KR20090111843A

KR20090111843A - Ｔｇｆ-베타의 제어 방출용 피브린 겔 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20090111843A
Application number: KR1020097017075A
Authority: KR
Inventors: 이사벨 캐틀라스; 샘 엘. 헬거손
Original assignee: 백스터 인터내셔널 인코포레이티드; 박스터 헬쓰케어 에스.에이.
Priority date: 2007-01-18
Filing date: 2008-01-18
Publication date: 2009-10-27
Also published as: CA2675157A1; CN101730539A; AU2008206052A1; CO6220838A2; MX2009007688A; JP2010516703A; WO2008089466A2; US20080181879A1; WO2008089466A3; EP2142222A2; BRPI0806622A2

Abstract

본 발명은, 일반적으로, 근골격계 장애, 예컨대 골 및 연골 장애, 연조직 장애 및 심장혈관계 질환을 포함하는, 치료적 적용을 위하여 동일계 내 제어 방출을 위한 전환성장인자-베타(TGF-β)를 함유하는, 피브린 실란트에 관한 것이다.

TGF-β 단백질, 피브린 실란트, 방출 속도

Description

ＴＧＦ-베타의 제어 방출용 피브린 겔 및 이의 용도{FIBRIN GEL FOR CONTROLLED RELEASE OF TGF-BETA AND USES THEREOF}

본 출원은 본 명세서에 그 전체가 참고로 포함되는, 2007년 1월 18일자로 출원된 미합중국 가특허 출원 제60/881,452호 및 2007년 6월 13일자로 출원된 미합중국 가특허 출원 제60/934,457호의 우선권 이익을 주장한다.

본 발명은, 일반적으로, 근골격계 및 심장혈관계 질환을 비롯한 치료적 적용에 있어 동일계 내 제어 방출(controlled release in situ)을 위한 전환성장인자-베타(TGF-β) 함유 피브린 실란트에 관한 것이다.

피브린 실란트는 인간 혈액-응고 단백질로부터 제조되고, 전형적으로 출혈을 조절하기 위해 수술 중에 사용되는 수술용 "아교"의 일종이다. 이러한 실란트 내 성분들은 적용 중에 상호작용하여 혈액 단백질 피브린으로 구성되는 안정한 응괴를 형성한다. 피브린 실란트는 현재 여러 가지 다른 목적으로, 예컨대 수술이 진행 중인 부위에서의 출혈을 조절하고, 상처 치유를 촉진시키고, 공동의(hollow) 신체 장기를 밀봉하거나 표준 봉합에 의해 만들어지는 구멍을 피복하고, 수술 중에 노출된 조직에 약물의 서-방출(slow-release) 전달을 제공하기 위해 수술 중에 사용된다.

피브린 실란트는 일반적으로 2종의 인간 혈장-유래 성분: (a) 촉매량의 인자 XIII 및 플라스미노겐과 함께 일차적으로 피브리노겐 및 피브로넥틴으로 구성되는 고도로 농축된 피브리노겐 복합체(FC) 및 (b) 고역가 트롬빈으로 이루어진다. 피브린 실란트는 또한 아프로티닌을 함유할 수 있다. 트롬빈의 작용에 의해, (가용성) 피브리노겐은 먼저 피브린 단량체로 전환되고, 피브린 단량체는 자발적으로 응집되어 소위 피브린 응괴를 형성한다. 동시에, 상기 용액 내에 존재하는 인자 XIII(FXIII)가 칼슘 이온의 존재 하에서 트롬빈에 의해 인자 XIIIa로 활성화된다. 응집된 피브린 단량체 및 존재할 수 있는 임의의 잔존하는 피브로넥틴은 가교되어 새로운 펩티드 결합 형성에 의해 고분자 중합체를 형성한다. 이러한 가교 반응에 의해, 형성되는 응괴의 강도가 실질적으로 증가한다. 일반적으로, 응괴는 상처 및 조직 표면에 잘 부착하여 접착 및 지혈 효과를 유발한다(미합중국 특허 제7,241,603호). 따라서 피브린 접착제는 부가적으로 칼슘 이온을 함유하는 트롬빈 성분과 함께 피브리노겐 복합체(FC) 성분을 포함하는 이-성분 접착제로서 종종 사용된다.

피브린 실란트의 특별한 장점은 이 접착제/겔이 이물질로서 그의 적용 부위에 잔존하지 않고, 선천적인 상처 치유에서와 같이 완전히 흡수되어 새로 형성된 조직으로 대체된다는 것이다. 다양한 세포들, 예를 들어, 대식세포 및, 이어서, 섬유아세포가 겔 내로 이동하고, 겔 물질을 용해시키고 재흡수하여 새로운 조직을 형성한다. 피브린 실란트는 동일계 내에서 피브린 겔을 형성하는데 사용되어 왔고, 이러한 피브린 겔은 세포 및 성장 인자의 전달을 위해 사용되어 왔다(Cox 등, Tissue Eng 10(5-6): 942-954, 2004; Wong 등, Thromb Haemost 89: 573-582, 2003).

조직 수복을 위해서는, 성장 인자 및 세포를 피브린 겔과 같은 기질 내에 위치시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 피브린 기질은 우태아혈청, 산호 과립, 및 리포솜을 포함하는 다양한 복합 혼합물 내에서 TGF-β의 전달을 위해 사용되어 왔다(Fortier 등, Am J Vet Res 58(1): 66-70, 1997; Arnaud 등, Chirurgie Plastique Esthetique 39(4): 491-498, 1994; Arnaud 등, Calcif Tissue Int 54: 493-498, 1994; Giannoni 등, Biotechnology and Bioengineering 83(1): 121-123, 2003). 피브린 겔로부터 성장 인자를 전달하기 위한 대안적인 수단으로 트랜스글루타미나제 기질, 항체, 및 상기 성장 인자에 결합된 VEGF 단편을 포함하는 접합체가 포함된다(예를 들어, 그 전체가 참고로 본원에 포함되는, 미합중국 특허 제6,506,365호; 미합중국 특허 제6,713,453호 및 미합중국 특허공개 제2003/0012818호 참조). 또한, 피브린 겔은 기질 내 FC 및 트롬빈의 농도에 따라 세포(예를 들어, 인간 중간엽 줄기세포(HMSC))의 성장 및 증식과, 어느 정도까지는, 골형성 분화를 유도하는 것으로 나타났다(Catelas 등, Tissue Eng 12(8): 2385-2396, 2006).

성장 인자를 체내의 특정 부위로 전달하는 피브린 실란트의 능력은 유용하지만, 조직의 적당한 재성장은 종종 적절한 치료가 보장되도록 그 부위에 특정 속도 로 전달되는 성장 인자 또는 사이토카인의 연속적이고/지속적인 공급을 요구한다. 이는 치료 단백질이 생체 내에서 짧은 반감기를 가지고 있는 경우에 특히 그러하다. 현재 사용되고 있는 피브린 실란트는 투여된 약물 또는 제제의 일부 지연된 방출을 제공하지만, 실란트 내 상기 제제의 수명을 연장시킬 수 있다면 생체 내에서 장기간의 조직 수복이 향상될 것이다.

따라서 다양한 상태 및 장애의 치료를 위해 생체 내에서 성장 인자를 전달하기 위한 효과적인 수단을 개발하고, 피브린 겔로부터 성장 인자의 제어 방출을 위한 개선된 방법을 개발하는 것이 당업계에 여전히 요구되고 있다.

발명의 요약

본 발명은 시험관 내 및 생체 내에서 성장 인자의 제어 방출을 위한 전환성장인자-베타(TGF-β) 함유 피브린 실란트의 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 실란트를 제형화하는데 사용되는 피브리노겐 복합체 성분의 함량을 변경함으로써 피브린 실란트로부터 TGF-β 단백질의 방출을 변경하는 방법을 제공한다. 상태 또는 장애의 치료를 위해, 일단 피브린 실란트로부터 방출된 TGF-β는 TGF-β가 시험관 내 또는 생체 내에서 그의 기대되는 생물학적 활성을 매개할 수 있도록 그의 생물학적 활성을 보유하는 것으로 의도된다.

일 측면에서, 본 발명은 피브린 실란트로부터 전환성장인자-베타(TGF-β) 단백질의 방출을 변경하는 방법이며, 상기 단백질은 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 피브린 실란트는 피브리노겐 복합체 성분, 트롬빈 성분 및 TGF-β 성분의 혼합에 의해 제조되고, 상기 방법은 a) 공지된 초기 양의 TGF-β 및 공지된 최종 농도의 피브리노겐 복합체를 갖는 제1 피브린 실란트로부터 방출되는 TGF-β의 양을 측정하는 단계, 및 b) 단계 a)에서 제1 피브린 실란트에 사용된 피브리노겐 복합체의 공지된 최종 농도를 변경하여 제2 피브린 실란트를 제조하는 단계를 포함하고, 여기서 제1 실란트 내 피브리노겐 복합체의 공지된 최종 농도와 비교하여 제2 실란트 내 피브리노겐 복합체의 농도를 증가시키는 것은 단계 a)의 제1 실란트로부터 TGF-β의 방출에 비해 제2 실란트로부터의 TGF-β 방출 속도를 감소시키고, 상기 제2 실란트는 단계 a)에서 제1 실란트와 동일한 초기 양의 TGF-β를 갖는 것인 방법을 제공한다.

관련 측면에서, 본 발명은 피브린 실란트로부터 전환성장인자-베타(TGF-β) 단백질의 방출을 변경하는 방법이며, 상기 단백질은 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 피브린 실란트는 피브리노겐 복합체 성분, 트롬빈 성분 및 TGF-β 성분의 혼합물에 의해 제조되며, 상기 방법은 a) 공지된 초기 양의 TGF-β 및 공지된 최종 농도의 피브리노겐 복합체를 갖는 제1 피브린 실란트로부터 방출되는 TGF-β의 양을 측정하는 단계, 및 b) 단계 a)에서 제1 피브린 실란트에 사용된 피브리노겐 복합체의 공지된 최종 농도를 변경하여 제2 피브린 실란트를 제조하는 단계를 포함하고, 여기서 제1 실란트 내 피브리노겐 복합체의 공지된 최종 농도와 비교하여 제2 실란트 내 피브리노겐 복합체의 농도를 감소시키는 것은 단계 a)의 제1 실란트로부터 TGF-β의 방출에 비해 제2 실란트로부터의 TGF-β 방출 속도를 증가시키고, 상기 제2 실란트는 단계 a)에서 제1 실란트와 동일한 초기 양의 TGF-β를 갖는 것인 방법을 제공한다.

일 실시양태에서, 제1 또는 제2 실란트 내 최종 피브리노겐 복합체 농도는 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 150 ㎎/㎖의 범위 이내이다. 관련 실시양태에서, 제1 또는 제2 실란트 내 최종 피브리노겐 복합체 농도는 약 5 ㎎/㎖ 내지 약 75 ㎎/㎖의 범위 이내이다.

다른 실시양태에서, 제1 피브린 실란트 내 최종 피브리노겐 복합체 농도는 제2 실란트 내 최종 피브리노겐 복합체 농도와 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 149 ㎎/㎖ 만큼이 다른 것으로 의도된다. 추가 실시양태에서, 제1 피브린 실란트 내 최종 피브리노겐 복합체 농도는 제2 피브린 실란트 내 피브리노겐 복합체 농도와 약 5 ㎎/㎖ 내지 약 75 ㎎/㎖ 만큼이 다르다. 또 다른 실시양태에서, 제1 피브린 실란트 내 최종 피브리노겐 복합체 농도는 제2 피브린 실란트 내 피브리노겐 복합체 농도와 약 10 ㎎/㎖ 내지 약 60 ㎎/㎖ 만큼이 다르다.

일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 실란트 내 트롬빈 성분의 최종 농도는 약 1 IU/㎖ 내지 250 IU/㎖의 범위 이내인 것으로 의도된다. 다른 실시양태에서, 제1 또는 제2 실란트 내 TGF-β의 최종 농도는 약 1 ng/㎖ 내지 약 1 ㎎/㎖의 범위 이내이다.

다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자 내에서 TGF-β 단백질의 제어 방출을 위한 방법이며, 상기 단백질이 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 환자에게 TGF-β를 함유하는 피브린 실란트를 투여하는 것을 포함하며, 상기 TGF-β의 25% 이상이 3일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 방법을 고려한다.

관련된 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자 내에서 TGF-β 단백질의 제어 방출을 위한 방법이며, 상기 단백질이 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 환자에게 TGF-β를 함유하는 피브린 실란트를 투여하는 것을 포함하며, 상기 TGF-β의 20% 이상이 10일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 방법을 제공한다.

상기 피브린 실란트로부터 방출되는 TGF-β는 생물학적으로 활성인 것으로 고려된다.

일부 실시양태에서, TGF-β의 35% 내지 90% 이상이 3일 이상 동안 보유된다. 관련 실시양태에서, TGF-β의 45% 내지 75% 이상이 3일 이상 동안 피브린 실란트 내에 보유된다. 추가 실시양태에서, TGF-β의 60% 이상이 3일 이상 동안 피브린 실란트 내에 보유된다.

다른 실시양태에서, TGF-β의 25% 내지 75% 이상이 10일 이상 동안 피브린 실란트 내에 보유된다. 관련 실시양태에서, 상기 TGF-β의 45% 내지 55% 이상이 10일 이상 동안 피브린 실란트 내에 보유된다.

관련 실시양태에서, 피브린 실란트가 3일 또는 10일 또는 두 기간 모두 동안에 상기 범위의 방출 동역학을 가질 수 있는 것으로 고려된다.

일 실시양태에서, 피브린 실란트는 피브리노겐 복합체(FC) 성분 및 트롬빈 성분을 혼합물로 배합하여 제조된다. 다른 실시양태에서, TGF-β는 FC 성분과 트롬빈 성분을 혼합하기 전에 FC 성분에 첨가된다. 추가 실시양태에서, TGF-β는 트롬빈 성분에 첨가된다. 다른 추가 실시양태에서, TGF-β는 상기 성분들이 피브린 겔을 형성하도록 허용되기 전에 FC 및 트롬빈의 혼합물에 첨가된다.

관련 실시양태에서, TGF-β 방출은 매일 일정한 양만큼 감소할 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 피브린 실란트 내 TGF-β 양은 하루에 약 1%씩, 하루에 약 2%씩, 하루에 약 3%씩, 하루에 약 4%씩, 하루에 약 5%씩, 하루에 약 6%씩, 하루에 약 7%씩, 하루에 약 8%씩, 하루에 약 9%씩 또는 하루에 약 10%씩 감소할 수 있거나, 원하는 방출량이 피브린 실란트를 제형화하는데 사용된 피브리노겐 복합체 농도 또는 트롬빈 농도에 근거하여 조정될 수 있다.

본 발명은 실란트 내 피브리노겐 복합체 성분의 최종 농도가 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 150 ㎎/㎖의 범위 이내인 것을 의도한다. 일부 실시양태에서, 실란트 내 트롬빈 성분의 최종 농도는 약 1 IU/㎖ 내지 250 IU/㎖의 범위 이내인 것으로 의도된다. 일 실시양태에서, 최종 피브리노겐 복합체 농도는 약 5 ㎎/㎖, 약 10 mg/㎖, 약 20 ㎎/㎖ 또는 약 40 ㎎/㎖이고, 최종 트롬빈 농도는 약 2 IU/㎖이다.

일 실시양태에서, 실란트 내 최종 TGF-β 농도는 약 1 ng/㎖ 내지 약 1 ㎎/㎖이다.

추가 실시양태에서, TGF-β는 TGF-β1인 것이 고려된다. 일 실시양태에서, TGF-β가 TGF-β1일 때, 상기 TGF-β1의 60% 이상은 3일 이상 동안 피브린 실란트 내에 보유되고, 상기 TGF-β1의 25% 이상은 10일 이상 동안에 피브린 실란트 내에 보유된다.

관련 실시양태에서, TGF-β는 TGF-β2인 것이 고려된다. 일 실시양태에서, TGF-β가 TGF-β2일 때, 상기 TGF-β2의 25% 이상은 3일 이상 동안 피브린 실란트 내에 보유된다.

다른 실시양태에서, TGF-β는 TGF-β3인 것이 고려된다. 일 실시양태에서, TGF-β가 TGF-β3일 때, 상기 TGF-β3의 55% 이상은 3일 이상 동안 피브린 실란트 내에 보유되고, 상기 TGF-β3의 25% 이상은 10일 이상 동안 피브린 실란트 내에 보유된다.

추가 측면에서, 본 발명은 전환성장인자-베타(TGF-β) 단백질의 동일계 내 제어 방출로부터 이익을 볼 수 있는 장애 또는 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이며, 상기 단백질은 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 방법은 TGF-β 단백질을 함유하는 피브린 실란트를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 피브린 실란트는 TGF-β의 25% 이상이 3일 이상 동안 피브린 실란트 내에 보유되거나, TGF-β의 20% 이상이 10일 이상 동안 피브린 실란트 내에 보유되는 TGF-β의 제어 방출을 제공하고, 상기 TGF-β는 상기 장애 또는 질환을 치료하는데 효과적인 속도로 방출되는 것인 방법을 고려한다.

추가 측면에서, 본 발명은 생활성 전환성장인자-베타(TGF-β) 단백질의 동일계 내 제어 방출로부터 이익을 볼 수 있는 장애 또는 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이며, 상기 단백질은 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 방법은 TGF-β 단백질을 함유하는 피브린 실란트를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 피브린 실란트는 TGF-β의 20% 이상이 10일 이상 동안 피브린 실란트 내에 보유되는 TGF-β의 제어 방출을 제공하고, 상기 TGF-β는 상기 장애 또는 질환을 치료하는데 효과적인 속도로 방출되는 것인 방법을 고려한다.

본 발명은 또한 전환성장인자 베타(TGF-β) 단백질의 동일계 내 제어 방출로부터 이익을 볼 수 있는 장애 또는 질환을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서, TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 구성된 군으로부터 선택되는 TGF-β 단백질을 함유하는 피브린 실란트의 용도이며, 상기 피브린 실란트가 상기에서와 같이 TGF-β의 제어 방출을 제공하는 것인 용도를 제공한다.

본 발명은 상기에 기술된 바와 같은 방출 동역학이 TGF-β 단백질의 동일계 내 제어 방출로부터 이익을 볼 수 있는 환자를 치료하기 위한 방법에, 또는 상기 환자를 치료하기 위한 약물의 제조에 있어 상기 피브린 실란트의 용도에 적용 가능한 것임을 고려한다.

일 측면에서, 상기 환자는 생체 내 TGF-β의 제어 방출로부터 이익을 볼 수 있으며 통상의 당업자에게 자명한 질환을 앓고 있다. 일 실시양태에서, 상기 질환 또는 장애는 근골격계 질환 또는 장애, 연조직 질환 또는 장애 및 심장혈관계 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 실시양태에서, 상기 근골격계 장애는 골 질환 또는 골 장애이다. 관련 실시양태에서, 상기 근골격계 장애는 연골 질환 또는 연골 장애이다.

일 실시양태에서, 상기 피브린 실란트는 그 자체로 또는 다른 물질과 병용하여 당업계에 공지된 방법, 예컨대 주사, 분무, 내시경 투여 또는 사전-형성된 겔을 이용하는 방법, 및 통상의 당업자에게 공지된 다른 방법을 이용하여 환자에게 투여된다.

본 발명은 또한 생활성 전환성장인자-베타(TGF-β) 단백질을 함유하는 피브린 실란트 제조용 키트로서, 상기 단백질은 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 피브린 실란트는 소정의 TGF-β 방출 속도를 가지며, 상기 키트는 a) 피브리노겐 복합체 성분을 함유하며 임의로 TGF-β 성분을 함유하는 제1 바이알 또는 제1 저장 용기, 및 b) 트롬빈 성분을 갖는 제2 바이알 또는 제2 저장 용기를 포함하고, 상기 키트는 제1 바이알 또는 제1 저장 용기가 TGF-β 성분을 포함하지 않는 경우에는 TGF-β 성분을 갖는 제3 바이알 또는 제3 저장 용기를 임의로 포함하며, 상기 키트는 그의 사용을 위한 지침서를 추가로 포함하는 것인 키트를 제공한다. 상기 키트는 또한 시험관 내 또는 생체 내에서 피브린 실란트의 사용 또는 투여를 위한 기구를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나 발명의 요지 및 범주 내에서 다양한 변화 및 변경이 상기 상세한 설명으로부터 통상의 당업자에게 자명해질 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정 실시예가 본 발명의 특정 실시양태를 나타내기는 하지만 이는 단지 예시로서 주어지는 것임을 이해하여야 한다.

도 1은 티셀 VH(상품명)([FC] = 25 ㎎/㎖, [트롬빈] = 2 IU/㎖)로 제조된 피 브린 겔로부터 그의 일일 방출량에 대한 TGF-β1 양의 효과를 나타낸 것이다.

도 2는 티셀 VH(상품명)([FC] = 25 ㎎/㎖, [트롬빈] = 2 IU/㎖)로 제조된 피브린 겔로부터 그의 누적 방출량에 대한 TGF-β1 양의 효과를 나타낸 것이다.

도 3은 티셀 VH(상품명)([트롬빈] = 2 IU/㎖)로 제조된 피브린 겔로부터 TGF-β1 일일 방출량에 대한 FC 농도의 효과를 나타낸 것이다.

도 4는 티셀 VH(상품명)([트롬빈] = 2 IU/㎖)으로 제조된 피브린 겔로부터 TGF-β1 누적 방출량에 대한 FC 농도의 효과를 나타낸 것이다.

도 5는 티셀 VH S/D(상품명)([트롬빈] = 2 IU/㎖)로 제조된 피브린 겔로부터 TGF-β1 일일 방출량에 대한 FC 농도의 효과를 나타낸 것이다.

도 6은 티셀 VH S/D(상품명)([트롬빈] = 2 IU/㎖)로 제조된 피브린 겔로부터 TGF-β1 누적 방출량에 대한 FC 농도의 효과를 나타낸 것이다.

도 7은 티셀 VH(상품명)([FC] = 25 ㎎/㎖)로 제조된 피브린 겔로부터 TGF-β1 일일 방출량에 대한 트롬빈 농도의 효과를 나타낸 것이다.

도 8은 티셀 VH(상품명)([FC] = 25 ㎎/㎖)로 제조된 피브린 겔로부터 TGF-β1 누적 방출량에 대한 트롬빈 농도의 효과를 나타낸 것이다.

도 9는 피브린 겔([FC] = 20 ㎎/㎖, [트롬빈] = 2 IU/㎖)로부터의 TGF-β1 누적 방출량에 대한 티셀 VH(상품명) 로트넘버의 효과를 나타낸 것이다.

도 10은 피브린 겔([FC] = 20 ㎎/㎖, [트롬빈] = 2 IU/㎖)로부터의 TGF-β1 누적 방출량에 대한 티셀 VH S/D(상품명) 로트넘버의 효과를 나타낸 것이다.

도 11은 3일째에 TGF-β1를 첨가하거나 첨가하지 않은 티셀 VH(상품명) 피브 린 겔 유래 배지 상청액, 또는 추가적으로 2 ng(1 ng/㎖)의 TGF-β1(양성 대조군)을 함유하는 신선하게 제조된 배지를 이용하여 단층으로 배양된 인간 중간엽 줄기세포(HMSC)의 증식을 나타낸 것이다(방출된 TGF-β1의 생물학적 활성). 결과는 1일째에 대해 표준화하였다.

도 12는 TGF-β1이 첨가되지 않은 피브린 겔 유래 배지 상청액에서 배양된 HMSC에서의 알칼라인 포스파타제(ALP) 활성, 및 신선하게 첨가된 TGF-β1을 함유하는 배지 내에서 배양된 HMSC에서의 ALP 활성과 비교하여, TGF-β1이 첨가된 티셀 VH(상품명) 피브린 겔 유래 배지 상청액 내(즉, 방출된 TGF-β1 함유 배지 내)에서 배양된 HMSC의 ALP 활성을 나타낸 것이다(방출된 TGF-β1의 생물학적 활성). 결과(처음에는 IU/㎖로 계산됨)는 증식 상태에 대해 표준화하였다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 근골격계 질환, 예컨대 골 및 연골 장애, 연조직 장애, 및 심장혈관계 질환의 치료를 비롯한 치료적 적용에 있어 동일계 내 제어 방출을 위한 TGF-β 함유 피브린 겔을 제공한다. 본 발명은 상기 겔로부터 방출되는 TGF-β가 생체 내 또는 시험관 내에서 피브린 실란트로부터의 방출이 소정의 생물학적 활성을 매개하도록 그의 생물학적 활성을 보유하는 것을 의도한다. 본 발명은 또한 소정의 TGF-β 방출 동역학을 얻기 위해 피브린 실란트를 제형화하는데 유용한 FC 성분 또는 트롬빈 성분의 농도를 결정하는 방법을 제공한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 발 명이 속하는 분야의 통상의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기 참조는 이 발명에 사용된 많은 용어의 일반적인 정의를 통상의 당업자에게 제공한다: 문헌[Singleton, 등, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger, 등, (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale 및 Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991)].

본원에 인용된 각각의 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참조는 그것이 본 명세서와 모순되지 않는 수준에서 그 전체가 참고로서 포함된다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 경우, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 그 반대를 지시하지 않는 한 복수 관계를 포함하는 것임이 여기에 특별히 언급된다.

본원에 사용된 경우, 하기 용어들은 달리 특정되지 않는 한 그들에게 지정된 의미를 갖는다.

본원에 사용된 경우, 용어 "피브린 실란트", "피브린 겔", "피브린 접착제", "피브린 응괴" 또는 "피브린 기질"은 상호호환적으로 사용되고 적어도 피브리노겐 복합체(FC) 성분 및 트롬빈 성분을 포함하며, 세포 성장 및 시간의 경과에 따른 생활성 물질의 방출을 위한 스캐폴드로 작용할 수 있는 3-차원 네트워크를 지칭한다.

본원에 사용된 경우, 용어 "제어 방출" 및 "지연 방출"은 동일한 의미를 가지며 피브린 겔 내 제제(예를 들어, 성장 인자)의 보유를 지칭한다. 제어 방출은 겔로부터 결합된 성장 인자의 확산 또는 해리에 의한 느리고 지속적인 분비/방출 및 그의 후속된 확산에 기인할 뿐만 아니라, 기질의 붕괴 및 효소적 분열에 기인한다.

본원에 사용된 경우, "동일계 내 형성"은 생리적 온도에서 그리고 체내 주사 부위에서의 형성 또는 적당한 시험관 내 조건에서 피브린 실란트의 형성을 지칭한다. 이 용어는 전형적으로 투여 전 및 투여 당시에는 실질적으로 가교되어 있지 않은, 피브린 실란트 내 전구 분자들 사이에서 공유 연결의 형성을 기술하기 위해 사용된다.

본원에 사용된 경우, "피브리노겐 복합체 성분"은 트롬빈과 혼합되어 응괴-유사 피브린 실란트를 형성하는 피브린/피브리노겐 용액을 지칭한다. 상기 피브리노겐 복합체(FC)는 주로 피브리노겐 및 피브로넥틴으로 구성되며, 또한 촉매량의 FXIII 및 플라스미노겐을 포함할 수 있다. 상기 피브리노겐 복합체 성분은 또한 시일러(Sealer) 단백질로 언급될 수 있다.

본원에 사용된 경우, "트롬빈 성분"은 피브리노겐 복합체 성분과 혼합되어 응괴-유사 피브린 실란트를 생성하는 트롬빈 용액을 지칭한다.

본원에 사용된 경우, "전환성장인자-베타 성분" 또는 "TGF-β 성분"은 액체 형태의 피브린 실란트에 용액 중의 성장 인자의 첨가를 지칭한다. TGF-β 성분, FC 복합체 성분 및 트롬빈 성분 각각은 TGF-β를 함유하는 피브린 실란트를 형성하기 위해 개별적으로 첨가될 수 있다. 임의로, TGF-β 성분은 트롬빈 성분과 혼합되기 전에 액체 FC 복합체 성분에 첨가된다.

본원에 사용된 경우, "재조합 인간 TGF-β"는 재조합 DNA 기술을 통해 수득되는 재조합 인간 전환성장인자-β(rh TGF-β)를 지칭한다. 이는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다.

본원에 사용된 경우, 용어 "생활성" 또는 "생물학적으로 활성"은 용액 중 또는 피브린 실란트 내 단백질, 예를 들어, TGF-β 단백질이 자연적으로 발현된 단백질과 비교하여(즉, 재조합적으로 또는 생체 내에서 발현될 때) 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 나타내는 생물학적 특성을 지칭한다.

본원에 사용된 경우, "검출가능한 잔기", "검출가능한 표지" 또는 "표지"는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 유용한 표지에는 ³²P, ³⁵S, 형광 염료, 전자-조밀 시약, 효소(예를 들어, ELISA에서 상업적으로 사용되는 바와 같은 것들), 바이오틴-스트렙타비딘, 딕옥시제닌, 합텐 및 그에 대한 항-혈청 또는 단일클론 항체가 이용가능한 단백질, 또는 표적에 서열 상보성을 갖는 핵산 분자가 포함된다. 상기 검출가능한 잔기는 종종 시료 내에서 결합된 검출가능한 잔기의 양을 정량하는데 사용될 수 있는, 측정 가능한 신호, 예컨대 방사능, 화학주성, 또는 형광 신호를 생성한다.

피브린 실란트

수많은 형태의 피브린이 피브린 실란트로 사용하는데 이용가능하다. 피브린 겔은 자가 혈장, 동결침전된 혈장(예를 들어, 상업적으로 이용가능한, 피브린 아교 키트), 혈장으로부터 정제된 피브리노겐, 및 재조합 피브리노겐 및 인자 XIIIa로부터 합성될 수 있다. 이러한 물질들 각각은 생화학적 조성에 있어 사소한 변이를 갖지만, 기본적으로는 유사한 기질을 제공한다. 문헌[Sierra DH, J Biomater Appl, 7, 309-352 (1993)]을 참조하시오. 이러한 물질들 사이의 유사성은 특이적인 효소적 생활성 및 전신 치유 반응 모두에서 나타난다.

본 발명에 유용한 피브린 겔은 2종의 주요 성분: 피브리노겐 복합체 (FC) 및 트롬빈으로 이루어지는 피브린 실란트로부터 형성된다. 상기 FC는 주로 피브리노겐 및 피브로넥틴으로 구성되고, 또한 촉매량의 FXIII 및 플라스미노겐을 포함할 수 있다. 상기 FC 및 트롬빈 성분은 일반적으로 인간 혈장으로부터 유래되지만, 또한 재조합/유전공학 기술에 의해 생산될 수 있다. 피브린 실란트의 예시는 미합중국 특허 제5,716,645호; 미합중국 특허 제5,962,405호; 미합중국 특허 제6,579,537호에 기술되어 있고 티셀(TISSEEL) VH(상품명) 및 티셀 VH S/D(상품명)(백스터 헬스케어, 미합중국 일리노이주 디어필드 소재)를 포함한다.

피브린 겔을 형성하기 위하여, FC를 먼저 재구성하거나, 해동하거나 다르게는 포장지 지침에 따라 조제하고, 추가로 희석 완충액을 이용하여 필요한 만큼 희석하여 치료제를 상기 액체 FC에 첨가한다. 대부분의 상업적으로 이용가능한 피브린 실란트는 아프로티닌과 같은 겔 용해의 억제제를 포함하는데, 이는 사용자의 자유재량으로 FC에 첨가된다. 아프로티닌 및 기타 겔 용해 억제제의 설명은 국제특 허공개 제99/11301호에 제공된다. 트롬빈 성분 역시 CaCl₂ 용액을 이용하여 액체 형태로 재구성하고, 추가로 희석 완충액을 이용하여 필요한 만큼 희석한다. 트롬빈 성분을, TGF-β를 추가로 포함하는 FC 성분과 혼합하여 피브린 겔을 형성하는 것이 고려된다. 아프로티닌 성분이 결핍된 피브린 실란트가 또한 고안되어 있다(에비셀(EVICEL, 상품명), 에티콘 인크(Ethicon, Inc.), 미합중국 뉴저지 소재).

조직 접착제로 사용될 수 있는 피브리노겐-함유 조제품을 생산하는 부가적인 방법은 각각 임의로 에탄올, 황산암모늄, 폴리에틸렌글리콜, 글리신 또는 베타-알라닌을 이용한 추가의 세척 및 침전 단계를 수반하는 동결침전물로부터의 생산, 및 공지된 혈장 분획화 방법의 범위 이내에서 혈장으로부터의 생산을 포함한다(예를 들어, 문헌["Methods of plasma protein fractionation", 1980, ed.: Curling, Academic Press, pp. 3-15, 33-36 and 57-74], 또는 문헌[Blomb ck B. 및 M., "Purification of human and bovine fibrinogen", Arkiv Kemi 10, 1959, p. 415 f.]). 피브린 실란트는 또한 환자 자신의 혈장을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 크리오실(CRYOSEAL, 등록상표)(써모제네시스 코르포레이션(Thermogenesis Corp.), 캐나다 란쵸 코르도바 소재) 또는 비보스탯(VIVOSTAT, 등록상표)(비볼류션(Vivolution) A/S, 덴마크 소재) 피브린 실란트 시스템을 통해 환자의 혈액 혈장으로부터 자가 피브린 실란트 성분의 생산이 가능하다. 피브린 실란트의 성분은 동결건조된 저온-냉동 액체, 또는 액체 형태로 이용가능하다.

피브린 겔의 성분은 요구되는 유형의 제어 방출을 제공하도록 적당한 농도로 첨가된다. FC 성분은 다양한 농도로 첨가될 수 있는데, 5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 15 ㎎/㎖, 20 ㎎/㎖, 25 ㎎/㎖, 30 ㎎/㎖, 35 ㎎/㎖, 40 ㎎/㎖, 45 ㎎/㎖, 50 ㎎/㎖, 150 ㎎/㎖ 이하(겔 내 최종 농도), 또는 필요에 따라 중간 농도를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한, FC 성분의 농도는 임의의 적당한 농도의 트롬빈 성분과 배합될 수 있는데, 1 IU/㎖, 2 IU/㎖, 5 IU/㎖, 7 IU/㎖, 10 IU/㎖, 15 IU/㎖, 20 IU/㎖, 25 IU/㎖, 30 IU/㎖, 35 IU/㎖, 40 IU/㎖, 50 IU/㎖, 60 IU/㎖, 70 IU/㎖, 80 IU/㎖, 90 IU/㎖, 100 IU/㎖, 120 IU/㎖, 140 IU/㎖, 150 IU/㎖, 175 IU/㎖, 200 IU/㎖, 225 IU/㎖ 및 250 IU/㎖을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

TGF-β와 같은 이차 제제를, 치료제를 위한 제어 방출 시스템을 조성하기 위해 피브린 실란트 조성물에 첨가하는 것을 고려한다. TGF-β는 1 ng/㎖ 내지 1 ㎎/㎖의 TGF-β 범위 이내에서, 적당한 지연 방출 제형을 제공하는 임의의 농도로 첨가될 수 있다. 피브린 실란트 내 TGF-β의 예시적인 농도에는 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 100 ng/㎖, 250 ng/㎖, 500 ng/㎖, 1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 750 ㎍/㎖ 및 1 ㎎/㎖가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

피브린 실란트에 사용되는 FC 또는 트롬빈의 농도는 피브린 겔 내에 첨가된 TGF-β가 수일 내지 수주에 걸쳐서 치료적으로 유효한 양으로 방출되게 하는 그러한 농도인 것을 고려한다. 일 측면에서, TGF-β는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20 일, 또는 그 이상 동안 피브린 겔로부터 방출된다.

TGF-β는 제어 또는 지연 방출 방식으로 TGF-β가 동일계 내에서 연장된 기간 동안에 이용가능하도록 피브린 실란트로부터 방출된다. TGF-β 방출은 매일 일정량 만큼 감소할 수 있는데, 예를 들어 TGF-β 수준은 하루에 약 1%씩, 하루에 약 2%씩, 하루에 약 3%씩, 하루에 약 4%씩, 하루에 약 5%씩, 하루에 약 6%씩, 하루에 약 7%씩, 하루에 약 8%씩, 하루에 약 9%씩 또는 하루에 약 10%씩 또는 그 이상으로 감소할 수 있는 것을 고려한다. 관련 실시양태에서, 25% 이상의 TGF-β가 3일 이상 동안 피브린 겔 내에 보유되는 것을 고려한다. 추가 실시양태에서, 35% 내지 90% 이상, 45% 내지 75% 이상, 또는 60% 이상의 TGF-β가 3일 이상 동안 피브린 겔 내에 보유된다. 또한 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 또는 90% 이상의 TGF-β가 3일 이상 동안 피브린 겔 내에 보유되는 것을 고려한다.

다른 실시양태에서, 20% 이상의 TGF-β가 10일 이상 동안 피브린 겔 내에 보유된다. 추가 실시양태에서, 25% 내지 75% 또는 45% 내지 55% 이상의 TGF-β가 10일 이상 동안 보유된다. 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74% 또는 75% 이상의 TGF-β가 10일 이상 동안 피브린 겔 내에 보유되는 것을 또한 고려한다.

본 발명은 피브린 실란트의 성분들의 농도를 변경함으로써 소정의 방출 동역학을 갖는 피브린 실란트를 제형화하는 방법을 제공한다. 일 측면에서, 상기 방법은 공지된 초기 양의 TGF-β 및 공지된 최종 농도의 피브리노겐 복합체를 포함하는 제1 피브린 실란트로부터 방출되는 TGF-β의 양을 측정하고, 단계 (a)에서 제1 피브린 실란트에 사용된 피브리노겐 복합체의 공지된 최종 농도를 변경하여 제2 피브린 실란트를 제조하는 것을 포함하며, 여기서 제1 실란트 내 피브리노겐 복합체의 공지된 최종 농도와 비교하여 제2 실란트 내 피브리노겐 복합체의 농도를 증가시키거나 감소시켜 단계 (a)에서 제1 실란트로부터의 TGF-β 방출에 비해 제2 실란트로부터의 TGF-β 방출 속도를 조절하며, 상기 제2 실란트는 단계 (a)의 제1 실란트와 동일한 초기 양의 TGF-β를 갖는다.

일 실시양태에서, 제1 또는 제2 실란트 내 최종 피브리노겐 복합체 농도는 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 150 ㎎/㎖의 범위 이내이다. 제1항 또는 제2항의 방법에서 제1 또는 제2 실란트 내 최종 피브리노겐 복합체 농도는 상기에 기술된 바와 같다. 관련 실시양태에서, 제1 피브린 실란트의 FC 농도는 제2 실란트 내 최종 FC 농도와 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 149 ㎎/㎖, 약 5 ㎎/㎖ 내지 약 75 ㎎/㎖, 또는 약 10 ㎎/㎖ 내지 약 60 ㎎/㎖ 만큼이 다르다. 추가 실시양태에서, 제1 피브린 실란트 내 FC 농도는 제2 실란트 내 최종 FC 농도와 약 2 ㎎/㎖, 3 ㎎/㎖, 4 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 15 ㎎/㎖, 20 ㎎/㎖, 25 ㎎/㎖, 30 ㎎/㎖, 35 ㎎/㎖ 40 ㎎/㎖, 45 ㎎/㎖, 50 ㎎/㎖, 또는 이러한 농도들 사이의, 약 149 ㎎/㎖ 이하의 임의의 양 만큼이 다르다.

본 발명에 유용한 피브린 실란트는 시험관 내 또는 생체 내 용도를 목적으로 부가적인 물질 또는 제제와 배합될 수 있는 것으로 의도된다. 이러한 제제에는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 성장인자류, 사이토카인류, 케모카인류, 혈액 응괴 인자, 효소, 케모카인, 가용성 세포-표면 수용체, 세포 부착 물질, 항체, 호르몬, 세포골격 단백질, 기질 단백질, 샤페론 단백질, 구조 단백질, 대사 단백질, 및 당업계에 공지된 기타를 포함하는, 부가적인 치료제가 포함된다. 예를 들어, 문헌[Physicians Desk Reference, 62nd Edition, 2008, Thomson Healthcare, Montvale, NJ]을 참고하시오.

피브린 실란트에 유용한 부가적인 물질에는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 중합체, 산호, 세라믹, 유리, 금속, 골-유래 물질, 히드록시아파타이트, 합성 스캐폴드 물질, 이러한 물질들의 조합, 및 당업계에 공지된 기타를 포함하는, 하중 지지(load bearing) 물질일 수 있는 골 또는 연골 질환용 실란트와 배합될 수 있는 물질이 포함된다. 예를 들어, 문헌[Guehennec 등, European Cells and Materials, 8:1-11, 2004], 미합중국 특허 제7,122,057호 및 미합중국 특허 제6,696,073호를 참고하시오.

일 실시양태에서, 피브린 겔은 역-결합(reversed-binding) 후에 그리고 FC 및 트롬빈 농도의 조절에 의한 제어 방식으로 생물학적으로 활성인 TGF-β를 전달 하기 위한 담체 시스템으로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에서, 피브린 겔이 25 ㎎/㎖의 FC 및 2 IU/㎖의 트롬빈(겔 내 최종 농도)을 이용하여 증기 가열된 티셀(TISSEL Vapor Heated, TISSEL VH, 상품명)로 제조될 때, 첨가된 TGF-β1의 약 80% 이상이 3일 후에도 겔 내에 보유되고, 첨가된 TGF-β1의 약 48% 이상이 10일 후에도 겔 내에 보유된다. TGF-β 방출 양은 겔 내에 첨가된 성장인자의 양에 비례한다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 피브린 겔이 5 ㎎/㎖의 FC 및 2 IU/㎖의 트롬빈(겔 내 최종 농도)을 이용하여 티셀(티셀 VH, 상품명)로 제조될 때, 첨가된 TGF-β1의 약 60% 이상이 3일 후에도 겔 내에 보유되고, 첨가된 TGF-β1의 약 25% 이상이 10일 후에도 겔 내에 보유된다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 피브린 겔이 5 ㎎/㎖의 FC 및 2 IU/㎖의 트롬빈(겔 내 최종 농도)을 이용하여 티셀 증기 가열된 용매/세정제(TISSEL Vapor Heated Solvent/Detergent, TISSEL VH S/D, 상품명)로 제조될 때, 첨가된 TGF-β1의 약 35% 이상이 3일 후에 겔 내에 보유되고, 10일 후에는 7% 미만이 겔 내에 보유된다(즉, 거의 완전히 방출됨). 따라서 티셀 VH(상품명) 또는 티셀 VH S/D(상품명)로 제조된 피브린 겔을 이용할 때 상기 보유는 FC 농도가 높을수록 증가한다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 2, 10 및 50 IU/㎖의 트롬빈을 함유하는 티셀 VH(상품명)로 제조된 피브린 겔(25 ㎎/㎖의 FC 함유, 겔 내 최종 농도)로부터의 TGF-β1 방출은 유사한데, 이는 트롬빈 농도가 TGF-β1 방출에 대해 FC 농도보다 약한 효과를 가짐을 제시하는 것이다. TGF-β1 방출은 가장 높은 트롬빈 농도(250 IU/㎖, 겔 내 최종 농도)에서 단지 유의미하게 더 높은데, 이는 더 불균질한 구조에서 겔 구조의 효과를 나타내는 것이다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 피브린 겔이 20 ㎎/㎖의 FC 및 2 IU/㎖의 트롬빈(겔 내 최종 농도)을 이용하여 서로 다른 로트넘버(lot number)의 티셀 VH(상품명)로 제조될 때, 하나의 로트로부터의 겔 내에는 TGF-β1의 67% 이상이 10일 후에도 보유되고, 다른 로트로부터의 겔 내에는 39%가 보유되고 세 번째 로트로부터의 겔 내에는 전혀 보유되지 않았다. 이러한 로트들 사이의 한 가지 차이점은 인자 XIII 함량(각각 42.2 U/㎖, 33.9 U/㎖ 및 <1 U/㎖)이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 피브린 겔이 20 ㎎/㎖의 FC 및 2 IU/㎖의 트롬빈(겔 내 최종 농도)을 이용하여 서로 다른 로트넘버의 티셀 VH S/D(상품명)로 제조될 때, 하나의 로트로부터의 겔 내에는 TGF-β1의 20% 이상이 10일 후에도 보유되고 다른 두 로트로부터의 겔 내에는 전혀 보유되지 않았다. 이러한 로트들의 인자 XIII 함량은 모두 3 U/㎖ 이하였다.

본 발명의 다른 실시양태에서 TGF-β2가 5 ㎎/㎖의 FC 및 2 IU/㎖의 트롬빈(겔 내 최종 농도)을 이용하여 티셀 VH(상품명)로 제조된 피브린 겔에 첨가될 때, 첨가된 TGF-β2의 약 25% 이상이 3일 후에도 겔 내에 보유된다. 보유는 FC 농도에 따라 증가한다. TGF-β3이 5 ㎎/㎖의 FC 및 2 IU/㎖의 트롬빈(겔 내 최종 농도)을 이용하여 티셀 VH(상품명)로 제조된 피브린 겔에 첨가될 때, 첨가된 TGF-β3의 55% 이상이 3일 후에도 겔 내에 보유되고 25%는 10일 후에도 보유된다.

상기에 개시된 실시양태는 상업적으로 이용가능한 피브린 실란트로부터 TGF- β 방출의 예시적인 실시양태이고 어떠한 경우에서도 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않음이 통상의 당업자에게 이해될 것이다.

TGF-β 단백질

TGF-베타는 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, TGF-β5로 알려진 5종 이상의 이소형태로 존재한다. 이들의 아미노산 서열은 대략 70-80%의 상동성을 나타낸다. TGF-베타-1은 일반적인 형태로 대부분 편재하여 발견되는 반면, 다른 이소형태는 세포 및 조직의 보다 제한된 범위에서 발현된다. TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3은 골 형태발생에 뚜렷한 기능을 갖는 것으로 나타났다(Fagenholz 등, J Craniofacial Surg. 12: 183-190, 2001). TGF-β1의 3차원 구조는 문헌[Hinck 등, Biochemistry 35: 8517-8534, 1996]에 기술되어 있다. TGF-β2의 3차원 구조는 문헌[Daopin 등, Science 257: 369-373, 1992]에 기술되어 있다. TGF-β3의 3차원 구조는 문헌[Mittl 등, Protein Sci. 5: 1261-1271, 1996]에 기술되어 있다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 피브린 겔로부터 방출된 TGF-β1의 생물학적 활성이 검사되었다. TGF-β1이 첨가된 겔 유래 배지 상청액 내(즉, 방출된 TGF-β1 함유 배지 내)에서 단층으로 배양한 후에 인간 중간엽 줄기세포(HMSC) 형태의 보다 정사각형 내지 다각형 모양으로의 변화는 세포 분화를 나타내며, 이는 TGF-β1이 첨가되지 않은 겔 유래 배지 상청액에서 배양된 세포와 비교하여 더 낮은 증식을 나타내는 경향과 일치한다. TGF-β1이 첨가된 겔 유래 배지 상청액 내(즉, 방출된 TGF-β1 함유 배지 내)에서 배양된 세포의 알시안 블루(Alcian blue) 양성 염 색은 HMSC가 연골형성을 거치기 시작했음을 나타낸다. 각각 초기 및 후기 연골형성 분화의 마커들인 알칼라인 포스파타제(ALP) 활성 및 알리자린 레드(Alizarin red) 염색은 여전히 음성이다. 세포 형태, 증식 및 연골형성 분화에 있어 이러한 변화는 TGF-β1이 상기 겔로부터 방출된 후에도 여전히 생물학적으로 활성임을 입증하는 것이다.

본 발명에 유용한 TGF-β 분자는 전장 단백질, 상기 단백질의 전구체, 상기 단백질의 아단위 또는 단편, 및 이의 기능성 유도체를 포함한다. TGF-β에 대한 언급은 자연적으로-유래된 단백질 조제품을 포함하는, 이러한 단백질의 모든 가능한 형태를 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에 따르면, 용어 재조합 TGF-β는 특정한 한정 하에 있지 않고 재조합 DNA 기술을 통해 수득되는, 이종유래 또는 자연 발생적인 임의의 TGF-β, 또는 이의 생물학적으로 활성인 유도체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 용어는 단백질 및 핵산, 예컨대, 유전자, pre-mRNA, mRNA, 및 폴리펩티드, 다형성 변이체, 대립유전자, 돌연변이, 및 종간 상동체를 포함하는데, 이들은: (1) 본원에 기술된 참조 핵산 또는 아미노산 서열에 의해 암호화되는 TGF-β1, -β2 또는 -β3 폴리펩티드에 대해, 약 25개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개 또는 그 이상의 아미노산 영역에 걸쳐, 약 60% 이상의 아미노산 서열 동일성, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고; (2) 본원에 기술된 바와 같은 참조 아미노산 서열을 포함하는 면역원, 이의 면역원성 단편, 및 이의 보존적으로 변형된 변 이체에 대해 유발되는 항체, 예를 들어 다중클론 항체에 특이적으로 결합하고; (3) 본원에 기술된 바와 같은 참조 아미노산 서열을 암호화하는 핵산, 및 그의 보존적으로 변형된 변이체에 엄격한 혼성화 조건 하에서 특이적으로 혼성화하고; (4) 본원에 기술된 바와 같은 참조 핵산 서열에 대해, 약 25개, 50개, 100개, 150개, 200개, 250개, 500개, 1000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 영역(성숙 단백질의 1218개 뉴클레오티드의 전장 서열 이하)에 걸쳐, 약 95% 이상, 약 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 전형적으로, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 영장류 동물, 예를 들어, 인간; 설치류, 예를 들어, 쥐, 생쥐, 햄스터; 소, 돼지, 말, 양, 또는 임의의 기타 동물을 포함하는 포유동물 유래이다. 본 발명의 핵산 및 단백질은 재조합 분자(예를 들어, 이종 유래이고 야생형 서열 또는 그의 변이체를 암호화하고, 또는 비-자연 발생적임)일 수 있다. 인간 TGF-β의 구조는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 의해 지원되는 유전자은행 데이터베이스(Genbank Database): 인간 TGF β-1, 유전자은행 등재번호 NP_000651, 인간 TGF β-2, 유전자은행 등재번호 NP_003229, TGF β-3 유전자은행 등재번호 NP 003230을 참조한다.

TGF-β의 생산은, (i) 유전적 조작에 의한, 예를 들어 RNA의 역전사 및/또는 DNA의 증폭을 통한 재조합 DNA의 생산, (ii) 형질감염에 의한, 예를 들어, 전기천공 또는 미세주입을 통한 재조합 DNA의 원핵세포 또는 진핵세포 내로의 도입, (iii) 예를 들어, 연속식 또는 회분식 방식으로 상기 형질전환된 세포의 배양, (iv) 예를 들어, 구성적으로(constitutively) 또는 유도 시 TGF-β의 발현, 및 (v) 정제된 TGF-β를 수득하기 위해, 예를 들어 음이온 교환 크로마토그래피 또는 친화 크로마토그래피를 통해, 예를 들어, 배양 배지로부터 또는 형질감염된 세포의 수확에 의한 상기 TGF-β의 단리에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법을 포함할 수 있다.

TGF-β는 약학적으로 허용가능한 TGF-β 분자를 생산하는 것을 특징으로 하는 적합한 원핵 또는 진핵 숙주 시스템에서 발현에 의해 생산될 수 있다. 일반적으로 사용되는 숙주세포에는: 그람 음성 또는 그람 양성 세균과 같은 원핵세포, 즉, 대장균, 바실러스, 스트렙토마이세스, 사카로마이세스, 살모넬라 등의 임의의 균주가 포함된다. 진핵세포의 예로는 D. Mel-2, Sf4, Sf5, Sf9, 및 Sf21 및 하이(High) 5와 같은 곤충세포; 식물세포 및 사카로마이세스 및 피치아와 같은 다양한 효모세포; 포유동물 세포, 예컨대 CHO(중국 햄스터 난소) 세포; 아기 햄스터 신장(BHK) 세포; 인간 신장 293 세포; COS-7 세포, HEK 293, SK-Hep, 및 HepG2, 및 당업계에 공지된 기타를 들 수 있다. 본 발명에 따라 TGF-β를 생산하거나 단리하는데 사용되는 시약 또는 조건에는 어떠한 제한도 없으며, 당업계에 공지되거나 상업적으로 이용가능한 임의의 시스템이 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, TGF-β는 당업계에 기술된 바와 같은 방법에 의해 수득된다.

매우 다양한 벡터가 TGF-β의 제조에 사용될 수 있고 당업계에 공지된 진핵 및 원핵 발현벡터로부터 선택될 수 있다. 원핵 발현을 위한 벡터의 예시에는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, pRSET, pET, pBAD 등과 같은 플라스미드가 포함되 고, 이들은 원핵 발현벡터에 사용되는 프로모터로 lac, trc, trp, recA, araBAD 등을 포함한다. 진핵 발현을 위한 벡터의 예시에는, 이들로 제한되는 것은 아니지만: (i) 효모에서의 발현을 위한, AOX1, GAP, GAL1, AUG1 등과 같은 프로모터를 이용하는 pAO, pPIC, pYES, pMET와 같은 벡터; (ii) 곤충세포에서의 발현을 위한, PH, p1O, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh 등과 같은 프로모터를 이용하는 pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC 등과 같은 벡터, 및 (iii) 포유동물 세포에서의 발현을 위한, pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV 등과 같은 벡터, 및 CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, 및 β-액틴과 같은 프로모터를 이용하는 우두바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 등과 같은 바이러스 시스템 유래 벡터가 포함된다.

DNA 또는 RNA를 암호화하는 폴리펩티드를 함유하는 숙주세포는 상기 세포의 성장 및 DNA 또는 RNA의 발현에 적합한 조건 하에서 배양된다. 폴리펩티드를 발현하는 그러한 세포는 공지된 방법을 이용하여 확인될 수 있고, 재조합 단백질은 폴리펩티드 생산의 증폭을 수반하거나 수반하지 않으면서, 공지된 방법을 이용하여 분리되고 정제될 수 있다. 예를 들어, 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA의 존재를 표시하는 표현형을 나타내는 유전적으로 변형된 포유동물 세포의 스크리닝을 통해, 예컨대 PCR 스크리닝, 서던 블롯 분석에 의한 스크리닝, 또는 상기 단백질의 발현에 대한 스크리닝을 통해 확인될 수 있다. 도입된 단백질-암호화 DNA를 갖는 세포의 선별은 DNA 구조물 내에 선별가능 마커를 포함시키고 선별가능 마커 유전자를 포함하는 형질감염 또는 감염 세포를 상기 선별가능 마커 유전자를 발현하는 오 로지 그러한 세포의 생존에만 적합한 조건 하에서 배양함으로써 수행될 수 있다. 도입된 DNA 구조물의 추가적인 증폭은 증폭에 적합한 조건 하에서 유전적으로 변형된 세포를 배양함(예를 들어, 증폭가능 마커 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 상기 증폭가능 마커 유전자의 다중 복제수를 포함하는 세포만이 생존할 수 있는 농도의 약물 존재 하에서 배양함)으로써 달성될 수 있다.

시료 내 단백질 농도를 결정하는 방법

치료 단백질은 종종 내생적으로 생산된, 자연-발생적인 단백질에 대한 이들의 유사성으로 인해 혈장 시료 내에서 검출되기 어렵다. 그러나 치료 단백질이 보다 높은 용해도 또는 안정성, 효소 분해에 대한 내성, 개선된 생물학적 반감기, 및 통상의 당업자에게 공지된 다른 특징과 같은 소정의 특성을 나타내는지 여부를 평가하기 위해 투여된 치료 폴리펩티드, 이의 단편, 변이체 또는 유사체의 양을 측정하는 것은 종종 유익하다. 상기 방법은 또한 지적재산권에 의해 보호될 수 있는 치료 단백질의 승인된 용도의 검출을 가능케 한다.

본 발명은 TGF-β 함유 피브린 겔로부터 TGF-β의 방출을 검출하고 상기 단백질의 방출 동역학을 결정하기 위한 방법을 제공한다. 다양한 농도의 피브리노겐 복합체 성분을 이용하여 제조된 피브린 실란트로부터의 이러한 방출 동역학의 비교는 치료 목적으로 소정의 방출 속도를 결정하는데 도움이 된다. 시간의 경과에 따라 피브린 실란트로부터 방출되는 단백질의 양을 확인하는 능력은 반감기, 흡수, 안정성 등에 근거한 최적의 치료를 결정하는데 도움이 된다. 검출 분석법은 효소 결합 면역흡수 분석법(enzyme linked immunosorbant assay, ELISA), 방사성 면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 섬광 근접 분석법(scintillation proximity assay, SPA), 표면 플라즈마 공명(surface plasma resonance, SPR), 또는 당업계에 공지된 기타 결합 분석법일 수 있다.

일반적으로, 시료 내 TGF-β의 존재를 검출하기 위하여, TGF-β를 TGF-β와 결합하는 항체, 가용성 수용체 또는 기타 단백질 또는 제제와 같은 TGF-β 결합제와 결합시킨다.

검출 단계를 위해, TGF-β 단백질은 검출가능 잔기 또는 검출가능 표지에 연결될 수 있다. 검출가능 잔기 또는 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 조성물을 지칭한다. 상기 검출가능 잔기는 종종 시료 내 결합된 검출가능 잔기의 양을 정량하는데 사용될 수 있는 측정가능 신호, 예컨대 방사능, 유색성, 또는 형광 신호를 생성한다. 검출가능 잔기는 공유적으로, 또는 이온성, 반 델 발스(van der Waals) 또는 수소결합을 통해, 예를 들어, 방사능 뉴클레오티드의 도입, 또는 스트렙타비딘에 의해 인식되는 바이오틴화 뉴클레오티드를 통해 단백질 내에 도입되거나 그에 부착될 수 있다. 검출가능 잔기는 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 간접적 검출은 검출가능 잔기에 대한 이차 직접적 또는 간접적 검출가능 잔기의 결합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 검출가능 잔기는 결합 파트너의 리간드, 예컨대 스트렙타비딘의 결합 파트너인 바이오틴일 수 있다. 결합 파트너는 그 자체로 직접적으로 검출될 수 있는데, 예를 들어 항체는 형광 분자로 표지될 수 있다. 상기 신호를 정량하는 방 법의 선별은 예를 들어, 섬광 계수, 음영계측기, 또는 유세포 분석기에 의해 달성된다.

본 발명의 분석 방법에 사용하기에 적당한 표지의 예시에는 방사능 표지, 형광단, 전자-조밀 시약, 효소(예를 들어, ELISA에 통상적으로 사용되는 것들), 바이오틴, 딕옥시제닌, 또는 합텐, 및 예를 들어 합텐 또는 펩티드 내로 방사능표지를 도입함으로써 검출 가능해질 수 있거나, 합텐 또는 펩티드와 특이적으로 반응하는 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있는 단백질이 포함된다. 그에 대한 항혈청 또는 단일클론 항체가 이용가능한 단백질, 또는 표적에 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자, 나노태그(nanotag), 분자 중량 비드(molecular mass bead), 자기 제제(magnetic agent), 나노- 또는 마이크로-비드 함유 형광 염료, 양자점, 양자비드, 형광 단백질, 형광 표지를 갖는 덴드리머(dendrimers), 마이크로-트랜스폰더(micro-transponder), 전자 공여 분자 또는 분자 구조, 또는 광 반사 입자가 또한 고려된다.

본 발명에 사용되는 것으로 고려되는 부가적인 표지에는 형광 염료(예를 들어, 플루오레신 이소티오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민 등), 방사능표지(예를 들어, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, 또는 ³²P), 효소(예를 들어, 당근과산화효소(HRP), 알칼라인 포스파타제 및 ELISA에 통상적으로 사용되는 것들), 및 콜로이드성 금, 착색된 유리 또는 플라스틱 비드(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등)와 같은 비색성(colorimetric) 표지, 및 발광 또는 화학발광 표지(예를 들어, 유로피 움(Eu), MSD 설포-태그)가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

상기 표지는 당업계에 공지된 방법에 따른 상기 분석의 소정의 성분에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 표지는 본 발명에 따른 활성제의 접합을 위해 이소시아네이트 또는 N-히드록시석시니미드 에스테르 시약을 이용하여 상기 성분에 공유적으로 결합된다. 본 발명의 일 측면에서, 이작용성(bifunctional) 이소시아네이트 시약은 그에 부착된 활성제 없이 표지 생체고분자 접합체를 형성하기 위해 상기 생체고분자에 표지를 접합시키는데 사용된다. 상기 표지 생체고분자 접합체는 본 발명에 따라 표지된 접합체의 합성을 위한 중간체로 사용될 수 있거나, 상기 생체고분자 접합체를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 상기에 지시된 바와 같이, 매우 다양한 표지가 사용될 수 있는데, 표지의 선택은 요구되는 민감성, 분석법의 소정의 성분과의 접합 용이성, 안정성 요건, 이용가능한 기구, 및 처리 규정에 좌우된다. 비-방사능 표지는 종종 간접적 수단에 의해 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자(예를 들어, 바이오틴)는 상기 분자에 공유적으로 결합된다. 그 후에 상기 리간드는 다른 분자(예를 들어, 스트렙타비딘)에 결합하는데, 이는 본래부터 검출가능하거나 검출가능 효소, 형광 화합물, 또는 화학발광 화합물과 같은 신호 시스템에 공유적으로 결합된다.

본 발명의 방법에 유용한 화합물은 또한 예를 들어, 효소 또는 형광단과의 접합에 의해, 신호-생성 화합물에 직접적으로 접합될 수 있다. 표지로 사용하기에 적당한 효소에는 히드롤라제(hydrolases), 특히 포스파타제, 에스터라제 및 글리코시다제, 또는 옥시도타제(oxidotases), 특히 퍼옥시다제가 포함되지만, 이들로 제 한되는 것은 아니다. 표지로 사용하기에 적당한 형광 화합물에는 상기에 언급된 것들과 플루오르세인 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론(umbleiferone), 에오신, TRITC-아민, 퀴닌(quinine), 플루오르세인 W, 아크리딘 옐로, 리사민(lissamine) 로다민, B 설포닐클로라이드 에리쓰로세인(B sulfonyl chloride erythroscein), 루테늄(트리스, 비피리디늄), 유로피움, 텍사스 레드, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 등이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 표지로 사용하기에 적당한 화학발광 화합물에는 MSD 설파-태그(MSD Sulfa-TAG), 유로피움(Eu), 사마리움(Sm), 루시페린 및 2,3-디히드로프탈라진디온(2,3-dihydrophthalazinediones), 예를 들어, 루미놀이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 다양한 표지 또는 신호 생산 시스템의 검토를 위해, 미합중국 특허 제4,391,904호를 참고하시오.

표지를 검출하기 위한 수단은 통상의 당업자에게 잘 알려져 있고 검출되는 표지의 유형에 따라 결정된다. 따라서, 예를 들어, 상기 표지가 방사능인 경우에, 검출 수단은 섬광 계수기(예를 들어, 방사능 면역분석, 섬광 근접 분석)(Pitas 등, Drug Metab Dispos. 34: 906-12, 2006) 또는 방사능사진촬영에서와 같은, 사진 필름을 포함한다. 상기 표지가 형광 표지인 경우에, 이는 적당한 파장의 빛으로 형광색소를 여기시키고 그 결과로 생성되는 형광을 검출함으로써 검출될 수 있다(예를 들어, ELISA, 유세포 분석, 또는 당업계에 공지된 다른 방법들). 상기 형광은 전하결합소자(charge coupled devices, CCDs) 또는 광전 증배관(photomultipliers) 등과 같은 전자적 검출기의 사용에 의해, 시각적으로 검출될 수 있다. 유사하게, 효소적 표지는 상기 효소에 대한 적합한 기질을 제공하고 그 결과로 생성되는 반응 생성물을 검출함으로써 검출될 수 있다. 비색성 또는 화학발광 표지는 상기 표지와 연관되는 색깔을 관찰함으로써 검출될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적당한 다른 표지 및 검출 시스템은 통상의 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 이렇게 표지된 조정자 및 리간드는 질환 또는 건강 상태의 진단에 사용될 수 있다.

상기 방법은 임의로 적어도 하나 이상의 세척 단계를 포함하는데, 결합된 TGF-β 조성물은 비결합 폴리펩티드에 의해 야기되는 배경 측정을 감소시키기 위해 단백질 결합을 측정하기 전에 세척된다. 상기 폴리펩티드 조성물의 인큐베이션 후 및 TGF-β 검출 전의 TGF-β 세척은 세정제(detergent)를 함유하는 적당한 완충액 내에서 수행된다. 적당한 세정제에는 알킬디메틸아민 옥사이드, 알킬글루코시드, 알킬말토시드, 알킬설페이트(예컨대 소듐 도데실 설페이트(SDS)), NP-40, 알킬티오글루코시드, 베타인, 담즙산, CHAP 시리즈, 디지토닌(digitonin), 글루카미드(glucamides), 레시틴/라이소레시틴, 트리톤-X(TRITON-X)를 포함하는 비이온성 폴리옥시에틸렌-계 세정제, 폴리소르베이트, 예컨대 트윈(TWEEN, 등록상표) 20 및 트윈 80, 브리즈(BRIJ, 등록상표), 제나폴(GENAPOL, 등록상표)　및 테시트(THESIT, 등록상표), 사차 암모늄 화합물 등이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한 문헌[Current Protocols in Protein Science, Appendix IB, Suppl. 11, 1998, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ]을 참고하시오. 적당한 세정제는 통상적인 실험을 통해 결정될 수 있다(문헌[Neugebauer, J., A Guide to the Properties and Use of Detergents in Biology and Biochemistry, Calbiochem-Novabiochem Corp., La Jolla, Calif., 1988] 참고).

피브린 실란트를 투여하는 방법

본 발명에 유용한 피브린 실란트는 당업계에 공지된 기술을 이용하여, 예를 들어 소정의 부위에 주사 또는 분무에 의해, 내시경으로, 스폰지-유사 담체, 사전-형성된 실란트 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 이용하여 대상에게 투여되는 것을 고려한다. 일 실시양태에서, 실란트는 주사되거나 분무되어 동일계 내에서 겔을 형성한다.

이러한 피브린 실란트는 통상의 당업자에게 자명해지는 바와 같이, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 하기에 기술된 상태를 포함하는, 생체 내에서 TGF-β의 지연/제어 방출로부터 이익을 볼 수 있는 대상에게 투여하는 것으로 의도된다. 일 실시양태에서, 상기 환자는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 근육, 관련 인대, 기타 결합조직, 및 뼈 및 연골의 질환을 포함하는 근골격계 질환; 이들로 제한되는 것은 아니지만, 근육, 섬유조직, 지방, 혈관, 및 윤활조직에 침범하는 장애를 포함하는 연조직 질환 또는 장애; 또는 심장혈관계 질환을 앓고 있다.

일 실시양태에서, 피브린 실란트는 골 이식을 위한 대체물로 제공되고, 따라서 이들로 제한되는 것은 아니지만, 척추유합술 케이지, 불-유합 결함의 치유, 골 증대술, 골 결절 수복 촉진, 골 조직 재건, 및 치과적 재생을 포함하는, 많은 동일한 징후에 적용될 수 있다. 또한, 다른 실시양태에서, 상기 실란트는 임플란트 이 식에 사용될 수 있다. 임플란트 이식 시, 임플란트는 인접하는 골 부위가 임플란트의 표면 위로 성장하도록 유도하고 헐거워짐(loosening) 및 기타 관련된 문제를 방지하는 피브린 실란트로 코팅될 수 있다. 다른 실시양태에서, 성장인자-강화 기질이 피부 내 만성 상처를 치유하는데 사용될 수 있다.

부가적인 골 또는 연골 장애 또는 상태에는 골관절염, 골다공증, 골형성장애, 구루병, 골연화증, 맥쿤-알브라이트 증후군(McCune-Albright syndrome), 알베르스-쉔베르크병(Albers-Schonberg disease), 파제트병(Paget's disease), 류마티스성 관절염, 골관절염, 연골 손상, 인공삽입물 주위의 골용해(periprosthetic osteolysis), 불완전 골생성증, 전이성 골 질환, 골연골종, 골생성, 골수염, 골병증, 골석화증, 골경화증, 다발연골염, 관절 연골 손상, 연골석회화증, 연골이형성증, 슬개골 연골연화증, 연골육종, 늑연골염, 골내연골종, 엄지발가락굽음증, 반달연골 손상, 관절순 열상(hip labral tear), 박리성 골연골염(ocd), 재발성 다발성 연골염 또는 골 또는 연골 형성의 촉진으로부터 이익을 볼 수 있는 임의의 상태가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

부가적인 결합조직 장애에는 엘러스-단로스 증후군(Ehlers-Danlos syndrome), 마르판(Marfan) 증후군, 공피증, 이완피부증, 뒤퓌트렌병(Dupuytren's disease), 제한적 공피증, 혼합 결합조직 질환, 스티클러 증후군 및 기타 결합조직 질환이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

TGF 단백질을 함유하는 피브린 실란트는 또한, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 건염, 혈액낭염, 근막통증증후군, 류마티스 질환 침범 연조직, 티쩨증후 군(Tietze's syndrome), 늑연골염, 근막염, 골부착부염, 구조성 장애, 육종 및 연조직에 영향을 주는 기타 상태를 포함하는, 연조직 질환 또는 상태를 치료하는데 유용하다.

TGF 단백질을 함유하는 피브린 실란트는 또한, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 허혈/재관류, 심근경색증, 울혈성 심장 기능상실, 죽상동맥경화증, 고혈압, 재협착, 동맥 염증, 심장동맥질환(CAD), 뇌졸중, 관 또는 심장 석회화, 혈전증, 말초혈관병, 혈관벽 재형성, 심실 재형성, 빠른 심실 조율, 심장 미세색전증, 빈맥, 서맥, 압력과부하, 대동맥 굴곡, 심장동맥 결찰, 심혈관질환, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 석회화에 의해 야기되는 판막 변성, 류마티스심장병, 심내막염, 또는 인공 판막의 합병증을 포함하는 판막질환; 심방세동, Q-T 간격 연장증후군, 굴심방결절 기능장애, 협심증, 심장기능상실, 고혈압, 심방세동, 심방조동, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 심낭삼출 및 심장막염을 포함하는 심장막병; 심장근육병증, 심장비후 또는 심장혈관계 발달장애를 포함하는, 심장혈관계 질환 또는 상태를 치료하는데 유용하다.

키트

키트가 또한 본 발명의 범위 이내에서 고려된다. 전형적인 키트는 FC 및 트롬빈 성분을 함유하는 피브린 실란트를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서 상기 키트는 피브린 실란트 내로의 혼입을 위한 TGF-β 단백질을 추가로 포함한다. 일 측면에서, 각 성분은 각각의 개별 보관 용기, 바이알 또는 관 내에 포함될 수 있다. 관련 측면에서, TGF-β는 FC 성분과의 혼합물일 수 있고 트롬빈 성분은 개별적인 보관 용기에 있을 수 있다. 관련 실시양태에서, 상기 보관 용기는 바이알, 병, 주머니, 저장소, 튜브, 블리스터, 파우치, 부착포 등이다. 상기 제형의 구성성분의 하나 이상은 동결건조, 냉동-건조, 분무 냉동-건조, 또는 임의의 다른 재구성 가능한 형태일 수 있다. 바람직하다면 다양한 재구성 매질이 추가로 제공될 수 있다.

상기 키트의 성분은 냉동되거나, 액체이거나 또는 동결건조된 형태일 수 있다. 상기 키트는 대상에게 피브린 겔을 투여하는데 적당한 기구를 포함하는 것이 추가로 고려된다. 추가 실시양태에서, 상기 키트는 또한 피브린 실란트를 제조하고 투여하기 위한 설명서를 포함한다.

본 발명의 부가적인 측면 및 세부사항은 제한하기 보다는 예시적인 것으로 의도되는, 하기 실시예로부터 자명해질 것이다.

실시예 1

재료 및 방법

8종의 다른 피브린 겔(티셀 VH(상품명) 또는 VH S/D(상품명))(S/D는 증가된 안전성을 제공하도록 추가된 바이러스 불활성화 단계임)(백스터 AG, 오스트리아 비엔나 소재) 제형을 각각 5-40 ㎎/㎖ 및 2-250 IU/㎖(겔 내 최종 농도)로 서로 다른 농도의 FC 및 트롬빈을 이용하여 제조하였다. 피브린 겔(총 0.3 ml)을 24-웰 배양 플레이트에서 제조하였다. 상기 FC 성분은 섬유소용해 억제제인 아프로티닌을 3000 KIU/㎖로 함유하고 있다.

5 내지 40 ng/0.3 ml 겔 농도의 재조합 인간(rh) TGF-β1(R&D 시스템즈), 또는 15 ng/0.3 ml 겔 농도의 rhTGF-β2(R&D 시스템즈, 미합중국 미네소타주 미네아폴리스 소재), 또는 15 ng/0.3 ml 겔 농도의 rhTGF-β3(R&D 시스템즈)을 겔 제조 시점에서 상기 FC 성분에 첨가하였다. 모든 겔을 표준 HMSC 성장 배지(론자 워커스빌 인크, 이전에는 캄브렉스 바이오사이언스 워커스빌 인크, 미합중국 메릴랜드주 워커스빌 소재)를 이용하여 10일 이하 동안 5% CO₂ 중에서 37℃로 인큐베이션 하였다. 배지를 매일 교체해 주었다. 배지 시료는 효소결합 면역흡수 분석법(ELISA)(R&D 시스템즈)에 의해 TGF-β의 양을 검사하기 전까지 냉동시켰다. 초기에 첨가된 TGF-β1의 완전한 회수를 확인하기 위해, 일부 겔을 10일간 인큐베이션한 후 유로키나제를 이용하여 용해시키고 상청액을 또한 ELISA로 검사하였다.

여러 방출 동역학을 수행하였다:

1. 방출 동역학에 대한 TGF-β1 양의 효과를 티셀 VH(상품명)로 제조된 단일 피브린 겔 제형(25 ㎎/㎖의 FC 농도 및 2 IU/㎖의 트롬빈 농도, 겔 내 최종 농도)을 이용하여 분석하였다.

2. TGF-β1 방출 동역학에 대한 고정된 트롬빈 농도(2 IU/㎖, 겔 내 최종 농도)를 갖는 FC 농도의 효과를 4종의 다른 FC 농도의 티셀 VH(상품명)을 이용하여 분석하였다.

3. TGF-β1 방출 동역학에 대한 고정된 트롬빈 농도(2 IU/㎖, 겔 내 최종 농 도)를 갖는 FC 농도의 효과를 4종의 다른 FC 농도의 티셀 VH S/D(상품명)을 이용하여 분석하였다.

4. TGF-β1 방출 동역학에 대한 고정된 FC 농도(25 ㎎/㎖, 겔 내 최종 농도)를 갖는 트롬빈 농도의 효과를 4종의 다른 트롬빈 농도의 티셀 VH(상품명)을 이용하여 분석하였다.

5. TGF-β1의 방출 동역학에 대한 티셀 VH(상품명) 또는 티셀 VH S/D(상품명)의 로트넘버를 달리하는 효과를 단일 피브린 겔 제형(20 ㎎/㎖의 FC 농도 및 2 IU/㎖의 트롬빈 농도, 겔 내 최종 농도)을 이용하여 분석하였다.

6. TGF-β2 방출 동역학에 대한 고정된 트롬빈 농도(2 IU/㎖, 겔 내 최종 농도)를 갖는 FC 농도의 효과를 4종의 다른 FC 농도의 티셀 VH(상품명)을 이용하여 분석하였다.

7. TGF-β3 방출 동역학에 대한 고정된 트롬빈 농도(2 IU/㎖, 겔 내 최종 농도)를 갖는 FC 농도의 효과를 4종의 다른 FC 농도의 티셀 VH(상품명)을 이용하여 분석하였다.

겔 표면에 접종된 HMSC에 대한 피브린 겔에 첨가된 TGF-β1(15 ng/0.3 ml 겔)의 효과를 형광 현미경으로 분석하였다. FC에 TGF-β1이 첨가되지 않은 겔을 대조군으로 사용하였다. 약 10,000개의 HMSC(론자 워커스빌 인크)를 5-40 ㎎/㎖의 FC 농도 및 2-250 IU/㎖의 트롬빈 농도(겔 내 최종 농도)를 갖는 24-웰 플레이트에 제조된 겔의 상부에 접종하였다. 상기 겔 내에 첨가된 TGF-β1의 존재 또는 부재 시에 세포의 형태 및 이동을 관찰하기 위해 1일, 4일, 7일 및 10일째에 세포와 함 께 겔을 칼세인/에티디움 브로마이드로 염색하였다.

방출된 TGF-β1의 생물학적 활성을 검사하기 위해, 3일째 겔 유래 배지 상청액(본래부터 첨가된 TGF-β1을 함유하지 않거나(대조군), 15 ng의 TGF-β1/0.3 ml 겔을 함유함. 겔은 20 ㎎/㎖의 FC 및 2 IU/㎖의 트롬빈(겔 내 최종 농도)으로 제조됨)을 HMSC 단층을 위한 배양 배지로 사용하였다. 새로 첨가된 TGF-β1을 함유하는 배지에서 배양된 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 7일째까지의 세포 형태에 있어서의 변화를 칼세인 염료로 염색한 후 광학 및 형광 현미경으로 분석하였다. 세포 증식을 또한 칼세인 염료 염색 후 세포 단층의 전체 형광 강도를 측정(흡광도에 의해 측정)함으로써 분석하였다. 결과를 1일째에 대해 표준화하였다. 세포 증식을 글리코아미노글리칸의 존재를 나타내는데 사용되는 알시안 블루 염색(연골형성에 대한), 및 알칼라인 포스파타제(ALP) 활성과 알리자린 레드 염색(골형성에 대한)으로 분석하였다. ALP 활성 결과(처음에는 IU/㎖로 계산됨)는 증식 상태에 대해 표준화하였다. 일부 겔은, TGF-β1이 첨가된 겔 유래 배지 상청액을 이용하여 관찰되는 임의의 변화가 실제로 겔 자체로부터 방출될 수 있는 일부 기타 생활성 성분에 의해서가 아니라 방출된 TGF-β1에 의해 유도되었음을 보장하기 위해 대조군 시료용으로 TGF-β1을 첨가하지 않고 제조하였다.

마지막으로, 피브린 겔 내로 접종된 HMSC 및 상기 겔 표면에 접종된 인간 제대 혈관내피세포(HUVEC, 론자 워커스빌 인크)의 행동에 대한 TGF-β1의 효과를 분석하기 위해, 10 ㎎/㎖의 FC 및 2 IU/㎖의 트롬빈(겔 내 최종 농도)을 함유하는 겔을 단일 배양 세포(HMSC 또는 HUVEC) 또는 4:1의 HMSC:HUVEC 비율로 동시-배양 세 포를 이용하여 제조하였다. 재조합 인간 TGF-β1(5 ng/0.3 ml 겔, R&D 시스템즈)을 상기 겔의 제조 시에 동시-배양 겔의 절반으로 FC에 첨가하였다. 겔을 혈청 보충제 함유 표준 내피세포 성장 배양배지(론자 워커스빌 인크)를 이용하여 21일 이하 동안 5% CO₂에서 37℃로 인큐베이션 하였다. 세포 형태 및 증식과 골형성 분화의 분석을 1일, 7일, 14일 및 21일째에 수행하였다. HUVEC의 서로 연결된 세포-세포 네트워크로의 재구성(골형성 분화의 초기 현상)을 포함하는 세포 형태를 칼세인 염료로 염색한 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 세포 증식은 정제된, 농축 소 트립신 용액 내에 피브린 겔을 용해시킨 후 세포 현탁액의 형광 강도에 의해 측정되었다. 마지막으로, ALP 활성은 골형성 분화의 초기 마커로서 측정되었다. 통계학적 분석은 유의 수준 5%로 아노바(ANOVA) 검사를 이용하여 수행되었다.

실시예 2 - 피브린 겔 내 다른 농도로 첨가된 TGF-β1의 방출 동역학

피브린 겔로부터 그의 방출 동역학에 대한 TGF-β1 양의 효과를 티셀 VH(상품명)로 제조된 단일 피브린 겔 제형(25 ㎎/㎖의 FC 농도 및 2 IU/㎖의 트롬빈 농도, 겔 내 최종 농도)을 이용하여 분석하였다. 상기 겔로부터의 일일(도 1) 및 누적(도 2) TGF-β1 방출량에 대한 TGF-β1 양의 효과 분석은 TGF-β1 방출 수준이 FC 성분에 초기에 첨가된 성장인자의 양에 비례함을 보여주었다. 전체적으로, 이 피브린 겔 제형을 이용한 결과는 초기에 첨가된 TGF-β1의 약 45% 내지 52%만이 10일 후에 방출됨을 나타내었다(도 2). 다시 말하면, 초기에 첨가된 TGF-β1의 약 48% 내지 55%가 10일 후에도 피브린 겔 내에 보유되었다. 단 3일 후의 TGF-β1의 누적 방출량을 고려한다면, 최소 보유는 약 80%이었다.

실시예 3 - FC 또는 트롬빈의 농도를 달리하는 피브린 겔로부터 TGF-β1의 방출 동역학

고정된 트롬빈 농도(2 IU/㎖)(티셀 VH)에서 TGF-β1 방출 동역학에 대한 FC 농도의 효과: 티셀 VH(상품명) 피브린 실란트를 이용할 때 TGF-β1 방출 동역학에 대한 FC 농도의 효과를 결정하기 위해, 방출을 티셀 VH의 4종의 다른 FC 농도(5, 10, 20 및 40 ㎎/㎖, 겔 내 최종 농도)에 대해 고정된 트롬빈 농도(2 IU/㎖)를 갖는 겔을 이용하여 분석하였다.

ELISA에 의한 일일 TGF-β1 방출량 분석은 분석된 모든 FC 농도에 대해 1일째에 스파이크(spike) 방출 및 10일째까지의 방출에 있어 감소를 나타내었다(도 3). 상기 방출은 더 낮은 FC 농도를 함유하는 겔의 경우 현저히 높았는데, 이는 방출 동역학에 대한 FC 농도의 효과, 및 피브린 겔의 FC 성분 단백질과 TGF-β1과의 잠재적 결합 친화력을 나타낸다. 10일째까지의 TGF-β1의 누적 방출량은 또한 성장인자의 초기 첨가된 양(15 ng)보다 낮았는데, 누적 방출량의 최대 백분율은 약 75%(5 ㎎/㎖의 FC 함유)이었고, 최소 백분율은 약 25%(40 ㎎/㎖의 FC 함유)이었다(도 4). 따라서, 이러한 결과는 10일 후에 약 25%(5 ㎎/㎖의 FC 함유)의 최소 보유 및 약 75%(40 ㎎/㎖의 FC 함유)의 최대 보유를 나타내었다. 단 3일 후의 TGF-β1의 누적 방출량을 고려한다면, 최소 보유는 약 60%(5 ㎎/㎖의 FC 함유)이었고 최대 보유는 약 90%(40 ㎎/㎖의 FC 함유)이었다.

고정된 트롬빈 농도(2 IU/㎖)(티셀 VH S/D(상품명))에서 TGF-β1 방출 동역학에 대한 FC 농도의 효과: 티셀 VH S/D(상품명) 피브린 실란트를 이용할 때 TGF-β1 방출 동역학에 대한 FC 농도의 효과를 결정하기 위해, 방출을 티셀 VH S/D(상품명)의 4종의 다른 FC 농도(5, 10, 20 및 40 ㎎/㎖, 겔 내 최종 농도)에 대해 고정된 트롬빈 농도(2 IU/㎖)를 갖는 겔을 이용하여 분석하였다.

ELISA에 의한 일일 TGF-β1 방출량 분석은 분석된 모든 FC 농도에 대해 1일째에 스파이크 방출 및 10일째까지의 방출에 있어 감소를 나타내었다(도 5). 상기 방출은 보다 낮은 FC 농도를 함유하는 겔의 경우 현저히 높았는데, 이는 방출 동역학에 대한 FC 농도의 효과, 및 피브린 겔의 FC 성분 단백질과 TGF-β1과의 잠재적 결합 친화력을 나타낸다. 10일째까지의 TGF-β1의 누적 방출량은 두 개의 가장 낮은 FC 농도(5 ㎎/㎖ 및 10 ㎎/㎖, 겔 내 최종 농도)의 경우 약 70%(40 ㎎/㎖의 FC 함유) 내지 거의 100%(93% 이상)에 도달하였다(도 6). 따라서, 최대 보유는 10일 후에 약 30%(40 ㎎/㎖의 FC 함유)이었다. 단 3일 후의 TGF-β1의 누적 방출량을 고려한다면, 최소 보유는 약 35%(5 ㎎/㎖의 FC 함유)이었고 최대 보유는 약 75%(40 ㎎/㎖의 FC 함유)이었다.

고정된 FC 농도(25 ㎎/㎖)에서 TGF-β1 방출(티셀 VH S/D(상품명))에 대한 트롬빈 농도의 효과: TGF-β1 방출 동역학에 대한 트롬빈 농도의 효과를 결정하기 위해, 방출을 티셀 VH의 4종의 다른 트롬빈 농도(2, 10, 50 및 150 IU/㎖, 겔 내 최종 농도)에 대해 고정된 FC 농도(25 ㎎/㎖)를 갖는 겔을 이용하여 분석하였다.

ELISA에 의한 일일 TGF-β1 방출량 분석은 분석된 모든 FC 농도에 대해 1일째에 스파이크 방출 및 10일째까지의 방출에 있어 감소를 나타내었다(도 7). 상기 방출은 2, 10 및 50 IU/㎖의 트롬빈에서 유사(3일 후 약 15% 방출(즉, 85% 보유), 및 10일 후 약 35% 방출(즉, 65% 보유))하였는데, 이는 트롬빈 농도가 TGF-β1 방출에 대해 FC 농도보다 더 약한 효과를 가짐을 제시하는 것이다. TGF-β1 방출은 가장 높은 트롬빈 농도(250 IU/㎖)에서 다만 유의미하게 더 높았는데, 이는 이렇게 높은 트롬빈 농도를 갖는 겔의 더욱 불균질한 구조로 인한 것인 듯하다. FC의 효과와 유사하게, 10일째까지의 TGF-β1의 누적 방출량은 성장인자의 초기 첨가된 양보다는 낮았다(도 8).

TGF-β1 방출에 대한 티셀 VH(상품명) 또는 티셀 VH S/D(상품명)의 로트넘버를 달리하는 효과: TGF-β1의 방출 동역학에 대한 티셀 VH(상품명) 또는 티셀 VH S/D(상품명)의 로트넘버를 달리하는 효과를 단일 피브린 겔 제형(20 ㎎/㎖의 FC 농도 및 2 IU/㎖의 트롬빈 농도, 겔 내 최종 농도)을 이용하여 분석하였다.

티셀 VH(상품명)로부터 FC 로트넘버를 달리하는 효과의 분석은 10일 후에 로트넘버에 따라 약 32% 내지 완전 방출의 누적 방출량을 나타내었다(도 9). 다시 말하면, 결과는 10일 후에 로트넘버에 따라 미미한 수준의 보유 내지 68%의 최대 보유를 나타내었다. 상기 결과는 이렇게 다른 로트 내 인자 XIII 함량에 의해 확 증되는데, 가장 낮은 % 방출(즉, 가장 높은 보유)은 가장 높은 양의 인자 XIII를 함유하는 로트넘버에서 수득된다(<1 U/㎖의 인자 XIII를 함유하는 로트 1, 33.9 U/㎖를 함유하는 로트 2 및 42.2 U/㎖를 함유하는 로트 3). 단 3일 후의 TGF-β1의 누적 방출량을 고려한다면, 최소 보유는 약 43%(로트 1 이용)이었고 최대 보유는 약 85%(로트 3 이용)이었다.

티셀 VH S/D(상품명)로부터 FC 로트넘버를 달리하는 효과의 분석은 10일 후에 로트넘버에 따라 약 80% 내지 완전 방출의 누적 방출량을 나타내었다(도 10). 따라서 결과는 10일 후에 미미한 수준의 보유 내지 20%의 최대 보유를 나타내었다. 이러한 로트들 내 인자 XIII 함량은 3 U/㎖ 이하였다. 단 3일 후의 TGF-β1의 누적 방출량을 고려한다면, 최소 보유는 약 57%(로트 1 이용)이었고 최대 보유는 약 67%(로트 3 이용)이었다.

실시예 4 - TGF-β의 다른 이성질체(TGF-β2 및 TGF-β3)의 방출 동역학

TGF-β2의 방출 동역학: 티셀 VH(상품명) 피브린 실란트로부터의 TGF-β2 방출 동역학에 대한 FC 농도의 효과를 티셀 VH(상품명)의 4종의 다른 FC 농도(5, 10, 20 및 40 ㎎/㎖, 겔 내 최종 농도)에 대해 고정된 트롬빈 농도(2 IU/㎖)를 갖는 겔을 이용하여 분석하였다.

ELISA 결과는 누적 TGF-β2 방출량이 적어도 초기 시점에서는 더 낮은 FC 농도를 함유하는 겔에서 유의하게 더 높다는 것을 보여주었는데, 이는 TGF-β2 방출 동역학에 대한 FC 농도의 효과, 및 피브린 겔의 FC 성분 단백질과 TGF-β2와의 잠 재적 결합 친화력을 제시하는 것이다. 10일째까지, 상기 방출은 85%(40 ㎎/㎖의 FC 함유) 내지 더 낮은 FC 농도를 함유하는 다른 제형의 경우에 100%에 도달하였다. 다시 말하면, 이러한 결과는 10일 후에 약 15%(40 ㎎/㎖의 FC 함유)의 최대 보유를 나타내었다. 단 3일 후의 TGF-β2의 누적 방출량을 고려한다면, 최소 보유는 약 25%(5 ㎎/㎖의 FC 함유)이었고 최대 보유는 약 70%(40 ㎎/㎖의 FC)이었다.

TGF-β3의 방출 동역학: 티셀 VH(상품명) 피브린 실란트로부터 TGF-β3 방출 동역학에 대한 FC 농도의 효과를 티셀 VH(상품명)의 4종의 다른 FC 농도(5, 10, 20 및 40 ㎎/㎖, 겔 내 최종 농도)에 대해 고정된 트롬빈 농도(2 IU/㎖)를 갖는 겔을 이용하여 분석하였다.

ELISA 결과는 누적 TGF-β3 방출량이 더 낮은 FC 농도를 함유하는 겔에서 유의하게 더 높다는 것을 보여주었는데, 이는 TGF-β3 방출 동역학에 대한 FC 농도의 효과, 및 피브린 겔의 FC 성분 단백질과 TGF-β3과의 잠재적 결합 친화력을 제시하는 것이다. 10일째까지의 TGF-β3의 누적 방출량은 또한 성장인자의 초기 첨가된 양보다 낮았는데, 누적 방출량의 최대 백분율은 약 75%(5 ㎎/㎖의 FC 함유)이었고 최소 백분율은 약 30%(40 ㎎/㎖의 FC)이었다. 다시 말하면, 이러한 결과는 10일 후에 약 25%(5 ㎎/㎖의 FC 함유)의 최소 보유 및 약 70%(40 ㎎/㎖의 FC 함유)의 최대 보유를 나타내었다. 단 3일 후의 TGF-β3의 누적 방출량을 고려한다면, 최소 보유는 약 55%(5 ㎎/㎖의 FC 함유)이었고 최대 보유는 약 90%(40 ㎎/㎖의 FC 함유)이었다.

실시예 5 - 피브린 겔의 표면에 접종된 HMSC에 대한 TGF-β1의 효과

인간 중간엽 줄기세포(HMSC)는 연골세포, 골모세포, 지방세포 및 근육세포를 포함하는 다른 특정화된 조직세포 유형으로 분화할 수 있는 다능성 전구세포이다(Caplan AI, J Orthop Res 9: 641-650, 1991). 이러한 세포의 예탁 및 분화는 특이적인 성장인자 뿐만 아니라 세포 상호작용을 포함하는, 다양한 요인들에 의해 조절된다. 성장인자의 TGF-β 패밀리 멤버들은 MSC 성숙의 조절자인 것으로 확인되었다. 구체적으로, TGF-β1은 아마도 MSC의 연골형성 또는 골형성 계통으로의 분화를 유도함으로써 연골 및 골 발달에 관여한다(Centrella 등, Endocrine Rev, 15: 27-39, 1994). 또한, TGF-β1은 혈관형성의 다른 측면, 골 성장 동안의 결정적인 과정에 관여하는 중요한 혈관형성 인자이다. 혈관형성 및 혈관 재형성에서 TGF-β 신호전달 기작의 중요성에 대해 수많은 연구가 보고되었다(Bertolino 등, Chest 128: 6, 2005). 마지막으로, TGF-β는 모세관 형태형성 및 혈관 벽 보전에 중요한 역할을 담당하는 것으로 나타났다(Pepper MS. Cytokine & Growth Factor Reviews 8(1): 21-43, 1997).

겔 표면에 접종된 HMSC에 대한 피브린 겔 내에 첨가된 TGF-β1(15 ng/0.3 ml 겔)의 효과를 형광 현미경으로 분석하였다. FC에 TGF-β1이 첨가되지 않은 겔을 대조군으로 사용하였다. 약 10,000개의 HMSC(론자 워커스빌 인크)를 5-40 ㎎/㎖의 FC 농도 및 2-250 IU/㎖의 트롬빈 농도(겔 내 최종 농도)를 갖는, 24-웰 플레이트에 제조된 겔의 상부에 접종하였다. 상기 겔에 첨가된 TGF-β1의 존재 또는 부재 시에 세포의 형태 및 이동을 관찰하기 위해 1일, 4일, 7일 및 10일째에 세포와 함께 겔을 칼세인/에티디움 브로마이드로 염색하였다.

겔 표면에 HMSC가 접종되어 있는 겔의 형광 현미경 분석은 상기 겔 내 TGF-β1을 첨가하거나 첨가하지 않은 경우에, 분석된 모든 겔 제형에 대해 HMSC가 잘 증식하였고 이미 7일째에 단층을 형성하였음을 보여주었다. 결과는 또한 피브린 겔 내에 첨가된 TGF-β1이 HMSC가 상기 겔 표면에서 배양될 때 HMSC 형태 및 겔 내로의 이동에 영향을 미침을 나타내었다. 실제로, 세포는 TGF-β1을 첨가하지 않고 제조된 겔 상에서는 가늘고 긴 모양을 나타내었지만, TGF-β1을 첨가하여 제조된 겔의 표면에 접종되었을 때에는 보다 정사각형 내지 다각형의 모양을 갖는다. 겔에 첨가된 TGF-β1의 존재 시에 MSC의 보다 정사각형 내지 다각형의 모양은 이들의 골형성 및/또는 연골형성 표현형으로의 분화를 나타낸다. 또한, TGF-β1을 첨가하지 않고 제조된 겔의 내부로 일부 세포가 이동하는 반면, TGF-β1을 첨가하여 제조된 겔의 표면상에는 대부분이 잔존하였다.

TGF-β1을 첨가하여 제조된 겔 내부로의 세포 이동의 부재는 상기 겔상에 접종된 세포에 TGF-β1을 전달하는 피브린 겔의 능력을 나타낸다. 본 발명의 피브린 겔에 의해 TGF-β1을 생체 내 환경에서 인접 지역 내 세포에 전달할 수 있다.

실시예 6 - 시험관 내에서 HMSC 단층에 대한 방출된 TGF-β1의 생물학적 활성

방출된 TGF-β1의 생물학적 활성을 검사하기 위해, 3일째 겔 유래 배지 상청 액(원래부터 TGF-β1을 포함하지 않거나(대조군), 15 ng의 TGF-β1/0.3 ml 겔 함유(겔 내 최종 농도), 겔은 20 ㎎/㎖의 FC 및 2 IU/㎖의 트롬빈으로 제조됨)을 HMSC 단층용 배양 배지로 사용하였다. 새로 첨가된 TGF-β1을 함유하는 배지에서 배양된 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 7일까지의 세포 형태에 있어서의 변화를 칼세인 염료로 염색한 후 광학 및 형광 현미경으로 분석하였다. 세포 증식을 또한 칼세인 염료 염색 후 세포 단층의 전체 형광 강도를 측정(흡광도로 측정됨)함으로써 분석하였다. 결과를 1일째에 대해 표준화하였다. 세포 증식을 글리코아미노글리칸(연골생성에 대한)의 존재를 보여주는데 사용되는 알시안 블루 염색과, 알칼라인 포스파타제(ALP) 활성 및 알리자린 레드 염색(골생성에 대한)으로 분석하였다. ALP 활성 결과(처음에는 IU/㎖로 계산됨)를 증식 상태에 대해 표준화하였다. 일부 겔은 TGF-β1이 첨가된 겔 유래 배지 상청액에서 관찰되는 임의의 변화가 겔 자체로부터 방출될 수 있는 일부 기타 생활성 성분에 의해서가 아니라 실제로 방출된 TGF-β1에 유도되었음을 보장하기 위해 대조군 시료용으로 TGF-β1을 첨가하지 않고 제조하였다.

3일째에 TGF-β1이 첨가된 겔 유래 배지 상청액 내(즉, 방출된 TGF-β1 함유 배지 내)에서 배양된 HMSC 단층은 이미 4일째에 형태에 있어서의 변화를 나타내었고 7일째에는 더욱 명확해졌다. 이들은 TGF-β1이 첨가되지 않은 겔 유래 배지 상청액에서 배양된 세포들에 비해 보다 정사각형 내지 다각형의 모양을 가지고 있고, 새로 첨가된 TGF-β1을 함유하는 배지(양성 대조군)에서 배양된 세포들과 유사한 모양을 가지고 있다.

4일 및 7일째 세포 증식을 1일째(기준선) 증식상태에 대해 표준화하였다. TGF-β1이 첨가된 겔 유래 배지 상청액 내(즉, 방출된 TGF-β1 함유 배지 내)에서 배양된 세포의 증식은 TGF-β1이 첨가되지 않은 겔 유래 배지 상청액에서 배양된 세포의 증식보다 감소하는 경향을 보였고, 새로 첨가된 TGF-β1을 함유하는 배지에서 배양된 세포의 증식과는 유사한 경향을 보였다(도 11).

TGF-β1이 첨가된 겔 유래 배지 생청액 내(즉, 방출된 TGF-β1 함유 배지 내)에서 단층으로 배양된 후 보다 정사각형 내지 다각형 모양으로의 HMSC 형태의 변화는 세포 증식을 나타내며, 이는 TGF-β1이 첨가되지 않은 겔 유래 배지 상청액 내에서 배양된 세포와 비교하여 더 낮은 증식을 나타내는 경향과 일치한다.

연골형성 또는 골형성 표현형으로의 세포 분화는 알리자린 레드(골형성에 대해)와 알리시안 블루(연골형성에 대해)로의 염색 및 ALP 활성에 의해 평가하였다. 알리시안 블루 염색은 TGF-β1이 첨가된 겔 유래 배지 상청액 내(즉, 방출된 TGF-β1 함유 배지 내)에서 배양된 HMSC에서 시간의 경과에 따라 증가하였고, 7일째에, 염색의 양은 TGF-β1이 첨가되지 않은 겔 유래 배지 상청액 내에서 배양된 HMSC에서 유의하게 더 높았으며, 새로 첨가된 TGF-β1 함유 배지에서 배양된 HMSC에서와는 유사하였다. 알리자린 레드 염색은 모든 시료에 음성으로 나타났다. ALP 활성은 TGF-β1이 첨가된 겔 유래 배지 상청액 내에서 배양된 HMSC에서 4일 및 7일 사이에 감소하였다(도 12). 이는 이미 4일째에 TGF-β1이 첨가되지 않은 겔 유래 배지 상청액 내에서 배양된 HMSC에서 검출된 수준보다는 현저히 낮았고(4일째 p=0.005 및 7일째 p=3E-06), 새로 첨가된 TGF-β1 함유 배지에서 배양된 HMSC에서 검출된 수준과는 유사하였다.

세포 형태에 있어서의 변화, 증식 및 연골형성 분화는 TGF-β1이 겔로부터의 방출 후에도 여전히 생물학적으로 활성임을 입증하는 것이다.

실시예 7 - 피브린 겔의 내부에 접종된 HMSC 및 피브린 겔의 표면에 접종된 HUVEC에 대한 TGF-β1의 효과

피브린 겔 내에 접종된 HMSC 및 상기 겔 표면에 접종된 인간 제대 혈관내피세포(HUVEC, 론자 워커스빌 인크)의 행동에 대한 TGF-β1의 효과를 분석하기 위해, 10 ㎎/㎖의 FC 및 2 IU/㎖의 트롬빈(겔 내 최종 농도)을 함유하는 겔을 단일 배양 세포(HMSC 또는 HUVEC) 또는 4:1의 HMSC:HUVEC 비율로 동시-배양 세포를 이용하여 제조하였다. 재조합 TGF-β1(5 ng/0.3 ml 겔)을 상기 겔의 제조 시에 동시-배양 겔의 반으로 FC 내에 첨가하였다. 겔을 혈청 보충제 함유 표준 내피세포 성장 배양배지(론자 워커스빌 인크)를 이용하여 21일 이하의 기간 동안 5% CO₂에서 37℃로 인큐베이션 하였다. 세포 형태 및 증식과 골형성 분화의 분석을 1일, 7일, 14일 및 21일째에 수행하였다. HUVEC의 서로 연결된 세포-세포 네트워크로의 재구성(골형성 분화의 초기 현상)을 포함하는 세포 형태를 칼세인 염료를 이용한 염색 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 세포 증식은 정제된, 농축 소 트립신 용액 내에 피브린 겔을 용해시킨 후 세포 현탁액의 형광 강도로 측정하였다. 마지막으로, 표준 알칼라인 포스파타제(ALP) 활성은 골형성 증식의 초기 마커로서 측정되었다.

형광 현미경 분석은 TGF-β1이 첨가된 동시-배양 겔 또는 단일 배양 겔에 접종될 때 HMSC가 더 고르게 분산되었고 더 가늘고 긴 모양을 가지고 있음을 나타내었다. HMSC는 더 작았고 TGF-β1이 첨가되지 않은 동시-배양 겔의 바닥으로 이동하는 경향을 보였다. 서로 연결된 세포-세포 네트워크로의 HUVEC 재구성(골형성 분화의 초기 현상)은 TGF-β1이 첨가되지 않은 동시-배양 겔에 비하여 TGF-β1을 함유하는 동시-배양 겔 및 단일 배양에서 더 일찍 개시되었고 더 넓은 수준으로 발생하였다.

세포 증식은 시간의 경과에 따라 증가하였다. TGF-β1이 첨가된 겔과 첨가되지 않은 겔 사이에서 어떠한 유의미한 차이도 관찰되지 않았다. 모든 HMSC-함유 조건에 대한 ALP 활성은 시간의 경과에 따라 증가하였다. ALP 활성 수준은 7일째를 제외하고는, TGF-β1이 첨가되지 않은 겔과 비교하여 TGF-β1이 첨가된 겔에서 더 높은 경향을 보였다. 이는 TGF-β1이 첨가된 겔에서 14일 후 초기 골형성 분화에 있어서의 증가를 나타내지만, 이는 또한 TGF-β1의 존재 시에 가능한 더 많은 개수의 HMSC를 반영할 수 있다. 수행된 증식 분석은 두 세포 유형을 구별하지 못하기 때문에, 상기 ALP 활성 수준이 HMSC의 전체 개수와 직접적으로 관련될 수는 없다.

상기 예시적인 실시예에 개시된 바와 같은 많은 변형 및 변이가 통상의 당업자에게 야기될 수 있음이 기대된다. 따라서 첨부된 청구범위에 나타나는 바와 같은 그러한 제한만이 본 발명에서 인정될 것이다.

Claims

피브린 실란트로부터 전환성장인자-베타(TGF-β) 단백질의 방출을 변경하는 방법이며, 상기 단백질은 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 피브린 실란트는 피브리노겐 복합체 성분, 트롬빈 성분 및 TGF-β 성분의 혼합물에 의해 제조되며, 상기 방법은

a) 공지된 초기 양의 TGF-β 및 공지된 최종 농도의 피브리노겐 복합체를 갖는 제1 피브린 실란트로부터 방출되는 TGF-β의 양을 측정하는 단계, 및

b) 단계 a)의 제1 피브린 실란트에 사용된 피브리노겐 복합체의 공지된 최종 농도를 변경하여 제2 피브린 실란트를 제조하는 단계를 포함하고,

여기서, 상기 제1 실란트 내 공지된 최종 농도의 피브리노겐 복합체와 비교하여 제2 실란트 내 피브리노겐 복합체의 농도를 증가시키는 것은 단계 a)의 제1 실란트로부터 TGF-β의 방출에 비해 제2 실란트로부터의 TGF-β 방출 속도를 감소시키고,

상기 제2 실란트는 단계 a)에서의 제1 실란트와 동일한 초기 양의 TGF-β를 갖는 것인, 피브린 실란트로부터 TGF-β 단백질의 방출을 변경하는 방법.
피브린 실란트로부터 전환성장인자-베타(TGF-β) 단백질의 방출을 변경하는 방법이며, 상기 단백질은 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 피브린 실란트는 피브리노겐 복합체 성분, 트롬빈 성분 및 TGF-β 성 분의 혼합물에 의해 제조되며, 상기 방법은

a) 공지된 초기 양의 TGF-β 및 공지된 최종 농도의 피브리노겐 복합체를 갖는 제1 피브린 실란트로부터 방출되는 TGF-β의 양을 측정하는 단계; 및

b) 단계 a)의 제1 피브린 실란트에 사용된 피브리노겐 복합체의 공지된 최종 농도를 변경하여 제2 피브린 실란트를 제조하는 단계를 포함하고,

여기서, 상기 제1 실란트 내 공지된 최종 농도의 피브리노겐 복합체와 비교하여 제2 실란트 내 피브리노겐 복합체의 농도를 감소시키는 것은 단계 a)의 제1 실란트로부터 TGF-β의 방출에 비해 제2 실란트로부터의 TGF-β 방출 속도를 증가시키고,

상기 제2 실란트는 단계 a)에서의 제1 실란트와 동일한 초기 양의 TGF-β를 갖는 것인, 피브린 실란트로부터 TGF-β 단백질의 방출을 변경하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 실란트 내 최종 피브리노겐 복합체 농도가 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 150 ㎎/㎖의 범위 이내인 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 실란트 내 최종 피브리노겐 복합체 농도가 약 5 ㎎/㎖ 내지 약 75 ㎎/㎖의 범위 이내인 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 피브린 실란트 내 최종 피브리노겐 복합체 농도가 상기 제2 실란트 내 최종 피브리노겐 복합체 농도와 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 149 ㎎/㎖ 만큼이 다른 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 피브린 실란트 내 최종 피브리노겐 복합체 농도가 상기 제2 실란트 내 최종 피브리노겐 복합체 농도와 약 5 ㎎/㎖ 내지 약 75 ㎎/㎖ 만큼이 다른 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 피브린 실란트 내 최종 피브리노겐 복합체 농도가 상기 제2 실란트 내 최종 피브리노겐 복합체 농도와 약 10 ㎎/㎖ 내지 약 60 ㎎/㎖ 만큼이 다른 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 실란트 내 트롬빈 성분의 최종 농도가 약 1 IU/㎖ 내지 250 IU/㎖의 범위 이내인 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 TGF-β의 최종 농도가 약 1 ng/㎖ 내지 약 1 ㎎/㎖의 범위 이내인 것인 방법.
필요로 하는 환자 내에서 전환성장인자-베타(TGF-β) 단백질의 제어 방출을 위한 방법으로서, 상기 단백질은 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 구성된 군으로부터 선택되고, TGF-β를 함유하는 피브린 실란트를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하며, TGF-β의 25% 이상이 3일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 피브린 실란트가 피브리노겐 복합체(FC) 성분 및 트롬빈 성분을 혼합물로 조합하여 제조되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 TGF-β가 FC 성분과 트롬빈 성분의 혼합 전에 상기 FC 성분에 첨가되는 것인 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 TGF-β의 35% 내지 90% 이상이 3일 이상 동안 보유되는 것인 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 TGF-β의 45% 내지 75% 이상이 3일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 것인 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 TGF-β의 60% 이상이 3일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 것인 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 방출되는 TGF-β가 생물학적으로 활성인 것인 방법.
필요로 하는 환자 내에서 전환성장인자-베타(TGF-β) 단백질의 제어 방출을 위한 방법으로서, 상기 단백질은 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 구성된 군으로부터 선택되고, TGF-β를 함유하는 피브린 실란트를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하며, TGF-β의 20% 이상이 10일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 피브린 실란트가 피브리노겐 복합체(FC) 성분 및 트롬빈 성분을 혼합물로 조합하여 제조되는 것인 방법.
제18항에 있어서, 상기 TGF-β가 FC 성분과 트롬빈 성분의 혼합 전에 상기 FC 성분에 첨가되는 것인 방법.
제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 TGF-β의 25% 내지 75% 이상이 10일 이상 동안 보유되는 것인 방법.
제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 TGF-β의 45% 내지 55% 이상이 10일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 것인 방법.
제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 방출된 TGF-β가 생물학적으로 활성인 것인 방법.
제11항 또는 제18항에 있어서, 상기 실란트 내 최종 피브리노겐 복합체 농도가 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 150 ㎎/㎖의 범위 이내인 것인 방법.
제11항 또는 제18항에 있어서, 상기 실란트 내 최종 트롬빈 농도가 약 1 IU/㎖ 내지 250 IU/㎖의 범위 이내인 것인 방법.
제11항 또는 제18항에 있어서, 상기 최종 피브리노겐 복합체 농도가 40 ㎎/㎖이고 상기 최종 트롬빈 농도가 약 2 IU/㎖인 것인 방법.
제10항 또는 제17항에 있어서, 상기 실란트 내 최종 TGF-β 농도가 약 1 ng/㎖ 내지 약 1 ㎎/㎖인 것인 방법.
제10항 또는 제17항에 있어서, 상기 TGF-β가 TGF-β1인 것인 방법.
제27항에 있어서, 상기 TGF-β1의 60% 이상이 3일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되고, 상기 TGF-β1의 25% 이상이 10일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 것인 방법.
제10항 또는 제17항에 있어서, 상기 TGF-β가 TGF-β2인 것인 방법.
제29항에 있어서, 상기 TGF-β2의 25% 이상이 3일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 것인 방법.
제10항 또는 제17항에 있어서, 상기 TGF-β가 TGF-β3인 것인 방법.
제31항에 있어서, 상기 TGF-β3의 55% 이상이 3일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되고, 상기 TGF-β3의 25% 이상이 10일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 것인 방법.
제10항 또는 제17항에 있어서, 상기 환자가 근골격계 질환 또는 장애, 연조직 질환 또는 장애 및 심장혈관계 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환을 앓고 있는 것인 방법.
제33항에 있어서, 상기 근골격계 장애가 골 질환 또는 골 장애인 것인 방법.
제33항에 있어서, 상기 근골격계 장애가 연골 질환 또는 연골 장애인 것인 방법.
제33항에 있어서, 상기 환자가 심장혈관계 질환을 앓고 있는 것인 방법.
전환성장인자-베타(TGF-β) 단백질의 동일계 내(in situ) 제어 방출로부터 이익을 볼 수 있는 장애 또는 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 단백질은 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 방법은 TGF-β 단백질을 함유하는 피브린 실란트를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하고,

상기 피브린 실란트는 TGF-β의 25% 이상이 3일 이상 동안 피브린 실란트 내에 보유되거나, TGF-β의 20% 이상이 10일 이상 동안 피브린 실란트 내에 보유되는 TGF-β의 제어 방출을 제공하고, 상기 TGF-β는 상기 장애 또는 질환을 치료하는데 효과적인 속도로 방출되는 것인 방법.
제37항에 있어서, 상기 피브린 실란트가 피브리노겐 복합체(FC) 성분 및 트롬빈 성분을 혼합물로 조합하여 제조되는 것인 방법.
제38항에 있어서, 상기 TGF-β가 FC 성분과 트롬빈 성분의 혼합 전에 상기 FC 성분에 첨가되는 것인 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 TGF-β의 35% 내지 90% 이상이 3일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 것인 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 TGF-β의 45% 내지 75% 이상이 3일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 것인 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 TGF-β의 60% 이상이 3일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 것인 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 TGF-β의 20% 이상이 10일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 것인 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 TGF-β의 25% 내지 75% 이상이 10일 이상 동안 보유되는 것인 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 TGF-β의 45% 내지 55% 이상이 10일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 것인 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 방출된 TGF-β가 생물학적으로 활성인 것인 방법.
제38항에 있어서, 상기 실란트 내 최종 FC 농도가 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 150 ㎎/㎖의 범위 이내인 것인 방법.
제38항에 있어서, 상기 실란트 내 최종 트롬빈 농도가 약 1 IU/㎖ 내지 250 IU/㎖의 범위 이내인 것인 방법.
제38항에 있어서, 상기 최종 피브리노겐 복합체 농도가 약 40 ㎎/㎖이고 상기 최종 트롬빈 농도가 약 2 IU/㎖인 것인 방법.
제37항에 있어서, 상기 실란트 내 최종 TGF-β 농도가 약 1 ng/㎖ 내지 약 1 ㎎/㎖인 것인 방법.
제37항에 있어서, 상기 TGF-β가 TGF-β1인 것인 방법.
제51항에 있어서, 상기 TGF-β1의 60% 이상이 3일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되고, 상기 TGF-β1의 25% 이상이 10일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 것인 방법.
제37항에 있어서, 상기 TGF-β가 TGF-β2인 것인 방법.
제53항에 있어서, 상기 TGF-β2의 25% 이상이 3일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 것인 방법.
제37항에 있어서, 상기 TGF-β가 TGF-β3인 것인 방법.
제55항에 있어서, 상기 TGF-β3의 55% 이상이 3일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되고, 상기 TGF-β3의 25% 이상이 10일 이상 동안 상기 피브린 실란트 내에 보유되는 것인 방법.
제37항에 있어서, 상기 환자가 근골격계 질환 또는 장애, 연조직 질환 또는 장애 및 심장혈관계 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환을 앓고 있는 것인 방법.
제57항에 있어서, 상기 근골격계 장애가 골 질환 또는 골 장애인 것인 방법.
제57항에 있어서, 상기 근골격계 장애가 연골 질환 또는 연골 장애인 것인 방법.
제57항에 있어서, 상기 환자가 심장혈관계 질환을 앓고 있는 것인 방법.
전환성장인자-베타(TGF-β) 단백질을 함유하는 피브린 실란트 제조용 키트로서, 상기 단백질은 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 피브린 실란트는 소정의 TGF-β 방출 속도를 가지며, 상기 키트는

a) 피브리노겐 복합체 성분를 함유하며 임의로 TGF-β 성분을 함유하는 제1 바이알 또는 제1 저장 용기, 및

b) 트롬빈 성분을 갖는 제2 바이알 또는 제2 저장 용기를 포함하고,

제1 바이알 또는 제1 저장 용기가 TGF-β 성분을 포함하지 않을 경우에는 TGF-β 성분을 갖는 제3 바이알 또는 제3 저장 용기를 임의로 포함하며,

추가로 그의 사용을 위한 지침서를 포함하는 것인, TGF-β 단백질을 함유하는 피브린 실란트 제조용 키트.