KR20090109546A

KR20090109546A - 생물학적 유체로부터 전염성 해면상 뇌병증 병원체의 직교적 제거 방법

Info

Publication number: KR20090109546A
Application number: KR1020097015922A
Authority: KR
Inventors: 잰 에스. 시모니; 그레이스 시모니; 존 에프. 모엘러
Original assignee: 텍사스 테크 유니버시티
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2007-12-27
Publication date: 2009-10-20
Also published as: US20110097746A1; WO2008083236A1; EP2125041A1; CN101588822A; JP2010515068A; CA2673825A1

Abstract

헤모글로빈 및 1 이상의 병원체를 포함하는 생물학적 유체를 첫 번째 필터와 접촉시켜 첫 번째 여과물을 생성하고; 첫 번째 여과물을 나노여과 장치와 접촉시켜 두 번째 여과물을 생성하고; 두 번째 여과물을 크로마토그래픽 물질과 접촉시켜 용출된 부분을 분리하고; 용출된 부분을 소수성 용매와 접촉시켜 소수성 및 친수성 상을 생성하고; 및 친수성 상을 분리하는 것을 포함하며, 상기 생물학적 유체가 약 65 kDa 이하의 특정 성분을 포함하는 방법에 관한 것이다. 고 분자량 성분 및 1 이상의 병원체를 포함하는 생물학적 유체를 첫 번째 필터와 접촉시켜 첫 번째 여과물을 생성하고; 첫 번째 여과물을 친수성 막과 접촉시켜 두 번째 여과물을 생성하고; 두 번째 여과물을 크로마토그래픽 물질과 접촉시켜 용출된 부분을 분리하고; 용출된 부분을 소수성 용매와 접촉시켜 소수성 및 친수성 상을 생성하고; 및 친수성 상을 분리하는 것을 포함하며, 상기 고 분자량 성분이 약 65 kDa 초과의 분자량을 갖는 방법에 관한 것이다. 헤모글로빈 및 1 이상의 병원체를 포함하는 생물학적 유체를 2번 이상의 여과 단계를 거치게 하고, 그로 인해 생물학적 유체에 관련된 병원체의 수치를 감소시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 헤모글로빈 용액에 복수의 여과 단계를 포함하는 직교적 분리 방법을 행함으로써 인간 및/또는 동물 유래의 헤모글로빈 용액 내 전염성 해면상 뇌병증 병원체를 제거하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

전염성 해면상 뇌병증 병원체, 프리온, 나노여과

Description

생물학적 유체로부터 전염성 해면상 뇌병증 병원체의 직교적 제거 방법{ORTHOGONAL METHOD FOR THE REMOVAL OF TRANSMISSIBLE SPONGIFORM ENCEPHALOPATHY AGENTS FROM BIOLOGICAL FLUIDS}

본 발명은 생물학적 유체 및 그것의 정제 방법에 대해 개시한다. 보다 상세하게, 이 개시는 생물학적 유체로부터 전염성 해면상 뇌병증 병원체의 직교적 제거 방법에 관한 것이다.

프리온 질병으로 또한 알려져 있는, 전염성 해면상 뇌병증(TSE)은 뇌에 "스폰지" 형태의 작은 구멍을 만드는 것으로 특징지어지는 희귀한 퇴행성 뇌질환의 일종이다. 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease)(CJD)은 인간 TSE 중에 가장 잘 알려진 것이다. 이는 연간 백만 명 당 약 한 명에 발생하는 희귀한 유형의 치매이다. 다른 인간 TSE에는 쿠루(kuru)병, 치명적 가족성 불면증(FFI) 및 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)(GSS)이 포함된다. 쿠루병은 파푸아 뉴기니의 고립된 부족민들에게서 확인되었고, 현재 거의 사라졌다. FFI 및 GSS는 세계에서 단지 몇 가족에서만 발견되는 매우 드문 유전성 질환이다. 변종 CJD (vCJD)라 불리는 CJD의 새로운 유형이 1996년에 기술되었고, 영국 및 몇몇 기타 유럽 국가에서 발견되었다. vCJD의 초기 증상은 전형적 인 CJD에서와 다르며, 이 질환은 전형적으로 젊은 환자에게서 나타난다. TSE의 증상은 다양하지만, 보통 인격 변화, 정신의학적 문제, 예를 들어 우울, 협동 부족 및/또는 불안 보행을 포함한다. 또한 환자는 간대성근경련이라고 불리는 불수의적인 율동성 운동, 이상 흥분, 불면증, 혼돈 또는 기억 장애를 경험할 수도 있다. 이 질병의 후기 단계에서, 환자는 심한 정신 장애를 겪고, 움직이거나 말하는 능력을 잃게 된다. TSE는 빠르게 진행하며, 일반적으로 수 개월에서 수 년 사이에 죽음으로 끝을 맺게 된다. 연구는 vCJD가 "광우병"으로도 또한 알려진, 소 해면상 양뇌증(BSE)이라 불리는 TSE 질병에 걸린 소의 쇠고기를 인간이 소비한 결과라고 제시한다. 동물에서 발견되는 다른 TSE로는 양과 염소에 감염되는 스크래피(scrapie), 엘크와 사슴에 감염되는 만성 소모 질환과 전염성 밍크 뇌병증이 있다. 몇 가지 드문 사례에서, TSE가 동물원의 동물과 같은 다른 포유류에서도 일어났다. 또한 TSE가 수혈 전염이 될 수 있다는 것을 시사하는 증거도 있지만, 감염과 증상이 나타나는 사이의 시간은 길 수 있다. 예를 들면, 인간은 증상이 나타나기 전 5 내지 20년간 감염이 되어있을 수 있다. 많은 나라에서는 TSE 발생을 예방하기 위해 상이한 조치를 실행했다. 미국 식품 의약국(FDA)은 반추 동물에게 동물 단백질을 먹이는 것을 막고, 1980년부터 프랑스와 포르투갈 및/또는 아일랜드에서 10년 이상을 보낸 사람의 헌혈 금지를 실행하였다. 또한 1980-1996년 사이에 영국에서 6개월 이상을 보낸 사람의 헌혈도 미국, 캐나다, 뉴질랜드 및 호주에서 이미 금지되었다.

미국에서 FDA는 이 주제를 다루는 TSE 자문위원회를 만들었다. 게다가 FDA 에서는 의료 제품에서 TSE 병원체의 존재를 규제하는 많은 문헌을 발행했다.

TSE와 같은 프리온 질병은 정상 세포 PrP^c가 단백분해효소 내성(PrP^Sc)인 병원성을 가지는 프리온 단백질인 그것의 동형으로 변환되는 것이 동반된다. PrP^Sc는 TSE를 일으키는 병원체로 믿어진다. TSE 감염의 위험은 TSE 병원체에 대한 대상의 효과적인 노출에 기초한다. 효과적인 노출이란 세 가지 주된 변수: 오염된 물질 내 감염성 병원체의 양; 노출의 경로; 및 특정 장벽 효과의 함수이다. 예를 들면, 비경구적 노출 경로는 소화관를 통한 노출보다 감염을 이루는 데 있어서 더욱 효과적이다. 따라서 TSE 병원체 제거로 또한 알려진, 현재의 PrP^Sc 제거를 위한 과정은 동물에서 유래되어 인간에 사용되는 비경구적 약품에서 더욱 엄격하다. 유사한 조치가 또한 인간의 조직에서 얻어지는 약품에서도 제안되고 있다.

헤모글로빈을 포함하는 혈액 제제로부터 TSE 병원체를 제거하는데 있어서의 하나의 난제는 헤모글로빈 분해의 민감성이다. 헤모글로빈은 특이하고 매우 불안정한 분자로 정제 과정 중 손상되기 쉽다. 이 4 량체 헴 단백질은 쉽게 불안정한 이량체로 분해되고 산화될 수 있다. 따라서, 혈액 성분의 주목적인 산소를 운반하는 능력을 상실한다. 무세포 헤모글로빈의 자발적 자가 산화는 초산화 음이온을 발생시킨다. 이 산화의 속도는 수소 이온에 의해(낮은 pH) 촉진된다. 초산화 음이온은 촉매로 작용하여 추가적인 헤모글로빈 자가 산화를 촉진하며 자발적 또는 효소에 의한 과산화수소 형성을 일으킨다. 과산화수소는 제1철 헤모글로빈 또는 제2철 헤모글로빈과 반응하여 철화 헤모글로빈(ferryl-hemoglobin)을 생성한다. 철화 헤모글로빈은 라디칼로 작용하여, 히드록실 라디칼과 같은 정도로 지질 과산화를 일으킨다. 헴을 관능성 환원 철 형태로 유지하는데 필요한 효소적 및 비효소적 항산화 체계를 갖추고 있지 않기 때문에 적혈구 밖 헤모글로빈 산화 반응을 조절하는 것은 어렵다. 따라서, 비가역적인 헴 산화는 헤모글로빈을 기초로 한 혈액 성분을 개발하는 사람에게 있어서 문제이다.

소 및 인간 유래의 헤모글로빈 용액은 효과적인 산소 운반 혈장 확장제가 되기 위해서는 많은 조건을 만족시켜야 한다. 무독성, 무면역 유도성, 무발열성이고, 긴 보존기간, 만족스러운 산소 운반 능력 및 교질 삼투압 및 혈장과 유사한 점도를 갖는 것 외에도, 이런 제품들에는 TSE와 같은 병원체가 없어야 한다. 헤모글로빈 용액으로부터 다른 병원체(예를 들어 미생물)는 소독/한외여과 후 분리 배양과 같은 기술을 사용하여 효과적으로 제거될 수 있지만, 제조 과정에서의 TSE 제거 능력이 입증되어야만 한다.

프리온 단백질(예를 들어 PrP^Sc)은 일반적인 불활성화 방법에 대해서 매우 저항성이 있다. 프리온 단백질은 요리와 오토클레이빙(autoclaving)뿐만 아니라 고농도의 산과 염기에의 노출(헤모글로빈을 포함하는 유체의 정제를 위해서는 너무 과도한 조건)에서도 살아남을 수 있다. 예를 들면, 제약 산업에서 헤모글로빈 포함 용액 내 TSE 병원체 제거 유일의 방법은 컬럼크로마토그래피법을 이용한 것 뿐이다.

FDA에 따르면, 혈액 제품, 특히 헤모글로빈 용액에서 5 로그의 TSE 병원체를 제거할 수 있는 과정은 받아들여지는 것으로 보인다. 그러나 이런 과정에서, 제거 단계가 직교적(즉, 병원체를 독립적인 기작으로 제거하는 것)일 때에만 상이한 단계에 의한 로그 제거가 부가적인 것으로 고려된다. 따라서, 헤모글로빈을 포함하는 용액으로부터 병원성 프리온 단백질을 줄이는 직교적 방법에 대한 필요가 존재한다.

요약

본원에 개시된 것은 헤모글로빈 및 1 이상의 병원체를 포함하는 생물학적 유체를 첫 번째 필터와 접촉시켜 첫 번째 여과물을 발생시키고; 그 첫 번째 여과물을 나노여과 장치와 접촉시켜 두 번째 여과물을 발생시키고; 그 두 번째 여과물을 크로마토그래피적 물질과 접촉시켜 용출된 부분을 분리하고; 용출된 부분을 소수성 용매와 접촉시켜 친수성 및 소수성 상을 발생시키고; 친수성 상을 분리하는 것을 포함하고, 여기서 생물학적 유체는 약 65 kDa 이하의 관심 대상의 구성 요소를 포함하는 방법이다. 또한 본원에 개시된 것은 높은 분자량을 가지는 구성 성분과 1 이상의 병원체를 포함하는 생물학적 유체를 첫 번째 필터와 접촉시켜 첫 번째 여과물을 발생시키고, 첫 번째 여과물을 친수성 막을 통과시켜 두 번째 여과물을 발생시키고, 두 번째 여과물을 크로마토그래피적 물질과 접촉시켜 용출된 부분을 분리하고, 용출된 부분을 소수성 용매와 접촉시켜 소수성 및 친수성 상을 발생시키고, 친수성 상을 분리하는 것을 포함하고, 여기서 높은 분자량을 가지는 구성 성분의 분자량이 약 65 kDa 이상인 방법이다. 또한 본원에 개시된 것은 헤모글로빈 및 1 이상의 병원체를 포함하는 생물학적 유체를 2 이상의 여과 단계를 거쳐 생물학적인 유체에 관련된 병원체의 수치를 줄이는 것을 포함하는 방법이다. 추가로 본원에 개시된 것은 인간 및/또는 동물 유래의 헤모글로빈 용액에서 전염성 해면상 뇌병증 병원체를 복수의 여과 단계를 포함하는 직교적 분리 방법을 이용하여 헤모글로빈용액에서 제거하는 것을 포함하는 방법이다.

본 개시의 실시 태양의 상세한 설명을 위해, 도면이 참조로 제공될 것이다.

도 1은 생물학적 유체 내 TSE 병원체의 수준을 낮추는 방법의 흐름도이다.

도 2는 헤모글로빈 용액 내 TSE 병원체의 감소에 있어서, 나노여과 장치, 이온-교환막 크로마토그래피 및 소수성 용매를 포함하는 직교적 다단계 과정의 효율성을 도시화해 나타낸 것이다. 그 결과는 개별 정제 과정에 대한 Log₁₀ 감소와 전체 다단계 과정에 대한 누적 Log₁₀의 감소로 나타냈다.

본원에 개시된 것은 하기에서 TSE 병원체라고 하는, 전염성 해면상 뇌병증(TSE)을 일으키는 것으로 생각되는 병원체와 같은 것을 생물학적 유체에서 제거하는 직교적인 방법에 대한 것이다. 본원에서 생물학적 유체란 질환을 치료하기 위해 유기체에 투여되는 천연 원료로부터 얻은 성분, 합성적으로 제조된 구성 성분 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 유체를 나타낸다. 일 실시 태양에서, 생물학적 유체는 헤모글로빈을 포함하는 조성물 또는 용액으로 또한 나타낼 수 있는, 헤모글로빈 포함 용액이다. 일 실시 태양에서 TSE 병원체는 프리온이며, 또는 병원성 프리온(PrP^sc)이다. 프리온은 단백질적인 감염성 입자로서는 짧으며 무해한 단백질로 체내 세포에서 발견되는 정상 형태와 질병을 일으키는 감염성 형태 두 가지 모두로 존재할 수 있다. 일 실시 태양에서, TSE 병원체는 본원에 개시된 직교적 방법론을 사용해서 헤모글로빈 포함 용액으로부터 제거할 수 있고, 본원에서 사용되는 직교적이라는 용어는 각 단계가 독립적인 기작에 의해 구성 성분(예를 들어 TSE 병원체)을 제거 및/또는 불활성화시키는 2 이상의 단계를 포함하는 방법론을 나타낸다. 예를 들면, 본원에 기재된 직교적 방법론은 구성 성분(예를 들어 TSE 병원체)의 상이한 물리화학적 속성을 이용하여 상기 구성 성분의 감소 또는 제거를 행하는 단계를 포함할 수 있다.

일 실시 태양에서, 상기 방법론은 크로마토그래피 기법, 화학 처리, 및 나노여과를 사용하여 생물학적 유체로부터 TSE 병원체를 제거하는 것을 포함한다. 예를 들면, 직교적 다단계 절차는 고 친화도 프리온 감소 필터, 나노여과 장치, 친수성막, 이온-교환막 크로마토그래피 및 소수성 용매를 포함할 수 있다. 일 실시 태양에서, TSE 병원체 제거를 위한 방법론은 사용자가 원하는 임의의 순서대로 수행될 수 있고, 별법으로 TSE 병원체 제거를 위한 방법론은 본원에 개시된 순서로 수행될 수도 있다. TSE 병원체 제거(즉, PrP^sc 제거)에 사용되는 결과물인 생물학적 유체는 헤모글로빈 포함 용액과 같은 생물학적 유체의 투여가 필요한 포유동물 질환의 치료에 사용하기 적합할 수 있다.

샘플, 200으로부터 TSE 병원체를 제거하는 방법의 일 실시 태양이 도 1에 나타나 있다. 일 실시 태양에서, 샘플은 헤모글로빈 포함 용액과 같은 생물학적 유체를 포함한다. 헤모글로빈 포함 용액은 인간 및 동물 (예를 들면 소와 같은 반추 동물) 유래의 헤모글로빈을 포함할 수 있다. 일 실시 태양에서, 헤모글로빈 포함 용액은 전혈에서 유래 된 것이며, 비세포성 헤모글로빈을 포함하는 용액이다. 이하에서 사용되는 바와 같이, 비세포성 헤모글로빈 포함 용액은 헤모글로빈 pI(등전위점) 근처의 pH일 수 있고, 다른 지시가 없으면 별법으로 약 6.6 내지 약 7.2, 별법으로 약 7.8 내지 약 8.2일 수 있다. 본원에 개시된 방법론을 실행하기에 앞서, 본 용액은 일산화탄소와 접촉하여 자유 헤모글로빈을 일산화탄소화 형태로 전환시킬 수 있다. 일산화탄소화 형태는 일산화탄소에 결합된 헤모글로빈을 나타낸다. 샘플은 일산화탄소로 포화되기 충분한 시간 동안 일산화탄소와 접촉시킬 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 대로, 일산화탄소의 포화양을 얻기 위해 필요한 기간은 다양한 인자, 예를 들어 샘플 용액의 구성 성분과 및 일산화탄소 공급원에 의존할 것이며, 이것은 사용자가 원하는 결과를 얻기 위해 조정될 수 있다. 이론에 의해 제한되지 않고, 헤모글로빈의 일산화탄소화 형태는 상대적으로 탈산소 헤모글로빈(즉, 산소에 결합하지 않은 헤모글로빈) 또는 산소헤모글로빈(즉, 산소에 결합한 헤모글로빈)에 비해서 보다 안정적이다. 일 실시 태양에서, 샘플은 일산화탄소화 헤모글로빈을 포함하는 생물학적 유체이다. 이러한 샘플에 블록 (10), (20), (40) 및 (50)에 기재된 방법론을 실행할 수 있다. 일 실시 태양에서, 개시된 방법론을 실행한 후의 최종 조성물은 분자량이 약 65 kDa 이하인 분자를 가지는 특정 성분(즉, 사용자가 원하는 구성 성분)을 갖는다.

도 1에 나타낸, 방법 (200)은 샘플을 고 유량 친화성 프리온 감소 필터, 블록 (10)에 접촉시킴으로써 시작될 수 있다. 이러한 고 유량 친화성 프리온 감소 필터는 폴리부틸렌 테레프탈레이트(PBT), 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 등과 같은 고 분자성 물질을 포함하는 비활성 막에 합쳐져 있는, 1 이상의 혈소판 감소 및/또는 백혈구 감소 물질을 포함할 수 있다. 이 필터는 유체의 빠른 흐름(즉, 고 유량), 예를 들어 및 비제한적으로 생물학적 유체를 약 500 내지 약 1000 mL의 유체를 약25분 이하로, 별법으로 약 20분 이하로 흐를 수 있게 한다. 이러한 필터는 전체로서 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제 6,945,411호에 기재되어 있다. 적합한 고유량 친화성 프리온 감소 필터의 예는 폴 류코트랩 친화성 프리온 감소 여과 시스템(PALL LEUKOTRAP AFFINITY PRION REDUCTION FILTRATION SYSTEM); 폴 코포레이션(Pall Corporation) (미국 미시건주 48103-9019 앤 아버(Ann Arbor))에서 시판 중인 전혈 수집, 여과 및 저장 시스템이다.

이론에 의해 제한되지 않고, 고 유량 친화성 프리온 감소 필터는 PrP^Sc-함유 백혈구를 선택적으로 제거하는 작용을 할 수 있다. 따라서, 블록 (10)은 백혈구와 관련된 TSE 병원체의 감소를 제공하고, 필터는 그러한 감염된 백혈구를 걸러낼 수 있는 크기일 수 있다. 이러한 여과를 백혈구 여과라고 할 수 있다.

비세포성 헤모글로빈인 출발 물질을 얻기 위해 적혈구로부터 헤모글로빈을 추출하는 것은 세포 구성 성분을 파괴하는 기술을 이용하여 일반적으로 수행된다. 예를 들면 적혈구 현탁액으로부터 헤모글로빈을 추출하는 것은 저삼투압성 세포융해를 통해서 이루어질 수 있다. 저삼투압성 세포융해는 PrP^Sc를 가진 백혈구를 파열시켜 TSE 병원체(즉, PrP^Sc)를 헤모글로빈 포함 용액에 방출하게 할 수 있다. 백혈구여과 또는 여과를 통해서 백혈구를 제거하는 과정 (예를 들면 고 유량 프리온 친화성 필터를 사용)은 백혈구로부터 자유 헤모글로빈 용액으로 PrP^Sc가 통과할 가능성을 감소시킬 것이다.

고 유량 친화성 프리온 감소 필터와 샘플을 접촉하는 것은 샘플 (예를 들어 헤모글로빈 포함 용액)로부터 약 1 로그 이상의 TSE 병원체를 제거하는 결과를 가져올 수 있고, 별법으로 약 40 내지 약 60 % (0.4-0.6 로그 감소), 약 0.7 내지 약 1.9 로그, 약 2.0 내지 약 3.7 로그 감소가 일어날 수 있고, 이는 생물학적 분석이나 웨스턴 블롯법(Western blot assay)에 의해 결정된다. 고 유량 친화성 프리온 감소 필터에 의해 적용된 후 샘플(예를 들어 헤모글로빈 포함 용액)은 이하에서 여과된 샘플이라고 한다. 여과된 샘플은 여과물 또는 고 유량 프리온 친화성 감소 필터에 남지 않은 샘플 부분을 포함한다.

다시 도 1에 나타낸, 방법 (200)은 블록 (20)으로 진행될 수 있고, 여과된 샘플은 두 번째 여과 장치와 접촉하게 된다. TSE 제거 방법으로써 잠재적인 여과 효과는 TSE 병원체(즉, PrP^Sc)가 약 1000 kDa까지의 질량을 갖는 특이한 섬유형 형태로 존재할 수 있다는 점에 기초한다. 두 번째 여과 장치는 나노여과 장치, 예를 들면 다공성 크기 선택적 막을 포함하는 중공사 필터 또는 디스크를 포함한다. 이런 나노여과 장치는 중합물질, 예를 들어 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 디아세테이트, 셀룰로오스 트리아세테이트, 폴리술폰 등을 포함할 수 있다. 필터는 분당 약 100 mL 내지 약 500 mL의 유체의, 예를 들면 및 비제한적으로 생물학적 유체의 빠른 흐름을 가능하게 한다. 일 실시 태양에서, 두 번째 여과 장치는 약 64.5 kDa, 다르게는 약 65 kDa, 다르게는 약 75 kDa의 분자량 컷오프(특정한 분자량 이상의 분자는 필터에 걸러지고, 더 작은 분자량의 분자는 필터에 남지 않는 것을 의미)를 가지고 있다. 일 실시 태양에서, 필터는 헤모글로빈 분자보다 약간 큰(예를 들어 64.5 kDa) 크기 컷오프를 가져, 헤모글로빈은 필터에 남지 않고, 보다 큰 분자, 예를 들어 TSE 병원체 (예를 들어 병원성 프리온)는 필터에 의해 남게 된다. 적합한 나노필터 장치의 예에는 미국 55447 미네소타주 미네폴리스(Minneapolis) 소재의 민테크 코포레이션(Minntech Corporation)에서 시판 중인 헤모코어(HEMOCOR) 고성능 혈액농축기 HPH 400, HPH 700, HPH 1000 또는 HPH 1400을 포함하지만, 이에 제한되지는 않으며, 이는 단일 여과 유닛으로 또는 합쳐지는 방식으로 여과 면적을 증가시키는데 사용될 수 있다. 일 실시 태양에서, 이러한 나노여과 장치는 약 65 kDa 이상, 별법으로 약 75 kDa 이상의 분자량을 갖는 TSE 병원체의 추가적인 감소를 가져온다. 두 번째 여과 장치를 통과한 여과된 샘플은 TSE 병원체의 양에 있어서, 첫 번째 여과된 샘플에 비해 약 1 로그 이상, 별법으로 약 1 내지 약 3.2 로그, 별법으로 약 3.3 내지 약 3.7 로그, 별법으로 약 3.8 내지 약 4.5 로그의 감소를 가질 수 있고, 이는 크기별 여과 샘플로 부르거나 명한다. 크기별 여과된 샘플은 여과물 또는 여과 장치에 의해 남지 않은 여과된 샘플로부터의 물질을 포함한다.

일 실시 태양에서, 샘플, 예를 들어 여과 장치를 통과한 본원에 개시된 것들은 본래의 생물학적 유체에 대해 희석될 수 있다. 희석 샘플은 부피가 큰 유체를 포함할 수 있기 때문에 다루기 불편할 수 있다. 추가적인 다수의 생물학적 구성 성분 (예를 들면 헤모글로빈, 단백질 등)은 희석 용액 내 저농도로 유지될 때, 감소된 안정성을 보일 수 있다. 일 실시 태양에서, 본원에 개시된 방법론에 의해 생성된 용액은 보다 농축된 샘플을 만들기 위한 특정 기법에 따라 농축될 수 있다. 이들 샘플의 농축에 적합한 기법이 공지되어 있다. 예를 들면, 여과된 샘플을 농축하기 위해 샘플을 약 10 kDa, 별법으로 약 40 kDa, 별법으로 약 50 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 투석기에 도입함으로써 나노여과 장치와 접촉시키는 것에 따라 샘플이 농축될 수 있다. 별법으로, 생물학적 유체는 개시된 방법론 상의 각 단계에 따라 농축될 수 있다. 샘플의 출발 농도 및 최종 농도는 사용되는 장치의 유형에 의존할 것이다. 결과적으로, 샘플의 최종 농도는 당업자에 의해 사용자가 원하는 값으로 조정될 수 있다.

다시 도 1에 나타낸, 샘플에서 TSE 병원체의 감소 방법은 이어서 블록 (40)으로 진행될 수 있고, 크기별 여과된 샘플은 크로마토그래픽 물질 또는 막, 예를 들면 이온-교환 막과 접촉할 수 있다. 일 실시 태양에서, 크로마토그래픽 막은 샘플 내의 TSE 병원체 (예를 들어 PrP^Sc)의 수치를 추가로 감소시키는 작용을 한다. 일 실시 태양에서, 크로마토그래픽 막은 강 음이온 교환기를 포함한다. 다른 실시 태양에서, 크로마토그래픽 물질은 음이온 교환 디스크, 별법으로 음이온 교환 캡슐, 별법으로 음이온 교환 모듈을 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 크로마토그래픽 물질의 예에는 다공도가 약 0.8 ㎛이고, 막 충전층 부피가 약 0.18 mL 내지 약 1000 mL, 별법으로 약 1000 mL보다 큰 아스트로디스크 크로마토그래피 유닛(ASTRODISC CHROMATOGRAPHY UNIT) 형태의 무스탕(MUTANG) Q 강 음이온 교환 막, 무스탕 Q 일회용 캡슐 및 무스탕 Q 모듈이 포함된다. 무스탕 Q 막은 폴 코포레이션(미국 48103-9019 미시건주 앤 아버 소재)에서 시판 중이다. 무스탕 Q 강 음이온 교환기를 포함하는 막을 사용하여 바람직한 저 단백질 결합 속성, 넓은 화학적 및 온도 저항, 및 빠른 유속의 이점을 제공할 수 있다. 예를 들면, 변형된 무스탕 Q 막은 높은 비율의 단백질, 예를 들어 헤모글로빈의 전파를 허용하면서, TSE 병원체의 수치를 감소시킬 수 있다. 크로마토그래픽 막과 접촉된 크기별 여과된 샘플은 TSE 병원체의 수치에 있어서, 여과된 샘플에 비해 약 1 로그 이상, 별법으로 약 3.8 내지 약 4.3 로그, 별법으로 약 1 내지 약 3.7 로그, 별법으로 약 4.3 내지 약 5 로그의 감소를 가질 수 있고, 이는 이하에서 크로마토그래피된 크기별 여과된 샘플로 명한다. 크로마토그래피된 크기별 여과된 샘플은 음이온 교환기에 부착되지 않는 물질을 샘플이 포함할 수 있도록, 조성물의 용출된 부분을 포함한다.

다시 도 1에 나타낸 방법은 이어서 블록 (50)으로 진행될 수 있고, 크로마토그래피된 크기별 여과된 샘플을 소수성 용매에 접촉시켰다. 소수성 용매에 접촉시키기 전에, 샘플의 pH를 약 8.0, 별법으로 약 7.8, 별법으로 약 8.2까지 증가시킬 수 있다. 이론에 의해 제한되지 않고, 크로마토그래피된 크기별 여과된 샘플(즉, 헤모글로빈을 포함)의 pH를 증가시키는 것은 음전하를 띈 분자를 야기하는 헤모글로빈 분자를 탈양성자화하고, 헤모글로빈을 친수성 상으로 분배하는 것을 용이하게 할 것이다. 일 실시 태양에서, 크로마토그래피된 크기별 여과된 샘플을 소수성 용매와 접촉시켜 교반하고, 이어서 2 이상의 상 (예를 들면 소수성 및 친수성 상)을 형성하도록 허용하여, 샘플의 1 이상의 구성 성분이 소수성 상과 결합하게 되고, 샘플의 1 이상의 구성 성분이 친수성 상과 결합해 남게 된다. 소수성 용매는 크로마토그래피 과정을 거친 샘플의 구성 성분과 혼화성인 임의의 소수성 용매일 수 있고, 별법으로 소수성 용매는 클로로포름, 톨루엔 또는 이들의 조합물을 포함한다. 이론에 의해 제한되지 않고, TSE 병원체 (예를 들어, PrP^Sc)의 집합된 형태는 소수성 용매에서 증가된 용해도를 가질 수 있고, 따라서 샘플 내에 존재하는 양을 추가로 줄일 수 있도록 소수성 용매 내로 우선적으로 분배될 수 있다. 추가로, TSE 병원체를 소수성 용매 내로 분배하는 것은 TSE 병원체의 분해를 야기할 수 있다. 따라서, 생물학적 유체를 소수성 용매와 접촉시키는 것은 TSE 병원체의 존재 및 감염성을 감소시킨다. 일 실시 태양에서, 블록 (50)은 소수성 용매와 접촉된, 크로마토그래피 과정을 거친 샘플을 원심분리, 별법으로 초고속 원심분리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 원심분리를 사용하여 크로마토그래피 과정을 거친 샘플을 소수성 및 친수성 상으로 분배하는 것을 용이하게 할 수 있다. 원심분리와 같은 기술을 이용한 샘플의 분리 방법 및 장치가 당업자에게 공지되어 있다. 일 실시 태양에서, 본원에 개시된 방법의 후속 단계에서 이어서 사용될 수 있는 크로마토그래피된 크기별 여과된 샘플의 친수성 상은 TSE 병원체의 수치에 있어서, 크로마토그래피 과정을 거친 샘플에 비해, 약 1 로그 이상, 별법으로 약 0.8 내지 약 1.2 로그, 별법으로 약 0.1 내지 약 0.7 로그, 별법으로 약 1.3 내지 약 3.5 로그의 감소가 있을 수 있고, 이는 처리된 샘플로 부르거나 명한다.

일 실시 태양에서, 본 방법은 처리된 샘플을 추가로 처리하여 유기체에 도입, 예를 들어 환자에게 투여하기에 적합한 조건에 샘플을 두는 것을 허용할 수 있다. 별법으로, 샘플 (예를 들어 인간 또는 동물 유래의 헤모글로빈)은 대용 혈액에 기초한 유리 헤모글로빈의 추가적인 제조 과정에 사용될 수 있다.

다른 실시 태양에서, 생물학적 유체는 혈장 또는 혈청을 포함한다. 혈장 샘플은 그의 분획, 예를 들어 알부민, 응고 인자, 이뮤노글로불린 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 이러한 샘플은 블록 (10), (30), (40) 및 (50)에 기재된 바와 같은 방법론으로 다루어질 수 있다. 일 실시 태양에서는 개시된 방법론으로 혈장 또는 혈청을 다룬 후에 얻어지는 최종 조성물이 약 65 kDa보다 크고 150 kDa 이하의 분자량을 갖는 특정 성분(즉, 사용자가 원하는 성분)을 갖는다.

도 1에 나타낸, 샘플 내의 TSE 병원체의 수치를 감소시키는 방법은 블록 (10)에서 시작할 수 있고, 고 분자량 성분, 예를 들어 이뮤노글로불린 (150 kDa)을 포함하는 생물학적 유체와 함께 사용하기에 적합한 고 유량 친화성 프리온 감소 시스템을 포함할 수 있다. 본원에서 고 분자량은 약 65 kDa보다 큰 분자량을 나타내고, 상기 고 분자량 성분을 포함하는 이러한 생물학적 유체는 고 분자량 샘플(HMWS)로 명한다. HMWS로부터 TSE 병원체를 제거하는데 사용하기에 적합한 고 유량 프리온 감소 필터의 예에는 폴 코포레이션에서 시판 중인 류코트랩 SC RC 여과 시스템이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 이들 HMWS로부터 적혈구, 혈소판 및 백혈구의 분리는 침윤성 기술, 예를 들어 백혈구를 포함하는 PrP^Sc를 손상시킬 수 있는 원심분리력을 필요로 할 수 있고, TSE 병원체 (즉, PrP^Sc)를 샘플에 도입할 수 있다. HMWS는 본원에 개시된 유형의 고 유량 프리온 감소 필터와 접촉될 때, 필터에 의해 TSE 병원체가 걸리지는 동안, 용액 (예를 들어 IgG) 내 특정 성분을 남게 할 수 있다. 필터로부터 제거된 용액은 이어서 처리될 수 있는 특정 성분을 포함하고, 샘플은 이하에서 여과된 HMWS라고 명한다. 여과된 HMWS는 HMSW에 비해, 약 1 로그 이상, 별법으로 약 0.7 내지 약 1.9 로그, 별법으로 약 2 내지 약 3.7 로그의 TSE 병원체 양의 감소를 가질 수 있다. 도 1에 나타낸 방법이 이어서 블록 (30)으로 진행될 수 있고, 여과된 HMWS는 친수성 막과 접촉될 수 있다.

친수성 막은 HMWS 내의 TSE 병원체 (예를 들면, PrP^Sc)의 수치를 추가로 감소시키는 작용을 할 수 있다. 일 실시 태양에서, 막은 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF), 별법으로 변형된 PVDF를 포함한다. PVDF를 포함하는 막을 사용하여 바람직한 저 단백질 결합 속성, 넓은 화학적 및 온도 저항, 및 빠른 유속의 이점을 제공할 수 있다. 예를 들면 변형된 PVDF 막은 높은 비율의 단백질, 예를 들어 헤모글로빈의 전파를 허용하면서, TSE 병원체의 수치를 감소시킬 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 친수성 PVDF 막의 예는 폴 코포레이션에서 시판 중인 얼티포어 그래이드(ULTIPOR Grade) DV50 막 필터가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 PVDF 막의 예는 본원에 전체로서 참고로 도입되어 있는 미국 특허 제 5,736,051호에 개시되어 있다. 이하에서 처리된 HMWS라고 명하는, 친수성 막과 접촉되는 여과된 HMWS 샘플은 여과된 HMWS에 비해 약 1 로그 이상, 별법으로 약 3.3 내지 약 3.7 로그, 별법으로 약 1 내지 약 3.2 로그, 별법으로 약 3.8 내지 약 4.5 로그의 TSE 병원체의 수치의 감소를 가질 수 있다. 이어서, 친수성 막으로부터의 여과물을 본원에 개시된 방법의 후속 단계 (예를 들어 블록 (40) 및/또는 (50))에서 사용할 수 있다.

일 실시 태양에서, 처리된 HMSW는 이어서 음이온 교환기 (예를 들어 블록 (40))와 접촉될 수 있고, 이어서 본원에 이전에 헤모글로빈 포함 용액에 대해 기재된 소수성 용매 (예를 들어 블록 (50))와 접촉될 수 있다. HMSW를 음이온 교환기 (예를 들어 블록 (40))와 접촉시킨 후, 샘플은 음이온 교환기를 통과하지 않은 HMSW에 비해, 약 1 로그 이상, 별법으로 약 3.8 내지 약 4.3 로그, 별법으로 약 1 내지 약 3.7 로그, 별법으로 약 4.3 내지 약 5 로그의 TSE 병원체의 수치의 감소를 가질 수 있다. HMSW를 소수성 용매와 접촉 (예를 들어 블록 (50))시킨 후, 샘플은 소수성 용매를 거치지 않은 HMSW에 비해, 약 1 로그 이상, 별법으로 약 0.8 내지 약 1.2 로그, 별법으로 약 0.1 내지 약 0.7 로그, 별법으로 약 1.3 내지 약 3.5 로그의 TSE 병원체의 수치의 감소를 가질 수 있다. 이전에 기재된 바와 같이, 본 방법은 이어서 처리된 샘플을 추가로 처리하여 유기체에 도입, 예를 들어 환자에게 투여하기에 적합한 조건에 샘플을 두게할 수 있다. 별법으로 샘플을 추가 처리 없이 사용할 수 있다.

일 실시 태양에서, 본 방법은 개시된 방법론으로 샘플을 다루기 전, 다루는 동안 또는 그 후에 샘플 내 TSE 병원체의 수치를 측정하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들면 샘플을 나노여과 장치, 도 1의 블럭 (20)과 접촉시키기 전에, 샘플의 적어도 일부분을 TSE 병원체 (예를 들면, PrP^Sc)의 존재에 대해 분석할 수 있다. 별법으로, 샘플을 음이온 교환기, 도 1의 블럭 (40)과 접촉시킨 후, 샘플의 적어도 일부분을 TSE 병원체의 존재에 대해 분석할 수 있다. 별법으로, 샘플을 소수성 용매, 도 1의 블럭 (50)과 접촉시킨 후에, 샘플의 적어도 일부분을 TSE 병원체의 존재에 대해 분석할 수 있다. 일부 실시 태양에서, 본 방법은 개시된 방법론의 각 단계 후에 샘플의 적어도 일부분을 TSE 병원체의 존재에 대해 분석하는 것을 추가로 포함한다. TSE의 존재에 대한 분석은 정성적, 정량적 또는 둘 다일 수 있다. 이러한 분석은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면 웨스턴 블롯, ELISA, 동물 감염성 분석 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일 실시 태양에서, 본원에 개시된 TSE 제거 과정으로 다루어진 샘플 (예를 들면 분배된 크로마토그래피 과정을 거친 샘플)은, 약 5 로그 이상, 별법으로 약 6 로그 이상, 별법으로 약 7 로그 이상으로 샘플 내 존재하는 TSE 병원체의 수치의 감소를 가질 수 있다. 일 실시 태양에서, 본원에 개시된 ELISA, 동물 감염성 분석 또는 이들의 조합을 포함하는 검출 방법인 방법론으로 다루어진 샘플은 검출할 수 없는 수치의 TSE 병원체를 가질 수 있다. 본원에 개시된 방법론으로 다루어질 때, 1 이상의 TSE 병원체의 감염 양을 포함하는 샘플은 충분한 양의 TSE 병원체의 감소를 가질 수 있어, 샘플의 감염성이 낮아지게 한다.

본원에 개시된 방법은 수동, 자동 또는 수동 및 자동 과정의 조합으로 수행될 수 있다. 일 실시 태양에서, 본원에 기재된 방법론의 구현을 위한 장치는 수동, 자동 또는 이들의 조합으로 조절될 수 있다. 일 실시 태양에서, 본 방법은 본원에 개시된 과정을 수행할 수 있는 컴퓨터화된 장치를 통해 구현될 수 있고, 본원에 개시된 상기 방법은 일반용 컴퓨터 상의 소프트웨어 또는 프로세서, 사용자 인터페이스, 마이크로프로세서, 메모리 및 다른 관련된 하드웨어 및 작동 소프트웨어를 가지는 컴퓨터화된 성분으로 구현될 수 있다. 본 방법을 구현하는 소프트웨어는 실재의 미디어에 저장되고/되거나 메모리, 예를 들면 컴퓨터 상에 존재할 수 있다. 비슷하게, 입력 및/또는 소프트웨어로부터의 출력, 예를 들어 성분 수치, 비교 및 결과를 실재의 미디어, 컴퓨터 메모리, 하드카피, 예를 들어 종이 인쇄물 또는 다른 저장 장치에 저장할 수 있다.

본원에 개시된 방법론은 상이한 물리적 속성에 의존하고, PrP^Sc의 전형적인 속성을 만족시키는 개개의 제거 단계를 포함하는 PrP^Sc 정제 플랫폼이다. 본원에 개시된 방법론은 백혈구의 제거에 의한 PrP^Sc 제거, 나노필터를 이용한 PrP^Sc 여과, 음이온 막 흡수제를 이용한 PrP^Sc 흡수 및 소수성 용매를 이용한 PrP^Sc의 불활성화를 포함한다.

이 실시 태양들은 일반적으로 개시되었고, 하기의 실시예는 특정 실시 태양으로서 제시되어, 이들의 실시 및 이점에 대해 설명한다. 본 실시예는 예시의 방법으로 이해되며, 어떤 방법으로도 청구의 범위의 설명을 제한하지 않는다.

실시예 1

나노여과에 의한 소 헤모클로빈 용액의 정제 및 PrP^Sc 항원 포획 효소 면역분석(EIA) 및 생체내 분석에 의한 프리온 제거 방법의 유효화

이 실시예에서 사용된 스크래피 병원체는 잘 성화되어 있고, TSE 감염성의 대체 표지자로 널리 받아들여지는 햄스터 263K 균주였다. 사용된 스크래피 제제는 10⁰, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 및 l0^-7의 희석액에서 수행되는 스파이킹(spiking) 실험에 앞서, 초음파 처리하고, 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 0.45 및 0.22 ㎛의 다공도를 가지는 필터의 연속 단계를 통해 여과한 10% 햄스터 뇌 파쇄액이었다.

소 혈액은 다수의 건강한 공여체 또는 미국 FDA 지침 하에 길러진 개개의 동물로부터 채취하였다. 혈액은 무균 조건 하에서 외부 경정맥 채혈에 의해 얻었다. 대략 2 리터의 혈액을 한 동물로부터 얻고, 75 mL의 ACD 항응고제가 들어 있는 500 mL 진공, 멸균, 무발열 물질 병(미국 52002 아이오와주 더뷰크(Dubuque) 소재의 메트릭스 컴패니(The Metrix Company)) 4개에 수집하였다. 상이한 동물로부터 채취한 혈액은 혼합하지 않았다. 병은 혈액 대체물 제조 시설로 이동시 겔 얼음 상으로 보관되었다. 이어서, 혈액을 류코트랩에 의해 백혈구로부터, 그리고 원심분리 에 의해 혈소판 및 혈장으로부터 적혈구를 분리하였다. 이 단계는 궁극적으로 정제되어야 할 헤모글로빈으로부터 비헴 단백질 및 다른 물질의 용량(load)을 감소시켰다. 모든 백혈구를 제거하는 것은 이러한 세포, 예를 들어 세포 거대 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 및 다른 것들과 관련된 바이러스를 또한 제거한다. 게다가, 백혈구의 완전 제거는 이들 세포 내에 존재할 수 있는 TSE 병원체를 제거하였다.

바이러스 및 TSE 병원체가 있을 수 있는 백혈구의 제거는 폴 류코트랩 친화성 프리온 감소 필터 시스템(미국 11548 뉴욕주 이스트 힐스(East hills) 소재 폴 코포레이션)을 사용하여 수행하였다. 제조사에 따르면, PrP^Sc에 대한 프리온 감소 성능은 2.9±0.7 로그이다. 제조사의 지시에 따라, 정제는 공혈 8시간 내의 전혈, 별법으로 4℃에서 밤새 보관된 혈액, 필터 당 450 mL 부피 내에 4 내지 22℃ 사이의 혈액 온도에서 수행되었다.

이어서, 무균 조건하의 표준 혈액은행 절차를 사용하여 무균, 무발열 물질성 플라스틱 용기 (미국 60015 일리노이주 디어필드(Deerfield) 소재 펜월 래보래토리스(Fenwal Laboratories)) 내에 등장성 생리 식염수 용액 (적혈구:생리 식염수, 1:4 부피비; 4℃에서 10분 주기로 760 x g에서)을 사용한 5번의 세척과 15℃에서 20분 동안 약 170 x g에서 5번의 원심분리를 연속으로 하여 적혈구를 혈소판 및 혈장으로부터 정제하였다.

백혈구 및 혈소판의 부재를 확인하기 위해서, 컬터(Coulter) 세포 계수계를 이용하여 세포 계수를 수행하였고, 현탁액 내 단백질의 부재를 통상적인 화학적 방법, 예를 들어 분광광도법에 의해 확인하였다.

적혈구로부터 헤모글로빈의 추출은 다공도가 0.45 ㎛인 고 유량 여과 모듈을 이용한 저삼투압성 투석-한외여과에 의해 수행하였다. 헤모글로빈 분리 중에 단백질 분해를 최소화하기 위해, 약한 저장성 매질 (240-260 mOsm kg)과 10 p.s.i 미만의 막간 압력을 사용하여 절차를 4℃에서 수행하였다. 추출된 헤모글로빈을 0.2 ㎛의 필터, 예를 들어 폴 서포어 DCF 캡슐 필터(Pall SSUPOR DCF Capsule Filter) (폴 코포레이션)를 통해 여과하고, 일산화탄소를 이용해 포화시킴으로써 일산화탄소형으로 변화시키고, 4℃ 펜월 이송 팩 내에 보관하였다.

이 실시예에서, 10% 햄스터 뇌 파쇄액으로 스파이크된 pH 6.8±0.2의 TRIS 완충액 내 리터당 60±10 그램 농도인 대략 500 mL의 소 헤모글로빈을 시판 중인 고성능 혈액농축기, 헤모코어 HPH 1400과 선택적으로 튜브 세트(민테크 코포레이션)를 사용하여 나노여과 하였다. 이 폴리술폰계 중공사 투석막은 20.9 cm의 유효 섬유 길이, 1.31 m²의 막 여과 면적, 시작 부피 86 mL 및 평균 컷오프 분자량 65 kDa를 갖는다. 유속 300 mL/분으로 막간 압력 30 kPa에서 여과를 수행하여 2시간 후 완료하였다.

투석물을 수집하고, 시판 중인 저 유량 폴리술폰계 투석기, 옵티플럭스(OPTlFLUX)와 선택적으로 튜브 세트(미국 02420 메사추세츠주 렉싱턴(Lexington) 소재 프레지니어스 메디컬 케어(Fresenius Medical Care))를 사용하여 거의 본래의 Hb 수치인 리터 당 55±8 그램으로 농축하였다. 이 장치는 1.5 m²의 표면적, 시작 부피 83 mL 및 평균 컷오프 분자량 10 kDa을 가졌다.

이 절차를 대략 1시간 후 완료하였고, 농축된 생성물을 제조사에 따라, PrP^Sc를 인식하는 BSE-스크래피 항원 검사 EIA 키트(BSE-SCRAPIE ANTIGEN TEST EIA KIT)(미국 04092 매인주 웨스트브룩(Westbrook) 소재 이덱스 래보래토리즈(IDEXX Laboratories, Inc.))를 사용하여 투석 전 샘플과 함께, 프리온 단백질 수치의 측정을 하였다. 별법으로 단백질 분해효소로 처리한 후, 샘플을 감염된 햄스터의 뇌로부터의 변성된 스크래피 관련 피브릴 병원체 (SAF)의 제제에 대해 만들어진 두 항체를 사용하는 SPI-BIO EIA 키트 (미국 48108 미시건주 앤 아버 소재 캐이맨 케미컬사(Cayman Chemical Co.))를 사용하여 제조자의 지시에 따라 처리하였다.

모든 실험을 3회 반복 수행하였고, PrP^Sc의 정제는 식: RT = log 10 (샘플 초기 부피 x 초기 PrP^Sc 농도) / (여과 후 샘플 부피 x 최종 PrP^Sc 농도) 을 사용하여 로그 감소 인자 (RF)의 계산으로 표현하였다. 결과는 헤모코어 HPH 1400이 2시간 후, m²당 400 mL의 중공사 표면적에 대한 헤모글로빈의 비율에서 90%가 넘는 헤모글로빈을 여과하였음을 나타내었고, 표 1에 나타낸 바와 같이, 나노여과를 사용하여 PrP^Sc 수치를 평균 3.47±0.14 로그만큼 감소시킬 수 있었다.

생체내 분석으로 또한 평가된 여과물은 (1) 스크래피 병원체로 스파이크되었고, 나노여과 과정을 거치지 않은 소 헤모글로빈 용액 및 (2) PrP^Sc로 스파이크되고, 나노여과된 소 헤모글로빈 용액이었고, 두 샘플은 모두 10⁰, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 및 l0^-7의 희석액에서 평가되었다.

스크래피 감염성에 대한 생체내 분석은 특정 용액의 분취액을 이용한 햄스터의 대뇌내 (i.c.) 접종 (대략 6-8 주된 새끼)을 수반하였다. 5마리의 햄스터를 스파이크되고 비정제된, 그리고 스파이크되고 정제된 헤모글로빈 용액의 각 희석 그룹으로 분배하였다 (희석액 당 5마리, 적정 당 7 희석액). 대조군 햄스터에는 헤모글로빈을 단독으로 접종하였다. 동물들을 200일 동안 매일 관찰하였고, 스크래피 감염 (운동실조, 만성적 소모성 질환 및 신경계 특징, 예를 들어 순환성 돌아다님(wandering)) 및 생존율의 전형적인 임상 신호를 모니터링 하였다. 200일의 관찰 기간은 소 프리온의 형질전환 쥐로의 전파가 대략 200일의 배양 시간을 보이는 것을 기초로 하여 선택되었다. 따라서, 200일 후에 살아남은 모든 동물은 마취제를 과다 투여하여 희생시켰고, 스크래피 감염, 스크래피 연관 피브릴 병원체의 특징적인 튜불리(tubuli)에 대해 전자현미경을 이용하여 그들의 뇌를 관찰하였다. 죽은 동물의 뇌 및 스크래피 감염의 임상적 신호로 인해 끝난 이들을 또한 SAF에 대해 전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 살아남은 것과 SAF 양성 비율은 표 2에 나타나 있다.

이 결과는 스파이크된 비정제의 소 헤모글로빈 제제가 대략 10⁵/mL의 스크래피 감염성 역가를 가진다는 것을 시사한다. 나노여과 후에 대략 10^3.5의 스크래피 감염성의 감소가 있었다. 이들 결과는 ELIA 연구에 의해 얻은 결과와 일치한다. 따라서, 나노여과 단독으로는 PrP^Sc 감염성을 완전히 제거하지 못했고, 10⁰및 10^-1의 희석액에서는 일부 동물이 살아남지 않았다. 추가로, 이 결과는 스크래피 감염성 역가가 약 10⁵ /mL일 때, 나노여과가 약 65 kDa 크기의 구멍을 갖는 중공사를 통해서라도 헤모글로빈 용액으로부터 PrP^Sc의 완전 정제를 위한 독립적인 방법으로서 기능하지 못한다는 것을 시사한다.

실시예 2

음이온 교환 막 크로마토그래피에 의한 소 헤모클로빈 용액의 정제 및 PrP^Sc 항원 포획 효소 면역분석(EIA)에 의한 프리온 제거 방법의 유효화

이 실시예에서 또한 사용된 스크래피 병원체는 햄스터 263K 균주였다. 사용된 스크래피 제제는 10⁰, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 및 l0^-7의 희석액에서 수행되는 스파이킹 실험에 앞서, 초음파 처리하고, 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 0.45 및 0.22 ㎛의 다공도를 가지는 필터의 연속 단계를 통해 여과한 10% 햄스터 뇌 파쇄액이었다.

이 실시예에서는 실시예 1에서와 같이, pH 6.8±2의 TRIS 완충액 내 리터당 60±10 그램 농도인 100 mL의 소 헤모글로빈 용액을 시판 중인 폴 아크로디스크 유닛과 무스탕 Q 막 (미국 48103-9019 미시건주 앤 아버 소재 폴 코포레이션)을 사용한 음이온 교환 막 크로마토그래피시켰다.

다공도 0.8 ㎛의 무스탕 Q 폴리에테르술폰 막은 플라스미드 DNA, 음전하를 띈 단백질 및 바이러스 입자에 효과적으로 결합하는 강 음이온 교환기이다. 헤모글로빈 20 mL 당 하나의 일회용 폴 아크로디스크 유닛을 사용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 크로파토그래피 전에 아크로디스크 유닛을 4 mL의 1 M NaOH을 사용하고, 이어서 4 mL의 1 M NaCl을 사용하여 사전컨디셔닝하고, pH 6.8±0.2의 20 mM 트리스 완충액을 사용하여 평형화하였다. 일산화탄소형의 스파이크된 헤모글로빈 용액 (pH 6.8±0.2)을 4 mL/분의 유량으로 크로마토그래피 분리하였다. pH 6.8에서 헤모글로빈은 전하를 띄지 않는다. 헤모글로빈의 전기적 전하의 제거는 pH 6.8±0.2의 20 mM TRIS 완충액으로 평형화된 강 음이온 교환 막에 그것이 결합하는 것을 방지하기 위한 것이다. 이 크로마토그래피법은 또한 DNA 및 바이러스 입자가 막에 결합하는 것에 영향을 주지 않도록 하기 위한 것이다. 개별 아크로디스크 유닛을 사용하여 5번의 크로마토그래피 수행 후에, 수집된 분획을 함께 모으고, 최종 부피를 측정하였다.

제조사에 따라, PrP^Sc를 인식하는 BSE-스크래피 항원 검사 EIA 키트 (미국 04092 매인주 웨스트브룩 소재 이덱스 래보래토리즈)를 사용하여 10⁰, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 및 l0^-7의 희석액에서 크로마토그래피 전 및 후의 샘플을 프리온 단백질 수치의 측정하였다. 추가로, 단백질 분해효소로 처리한 후, 샘플을 감염된 햄스터의 뇌로부터의 변성된 SAF의 제제에 대해 만들어진 두 항체를 사용하는 SPI-BIO EIA 키트 (미국 48108 미시건주 앤 아버 소재 캐이맨 케미컬사)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 처리하였다.

모든 실험을 3회 반복 수행하였다. PrP^Sc의 정제는 식: RT = log 10 (샘플 초기 부피 x 초기 PrP^Sc 농도) / (여과 후 샘플 부피 x 최종 PrP^Sc 농도) 을 사용하여 로그 감소 인자 (RF)의 계산으로 표현하였다. 이 결과는 교환기의 막표면에 대한 헤모글로빈의 비율이 대략 cm² 당 5 mL였던, 무스탕 Q 막 음이온 교환기와 접촉시킨 본 샘플이 헤모글로빈 수치의 감소를 보이지 않는다는 것을 나타내었다. 그러나, 표 3에 나타낸 것과 같이, 음이온 교환 막 크로마토그래피와 무스탕 Q를 사용하여 샘플 내의 PrP^Sc 수치를 4.01±0.24 로그만큼 감소시킬 수 있었다.

실시예 3

소수성 용매에 의한 소 헤모클로빈 용액의 정제 및 PrP^Sc 항원 포획 효소 면역분석(EIA)에 의한 프리온 제거 방법의 유효화

이 실시예에서 사용된 스크래피 병원체는 역시 햄스터 263K 균주였다. 사용된 스크래피 제제는 10⁰, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 및 l0^-7의 희석액에서 수행되는 스파이킹 실험에 앞서, 초음파 처리하고, 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 0.45 및 0.22 ㎛의 다공도를 가지는 필터의 연속 단계를 통해 여과한 10% 햄스터 뇌 파쇄액이었다.

이 실시예에서는 실시예 1에서와 같이, 제조된 pH 8.0±2의 TRIS 완충액 내 리터당 60±10 그램 농도인 200 mL의 일산화탄소형 소 헤모글로빈 용액을 10% 햄스터 뇌 파쇄액으로 스파이크하고, 클로로포름을 이용해 소수성 용매 처리하였다 (HPLC 그래이드, 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))

클로로포름을 이용한 일련의 3가지 처리 후 원심분리 단계를 소벌(Sorvall) 원심분리기 (모델 RC5C, SS-34 회전자)를 이용하여 다음의 방법으로 수행하였다: (1) 15 대 1 (부피비)로 클로로포름과 혼합한 헤모글로빈을 15분 동안 볼텍싱하고, 4℃에서 30분 동안 760 x g에서 원심분리하였다; (2) 상징수를 두 번째 순서의 튜브로 통과시키고, 클로로포름과 16 대 1 (부피비)로 혼합하고, 10분 동안 볼텍싱하고, 4℃에서 15분 동안 1,600 x g에서 원심분리하고, 15분 동안 3,800 x g에서 원심분리하였다; (3) 상징수를 세 번째 순서의 튜브로 이동시키고, 클로로포름 없이 4℃에서 90분 동안 48,400 x g에서 원심분리하였다. 세 번째 원심분리 후, 헤모글로빈 용액을 질소 가스, 이어서 일산화탄소를 이용해 플러싱(flushing)함으로써 남아있는 미량의 클로로포름을 제거하여 이의 일산화탄소형으로의 완전한 전환을 확실히 하였다.

제조사에 따라, PrP^Sc를 인식하는 BSE-스크래피 항원 검사 EIA 키트 (미국 04092 매인주 웨스트브룩 소재 이덱스 래보래토리즈)를 사용하여 10⁰, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 및 l0^-7의 희석액에서 클로로포름 처리 전 및 후의 샘플을 프리온 단백질 수치의 측정하였다. 추가로, 단백질 분해효소로 처리한 후, 샘플을 감염된 햄스터의 뇌로부터의 변성된 SAF의 제제에 대해 만들어진 두 항체를 사용하는 SPI-BIO EIA 키트 (미국 48108 미시건주 앤 아버 소재 캐이맨 케미컬사)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 처리하였다.

모든 실험을 3회 반복 수행하였다. PrP^Sc의 정제는 식: RT = log 10 (샘플 초기 부피 x 초기 PrP^Sc 농도) / (여과 후 샘플 부피 x 최종 PrP^Sc 농도) 을 사용하여 로그 감소 인자 (RF)의 계산으로 표현하였다. 표 4에 나타낸 것과 같이, 클로로포름을 사용한 처리로 PrP^Sc 수치를 1.15±0.14 로그만큼 감소시켰다. 이 데이터는 클로로포름 처리가 PrP^Sc로부터 헤모글로빈 용액의 정제에 대해 불활성화 단계로 여겨질 수 있음을 시사한다.

실시예 4

나노여과, 음이온 교환 막 크로마토그래피 및 소수성 용매에 의한 소 헤모글로빈 용액의 정제 및 생체내 분석에 의한 프리온 제거 방법의 유효화

생체내 분석에 의해 평가된 용액은 (1) 10⁰, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 및 l0^-7의 희석액에서 스크래피 병원체로 스파이크되고, 프리온 정제 과정을 거치지 않은 소 헤모글로빈 용액 및 (2) 10⁰, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 및 l0^-7의 희석액에서 스크래피 병원체로 스파이크되고 나노여과, 음이온 교환 막 크로마토그래피 및 소수성 용매 처리에 기초한 연속의 프리온 정제 과정을 거친 소 헤모글로빈 용액이었다. 이 실시예에 대한 출발 물질은 일산화탄소형 소 헤모글로빈 용액이고, 실시예 1에서와 같이 제조하였고, 이전에 기재된 바와 같이 스파이크되었다.

TSE 정제 과정은 각각 실시예 1, 2 및 3에 기재된 바와 같이 (1) 나노여과, (2) 음이온 교환 막 크로마토그래피 및 (3) 클로로포름을 이용한 소수성 용매 처리를 결합하였다. 헤모글로빈의 나노여과 및 음이온 막 교환 장치로의 흡수를 낮게 유지하기 위해서, 헤모글로빈의 전하를 제거함으로써 이의 정전기적 상호작용이 제거된 완충액 계에 용해시켰다. 이러한 완충액 계는 실시예 1 및 2에 기재되어 있다. 추가적으로, 헴이 산화되는 것을 방지하기 위해, 헴 산소를 완전히 일산화탄소로 대체하여 산화력에 대해 매우 저항력 있는 일산화탄소형 헤모글로빈을 형성하였다. 헤모글로빈 농도를 측정하여 샘플 부피의 모든 변화를 희석에 대해 보정하였다. 정제 전 샘플 내의 헤모글로빈의 평균 농도는 대략 리터 당 60±10 그램이었고, 정제 후에는 대략 리터 당 55±8 그램이었다.

스크래피 감염성에 대한 생체내 분석은 특정 용액의 분취액을 이용한 햄스터의 대뇌내 (i.c.) 접종 (대략 6-8 주된 새끼)을 수반하였다. 5마리의 햄스터를 스파이크되고 비정제된, 그리고 스파이크되고 정제된 헤모글로빈 용액의 각 희석 그룹으로 분배하였다 (희석액 당 5마리, 적정 당 7 희석액). 대조군 햄스터에는 헤모글로빈을 단독으로 접종하였다. 동물들을 200일 동안 매일 관찰하였고, 스크래피 감염 (운동실조, 만성적 소모성 질환 및 신경계 특징, 예를 들어 순환성 돌아다님) 및 생존율의 전형적인 임상 신호를 모니터링 하였다. 200일 후에 살아남은 모든 동물은 마취제를 과다 투여하여 희생시켰고, 스크래피 감염 (스크래피 연관 피브릴 병원체 - SAF)의 특징적인 튜불리(tubuli)에 대해 전자현미경을 이용하여 그들의 뇌를 관찰하였다. 죽은 동물의 뇌 및 스크래피 감염의 임상적 신호로 인해 끝난 이들을 또한 SAF에 대해 전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 살아남은 것과 SAF 양성 비율은 표 5에 나타나 있다.

이 결과는 스파이크된 비정제의 소 헤모글로빈 제조가 대략 10⁵/mL의 스크래피 감염성 역가를 가진다는 것을 시사한다. 스크래피의 다단계 정제 절차가 소 헤모글로빈 샘플을 스파이크한 후, 스크래피 감염성이 검출되지 않았다. 헤모글로빈을 단독으로 동물에 접종하는 것은 어떤 관찰된 임상적 변화 및 형태학상 변화를 가져오지 않았다.

이들 데이터는 나노여과, 음이온 막 크로마토그래피 및 소수성 용매 처리의 연속된 순차적 이용에 의해 TSE 병원체로부터 소 헤모글로빈 용액의 정제가 스크래피 감염성을 효과적으로 제거할 수 있다는 것을 시사한다.

이러한 PrP^Sc로부터 소 헤모글로빈의 다단계 정제 절차는 TSE 병원체의 제거 요소 (나노여과 및 음이온 교환 막 크로마토그래피) 및 불활성화 (소수성 용매)를 포함하기 때문에, 직교적인 것으로 고려될 수 있다.

실시 태양들을 나타내고 개시하였지만, 본 발명의 사상 및 기술에서 벗어나지 않고 당업자에 의해 이들의 변형이 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 실시 태양은 오직 예시적인 것이며, 제한하는 것은 아니다. 다수의 변경 및 변형이 가능하고 이는 본 발명의 범위 내이다. 수치 범위 또는 제한이 명백히 언급된 부분에서는, 그러한 표현 범위 또는 제한이 명백히 언급된 범위 또는 제한 내에 맞는 유사한 크기의 반복적 범위 또는 제한을 포함하는 것으로 이해된다 (예를 들어 약 1 내지 약 10은 2,3,4 등을 포함하고, 0.10 초과는 0.11, 0.12, 0.13 등을 포함한다). 청구항의 임의의 요소에 관련된 용어 "선택적으로"는 대상 요소가 필요하거나, 별법으로 필요하지 않다는 것을 의미한다. 두 가지 대안 모두 청구항의 범위 내에 있다. 보다 넓은 용어, 예를 들어 포함하다(comprise), 포함하다(include), 갖다(have) 등을 사용하는 것은 보다 좁은 용어, 예를 들어 구성되다(consisit of), 필수 성분으로 하다(consist essentially of), 실질적으로 이루어지다(comprise substantially) 등을 지지하는 것으로 이해되어야 한다.

따라서, 보호 범위는 상기 기재된 상세한 설명에 의해 제한되지 않고, 오직 하기의 청구항에 의해 제한되며, 범위에는 청구항의 대상의 모든 등가물이 포함된다. 각각의 모든 청구항은 본 발명의 실시 태양으로서 명세서에 도입되어 있다. 따라서, 청구항은 추가적 설명이며, 본 발명의 실시 태양에 대한 부가이다. 본원의 참고 논의는 본 발명의 선행 기술이고, 특히 본 출원의 우선일 후에 공개될 수 있는 임의의 참고 문헌이다. 본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공보의 개시는 본원에 기재된 것들을 보충하는 예시적, 절차상 또는 다른 세부 사항을 제공하는 정도로 본원에 참고로 도입되어 있다.

Claims

헤모글로빈 및 1 이상의 병원체를 포함하는 생물학적 유체를 첫 번째 필터와 접촉시켜 첫 번째 여과물을 생성하고;

첫 번째 여과물을 나노여과 장치와 접촉시켜 두 번째 여과물을 생성하고;

두 번째 여과물을 크로마토그래픽 물질과 접촉시켜 용출된 부분을 분리하고;

용출된 부분을 소수성 용매와 접촉시켜 소수성 및 친수성 상을 생성하고; 및

친수성 상을 분리하는 것을 포함하는 방법으로서,

상기 생물학적 유체가 65 kDa 이하의 특정 성분을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 첫 번째 필터와 접촉시키기 전에 헤모글로빈을 포함하는 생물학적 유체를 일산화탄소로 포화시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 생물학적 유체가 인간 유래의 헤모글로빈, 동물 유래의 헤모글로빈 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 병원체가 단백질성 프리온, 전염성 해면상 뇌병증 병원체 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 첫 번째 필터가 고 유량 친화성 프리온 감소 필터를 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 필터가 약 25분 이하 동안 약 500 ml 내지 약 1000 ml의 유속을 갖는 방법.
제1항에 있어서, 첫 번째 여과물 내 병원체의 양이 생물학적 유체 내 병원체의 양에 비해, 약 1 로그 이상 감소되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 나노여과 장치가 중공사 필터 또는 디스크를 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 나노여과 장치가 약 65 kDa의 분자량 컷오프를 가지는 방법.
제1항에 있어서, 두 번째 여과물 내 병원체의 양이 첫 번째 여과물 내 병원체의 양에 비해, 약 1 로그 이상 감소되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 크로마토그래픽 물질이 강 음이온 교환기를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 용출된 부분 내 병원체의 양이 두 번째 여과물 내 병원체의 양에 비해 약 1 로그 이상 감소되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 소수성 용매가 클로로포름, 톨루엔 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 친수성 상 내의 병원체의 양이 생물학적 유체 내 병원체의 양에 비해, 약 5 로그 이상 감소되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 친수성 상이 감염성이 아닌 방법.
제1항에 있어서, 병원체의 양을 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 조성물 내의 병원체의 양의 결정이 웨스턴 블롯 분석법, ELISA, 동물 감염성 분석 또는 이들의 조합에 의해 수행되는 방법.
고 분자량 성분 및 1 이상의 병원체를 포함하는 생물학적 유체를 첫 번째 필터와 접촉시켜 첫 번째 여과물을 생성하고;

첫 번째 여과물을 친수성 막과 접촉시켜 두 번째 여과물을 생성하고;

두 번째 여과물을 크로마토그래픽 물질과 접촉시켜 용출된 부분을 분리하고;

용출된 부분을 소수성 용매와 접촉시켜 소수성 및 친수성 상을 생성하고; 및

친수성 상을 분리하는 것을 포함하는 방법으로서,

상기 고 분자량 성분이 65 kDa 초과의 분자량을 갖는 방법.
제18항에 있어서, 상기 친수성 막이 폴리비닐리덴 플루오라이드를 포함하는 방법.
헤모글로빈 및 1 이상의 병원체를 포함하는 생물학적 유체를 2번 이상의 여과 단계를 거치게 하고, 그로 인해 생물학적 유체에 관련된 병원체의 양을 감소시키는 것을 포함하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 병원체가 전염성 해면상 뇌병증 병원체를 포함하고, 병원체의 양의 감소가 약 5 로그 이상인 방법.
헤모글로빈 용액에 복수의 여과 단계를 포함하는 직교적 분리 방법을 행함으로써 인간 및/또는 동물 유래의 헤모글로빈 용액 내 전염성 해면상 뇌병증 병원체를 제거하는 것을 포함하는 방법.