KR20100001626A

KR20100001626A - 양수 내 염증/감염 진단 방법

Info

Publication number: KR20100001626A
Application number: KR1020080061612A
Authority: KR
Inventors: 윤보현; 한병돈; 박찬욱; 이시은
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2008-06-27
Filing date: 2008-06-27
Publication date: 2010-01-06

Abstract

본 발명은 양수 내 염증/감염 진단 방법에 관한 것으로, 구체적으로 염증이 있는 양수에서 MMP에 의해 단백분해된 조각 인슐린양성장인자결합단백질-1의 양을 측정함으로써 양수 내 염증/감염을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 기존의 양수 내 염증/감염 진단 마커인 MMP-8과 높은 상관관계를 나타냄으로, 양수 내 염증/감염 여부를 높은 민감도로 특이적인 진단에 이용할 수 있다.

양수, 염증, 감염, 인슐린양성장인자결합단백질-1, MMP-8(matrix metalloproteinase-8)

Description

양수 내 염증/감염 진단 방법{Method for diagnosis of inflammation and infection in amniotic fluid}

본 발명은 양수 내 염증/감염 진단 방법에 관한 것이다.

양수 내 염증/감염은 조기분만 및 불량한 임신결과의 위험 요인이다. MMP( Matrix metalloproteinase)는 염증이 있는 부위에서 유래한 단백분해효소로서, 상기 MMP 패밀리 중 일부(MMP-3, MMP-8 및 MMP-9)들은 양수 내 염증 또는 감염이 있는 경우에 농도가 증가하며, 즉 상기 MMP는 조기 진통이나 조기양막파수를 일으켜서 조산을 하는데 있어서 중대한 영향을 끼치는 것으로 알려져 있다.

IGFBP(insulin-like growth factor binding protein)들은 인슐린량성장인자(Insulin-like growth factor, 이하 IGF)에 높은 친화력이 있어, IGF가 그의 수용체에 결합하는 것을 방해한다. 임신기간 동안 IGFBP-1은 탈락막에서 생성되어 임신기간 동안 양수와 모체 내 혈청에 높은 농도로 존재하고 있으며, IGF의 작용을 조절함으로써 태반의 발달에 관여하는 것으로 알려져 있다. 그러나 단백분해효소를 매개로 하는 IGFBP의 분절화(fragmentation)는 결과적으로 IGF/IGFBP 복합체에 서 IGF가 떨어져 나오게 하고, 이를 통해 떨어져 나온 IGF가 IGF 수용체에 결합하여 그 수용체를 활성화한다. 상기 IGFBP의 분절화에 특정 MMP들(MMP-3와 MMP-9)이 IGFBP의 단백분해효소로 작용하여, IGFBP-1을 분할함으로써 IGF 생체이용률을 증가시켜서 임신 초기에 태반의 발달을 조절하는 것이 밝혀졌다(Gravett Mg et al ., JAMA 292:462-469, 2004).

또한, Rutanen 등(Clin Chim Acta, 253(1-2):91-101, 1996)은 IGFBP-1이 양수 내에 특히 고농도로 있음을 이용하여, 양막파수가 불확실한 산모의 자궁경부 질분비물에서 IGFBP-1을 발견하여 양막파수를 진단하고 조기분만을 예측할 수 있음을 보고하였다. 또한 인산화되지 않은(non-phosphorylated) IGFBP-1은 양수 내에 주로 존재하고 인산화된(phosphorylated) IGFBP-1은 탈락막 세포에서 분비되어 자궁경부가 벌어질 때 질로 분비됨이 발견되면서, 이를 이용하여 Kekki 등(Acta Obstet Gynecol Scand, 80(6): 546-551, 2001)은 양막 파수가 없는 조기 진통 산모에서 자궁경부 질분비물 검사에서 인산화 IGFBP-1이 양성인 경우 조기 분만의 위험성이 높음을 보고하였다. 이러한 비침습적인 방법으로 채취한 질분비물을 이용한 검사방법은 임상적 유용성이 더욱 클 것으로 생각된다.

이에 본 발명자들은 염증이 있는 양수 및 질분비물 내에서 MMP에 의해 단백분해된 조각 인슐린양성장인자결합단백질-1(IGFBP-1)의 양을 측정한 결과, 상기 조각 IGFBP-1의 양이 기존의 양수 내 염증/감염 진단 마커인 MMP-8과 높은 상관관계를 나타내어, 상기 조각 IGFBP-1이 양수 내 염증/감염 진단 마커로 유용하게 사용 될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 양수 내 염증/감염 진단용 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 마커를 이용하여 양수 내 염증/감염 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 양수 내 염증/감염 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 생물 분자가 고형 기질에 집적된 양수 내 염증/감염 진단용 바이오칩을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 IGFBP-1(insulin-like growth factor binding protein-1)의 12 kDa, 14 kDa, 17 kDa, 21 kDa 및 23 kDa 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 포함하는 양수 내 염증/감염 진단용 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 산모 개체로부터 분리된 양수 또는 질분비물 시료 내의 상기 마커 중 하나 이상의 농도를 측정하는 단계;

2) 단계 1)의 상기 마커의 농도가 정상 산모보다 높은 산모 개체를 선별하는 단계를 포함하는 양수 내 염증/감염 진단을 위한 상기 마커의 측정방법을 제공한 다.

또한, 본 발명은

1) 산모 개체로부터 분리된 시료 내의 상기 마커 중 하나 이상 및 전장 IGFBP-1의 농도를 측정하는 단계;

2) 단계 1)의 전장 IGFBP-1의 농도에 대한 상기 마커의 농도의 비율이 정상 산모보다 높은 산모 개체를 선별하는 단계를 포함하는 양수 내 염증/감염 진단을 위한 상기 마커의 측정방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 양수 내 염증/감염 진단용 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 마커 중 어느 하나의 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 생물 분자가 고형 기질에 집적된 양수 내 염증/감염 진단용 바이오칩을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 IGFBP-1(insulin-like growth factor binding protein-1)의 12 kDa, 14 kDa, 17 kDa, 21 kDa 및 23 kDa 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 포함하는 양수 내 염증/감염 진단용 마커를 제공한다.

본 발명자들은 산모의 양수를 채취하여, 염증이 있는 양수와 없는 양수로 구분하고(표 1 및 표 2 참조), 기존의 양수 내 염증/감염 진단 마커인 MMP-8을 대상 으로 염증 지수를 확인하였다. 상기 염증이 없는 양수 내에서 IGFBP-1은 전장의 형태(30 kDa)로 존재하였으나, 염증이 있는 양수에서는 조각 IGFBP-1 형태(12 kDa, 17 kDa 및 21 kDa)가 우세하였다(도 1 참조). 또한, 전장 IGFBP-1에 대한 조각 IGFBP-1의 비는 염증이 없는 양수에서보다, 염증이 있는 양수에서 의미 있게 높았다(도 2 및 도 6 참조). 조각/전장 IGFBP-1의 비가 높을수록 염증의 정도도 높은 상관관계를 나타내었다(도 3 참조). 또한, 생체 외 실험에서 외인성 rhIGFBP-1은 염증이 있는 양수에서 분해되었으나 염증이 없는 양수에서는 그렇지 않았다(도 4 참조). 아울러, 양수 내 전장 IGFBP-1은 외인성 인간 MMP-3(12 kDa, 21 kDa 및 23 kDa), MMP-8(12 kDa, 17 kDa 및 21 kDa) 및 MMP-9(12 kDa, 14 kDa, 17 kDa 및 21 kDa)에 의해 분해되었으며 이는 시간 의존적이었다(도 5 참조).

또한, 본 발명자들은 산모의 양수 및 질분비물을 채취하여, 염증이 있는 양수와 없는 양수로 구분하고(표 3 참조), 양수천자술 및 질분비물 채취 임신 주수로 보정한 전장 IGFBP-1에 대한 IGFBP-1 단편의 비율을 계산한 결과, 전장 IGFBP-1에 대한 전체 IGFBP-1 단편의 비율과 17 kDa 단편의 비율이 양수내 염증이 있는 경우에서 염증이 없는 경우보다 의미 있게 높았다.

이에, 상기 IGFBP-1의 12 kDa, 14 kDa, 17 kDa, 21 kDa 및 23 kDa 단편은 염증이 없는 양수에 비해 유의성 있게 발현량이 높음을 확인하였는바, 양수 내 염증/감염 진단용 마커로 사용될 수 있으며 상기 마커는 하나 또는 둘 이상을 동시에 진단에 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은

2) 단계 1)의 상기 마커의 농도가 정상 산모보다 높은 산모 개체를 선별하는 단계를 포함하는 양수 내 염증/감염 진단을 위한 상기 마커의 측정방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 산모의 염증이 있는 양수에서는 조각 IGFBP-1 형태(12 kDa, 17 kDa 및 21 kDa)가 우세하였다(도 1, 2 및 도 6 참조). 또한, 조각/전장 IGFBP-1의 비가 높을수록 염증의 정도도 높은 상관관계를 나타내었다(도 3 참조). 또한, 생체 외 실험에서 외인성 rhIGFBP-1은 염증이 있는 양수에서 분해되었으나 염증이 없는 양수에서는 그렇지 않았다(도 4 참조). 아울러, 양수 내 전장 IGFBP-1은 외인성 인간 MMP-3(12 kDa, 21 kDa 및 23 kDa), MMP-8(12 kDa, 17 kDa 및 21 kDa) 및 MMP-9(12 kDa, 14 kDa, 17 kDa 및 21 kDa)에 의해 분해되었으며 이는 시간 의존적이었다(도 5 참조). 또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 산모의 양수 및 질분비물을 채취하여 양수천자술 및 질분비물 채취 임신 주수로 보정한 전장 IGFBP-1에 대한 IGFBP-1 단편의 비율을 계산한 결과, 전장 IGFBP-1에 대한 전체 IGFBP-1 단편의 비율과 17 kDa 단편의 비율이 양수내 염증이 있는 경우에서 염증이 없는 경우보다 의미 있게 높았다(도 7 참조). 이에, 상기 마커의 발현량을 측정함으로써 양수 내 염증/감염 진단이 가능하다.

단계 1)에서 양수는 복식 양수천자를 이용하여 수득되고, 질분비물은 질 또 는 자궁경부에서 채취되며, 상기 질분비물은 양수포집기, 면봉, Dacron swab 또는 주사기 등 여러 가지 방법에 의해 채취될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서와 같이 면봉 등을 직장자궁오목에 삽입하여 채취할 수 있고, 또는 대한민국 제 0789849호의 양수포집기구를 이용하여 포집할 수 있다. 상기 시료는 마커의 탐지감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데 예를 들어 산모로부터 추출한 양수 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 1)의 측정은 2차원 전기영동, 바이오칩 또는 상기 마커 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 측정될 수 있으며, 상기 바이오칩은 바람직하게는 단백질칩 또는 핵산 어레이 등이 있다. 또한, 상기 마커 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 측정하는 방법에는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법 등이 있을 수 있다.

또한, 본 발명은

본 발명의 구체적인 실시예에서, 산모의 염증이 있는 양수에서는 조각 IGFBP-1 형태(12 kDa, 17 kDa 및 21 kDa)가 우세하였다(도 1 내지 2 참조). 또한, 조각/전장 IGFBP-1의 비가 높을수록 염증의 정도도 높은 상관관계를 나타내었다(도 3 참조). 또한, 생체 외 실험에서 외인성 rhIGFBP-1은 염증이 있는 양수에서 분해되었으나 염증이 없는 양수에서는 그렇지 않았다(도 4 참조). 아울러, 양수 내 전장 IGFBP-1은 외인성 인간 MMP-3(12 kDa, 21 kDa 및 23 kDa), MMP-8(12 kDa, 17 kDa 및 21 kDa) 및 MMP-9(12 kDa, 14 kDa, 17 kDa 및 21 kDa)에 의해 분해되었으며 이는 시간 의존적이었다(도 5 참조). 또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 산모의 양수 및 질분비물을 채취하여 양수천자술 및 질분비물 채취 임신 주수로 보정한 전장 IGFBP-1에 대한 IGFBP-1 단편의 비율을 계산한 결과, 전장 IGFBP-1에 대한 전체 IGFBP-1 단편의 비율과 17 kDa 단편의 비율이 양수내 염증이 있는 경우에서 염증이 없는 경우보다 의미 있게 높았다(도 7 참조). 이에, 상기 마커의 발현량을 측정함으로써 양수 내 염증/감염 진단이 가능하다.

단계 1)의 시료는 양수 또는 질분비물로, 상기 양수는 복식 양수천자를 이용하여 수득되고, 질분비물은 질 또는 자궁경부에서 채취되며, 상기 질분비물은 양수 포집기, 면봉, Dacron swab 또는 주사기 등 여러 가지 방법에 의해 채취될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서와 같이 면봉 등을 직장자궁오목에 삽입하여 채취할 수 있고, 또는 대한민국 제 0789849호의 양수포집기구를 이용하여 포집할 수 있다. 상기 시료는 마커의 탐지감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데 예를 들어 산모로부터 추출한 양수 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체화에서, 상기 시료가 양수인 경우, 단계 1)의 마커가 12 kDa 단편인 경우 단계 2)의 비율이 0.05 내지 0.18, 단계 1)의 마커가 17 kDa 단편인 경우 단계 2)의 비율이 0.05 내지 0.1 및 단계 1)의 마커가 21 kDa 단편인 경우 단계 2)의 비율이 0.2 내지 0.5이면, 양수 내 염증/감염이 있는 것으로 진단할 수 있다. 또한, 단계 2)에서 전장 IGFBP-1의 농도에 대한 상기 모든 마커의 농도의 총합의 비율이 0.4 내지 0.7이면, 양수 내 염증/감염이 있는 것으로 진단할 수 있다. 또한, 전체 조각에 대해 양수내 염증 진단의 이상적인 Cut-off는 0.537(민감도 80%, 특이도 78%); 21 kDa 조각에 대해 양수내 염증 진단의 이상적인 Cut-off는 0.28(민감도 77%, 특이도 75%); 17 kDa 조각에 대해 양수내 염증 진단의 이상적인 Cut-off는 0.08(민감도 66%, 특이도 72%); 및, 12 kDa 조각에 대해 양수내 염증 진단의 이상적인 Cut-off는 0.11(민감도 77%, 특이도 74%)이었다. 또한, 상기 시료가 질분비물인 경우, 단계 1)의 마커가 17 kDa 단편인 경우 단계 2)의 비율이 0.55 내지 0.6이면, 양수 내 염증/감염이 있는 것으로 진단할 수 있고, 단계 2)에서 전장 IGFBP-1의 농도에 대한 상기 모든 마커의 농도의 총합의 비율이 1.74 내지 1.83이면, 양수 내 염증/감염이 있는 것으로 진단할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 산모의 염증이 있는 양수에서는 조각 IGFBP-1 형태(12 kDa, 17 kDa 및 21 kDa)가 우세하였다(도 1 내지 2 참조). 또한, 조각/전장 IGFBP-1의 비가 높을수록 염증의 정도도 높은 상관관계를 나타내었다(도 3 참조). 또한, 생체 외 실험에서 외인성 rhIGFBP-1은 염증이 있는 양수에서 분해되었으나 염증이 없는 양수에서는 그렇지 않았다(도 4 참조). 아울러, 양수 내 전 장 IGFBP-1은 외인성 인간 MMP-3(12 kDa, 21 kDa 및 23 kDa), MMP-8(12 kDa, 17 kDa 및 21 kDa) 및 MMP-9(12 kDa, 14 kDa, 17 kDa 및 21 kDa)에 의해 분해되었으며 이는 시간 의존적이었다(도 5 참조). 또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 산모의 양수 및 질분비물을 채취하여 양수천자술 및 질분비물 채취 임신 주수로 보정한 전장 IGFBP-1에 대한 IGFBP-1 단편의 비율을 계산한 결과, 전장 IGFBP-1에 대한 전체 IGFBP-1 단편의 비율과 17 kDa 단편의 비율이 양수내 염증이 있는 경우에서 염증이 없는 경우보다 의미 있게 높았다(도 7 참조). 이에, 본 발명의 키트는 양수 내 염증/감영이 있는 산모와 정상 산모에게서 발현에 차이가 있는 상기와 같은 5개 마커 중 하나 이상의 마커를 정량하는데 사용하기 위해, 상기 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있고, 또는 두 종류 이상의 상기 특이적인 항체의 조합을 포함할 수 있다.

상기 키트는 양수 내 염증/감염 여부를 구별하여 의사 등 진료 행위자가 양수 내 염증/감염을 진단하는 것을 가능하게 할 뿐 아니라, 치료에 대한 환자의 반응을 모니터하여 그 결과에 따라 치료를 변경하는 것을 가능하게 한다. 또한, 양수 내 염증/감염 모델(예: 마우스, 랫트 등의 동물모델)의 생체 내 또는 생체 외에서 하나 이상의 마커의 발현을 조절하는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있다. 이에, 본 발명의 마커는 표준 물질로 상기 키트에 추가로 포함될 수 있다.

본 발명의 키트에 사용될 수 있는 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다.

다클론 항체는 상기 5개 마커 중 어느 하나를 동물에 주사하고 해당 동물로 부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다.

단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술 등이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; Cote RJ et al ., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al., Mol Cell Biol 62:109-120, 1984).

또한 상기 5개 마커 중 어느 하나에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작제하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al ., Science 254: 1275-1281, 1989).

상기 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로 필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.

또한, 환자로부터 수득된 시료를 고형 기질에 결합된 본 발명의 5개 마커 중 어느 하나의 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 경우, 시료는 항체와 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있다.

본 발명의 키트는 추가로 상기 마커에 특이적으로 결합하는 검출용 항체를 포함할 수 있다. 상기 검출용 항체는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지한 접합체(conjugate)일 수 있고, 바람직하게는 상기 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 1차 항체일 것이다. 예를 들어, 상기 발색효소는 퍼록시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 산성 포스파타제(acid phosphatase)(예: 양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase))일 수 있고; 형광물질인 경우, 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 등을 사용하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 키트는 추가로 (1) 상기 마커에 특이적으로 결합하는 검출용 항체 및 (2) 상기 검출용 항체에 결합할 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드에는 단백질 A 또는 검출용 항체에 특이적으로 결합 하는 2차 항체 등이 있다. 또한 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지한 접합체(conjugate)일 수 있다. 상기 검출용 항체는 상기 리간드를 위해, 바이오틴화(biotinylation) 또는 다이곡시제닌(digoxigenin) 처리한 1차 항체를 이용하는 것이 바람직하나, 상기 검출용 항체의 처리방법은 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 리간드로는 상기 검출용 항체에 결합하기 위해, 스트렙타비딘, 아비딘 등이 사용되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 진단 및 스크리닝용 키트는 상기 항체 및 마커 복합체에 검출용 항체를 처리한 후 검출용 항체의 양을 탐색함으로써 양수 내 염증/감염을 진단할 수 있다. 또는 상기 항체 및 마커 복합체에 검출용 항체 및 리간드를 순차적으로 처리한 후, 검출체용 항체의 양을 탐색함으로써 양수 내 염증/감염을 진단할 수 있다. 검출용 항체의 양 측정이나 존재 검출은 형광, 발광, 화학발광(chemiluminescence), 흡광도, 반사 또는 투과를 통해 이루어질 수 있다.

또한, 상기 검출용 항체 또는 리간드의 양을 탐색하는 방법으로는 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템을 이용하는 것이 바람직하고, 여기에는 검출체로 형광물질이 부착되어 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로 방사선 동위원소가 부착되어 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법; 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

예를 들어 상기 형광법은 형광 스캐너 프로그램을 이용하여 상기 검출용 항체를 형광물질로 라벨링한 후 스포팅하여 신호를 확인하는 방법으로, 이 방법을 적용하여 결합 정도를 확인할 수 있다. 상기 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 SPR 시스템은 형광법과는 달리 시료를 형광물질로 표지할 필요가 없이 항체의 결합 정도를 실시간으로 분석하는 것이 가능하나 동시다발적인 시료 분석이 불가능하다는 단점이 있다. SPRI의 경우에는 미세정렬 방법을 이용하여 동시다발적인 시료 분석이 가능하지만 탐지 강도가 낮은 단점이 있다.

또한, 본 발명의 진단용 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 추가로 포함할 수 있다. 분석을 위해 사용되는 시료는 양수 또는 질분비물로, 상기 양수는 복식 양수천자를 이용하여 수득되고, 질분비물은 질 또는 자궁경부에서 채취되며, 상기 질분비물은 양수포집기, 면봉, Dacron swab 또는 주사기 등 여러 가지 방법에 의해 채취될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서와 같이 면봉 등을 직장자궁오목에 삽입하여 채취할 수 있고, 또는 대한민국 제 0789849호의 양수포집기구를 이용하여 포집할 수 있다. 상기 시료는 마커의 탐지감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데 예를 들어 산모로부터 추출한 양수 시료는 음이온 교환 크로마토 그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

아울러, 본 발명은 상기 5개 단백질 중 어느 하나의 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 생물 분자가 고형 기질에 집적된 양수 내 염증/감염 진단용 바이오칩을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 산모의 염증이 있는 양수에서는 조각 IGFBP-1 형태(12 kDa, 17 kDa 및 21 kDa)가 우세하였다(도 1 내지 2 참조). 또한, 조각/전장 IGFBP-1의 비가 높을수록 염증의 정도도 높은 상관관계를 나타내었다(도 3 참조). 또한, 생체 외 실험에서 외인성 rhIGFBP-1은 염증이 있는 양수에서 분해되었으나 염증이 없는 양수에서는 그렇지 않았다(도 4 참조). 아울러, 양수 내 전장 IGFBP-1은 외인성 인간 MMP-3(12 kDa, 21 kDa 및 23 kDa), MMP-8(12 kDa, 17 kDa 및 21 kDa) 및 MMP-9(12 kDa, 14 kDa, 17 kDa 및 21 kDa)에 의해 분해되었으며 이는 시간 의존적이었다(도 5 참조). 또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 산모의 양수 및 질분비물을 채취하여 양수천자술 및 질분비물 채취 임신 주수로 보정한 전장 IGFBP-1에 대한 IGFBP-1 단편의 비율을 계산한 결과, 전장 IGFBP-1에 대한 전체 IGFBP-1 단편의 비율과 17 kDa 단편의 비율이 양수내 염증이 있는 경우에서 염증이 없는 경우보다 의미 있게 높았다(도 7 참조). 이에, 본 발명의 바이오칩은 양수 내 염증/감염이 있는 산모와 정상 산모에게서 발현에 차이가 있는 상기와 같 은 5개 단백질 중 하나 이상의 단백질을 측정하는데 사용하기 위해, 상기 5개 단백질 중 어느 하나의 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있고, 또는 두 종류 이상의 상기 특이적인 항체의 조합을 포함할 수 있다.

상기 생물 분자는 저분자 화합물, 리간드, 앱타머, 펩티드, 폴리펩티드, 특이적 결합 단백질, 고분자 물질 및 항체 등으로 이루어진 군으로부터 선택되며 상기 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 물질이면 무엇이든 사용 가능하며, 항체 또는 앱타머를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하며, 모노클로날 항체를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.

또한, 본 발명의 바이오칩의 고형 기질은 플라스틱, 유리, 금속 및 실리콘으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 그 표면에 상기 항체를 부착시키기 위해 화학 처리되거나 링커 분자가 결합하여 있을 수 있으나 이에 한정되 는 것은 아니다. 본 발명의 바이오칩은 시료에서 전체 단백질을 채취하여 바이오칩과 반응시켜 손쉽고 정확하게 양수 내 염증/감염 진단을 수행할 수 있다.

상기 바이오칩의 기판에 코팅된 활성기는 상기 물질을 결합하는 역할을 하며, 아민기(amine group), 알데하이드기(aldehyde group), 카르복실기(carboxyl group) 및 티올기(thiol group)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 당업자에게 단백질 분자를 기판에 결합할 수 있는 활성기로 알려진 모든 활성기가 사용 가능하며, 이제 한정되는 것은 아니다.

분석을 위해 사용되는 시료는 양수 또는 질분비물로, 상기 양수는 복식 양수천자를 이용하여 수득되고, 질분비물은 질 또는 자궁경부에서 채취되며, 상기 질분비물은 양수포집기, 면봉, Dacron swab 또는 주사기 등 여러 가지 방법에 의해 채취될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서와 같이 면봉 등을 직장자궁오목에 삽입하여 채취할 수 있고, 또는 대한민국 제 0789849호의 양수포집기구를 이용하여 포집할 수 있다. 상기 시료는 마커의 탐지감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데 예를 들어 산모로부터 추출한 양수 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 방법은 기존의 양수 내 염증/감염 진단 마커인 MMP-8과 높은 상관 관계를 나타냄으로, 양수 내 염증/감염 여부를 높은 민감도로 특이적인 진단에 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용을 한정하지는 않는다.

< 실시예 1> 연구대상 1

연구대상은 표 1에 기술한 바와 같은 특성의 조기 분만한 산모 20명이다. 양수 검체는 복부 양수천자술을 통하거나 제왕절개분만 중에 채취되었고, 원심분리를 거쳐 영하 70℃에서 폴리프로필렌 용기에 보관되었다. 양수 채취는 서면으로 된 사전동의 후에 이루어졌다. 본 기관의 의학연구윤리심의위원회(Institutional Review Board)는 연구 목적으로 이러한 환자에게서 생화학적 물질과 정보를 수집하는 것을 승인하였다.

총 20개의 양수 검체가 사용되었으며, 양수 내 염증은 양수 내 백혈구 수치, 양수 내 균 동정 및 태반의 병리학적 검사를 통한 조직학적 융모양막염을 검사 결과에 따라 진단되었다. 양수 내 염증은 다음과 같은 조건을 만족할 때로 정의하였다: 1) 양수 내 백혈구 수치가 1㎜³당 30개 초과인 경우; 2) 양수 내 균 동정 검사상 양성인 경우; 3) 양수검사 후 72시간 이내에 분만했을 시, 조직학적 융모양막염 이 있는 경우. 또한, 양수 내 염증의 세기는 ELISA kit(Amersham Pharmacia Biotech, 영국)를 이용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 양수 내 MMP-8의 농도를 측정함으로써 평가되었다. 상기 검사는 양수 내 염증을 진단하는데 가장 민감하고 특이한 것으로 알려져 있다. 상기 검사의 민감도는 0.3 ng/㎖이며, 검사 내 및 검사간(intra-assay 및 inter-assay) 계수는 각각 3.1%, 9.5%이었다.

연구대상 1의 특성

	염증이 없는 양수 (n=9)	염증이 있는 양수 (n=11)	P value
산모의 나이 (세), 중앙값(범위)	31 (23-34)	31 (25-43)	NS
초산인 산모의 수	6 (67%)	4 (36%)	NS
양수검사당시 임신 주수, 중앙값(범위)	32.1 (26.1-36.7)	31.1 (17.9-35.6)	NS
분만시 임신 주수, 중앙값(범위)	39.4 (36.1-41.4)	31.7 (18.1-35.7)	<.001
양수검사 적응증	-	-	NS
조기진통	6 (67%)	6 (55%)
조기양막파수	2 (22%)	4 (36%)
기타	1 (11%)	1 (9%)

< 실시예 2> 염증이 있는 양수 내 IGFBP -1 분절화 확인

<2-1> 웨스턴 블랏

조산한 산모에게서 채취한 20개의 양수 검체에서 웨스턴 블랏 방법으로 측정하였다.

구체적으로 1-2 ㎕의 인간 양수 검체를 SDS 완충용액에 희석하여 10분간 끓인 후, 13.5% SDS-PAGE 겔에서 전기영동 하였고, 겔 상의 단백질을 PVDF(polyvinylidene difloride; Millipore, USA)로 30 V, 400 ㎃, 1시간의 조건으로 전기영동 하여 옮긴 후, 4℃에서 5% 밀크 단백 용액에 밤새도록 담가 놓아 비특이 결합을 차단하였다. 상기 막을 Tween20이 0.1% 함유된 PBS로 5분씩 3회 세척한 뒤, 래빗 항-인간 IGFBP-1 다클론 항체 1:1,000(Upstate, USA)을 1.5시간 동안 상온에서 붙인 후, Tween20이 0.1% 함유된 PBS로 5분씩 3회 세척하였다. 이후 알칼라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase)가 결합된 산양의 항-토끼 항체 1:5,000(Zymed Laboratories, USA)을 1시간 동안 상온에서 붙인 후, Tween20이 0.1% 함유된 PBS로 5분씩 3회 세척하였다. BCIP/NBT 화학발광(chemiluminescent) 시약(Sigma, USA)을 사용하여 그 발색 정도를 X-ray 필름에 감광시켜 측정하였다.

<2-2> 덴시토미터 분석

웨스턴 블랏의 결과를 TINA 2.0 소프트웨어 프로그램(Raytest, 독일)을 이용하여 분석하였다. 상기 결과를 이용하여 전장 IGFBP-1에 대한 IGFBP-1 단편의 비율을 계산하였다. 상기 비율은 Mann-Whitney U-test로 비교하였고, P 값이 <0.05이면 유의한 것으로 하였다.

그 결과, IGFBP-1은 염증이 없는 양수 내에서 전장의 온전한 형태(분자량 30 kDa)로 존재하였다(도 1의 레인 1 내지 4). 그러나 염증이 있는 양수 내에서는 전장의 IGFBP-1은 감소하였고, 대신 21, 17, 및 12 kDa의 조각 IGFBP-1이 발견되었다(도 1의 레인 5 내지 8). 또한, 양수 내 염증이 있는 경우에는 양수 내 염증이 없는 경우에서보다 전장 IGFBP-1에 대한 IGFBP-1 단편의 비율이 의미 있게 높았다(도 2).

< 실시예 3> IGFBP -1의 분절과 양수 내 MMP -8의 관계 확인

인간 MMP-8의 양수 내 IGFBP-1 분해능력을 측정하기 위해, 2 ㎕ 양수(실시예 1에서 측정된 양수 내 MMP-8의 농도가 Low, 0.5, 158.9, 319.8, 633.3, 2199.9 및 5790.1인 경우), 50 mM Tris(pH 7.5) 용액(150 mM 염화나트륨, 10 mM 염화칼슘 및 0.05% Triton) 및 단백분해효소 인간 MMP-8 활성화를 위한 1 mM APMA(p-aminophenylmercuric acetate; Calbiochem, USA) 용액을 함께 37℃에서 12-24시간 동안 배양하였다(효소와 기질의 농도 비율은 1:1). SDS-PAGE 완충용액을 첨가한 후 혼합물을 끓임으로써 배양을 종료하였다. 상기 반응 결과를 실시예 2의 방법으로 웨스턴 블랏 및 덴시토미터 분석하였다.

그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 조각/전장 IGFBP-1의 비율이 높을수록 양수 내 MMP-8의 농도도 높아져서 강한 관련성을 나타내었다. 양수 내 염증이 없는 경우에는 조각 IGFBP-1의 농도가 낮았고(레인 1 및 레인 2), 양수 내 염증에 의해 MMP-8의 농도가 높아짐에 따라 조각 IGFBP-1이 증가하였고 전장 IGFBP-1은 감소하였다(도 3의 레인 3 내지 레인 7).

< 실시예 4> 양수 내에서 외인성 rhIGFBP -1의 단백분해 확인

양수 내 rhIGFBP-1이 단백분해됨을 확인하기 위해, 10 ㎕ 양수[염증이 있는 양수 2 검체(MMP-8 농도: 415.2, 2199.9 ng/㎖) 및 없는 양수 2 검체(MP-8 농도: <0.3 ng/㎖)], 100 ng rhIGFBP-1(R&D, USA) 및 50 mM Tris(pH 7.5) 용액을 함께 37℃에서 0, 6 및 12시간 동안 배양하였다. 환원(reducing) 완충용액(SDS-PAGE sample buffer)을 첨가한 후 혼합물을 끓임으로써 배양을 종료하였다. 상기 반응 시간별 결과를 실시예 2의 방법으로 웨스턴 블랏 및 덴시토미터 분석하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 염증이 있는 양수에서는 전장 rhIGFBP-1의 농도가 점차 감소하였고 12 kDa의 조각 IGFBP-1의 농도가 증가하였다. 그러나 염증이 없는 양수 내에서는 rhIGFBP-1 형태의 변화가 없었다.

< 실시예 5> 양수 내에서 외인성 MMP 에 의한 시간별 단백분해의 과정

외인성 MMP의 양수 내 IGFBP-1 분해능력을 측정하기 위해, 2 ㎕ 염증이 없는 양수, 외인성 인간 MMP-3, MMP-8 또는 MMP-9(Calbiochem, 독일), 50 mM Tris(pH 7.5) 용액 및 1 mM APMA 용액을 함께 37℃에서 0, 3, 6, 12 및 24시간 동안 배양하였다(효소와 기질의 농도 비율은 1:1). SDS-PAGE 완충용액을 첨가한 후 혼합물을 끓임으로써 배양을 종료하였다. 상기 반응 결과를 실시예 2의 방법으로 웨스턴 블랏 및 덴시토미터 분석하였다.

그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 양수 내 IGFBP-1이 외인성 인간 MMP-3, MMP-8 또는 MMP-9에 의해 시간의존적으로 분해됨을 확인하였다. MMP-3는 양수 내 전장 IGFBP-1을 23, 21, 및 12 kDa 조각으로 분할하였다. MMP-9은 21, 17 및 12 kDa 조각으로 단백분해 하였고, MMP-8은 양수 IGFBP-1을 21, 17, 14 및 12 kDa 등 4개의 조각으로 분해하였다. 그러나 대조군 양수에서는 양수 IGFBP-1 형태의 변화는 없었다.

< 실시예 6> 연구대상 2 및 염증이 있는 양수 내 IGFBP -1 분절화 확인

<6-1> 연구대상 2

서울대병원에 1993년 1월부터 1995년 7월까지 임신 35주 이전 조기진통으로 입원한 표 2에 기술한 바와 같은 특성의 103명을 대상으로 시행하였다. 양수 검체는 복부 양수천자술로 채취되었고, 원심분리를 거쳐 영하 70℃에서 폴리프로필렌 용기에 보관되었다. 양수 채취는 서면으로 된 사전동의 후에 이루어졌다. 본 기관의 의학연구윤리심의위원회(Institutional Review Board)는 연구 목적으로 이러한 환자에게서 생화학적 물질과 정보를 수집하는 것을 승인하였다.

실시예 1의 방법으로 측정한 양수내 MMP-8의 농도가 23 ng/㎖ 이상인 경우, 염증이 있는 것으로 진단되었다.

연구대상 2의 특성

	염증이 없는 양수 (n=68)	염증이 있는 양수 (n=35)	P value
산모의 나이 (세), 평균 ± 표준편차	29.1 ± 4.2	29.0 ± 4.1	NS
초산	59%	37%	<.05
양수검사 당시 임신 주수 중앙값(범위)	32.7 (21.0-35.1)	29.6 (22.3-35.1)	<.001
분만시 임신 주수, 중앙값(범위)	37.3 (21.4-41.7)	29.6 (22.4-38.3)	<.001

<6-2> 염증이 있는 양수 내 IGFBP -1 분절화 확인

실시예 2의 방법으로 103명의 양수 검체에서 IGFBP-1의 분절화를 확인한 후, 전장 IGFBP-1에 대한 IGFBP-1 단편의 비율을 계산하였다.

그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 양수내 염증이 있는 경우에는 양수내 염증이 없는 경우보다 조각 IGFBP-1 대 온전한 IGFBP-1의 비율이 의미 있게 높았다. 또한, 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 전체 조각의 비율은 각각 중앙값 0.75 vs. 중앙값 0.26이며; 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 21 kDa 조각의 비율은 각각 중앙값 0.51 vs. 중앙값 0.18이며; 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 17 kDa 조각의 비율은 각각 중앙값 0.10 vs. 중앙값 0.04이며; 및, 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 12 kDa 조각의 비율은 각각 중앙값 0.19 vs. 중앙값 0.04이었다.

또한, 전체 조각에 대해 중앙값 0.75에서 양수내 염증진단의 민감도 51%, 특이도 85%; 21 kDa 조각에 대해 중앙값 0.51에서 양수내 염증진단의 민감도 49%, 특이도 90%; 17 kDa 조각에 대해 중앙값 0.10에서 양수내 염증진단의 민감도 49%, 특이도 78%; 및, 12 kDa 조각에 대해 중앙값 0.19에서 양수내 염증진단의 민감도 49%, 특이도 89%이었다.

아울러, 전체 조각에 대해 양수내 염증진단을 위한 이상적인 Cut-off는 0.537(민감도 80%, 특이도 78%); 21 kDa 조각에 대해 양수내 염증진단을 위한 이상적인 Cut-off는 0.28(민감도 77%, 특이도 75%); 17 kDa 조각에 대해 양수내 염증진단을 위한 이상적인 Cut-off는 0.08(민감도 66%, 특이도 72%); 및, 12 kDa 조각에 대해 양수내 염증진단을 위한 이상적인 Cut-off는 0.11(민감도 77%, 특이도 74%)이었다.

< 실시예 7> 연구대상 3 및 염증이 있는 양수 및 질분비물 내 IGFBP -1 분절화 확인

<7-1> 연구대상 3

서울대병원에 1995년부터 2003년까지 임신 36주 이전 조기진통으로 입원한 표 3에 기술한 바와 같은 특성의 119명을 대상으로 시행하였다. 검사 시료인 양수 및 질분비물 채취는 서면으로 된 사전동의 후에 이루어졌다. 본 기관의 의학연구윤리심의위원회(Institutional Review Board)는 연구 목적으로 이러한 환자에게서 생화학적 물질과 정보를 수집하는 것을 승인하였다.

<7-2> 시료 채취

<7-2-1> 양수 시료

양수는 복부 양수천자 시술을 통해 채취하여, 마이코플라스마를 포함한 호기, 혐기성 세균 배양 검사를 시행하고 양수내 백혈구 수치를 측정하였고, 남은 양수는 원심분리를 거쳐 영하 70℃에서 폴리프로필렌 용기에 보관되었다.

<7-2-2> 질분비물 시료

다크론 면봉을 이용하여 직장자궁오목에 10초간 삽입하여 질분비물을 채취한 뒤, 1 ㎖ 완충 용액(1% bovine serum albumin in Tris buffer with ethylene-diamine-tetra-acetic acid 5 mmol/L, phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride 5 mmol/L, 및 0.5 trypsin-inhibitory unit aprotinin)에 담근 상태로 원심분리를 거쳐 영하 70℃에서 폴리프로필렌 용기에 보관되었다.

실시예 1의 방법으로 측정한 양수내 MMP-8의 농도가 23 ng/㎖ 이상인 경우, 염증이 있는 것으로 진단되었다. 그 결과, 표 3에서 나타난 바와 같이 양수내 염증이 있는 군에서 양수천자술 및 질분비물 채취 시기와 분만 주수가 유의하게 빨랐으며, 양수내 감염 및 태반의 조직학적 융모양막염의 빈도도 의미 있게 높았다.

연구대상 3의 특성

	염증이 없는 양수 AF MMP-8 < 23 (N=88)	염증이 있는 양수 AF MMP-8 > 23 (N=31)	P value
산모의 나이 (세), 중앙값(범위)	30(20-41)	30(22-43)	유의하지 않음
양수검사 당시 임신 주수, 중앙값(범위)	31.9 (19.3-36.6)	29.9 (22.7-35.6)	0.053
분만시 임신 주수, 중앙값(범위)	37.5 (27.3-41.6)	30.6 (22.7-38.3)	< 0.001
출생시 체중 (g), 중앙값(범위)	2800 (948-4210)	1850 (620-3140)	< 0.001
초산부 (%)	59.1	54.8	유의하지 않음
양수 배양 양성(%)	1.1	9.7	0.054
조직학적 융모양막염 (%)	21.3	57.7	0.001

<7-3> 염증이 있는 양수 및 질분비물 내 IGFBP -1 분절화 확인

실시예 2의 방법으로 119명의 양수 및 질분비물 검체에서 IGFBP-1의 분절화를 확인한 후, 전장 IGFBP-1에 대한 IGFBP-1 단편의 비율을 계산하였다.

그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 양수천자술 및 질분비물 채취 임신 주수를 보정하면, 전체 조각과 17 kDa 조각에 대해서만 온전한 IGFBP-1과의 비율에서 양수내 염증이 있는 경우에서 염증이 없는 경우보다 의미 있게 높았다: 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 전체 조각 비율은 각각 중앙값 1.72 vs. 중앙값 1.85이며; 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 21 kDa 조각의 비율은 각각 중앙값 0.65 vs. 중앙값 0.72이며; 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 17 kDa 조각의 비율은 각각 중앙값 0.51 vs. 중앙값 0.62이며; 및, 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 12 kDa 조각의 비율은 각각 중앙값 0.43 vs. 중앙값 0.42이었다.

도 1은 양수 내 전장 또는 조각 IGFBP-1을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 도이다:

레인 1 ~ 4: 염증이 없는 양수; 및,

레인 5 ~ 8: 염증이 있는 양수.

도 2는 양수 내 전장에 대한 조각 IGFBP-1의 양의 비율을 나타낸 도이다:

a: 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 전체 조각의 비율은 각각 중앙값 0.41(범위, 0.13-0.69) vs. 중앙값 3.0(범위, 1.17-8.77)이며;

b: 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 21 kDa 조각의 비율은 각각 중앙값 0.33(범위, 0.13-0.49) vs. 중앙값 1.57(범위, 0.73-3.75)이며;

c: 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 17 kDa 조각의 비율은 각각 중앙값 0.05(범위, 0.00-0.15) vs. 중앙값 0.60(범위, 0.21-3.35)이며; 및,

d: 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 12 kDa 조각의 비율은 각각 중앙값 0.06(범위, 0.00-0.15) vs. 중앙값 0.34(범위, 0.17-1.67).

도 3은 양수 내 MMP-8 농도에 따른 양수 IGFBP-1의 분해 정도를 나타낸 도이다:

a: 웨스턴 블랏 분석 및 덴시토미터 측정 결과; 및,

b: MMP-8 농도와 조각/전장 IGFBP-1 비율의 관계(r=0.86; p<0.001; Spearman rank correlation test).

도 4는 양수 내에서 외인성 rhIGFBP-1의 단백분해를 확인한 결과를 나타낸 도이다:

a: 염증이 없는 양수; 및,

b: 염증이 있는 양수.

도 5는 양수 내에서 외인성 MMP에 의한 시간별 단백분해의 과정을 확인한 결과를 나타낸 도이다:

a: 대조군(염증이 없는 양수);

b: 외인성 MMP-3를 첨가;

c: 외인성 MMP-9를 첨가; 및,

d: 외인성 MMP-8을 첨가.

도 6은 양수 내 전장에 대한 조각 IGFBP-1의 양의 비율을 나타낸 도이다:

a: 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 전체 조각의 비율은 각각 중앙값 0.75 vs. 중앙값 0.26이며;

b: 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 21 kDa 조각의 비율은 각각 중앙값 0.51 vs. 중앙값 0.18이며;

c: 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 17 kDa 조각의 비율은 각각 중앙값 0.10 vs. 중앙값 0.04이며; 및,

d: 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 12 kDa 조각의 비율은 각각 중앙값 0.19 vs. 중앙값 0.04.

도 7은 양수 내 전장에 대한 조각 IGFBP-1의 양의 비율을 나타낸 도이다(p* 값: 질분비물 및 양수천자술을 시행한 임신 주수를 보정하였을 때의 p 값):

a: 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 21 kDa 조각의 비율은 각각 중앙값 1.72 vs. 중앙값 1.85이며;

b: 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 17 kDa 조각의 비율은 각각 중앙값 0.65 vs. 중앙값 0.72이며;

c: 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 12 kDa 조각의 비율은 각각 중앙값 0.51 vs. 중앙값 0.62이며; 및,

d: 염증이 없는 양수 및 염증이 있는 양수에서의 전장에 대한 전체 조각의 비율은 각각 중앙값 0.43 vs. 중앙값 0.42.

Claims

IGFBP-1(insulin-like growth factor binding protein-1)의 12 kDa, 14 kDa, 17 kDa, 21 kDa 및 23 kDa 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 포함하는 양수 내 염증/감염 진단용 마커.
제 1항에 있어서, 상기 마커는 하나 또는 둘 이상을 동시에 진단 및 스크리닝에 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 마커.
1) 산모 개체로부터 분리된 양수 또는 질분비물 시료 내의 제 1항의 마커 중 하나 이상의 농도를 측정하는 단계;

2) 단계 1)의 상기 마커의 농도가 정상 산모보다 높은 산모 개체를 선별하는 단계를 포함하는 양수 내 염증/감염 진단을 위한 상기 마커의 측정방법.
제 3항에 있어서, 단계 1)의 질분비물은 질 또는 자궁경부로부터 채취하는 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단을 위한 상기 마커의 측정방법.
제 3항에 있어서, 단계 1)의 질분비물은 양수포집기, 면봉, Dacron swab 또는 주사기에 의해 채취하는 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단을 위한 상기 마커의 측정방법.
제 3항에 있어서, 단계 1)의 측정은 2차원 전기영동, 바이오칩 또는 상기 마커 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단을 위한 상기 마커의 측정방법.
1) 산모 개체로부터 분리된 시료 내의 제 1항의 마커 중 하나 이상 및 전장 IGFBP-1의 농도를 측정하는 단계;

2) 단계 1)의 전장 IGFBP-1의 농도에 대한 상기 마커의 농도의 비율이 정상 산모보다 높은 산모 개체를 선별하는 단계를 포함하는 양수 내 염증/감염 진단을 위한 상기 마커의 측정방법.
제 7항에 있어서, 단계 1)의 시료는 양수인 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단을 위한 상기 마커의 측정방법.
제 7항에 있어서, 단계 1)의 시료는 질분비물인 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단을 위한 상기 마커의 측정방법.
제 9항에 있어서, 질분비물은 질 또는 자궁경부로부터 채취하는 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단을 위한 상기 마커의 측정방법.
제 9항에 있어서, 양수포집기, 면봉, Dacron swab 또는 주사기에 의해 채취하는 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단을 위한 상기 마커의 측정방법.
제 8항에 있어서, 단계 1)의 마커가 12 kDa 단편인 경우 단계 2)의 비율이 0.05내지 0.18이면, 양수 내 염증/감염이 있는 것으로 진단되는 것을 특징으로 하는 상기 마커의 측정방법.
제 8항에 있어서, 단계 1)의 마커가 17 kDa 단편인 경우 단계 2)의 비율이 0.05 내지 0.1이면, 양수 내 염증/감염이 있는 것으로 진단되는 것을 특징으로 하는 상기 마커의 측정방법.
제 8항에 있어서, 단계 1)의 마커가 21 kDa 단편인 경우 단계 2)의 비율이 0.2 내지 0.5이면, 양수 내 염증/감염이 있는 것으로 진단되는 것을 특징으로 하는 상기 마커의 측정방법.
제 8항에 있어서, 단계 2)에서 전장 IGFBP-1의 농도에 대한 상기 모든 마커의 농도의 총합의 비율이 0.4 내지 0.7이면, 양수 내 염증/감염이 있는 것으로 진단되는 것을 특징으로 하는 상기 마커의 측정방법.
제 9항에 있어서, 단계 1)의 마커가 17 kDa 단편인 경우 단계 2)의 비율이 0.55 내지 0.6이면, 양수 내 염증/감염이 있는 것으로 진단되는 것을 특징으로 하는 상기 마커의 측정방법.
제 9항에 있어서, 단계 2)에서 전장 IGFBP-1의 농도에 대한 상기 모든 마커 의 농도의 총합의 비율이 1.74 내지 1.83이면, 양수 내 염증/감염이 있는 것으로 진단되는 것을 특징으로 하는 상기 마커의 측정방법.
제 7항에 있어서, 단계 1)의 측정은 2차원 전기영동, 바이오칩 또는 상기 마커 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 상기 마커의 측정방법.
제 1항의 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 양수 내 염증/감염 진단용 키트.
제 19항에 있어서, 상기 마커가 추가적으로 포함되는 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 키트.
제 19항에 있어서, 분석을 위한 시료는 양수 또는 질분비물인 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 키트.
제 21항에 있어서, 질분비물은 질 또는 자궁경부로부터 채취하는 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 키트.
제 21항에 있어서, 질분비물은 양수포집기, 면봉, Dacron swab 또는 주사기에 의해 채취하는 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 키트.
제 19항에 있어서, 상기 항체는 고체 기질(solid substrate)에 결합되는 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 키트.
제 19항에 있어서, 상기 마커에 결합하는 검출용 항체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 키트.
제 25항에 있어서, 상기 검출용 항체는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 및 콜로이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 검출체가 부착된 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 키트.
제 26항에 있어서, 상기 검출용 항체는 i) SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법, 또는 ii) 검출용 항체에 부착된 형광표지에 의한 형광을 검출함으로써 양이 측정되는 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 키트.
제 27항에 있어서, 상기 검출용 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 키트.
제 28항에 있어서, 상기 리간드는 단백질 A 또는 검출용 항체에 특이적으로 결합하는 2차 항체인 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 키트.
제 28항에 있어서, 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 및 콜로이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 검출체가 부착된 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 키트.
제 30항에 있어서, 상기 리간드는 i) SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법, 또는 ii) 리간드에 부착된 형광표지에 의한 형광을 검출함으로써 양이 측정되는 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 키트.
제 1항의 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 생물 분자가 고형 기질에 집적된 양수 내 염증/감염 진단용 바이오칩.
제 32항에 있어서, 상기 생물 분자는 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 바이오칩.
제 32항에 있어서, 상기 고형 기질은 플라스틱, 유리, 금속 및 실리콘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 바이오칩.
제 32항에 있어서, 분석을 위한 시료는 양수 또는 질분비물인 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 바이오칩.
제 35항에 있어서, 질분비물은 질 또는 자궁경부로부터 채취하는 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 바이오칩.
제 35항에 있어서, 질분비물은 양수포집기, 면봉, Dacron swab 또는 주사기에 의해 채취하는 것을 특징으로 하는 양수 내 염증/감염 진단용 바이오칩.