KR20090121428A - 씨형간염 바이러스 중합효소의 작용을 저해하는 화합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 C형 간염바이러스 매개 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서 보다 상세하게는 하기 화학식 (도 1)의 화합물을 유효성분으로 포함하는 C형 간염바이러스 매개 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 C형 간염바이러스의 RNA 중합효소의 활성을 저해하는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 화합물은 C형 간염바이러스에 의한 간염 등 간질환의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물의 제조에 사용할 수 있다.

화학식= 도 1

C형 간염, 간염바이러스, 예방, 치료

Description

씨형간염 바이러스 중합효소의 작용을 저해하는 화합물{A chemical compound inhibiting NS5B polymerase activity of hepatitis c virus}

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본 발명은 C형 간염바이러스 매개 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서 보다 상세하게는 하기 도 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 C형 간염바이러스 매개 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

C형 간염바이러스(Hepatitis C virus; HCV)는 1989년에 최초로 발견된 바이러스로 급성 또는 만성간염, 간경변 및 간암 등 간질환의 중요한 원인바이러스 중 하나이다(Choo Q, et al, Science 244: 359-362, 1989; Kuo, G. et al., Science, 244: 362-364, 1989). C형 간염바이러스는 주로 비경구적(非經口的)인 경로로 전파되며, B형 간염바이러스의 경우와 마찬가지로 바이러스에 오염된 주사침이나 바늘, 수혈, 오염된 혈액제제 등에 의해서 전파된다.

C형 간염바이러스에 감염되면, 평균 7주 정도의 잠복기를 거쳐 급성 간염 증상이 나타나게 되며, 간세포가 손상되어 ALT 수치 등이 증가하게 된다. 이 후 급성간염 증상이 완화되면서, 만성 간염으로 이행되게 되는데, C형 간염바이러스의 경우 만성화율이 대단히 높아서, 급성 C형 간염 후 약 80 내지 90%의 환자들이 만성 간염으로 이행된다(Kuo, G. et al., Science, 244: 362-364, 1989). 또한, 만성 C형 간염의 약 20%가 간경변으로 진행하게 된다(Camps J et al., Gut, 34: 1714 - 1717, 1993).

상기 C형 간염바이러스는 간염, 간경변 및 간암 등 간질환에 중요한 원인균으로서, 그 예방이나 치료가 중요한 데에 비해, 바이러스의 변이가 심하여 아직까지 효과적인 치료제나 백신이 개발되지 못하고 있다. 현재 C형 간염바이러스의 치료를 위해서 인터페론-α(interferon-α)을 단독으로 투여하거나 인터페론-α를 리바비린(ribavirin)과 병용하여 투여하는 방법이 사용되고 있다. 그러나, 이 두 가지 약물은 C형 간염바이러스에 특이적인 것이 아니며, 치료 유지율이 낮고, 심각한 부작용(예, 망막증, 갑상선염, 급성췌장염, 및 우울증)들을 유발하며, 모든 C형 간염 환자에게 효과를 보는 것이 아니어서 환자의 상태나 바이러스 계통(strain)에 따라 상이한 효과가 나타난다. 따라서, 이러한 한계를 극복한 C형 간염바이러스 감염 치료에 효과적인 새로운 항바이러스제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

따라서, C형 간염바이러스에 대한 예방 및 치료제를 개발하기 위하여, C형 간염바이러스의 증식에 특이적인 단백질을 목표(target)로 하는 연구가 이루어져 왔다. C 형 간염바이러스는 3,010개의 아미노산으로 구성된 한 개의 복합단백질(polyprotein)로부터 최소한 10개의 단백질을 생성하는데, 이러한 단백질은 C(core protein), E1(envelope protein1), E2(envelope protein2)와 같은 구조 단백질과 최소한 7종의 비구조 단백질(non-structural protein; NS)로 나뉘어 진다.

그 중 NS3 및 NS5B 단백질의 특성에 대해서 많은 연구가 이루어져 왔다. NS3는 두가지 기능을 하는 단백질로서, NS3의 N 말단 부분은 단백질 가수분해 효소의 활성을 가져서 바이러스 단백질을 자르는 역할을 하고, C 말단 부분은 헬리카제 활성을 가져서 이 바이러스의 RNA 복제시에 간헐적으로 나타나는 이중나선을 풀어주는 역할을 한다. NS5B는 RNA복제를 담당하는 RNA 의존적 RNA 중합효소(RNA dependent RNA polymerase)로서, 바이러스 게놈 RNA의 5 UTR(untranslated region)을 인식하여 (-)사슬 RNA를 합성하며, 3 UTR을 인식하여 (+)사슬 RNA를 합성하게 된다.

따라서, C형 간염바이러스의 증식에 필수적인 NS3 또는 NS5B의 기능을 저해하여 C형 간염을 예방 또는 치료하려는 시도가 있어 왔으나(Stuyver L. et al., Antimicrobial agents and chemotherapy, 47: 244-254, 2003) 아직 효율적인 치료제는 개발되지 않은 실정이다.

이에 본 발명자들은 새로운 C형 간염바이러스 매개 간질환 예방 및 치료제를 개발하기 위하여 연구한 결과, 하기 화학식 (도 1)으로 표시되는 본 발명의 화합물 이 C형 간염바이러스의 RNA 중합효소에 대하여 우수한 저해활성을 갖는다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 C형 간염바이러스 매개 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

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이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 화합물은 C형 간염바이러스의 RNA 중합효소의 활성을 저해하는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 화합물은 C형 간염바이러스에 의한 간염 등 간질환의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물의 제조에 사용할 수 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 C형 간염바이러스의 RNA 중합효소에 대해 우수한 저해활성을 가지는 C형 간염바이러스 매개 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 약학적 조성물은 하기 화학식 (도 1)의 화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 화학식 (도 1)의 화합물은 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나(예를 들면, 켐브리지사(ChemBridge, 미국)에서 구입) 또는 당 업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 화학식 (도 1)의 화합물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 C형 간염바이러스에 의해 매개되는 간질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 화학식 (도 1)의 화합물의 약학적으로 유효한 양으로는 0.1 μg/day/체중kg 내지 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 1 μg/day/체중kg 내지 10 mg/day/체중kg이다. 그러나, 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다.

상기에서 약학적으로 허용되는 담체로는 모든 약제학적으로 사용되는 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물이 적용될 수 있는 질환은 C형 간염바이러스 매개 간질환이다. 상기 간질환은 C형 간염바이러스에 의해 유발되는 것이며, 이에 제한되지는 않으나, 급성 C형 간염, 만성 C형 간염, 간경변, 간암 등을 포함한다.

C형 간염바이러스는 (+)사슬인 RNA 게놈을 가진 바이러스이며, 게놈의 복제를 위해서는 템플릿(template)역할을 하는 (-)사슬 RNA가 합성되어야 하며, (-)사슬 RNA에서 (+)사슬 RNA가 합성되어야 한다. 이러한 합성에 관여하는 단백질이 C형 간염바이러스가 가지고 있는 NS5B, 즉 RNA 의존적 RNA 중합효소(RNA dependent RNA polymerase)이다. 따라서, 상기 RNA 중합효소의 활성을 저해하면 C형 간염바이러스의 증식이 억제되며, 그 결과 C형 간염바이러스에 의해 유발되는 간질환 등 각종 질환을 예방 또는 치료할 수 있게 된다.

한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 적합한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 경피 투여는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.

흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 간질환을 예방 또는 치료하는 효과를 가지는 인터페론-α 또는 리바비린과 같은 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다

본 발명의 일실시예에서는 화합물 라이브러리에서 NS3 헬리카제 및 NS5B RNA 중합효소로 이루어진 C형 간염바이러스 자가복제 효소활성을 저해하는 물질을 선별하였다.

한편, 본 발명의 다른 실시예에서는 상기 선별된 물질의 C형 간염바이러스 RNA 중 합효소의 저해활성을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 화합물이 RNA 중합효소 저해활성을 보였다.

따라서, 본 발명은 C형 간염바이러스 RNA 중합효소에 대해 우수한 저해활성을 가지는 C형 간염바이러스 매개 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

C형 간염바이러스 자가복제 효소에 대한 저해활성을 가지는 화합물의 분리

C형 간염바이러스 자가복제 효소활성의 측정은 다음과 같은 방법으로 수행되었다. 대장균(기탁번호 KCTC10094BP)을 LB 배지(0.5% 효모 추출물(yeast extract), 1% 트립톤, 1% NaCl)에서 OD가 0.6이 되도록 37℃의 진탕조건 하에서 배양하였다. 배지에 IPTG를 1mM이 되도록 첨가하고 2시간 동안 다시 37℃의 진탕조건 하에서 배양하였다. 화합물 라이브러리 상의 각 화합물 20mM를 각각의 배지에 첨가하고 2시간 동안 다시 37℃의 진탕조건 하에서 배양하였다. 이 때 대조군으로는 상기 화합물을 첨가하지 않고 배양한 것을 사용하였다.

배양이 끝난 배양물을 원심분리하여 세포를 수집하고, 증류수로 1회 세척하였다. 세포를 세포용해완충액(30mM Tris-EDTA(pH 8.0), 20% sucrose, 1 mg/ml 리소자임(lysozyme))으로 파괴한 뒤 실온에서 10분간 방치하였다. 루시퍼라제에 의한 발광도는 스테디글로 키트(steadyglo; Promega, USA)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 측정하였다.

MTT 분석법에 의한 비독성 또는 저독성 화합물의 선별은 다음과 같은 방법으로 수행되었다. PBS 버퍼에 현탁한 Huh-7 세포(2.5X10³ cells/well)에 각 화합물 20μM를 넣은 후 37℃, 5% CO₂ 하에서 3일간 배양하였다. 이 때 대조군으로는 화합물을 넣지 않은 것을 사용하였다. 배양 후 MTT 용액(2mg/ml) 20μl를 각 세포 배양액에 투여한 후 24시간 동안 다시 배양하였다. 10% SDS 용액 100μl를 각 세포 배양액에 넣은 후 37℃, 5% CO₂ 하에서 하룻밤 방치하고, 이를 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

<실시예 2>

C 형간염 바이러스 RNA 중합효소에 대한 저해활성 측정

상기 실시예 1에서 선별된 화합물의 C형간염 바이러스 RNA 중합효소에 대한 저해활 성을 측정하기 위해 [³²P]-UTP 혼입법([³²P]-UTP incorporation assay)를 수행되었다.

최종농도가 20 mM Tris-HC(pH 7.5), 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM EDTA인 버퍼에 5 μCi [³²P]-UTP, 50 μM UTP, 5 μg/ml poly(A)-oligo(U)를 첨가한 후, 화합물을 1, 5 및 10μM가 되도록 혼합하였다. 대조군으로는 본 발명의 화합물이 첨가되지 않은 것을 사용하였다.

이상의 각각의 시료에 대장균에서 과다발현시킨 후 흡착크로마토그래피로 분리한 1μg의 C형간염 바이러스 RNA 중합효소를 첨가한 후 30℃에서 90분 동안 반응을 수행하였다. 반응 후 EDTA를 최종농도가 100 mM이 되도록 첨가하여 RNA 중합효소의 중합반응을 중단시켰다.

각 반응물은 플라스미드 SV 미니(Plasmid SV Mini; 제너랄바이오시스템사, 한국) 키트를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 분리하였다. 이를 상세히 설명하면 다음과 같다. 반응이 끝난 각 반응 튜브에 최종반응물에 5배 부피의 PB 버퍼(키트 제조사 제공)를 혼합한 후 각각 퀵 스핀 컬럼(Quick Spin column; Generalbiosystem, 한국)에 옮겼다. 상기 컬럼을 10,000 ×g로 30초 동안 원심분리하여 혼입되지 않 은(un-incorporated) [³²P]-UTP를 제거하였다. 각 컬럼에 NW 버퍼(키트 제조사 제공) 700 μl를 넣고 10,000 ×g로 30초 동안 원심분리하여 세척하였다. 각 컬럼을 다시 10,000 ×g로 2분 동안 원심분리하여 컬럼에 남아 있는 에탄올을 제거하였다. 각 컬럼에 100 μl의 EB 버퍼(키트 제조사 제공)를 넣고 1분 동안 실온에서 방치한 후, 10,000 ×g로 1분 동안 원심분리하여 [³²P]-UTP가 혼입된(incorporated) 주형(template)을 용리(elution)시킨 다음, 신틸레이션 계수기(scintillation counter; Pharmacia, 미국)로 cpm(count per minute)값을 측정하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.

상기 도 2의 결과를 바탕으로 본 화합물의 IC₅₀값을 구한 결과 0.9μM임을 알 수 있었다.

<제조예 1>

본 발명의 화합물을 포함하는 정제의 제조

본 발명의 화합물 각각 250mg을 부형제 직타용 락토즈 260mg과 아비셀(미결정 셀룰로오스) 35mg, 붕해 보조제인 나트륨 전분 글리코네이트 15mg, 결합제인 직타용 L-HPC(Low- hydroxyprophylcellulose) 80mg과 함께 U형 혼합기에 넣고 20분간 혼합하였다. 혼합이 완료된 후 활탁제로서 마그네슘 스테아레이트 10mg을 추가로 첨가하 고 3분간 혼합하였다. 정량시험과 항습도 시험을 거쳐 타정하고 필름 코팅하여 정제를 각각 제조하였다.

<제조예 2>

본 발명의 화합물을 포함하는 시럽제의 제조

일정량의 물에 적당량의 백당을 용해시키고 여기에 보존제로서 파라옥시메틸벤조에이트 80mg 및 파라옥시프로필벤조에이트 16mg을 가하고 본 발명의 화합물을 각각 450mg씩 넣고 60℃로 유지시키면서 완전히 용해한 후 냉각시키고 증류수를 가해 150ml로 만들어 0.3% 시럽제를 각각 제조하였다.

도 1은 본 발명의 화합물의 화학식이다.

도 2는 본 발명의 화합물의 농도에 따른 C형 간염바이러스 RNA 중합효소에 대한 저해 활성을 나타낸 그래프이다. #10= 본 발명의 화합물 (도 1)

Claims (1)

1. 화학식 (도 1)의 화합물을 유효성분으로 포함하는 C형 간염바이러스 매개 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.

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