Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌 황산염 1.25 g, 아르기 닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 류신 1.8 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 우라실 0.6 g을 혼합한 것) 1.3 g.
배양 조건은, 숙주의 증식에 적합하고, 또한 생성된 효소가 안정하게 유지되는 데 적당한 조건이면 어떠한 조건이라도 좋지만, 구체적으로는, 혐기도(嫌氣度), 배양 시간, 온도, 습도, 정치 배양 또는 진탕 배양 등의 개개의 조건을 조절할 수 있다. 배양 방법은, 동일 조건에서의 배양(1단계 배양)이라도 좋고, 2 이상의 다른 배양 조건을 이용하는, 소위 2단계 배양 또는 3단계 배양이라도 좋지만, 대량 배양을 행하는 경우에는, 배양 효율이 좋은 2단계 배양 등이 바람직하다.
이하에, 본 발명의 지방산 조성물의 구체적인 제조 방법으로서, 숙주로서 효모를 이용하여 2단계 배양을 행한 경우를 예시하여 설명한다. 즉, 전배양으로서, 상기에서 얻어진 콜로니를, 예컨대 상기한 SC-Trp 배지 등에 식균하고, 30℃에서 2일간 진탕 배양을 행한다. 그 후, 본 배양으로서, YPD5(2% 효모 엑기스, 1% 폴리펩톤, 5% 글루코오스) 배지 10 ml에 전배양액을 500 ㎕ 첨가하고, 30℃에서 2일간 진탕 배양을 행하는 방법이다.
본 발명의 지방산 조성물
본 발명은 또한, 본 발명의 LPAAT3 또는 4가 발현되고 있는 세포에서의 1 또는 그 이상의 지방산의 집합체인 지방산 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 LPAAT3 또는 4가 발현되고 있는 형질전환체를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물이다. 지방산은, 유리 지방산이라도 좋고, 트리글리세리드, 인지질 등이라도 좋 다. 특히, 본 발명의 지방산 조성물은, 그 지방산 조성에 있어서, 이하의
i) 올레산 함유량
ii) 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율
iii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율, 및
iv) 팔미트산 함유량에 대한, 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율 중 적어도 하나 이상이, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물의 상기 비율보다 높은 것, 또는, 본 발명의 지방산 조성물에 있어서의 아라키돈산 함유율이, 상기 재조합 벡터로 형질전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물보다 높은 것을 특징으로 한다. 여기서, 「본 발명의 재조합 벡터로 형질전환되지 않은 숙주」란, 예컨대 본 명세서 중의 「본 발명의 리소포스파티드산 아실기 전이 효소를 코딩하는 핵산」의 항목에서 기재한 핵산이 삽입되어 있지 않은 벡터(빈 벡터)로 형질전환된 숙주이다. 또, 상기 지방산 조성물에 대해서는, 상기 「본 발명의 리소포스파티드산 아실기 전이 효소를 코딩하는 핵산」의 항목에서도 설명한 바와 같이 배양 조건을 변화시킨 경우에는, 그 지방산 조성이 다소 변화되는 경우도 있다.
본 발명의 지방산 조성물에 포함되는 지방산으로서는, 장쇄 탄수화물의 쇄형 또는 분기형의 모노카르복실산을 말하고, 예컨대 미리스트산(테트라데칸산)(14:0), 미리스톨레산(테트라데센산)(14:1), 팔미트산(헥사데칸산)(16:0), 팔미톨레산(9-헥사데센산)(16:1), 스테아르산(옥타데칸산)(18:0), 올레산(cis-9-옥타데센산)(18:1(9)), 박센산(11-옥타데센산)(18:1(11)), 리놀레산(cis,cis-9,12 옥타데카디 엔산)(18:2(9,12)), α-리놀렌산(9,12,15-옥타데카트리엔산)(18:3(9,12,15)), γ-리놀렌산(6,9,12-옥타데카트리엔산)(18:3(6,9,12)), 스테아리돈산(6,9,12,15-옥타데카테트라엔산)(18:4(6,9,12,15)), 아라키드산(이코산산)(20:0), (8,11-이코사디엔산)(20:2(8,11)), 미드산(5,8,11-이코사트리엔산)(20:3(5,8,11)), 디호모γ-리놀렌산(8,11,14-이코사트리엔산)(20:3(8,11,14)), 아라키돈산(5,8,11,14-이코사테트라엔산)(20:4(5,8,11,14)), 에이코사테트라엔산(5,11,14,17-이코사테트라엔산)(20:4(5,11,14,17)), 에이코사펜타엔산(5,8,11,14,17-이코사펜타엔산)(20:5(5,8,11,14,17)), 베헨산(도코산산)(22:0), (7,10,13,16-도코사테트라엔산)(22:4(7,10,13,16)), (4,7,13,16,19-도코사펜타엔산)(22:5(4,7,13,16,19)), (4,7,10,13,16-도코사펜타엔산)(22:5(4,7,10,13,16)), (4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산)(22:6(4,7,10,13,16,19)), 리그노세르산(테트라도코산산)(24:0), 네르본산(cis-15-테트라도코산산)(24:1), 세로트산(헥사도코산산)(26:0) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 상기 물질명은 IUPAC 생화학 명명법으로 정의된 관용명이며, 조직명, 및 탄소수와 이중 결합의 위치를 나타내는 수치를, 괄호 내에 기재했다.
본 발명의 지방산 조성물의 특징의 하나로서, 아라키돈산 함유율이 높은 것을 들 수 있다. 아라키돈산은, 화학식 C20H32O2로 표시되는, 분자량 304.47의 물질로, 4개의 이중 결합을 포함하는 20개의 탄소쇄로 이루어지는 카르복실산(〔20:4(n-6)〕)이며, (n-6)계에 분류된다. 아라키돈산은, 동물의 세포막 중의 중요한 인지질(특히 포스파티딜에탄올아민·포스파티딜콜린·포스파티딜이노시톨)로서 존재하고, 뇌에 많이 포함된다. 또한 아라키돈산은, 아라키돈산 캐스케이드에 의해 생성되는 프로스타글란딘·트롬복산·류코트리엔 등 일련의 에이코사노이드의 출발 물질이고, 세포 간의 신호 전달에 있어서의 세컨드 메신저로서도 중요하다. 한편, 아라키돈산은, 동물에서는 리놀레산을 원료로서 체내에서 합성된다. 그러나, 동물의 종 또는 연령 등에 따라서는, 이 기능이 충분하지 않기 때문에 필요한 양을 생산할 수 없거나, 또는 전혀 생산하는 기능이 없기 때문에, 음식물로부터 아라키돈산을 섭취해야 하므로, 아라키돈산은 필수 지방산이라고 할 수 있다.
본 발명의 지방산 조성물 중의 아라키돈산 함유율은, 예컨대 이하와 같이 측정할 수 있다. 즉, 본 발명의 LPAAT3 또는 4의 플라스미드를, 예컨대 실시예 9에 기재한 방법에 의해 pDuraSC나 pDura5MCS 등의 벡터에 삽입하고, M. 알피나주로 형질전환하여 얻어진 형질전환체를 발현시켜, 실시예 9에 기재한 배양 방법 등에 따라 얻어진 배양균체를 이용하여 균체 내의 지방산 함유율이나 배지 당의 아라키돈산의 함유량 등을 측정하는 방법이다. 아라키돈산의 함유량 등의 분석 방법으로서는, 예컨대 얻어진 배양균체의 지방산을 염산메탄올법에 의해 지방산 메틸에스테르에 유도한 후, 헥산으로 추출하여, 헥산을 유거하고 나서, 가스 크로마토그래피로 행하는 방법을 들 수 있다. 이에 따르면, 본 발명의 LPAAT3 또는 4를 M. 알피나로 형질전환시킨 경우는, 균체 내의 지방산 함유율도 배지 당의 아라키돈산 생산량도 높은 것이 나타나 있다. 이와 같이, 아라키돈산 함유율이 높은 본 발명의 지방산 조성물은, 아라키돈산을 효율적으로 섭취할 수 있기 때문에, 바람직하다.
본 발명의 지방산 조성물은, 상기한 지방산 중, 1 또는 그 이상의 지방산의 조합이면, 어떠한 수의 어떠한 종류의 지방산으로 이루어지는 조성물이라도 좋다.
이러한 본 발명의 지방산 조성물이 얻어진 것, 즉, 본 발명의 LPAAT3 또는 4가 발현된 것의 확인은, 공지의 일반적인 방법을 이용하여 행할 수 있다. 예컨대, 효모로 LPAAT를 발현시킨 경우는, 지방산 조성의 변화로서 확인할 수 있다. 즉, 상기 본 발명의 지방산 조성물의 제조 방법에 의해 얻어진 동결 건조한 균체에, 적당한 비율로 조정한 클로로포름:메탄올을 첨가하여 교반한 후, 적당한 시간, 가열 처리를 한다. 또한 원심 분리에 의해 균체를 분리하여, 용매를 회수하는 것을 수 회 반복한다. 그 후, 적당한 방법을 이용하여 지질을 건고시키고 나서, 클로로포름 등의 용매를 첨가하여 지질을 용해한다. 이 시료를 적당량 분취하여, 염산메탄올법에 의해 균체의 지방산을 메틸에스테르에 유도한 후에, 헥산으로 추출하여, 헥산을 유거하고 나서, 가스 크로마토그래피로 분석을 행한다.
그 결과, 상기한 지방산 조성을 갖는 지방산 조성물 및/또는 아라키돈산 함유율이 높은 지방산 조성물이 얻어진 경우는, 본 발명의 지방산 조성물이 얻어졌다고 판단할 수 있다. 또, 본 발명의 LPAAT는, 공지의 LPAAT 지방산 조성물의 지방산 조성과는 지방산 조성이 다르기 때문에, 본 발명의 LPAAT는 공지의 LPAAT와 기질 특이성이 다른 것이 나타난다.
본 발명의 지방산 조성물을 포함하는 식품 등
또한, 본 발명은, 상기 지방산 조성물을 포함하는 식품을 제공한다. 본 발명의 지방산 조성물은, 통상법에 따라, 예컨대 유지를 포함하는 식품, 공업 원료[화 장료, 의약(예컨대, 피부 외용약), 비누 등의 원료]의 제조 등의 용도에 사용할 수 있다. 화장료(조성물) 또는 의약(조성물)의 제형으로서는, 용액형, 페이스트형, 겔형, 고체형, 분말형 등 임의의 제형을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 식품의 형태로서는, 캡슐 등의 의약 제제의 형태, 또는 단백질, 당류, 지방, 미량 원소, 비타민류, 유화제, 향료 등에 본 발명의 지방산 조성물이 배합된 자연 유동식, 반소화 상태 영양식, 및 성분 영양식, 드링크제, 경장 영양제 등의 가공 형태를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 식품의 예로서는, 영양 보조 식품, 건강 식품, 기능성 식품, 유아용 식품, 유아용 조제유, 미숙아용 조제유, 노인용 식품 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 명세서에 있어서는, 식품이란, 고체, 유동체 및 액체, 및 이들의 혼합물로서, 섭식 가능한 것의 총칭을 말한다.
영양 보조 식품이란, 특정한 영양 성분이 강화되어 있는 식품을 말한다. 건강 식품이란, 건강적이거나 건강에 좋다고 하는 식품을 말하며, 영양 보조 식품, 자연 식품, 다이어트 식품 등이 포함된다. 기능성 식품이란, 몸의 조절 기능을 담당하는 영양 성분을 보급하기 위한 식품을 말하며, 특정 보건 용도 식품과 동일한 뜻이다. 유아용 식품이란, 약 6세까지의 아이에게 주기 위한 식품을 말한다. 노인용 식품이란, 무처리의 식품과 비교하여 소화 및 흡수가 용이하도록 처리된 식품을 말한다. 유아용 조제유란, 약 1세까지의 아이에게 주기 위한 조제유을 말한다. 미숙아용 조제유란, 미숙아가 생후 약 6개월이 될 때까지 주기 위한 조제유를 말한다.
이들 식품으로서는, 고기, 생선, 견과류 등의 천연 식품(유지로 처리한 것); 중화 요리, 라면, 스프 등의 조리시에 유지를 첨가하는 식품; 튀김, 프라이, 유부, 볶음밥, 도넛, 카린토(karinto, 일본식 튀김 과자) 등의 열 매체로서 유지를 이용한 식품; 버터, 마가린, 마요네즈, 드레싱, 초콜릿, 즉석 라면, 카라멜, 비스킷, 쿠키, 케이크, 아이스크림 등의 유지 식품 또는 가공시에 유지를 첨가한 가공 식품; 쌀과자, 하드 비스킷, 팥앙금빵 등의 가공 마무리시에 유지를 분무 또는 도포한 식품 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 식품은, 유지를 포함하는 식품에 한정되는 것은 아니고, 예컨대 빵, 국수류, 밥, 과자류[캔디, 츄잉 껌, 구미(gummies), 정과(錠菓), 일본식 과자], 두부 및 그 가공품 등의 농산 식품; 청주, 약용주, 미림, 식초, 간장, 된장 등의 발효 식품; 요구르트, 햄, 베이컨, 소시지 등의 축산 식품; 어묵, 아게텐(ageten, 일본 튀김 요리), 한펜(hanpen, 생선을 갈아 찐 것) 등의 수산 식품; 과즙 음료, 청량 음료, 스포츠 음료, 알콜 음료, 차 등을 들 수 있다.
본 발명의 LPAAT를 코딩하는 핵산 또는 LPAAT 단백질을 이용한 균주의 평가·선택 방법
본 발명은 또한, 본 발명의 LPAAT를 코딩하는 핵산 또는 LPAAT 단백질을 이용하여, 지질 생산균의 평가나 선택을 행하는 방법을 제공한다. 구체적으로는 이하와 같다.
(1) 평가 방법
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 LPAAT를 코딩하는 핵산 또는 LPAAT 단백 질을 이용하여, 지질 생산균의 평가를 행하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 상기 평가 방법으로서는, 우선, 본 발명의 염기 서열에 기초하여 설계한 프라이머 또는 프로브를 이용하여, 피검 균주인 지질 산생 균주의 본 발명의 상기 활성에 대해 평가하는 방법을 들 수 있다. 이러한 평가 방법의 일반적 수법은 공지이며, 예컨대 국제 특허 출원 공보 제WO01/040514호, 일본 특허 공개 평성 제8-205900호 공보 등에 기재되어 있다. 이하, 이 평가 방법에 대해 간단히 설명한다.
우선, 피검 균주의 게놈을 조제한다. 조제 방법은, 헤리퍼드법(hereford method)이나 초산칼륨법 등, 어떠한 공지의 방법도 이용할 수 있다(예컨대, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990) 참조).
본 발명의 염기 서열, 바람직하게는, 서열 번호 36 또는 37에 기초하여 프라이머 또는 프로브를 설계한다. 상기 프라이머 또는 프로브는 본 발명의 염기 서열의 어떤 부분도 이용할 수 있고, 또한 그 설계는 공지의 수법을 이용하여 행할 수 있다. 프라이머로서 이용하는 폴리뉴클레오티드의 염기 수는, 통상, 10 염기 이상이고, 15∼25 염기인 것이 바람직하다. 또한, 끼워넣는 부분의 염기 수는, 통상, 300∼2000 염기가 적당하다.
상기에서 제작한 프라이머 또는 프로브를 이용하여, 상기 피검 균주의 게놈 중에 본 발명의 염기 서열과 특이적인 서열이 존재하는지 여부를 조사한다. 본 발명의 염기 서열과 특이적인 서열의 검출은, 공지의 수법을 이용하여 행할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 염기 서열에 특이적 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리뉴 클레오티드 또는 상기 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 하나의 프라이머로서 이용하고, 다른 한 쪽의 프라이머로서 이 서열보다 상류 또는 하류의 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 이용하며, 예컨대 PCR법 등에 의해 피검 균주의 핵산을 증폭하여, 증폭물의 유무, 증폭물의 분자량의 크기 등을 측정할 수 있다.
본 발명의 방법에 알맞는 PCR법의 반응 조건은, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 이하의 조건을 들 수 있다.
변성 온도: 90∼95℃
어닐링 온도: 40∼60℃
신장 온도: 60∼75℃,
사이클 수: 10회 이상
등의 조건이다. 얻어진 반응 생성물인 증폭 산물을, 아가로스겔 등을 이용한 전기 영동법 등에 의해 분리하여, 증폭 산물의 분자량을 측정할 수 있다. 이에 따라, 증폭 산물의 분자량이 본 발명의 염기 서열과 특이적인 영역에 상당하는 핵산 분자를 포함하는 크기인지 여부를 확인함으로써, 피검 균주의 본 발명의 상기 활성을 예측 또는 평가할 수 있다. 또한, 상기 증폭 산물의 염기 서열을 상기 방법 등으로 해석함으로써, 본 발명의 상기 활성을 보다 더 정확히 예측 또는 평가할 수 있다. 또, 본 발명의 상기 활성의 평가 방법은, 상기한 바와 같다.
또한, 본 발명의 상기 평가 방법으로서는, 피검 균주를 배양하고, 서열 번호 36 또는 37 등의 본 발명의 염기 서열이 코딩하는 LPAAT의 발현량을 측정함으로써, 피검 균주의 본 발명의 상기 활성을 평가할 수도 있다. 또, LPAAT의 발현량은, 피검 균주를 적당한 조건으로 배양하고, LPAAT의 mRNA 또는 단백질을 정량함으로써 측정할 수 있다. mRNA 또는 단백질의 정량은, 공지의 수법을 이용하여 행할 수 있다. mRNA의 정량은, 예컨대 노던 하이브리다이제이션이나 정량적 RT-PCR에 의해, 단백질의 정량은, 예컨대 웨스턴 블로팅에 의해 행할 수 있다(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003). 또한, 상기 활성의 평가 방법으로서, 본 발명의 LPAAT가 산생하는 지방산 조성물의 조성 및/또는 아라키돈산 함유율을 측정하는 방법을 들 수도 있다. 지방산 조성물의 조성 및/또는 아라키돈산 함유율의 측정 방법은 상기한 바와 같다.
(2) 선택 방법
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명의 LPAAT를 코딩하는 핵산 또는 LPAAT 단백질을 이용하여, 지질 생산균의 선택을 행하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 상기 선택 방법으로서는, 피검 균주를 배양하고, 서열 번호 36 또는 37 등의 본 발명의 염기 서열이 코딩하는 LPAAT의 발현량을 측정하여, 목적으로 하는 발현량의 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 균주를 선택할 수 있다. 또한, 기준이 되는 균주를 설정하고, 이 기준 균주와 피검 균주를 각각 배양하며, 각 균주의 상기 발현량을 측정하고, 기준 균주와 피검 균주의 발현량을 비교하여, 원하는 균주를 선택할 수도 있다. 구체적으로는, 예컨대 기준 균주 및 피검 균주를 적당한 조건으로 배양하고, 각 균주의 발현량을 측정하여, 기준 균주보다 피검 균주 쪽이 고발 현, 또는 저발현인 피검 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 균주를 선택할 수 있다. 원하는 활성에는, 상기한 바와 같이, LPAAT의 발현량 및/또는 LPAAT가 산생하는 지방산 조성물의 조성 및/또는 아라키돈산 함유율을 측정하는 방법을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 선택 방법으로서는, 피검 균주를 배양하여, 본 발명의 상기 활성이 높거나 또는 낮은 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 피검 균주를 선택할 수도 있다. 원하는 활성에는, 상기한 바와 같이, LPAAT의 발현량 및/또는 LPAAT가 산생하는 지방산 조성물의 조성 및/또는 아라키돈산 함유율을 측정하는 방법을 들 수 있다.
피검 균주 또는 기준 균주로서는, 예컨대 상기한 본 발명의 벡터를 도입한 균주, 상기 본 발명의 핵산의 발현이 억제된 균주, 돌연변이 처리가 실시된 균주, 자연 변이된 균주 등을 이용할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 본 발명의 LPAAT 활성 및 LPAAT의 지방산 조성물을 형성할 수 있는 활성 및 본 발명의 세포 내 아라키돈산 함유율을 높이는 활성은, 예컨대 본 명세서 중의 「본 발명의 리소포스파티드산 아실기 전이 효소를 코딩하는 핵산」, 「본 발명의 지방산 조성물」의 항목에서 기재한 방법에 의해 측정하는 것이 가능하다. 돌연변이 처리로서는, 예컨대 자외선 조사나 방사선 조사 등의 물리적 방법, EMS(에틸메탄술포네이트), N-메틸-N-니트로소구아니딘 등의 약제 처리에 의한 화학적 방법 등을 들 수 있지만(예컨대, 오시마 야스지 편저, 생물 화학 실험법 39 효모 분자 유전학 실험법, p.67-75, 학회 출판 센터 등 참조), 이들에 한정되지 않는다.
또, 본 발명의 기준 균주, 피검 균주로서 이용하는 균주로서는, 상기한 지질 생산균 또는 효모 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 구체적으로는, 기준 균주, 피검 균주는, 다른 속이나 종에 속하는 어떠한 균주를 조합하여 이용하더라도 좋고, 피검 균주는 1 또는 그 이상의 균주를 동시에 이용하더라도 좋다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 실시예에 한정되는 것이 아니다.
실시예 1
(1) EST 해석
M. alpina 1S-4주를 100 ml의 배지(1.8% 글루코오스, 1% 효모 엑기스, pH 6.0)에 식균하고, 3일간 28℃에서 전배양했다. 10 L 배양조(Able Co., 도쿄)에 5 L의 배지(1.8% 글루코오스, 1% 대두분, 0.1% 올리브유, 0.01% 아데카놀, 0.3% KH2PO4, 0.1% Na2SO4, 0.05% CaCl2·2H2O, 0.05% MgCl2·6H2O, pH 6.0)를 넣고, 전배양물을 전량 식균하여, 300 rpm, 1 vvm, 26℃의 조건으로 8일간 통기 교반 배양했다. 배양 1, 2 및 3일째에 각각 2%, 2% 및 1.5% 상당의 글루코오스를 첨가했다. 배양 1, 2, 3, 6 및 8일째의 각 스테이지에 균체를 회수하고, 염산 구아니딘/CsCl법으로 total RNA를 조제했다. Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(다카라바이오)를 이용하여, total RNA로부터 poly(A)+RNA의 정제를 행했다. 각 스테이지의 cDNA 라이브러리를, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)를 이용하여 제작하고, cDNA의 5'측으로부터의 원 패스 시퀀스 해석(8000 클론×5 스테이지) 을 행했다. 얻어진 서열을 클러스터링했다. 그 결과, 약 5000의 서열을 얻었다.
(2) LPAAT 유전자 호몰로그의 탐색
EST 해석으로 얻어진 염기 서열을 GENEBANK에 등록되어 있는 아미노산 서열에 대하여 상동성 검색 프로그램인 BLASTX로 검색하여, LPAAT 유전자의 호몰로그를 추출했다. 그 결과, 4개의 LPAAT의 호몰로그의 서열(서열 번호 1, 5, 6 및 7)을 발견했다.
상기 검색으로 각각의 서열이 가장 높은 동일성을 나타낸 단백질은 다음과 같다.
서열 번호 5는 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 유래의 1-아실-sn-글리세롤-3-인산아실 전이 효소와 같은 추정 단백질(GB accession No.EAA28956)과;
서열 번호 6은 서양 유채씨(Brassica napus) 유래의 1-아실-sn-글리세롤-3-인산 아실 전이 효소와 같은 추정 단백질(GB accession No.T07936)과;
서열 번호 1은 에머리셀라 니듈란스(Emericella nidulans) 유래의 1-아실-sn-글리세롤-3-인산 아실 전이 효소와 같은 단백질 AtaAp(GB accession No.AAD37345)와;
서열 번호 7은 S. 세레비지애(S. cerevisiae) 유래의 1-아실-sn-글리세롤-3-인산 아실 전이 효소 단백질인 Slc1p(GB accession No.CAA98614)와, 각각 가장 동일성이 높았다.
국제 특허 출원 공보 제WO2004/087902호와 미국 특허 출원 제US2006/0094090호 공보의 명세서 중에 기재되어 있는 M. 알피나의 LPAAT 호몰로그의 서열과 상기 에서 얻어진 서열을 비교하면, 서열 번호 5는 LPAAT1 호몰로그의 부분 서열, 서열 번호 6은 LPAAT2 호몰로그의 부분 서열이었다.
그래서, 서열 번호 5에 따른 유전자를 LPAAT1 유전자, 서열 번호 6에 따른 유전자를 LPAAT2 유전자, 서열 번호 1에 따른 유전자를 LPAAT3 유전자, 서열 번호 7에 따른 유전자를 LPAAT4 유전자로 했다.
상기한 서열에 대해, 유래하는 라이브러리와 그 EST는 표 2와 같다. 또, 표 2에는 몇 일째의 배양으로 얻어진 cDNA 라이브러리 유래의 클론인지를 나타내고 있다.
[표 2]
유래하는 라이브러리
유전자 서열 번호 1일째 2일째 3일째 6일째 8일째
LPAAT 1 서열 번호 5 1 1 3
LPAAT 2 서열 번호 6 1
LPAAT 3 서열 번호 1 1 3 1
LPAAT 4 서열 번호 7 7
실시예 2
(1) LPAAT 호몰로그의 클로닝
서열 번호 1에는 990bp로 이루어지는 CDS(서열 번호 8)가 포함되어 있고, LPAAT3 유전자의 전체 길이를 코딩하고 있는 서열이라고 생각되었다. 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질(LPAAT3p)의 추정 아미노산 서열을 서열 번호 2에 나타냈다. 이 ORF 서열을 포함하는 DNA를 PCR로 증폭하기 위해 이하의 프라이머를 제작했다.
프라이머 I-1:GGATGTCATCAATGTCATCAATAGAG(서열 번호 9)
프라이머 I-2:CTAACCCCCTCTTCCTCCACCAC(서열 번호 10)
3일째 cDNA 라이브러리를 주형으로 해서, 프라이머 I-1과 I-2에 의해, ExTaq(다카라바이오)를 이용하여 PCR을 행했다. PCR의 조건은, 94℃ 2분 후, 94℃ 1분, 54℃ 1분, 72℃ 2분을 1사이클로서 30사이클 행했다.
증폭된 단편을 TOPO-TA cloning Kit(INVITROGEN CORPORATION)를 이용하여 TA-클로닝을 행했다. 몇 개의 클론의 염기 서열을 확인하고, 이 유전자의 옳은 염기 서열을 포함한다고 생각되는 클론을 pCR-LPAAT3로 했다.
서열 번호 5, 6 및 7에는, LPAAT 호몰로그를 코딩한다고 생각되는 CDS가 존재하지 않았기 때문에, 이들 유전자의 전체 길이를 코딩하는 cDNA를 클론화하기 위해 각각의 서열에 기초하여, 이하와 같이 프라이머를 제작했다.
서열 번호 5에 기초하여 설계한 프라이머:
프라이머 955-1:GGACGTGTCAAGGAAAAGGA(서열 번호 11)
프라이머 955-2:TCCTTCAGATGAGCCTCCTG(서열 번호 12)
서열 번호 6에 기초하여 설계한 프라이머:
프라이머 A-1:ggcgtccttctccacgtacttc(서열 번호 13)
프라이머 A-2:gtgaaatacattccattctacg(서열 번호 14)
서열 번호 7에 기초하여 설계한 프라이머:
프라이머 B-1:CCTCGCAAAATGTATCGTGG(서열 번호 15)
프라이머 B-2:GATGGGAAGTTGAGCTTGAATG(서열 번호 16)
이들 프라이머를 이용하고, 각각 서열 번호 5, 6 및 7을 구성하는 EST를 포함하는 cDNA 라이브러리를 주형으로 해서, ExTaq(다카라바이오)를 이용하여 PCR 반 응을 행했다. 얻어진 DNA 단편을 TOPO-TA cloning Kit(INVITROGEN CORPORATION)를 이용하여 TA-클로닝을 행하여, 각각의 인서트 부분의 염기 서열을 결정했다.
그 결과, 서열 번호 5의 제20번째로부터 518번째, 서열 번호 6의 제116번째로부터 제616번째, 서열 번호 7의 제159번째로부터 제687번째의 염기 서열을 포함하는 DNA 단편이 각각 클론화된 것을 확인하고, 이들 플라스미드를 각각 pCR-955-P, pCR-A-P 및 pCR-B-P로 했다. 다음에, 이들 플라스미드를 각각 주형으로 해서, 상기 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 행했다. 반응에는, ExTaq(다카라바이오)를 이용했지만, 첨부의 dNTP 믹스 대신에 PCR 라벨링 믹스(로슈 진단사)를 이용하고, 증폭되는 DNA를 다이곡시제닌(DIG) 라벨하여, cDNA 라이브러리를 스크리닝에 이용하는 프로브를 제작했다. 이 프로브를 이용하여, EST 해석으로 각각의 서열을 구성하는 EST를 얻은 cDNA 라이브러리를 스크리닝했다.
하이브리다이제이션의 조건은, 다음과 같다.
버퍼: 5×SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 50% 포름아미드;
온도: 42℃(하룻밤);
세정 조건: 0.2×SSC, 0.1% SDS 용액 중(65℃)에서 20분간×3회 ;
검출은, DIG 핵산 검출 키트(로슈 진단사)를 이용하여 행했다. 스크리닝에 의해 얻어진 파지(phage) 클론으로부터, in vivo 제거(excision)에 의해, 플라스미드를 추출하여, 각 플라스미드 DNA를 얻었다.
서열 번호 5를 포함하는 cDNA를 스크리닝하여 얻어진 클론의 인서트의 염기 서열을 서열 번호 17에 나타낸다. 서열 번호 17에는, 제36번째로부터 제1289번째까 지의 1254bp로 이루어지는 CDS가 포함되어 있어, LPAAT1 호몰로그의 전체 길이를 코딩하고 있는 서열이 얻어졌다고 생각되었다. 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 추정 아미노산 서열을 서열 번호 18에 나타냈다. 서열 번호 17을 포함하는 플라스미드를 pB-LPAAT1로 했다.
서열 번호 6을 포함하는 cDNA를 스크리닝하여 얻어진, 인서트의 길이가 가장 긴 클론의 인서트의 염기 서열을 서열 번호 19에 나타낸다. 서열 번호 19에는, 제26번째로부터 제949번째까지의 924bp로 이루어지는 CDS가 포함되어 있어, LPAAT2 호몰로그의 전체 길이를 코딩하고 있는 서열이 얻어졌다고 생각되었다. 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 추정 아미노산 서열을 서열 번호 20에 나타냈다. 서열 번호 19를 포함하는 플라스미드를 pB-LPAAT2로 했다.
서열 번호 7을 포함하는 cDNA를 스크리닝하여 얻어진 클론 중, 인서트 길이가 가장 긴 클론의 염기 서열을 결정한 바, 서열 번호 1의 제103번째로부터 제1148번째의 염기 서열이 포함되어 있었다. 이것은 먼저 얻어진 서열 번호 7과 공통된 서열을 포함하고 있었기 때문에, 이들을 조합하면 서열 번호 3에 나타내는 서열이 얻어졌다. 서열 번호 3에는 서열 번호 23에 나타내는 942bp로 이루어지는 CDS가 존재하여, LPAAT 호몰로그의 전체 길이를 코딩하고 있는 서열이 얻어졌다고 생각되었다. 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질(LPAAT4p)의 추정 아미노산 서열을 서열 번호 4에 나타냈다. 이 영역을 포함하는 DNA를 PCR에 의해 증폭하기 위해 이하의 프라이머를 제작했다.
B-3:CAYGYCCATAGGCTCTTCTAATCC(서열 번호 21)
B-4:GTTTTACTCTTTCAGTGTCCTCC(서열 번호 22)
3일째의 균체로부터 조제한 cDNA를 주형으로 해서, 프라이머 B-3과 B-4에 의해, ExTaq(다카라바이오)를 이용하여 PCR을 행했다. 증폭된 단편을 pCR2.1-TOPO에 TA-클로닝하고 염기 서열을 확인하여, 이 유전자의 옳은 염기 서열을 포함하면 클론을 pCR-LPAAT4로 했다.
(2) 서열 해석
상기한 바와 같이 하여 얻어진 M. 알피나 유래의 LPAAT 호몰로그의 cDNA 서열을 GENEBANK에 등록되어 있는 아미노산 서열에 대하여 BLASTX를 이용하여 상동성 해석을 행했다. 그 결과, 각 서열에 대하여 가장 E-value가 낮은, 즉 동일성이 높은 아미노산 서열은 이하와 같았다. 각 서열의 ORF와, 가장 동일성이 높은 서열에 따른 염기 서열의 동일성, 및 아미노산 서열의 동일성을 clustalW로 구하고, 이하에 합쳐서 기재했다.
서열 번호 17은, 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans) 유래의 1-아실-sn-글리세롤-3-인산 아실 전이 효소와 같은 추정 단백질(GB accession No.EAA60126)의 해당하는 부분만을 비교한 경우, 염기 서열로 51%, 아미노산 서열로 32.1%였다.
서열 번호 19는, 마그나포르테 그리시아(Magnaporthe grisea) 유래의 1-아실-sn-글리세롤-3-인산 아실 전이 효소와 같은 추정 단백질(GB accession No.EAA48685)의 해당하는 부분만을 비교한 경우, 염기 서열로 53%, 아미노산 서열로 31%였다.
서열 번호 1 및 3은, 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis) 유래의 1-아실-sn-글리세롤-3-인산 아실 전이 효소와 같은 추정 단백질(GB accession No.EAK87199)의 해당하는 부분만을 비교한 경우, 서열 번호 1의 염기 서열로 49%, 아미노산 서열로 37%; 서열 번호 3의 염기 서열로 51%, 아미노산 서열로 36%였다.
또한, 서열 번호 17과 서열 번호 19에 대해서는, 각각 M. 알피나 유래의 기지의 LPAAT 호몰로그인 LPAAT1 유전자(WO2004/087902)와 LPAAT2 유전자(US2006/0094090) 및 이들이 코딩하는 추정 아미노산 서열로 비교했다. 상기 문헌에 개시되어 있는 서열과 M. alpina 1S-4주로부터 취득한 서열을 각각의 해당하는 영역에서 비교하면, LPAAT1은 염기 서열로 89%, 아미노산 서열로 91%의 동일성, LPAAT2는 염기 서열로 92%, 아미노산 서열로 98%의 동일성인 것이 확인되었다.
한편, 서열 번호 1∼4는, 기지의 염기 서열 및 아미노산 서열과 비교하더라도 동일성이 현저하게 높은 것은 아니며, M. 알피나 유래의 신규 LPAAT 유전자인 것이라고 생각되었다. 각각의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열을 도 2 및 도 3에 나타낸다. LPAAT3와 LPAAT4의 ORF 부분의 DNA 서열을 비교하면 동일성은 67%(도 4)이고, 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질 LPAAT3p와 LPAAT4p의 추정 아미노산 서열을 비교하면 동일성은 69%(도 5)였다.
LPAAT3p 및 LPAAT4p의 추정 아미노산 서열을 기지의 아미노산 서열과 비교했다(도 6). 도의 하선으로 나타낸 바와 같이 LPAAT3p 및 LPAAT4p도, 이들의 LPAAT 단백질 또는 그 호몰로그와 마찬가지로, 글리세로인지질 아실기 전이 효 소(Glycerolipid acyltransferase)의 보존 서열 HX4D(J. Bacteriology, 180, 1425-1430, 1998)가 보존되어 있었다.
여기서, 도 6의 아미노산 중, gi_46101966으로 표시되는 아미노산 서열(서열 번호 40)은 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis) 521(GB accession No.EAK87199)유래이고, gi_5002178로 표시되는 아미노산 서열(서열 번호 41)은 에머리셀라 니듈란스(Emericella nidulans) 유래(GB accession No. AAD37345)이며, gi_6320151로 표시되는 아미노산 서열(서열 번호 42)은, 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae) 유래(GB accession No. NP_010231)이고, gi_19115517로 표시되는 아미노산 서열(서열 번호 43)은 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 972h-유래(GB accession No. NP_594605)이며, gi_17564032로 표시되는 아미노산 서열(서열 번호 44)은 캐노하디티스 엘레강스(Caenorhabditis elegans) 유래(GB accession No. NP_505578)이다.
실시예 3
LPAAT 활성의 측정
(1) Δslc1:URA3주의 육종
효모의 LPAAT 활성을 담당하는 유전자로서 알려진 SLC1의 CDS를 취득하기 위해 이하의 프라이머를 제작했다.
프라이머 SLC1-1 ggtgaagggggaattcttc(서열 번호 45)
프라이머 SLC1-2 atgtcgacgtggcttaatgcatc(서열 번호 46)
사카로마이세스 세레비지아 S288C주의 게놈 DNA를 취득하기 위해, YPD 배지 10 ml에 식균하고, 30℃로 1일 진탕 배양했다. 배양액 1.5 ml로부터, Dr. GenTEL(효모용)(다카라바이오)을 이용하여, DNA를 추출했다. 이것을 주형으로 해서, 프라이머 SLC1-1과 SLC1-2를 이용하여 PCR 반응에 의해, SLC1의 CDS를 증폭했다. 얻어진 PCR 산물을, 제한 효소 EcoRI과 SalI로 소화하고, 벡터 pUC18의 EcoRI-SalI 사이트에 삽입한 후, 염기 서열을 확인하여, 플라스미드 pUC-SLC1을 얻었다. 계속해서, 플라스미드 pUC-SLC1을 제한 효소 SalI로 소화한 후, 말단을 평활화하며, 셀프 라이게이션(self-ligation)함으로써, 플라스미드 pUC-SLC1-2를 얻었다.
SLC1 유전자의 결실주를 이하와 같이 제작했다. 플라스미드 pURA34(일본 특허 공개 제2001-120276호 공보)를 제한 효소 HindIII로 소화하고, 말단을 평활화하여 얻어진 약 1.2 kb의 DNA 단편과, 플라스미드 pUC-SLC1-2를 제한 효소 EcoRV와 HincII로 소화하여 얻어진 약 3.1 kb의 DNA 단편을 연결하여, 플라스미드 pUCΔ slc1:URA3를 구축했다. 사카로마이세스 세레비지아 YPH499주(STRATAGENE)를, 플라스미드 pUCΔslc1:URA3를 제한 효소 EcoRI와 HindIII로 소화한 DNA 단편으로 형질전환했다. 형질전환주는, SC-Ura[1 L당, Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 류신 1.8 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 트립토판 1.2 g을 혼합한 것) 1.3 g] 한천 배지(2% 아가)에 생육할 수 있는 것으로서 선발했다. 얻어진 형질전환주 중, 임의의 1주를 Δslc1:URA3-1주 로 했다.
(2) Δslc1:URA3주로의 LPAAT 유전자의 도입
ScSLC1 발현용 벡터를 구축하기 위해, pUC-SLC1을 제한 효소 EcoRI와 SalI로 소화하여 얻어진 0.9 kb의 DNA 단편을, 벡터 pYE22m의 EcoRI-SalI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pYE-ScSLC1을 구축했다.
Δslc1:URA3-1주를, 플라스미드 pYE22m, pYELPAAT3, pYELPAAT4, pYESLC1으로 각각 형질전환했다. 형질전환주는, SC-Trp, Ura[1 L당, Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 류신 1.8 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g을 혼합한 것) 1.3 g] 한천 배지(2% 아가)에 생육할 수 있는 것으로서 선발했다.
각각의 플라스미드로부터 얻어진 형질전환주의 임의의 주를, C-3주, LPAAT2-3주, LPAAT3-3주, SLC1-3주로 했다.
(3) 마이크로솜 분획의 조제
C-3주, LPAAT3-3주, LPAAT4-3주, SLC1-3주를, 각각 SC-Trp, Ura 액체 배지 10 ml, 30℃에서 1일간, 진탕 배양했다. 이 배양액 중, 1 ml를 SC-Trp, Ura 액체 배지 100 ml에 식균하여, 28℃에서 1일간 배양했다. 균체를 원심 분리에 의해 모으고, 1/2의 양의 멸균수로 세정한 후, 5 ml의 버퍼 B[0.6 M 소르비톨, 5 mM 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES), 1 mM KCl, 0.5 mM 에틸렌디아민사초산(EDTA), 1 mM 페 닐메틸술포닐(PMSF), pH 6.0]에 현탁했다. 프렌치 프레스를 이용하여 16 kPa로 균체를 파쇄하고, 20000×g, 1시간, 4℃로 원심 분리하여 얻어진 상청을, 100000×g, 1시간, 4℃로 더 원심 분리하며, 얻어진 침전물을 버퍼 B에 용해하여, 마이크로솜 분획을 조정했다. 각 샘플에 포함되는 단백질 농도는 프로테인 분석 CBB 용액(나카라이테스크)을 이용하여 정량했다.
(4) LPAAT 활성의 측정
LPAAT 활성은, 이하와 같이 측정했다. 반응액은, 100 ㎍ 1-올레오일-2-히드록시-sn-글리세로-3-인산(LPA-18:1), 50 ㎍ 리놀레오일 코엔자임 A(18:2-CoA), 0.5 mM 디티오스레이톨(dithiothreitol)(DTT), 0.5 mg 소 혈청 알부민(BSA), 2 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl 버퍼 pH 7.5, 100 ㎕ 마이크로솜 분획, 전량을 500 ㎕로 했다. 28℃에서 10분간 반응시키고, 클로로포름:메탄올=1:2를 1875 ㎕ 첨가하여 반응을 정지했다. 내부 표준으로서, 1,2-디헵타데카노일-sn-글리세로-인산을 20 ㎍ 첨가했다. Bligh & Dyer 등의 방법에 따라 지질을 추출하고, 전량을 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 분획했다. TLC에는, 실리카 겔 60 플레이트(머크)를 이용하고, 전개 용매는 클로로포름:메탄올:초산:물=170:25:25:4로 했다. PA 분획을 긁어모으고, 1 ml의 디클로로메탄과 2 ml의 10% 염산메탄올을 첨가하며, 지방산을 염산메탄올법에 의해 메틸에스테르에 유도한 후, 헥산으로 추출하여, 헥산을 유거하고, 가스 크로마토그래피에 의해 분석을 행하여, 이 분획에 포함되는 리놀레산량을 정량했다. 상기 반응에 의해 PA 분획 중의 리놀레산의 효소액의 단백질 당의 값을 표에 나타냈다.
[표 3]
PA 분획 중 리놀레산 효소액의 단백질 당 값(LPAAT 활성)
샘플명 C-2 LPAAT3-3 LPAAT4-3 SLC1-3
18:2 ㎍/㎎-단백질 0.20 1.04 10.51 2.99
이와 같이, LPAAT3, LPAAT4, SLC1을 발현시킨 주에서는, 상기 반응에 있어서 PA 분획에 받아들이는 리놀레산(18:2) 양이 증가하고 있어, LPAAT3 및 LPAAT4는, LPAAT 활성을 갖는 것이 나타났다.
실시예 4
효모 발현 벡터의 구축
LPAAT1, LPAAT2, LPAAT3 및 LPAAT4를 효모로 발현시키기 위해, 이하와 같이 효모 발현용 벡터를 구축했다.
LPAAT1을 효모로 발현시키기 위해, 이하와 같이 효모 발현 벡터를 구축했다. 즉, 플라스미드 pB-LPAAT1을 주형으로 해서, 이하의 프라이머 LPAAT1-6F(서열 번호 38)와 LPAAT1-R1(서열 번호 39)을 이용하여 ExTaq(다카라바이오)에 의해, PCR 반응을 행했다.
LPAAT1-6F:TCTGAGATGGATGAATCCACCACCACCAC(서열 번호 38)
LPAAT1-R1:GTCGACTCAACCAGACGATACTTGCTGCAGAG(서열 번호 39)
얻어진 DNA 단편에 대해, TOPO-TA cloning Kit(INVITROGEN)를 이용하여, TA-클로닝을 행하고, 인서트 부분의 염기 서열을 확인하여, 옳은 염기 서열을 갖는 플라스미드를 pCR-LPAAT1으로 했다. 이 플라스미드를 제한 효소 EcoRI와 SalI로 소화 하여 얻어진 약 1.3 kb의 DNA 단편을, 효모 발현용 벡터 pYE22m의 EcoRI-SalI 부위에 삽입하여, 플라스미드 pYE-MALPAAT1을 구축했다.
LPAAT2를 효모로 발현시키기 위해, 이하와 같이 효모 발현 벡터를 구축했다. 즉, 플라스미드 pB-LPAAT2를 제한 효소 KpnI로 소화한 후, 알칼리포스파타제 처리함으로써 말단을 평활화하고, 계속해서 제한 효소 BamHI로 소화하여 얻어지는 DNA 단편을, 제한 효소 SalI로 소화한 후 말단을 평활화하며 계속해서 제한 효소 BamHI로 소화한 효모용 발현 벡터 pYE22m에 삽입하여, 플라스미드 pYE-MALPAAT2로 했다.
LPAAT3 및 4를 효모로 발현시키기 위해, 이하와 같이 효모 발현 벡터를 구축했다. 즉, 플라스미드 pCR-LPAAT3 또는 플라스미드 pCR-LPAAT4를 제한 효소 EcoRI로 소화하고, 인서트 부분을 추출하여, 효모용 발현 벡터 pYE22m의 EcoRI 부위에 연결했다. 삽입한 DNA 단편의 방향을 확인하여, pYE22m의 GAPDH 프로모터로부터 ORF가 전사되는 방향에 삽입된 것을 각각 pYE-MALPAAT3 및 pYE-MALPAAT4로 했다.
실시예 5
효모의 형질전환
플라스미드 pYE22m, pYE-MALPAAT1, pYE-MALPAAT2, pYE-MALPAAT3 또는 pYE-MALPAAT4를 이용하여 초산리튬법에 의해, 효모 사카로마이세스 세레비지아 EH13-15주(trp1, MATα)(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)로 형질전환했다. 형질전환주는, SC-Trp[1 L당, Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 류신 1.8 g, 리신 0.9 g, 메 티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 우라실 0.6 g을 혼합한 것) 1.3 g] 한천 배지(2% 아가) 상에서 생육하는 것으로서 선발했다.
실시예 6
효모의 배양
각각의 벡터에서의 형질전환주 중 임의의 2주씩(c-1주, c-2주, LPAAT1-1주, LPAAT1-2주, LPAAT2-1주, LPAAT2-2주, LPAAT3-1주, LPAAT3-2주 및 LPAAT4-1주, LPAAT4-2주)을 선택하여, 이하의 조건으로 배양했다.
즉, 전배양으로서, SC-Trp 배지 10 ml에 효모를 플레이트로부터 1 백금귀(白金耳, 루프형 식균 도구) 식균하고, 30℃에서 2일간 진탕 배양을 행했다. 본 배양은, YPD5(효모 엑기스 2%, 폴리펩톤 1%, 글루코오스 5%) 배지 10 ml에 전배양액을 500 ㎕ 첨가하고, 30℃에서 2일간 진탕 배양을 행했다.
실시예 7
효모의 지방산 분석
효모의 배양액을 원심 분리함으로써, 균체를 회수했다. 10 ml의 멸균수로 세정하고, 원심 분리에 의해 다시 균체를 회수하여, 동결 건조했다. 동결 건조 균체에 클로로포름:메탄올(2:1)을 4 ml 첨가하고, 강하게 교반한 후, 70℃에서 1시간 처리했다. 원심 분리에 의해 균체를 분리하고, 용매를 회수했다. 남은 균체에 재차 클로로포름:메탄올(2:1)을 4 ml 첨가하고, 마찬가지로 용매를 회수했다. 스피드 백(SpeedVac)으로 지질을 건고한 후, 2 ml의 클로로포름을 첨가하여 지질을 용해했 다. 이 시료 중, 200 ㎕을 분취하고, 염산메탄올법에 의해 균체의 지방산을 메틸에스테르로 유도한 후, 헥산으로 추출하여, 헥산을 유거하며, 가스 크로마토그래피에 의해 분석을 행했다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
[표 4]
형질전환주의 지방산 조성(숙주 EH13-15)
Figure 112009066869075-PCT00001
M. 알피나 유래의 4개의 LPAAT 호몰로그를 도입한 효모와, 대조군의 효모의 지방산 조성을 비교했다. LPAAT2를 도입한 효모의 지방산 조성은 대조군주와 비교해서 약간 올레산의 비율이 증가하지만, 거의 차이는 없었다. 또한, LPAAT1을 도입한 효모의 지방산 조성은, 팔미트산의 비율이 대조군주에 비해 상승하는 한편, 팔미톨레산 함량의 비율은 감소했다. 따라서, 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율은 대조군주에 비해 낮아졌다. 스테아르산 및 올레산의 비율은 대조군주와 동일한 정도였다.
한편, LPAAT3 또는 LPAAT4를 도입한 효모에서는 올레산의 비율이 대조군주에 비해 1할 이상 상승했다. 한편, 팔미톨레산, 팔미트산의 비율은 모두 감소하고 있 었다. 팔미트산에 대한 팔미톨레산의 비는, 대조군주에 비해 높아졌다.
이상의 결과로부터, M. 알피나 유래의 4개의 LPAAT 호몰로그는, 그 기질의 아실기의 특이성이 다르기 때문에 이들 유전자를 도입한 효모에서는 각각의 호몰로그에서 지방산 조성이 다른 것이 나타났다. 또한, 상기 호몰로그를 적절히 구별하여 사용함으로써, 목적으로 하는 지방산 조성의 생물을 육종할 수 있는 것이 나타났다.
실시예 8
아라키돈산 생산 효모에서의 발현 해석
(1) 아라키돈산 생산 효모의 육종
아라키돈산 생산 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 육종하기 위해, 이하의 플라스미드를 구축했다.
우선, M. alpina 1S-4주로부터 조제한 cDNA를 주형으로 해서, Δ12-f와 Δ12-r, Δ6-f와 Δ6-r, GLELO-f와 GLELO-r 또는 Δ5-f와 Δ5-r이라고 하는 프라이머의 조합으로 ExTaq를 이용하여 PCR을 행하여, M. alpina 1S-4주의 Δ12지방산 불포화화 효소 유전자, Δ6지방산 불포화화 효소 유전자, GLELO 지방산 쇄 길이 연장 효소 유전자 및 Δ5지방산 불포화화 유전자를 증폭했다.
Δ12-f:TCTAGAatggcacctcccaacactattg(서열 번호 24)
Δ12-r:AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC서열 번호 25)
Δ6-f:TCTAGAatggctgctgctcccagtgtgag(서열 번호 26)
Δ6-r:AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG(서열 번호 27)
GLELO-f:TCTAGAatggagtcgattgcgcaattcc(서열 번호 28)
GLELO-r:GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC(서열 번호 29)
Δ5-f:TCTAGAatgggtgcggacacaggaaaaacc(서열 번호 30)
Δ5-r:AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC(서열 번호 31)
이들을 TOPO-TA-cloning Kit에 의해 클론화했다. 염기 서열을 확인하여, 서열 번호 32∼35의 염기 서열을 포함하는 클론을 각각 플라스미드 pCR-MAΔ12DS(서열 번호 32의 염기 서열을 포함함), pCR-MAΔ6DS(서열 번호 33의 염기 서열을 포함함), pCR-MAGLELO(서열 번호 34의 염기 서열을 포함함), pCR-MAΔ5DS(서열 번호 35의 염기 서열을 포함함)로 했다.
한편, 플라스미드 pURA34(일본 특허 공개 제2001-120276호 공보)를 제한 효소 HindIII로 소화하여 얻어진 약 1.2 kb의 DNA 단편을, 벡터 pUC18을 제한 효소 EcoRI와 SphI로 소화한 후 말단을 평활화하고, 셀프 라이게이션하여 얻어진 벡터의 HindIII 사이트에 삽입하고, 벡터의 EcoRI 사이트측이 URA3의 5'측인 클론을 pUC-URA3로 했다. 또한, YEp13을 제한 효소 SalI와 XhoI로 소화하여 얻어진 약 2.2 kb의 DNA 단편을 벡터 pUC18의 SalI 사이트에 삽입하고, 벡터의 EcoRI 측이 LUE2의 5'측인 클론을 pUC-LEU2로 했다.
다음에, 플라스미드 pCR-MAΔ12DS를 제한 효소 HindIII로 소화한 후 말단을 평활화한 것을 제한 효소 XbaI로 소화하여 얻어진 약 1.2 kbp의 DNA 단편과, 벡터 pESC-URA(STRATAGENE)를 제한 효소 SacI로 소화한 후 말단을 평활화한 것을 제한 효소 SpeI로 소화한 약 6.6 kbp의 DNA 단편을 연결하여, 플라스미드 pESC-U-Δ12를 얻었다. 플라스미드 pCR-MAΔ6DS를 제한 효소 XbaI로 소화한 후 말단을 평활화한 것을 제한 효소 HindIII로 소화하여 얻어진 약 1.6 kbp의 DNA 단편과, 플라스미드 pESC-U-Δ12를 제한 효소 SalI로 소화한 후 말단을 평활화한 것을 제한 효소 HindIII로 소화한 약 8 kbp의 DNA 단편과 연결하여, 플라스미드 pESC-U-Δ12:Δ6을 얻었다. 이것을 제한 효소 PvuII로 부분 소화하여 얻어진 약 4.2 kb의 단편을 pUC-URA3의 SmaI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pUC-URA-Δ12:Δ6을 얻었다.
또한, 플라스미드 pCR-MAGLELO를 제한 효소 XbaI와 SacI로 소화하여 얻어진 약 0.95 kbp의 DNA 단편과, 벡터 pESC-LEU(STRATAGENE)를 제한 효소 XbaI와 SacI로 소화하여 얻어진 약 7.7 kbp의 DNA 단편과 연결하여, 플라스미드 pESC-L-GLELO를 얻었다. 플라스미드 pCR-MAΔ5DS를 제한 효소 XbaI로 소화한 후 말단을 평활화한 것을 제한 효소 HindIII로 소화하여 얻어진 약 1.3 kbp의 DNA 단편과, 플라스미드 pESC-L-GLELO를 제한 효소 ApaI로 소화한 후 말단을 평활화한 것을 제한 효소 HindIII로 소화하여 얻어진 약 8.7 kbp의 DNA 단편을 연결하여, 플라스미드 pESC-L-GLELO:Δ5를 얻었다. 이것을 제한 효소 PvuII로 소화하여 얻어진 약 3.2 kb 단편을 pUC-LEU2의 SmaI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pUC-LEU-GLELO:Δ5를 얻었다. 사카로마이세스 세레비지아 YPH499주(STRATAGENE)를 플라스미드 pUC-URA-Δ12:Δ6과 플라스미드 pUC-LEU-GLELO:Δ5로 동시 형질전환(co-transformation)했다. 형질전환주는, SC-Leu,Ura[1 L당, Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페 닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 트립토판 1.2 g을 혼합한 것) 1.3 g] 한천 배지 (2% 아가) 상에서 생육하는 것으로서 선발했다. 이렇게 해서 얻어진 주 중, 임의의 한 주를 ARA3-1주로 했다.
(2) 아라키돈산 생산 효모의 형질전환주의 취득과 해석
ARA3-1주를 플라스미드 pYE22m, pYE-MALPAAT3, pYE-MALPAAT4로 각각 형질전환했다. 형질전환주는, SC-Trp,Leu,Ura[1 L당, Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g을 혼합한 것) 1.3 g] 한천 배지 (2% 아가) 상에서 생육하는 것으로서 선발했다. 이렇게 해서 얻어진 임의의 주를 각각, ARA-C, ARA-LPAAT3, ARA-LPAAT4로 했다.
이들 주를 상기 SC-Trp,Leu,Ura 액체 배지 10 ml에서 30℃, 1일간 배양하고, 그 중 1 ml를 SG-Trp,Leu,Ura[1 L당, Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO) 6.7 g, 갈락토오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g을 혼합한 것) 1.3 g] 액체 배지 10 ml에서 30℃, 2일간 배양하여, 균체의 지방산 분석을 행했다. 균체의 지방산 조성을 표 5에, 균체 내의 지방산 함유율을 표 6에, 균체의 아라키돈산 함유율을 표 7에 각각 나타냈다.
[표 5] 형질전환주의 지방산 조성
샘플명 ARA-C ARA-LPAAT3 ARA-LPAAT4
16:0 16:1 18:0 18:1 18:1 n-7 18:2 18:3(n-6) DGLA AA 기타 29.85 26.88 10.23 13.26 0.74 8.06 0.28 0.40 0.16 10.14 30.07 26.82 10.39 13.10 0.72 8.17 0.25 0.38 0.16 9.93 27.32 29.81 9.76 14.24 0.66 9.22 0.25 0.33 0.20 8.20
총합 100.00 100.00 100.00
[표 6]
형질전환주의 균체내 지방산 함유율
샘플명 ARA-C ARA-LPAAT3 ARA-LPAAT4
균체내지방산 함유율(%) 5.58 6.30 5.50
[표 7]
형질전환주의 균체내 아라키돈산 함유율
샘플명 ARA-C ARA-LPAAT3 ARA-LPAAT4
㎍/g 89.4 111.4 101.0
ARA-LPAAT4주에서는, 포화 지방산인 팔미트산과 스테아르산의 비율이 저하되고, 리놀레산나 아라키돈산의 비율이 증가했다. 한편, ARA-LPAAT3은, 지방산 조성이 대조군주와 다르지 않지만, 균체 내 지방산 함유율이 증가했다. 즉, LPAAT3이 발현되고 있는 숙주 세포 내의 아라키돈산 함유율도, LPAAT4가 발현되고 있는 숙주 세포 내의 아라키돈 함유율도 대조군 세포내의 아라키돈산 함유율보다 높은 것을 확인할 수 있었다.
또한, 이들 플라스미드 도입주 각 4주를 상기 SC-Trp,Leu,Ura 액체 배지 10 ml에서 30℃, 1일간 배양하고, 그 중 1 ml를 SG-Trp,Leu,Ura 액체 배지 10 ml에 식 균해서 15℃, 7일간 배양하여, 균체의 지방산 분석을 행했다. 균체의 지방산 조성을 표 8에, 균체 내의 지방산 함유율을 표 9에, 균체 내의 아라키돈산 함유율을 표 10에 각각 나타냈다.
[표 8]
형질전환주의 균체내 PUFA 함유율
균체 내 총지방산에서 차지하는 PUFA 비율(%)
샘플명 대조군 LPAAT3 LPAAT4
18:2 18:3 (n-6) DGLA ARA 8.37±0.26 0.54±0.07 0.33±0.02 0.44±0.03 8.79±0.24 0.65±0.11 0.38±0.07 0.61±0.06 9.52±0.28 0.74±0.07 0.25±0.05 0.48±0.02
평균±SD
[표 9]
형질전환주의 균체내 지방산 함유율
균체내 지방산 함유율
샘플명 대조군 LPAAT3 LPAAT4
(%) 6.32±0.59 7.33±0.70 6.45±0.59
평균±SD
[표 10]
형질전환주의 균체내 아라키돈산 함유율
균체내 아라키돈산 함유율
샘플명 대조군 LPAAT3 LPAAT4
(%) 0.028±0.003 0.045±0.008 0.031±0.003
아라키돈산 생산 효모로, M. 알피나 유래의 LPAAT3를 발현시킨 경우, 대조군과 비교하여, 리놀레산, γ-리놀렌산, DGLA, 아라키돈산이라고 하는 PUFA의 비율이 높아졌다. 또한, 균체 내의 지방산 함유율이 높아졌다. 한편, M. 알피나 유래의 LPAAT4를 발현시킨 경우에는, 리놀레산, γ-리놀렌산의 비율이 높아지고, 아라키돈산의 비율도 높아졌다.
실시예 9
(1) M. 알피나 발현용 벡터의 구축
M. 알피나 발현용 벡터로서, GAPDH 프로모터로부터 목적 유전자를 발현시키는 pDuraSC와 히스톤 프로모터로부터 목적 유전자를 발현시키는 pDuraMCS를 이용했다. LPAAT3 및 LPAAT4를 M. 알피나에서 발현시키기 위해, 이하와 같이 벡터를 구축했다. 플라스미드 pCR-LPAAT3 또는 플라스미드 pCR-LPAAT4를 제한 효소 EcoRI로 소화하고, 인서트 부분을 추출하여, 벡터 pDuraSC 또는 벡터 pDura5MCS의 멀티 클로닝 사이트의 EcoRI 사이트에 삽입했다. 삽입된 DNA의 방향을 확인하여, 각각의 벡터의 프로모터로부터 ORF가 전사되는 방향에 삽입된 것을 각각 플라스미드 pDuraSC-LPAAT3, 플라스미드 pDuraSC-LPAAT4, 플라스미드 pDura5MCS-LPAAT3, 플라스미드 pDura5MCS-LPAAT4로 했다.
(2) M. 알피나 형질전환주의 취득
이들 플라스미드로, M. 알피나로부터 특허 문헌(제WO2005/019437호 「지질 생산균의 육종 방법」)에 기재된 방법에 따라 유도한 우라실 요구성 주 Δura-3를 숙주로서 파티클 딜리버리법으로 형질전환을 행했다. 형질전환주의 선택에는, SC 한천 배지[Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate (Difco) 0.5%, 황산암모늄 0.17%, 글루코오스 2%, 아데닌 0.002%, 티로신 0.003%, 메티오닌 0.0001%, 아르기닌 0.0002%, 히스티딘 0.0002%, 리신 0.0004%, 트립토판 0.0004%, 트레오닌 0.0005%, 이소류신 0.0006%, 류신 0.0006%, 페닐알라닌 0.0006%, 한천 2%]를 이용했다.
(3) 형질전환 M. 알피나의 평가
얻어진 형질전환주를, GY 배지(글루코오스 2%, 효모 엑기스 1%) 4 ml에 식균하고, 28℃에서 3일간 또는 4일간 진탕 배양을 행했다. 균체를 여과에 의해 회수하고, RNeasy plant kit(QIAGEN)를 이용하여 RNA를 추출했다. 수퍼 스크립트 제1 스트랜드 시스템(SuperScript First-Strand system) for RT-PCR(인비트로겐)에 의해 cDNA를 합성했다. 도입한 컨스트럭트로부터의 각 유전자의 발현과, 전체의 각 유전자의 발현을 확인하기 위해, 이하의 프라이머의 조합으로 RT-PCR을 행했다.
○ 플라스미드 pDuraSC-LPAAT3 도입주
도입 컨스트럭트로부터의 발현에 이용한 프라이머
프라이머 MaGAPDHpfw:CACACCACACATTCAACATC(서열 번호 47)
프라이머 LAT3-2R:GAATCGTAGATATGGTTGTATCCAGCGCT(서열 번호 48)
전체의 LPAAT3의 발현에 이용한 프라이머
프라이머 LAT3-1F:CTGGCGGTCATCCTTGTTTTCTACCTG(서열 번호 49)와 프라이머 LAT3-2R(서열 번호 48)
○ 플라스미드 pDuraSC-LPAAT4 도입주
도입 컨스트럭트로부터의 발현에 이용한 프라이머
프라이머 MaGAPDHpfw(서열 번호 47)
프라이머 LAT4-2R:GAATCATAGATGTGTGAGTATCCTTGCGA(서열 번호 50)
전체의 LPAAT4의 발현에 이용한 프라이머
프라이머 LAT4-1F: TTCTAATCCTGTCCTACTGGCAGCG(서열 번호 51)
프라이머 LAT4-2R(서열 번호 50)
○ 플라스미드 pDura5MCS-LPAAT3 도입주
도입 컨스트럭트로부터의 발현에 이용한 프라이머
프라이머 PD4P: CGCATCCCGCAAACACACAC(서열 번호 52)
프라이머 LAT3-2R(서열 번호 48)
전체의 LPAAT3의 발현에 이용한 프라이머
프라이머 LAT3-1F(서열 번호 49)와 프라이머 LAT3-2R(서열 번호 48)
○ 플라스미드 pDura5MCS-LPAAT4 도입주
도입 컨스트럭트로부터의 발현에 이용한 프라이머
프라이머 PD4P(서열 번호 52)와 프라이머 LAT4-2R(서열 번호 50)
전체의 LPAAT4의 발현에 이용한 프라이머
프라이머 LAT4-1F(서열 번호 51)와 프라이머 LAT4-2R(서열 번호 50)
상기 RT-PCR의 결과로부터, 각 유전자의 도입 컨스트럭트로부터의 발현 및 전체의 발현이 높은 것으로서, 플라스미드 pDuraSC-LPAAT3 도입주로부터 Gp-LPAAT3-3주, Gp-LPAAT3-29주를, 플라스미드 pDuraSC-LPAAT4 도입주로부터 Gp-LPAAT4-26주와 Gp-LPAAT4-68주를, 플라스미드 pDura5MCS-LPAAT3 도입주로부터 Hp-LPAAT3-34주를, 플라스미드 pDura5MCS-LPAAT4 도입주로부터 Hp-LPAAT4-26주와 Hp- LPAAT4-31주를 각각 선발했다.
이들 주를, GY 배지 4 ml, 28℃, 125 rpm으로, 3일간 또는 4일간 진탕 배양했다(각 n=3). 배양 종료 후, 균체를 여과에 의해 회수하여, 동결 건조했다. 건조 균체의 일부(약 10∼20 mg 정도)를 취하고, 염산메탄올법에 의해 균체의 지방산을 메틸에스테르로 유도한 후, 헥산으로 추출하고, 헥산을 유거하여, 가스 크로마토그래피에 의해 분석을 행했다. 균체 내의 지방산 함유율과, 배지 당 아라키돈산 생산량을 이하의 표에 정리했다.
[표 11]
LPAAT3 고발현 M.알피나의 균체내 지방산 함유율(%)
Gp-LPAAT3-3 Gp-LPAAT3-29 Hp-LPAAT3-34 1S-4
3일째 4일째 22.72±4.35 29.44±1.61 21.52±7.30 29.33±1.36 23.86±5.36 35.81±0.35 19.69±2.22 24.92±5.62
평균±SD
[표 12]
LPAAT3 고발현 M.알피나의 ARA 생산량(g/L)
Gp-LPAAT3-3 Gp-LPAAT3-29 Hp-LPAAT3-34 1S-4
3일째 4일째 0.78±0.20 1.28±0.09 0.69±0.37 1.19±0.24 0.70±0.31 1.59±0.14 0.58±0.06 0.99±0.26
평균±SD
[표 13]
LPAAT4 고발현 M.알피나의 균체내 지방산 함유율(%)
Gp-LPAAT4-26 Gp-LPAAT4-68 Hp-LPAAT4-26 Hp-LPAAT4-31 1S-4
3일째 4일째 22.29±2.07 35.05±1.30 26.15±5.35 30.88±4.01 21.41±2.16 32.65±2.63 21.25±1.87 32.83±1.73 19.69±2.22 24.92±5.62
[표 14]
LPAAT4 고발현 M.알피나의 ARA 생산량(g/L)
Gp-LPAAT4-26 Gp-LPAAT4-68 Hp-LPAAT4-26 Hp-LPAAT4-31 1S-4
3일째 4일째 0.80±0.08 1.70±0.16 0.97±0.29 1.50±0.23 0.79±0.15 1.62±0.25 0.79±0.10 1.63±0.05 0.58±0.06 0.99±0.26
이들 결과로부터, 시험한 모든 형질전환 M. 알피나 주는, 균체 내의 지방산 함유율도 배지 당 아라키돈산 생산량도 대조군보다 높은 것이 나타났다.
서열표 프리 텍스트
서열 번호 9: 프라이머
서열 번호 10: 프라이머
서열 번호 11: 프라이머
서열 번호 12: 프라이머
서열 번호 13: 프라이머
서열 번호 14: 프라이머
서열 번호 15: 프라이머
서열 번호 16: 프라이머
서열 번호 21: 프라이머
서열 번호 22: 프라이머
서열 번호 24: 프라이머
서열 번호 25: 프라이머
서열 번호 26: 프라이머
서열 번호 27: 프라이머
서열 번호 28: 프라이머
서열 번호 29: 프라이머
서열 번호 30: 프라이머
서열 번호 31: 프라이머
서열 번호 38: 프라이머
서열 번호 39: 프라이머
서열 번호 45: 프라이머
서열 번호 46: 프라이머
서열 번호 47: 프라이머
서열 번호 48: 프라이머
서열 번호 49: 프라이머
서열 번호 50: 프라이머
서열 번호 51: 프라이머
서열 번호 52: 프라이머
SEQUENCE LISTING <110> SUNTORY LIMITED. <120> NOVEL LYSOPHOSPHATIDIC ACID ACYLTRANSFERASE GENES <130> FA0038-08045 <150> JP2007-139046 <151> 2007-05-25 <150> JP2007-323965 <151> 2007-12-14 <160> 52 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1207 <212> DNA <213> Mortierella alpina <220> <221> CDS <222> (158)..(1147) <223> <400> 1 ccccgtcttt actcctgcac acagacacac acccacactc tctctttcct ggtttgaaca 60 gatcccaatt gccgactcca tctttctcca tactcttcac ccctcccatc gccctccttt 120 cacttcctct gtttctcatc tgacgccaat cgtaagg atg tca tca atg tca tca 175 Met Ser Ser Met Ser Ser 1 5 ata gag ccc gca ctg tcc tcg ttt cca ggc aac ctg gcg gtc atc ctt 223 Ile Glu Pro Ala Leu Ser Ser Phe Pro Gly Asn Leu Ala Val Ile Leu 10 15 20 gtt ttc tac ctg gca ctt cca cga ctt ctt gcc gtc ctg cca caa aag 271 Val Phe Tyr Leu Ala Leu Pro Arg Leu Leu Ala Val Leu Pro Gln Lys 25 30 35 att cag ttc atc gcc aaa tgt ctc att gtc ctt aca gcc acc ttc ctc 319 Ile Gln Phe Ile Ala Lys Cys Leu Ile Val Leu Thr Ala Thr Phe Leu 40 45 50 atg tct gtg gca gga tgc ttt gtc gcc att gtc tgt gct ctc ctc caa 367 Met Ser Val Ala Gly Cys Phe Val Ala Ile Val Cys Ala Leu Leu Gln 55 60 65 70 aag cgc tat gcc ata aat tac gtg gtt gcg agg atc ttt tct tat atc 415 Lys Arg Tyr Ala Ile Asn Tyr Val Val Ala Arg Ile Phe Ser Tyr Ile 75 80 85 gca tgc agg cct tgt gga gtc acg ttc aat atc gtg ggc gaa gaa cac 463 Ala Cys Arg Pro Cys Gly Val Thr Phe Asn Ile Val Gly Glu Glu His 90 95 100 ctc gag aac act cca gca atc gtt gtc tgc aac cac cag agc tcc atg 511 Leu Glu Asn Thr Pro Ala Ile Val Val Cys Asn His Gln Ser Ser Met 105 110 115 gat atg atg gtc ttg gga cga gtg ttc cca atg cgc tgc gtg gtt atg 559 Asp Met Met Val Leu Gly Arg Val Phe Pro Met Arg Cys Val Val Met 120 125 130 gcc aag aag gaa ctt cag tac ttt cca ttt ctc ggc atc ttt atg acg 607 Ala Lys Lys Glu Leu Gln Tyr Phe Pro Phe Leu Gly Ile Phe Met Thr 135 140 145 150 ctg agc aat gcc att ttt att gac cgc aag aat cat aag aag gcc att 655 Leu Ser Asn Ala Ile Phe Ile Asp Arg Lys Asn His Lys Lys Ala Ile 155 160 165 gag tct aca acc cag gcc gtt gct gac atg aag aag cac aac tct ggg 703 Glu Ser Thr Thr Gln Ala Val Ala Asp Met Lys Lys His Asn Ser Gly 170 175 180 atc tgg atc ttc ccc gag gga act cgc tcc cgg ctt gac acg gcc gac 751 Ile Trp Ile Phe Pro Glu Gly Thr Arg Ser Arg Leu Asp Thr Ala Asp 185 190 195 ctg ctg cca ttc aag aag gga gcc ttt cat ctt gca atc cag tca gga 799 Leu Leu Pro Phe Lys Lys Gly Ala Phe His Leu Ala Ile Gln Ser Gly 200 205 210 ctt ccc atc cta ccc att gtc agc gct gga tac aac cat atc tac gat 847 Leu Pro Ile Leu Pro Ile Val Ser Ala Gly Tyr Asn His Ile Tyr Asp 215 220 225 230 tct gcc aag cga tct ttc cct ggc ggt gag ctc gag atc agg gtt ttg 895 Ser Ala Lys Arg Ser Phe Pro Gly Gly Glu Leu Glu Ile Arg Val Leu 235 240 245 gag ccc ata cct acc aca ggc atg acg gcc gat gat gtg aac gat ctg 943 Glu Pro Ile Pro Thr Thr Gly Met Thr Ala Asp Asp Val Asn Asp Leu 250 255 260 atg gag cgg aca cgg gca gtg atg ttg aag aac cta aag gag atg gat 991 Met Glu Arg Thr Arg Ala Val Met Leu Lys Asn Leu Lys Glu Met Asp 265 270 275 gtc aac tcc ttg gca gta tct tca aaa ccc tcg ctc tca gtg gac gag 1039 Val Asn Ser Leu Ala Val Ser Ser Lys Pro Ser Leu Ser Val Asp Glu 280 285 290 ctc aag tca gcg ccc gca ctg aag cag gag gcg aag tcg act gcg gtg 1087 Leu Lys Ser Ala Pro Ala Leu Lys Gln Glu Ala Lys Ser Thr Ala Val 295 300 305 310 gtg gag gaa gag ggg gtt agc tac gac agc gtg aag aag agg aag acg 1135 Val Glu Glu Glu Gly Val Ser Tyr Asp Ser Val Lys Lys Arg Lys Thr 315 320 325 gtc aag gct tag atcgtgggta atggtgatat atgtatttag ttcacgcact 1187 Val Lys Ala attaaaatcc tgatgtcctt 1207 <210> 2 <211> 329 <212> PRT <213> Mortierella alpina <400> 2 Met Ser Ser Met Ser Ser Ile Glu Pro Ala Leu Ser Ser Phe Pro Gly 1 5 10 15 Asn Leu Ala Val Ile Leu Val Phe Tyr Leu Ala Leu Pro Arg Leu Leu 20 25 30 Ala Val Leu Pro Gln Lys Ile Gln Phe Ile Ala Lys Cys Leu Ile Val 35 40 45 Leu Thr Ala Thr Phe Leu Met Ser Val Ala Gly Cys Phe Val Ala Ile 50 55 60 Val Cys Ala Leu Leu Gln Lys Arg Tyr Ala Ile Asn Tyr Val Val Ala 65 70 75 80 Arg Ile Phe Ser Tyr Ile Ala Cys Arg Pro Cys Gly Val Thr Phe Asn 85 90 95 Ile Val Gly Glu Glu His Leu Glu Asn Thr Pro Ala Ile Val Val Cys 100 105 110 Asn His Gln Ser Ser Met Asp Met Met Val Leu Gly Arg Val Phe Pro 115 120 125 Met Arg Cys Val Val Met Ala Lys Lys Glu Leu Gln Tyr Phe Pro Phe 130 135 140 Leu Gly Ile Phe Met Thr Leu Ser Asn Ala Ile Phe Ile Asp Arg Lys 145 150 155 160 Asn His Lys Lys Ala Ile Glu Ser Thr Thr Gln Ala Val Ala Asp Met 165 170 175 Lys Lys His Asn Ser Gly Ile Trp Ile Phe Pro Glu Gly Thr Arg Ser 180 185 190 Arg Leu Asp Thr Ala Asp Leu Leu Pro Phe Lys Lys Gly Ala Phe His 195 200 205 Leu Ala Ile Gln Ser Gly Leu Pro Ile Leu Pro Ile Val Ser Ala Gly 210 215 220 Tyr Asn His Ile Tyr Asp Ser Ala Lys Arg Ser Phe Pro Gly Gly Glu 225 230 235 240 Leu Glu Ile Arg Val Leu Glu Pro Ile Pro Thr Thr Gly Met Thr Ala 245 250 255 Asp Asp Val Asn Asp Leu Met Glu Arg Thr Arg Ala Val Met Leu Lys 260 265 270 Asn Leu Lys Glu Met Asp Val Asn Ser Leu Ala Val Ser Ser Lys Pro 275 280 285 Ser Leu Ser Val Asp Glu Leu Lys Ser Ala Pro Ala Leu Lys Gln Glu 290 295 300 Ala Lys Ser Thr Ala Val Val Glu Glu Glu Gly Val Ser Tyr Asp Ser 305 310 315 320 Val Lys Lys Arg Lys Thr Val Lys Ala 325 <210> 3 <211> 1148 <212> DNA <213> Mortierella alpina <220> <221> misc_feature <222> (1140)..(1140) <223> n means any bases <220> <221> CDS <222> (55)..(996) <223> <400> 3 ctcttccatt caacgatcgt tttcttccct agcacacgtt tctgttcgtc cgac atg 57 Met 1 tcc ata ggc tct tct aat cct gtc cta ctg gca gcg atc ccc ttc gtc 105 Ser Ile Gly Ser Ser Asn Pro Val Leu Leu Ala Ala Ile Pro Phe Val 5 10 15 tac ctt ttt gtc ctc cct cgc atc ctc gcc ttc ctc cct caa aag gcc 153 Tyr Leu Phe Val Leu Pro Arg Ile Leu Ala Phe Leu Pro Gln Lys Ala 20 25 30 cag ttc ctc gca aaa tgt atc gtg gtc ttg atc gcc acc ctc atc atg 201 Gln Phe Leu Ala Lys Cys Ile Val Val Leu Ile Ala Thr Leu Ile Met 35 40 45 tcc gtc gca ggc tgc ctc atc tct att gtc tgt gcg ctc ctc gac aaa 249 Ser Val Ala Gly Cys Leu Ile Ser Ile Val Cys Ala Leu Leu Asp Lys 50 55 60 65 cgc tat gtg atc aac tac gtt gtc tca aga ctc ttc tca ttc ctt gca 297 Arg Tyr Val Ile Asn Tyr Val Val Ser Arg Leu Phe Ser Phe Leu Ala 70 75 80 gca aga ccc tgc ggc gtc act tac aag att gtg ggc gag gag cat ttg 345 Ala Arg Pro Cys Gly Val Thr Tyr Lys Ile Val Gly Glu Glu His Leu 85 90 95 gat aag tac ccc gcc att gtc gtt tgc aac cac cag agc tca atg gac 393 Asp Lys Tyr Pro Ala Ile Val Val Cys Asn His Gln Ser Ser Met Asp 100 105 110 atg atg gtt ctg gga cgc gtc ttc cct aag cac tgt gtc gtc atg gca 441 Met Met Val Leu Gly Arg Val Phe Pro Lys His Cys Val Val Met Ala 115 120 125 aag aag gag ctt ctt tac ttt ccg ttc ctg ggc atg ttc atg aaa ctg 489 Lys Lys Glu Leu Leu Tyr Phe Pro Phe Leu Gly Met Phe Met Lys Leu 130 135 140 145 agc aat gcc att ttc atc gac cgc aag aac cat aag aag gcg atc gag 537 Ser Asn Ala Ile Phe Ile Asp Arg Lys Asn His Lys Lys Ala Ile Glu 150 155 160 tct acc acc caa gct gtc gcc gac atg aag aag cac aac tct gga atc 585 Ser Thr Thr Gln Ala Val Ala Asp Met Lys Lys His Asn Ser Gly Ile 165 170 175 tgg att ttc 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Val Leu Gly Arg Val Phe Pro Lys His Cys Val Val Met 115 120 125 Ala Lys Lys Glu Leu Leu Tyr Phe Pro Phe Leu Gly Met Phe Met Lys 130 135 140 Leu Ser Asn Ala Ile Phe Ile Asp Arg Lys Asn His Lys Lys Ala Ile 145 150 155 160 Glu Ser Thr Thr Gln Ala Val Ala Asp Met Lys Lys His Asn Ser Gly 165 170 175 Ile Trp Ile Phe Pro Glu Gly Thr Arg Ser Arg Leu Asp Lys Ala Asp 180 185 190 Leu Leu Pro Phe Lys Lys Gly Ala Phe His Leu Ala Ile Gln Ala Gln 195 200 205 Leu Pro Ile Leu Pro Ile Val Ser Gln Gly Tyr Ser His Ile Tyr Asp 210 215 220 Ser Ser Lys Arg Tyr Phe Pro Gly Gly Glu Leu Glu Ile Arg Val Leu 225 230 235 240 Glu Pro Ile Pro Thr Lys Gly Leu Thr Thr Asp Asp Val Asn Asp Leu 245 250 255 Met Asp Lys Thr Arg Asn Leu Met Leu Lys His Leu Lys Asp Met Asp 260 265 270 Ser His Cys Ser Ser Ala Val Gly Asn Gly Ser Leu Pro Leu Asp Ala 275 280 285 Asp Ile Ala Lys Ser Thr Ala Thr Ser Ile Gly Asn Thr Asp Asp Ala 290 295 300 Val Thr Lys Arg Arg Thr Leu Lys Glu 305 310 <210> 5 <211> 843 <212> DNA <213> Mortierella alpina <220> <221> misc_feature <222> (793)..(793) <223> n means any bases <400> 5 gcgccattga ggagaacctg ggacgtgtca aggaaaagga tccactctgg ctggtagtct 60 tccctgaagg aacagtcgtc tccaaggaaa cgcgtttgcg atctgttgcc ttttcaaaga 120 aggctggtct ttcggatcac cgccatgtgt tgcttccaag aaccagcggc ctctttgttt 180 gcatcaacaa gttgcgtgga tccgtcgaat acttatacga cgcgacagtt ggctactcga 240 acgttgaata tggagagatt ccacaggagc tttacccttt gccagggcta tatatcaaca 300 aggcgcagcc caaggagatc aacatgcacc tgcggcggtt tgctatcaag gatatcccca 360 cgtcagaacc cgagtttgtg gagtgggtcc gagcgcggtg ggtagagaag gatgagctga 420 tggaggagtt ttataccaag ggccgattcc catcgcagct gacggctgag gacattggcg 480 agaaggagac caacaaggca ggaggctcat ctgaaggaca gagtgtcaga atcccgctca 540 aatcgcgagg catgatggac tacctcatgc cttcggccat taacctggtt gcgctgccag 600 tactggcttt tgcgatgaga tatgctctgc agcaagtatc gtctggttga tttatttttt 660 gttagacgct gccgtagttg taaatttgat gagtgctatt tagagcaaac gaaagaagag 720 acttaaacgc atggatgtgt gtaatttcat aacagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 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Gly Pro Lys Met Asn Pro Ile Tyr Lys Gly Leu Arg Ala Phe 25 30 35 gtc tgg gcc ttg tac ttc aac cta gga gca tct ctc ata tcg ata acc 197 Val Trp Ala Leu Tyr Phe Asn Leu Gly Ala Ser Leu Ile Ser Ile Thr 40 45 50 caa gtc ctg tcg ttg cct ctg gcg ttg atc gct cca aaa gtt tac cag 245 Gln Val Leu Ser Leu Pro Leu Ala Leu Ile Ala Pro Lys Val Tyr Gln 55 60 65 70 tgg cac atc act aaa acc cag ggt cac ttt ggg gct ttc ctg ctc aag 293 Trp His Ile Thr Lys Thr Gln Gly His Phe Gly Ala Phe Leu Leu Lys 75 80 85 atg aac cag cta ttt gcg ccc tca gat atc gtc ttg acg gga gat gaa 341 Met Asn Gln Leu Phe Ala Pro Ser Asp Ile Val Leu Thr Gly Asp Glu 90 95 100 agt gtc agg gga atc gtc aag gtg tac caa gga cga agg ctg aag gac 389 Ser Val Arg Gly Ile Val Lys Val Tyr Gln Gly Arg Arg Leu Lys Asp 105 110 115 act ggt gag gcg tac agc ggt cat gga gag gac att att ctg gat atg 437 Thr Gly Glu Ala Tyr Ser Gly His Gly Glu Asp Ile Ile Leu Asp Met 120 125 130 ccc gag agg atg gtt ttc atc gcg aac cac cag atc tat tct gac tgg 485 Pro Glu Arg Met Val Phe Ile Ala Asn His Gln Ile Tyr Ser Asp Trp 135 140 145 150 atg tac ctc tgg tgc ttc tcc tat ttc gca gag agg cac agg gca ctg 533 Met Tyr Leu Trp Cys Phe Ser Tyr Phe Ala Glu Arg His Arg Ala Leu 155 160 165 aag att att ctt cgg ggc gac ctg acc tgg atc cct gtc ttt ggc tgg 581 Lys Ile Ile Leu Arg Gly Asp Leu Thr Trp Ile Pro Val Phe Gly Trp 170 175 180 ggt atg cgg ttc ttt gac ttt atc ttt ttg aaa cgt aat gac tgg gca 629 Gly Met Arg Phe Phe Asp Phe Ile Phe Leu Lys Arg Asn Asp Trp Ala 185 190 195 cat gac aga cgc gcc att gag gag aac ctg gga cgt gtc aag gaa aag 677 His Asp Arg Arg Ala Ile Glu Glu Asn Leu Gly Arg Val Lys Glu Lys 200 205 210 gat cca ctc tgg ctg gta gtc ttc cct gaa gga aca gtc gtc tcc aag 725 Asp Pro Leu Trp Leu Val Val Phe Pro Glu Gly Thr Val Val Ser Lys 215 220 225 230 gaa acg cgt ttg cga tct gtt gcc ttt tca aag aag gct ggt ctt tcg 773 Glu Thr Arg Leu Arg Ser Val Ala Phe Ser Lys Lys Ala Gly Leu Ser 235 240 245 gat cac cgc cat gtg ttg ctt cca aga acc agc ggc ctc ttt gtt tgc 821 Asp His Arg His Val Leu Leu Pro Arg Thr Ser Gly Leu Phe Val Cys 250 255 260 atc aac aag ttg cgt gga tcc gtc gaa tac tta tac gac gcg aca gtt 869 Ile Asn Lys Leu Arg Gly Ser Val Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Thr Val 265 270 275 ggc tac tcg aac gtt gaa tat gga gag att cca cag gag ctt tac cct 917 Gly Tyr Ser Asn Val Glu Tyr Gly Glu Ile Pro Gln Glu Leu Tyr Pro 280 285 290 ttg cca ggg cta tat atc aac aag gcg cag ccc aag gag atc aac atg 965 Leu Pro Gly Leu Tyr Ile Asn Lys Ala Gln Pro Lys Glu Ile Asn Met 295 300 305 310 cac ctg cgg cgg ttt gct atc aag gat atc ccc acg tca gaa ccc gag 1013 His Leu Arg Arg Phe Ala Ile Lys Asp Ile Pro Thr Ser Glu Pro Glu 315 320 325 ttt gtg gag tgg gtc cga gcg cgg tgg gta gag aag gat gag ctg atg 1061 Phe Val Glu Trp Val Arg Ala Arg Trp Val Glu Lys Asp Glu Leu Met 330 335 340 gag gag ttt tat acc aag ggc cga ttc cca tcg cag ctg acg gct gag 1109 Glu Glu Phe Tyr Thr Lys Gly Arg Phe Pro Ser Gln Leu Thr Ala Glu 345 350 355 gac att ggc gag aag gag acc aac aag gca gga ggc 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Gln Gly His Phe 65 70 75 80 Gly Ala Phe Leu Leu Lys Met Asn Gln Leu Phe Ala Pro Ser Asp Ile 85 90 95 Val Leu Thr Gly Asp Glu Ser Val Arg Gly Ile Val Lys Val Tyr Gln 100 105 110 Gly Arg Arg Leu Lys Asp Thr Gly Glu Ala Tyr Ser Gly His Gly Glu 115 120 125 Asp Ile Ile Leu Asp Met Pro Glu Arg Met Val Phe Ile Ala Asn His 130 135 140 Gln Ile Tyr Ser Asp Trp Met Tyr Leu Trp Cys Phe Ser Tyr Phe Ala 145 150 155 160 Glu Arg His Arg Ala Leu Lys Ile Ile Leu Arg Gly Asp Leu Thr Trp 165 170 175 Ile Pro Val Phe Gly Trp Gly Met Arg Phe Phe Asp Phe Ile Phe Leu 180 185 190 Lys Arg Asn Asp Trp Ala His Asp Arg Arg Ala Ile Glu Glu Asn Leu 195 200 205 Gly Arg Val Lys Glu Lys Asp Pro Leu Trp Leu Val Val Phe Pro Glu 210 215 220 Gly Thr Val Val Ser Lys Glu Thr Arg Leu Arg Ser Val Ala Phe Ser 225 230 235 240 Lys Lys Ala Gly Leu Ser Asp His Arg His Val Leu Leu Pro Arg Thr 245 250 255 Ser Gly Leu Phe Val Cys Ile Asn Lys Leu Arg Gly Ser Val Glu Tyr 260 265 270 Leu Tyr Asp Ala Thr Val Gly Tyr Ser Asn Val Glu Tyr Gly Glu Ile 275 280 285 Pro Gln Glu Leu Tyr Pro Leu Pro Gly Leu Tyr Ile Asn Lys Ala Gln 290 295 300 Pro Lys Glu Ile Asn Met His Leu Arg Arg Phe Ala Ile Lys Asp Ile 305 310 315 320 Pro Thr Ser Glu Pro Glu Phe Val Glu Trp Val Arg Ala Arg Trp Val 325 330 335 Glu Lys Asp Glu Leu Met Glu Glu Phe Tyr Thr Lys Gly Arg Phe Pro 340 345 350 Ser Gln Leu Thr Ala Glu Asp Ile Gly Glu Lys Glu Thr Asn Lys Ala 355 360 365 Gly Gly Ser Ser Glu Gly Gln Ser Val Arg Ile Pro Leu Lys Ser Arg 370 375 380 Gly Met Met Asp Tyr Leu Met Pro Ser Ala Ile Asn Leu Val Ala Leu 385 390 395 400 Pro Val Leu Ala Phe Ala Met Arg Tyr Ala Leu Gln Gln Val Ser Ser 405 410 415 Gly <210> 19 <211> 1050 <212> DNA <213> Mortierella alpina <220> <221> CDS <222> (26)..(949) <223> <400> 19 ggttcaacac actccgcttc ccggc atg ctc gag tcc gtc acc cga ccc aca 52 Met Leu Glu Ser Val Thr Arg Pro Thr 1 5 aag gcc ctg ctc tat gga tca gcc ctc ttc agt ttc tgc tcg ttg ctc 100 Lys Ala Leu Leu Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Ser Phe Cys Ser Leu Leu 10 15 20 25 aat gtg gtc cag gtg ttc tcg ctg ctc ctg cag ccg ttc tcg aag cgt 148 Asn Val Val Gln Val Phe Ser Leu Leu Leu Gln Pro Phe Ser Lys Arg 30 35 40 ctc ttc ttt gaa gtg aac gcc cgc gtg gct ggc tcc atg tgg aaa gtc 196 Leu Phe Phe Glu Val Asn Ala Arg Val Ala Gly Ser Met Trp Lys Val 45 50 55 atg cag ttg atc atg gag aaa aaa cac aag gct gcc atc acc ttc tca 244 Met Gln Leu Ile Met Glu Lys Lys His Lys Ala Ala Ile Thr Phe Ser 60 65 70 gga gac aag atc cca cac cac gag agt gct atc gtc ttt ggc aac cac 292 Gly Asp Lys Ile Pro His His Glu Ser Ala Ile Val Phe Gly Asn His 75 80 85 cga tcc ttt gtt gac ttt tac atg ttt cac acc gtt gct gct cgg agg 340 Arg Ser Phe Val Asp Phe Tyr Met Phe His Thr Val Ala Ala Arg Arg 90 95 100 105 ggc atg ctc aat tac atg aag tac ttt gcc aag gat tct ttg aaa tac 388 Gly Met Leu Asn Tyr Met Lys Tyr Phe Ala Lys Asp Ser Leu Lys Tyr 110 115 120 att cca ttc tac gga tgg ggc atg tgg atc atg gga atg ctg ttc atc 436 Ile Pro Phe Tyr Gly Trp Gly Met Trp Ile Met Gly Met Leu Phe Ile 125 130 135 aac cgc aac tgg cag cag gat cag ctc aag atc aac aag atg ttt gcg 484 Asn Arg Asn Trp Gln Gln Asp Gln Leu Lys Ile Asn Lys Met Phe Ala 140 145 150 cgg ata ttg gat atc caa gca ccg gtc tgg gtc gcc agt ttc ctg gag 532 Arg Ile Leu Asp Ile Gln Ala Pro Val Trp Val Ala Ser Phe Leu Glu 155 160 165 ggt tct cgt ctg acg cct agc aag ctg gct gcc tct caa aag ttc atg 580 Gly Ser Arg Leu Thr Pro Ser Lys Leu Ala Ala Ser Gln Lys Phe Met 170 175 180 185 ctg gga cgc ggc ctg cct ctg ctc tcg aat gtc atg atg ccc agg acc 628 Leu Gly Arg Gly Leu Pro Leu Leu Ser Asn Val Met Met Pro Arg Thr 190 195 200 aag gga ttc att gcc tgc gtc aac aaa ttc cga gga act cat gtg aag 676 Lys Gly Phe Ile Ala Cys Val Asn Lys Phe Arg Gly Thr His Val Lys 205 210 215 tgt gtt tac gac ttc acg ttt gcc tat tac cac aag acc aag ggt ttt 724 Cys Val Tyr Asp Phe Thr Phe Ala Tyr Tyr His Lys Thr Lys Gly Phe 220 225 230 gga gtg ccc cca gat ctg gtg cgt gtt cac act ggt cag ctc agc ccc 772 Gly Val Pro Pro Asp Leu Val Arg Val His Thr Gly Gln Leu Ser Pro 235 240 245 gag tac aag ttt cat gtg cat gtg aga cgc tat cag ctc gac gat ctg 820 Glu Tyr Lys Phe His Val His Val Arg Arg Tyr Gln Leu Asp Asp Leu 250 255 260 265 ccc gta gat gaa gag aag ctg agc gag tgg gtg gtt cag aag tac gtg 868 Pro Val Asp Glu Glu Lys Leu Ser Glu Trp Val Val Gln Lys Tyr Val 270 275 280 gag aag gac gcc ttc tta gag caa atg aag gag aac tgg aca gac ggt 916 Glu Lys Asp Ala Phe Leu Glu Gln Met Lys Glu Asn Trp Thr Asp Gly 285 290 295 att gaa gga ggt gtc tgg tca gag aag tgg tga gcgaccacca ctgacaagaa 969 Ile Glu Gly Gly Val Trp Ser Glu Lys Trp 300 305 aaacatgcag catatttttt ttagaggaat gaataagaat tgttatattt ataaaggcaa 1029 actatcgccg attacaaagt c 1050 <210> 20 <211> 307 <212> PRT <213> Mortierella alpina <400> 20 Met Leu Glu Ser Val Thr Arg Pro Thr Lys Ala Leu Leu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Ala Leu Phe Ser Phe Cys Ser Leu Leu Asn Val Val Gln Val Phe Ser 20 25 30 Leu Leu Leu Gln Pro Phe Ser Lys Arg Leu Phe Phe Glu Val Asn Ala 35 40 45 Arg Val Ala Gly Ser Met Trp Lys Val Met Gln Leu Ile Met Glu Lys 50 55 60 Lys His Lys Ala Ala Ile Thr Phe Ser Gly Asp Lys Ile Pro His His 65 70 75 80 Glu Ser Ala Ile Val Phe Gly Asn His Arg Ser Phe Val Asp Phe Tyr 85 90 95 Met Phe His Thr Val Ala Ala Arg Arg Gly Met Leu Asn Tyr Met Lys 100 105 110 Tyr Phe Ala Lys Asp Ser Leu Lys Tyr Ile Pro Phe Tyr Gly Trp Gly 115 120 125 Met Trp Ile Met Gly Met Leu Phe Ile Asn Arg Asn Trp Gln Gln Asp 130 135 140 Gln Leu Lys Ile Asn Lys Met Phe Ala Arg Ile Leu Asp Ile Gln Ala 145 150 155 160 Pro Val Trp Val Ala Ser Phe Leu Glu Gly Ser Arg Leu Thr Pro Ser 165 170 175 Lys Leu Ala Ala Ser Gln Lys Phe Met Leu Gly Arg Gly Leu Pro Leu 180 185 190 Leu Ser Asn Val Met Met Pro Arg Thr Lys Gly Phe Ile Ala Cys Val 195 200 205 Asn Lys Phe Arg Gly Thr His Val Lys Cys Val Tyr Asp Phe Thr Phe 210 215 220 Ala Tyr Tyr His Lys Thr Lys Gly Phe Gly Val Pro Pro Asp Leu Val 225 230 235 240 Arg Val His Thr Gly Gln Leu Ser Pro Glu Tyr Lys Phe His Val His 245 250 255 Val Arg Arg Tyr Gln Leu Asp Asp Leu Pro Val Asp Glu Glu Lys Leu 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aagaagcaca actctggaat ctggattttc 540 cccgaaggaa cacgttcccg cttggacaag gccgatctct tgcccttcaa gaagggagcc 600 ttccacctcg ccattcaagc tcaacttccc atcctcccca tcgtctcgca aggatactca 660 cacatctatg attcatcaaa acgctacttc cccggtggag agctcgagat cagagtcctg 720 gaacccatcc ctaccaaggg attgaccaca gacgatgtca acgacctgat ggacaagaca 780 cgcaacttga tgctcaagca cctcaaggac atggattctc attgctcctc cgccgtcgga 840 aacggatctc tgcctctcga cgccgacatt gcaaagtcaa cggctacatc gatcggaaac 900 acagacgatg ctgtcacaaa gaggaggaca ctgaaagagt aa 942 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> primer <400> 24 tctagaatgg cacctcccaa cactattg 28 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> primer <400> 25 aagcttttac ttcttgaaaa agaccacgtc 30 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> primer <400> 26 tctagaatgg ctgctgctcc cagtgtgag 29 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> primer <400> 27 aagcttttac tgtgccttgc ccatcttgg 29 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> primer <400> 28 tctagaatgg agtcgattgc gcaattcc 28 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> primer <400> 29 gagctcttac 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tgccattttc atcgaccgca agaaccataa gaaggcgatc 480 gagtctacca cccaagctgt cgccgacatg aagaagcaca actctggaat ctggattttc 540 cccgaaggaa cacgttcccg cttggacaag gccgatctct tgcccttcaa gaagggagcc 600 ttccacctcg ccattcaagc tcaacttccc atcctcccca tcgtctcgca aggatactca 660 cacatctatg attcatcaaa acgctacttc cccggtggag agctcgagat cagagtcctg 720 gaacccatcc ctaccaaggg attgaccaca gacgatgtca acgacctgat ggacaagaca 780 cgcaacttga tgctcaagca cctcaaggac atggattctc attgctcctc cgccgtcgga 840 aacggatctc tgcctctcga cgccgacatt gcaaagtcaa cggctacatc gatcggaaac 900 acagacgatg ctgtcacaaa gaggaggaca ctgaaagag 939 <210> 38 <211> 29 <212> DNA <213> primer <400> 38 tctgagatgg atgaatccac caccaccac 29 <210> 39 <211> 32 <212> DNA <213> primer <400> 39 gtcgactcaa ccagacgata cttgctgcag ag 32 <210> 40 <211> 343 <212> PRT <213> Ustilago maydis 521 <400> 40 Met Ala Val Leu Ser Lys Ser Phe Ser Thr Leu Thr Ala Gly Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Leu Ile Ser Pro Arg Ser Gln Lys Leu Arg Phe Tyr 20 25 30 Leu Asn Ser Ile Ile Tyr Ile Ala Gly Leu Gly Ile Cys Ser Val Trp 35 40 45 Gly Ile Phe Val Ser Ile Leu Leu Ser Leu Val Pro Gly Gln Arg Leu 50 55 60 Asn Ile Asn Lys Val Val Ala Arg Ser Phe Trp Arg Leu Thr Ser Pro 65 70 75 80 Leu Val Gly Ile Arg Phe Ile Val Glu Gly Glu Glu His Phe Gln Ala 85 90 95 Ala Arg Pro Ala Val Val Val Gly Asn His Gln Thr Ala Met Asp Ile 100 105 110 Leu Tyr Leu Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asn Ala Ser Ile Met Ala Lys 115 120 125 Lys Glu Leu Gln Phe Ala Pro Leu Leu Gly Gln Phe Met Ser Leu Ser 130 135 140 Gly Ala Val Phe Ile Asn Arg Lys Asn Leu Lys Asp Ser Ile Lys Ala 145 150 155 160 Phe Gln Gln Val Gly Glu Thr Met Asn Asn Lys Lys Leu Ser Leu Trp 165 170 175 Ile Phe Pro Glu Gly Thr Arg Ser Gly Leu Ala Thr Pro Asp Leu Leu 180 185 190 Pro Phe Lys Lys Gly Ala Phe His Leu Ala Ile Gln Ala Gly Val Pro 195 200 205 Val Val Pro Val Val Cys Glu Asn Tyr Asn Arg Leu Phe Asp Ser Arg 210 215 220 Ser Arg Phe Glu Ser Gly Thr Ile Arg Ile Lys Val Leu Ala Pro Ile 225 230 235 240 Pro Thr Lys His Leu Thr Ala Ala Asp Ala Asn Glu Leu Thr Glu Lys 245 250 255 Val Arg Gln Leu Met Leu Asp Glu Leu Arg Asn Met Asp Ala Glu Arg 260 265 270 Gln Arg Thr Asp Thr Ala Ala Ser Val Asn Asn Asp Glu Ala Ser Met 275 280 285 Ala Gly Val Ala Gly Phe Phe Ser Lys Phe Val Gly Thr Ala Asn Ser 290 295 300 Trp Gln Ser Val Asn Ser Asn Val Asp Lys Gln Glu Lys Arg Leu Arg 305 310 315 320 Gln Asn Gly Thr Thr Gly Glu Asn Pro Glu Asp Tyr His Leu Val Ser 325 330 335 Glu Ala Gln Lys Lys Ser Asn 340 <210> 41 <211> 291 <212> PRT <213> Emericella nidulans <400> 41 Met Ser Leu Leu Tyr Tyr Ile Ala Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Ile Ala 1 5 10 15 Phe Thr Ala Ser Leu Phe Leu Val Gly Gln Lys Val Pro Arg Ala Ser 20 25 30 Phe Val Ala Arg Cys Leu Ala Ser Tyr Gly Ser Leu Leu Val Cys Ala 35 40 45 Met Tyr Gly Val Val Ala Ser Ile Val Leu Arg Val Val Gly Tyr Gly 50 55 60 Arg Ile Ser Gln Trp Ala Thr Ala Arg Ser Phe Lys Trp Val Met Arg 65 70 75 80 Phe Thr Thr Gly Val Arg Phe Asp Ile Val Glu Gly Lys Glu Tyr Leu 85 90 95 Ser Thr Arg Pro Ala Val Ile Ile Gly Asn His Gln Ser Glu Leu Asp 100 105 110 Val Leu Met Leu Gly Glu Ile Phe Pro Pro Tyr Cys Ser Val Thr Ala 115 120 125 Lys Lys Ser Leu Arg Tyr Val Pro Phe Leu Gly Trp Phe Met Ala Leu 130 135 140 Ser Arg Thr Val Phe Ile Asp Arg Ala Asn Arg Gln Thr Ala Val Lys 145 150 155 160 Ala Phe Asp Ser Ala Ala Glu Glu Met Arg Ser His Arg Gln Ser Val 165 170 175 Phe Ile Phe Ala Glu Gly Thr Arg Ser Tyr Ser Glu Lys Pro Glu Leu 180 185 190 Leu Pro Phe Lys Lys Gly Ala Phe His Leu Ala Val Lys Ala Gly Val 195 200 205 Pro Ile Val Pro Val Val Val Glu Asn Tyr Ser His Ile Leu Ala Pro 210 215 220 Lys Lys Phe Arg Phe Glu Ala Gly Ser Ile Lys Val Lys Val Leu Pro 225 230 235 240 Pro Ile Ser Thr Asp Gly Leu Thr Ala Ala Asp Val Asp Gly Leu Thr 245 250 255 Thr Ser Thr Arg Glu Ser Met Leu Asn Thr Leu Leu Glu Leu Ser Asn 260 265 270 Ala Gly Pro Ala Asp Leu Pro Ser Ser Ser Lys Gly Gln Ser Thr Ala 275 280 285 Val Asp Leu 290 <210> 42 <211> 303 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 42 Met Ser Val Ile Gly Arg Phe Leu Tyr Tyr Leu Arg Ser Val Leu Val 1 5 10 15 Val Leu Ala Leu Ala Gly Cys Gly Phe Tyr Gly Val Ile Ala Ser Ile 20 25 30 Leu Cys Thr Leu Ile Gly Lys Gln His Leu Ala Gln Trp Ile Thr Ala 35 40 45 Arg Cys Phe Tyr His Val Met Lys Leu Met Leu Gly Leu Asp Val Lys 50 55 60 Val Val Gly Glu Glu Asn Leu Ala Lys Lys Pro Tyr Ile Met Ile Ala 65 70 75 80 Asn His Gln Ser Thr Leu Asp Ile Phe Met Leu Gly Arg Ile Phe Pro 85 90 95 Pro Gly Cys Thr Val Thr Ala Lys Lys Ser Leu Lys Tyr Val Pro Phe 100 105 110 Leu Gly Trp Phe Met Ala Leu Ser Gly Thr Tyr Phe Leu Asp Arg Ser 115 120 125 Lys Arg Gln Glu Ala Ile Asp Thr Leu Asn Lys Gly Leu Glu Asn Val 130 135 140 Lys Lys Asn Lys Arg Ala Leu Trp Val Phe Pro Glu Gly Thr Arg Ser 145 150 155 160 Tyr Thr Ser Glu Leu Thr Met Leu Pro Phe Lys Lys Gly Ala Phe His 165 170 175 Leu Ala Gln Gln Gly Lys Ile Pro Ile Val Pro Val Val Val Ser Asn 180 185 190 Thr Ser Thr Leu Val Ser Pro Lys Tyr Gly Val Phe Asn Arg Gly Cys 195 200 205 Met Ile Val Arg Ile Leu Lys Pro Ile Ser Thr Glu Asn Leu Thr Lys 210 215 220 Asp Lys Ile Gly Glu Phe Ala Glu Lys Val Arg Asp Gln Met Val Asp 225 230 235 240 Thr Leu Lys Glu Ile Gly Tyr Ser Pro Ala Ile Asn Asp Thr Thr Leu 245 250 255 Pro Pro Gln Ala Ile Glu Tyr Ala Ala Leu Gln His Asp Lys Lys Val 260 265 270 Asn Lys Lys Ile Lys Asn Glu Pro Val Pro Ser Val Ser Ile Ser Asn 275 280 285 Asp Val Asn Thr His Asn Glu Gly Ser Ser Val Lys Lys Met His 290 295 300 <210> 43 <211> 279 <212> PRT <213> Schizosaccharomyces pombe 972h- <400> 43 Met Gly Phe Ile Lys Ser Thr Leu Leu Ala Thr Val Thr Val Phe Val 1 5 10 15 Gly Leu Cys Gly Ile Asn Arg Phe Phe Thr Leu Pro Lys Cys Ile Arg 20 25 30 Tyr His Phe Arg Tyr Phe Ala Cys His Thr Phe Leu Ala Ile Ser Ser 35 40 45 Ala Tyr Gly Val Ile Ala Ser Val Val Ala Arg Leu Cys Gly Tyr Pro 50 55 60 Val Met Gly Gln Tyr Leu Thr Ala Lys Ala Tyr Tyr Gly Leu Ala Ser 65 70 75 80 Thr Ile Leu Asp Phe Arg Phe Lys Ile Glu Asn Glu Glu Ile Leu Arg 85 90 95 Lys His Lys Ser Ala Val Leu Val Val Asn His Gln Ser Glu Leu Asp 100 105 110 Ile Leu Ala Ile Gly Arg Thr Phe Gly Pro Asn Tyr Ser Val Ile Ala 115 120 125 Lys Lys Ser Leu Arg Tyr Val Pro Ile Leu Gly Trp Phe Met Ile Leu 130 135 140 Ser Asp Val Val Phe Ile Asp Arg Ser Arg Arg Ser Asp Ala Ile Gln 145 150 155 160 Leu Phe Ala Lys Ala Ala Arg Arg Met Arg Lys Glu Asn Ile Ser Ile 165 170 175 Trp Val Phe Ala Glu Gly Thr Arg Ser Tyr Ser Leu Lys Pro Cys Leu 180 185 190 Leu Pro Leu Lys Lys Gly Ala Phe His Leu Ala Val Gln Ala Gln Val 195 200 205 Pro Ile Ile Pro Ile Ala Ile Gln Thr Tyr Gly His Leu Phe His Pro 210 215 220 Pro Thr Lys Val Phe Asn Lys Gly Glu Ala Leu Ile Lys Val Leu Asp 225 230 235 240 Pro Ile Pro Thr Glu Gly Lys Thr Ala Glu Asp Val Asn Asp Leu Leu 245 250 255 His Glu Thr Glu Thr Ala Met Asn Asn Ala Leu Val Glu Ile Asp Asp 260 265 270 Tyr Gly Lys Val Lys Lys Gln 275 <210> 44 <211> 282 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegans <400> 44 Met Glu Asn Phe Trp Ser Ile Val Val Phe Phe Leu Leu Ser Ile Leu 1 5 10 15 Phe Ile Leu Tyr Asn Ile Ser Thr Val Cys His Tyr Tyr Met Arg Ile 20 25 30 Ser Phe Tyr Tyr Phe Thr Ile Leu Leu His Gly Met Glu Val Cys Val 35 40 45 Thr Met Ile Pro Ser Trp Leu Asn Gly Lys Gly Ala Asp Tyr Val Phe 50 55 60 His Ser Phe Phe Tyr Trp Cys Lys Trp Thr Gly Val His Thr Thr Val 65 70 75 80 Tyr Gly Tyr Glu Lys Thr Gln Val Glu Gly Pro Ala Val Val Ile Cys 85 90 95 Asn His Gln Ser Ser Leu Asp Ile Leu Ser Met Ala Ser Ile Trp Pro 100 105 110 Lys Asn Cys Val Val Met Met Lys Arg Ile Leu Ala Tyr Val Pro Phe 115 120 125 Phe Asn Leu Gly Ala Tyr Phe Ser Asn Thr Ile Phe Ile Asp Arg Tyr 130 135 140 Asn Arg Glu Arg Ala Met Ala Ser Val Asp Tyr Cys Ala Ser Glu Met 145 150 155 160 Lys Asn Arg Asn Leu Lys Leu Trp Val Phe Pro Glu Gly Thr Arg Asn 165 170 175 Arg Glu Gly Gly Phe Ile Pro Phe Lys Lys Gly Ala Phe Asn Ile Ala 180 185 190 Val Arg Ala Gln Ile Pro Ile Ile Pro Val Val Phe Ser Asp Tyr Arg 195 200 205 Asp Phe Tyr Ser Lys Pro Gly Arg Tyr Phe Lys Asn Asp Gly Glu Val 210 215 220 Val Ile Arg Val Leu Asp Ala Ile Pro Thr Lys Gly Leu Thr Leu Asp 225 230 235 240 Asp Val Ser Glu Leu Ser Asp Met Cys Arg Asp Val Met Leu Ala Ala 245 250 255 Tyr Lys Glu Val Thr Leu Glu Ala Gln Gln Arg Asn Ala Thr Arg Arg 260 265 270 Gly Glu Thr Lys Asp Gly Lys Lys Ser Glu 275 280 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> primer <400> 45 ggtgaagggg gaattcttc 19 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> primer <400> 46 atgtcgacgt ggcttaatgc atc 23 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 47 cacaccacac attcaacatc 20 <210> 48 <211> 29 <212> DNA <213> primer <400> 48 gaatcgtaga tatggttgta tccagcgct 29 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> primer <400> 49 ctggcggtca tccttgtttt ctacctg 27 <210> 50 <211> 29 <212> DNA <213> primer <400> 50 gaatcataga tgtgtgagta tccttgcga 29 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> primer <400> 51 ttctaatcct gtcctactgg cagcg 25 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 52 cgcatcccgc aaacacacac 20

Claims (10)

  1. 이하의 (a)∼(e) 중 어느 하나에 기재한 염기 서열을 포함하는 핵산:
    (a) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
    (b) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 이루어지는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
    (c) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 67% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
    (d) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 69% 이상인 아미노산 서열을 코딩하고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
    (e) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열.
  2. 제1항에 있어서, 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나인 염기 서열을 포함하는 핵산:
    (a) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
    (b) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
    (c) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 코딩하고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열.
  3. 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나에 기재한 염기 서열 또는 그 단편을 포함하는 핵산:
    (a) 서열 번호 36 또는 서열 번호 37로 표시되는 염기 서열;
    (b) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 염기 서열;
    (c) 서열 번호 1 또는 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열.
  4. 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나에 기재한 단백질:
    (a) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질;
    (b) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 69% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이고, 또한, 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질.
  5. 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재한 핵산을 함유하는 재조합 벡터.
  7. 제6항에 기재한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체.
  8. 제7항에 기재한 형질전환체를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물로서, 상기 지방산 조성물에서 아라키돈산 함유율이, 제6항에 기재한 재조합 벡터로 형질전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물보다 높은 것을 특징으로 하는 지방산 조성물.
  9. 제7항에 기재한 형질전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터, 제8항에 기재한 지방산 조성물을 채취하는 것을 특징으로 하는 지방산 조성물의 제조 방법.
  10. 제8항에 기재한 지방산 조성물을 포함하는 식품.
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