KR20090101490A - Ｈｉｖ 복합 백신 및 프라임 부스트 방법 - Google Patents

Ｈｉｖ 복합 백신 및 프라임 부스트 방법

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KR20090101490A
KR20090101490A KR1020097016826A KR20097016826A KR20090101490A KR 20090101490 A KR20090101490 A KR 20090101490A KR 1020097016826 A KR1020097016826 A KR 1020097016826A KR 20097016826 A KR20097016826 A KR 20097016826A KR 20090101490 A KR20090101490 A KR 20090101490A
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hiv
virus
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gene
recombinant
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KR1020097016826A
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칠-용 강
차드 미찰스키
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더 유니버시티 오브 웨스턴 온타리오
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Abstract

본 발명은 HIV에 대해 장기 지속하는 체액성, 세포매개성 및 점막 면역반응을 유도하는, HIV/AIDS에 대한 신규한 복합 프라임-부스트(prime-boost) 백신에 관한 것이다.

Description

ＨＩＶ 복합 백신 및 프라임 부스트 방법 {HIV COMBINATION VACCINE AND PRIME BOOST METHOD}
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2007년 1월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 60/880103을 우선권으로 주장하며, 상기 가출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
배경
2004년말에, HIV/AIDS에 관한 공동 국제연합 프로그램 (UNAIDS) 및 세계보건기구 (WHO)는 HIV 및 AIDS 유행병의 UNAIDS/WHO 글로벌 써머리(global summary)를 발표하였다. 상기 글로벌 써머리에는, 2004년에만 전세계적으로 3백만명이 넘는 사람들이 AIDS로 인해 사망하였고, 예방 노력에도 불구하고 추가 5백만명이 새로 감염된 것으로 평가되어 있다. 이는 현재 HIV 감염 상태로 살아가고 있는 사람들의 수를 4천만이라는 경이적인 수가 되게 한다. 안타깝게도, 치료 선택권은 제한적이고, 종종 경제적으로 터무니없이 부담스러우며, 궁극적으로는 치유를 의미하는 것이 아니다. 이러한 파괴적인 질병을 제어하는 신규한 수단을 발견하는 것이 절실하며, 이는 안전하고 유효한 HIV 백신을 개발하는 데에 있는 것으로 믿어진다
20년이 넘는 연구와 개발에도 불구하고, 과학자들은 HIV에 대한 안전하고 유효한 백신을 아직 개발하지 못했다. 본 발명자들은 바이러스 부하(virus load)를 일시적으로 감소시킬 수 있는 고도로 활성인 항-레트로바이러스 요법(higly active anti-retroviral therapy, HAART)이 등장함에 따라 HIV 감염의 치료에서 얼마간의 성공을 목격하였지만, 이러한 방법은 독성, 주요 선진국 이외의 지역에서의 터무니없이 비싼 가격, 및 약물 내성 바이러스 균주 수의 지속적인 증가를 포함하는 많은 문제점을 안고있다. 주로 이러한 문제점들로 인해, HIV 감염을 제어하는 최상의 수단으로서 백신 개발이 다시 한번 주목을 받게 되었다.
전체(whole) 비활성화된 시미안 면역결핍 바이러스(simian immunodeficiency virus, SIV)로 면역화되거나 SIV 감염된 세포로 면역화된 붉은털(rhesus macaque) 원숭이가 치명적인 SIV 공격(challenge)을 방어하였다는 것이 증명됨에 따라 HIV 감염 및 AIDS의 예방은 이론적으로 달성가능한 것이 되었다. 그 이후로, HIV/AIDS에 대한 인간 백신을 개발하기 위해 수 많은 방법이 사용되어 왔다. 이러한 방법은 비활성화된 바이러스, HIV-1 항원을 발현하는 바이러스 유사 입자, HIV-1 항원을 발현하는 재조합 생 바이러스 벡터, 외피 기반(envelope based) 서브유닛(subunit) 백신, HIV-1 유전자 서열을 함유하는 DNA를 사용한 유전자 백신접종, 다가 펩티드 백신 등을 포함한다. 이러한 모든 방법과 관련하여 고유의 장단점이 존재하지만, 현재까지 어떠한 방법도 성공적인 것으로 판명되지 않았다.
HIV/AIDS에 대한 백신 개발은 3가지 주된 문제를 해결하기 위해 계속 노력하고 있다. 첫 번째는 방어 반응을 발생시키기 위해 HIV의 어떤 항원(들)이 면역계에 제시되는 것이 필요한 가이다. 두 번째는 이러한 항원들을 면역계에 제시하는 가장 효과적인 방법은 무엇인 가이다. 마지막으로, 인간 면역 반응의 어떤 구성요소들이 HIV 감염에 대한 방어를 부여하는 가 (세포성, 체액성 또는 점막 면역, 또는 3가지의 어떤 조합)이다. 잠재적인 백신은 성공적이 되기 위해 이러한 모든 문제를 다루어야 한다.
개요
본 발명은 HIV에 대해 장기간 지속하는 체액성, 세포매개성 및 점막 면역 반응을 유도하는, HIV/AIDS에 대한 신규한 복합 프라임-부스트(prime-boost) 백신을 제공한다.
부분적으로, 본 발명의 백신은 프라임(prime) 주사로서 전사멸(whole-killed) 바이러스인 유전적으로 변형된 HIV를 사용하는 것을 포함한다. 이는 본래의 바이러스 표면 구조에 의한 최대 자극을 제공한다. 천연 Env 당단백질 신호 서열이 더욱 효율적이고 비세포독성인 것으로 대체되고 nef 유전자의 일부가 결실된, 빠르게 복제하고 비병원성인 HIV-1을 사용하여 프라이밍 백신이 구성된다. 이러한 유전적으로 변화된 바이러스 (HIV-1의 단지 하나의 서브타입이 아니라 다수의 서브타입으로부터 구성될 수 있음)가 대량으로 생성되고, 비활성화되어, 강력한 체액성 또는 항체 매개된 면역 반응을 유도하기 위해 사멸된 전바이러스(whole-virus) 백신으로서 사용될 수 있다. 사멸된 전바이러스 백신은 실질적으로 모든 바이러스 단백질을 숙주 면역계로 발현시킬 뿐만 아니라 그러한 단백질을 성숙한 천연 형태로 제시하는 중요한 이점을 지닌다.
본 발명의 백신은 바이러스 유사 입자를 형성하는 gag-HIV 에피토프 융합 단백질을 전달하는 재조합 아데노바이러스를 부스트 면역화 양식(boost immunization modality)으로서 사용하는 것을 추가로 포함한다. 중화 에피토프와 세포독성 T-세포 에피토프 영역 둘 모두와 융합되는 HIV gag 유전자를 지닌 이러한 복제불능(replication-incompetent) 재조합 아데노바이러스 (rAd) 벡터는 모든 주요 HIV-1 서브타입으로부터 구성될 수 있다. 이러한 벡터는 이들의 복제를 지탱해주는 복제허용(permissive) 헬퍼 세포주에서 생성될 수 있고, 그 후 함께 투여되는데, 여기서 이들 벡터는 숙주 세포를 감염시킬 수 있지만 숙주 세포내에서 복제될 수 없고, 그 대신 면역계에 제시되는 HIV 표적 항원을 함유하는 바이러스 유사 입자를 생성시킨다. 따라서, 복제결합 rAd는 부스트 백신으로서 사용되고, 체액성 및 세포매개성 면역을 유도할 수 있을 뿐만 아니라 잠재적으로 점막 면역도 유도할 수 있다.
종합해 볼 때, 본 발명자들은 이러한 복합 방법이 강력한 HIV/AIDS 백신접종 방법을 나타낸다고 믿는다.
본 발명의 방법의 실시를 위한 조성물 및 키트가 또한 본원에서 설명된다.
본 발명의 이러한 구체예, 그 밖의 구체예 및 이들 구체예의 특징 및 특성은 하기 설명, 도면 및 청구의 범위로부터 명백해질 것이다. 본 발명의 범위를 완전히 이해하기 위해, 본 발명의 바람직한 구체예를 형성하도록 본 발명의 다양한 일면이 결합될 수 있다는 것이 추가로 인식될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 nef 결실되고 EnvNSS 대체된 복합 변종의 구성을 도시한다. 연구되는 HIV-1의 각각의 균주의 경우, nef 유전자의 표적화된 결실이 도입되었고, HIV-1 Env의 천연 신호 서열이 꿀벌 멜리틴(melittin)의 신호 서열로 대체되었다 (A). 그러나, env의 N-말단 코딩 영역과 vpu의 C-말단 코딩 영역 간의 중첩으로 인해 (A, 삽입그림), 이는 vpu 유전자를 또한 붕괴시킨다. 서브타입 특이성의 변이, 세포 향성(cellular tropism), 1차(primary) 대 조직 배양 적응된 바이러스, 신호 서열 길이 및 EnvNSS에 존재하는 양하전된 아미노산 잔기의 수를 기초로 하여 HIV-1의 4개의 별개의 균주가 본 연구를 위해 선택되었다. 가장 주목할 만하게도, EnvNSS에 존재하는 양하전된 아미노산의 수가 효과적인 Env 당단백질 생합성에 있어서 결정적인 것으로 밝혀졌다. 패널 B에는 선택된 균주의 표현형 특성이 간략히 기재되어 있고, C에는 각각의 바이러스의 Env 신호 펩티드가 제시되어 있는데, 여기서 양하전된 아미노산 잔기는 밑줄그어져 있고 추정 신호 서열 절단 부위는 이중 줄무늬 (//)로 표시되어 있다.
도 2는 A3.01 및 H9 세포에서 HIV- NL4-3 변종의 복제 및 감염력을 도시한다. 프로바이러스 DNA의 트랜스펙션 후, 2일째 마다 세포를 분할하고, 세포 상층액의 샘플을 수집하고, p21 ELISA에 의해 분석하여 바이러스 복제를 모니터링하였다. 생성되는 바이러스 입자의 감염력을 평가하기 위해, 샘플을 MAGI 검정에 의해 추가로 분석하고, p24 단백질 ng 당 존재하는 감염성 바이러스 입자의 수를 나타내도록 결과를 표준화하였다. 본 도면에 도시된 바와 같이, 유전적으로 변형된 nef 결실되고 EnvNSS 대체된 복합 변종 (NL4-3 T)은 A3.01 (A) 및 H9 (B) 세포 둘 모두에서 야생형 바이러스 (NL4-3 W) 보다 빠르게 그리고 이와 동일하거나 이 보다 높은 역가로 복제된다. 이는 야생형 바이러스가 NL4-3 T 변종 보다 약 10배 (B, 삽입그림) 내지 50배 (A, 삽입그림) 더 감염성임에도 불구하고 그러한 것이다.
도 3은 복제결함(replication-defective) rAd 벡터의 개략도이다. 복제결함 rAd 벡터는 일련의 중화 또는 T-세포 에피토프에 융합된 HIV-1 또는 HIV-2 gag 유전자의 트렁케이션된(truncated) 형태로 구성된 융합 단백질을 Ad5 백본 벡터의 결실된 E1A 영역내로 클로닝함으로써 생성되었다. 본 도면은 5개의 rAd 벡터 (rAd1 내지 5)를 각각 도시하며, 삽입된 에피토프 각각의 명칭 및 아미노산 서열을 도시한다. rAd1 내지 3은 중화 에피토프 (HIV-2 gag에 융합되어 있음)를 함유하며, rAd4 및 5는 T-세포 에피토프 (HIV-1 gag에 융합되어 있음)를 함유한다.
도 4는 동물 선택 및 계획을 도시한다. 18마리의 수컷 붉은털 원숭이를 본 실험을 위해 선택하고, 캘리포니아 내셔널 프라이메이트 리서치 센터(California National Primate Research Center) (Davis, California)에 수용시켰다. 각각의 피검체에 대한 개개의 동물 식별 번호 뿐만 아니라 연구가 개시될 당시의 동물의 연령이 나타나 있다. 동물들을 3개의 군, 즉, 1군, 2군 및 대조군으로 나누었다. 시점 및 면역원을 포함하는 각각의 군에 대한 백신접종 계획이 나타나 있다 (AT-2: AT-2 비활성화된 전사멸 바이러스 항원과 CpG 애쥬번트를 사용한 면역화, rAd: rAd 항원과 CpG 애쥬번트를 사용한 면역화). 각각의 동물 군을 공격 일자를 기준으로 하여 2개의 추가 군으로 세분하였다 (*이것은 백신접종 프로토콜과 무관한 것으로 믿어지는 일시적인 건강에 대한 우려로 인해 백신접종이 지연된 33226번 동물을 포함시키기 위해 필요하였음). 33주째에 공격받은 18마리의 동물 중 12마리를 하위군 WOV01로 표시하였고, 39주째 공격받은 나머지 6마리 동물을 하위군 WOV02로 표시하였다. 바이러스 공격은 SHIV 89.6 바이러스와 SHIV SF162p4 바이러스를 정맥내로 복합 투여하는 것으로 구성되었다. 샘플을 도 5에 나타나 있는 바와 같이 수거하고, 이 도면에 표시된 일자에 각각의 동물에 대해 검시(necropsy)를 수행하였다.
도 5는 동물 체중 측정치를 도시한다. 동물들을 주기적으로 칭량하고, 전반적 건강 및 안녕(well-being)을 평가하기 위해 백신접종전 및 백신접종후 상태 뿐만 아니라 공격전 및 공격후 상태를 조사하였다. 모든 동물은 측정가능한 체중 손실 또는 부정적인 부작용없이 백신접종 프로토콜을 잘 감내하였다 (백신접종 일자는 황색 화살표로 표시됨). 또한, 일부 동물이 공격후 (공격 일자는 적색 화살표로 표시됨) 약간의 체중 변동을 나타냈지만, 모두 비교적 건강하게 존재하였고, 검시할 때까지 수 개월 동안 모니터링되었다.
도 6은 CD4:CD8 T-세포 비를 도시한다. 샘플링된 혈액 μl 당 CD4+ 및 CD8+ T-세포의 수를 유량 세포계측법에 의해 측정하고, CD4:CD8 비를 계산하였다. 건강한 동물은 통상적으로 1 보다 큰 CD4:CD8 비를 나타내었다 (점선으로 표시됨). 백신접종되지 않은 대조군을 포함하는 모든 군의 동물들은 공격전 및 공격후 둘 모두 일관된 CD4:CD8 비를 유지하였다. 백신접종 일자는 연회색 화살표로 표시되어 있고, 공격 일자는 암회색 화살표로 표시되어 있다.
도 7은 T-세포 증식 검정을 도시한다. 림프구 증식 검정을 수행하여 HIV 특이적 CD4+ T-세포 반응을 평가하였다. 세포를 AT-2 비활성화된 HIV로 자극시키고, 세포 증식을 방사성표지된 기질을 혼입시킴으로써 측정하였다. 2의 자극 지수 (SI) (점선으로 표시됨)를 양성 증식에 대한 컷오프(cutoff) 값으로서 사용하였다. 백신접종 일자는 연회색 화살표로 표시되어 있고, 공격 일자는 암회색 화살표로 표시되어 있다. 동물들을 공격전 백신접종 단계 (패널 A) 뿐만 아니라 공격후 단계 (패널 B) 둘 모두 동안 평가하였다.
도 8은 IFN-γ ELISPOT 검정을 도시한다. CD8+ 세포독성 T-세포 (CTL) 반응을 IFN-감마 ELISPOT 검정에 의해 평가하였다. IFN-감마 분비 세포의 빈도를 6주째, 12주째, 20주째 및 38주째에 조사하였다. HIV-1 Gag 단백질의 보존된 영역을 나타내는 20개의 펩티드 (15량체)의 푸울(pool)을 사용하여 세포를 자극하였다. 하나의 HIV-1 혈청양성 환자로부터의 분리된 PBMC가 양성 대조군으로서 기능하였다. 본 도면에서 결과는 백만개의 PBMC 당 IFN-감마 발현 세포의 수로서 표현된다. 33주째에 공격받은 WOV01 동물군으로부터의 대표적인 데이터가 도시되어 있다.
도 9는 혈장 vRNA (바이러스 부하) 검정을 도시한다. SHIV 공격 후, 혈장 SIV RNA의 수준을 분지 DNA(branched DNA, bDNA) 검정에 의해 측정하였다. 검정을 위한 컷오프 검출 한계는 ml 당 혈장 vRNA의 log 2.1 카피(copy)이다 (점선으로 표시됨). 33주째에 공격받은 (암회색 화살표로 표시됨) WOV01 동물군으로부터의 대표적인 데이터가 도시되어 있다.
도 10은 혈장 IgG 항-HIV 항체 검정을 도시한다. 포획 항원으로서 HIV-1 IIIB 정제된 바이러스 용해물을 사용하여 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 존재하는 항-HIV-1 항체의 수준에 대해 혈청 샘플을 분석하였다. 백신접종 일자는 연회색 화살표로 표시되어 있고, 공격 일자는 암회색 화살표로 표시되어 있다. 33주째에 공격받은 WOV01 동물군으로부터의 대표적인 데이터가 도시되어 있다.
도 11은 프라임-부스트 백신 실험의 타임라인(timeline)을 도시한다. 이는 백신 실험 계획을 요약한 것으로서, 시간은 1군 및 2군 (백신접종군)에 대해서는 면역화후 주수(week)로 나타나 있고, 대조군에 대해서는 공격후 주수로 나타나 있다. 연회색 원은 샘플 수거 시점을 나타내고, 암회색 원은 39주째 (WOV01 하위군 동물에 대한 33주째와 대비됨)에 공격받은 WOV02 하위군 동물들을 포함시키기 위해 채취된 추가 샘플을 나타낸다. 연회색 화살표는 백신접종 시점을 나타내고, 암회색 화살표는 공격 시점을 나타낸다. AT-2: 500μl AT-2 비활성화된 전사멸 바이러스 항원과 500μl CpG 애쥬번트를 사용한 면역화, rAd: 500μl rAd 항원과 500μl CpG 애쥬번트를 사용한 면역화, SHIV 공격: SHIV 89.6과 SHIV SF162p4 둘 모두의 복합 TCID50=100에 의한 바이러스 공격.
상세한 설명
A. 정의
편의를 위해, 본 명세서, 실시예 및 청구의 범위에서 사용된 특정 용어들을 여기에 정리해 두었다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 학술 용어들은 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 지닌다.
본원에서 단수 형태로 표시된 용어는 그 용어의 대상이 1개 또는 1개를 초과 (즉, 적어도 1개)함을 의미한다. 예로서, "엘리먼트"라 함은 1개의 엘리먼트 또는 1개를 초과하는 엘리먼트를 의미한다.
"투여하는"이라는 용어는 피검체의 시스템내로 또는 피검체내 또는 피검체상의 특정 영역으로 비제한적으로 약제 조성물 또는 치료제를 포함하는 본 발명의 화합물을 전달하는 임의의 방법을 포함한다. 본원에서 사용되는 어구 "전신 투여", "전신 투여되는", "말초 투여" 및 "말초 투여되는"이란 화합물, 약물 또는 기타 물질이 환자의 시스템으로 진입함으로써 대사 및 그 밖의 유사한 과정을 겪게 되도록, 직접 투여가 아닌 방식으로 중추신경계내로 투여되는 것, 예를 들어 피하 투여를 의미한다. "비경구 투여" 및 "비경구 투여되는"이란 장 및 국소 투여가 아닌 투여 방식을 의미하는데, 일반적으로 주사에 의해 이루어지며, 비제한적으로 정맥, 근내, 동맥내, 수막강내(intrathecal), 피막내(intracapsular), 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관(transtracheal), 피하, 표피하(subcuticular), 관절내, 피막하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 척수강내(intraspinal) 및 흉골내(intrasternal) 주사 및 주입을 포함한다.
"아미노산"이라는 용어는 당 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 아미노산 및 보호기를 명명하기 위해 본원에서 사용된 약어는 IUPAC-IUB 커미션 온 바이오케미컬 노멘클러쳐(IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature) (참조: Biochemistry (1972) 11 : 1726-1732)의 권고에 기초한 것이다. 특정 구체예에서, 본원에서 사용된 아미노산은 단백질에서 발견되는 천연 아미노산 또는 아미노기와 카복실기를 함유하는 이러한 아미노산의 천연 동화 또는 이화 산물이다. 특히 적절한 아미노산 측쇄는 하기 아미노산의 측쇄로부터 선택된 측쇄를 포함한다: 글리신, 알라닌, 발린, 시스테인, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 글루탐산, 아스파르트산, 글루타민, 아스파라긴, 리신, 아르기닌, 프롤린, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판.
추가로 "아미노산"이란 용어는 본원에 언급된 임의의 특정 아미노산의 유사체, 유도체 및 동종체(congener) 뿐만 아니라 C-말단 또는 N-말단 보호된 아미노산 유도체 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단 보호기로 변형됨)를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 측쇄가 길어지거나 짧아지지만 여전히 카복실기, 아미노기 또는 고리화를 위한 그 밖의 반응성 전구체 작용기를 제공하는 아미노산 유사체 뿐만 아니라 적절한 작용기를 지닌 변이체 측쇄를 지닌 아미노산 유사체를 사용하는 것을 고려한다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 아미노산 유사체, 예를 들어 시아노알라닌, 카나바닌(canavanine), 드젠콜산(djenkolic acid), 노르류신, 3-포스포세린, 호모세린(homoserine), 디히드록시-페닐알라닌, 5-히드록시트립토판, 1 메틸히스티딘, 3-메틸히스티딘, 아미노피멜산, 오르니틴 또는 디아미노부티르산을 포함할 수 있다. 본원에서 사용하기에 적절한 측쇄를 지닌 그 밖의 천연 아미노산 대사물 또는 전구체는 당업자에 의해 인식될 것이고, 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 그러한 아미노산의 (d) 및 (l) 입체이성질체가 포함되는데, 이는 아미노산의 구조가 입체이성질체 형태를 허용하는 경우이다. 본원에서 아미노산 및 아미노산 잔기의 배열은 적절한 기호인 (d), (l) 또는 (dl)로 나타난다. 또한, 배열이 표시되지 않은 경우, 아미노산 또는 잔기는 배열 (d), (l) 또는 (dl)을 지닐 수 있다. 따라서, 이러한 비대칭으로부터 발생하는 이성질체가 본 발명의 범위내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 이성질체는 통상적인 분리 기술 및 입체적으로 조절되는 합성법에 의해 실질적으로 순수한 형태로 수득될 수 있다. 본원의 목적상, 달리 명시되지 않는 한, 명명된 아미노산은 (d) 또는 (l) 입체이성질체 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 예를 들어 임의의 이소타입 (IgG, IgA, IgM, IgE 등)의 전항체(whole antibody)를 포함하는 것으로 의도되며, 이는 폴리클로날, 모노클로날, 재조합 및 인간화된 항체, 및 특정 단백질의 에피토프를 특이적으로 인식하고 이와 결합할 수 있는 이들의 단편을 포함한다. 항체는 통상적인 기술을 이용하여 단편화될 수 있고, 단편은 동일한 방식으로 유용성이 대해 스크리닝될 수 있다. 따라서, 상기 용어는 특정 단백질과 선택적으로 반응할 수 있는 항체 분자의 단백분해적으로 절단되거나 재조합적으로 제조된 부분의 세그먼트를 포함한다. 이러한 단백분해 단편 및/또는 재조합 단편의 비제한적인 예는 Fab, F(ab')2, Fab', Fv, 및 펩티드 링커에 의해 결합된 V[L] 및/또는 V[H] 도메인을 함유하는 단일 사슬 항체 (scFv)를 포함한다. scFv는 공유결합되거나 비공유결합되어 2개 이상의 결합 부위를 지닌 항체를 형성할 수 있다.
"포함한다" 및 "포함하는"이란 용어는 포괄적이고 개방적인 견지에서 사용되며, 추가의 엘리먼트가 포함될 수 있음을 의미한다.
"보존적 치환"이란 용어는 광범위하게 유사한 분자 특성을 지닌 아미노산 사이의 교환을 의미한다. 예를 들어, 지방족 그룹인 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신내에서의 상호교환은 보존적인 것으로 간주될 수 있다. 때때로, 이들 중 하나가 글리신으로 치환되는 것이 또한 보존적인 것으로 간주될 수 있다. 다른 보존적 상호교환은 지방족 그룹인 아스파르테이트와 글루타메이트내에서의 상호교환; 아미드 그룹인 아스파라긴과 글루타민내에서의 상호교환; 히드록실 그룹인 세린과 트레오닌내에서의 상호교환; 방향족 그룹인 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판내에서의 상호교환; 염기성 그룹인 리신, 아르기닌 및 히스티딘내에서의 상호교환; 및 황 함유 그룹인 메티오닌과 시스테인내에서의 상호교환을 포함한다. 때때로, 메티오닌과 류신 그룹내에서의 치환이 또한 보존적인 것으로 간주될 수 있다. 바람직한 보존적 치환 그룹은 아스파르테이트-글루타메이트; 아스파라긴-글루타민; 발린-류신-이소류신; 알라닌-발린; 발린-류신-이소류신-메티오닌; 페닐알라닌-티로신; 페닐알라닌-티로신-트립토판; 리신-아르기닌; 및 히스티딘-리신-아르기닌이다.
"등가물"은 핵산 또는 누클레오티드 서열과 관련하여 사용되는 경우 작용성 등가 폴리펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 의미한다. 등가 누클레오티드 서열은 하나 이상의 누클레오티드 치환, 첨가 또는 결실에 의해 달라지는 서열, 예를 들어 대립유전자 변이체를 포함하는데, 이에 따라 유전 코드의 축퇴(degeneracy)로 인해 달라지는 서열을 포함할 것이다. 예를 들어, 핵산 변이체는 누클레오티드 치환, 결실 또는 첨가에 의해 생성된 변이체를 포함할 수 있다. 치환, 결실 또는 첨가는 하나 이상의 누클레오티드를 수반할 수 있다. 변이체는 코딩 영역, 비코딩 영역 또는 둘 모두에서 변화될 수 있다. 코딩 영역에서의 변화는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 생성시킬 수 있다.
변이체 펩티드는 당 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 직접 화학 합성에 의해 공유적으로 제조될 수 있다. 변이체는 예를 들어 아미노산 서열내에서의 잔기들의 결실, 삽입 또는 치환을 추가로 포함할 수 있다. 최종 구성물에 도달하도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 또한 이루어질 수 있는데, 단, 최종 구성물은 요망되는 활성을 지닌다. 이러한 변이체는 펩티드 분자를 엔코딩하는 DNA에서 누클레오티드를 (문헌[Adelman et al., DNA 2: 183 (1983)]에서 예증된 바와 같이) 특정부위(site-directed) 돌연변이유발시켜서 변이체를 엔코딩하는 DNA를 생성시킨 후 상기 DNA를 재조합 세포 배양물에서 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 변이체는 전형적으로 야생형 폴리펩티드와 동일한 정성적 생물학적 활성을 나타낸다. 공지된 폴리펩티드의 모든 가능한 단일 아미노산 치환체가 또한 합성될 수 있는 것으로 당 분야에 공지되어 있다 (Geysen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 18:3998-4002 (1984)). 다양한 치환의 효과가 항상 상가적인 것은 아니지만, 폴리펩티드내의 상이한 잔기 위치에서의 2개의 유리한 또는 중성 단일 치환이 임의의 단백질 활성을 상실함이 없이 안전하게 조합될 수 있다고 예측하는 것은 타당하다. 축퇴 폴리펩티드의 제조 방법은 공지되어 있다 (Rutter, U.S. Pat. No. 5,010,175; Haughter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 82:5131-5135 (1985); Geysen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 18:3998-4002 (1984); WO86/06487; 및 WO86/00991).
치환 전략을 고안함에 있어서, 당업자는 변화시키려는 잔기 및 어떠한 아미노산 또는 아미노산 부류가 적절한 대체물인 지를 결정할 것이다. 또한, 패밀리(family) 또는 천연 동족체 단백질에서의 서열 변이의 연구가 또한 참작될 수 있다. 특정 아미노산 치환이 종종 다른 것들 보다 더 용인되며, 이러한 치환은 본래의 아미노산과 이의 대체물 간의 크기, 전하 등의 유사성과 종종 상호관련된다. 아미노산의 삽입 또는 결실이 또한 상기 설명된 바와 같이 이루어질 수 있다. 치환은 바람직하게는 보존적이다 (참조: Schulz et al., Principle of Protein Structure (Springer-Verlag, New York (1978)); 및 Creighton, Proteins: 0Structure and Molecular Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco 1983)) (두 문헌 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함되어 있음).
본원에서 사용된 용어 "본질적으로 비세포용해성"은 레트로바이러스가 이에 의해 감염된 세포를 유의할 만하게 손상시키지 않거나 치사시키지 않음을 의미한다.
본원에서 사용된 핵산의 "작용성" 단편은 이에 결합된 유전자의 신호 서열을 코딩할 수 있는 핵산 단편이다. 따라서, 핵산의 "작용성 단편"은 적절한 조건에서 신호 서열을 코딩할 수 있는 핵산을 포함하는 것으로 의도된다.
"HIV"란 용어는 인간 면역결핍 바이러스를 지칭하는 것으로 당업자에게 공지되어 있다. 2가지 유형의 HIV, 즉, HIV-1 및 HIV-2가 존재한다. HIV-1의 많은 상이한 균주가 존재한다. HIV-1의 균주는 3가지 그룹, 즉, "주요(major)" 그룹 M, "아웃라이어(outlier)" 그룹 O 및 "신규(new)" 그룹 N으로 분류될 수 있다. 이러한 3가지 그룹은 인간내로의 시미안 면역결핍 바이러스의 3가지 개별적 도입을 나타낼 수 있다. M-그룹내에는 10개 이상의 서브타입 또는 클레이드(clade), 예를 들어 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J 및 K가 존재한다. "클레이드"는 구성원들이 공통의 조상으로부터 유래된 상동성(homologous feature)을 공유하는 종(species)과 같은 생물체의 군이다. 본원에서 HIV-1이라 함은 이러한 균주들 모두를 포함한다.
"포함하는"이란 용어는 "비제한적으로 포함하는"을 의미하기 위해 사용된다. "포함하는" 및 "비제한적으로 포함하는"은 상호교환적으로 사용된다.
"비감염성"이란 용어는 감염시킬 능력이 감소된 상태 내지 그러한 능력이 존재하지 않음을 의미한다.
"환자" 또는 "피검체" 또는 "숙주"는 인간 또는 비인간 동물을 지칭한다.
"약제 전달 장치"란 용어는 치료제(들)을 피검체에 투여하기 위해 사용될 수 있는 임의의 장치를 지칭한다. 약제 전달 장치의 비제한적 예는 피하 주사기, 다중챔버 주사기, 스텐트(stent), 카테터, 경피 패치, 미세침(microneedle), 마이크로어브레이더(microabrader) 및 이식형 방출 제어 장치를 포함한다. 한 가지 구체예에서, "약제 전달 장치"이란 용어는 주사 전에 2개의 화합물을 혼합할 수 있는 2중 챔버 주사기를 지칭한다.
"약제학적으로 허용되는"이란 어구는 건전한 의학적 판단의 범위내에서 합리적인 유익/유해 비에 상응하게 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 그 밖의 문제 또는 합병증없이 인간 및 동물의 조직과 접촉한 상태로 사용하기에 적절한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여형을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
본원에서 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체"라는 어구는 하나의 기관 또는 신체의 일부에서 또 다른 기관 또는 신체의 일부로 본 발명의 화합물을 운반하거나 수송하는 데에 관여하는, 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 또는 물질을 캡슐화하는 용매를 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분들과 양립할 수 있고 환자에게 유해하지 않다면 "허용"된다고 할 것이다. 약제학적으로 허용되는 담체로서 기능할 수 있는 물질의 몇 가지 예는 (1) 당, 예를 들어 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스; (2) 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로오스 및 이의 유도체, 예를 들어 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말 트라가칸트(powdered tragacanth); (5) 맥아(malt); (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 부형제, 예를 들어 코코아 버터 및 좌약용 왁스; (9) 오일, 예를 들어 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예를 들어 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예를 들어 마그네슘 히드록시드 및 알루미늄 히드록시드; (15) 알긴산; (16) 발열원 비함유 물; (17) 등장 식염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 폴리안히드라이드(polyanhydride); 및 (22) 약제 제형에 사용되는 그 밖의 비독성인 양립성 물질을 포함한다.
"폴리누클레오티드" 및 "핵산"이란 용어는 데옥시리보누클레오티드 또는 리보누클레오티드, 또는 이들의 유사체인 임의의 길이의 누클레오티드의 중합체 형태를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 폴리누클레오티드의 비제한적인 예는 다음과 같다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 연관 분석으로부터 규정된 유전자좌(들), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리누클레오티드, 분지된 폴리누클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리누클레오티드는 변형된 누클레오티드, 예를 들어 메틸화된 누클레오티드 및 누클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 누클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 제공될 수 있다. 누클레오티드의 서열은 비누클레오티드 성분에 의해 간섭될 수 있다. 폴리누클레오티드는 중합 후에, 예를 들어 표지화 성분과의 컨쥬게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다. "재조합" 폴리누클레오티드란 용어는 게놈, cDNA, 반합성 또는 합성 기원의 폴리누클레오티드로서, 천연 상태에서는 존재하지 않거나 비천연 배열로 또 다른 폴리누클레오티드에 결합되어 있는 폴리누클레오티드이다. "올리고누클레오티드"는 약 100개 미만의 누클레오티드, 예를 들어 약 75개, 약 50개, 약 25개 또는 약 10개 미만의 누클레오티드를 지닌 단일 가닥 폴리누클레오티드를 지칭한다.
"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 (단일 사슬인 경우) 본원에서 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비아미노산(non-amino acid)에 의해 간섭될 수 있다. 상기 용어는 또한 변형된 아미노산 중합체을 포함하는데, 변형은 예를 들어 이황화물 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지화 성분과의 컨쥬게이션과 같은 임의의 다른 조작이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 화학적으로, 세포 비함유 시스템에서 리보솜에 의해, 또는 세포내에서 리보솜에 의해 합성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 화학적 합성은 다양한 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있는데, 이러한 방법은 단계적 고체상 합성, 펩티드 단편의 입체형태적으로 보조된 재연결(conformationally-assisted re-ligation)을 통한 반합성, 클로닝된 또는 합성 펩티드 세그먼트의 효소적 연결 및 화학적 연결을 포함한다. 고유의 화학적 연결은 2개의 보호되지 않은 펩티드 세그먼트의 화학선택적 반응을 이용하여, 일시적 티오에스테르 결합된 중간체를 생성시킨다. 그 후, 상기 일시적 티오에스테르 결합된 중간체는 자발적으로 재배열되어, 연결 부위에서 고유의 펩티드 결합을 지닌 전장 연결 생성물을 제공한다. 전장 연결 생성물은 세포 비함유 합성에 의해 생성된 단백질과 화학적으로 동일하다. 전장 연결 생성물은 허용되는 경우 리폴딩(refolding)되고/되거나 산화되어, 고유의 이황화물 함유 단백질 분자를 형성한다 (참조: 예를 들어 미국 특허 번호 6,184,344 및 6,174,530; 및 T. W. Muir et al., Curr. Opin. Biotech. (1993): vol. 4, p 420; M. Miller, et al., Science (1989): vol. 246, p 1149; A. Wlodawer, et al., Science (1989): vol. 245, p 616; L. H. Huang, et al., Biochemistry (1991): vol. 30, p 7402; M. Schnolzer, et al., Int. J. Pept. Prot. Res. (1992): vol. 40, p 180-193; K. Rajarathnam, et al., Science (1994): vol. 264, p 90; R. E. Offord, "Chemical Approaches to Protein Engineering", in Protein Design and the Development of New therapeutics and Vaccines, J. B. Hook, G. Poste, Eds., (Plenum Press, New York, 1990) pp. 253-282; C. J. A. Wallace, et al., J. Biol. Chem. (1992): vol. 267, p 3852; L. Abrahmsen, et al., Biochemistry (1991): vol. 30, p 4151; T. K. Chang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91 : 12544-12548; M. Schnlzer, et al., Science (1992): vol., 3256, p 221; and K. Akaji, et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) (1985) 33: 184).
당업자에게 공지된 바와 같이, "레트로바이러스"는 통합된 DNA 중간체 (프로바이러스 DNA)를 통해 복제되는 이배체의 양성 가닥 RNA 바이러스이다. 특히, RNA 바이러스에 의해 감염되는 경우, 렌티바이러스 게놈은 각각의 레트로바이러스에 단백질로서 함유된 바이러스 엔코딩된 역전사효소에 의해 DNA로 역전사된다. 그 후, 바이러스 DNA는 감염 세포의 숙주 세포 게놈내로 준무작위로(pseudo-randomly) 통합되어, 딸세포에 의해 유전되는 "프로바이러스"를 형성한다. 레트로바이러스 게놈은 3개 이상의 유전자를 함유하는데, gag는 바이러스의 코어 및 구조 단백질을 코딩하고; pol은 역전사효소, 프로테아제 및 인티그라제(integrase)를 코딩하며; env는 바이러스 표면 단백질을 코딩한다. 레트로바이러스 패밀리내에서, HIV는 렌티바이러스로서 분류되며, 이는 동물 렌티바이러스, 예를 들어 고양이 (고양이 면역결핍 바이러스), 양 (비스나(visna) 바이러스), 염소 (염소 관절염-뇌염 바이러스), 및 비인간 영장류 (시미안 면역결핍 바이러스)를 감염시키는 것들과 유전적 및 형태학적 유사성을 지닌다.
본원에서 사용된 "충분한 결실"은 전사를 억제함으로써 상응하는 단백질 생성물의 생성을 억제하기에 충분한 핵산 서열의 결실을 의미한다.
B. 렌티바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법
프라임 주사로서 유효량의 본 발명의 사멸된 본질적으로 비감염성인 비병원성 재조합 렌티바이러스 (a) 및 부스트 면역화 양식으로서 렌티바이러스 단백질을 엔코딩하는 핵산을 포함하는 유효량의 재조합 복제결함 아데노바이러스 벡터 (b)를 렌티바이러스 감염을 예방하거나 치료할 필요가 있는 동물에게 투여하는 것을 포함하여 렌티바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법이 제공된다.
본원에서 사용된 용어 "유효량"은 요망되는 결과를 달성하는 데에 필요한 투여량에서 이를 달성하는 데에 필요한 시간 동안 유효한 양을 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "동물"은 포유동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 동물계의 모든 구성원을 포함한다.
특정 구체예에서, (a)는 (b)가 동물에게 투여되기 전에 동물에게 투여된다.
특정 구체예에서, (b)는 치료 또는 예방 과정에 걸쳐 1회를 초과하여 환자에게 투여된다.
특정 구체예에서, (a)는 이를 필요로 하는 환자에게 투여되고, (b)는 (a)를 투여한 후 3주째, 8주째 및 16주째에 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다.
특정 구체예에서, 렌티바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 당단백질 120 신호 서열을 지닌 재조합 렌티바이러스를 포함하는 유효량의 백신 (a)과 렌티바이러스 단백질을 엔코딩하는 핵산을 포함하는 유효량의 재조합 복제결함 아데노바이러스 벡터 (b)를 투여하는 것을 포함하는데, 상기 당단백질 120 신호 서열은 SEQ ID NO: 3 내지 6으로 제시된 폴리펩티드 서열, 또는 이의 작용성 단편 또는 변이체로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 작용성 단편 또는 변이체는 단지 1개의 양하전된 아미노산을 함유한다.
상기 방법에서 (a) 및 (b)로서 사용된 조성물은 하기 추가로 설명된다.
C. 프라임 주사로서 사용되는 조성물
본질적으로 비감염성인 신호 서열을 제공하도록 바이러스의 외피 당단백질, 바람직하게는 gp120의 천연 신호 서열이 변형된, 다양한 사멸된 본질적으로 비감염성인 비병원성 재조합 렌티바이러스가 프라임 주사인 (a)로서 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 바이러스는 nef 유전자를 결실시킴으로써 비병원성으로 된다.
상기 언급된 구체예에 따르면, 비감염성 NSS를 제공하기 위한 변형은 NSS 서열에서 단지 1개의 양하전된 아미노산을 생성시킨다. 바람직하게는, 렌티바이러스는 HIV-1이다.
특정 구체예에서, 상기 렌티바이러스는 고도로 효율적인 복제를 할 수 있는 본질적으로 비세포용해성인 재조합 HIV-1이며, 여기서 상기 바이러스의 외피 당단백질의 NSS는 길이가 약 20개 내지 약 40개 아미노산인 신호 서열로 대체되어 있고, 상기 신호 서열은 단지 1개의 양하전된 아미노산을 함유한다.
변형된 gp120 신호 서열은 천연 신호 서열 (M R V K E KK TQHLW R WGW R WGTMLLGMLMICSA; SEQ ID NO: 1)에서 양하전된 아미노산을 중성 아미노산으로 치환함으로써 제조될 수 있고; 이러한 변형체는 MX1VX2EX3KTQHLWX4WGWX5WGTMLLGMLMICSA (SEQ ID NO: 2)로서 표현될 수 있으며, 여기서 X1, X2, X3, X4 및 X5는 중성 아미노산이다. 양하전된 잔기는 진하게 표시되어 있고 밑줄그어져 있다.
예시적인 변형된 신호 서열은 다음과 같은 서열을 포함한다:
M R VAEI K TQHLW R WGW R WGTMLLGMLMICSA (YL-I; SEQ ID NO: 3), MIV K E KK TQHLWIWGWIWGTMLLGMLMICSA (YL-2; SEQ ID NO: 4), M R VVEI K TQHLWIWGWIWGTMLLGMLMICSA (YL-3; SEQ ID NO: 5), MIVAEI K TQHLWIWGWIWGTMLLGMLMICSA (YL-4; SEQ ID NO: 6), M K FLVNVALVFMVVYISYIYADPINM (변형된 멜리틴 신호 펩티드, 밑줄그어진 서열은 링커 삽입의 결과이며, 신호 서열과 성숙한 gp120 단백질 사이의 5개의 아미노산을 나타냄; SEQ ED NO: 7), MLLLLLMLFHLGLQASISG R DPINM (변형된 인터류킨 3 신호 펩티드, 밑줄그어진 서열은 링커 삽입의 결과이며, 신호 서열과 성숙한 gp120 단백질 사이의 7개의 아미노산을 나타냄; SEQ ED NO: 8), 또는 이의 작용성 단편 또는 변이체.
상기 조성물을 생성시키기 위한 그 밖의 조성물 및 방법은 본원에 그 전문이 참조로 포함되어 있는 미국 특허 번호 7,067,134에 기재되어 있다.
본 발명의 재조합 렌티바이러스는 당 분야에 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 상기 렌티바이러스는 숙주에서 이러한 렌티바이러스가 복제되고 발현되기에 적절한 조건하에서 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 재조합 렌티바이러스로 트랜스펙션된 세포를 또한 제공하는데, 여기서 상기 바이러스의 외피 당단백질인 gp120의 천연 신호 서열은 본질적으로 비세포용해성 바이러스를 제공하도록 변형되거나 본질적으로 비감염성인 신호 서열로 대체된다. 상기 세포는 바람직하게는 T-림프구, 더욱 바람직하게는 형질전환된 세포주로부터 유래되지 않은 T-세포이다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 유효량의 비병원성이고 본질적으로 비감염성인 렌티바이러스를 투여하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다. 약 0.01 내지 약 2.5 mg/kg 체중, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 0.5 mg/kg 체중, 가장 바람직하게는 약 0.10 내지 약 0.23 mg/kg 체중의 투여량 수준이 본원에 기재된 방법에서 프라임 주사로서 유용하다. 단일 투여형을 생성시키기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료하려는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 백신의 투여량은 질병 상태, 연령, 성별 및 개체의 체중, 및 개체에서 요망되는 반응을 유도시키는 항체의 능력과 같은 인자들에 따라 달라질 수 있다. 투여 계획은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 수 개의 분할된 투여량이 매일 투여될 수 있거나, 치료 상황의 급변에 의해 지시되는 바와 같이 투여량이 비례적으로 감소될 수 있다. 백신의 투여량은 또한 상황에 따라 최적의 예방적 투여량 반응을 제공하도록 변화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 생체내에서 생물학적으로 적합한 형태로 피검체에 투여하기에 적절하다. 본원에서 사용된 "생체내 투여하기에 적절한 생물학적으로 적합한 형태"는 임의의 독성 효과 보다 치료 효과가 더 우세한, 투여하려는 물질의 형태를 의미한다. 상기 물질은 임의의 동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다.
본 발명의 백신은 적절한 희석제, 애쥬번트 및/또는 담체를 추가로 함유할 수 있다. 바람직하게는, 백신은 생체내에서 백신의 면역원성을 향상시킬 수 있는 애쥬번트를 함유한다. 애쥬번트는 그람 네거티브 세균 내독소의 지질-A 부분, 미코박테리아의 트레할로오스 디미콜레이트, 인지질 리소레시틴, 디메틸디옥타데실 암모늄 브로마이드 (DDA), 특정 선형 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 (POP-POE) 블록 공중합체, 알루미늄 히드록시드, 리포솜 및 CpG (시토신-포스페이트-구아니딘) 중합체를 포함하는 당 분야에 공지된 많은 애쥬번트로부터 선택될 수 있다. 또한, 백신은 GM-CSF, IL-2, IL-12, TNF 및 IFNγ를 포함하는, 면역 반응을 향상시키는 것으로 공지된 사이토카인을 포함할 수 있다.
본 발명의 백신은 제형화되어 경구, 피내, 근내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내 및 질내, 또는 임의의 다른 표준 면역화 경로를 통해 백신으로서 도입될 수 있다.
본 발명의 백신을 제형화하는 경우, 습윤제, 에멀젼화제 및 활택제, 예를 들어 소듐 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트 뿐만 아니라 착색제, 이형제(releasing agent), 코팅제, 감미제, 착향제 및 방향제, 방부제 및 산화방지제가 제형화되는 약물에 존재할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구, 비강, 국소 (협측(buccal) 및 설하를 포함함), 직장, 질, 에어로졸 및/또는 비경구 투여를 위해 적합할 수 있다. 제형은 단위 투여형으로 편리하게 제공될 수 있고, 약학 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일 투여량을 생성시키도록 담체 물질과 배합될 수 있는 조성물이 양은 치료 중인 피검체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 수 있다.
이러한 제형을 제조하는 방법은 본 발명의 조성물을 담체 및 임의로 하나 이상의 보조 성분과 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 제형은 약물을 액체 담체 또는 미세 분할된 고체 담체와 균일하게 그리고 철저하게 회합시킨 후, 필요에 따라 생성물을 성형함으로써 제조된다.
경구 투여에 적절한 제형은 캡슐, 샤세(cachet), 알약, 정제, 로젠지(lozenge) (착향 베이시스(basis), 일반적으로 수크로오스 및 아카시아 또는 트라가칸트를 사용함), 분말, 과립의 형태로, 또는 수성 또는 비수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서, 또는 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼으로서, 또는 엘릭서 또는 시럽으로서, 또는 파스틸(pastille) (비활성 염기, 예를 들어 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로오스 및 아카시아를 사용함)로서 존재할 수 있으며, 각각 활성 성분으로서 소정량의 본 발명의 조성물을 함유한다. 또한, 본 발명의 조성물은 볼루스(bolus), 지제(electuary) 또는 페이스트로서 투여될 수 있다.
경구 투여용 고체 투여형 (캡슐, 정제, 알약, 당의정, 분말, 과립 등)의 경우, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들어 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트, 및/또는 다음과 같은 것들 중 어느 하나와 혼합된다: (1) 충전제 또는 증량제(extender), 예를 들어 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨, 및/또는 실리스산; (2) 결합제, 예를 들어 카복시메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로오스 및/또는 아카시아; (3) 보습제, 예를 들어 글리세롤; (4) 붕해제, 예를 들어 한천-한천, 칼슘 카보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 및 소듐 카보네이트; (5) 용해 지연제, 예를 들어 파라핀; (6) 흡수 가속화제, 예를 들어 4차 암모늄 화합물; (7) 습윤제, 예를 들어 아세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡착제, 예를 들어 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 활택제, 예를 들어 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트, 및 이들의 혼합물; 및 (10) 착색제. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 조성물은 완충제를 또한 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물이 락토오스 또는 유당(milk sugar)과 같은 부형제 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용하여 연질 및 경질 충전 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 또한 사용될 수 있다.
정제는 임의로 하나 이상의 보조 성분을 사용하여 압축 또는 성형에 의해 제조될 수 있다. 압축된 정제는 결합제 (예를 들어, 젤라틴 또는 히드록시프로필메틸 셀룰로오스), 활택제, 비활성 희석제, 방부제, 붕해제 (예를 들어, 소듐 스타치 글리콜레이트(sodium starch glycolate) 또는 가교된 소듐 카복시메틸 셀룰로오스), 표면활성제 또는 표면분산제를 사용하여 제조될 수 있다. 성형된 정제는 비활성 액체 희석제로 보습된 본 발명의 조성물의 혼합물을 적절한 장치에서 성형함으로써 제조될 수 있다. 정제 및 그 밖의 고체 투여형, 예를 들어 당의정, 캡슐, 알약 및 과립은 장 코팅 및 약제 제형화 분야에 널리 공지된 그 밖의 코팅과 같은 코팅 및 쉘(shell)을 사용하여 임의로 스코어링(scoring)되거나 제조될 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 투여형은 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서를 포함한다. 상기 액체 투여형은 본 발명의 조성물 이외에 당 분야에서 통상적으로 사용되는 비활성 희석제, 예를 들어 물 또는 그 밖의 용매, 가용화제 및 에멀젼화제, 예를 들어 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유(germ oil), 올리브유, 피마자유 및 참깨유), 글리세롤, 테트라히드로푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
현탁액은 본 발명의 조성물 이외에 현탁제, 예를 들어 에톡실화된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정질 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천-한천 및 트라가칸트, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
직장 또는 질 투여를 위한 제형은 좌약으로서 제공될 수 있는데, 이는 본 발명의 조성물을 예를 들어 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 좌약용 왁스 또는 살리실레이트를 포함하는 하나 이상의 적절한 비자극성 부형제 또는 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있고, 실온에서는 고체이지만 체온에서는 액체이므로 체강에서 용해되어 활성 약물을 방출시킨다. 질 투여를 위해 적합한 제형은 당 분야에 적절한 것으로 공지된 담체를 함유하는 페사리(pessary), 탐폰(tampon), 크림, 젤, 페이스트, 포움(foam) 또는 스프레이 제형을 또한 포함한다.
본 발명의 조성물의 경피 투여를 위한 투여형은 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 성분은 멸균 조건하에서 약제학적으로 허용되는 담체 그리고 임의의 방부제, 완충제 또는 필요한 경우 추진제와 혼합될 수 있다.
연고, 페이스트, 크림 및 젤은 본 발명의 조성물 이외에 부형제, 예를 들어 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리스산, 탈크 및 아연 산화물, 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
분말 및 스프레이는 본 발명의 조성물 이외에 부형제, 예를 들어 락토오스, 탈크, 실리스산, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 및 폴리아미드 분말, 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 통상적인 추진제, 예를 들어 클로로플루오로히드로카본 및 비치환된 휘발성 히드로카본, 예를 들어 부탄 및 프로판을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 에어로졸에 의해 투여될 수 있다. 이는 화합물을 함유하는 수성 에어로졸, 리포솜 제제 또는 고체 입자를 제조함으로써 달성된다. 비수성 (예를 들어, 플루오로카본 추진제) 현탁액이 사용될 수 있다. 음파 분무기가 사용될 수 있는데, 이는 약물이 전단(shear)에 노출되는 것을 최소화시키기 때문이며, 이러한 전단은 본 발명의 조성물에 함유된 화합물의 분해를 일으킬 수 있다.
통상적으로, 약제학적으로 허용되는 통상적인 담체 및 안정화제를 사용하여 본 발명의 조성물의 수성 용액 또는 현탁액을 제형화함으로써 수성 에어로졸이 제조된다. 담체 및 안정화제는 특정한 본 발명의 조성물의 요건에 따라 달라지지만, 전형적으로 비이온성 계면활성제 (트윈(Tween), 플루로닉(Pluronic) 또는 폴리에틸렌 글리콜), 무해한(innocuous) 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 소르비탄 에스테르, 올레산, 레시틴, 아미노산, 예를 들어 글리신, 버터, 식염, 당 또는 당 알코올을 포함한다. 에어로졸은 일반적으로 등장 용액으로부터 제조된다.
또한, 백신은 주사 (정맥내, 근내 또는 피하)로서 비경구적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 임의로 하나 이상의 애쥬번트를 함유할 수 있다. CpG 중합체, 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트, 식물성 및 동물성 오일 등과 같은 임의의 적합한 애쥬번트가 사용될 수 있고, 애쥬번트의 양은 사용되는 특정 애쥬번트의 특성에 좌우된다. 또한, 항감염성 백신 조성물은 하나 이상의 안정화제, 예를 들어 탄수화물, 예를 들어 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로오스, 덱스트린, 및 글루코오스 뿐만 아니라 단백질, 예를 들어 알부민 또는 카제인, 및 완충제, 예를 들어 알칼리 금속 포스페이트 등을 또한 함유할 수 있다.
비경구 투여를 위해 적합한 본 발명의 약제 조성물은 본 발명의 조성물을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 멸균 등장 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용 직전에 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 함께 포함하며, 이는 산화방지제, 완충제, 정균제, 제형이 의도된 수용자의 혈액과 등장이 되게 하는 용질 또는 현탁제 또는 증점제를 함유할 수 있다.
본 발명의 약제 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들어 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용하고, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지시키고, 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다.
또한, 본 발명의 비감염성 재조합 렌티바이러스는 리포솜에 캡슐화되어 주사를 통해 투여될 수 있다. 시판되는 리포솜 전달 시스템은 노바박스, 인크.(Novavax, Inc., Rockville, Md.)로부터 입수할 수 있고, Novasomes™이라는 명칭으로 시판된다. 이러한 리포솜은 면역원 또는 항체 전달을 위해 특이적으로 제형화된 것이다. 본 발명의 구체예에서, 이러한 비인지질성(non-phospholipid) 양하전된 리포솜의 표면에 결합된 Isd 펩티드 또는 항체 분자를 함유하는 Novasomes™이 사용될 수 있다.
D. 부스트 면역화 양식으로서 사용되는 조성물
아데노바이러스 5형 (Ad5) 게놈을 기반으로 한 다양한 복제결함 재조합 아데노바이러스 벡터가 상기 기재된 방법에서 부스트 면역화 양식인 (b)로서 사용될 수 있다. 즉, Ad5 게놈으로 구성된 백본 벡터는 바이러스 복제에 필요한 아데노바이러스 E1A 유전자의 결실을 함유한다 (Graham, F., et al. (1977) General Virology 36:59-72). 본 발명의 표적 HIV-1 유전자 (하기에 기재되어 있고, 도 3에 도시되어 있음)가 삽입된 부위는 이러한 결실된 유전자 영역에 존재한다. 표적 HIV-1 유전자는 웹사이트(http://www.hiv.lanl.gov/content/index)의 로스 알라모스 내셔널 래보러토리 HIV 데이터베이스(Los Alamos National Laboratory HIV Databases)로부터 선택될 수 있다.
특정 구체예에서, HIV 유전자는 상기 E1A 영역내에 삽입된다. HIV 유전자는 예를 들어 HIV-1 gag 또는 HIV-2 gag일 수 있다.
다른 구체예에서, HFV 유전자 및 하나 이상의 중화 또는 T-세포 에피토프가 E1A 영역에 삽입된다. 하나 이상의 중화 또는 T-세포 에피토프가 예를 들어 SEQ ID NO:14 내지 34 중 어느 하나로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
발현 벡터는 아데노바이러스의 유전 공학처리된 형태를 포함한다. 36 kb의 선형 이중가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스의 유전자 구성(genetic organization)에 대한 지식은 아데노바이러스 DNA의 커다란 조각이 7 kb 이하의 외래 서열로 치환될 수 있게 한다. 레트로바이러스와 대조적으로, 숙주 세포의 아데노바이러스 감염은 염색체 통합을 일으키지 않는데, 이는 아데노바이러스 DNA가 잠재적인 유전독성없이 에피솜 방식으로 복제될 수 있기 때문이다. 또한, 아데노바이러스는 구조적으로 안정하고, 광범위한 증폭 후에 게놈 재배열이 검출되지 않았다. 아데노바이러스는 이의 세포 주기 단계와 관계없이 실질적으로 모든 내피 세포를 감염시킬 수 있다. 지금까지, 아데노바이러스 감염은 단지 인간의 급성 호흡기 질병과 같은 가벼운 질병과 관련된 것으로 여겨진다.
아데노바이러스는 이의 중간크기 게놈, 조작의 용이성, 높은 역가, 넓은 표적 세포 범위 및 높은 감염력으로 인해 유전자 전달 벡터로서 사용하기에 특히 적합하다. 상기 바이러스 게놈의 양쪽 단부는 100 내지 200개의 염기쌍 역반복부 (ITR)을 함유하며, 이는 바이러스 DNA 복제 및 패키징에 필요한 cis 엘리먼트이다. 상기 게놈의 초기 (E) 및 후기 (L) 영역은 바이러스 DNA 복제의 개시에 의해 분할되는 상이한 전사 단위를 함유한다. E1 영역 (E1A 및 E1B)은 바이러스 게놈 및 수 개의 세포 유전자의 전사의 조절을 담당하는 단백질을 엔코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)의 발현은 바이러스 DNA 복제를 위한 단백질의 합성을 일으킨다. 이러한 단백질은 DNA 복제, 후기 유전자 발현 및 숙주 세포 셧오프(shut-off)에 관여한다. 대부분의 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 후기 유전자의 생성물은 주요 후기 프로모터 (MLP)에 의해 유래되는 하나의 주요 전사체의 현저한 프로세싱 후에만 발현된다. MLP (16.8 m.u.에 위치함)는 감염의 후기 동안 특히 효과적이며, 이러한 프로모터로부터 유래된 모든 mRNA는 번역을 위해 바람직한 mRNA가 되게 하는 5'-트리파타이트 리더(tripartite leader) (TPL) 서열을 지닌다.
현재의 시스템에서, 재조합 아데노바이러스는 셔틀 벡터와 프로바이러스 벡터 간의 상동 재조합으로부터 생성된다. 2개의 프로바이러스 벡터 간의 가능한 재조합으로 인해, 야생형 아데노바이러스가 이러한 프로세스로부터 생성될 수 있다. 따라서, 개별적 플라크로부터 바이러스의 단일 클론을 분리하고, 이의 게놈 구조를 조사하는 것이 중요하다.
복제 결함이 있는 현재의 아데노바이러스 벡터의 생성 및 증식은 Ad5 DNA 단편에 의해 인간 배아 신장 세포로부터 형질전환되었고 E1 단백질을 항시적으로 발현하는 293이라 명명되는 독특한 헬퍼 세포주에 의존한다. E3 영역이 아데노바이러스 게놈으로부터 없어도 되기 때문에, 현재의 아데노바이러스 벡터는 293 세포의 도움으로 E1, E3 또는 둘 모두의 영역에서 외래 DNA를 함유한다. 자연 상태에서, 아데노바이러스는 약 105%의 야생형 게놈을 패키징하여 여분의 약 2 kb의 DNA에 대한 용량을 제공할 수 있다. E1 및 E3 영역에서 대체될 수 있는 약 5.5 kb의 DNA와 조합되는 경우, 현재의 아데노바이러스 벡터의 최대 용량은 7.5 kb 이하이거나 벡터의 전장의 약 15%이다. 아데노바이러스 게놈의 80%가 넘는 부분이 벡터 백본에 존재하며, 이는 벡터로 인한 세포독성의 공급원이다. 또한, E1 결실된 바이러스의 복제결함은 불완전하다. 예를 들어, 바이러스 유전자 발현의 누손(leakage)이 높은 감염다중도 (MOI)로 현재 이용가능한 벡터와 관련하여 관찰되었다.
헬퍼 세포주는 인간 세포, 예를 들어 인간 배아 신장 세포, 근육 세포, 조혈 세포 또는 그 밖의 인간 배아 중간엽 또는 내피 세포로부터 유래될 수 있다. 또한, 헬퍼 세포는 인간 아데노바이러스의 복제를 허용되는 그 밖의 포유동물 종의 세포로부터 유래될 수 있다. 이러한 세포는 예를 들어 Vero 세포 또는 그 밖의 원숭이 배아 중간엽 또는 내피 세포를 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, 바람직한 헬퍼 세포주는 293이다.
293 세포를 배양하고 아데노바이러스를 증식시키는 방법은 100 내지 200 ml의 배지를 함유하는 1 리터 들이 실리콘처리된 회전 플라스크 (Techne, Cambridge, UK)내로 개개의 세포를 접종시킴으로써 천연 세포 응집물을 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 40 rpm에서 교반한 후, 세포 생존성을 트립판 블루를 사용하여 평가한다. 또 다른 포맷(format)에서, Fibra-Cel 미세담체 (Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 g/l)를 다음과 같이 사용한다. 5 ml의 배지에 재현탁된 세포 접종물을 250 ml 들이 엘렌마이어 플라스크내의 담체 (50 ml)에 첨가하고, 1 내지 4시간 동안 때때로 교반하며 정지 상태로 유지시킨다. 그 후, 배지를 50 ml의 신선한 배지로 교체하고, 진탕을 개시한다. 바이러스 생성을 위해, 세포를 약 80% 컨플루언스(confluence)로 성장하게 한 후, 배지를 (25%의 최종 부피로) 교체하고, 아데노바이러스를 0.05의 MOI로 첨가한다. 배양물을 밤새 정지 상태로 유지시킨 후, 부피를 100%로 증가시키고, 진탕을 추가 72시간 동안 수행하였다.
아데노바이러스 벡터가 복제결함성이거나 적어도 조건적으로 결함성이어야 한다는 요건 이외에 아데노바이러스 벡터의 특성은 본 발명의 성공적인 실시에 중요한 것으로 믿어지지 않는다. 아데노바이러스는 42개의 상이한 공지된 혈청형 또는 서브그룹 A 내지 F 중 어느 하나일 수 있다. 서브그룹 C의 아데노바이러스 5형이 본 발명에서 사용되는 조건적 복제결함 아데노바이러스 벡터를 수득하기 위한 바람직한 출발 물질이다. 이는 아데노바이러스 5형이 상당량의 생화학적 및 유전적 정보가 공지된 인간 아데노바이러스이고, 이것이 아데노바이러스를 벡터로서 사용하는 대부분의 구성물을 위해 역사적으로 사용되어 왔기 때문이다.
아데노바이러스는 성장시키고 조작하기가 용이하고, 시험관내 및 생체내에서 넓은 숙주 범위를 나타낸다. 이러한 바이러스의 군은 높은 역가, 예를 들어 ml 당 109 내지 1011개의 플라크 형성 단위로 수득될 수 있고, 고도로 감염성이다. 아데노바이러스의 생활 주기는 숙주 세포 게놈내로의 통합을 필요로 하지 않는다. 아데노바이러스 벡터에 의해 전달되는 외래 유전자는 에피솜과 관련되므로 숙주 세포에 대해 낮은 유전독성을 지닌다. 야생형 아데노바이러스에 의한 백신접종의 연구에서 부작용은 보고되지 않았는데, 이는 생체내 유전자 전달 벡터로서의 이의 안전성 및 치료 잠재성을 입증해준다.
아데노바이러스 벡터는 진핵생물 유전자 발현 및 백신 개발에서 사용되어 왔다. 최근, 동물 연구는 재조합 아데노바이러스가 유전자 요법을 위해 사용될 수 있음을 제시하였다 (Stratford-Perricaudet and Perricaudet, (1991) In: Human Gene Transfer, Eds, O. Cohen-Haguenauer and M. Boiron, Editions John Libbey Eurotext, France, pp. 51-61 ; Stratford-Perricaudet et al. (1990) Hum. Gene Ther., 1:241-256; and Rich et al. (1993) Hum. Gene Ther., 4:461-476). 재조합아데노바이러스를 상이한 조직에 투여하는 연구는 기관 점적주입(trachea instillation), 근육 주사, 말초 정맥내 주사 및 뇌내로의 정위 접종(stereotactic inoculation)을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 아데노바이러스 5형 (Ad5)을 기반으로 한 유효량의 복제결함 재조합 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다. 약 1x108 내지 1x1010 pfu/kg 체중, 바람직하게는 약 5x108 내지 5xlO9, 가장 바람직하게는 약 8.46xlO8 내지 2.21x1O9 pfu/kg 체중의 투여량 수준이 본원에 기재된 방법에서 부스트 면역화 양식으로서 유용하다. 단일 투여형을 생성시키도록 담체 물질과 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료하려는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 백신의 투여량은 질병 상태, 연령, 성별 및 개체의 체중, 및 개체에서 요망되는 반응을 유도시키는 항체의 능력과 같은 인자들에 따라 달라질 수 있다. 투여 계획은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 수 개의 분할된 투여량이 매일 투여될 수 있거나, 치료 상황의 급변에 의해 지시되는 바와 같이 투여량이 비례적으로 감소될 수 있다. 백신의 투여량은 또한 상황에 따라 최적의 예방적 투여량 반응을 제공하도록 변화될 수 있다.
E. 키트
본 발명은 키트, 예를 들어 렌티바이러스 감염을 예방하거나 치료하기 위한 키트를 제공한다. 예를 들어, 키트는 상기 기재된 하나 이상의 약제 조성물 및 임의로 상기 약제 조성물의 사용 설명서를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 약제 조성물 및 그러한 조성물의 투여를 달성하기 위한 하나 이상의 장치를 포함하는 키트를 제공한다.
키트 성분은 상기 방법의 수동적 실시 또는 상기 방법의 부분 자동화되거나 완전 자동화된 실시를 위해 패키징될 수 있다. 키트와 관련된 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 조성물 및 임의로 상기 조성물의 사용 설명서를 포함하는 키트를 고려한다. 이러한 키트는 예를 들어 영상화, 진단, 치료 및 다른 적용례를 포함하는 다양한 용도를 지닐 수 있다.
실시예
본 발명은 어떠한 식으로든 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 본원 전반에 걸쳐 인용된 논문, 허여된 특허, 공개 또는 비공개 특허 출원를 포함하는 모든 참고 문헌의 내용은 본원에 명백히 참조로 포함된다. 본 발명의 실시는 달리 언급되지 않는 한 당 분야의 기술에 속하는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자이식 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술은 문헌에 상세히 설명되어 있다 (참조: Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Patent No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); , VoIs. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
실시예 1: 고역가 복제를 할 수 있는 유전적으로 변형된 약독된 HIV-1
HIV의 경우, 독성의 약독화가 통상적으로 바이러스 복제의 감소를 초래한다는 점을 고려해 볼 때 과학자들로 하여금 비활성화를 위해 대량의 바이러스를 안전하게 생성시킬 수 없게 하는 것을 포함하는 다수의 방해물이 백신으로서 전사멸되거나 비활성화된 바이러스를 개발하지 못하게 하였다. 이러한 문제를 극복하는 본 발명의 방법은 고역가 복제를 할 수 있는 비세포독성이고 비병원성인 HIV-1를 구성하는 것이고, 이는 2개의 바이러스 단백질인 Nef 및 Env의 변형을 기초로 한다.
HIV-1의 nef 유전자는 크기가 25 내지 27 kDa인 210개 내지 250개 아미노산 단백질을 엔코딩한다. CD4 및 MHC 클래스 I 분자와 같은 세포 표면 단백질의 하향조절을 포함하는 다수의 기능이 Nef에 기인한 것이다. 생각컨대, 세포 표면상에서의 이용가능한 CD4 분자의 감소는 세포의 중복감염(superinfection)을 예방하는 역할을 하고, MHC I 복합체의 제거는 바이러스 면역 회피 전략 중 하나를 나타낸다. 또한, Nef는 바이러스 감염력에서 중요한 역할을 하고, 단백질 키나아제와의 상호작용을 통해 숙주 세포 신호 전달 경로를 또한 조절하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, Nef로 인한 가장 중요한 역할은 이것이 이러한 유전적으로 변형된 바이러스의 구성과 관련된 경우 HIV-1 병원성에서 이의 역할이다. 수 가지 계열의 증거는 HIV 및 그 밖의 영장류 렌티바이러스의 Nef 단백질이 바이러스 병인론에 결정적임을 나타낸다. 관련 바이러스인 SIV의 경우, nef 결실된 균주가 비병원성일 뿐만 아니라 이러한 바이러스에 의한 감염이 후속 야생형 바이러스 공격에 대한 방어를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 인간 HIV-1 감염의 중증 복합 면역결핍 마우스 모델 (SCID-hu)에서의 실험은 Nef가 효과적인 생체내 병원성을 위해 필요함을 밝혀주었다. 그러나, 이러한 리포트 보다 더욱 강력한 것은 HIV-의 nef 결함 균주로 감염된 장기간의 비진행성 AIDS 환자를 확인한 것이었다. 이러한 사람들은 HIV-1로 감염되어 있지만 진성(full-blown) AIDS로 진행하지 않고 (또는 매우 장기간에 걸쳐 그렇게 진행함), 유전적 분석은 감염 바이러스에서의 유일한 현저한 변화는 nef 유전자의 붕괴임을 나타낸다. 종합해 볼 때, 이러한 증거는 nef 유전자의 표적화된 결실을 함유하는 HIV-1 균주가 비병원성이거나 매우 약독된 표현형을 나타냄을 제시한다.
env 유전자는 본 발명의 유전적으로 변형된 HIV-1의 구성과 관련하여 관심있는 나머지 유전자, 더욱 상세하게는 Env 당단백질의 신호 서열이다. Env 단백질은 본래 약 850개 아미노산으로 구성된 대량으로 당화된 160 kDa 전구체로서 합성된다. 후속하여 이러한 폴리프로테인(polyprotein)은 숙주 엔도펩티다아제에 의해 표면 당단백질인 gp120 및 트랜스멤브레인 단백질인 gp41로 절단되며, 이들 단백질은 각각 세포 부착 및 바이러스 진입을 담당한다. Env 단백질의 한 가지 비정상적 특징은 이의 비정상적 신호 서열이다. 모든 신호 서열은 본질적으로 동일한 일반적 경로를 따라 만들어진다. 즉, 이러한 서열은 양하전된 N-말단 영역, 중심 소수성 영역 및 절단 부위를 형성하는 극성 C-말단 영역을 지닌다. 그러나, HIV-1 Env 단백질 천연 신호 서열 (EnvNSS)은 비정상적으로 긴 소수성 도메인 및 고도로 양하전된 N-말단을 함유한다. 앞서, 본 발명자들은 EnvNSS를 꿀벌 멜리틴의 서열 (EnvMSS)로 대체하면 증가된 Env 단백질 발현 및 분비, 분자 샤퍼론 칼넥신(chaperone calnexin)으로부터의 신속한 해리 및 효과적인 신호 서열 절단이 일어남을 밝혀내었다. 또한, 본 발명자들은 EnvNSS가 대체된 경우 당단백질 폴딩 및 세포내 수송의 가속된 반응속도론을 관찰하였다. 그러나, 더욱 중요한 것은 EnvNSS의 존재가 세포 아폽토시스 및 괴사 둘 모두를 초래한다는 발견이다. 천연 신호 서열로부터 발현된 재조합 gp120이 세포를 신속히 치사시키고, 멜리틴 신호 서열에 의한 대체가 이러한 효과를 폐지시키는 것으로 밝혀졌다. 전반적으로, 이러한 데이터는 HIV-1 EnvNSS가 또 다른 보다 효과적인 비세포독성인 신호 서열 (예를 들어 꿀벌 멜리틴의 신호 서열)로 대체되면 비세포독성 표현형을 지니고 향상된 복제 능력을 나타내는 HIV-1가 생성될 것임을 제시한다.
종합해보면, nef 유전자의 표적화된 결실을, EnvNSS를 꿀벌 멜리틴의 서열로 대체하는 것과 복합되면 감소된 병원성을 지니며 감염된 세포에서 신속한 고역가 복제를 할 수 있는 상태로 유지되는 바이러스를 생성시킬 수 있다. 이를 위해, 본 발명자들의 실험실은 고도로 연구되고 잘 특성화된 프로바이러스인 pNL4-3에서 이러한 변이가 복합된 유전적으로 변형된 HIV-1를 최초로 구성하였다. HIV-1NL4-3은 T 세포 향성 및 강력한 다핵체(syncitium) 유도 능력을 나타내는 실험실 적응된 서브타입 B 바이러스이다 (도 1B). pNL4-3 프로바이러스는 유전적 변형을 위해 적합한 NIH AIDS 리서치 앤드 레퍼런스 리에이전트(Research and Reference Reagent) 프로그램을 통해 입수가능한 HIV-1NL4-3 균주의 감염성 분자 클론이다.
이러한 프로바이러스를 사용하여 본 발명자들은 바이러스 병원성을 감소시키기 위해 nef 유전자의 표적화된 결실을 최초로 구성하였다 (도 1A). 바이러스 복제에 결정적인 HIV 긴 말단 반복부 (LTR)의 업스트림이 아닌 Nef 개시 코돈의 다운스트림에 있는 206개의 누클레오티드의 제거를 초래하는 제한 효소 분해에 의해 결실이 이루어졌다. 이러한 결실은 Nef 기능에 중요한 수 개의 내부 영역을 제거할 뿐만 아니라 단백질을 심각하게 트렁케이팅시키는 일련의 조기(premature) 정지 코돈을 유도한다. 최종 결과는 단지 18개의 아미노산의 코딩 영역이며, 이러한 코딩 영역은 숙주 세포에 의해 신속하게 분해되는 비작용성 단백질을 생성시키는 것으로 본 발명자들은 믿고 있는데, 이는 본 발명자들이 웨스턴 블롯 분석에 의해 상기 단백질의 존재를 검출할 수 없기 때문이다.
프로바이러스의 두 번째 변형은 세포독성을 감소시키고 바이러스 복제의 효율을 증가시키기 위해 EnvNSS를 꿀벌 멜리틴으로 대체하는 것이었다. 상기 언급된 바와 같이, HIV-1은 비정상적으로 길고 고도로 양하전된 신호 서열을 함유한다. pNL4-3 EnvNSS는 길이가 28개 아미노산이고, 5개의 양하전된 아미노산을 함유한다 (도 1C). PCR 및 분자 클로닝 기술을 이용하여, 이러한 신호 서열은 길이가 21개 아미노산이고 단지 하나의 양하전된 아미노산을 함유하는 고도로 효과적인 꿀벌 멜리틴 신호 서열로 대체되었다. EnvNSS가 위치하는 HIV-1 env 유전자의 N-말단이 바이러스 게놈에서 HIV-1 vpu 유전자의 C-말단과 중첩된다는 것을 주목하는 것이 중요하다 (도 1A). 다행스럽게도, HIV-1 vpu 유전자는 바이러스 감염력에서 역할을 하지만 바이러스 복제를 위해서는 없어도 되는 것으로 밝혀졌고, 인식되는 바와 같이 바이러스의 증식을 제한하지 않는다.
구성된 경우, 야생형 (NL4-3 W) 및 유전적으로 변형된 (NL4-3 T) 바이러스 둘 모두는 HIV-1 복제를 지탱해주는 감수성 T-세포주 A3.01 및 H9내로 프로바이러스 DNA를 트랜스펙션시킴으로써 회수되었다. 감수성 세포내로 트랜스펙션된 경우, 프로바이러스 DNA 클론은 즉시 이들의 엔코딩된 HIV-1 유전자 생성물을 발현하기 시작하여, 수거되어 후속 실험에서 사용될 수 있는 자손 바이러스 입자를 생성시킨다. 감염성 분자 클론의 트랜스펙션 후, 세포를 배양하고 2일째 마다 분할하고, 바이러스 복제를 모니터링하기 위해 트랜스펙션 후 4일째에서 출발하여 배양 상층액의 샘플을 수거하여 p24 ELISA에 의해 분석하였다. 이러한 실험은 감염된 세포에 의해 배양 상층액내로 방출된 p24 항원의 양을 측정한다. 이는 HIV-1 복제의 수준을 간접적으로 측정하기 위한 널리 인정된 검정이다. A3.01 및 H9 세포 둘 모두의 경우, 유전적으로 변형된 N4-3 T 바이러스는 야생형 HIV-1과 동일하거나 이 보다 높은 역가로 복제되었고, 주목할 만하게 가속된 반응속도론과 관련해서도 그러하였는데, NL4-3 T에서 바이러스 복제의 피크는 야생형 NL4-3 W에서 보다 48시간 빠른 트랜스펙션 후 96시간째에 도달하였다 (도 2).
이러한 바이러스를 추가로 특성화하기 위해, 샘플을 또한 갈락토시다아제 지표의 다중핵 활성제(multi-nuclear activator of a galactosidase indicator, MAGI) 검정에 의해 또한 분석하였는데, 이러한 검정은 바이러스 감염력을 평가한다. 이러한 시스템에서, 세포 표면상에서 CD4 (바이러스 수용체)를 발현하는 HeLa 기반 세포주가 바이러스의 다양한 희석액으로 감염된다. 세포 내부에 존재하는 경우, 복제성 바이러스는 바이러스 트랜스액티베이터(transactivator) 단백질인 Tat를 포함하는 바이러스 단백질을 생성시키기 시작할 것이다. Tat은 후속하여 세포 게놈내로 도입된 바이러스 LTR 프로모터에 의해 유도된 B-갈락토시다아제 유전자의 발현을 활성화시킨다. 그 후, 감염된 세포내에서 생성된 B-갈락토시다아제 효소는 세포에 공급되는 기질 X-gal을 절단하기 시작하여, 청색을 발생시킨다. 따라서, 청색 세포가 "감염된" 것으로서 계수되고, 바이러스의 희석율에 대해 청색 세포의 수를 계산함으로써 존재하는 감염성 바이러스 입자의 전체 개수가 결정될 수 있다. 이러한 실험의 결과는 고역가로 신속히 복제하는 능력에도 불구하고 NL4-3 T 바이러스가 야생형 보다 10배 내지 50배 덜 감염성으로 됨을 나타내었다 (도 2 삽입그림). 이러한 결과는 유전적 변형을 통해 고역가 복제를 할 수 있는 약독된 HIV-1 균주를 생성시키는 것이 실제로 가능함을 확인해준다.
이러한 결과를 추가로 뒷받침하고 이러한 현상이 본 발명자들이 선택한 균주 (NL4-3)에만이 아닌 HIV-1 생물학에 일반적인 것임을 확인하기 위해, 유사한 구성물이 89.6, CM235-4 및 94UG114.1.6를 포함하는 수 개의 다른 HIV-1 균주에서 생성되었다 (도 1B 및 C). 이는 다양한 HIV-1 서브타입을 나타낼 뿐만 아니라 다핵체 유도, 분리원 및 세포 향성에서의 변화를 나타낸다. 간단히 말하면, 회수된 모든 바이러스는 NL4-3와 유사하게 거동하는데, nef 결실 및 EnvNSS 대체가 복합된 유전적으로 변형된 바이러스는 강력하게 감소된 감염력을 나타냄에도 불구하고 이의 야생형 대응물 보다 효율적으로 복제된다. 예를 들어, HIV89.6은 HIV-1의 서브타입 B이고 다핵체 유도성인 2중 향성 분리물이다. 변종 89.6 T 바이러스는 감수성 A3.01 세포내로 트랜스펙션된 경우 야생형 바이러스 보다 훨씬 효율적으로 복제되는데, 1000 ng/ml p24를 넘어서 피크에 이르는 반면 (실험실 적응된 NL4-3 균주와 필적함) 야생형 바이러스는 변형된 바이러스 보다 10배 더 감염성임에도 불구하고 600 ng/ml p24 미만에서 피크에 도달하였다. 이러한 결과는 HIV-1 nef 유전자 결실과 Env 신호 서열 대체가 복합되면 강력하게 약독된 감염력을 지닌 효율적으로 복제하는 HIV-1이 생성된다는 본 발명자들의 가설을 확인해준다. 다수의 HIV-1 서브타입으로부터 변형된 바이러스의 이러한 유형을 구성할 수 있는 능력이 중요한데, 이는 현재 세계에 존재하는 증가하는 수의 HIV 균주에 대한 방어를 제공하기 위해 단일 백신 제형으로 다수의 HIV-1 서브타입을 조합시키는 것이 필요할 수 있기 때문이다.
실시예 2: 복제결함 재조합 아데노바이러스 및 VLP
아데노바이러스 벡터는 백신 벡터로서 흥미를 끌게 하는 수 가지 특성을 지닌다. 이러한 벡터는 복제허용 세포주에서 고역가로 신속하게 복제되고, 대량의 관심있는 단백질을 생성시킬 수 있다. 이러한 벡터는 분열 세포 및 비분열 세포 둘 모두를 감염시킬 수 있고, 특성상 에피솜과 관련되므로, 숙주 게놈내로 통합되지 않는다 (이는 형질전환의 위험 및 잠재적 종양유전자 효과를 최소화시킨다). 이러한 벡터는 점막, 위장관을 포함하는 다수의 부위에 그리고 비경구적으로 기관 또는 조직에 외래 유전자를 표적화시킴으로써 점막 및 전신 면역 둘 모두를 유도할 수 있다. 또한, 약독되지 않은 완전히 복제능력있는 형태의 보다 병원성인 아데노바이러스 4형 및 7형의 장 코팅된 캡슐을 이용하는 군용 및 민간용 백신접종 프로그램은 Ad 백신 벡터의 안전성을 이미 확립하였다. 그러나, 이러한 연구에서 사용되는 것들을 포함하는 현세대의 아데노바이러스 벡터가 단지 단일 라운드(single-round) 복제를 할 수 있는 복제결함 바이러스가 되도록 공학처리되었음을 주목하는 것이 중요하다.
본 발명의 시스템은 아데노바이러스 5형 (Ad5) 게놈을 기반으로 한 복제결함 재조합 아데노바이러스 벡터를 사용한다. 즉, Ad5 게놈으로 구성된 백본 벡터는 바이러스 복제를 위해 필요한 아데노바이러스 E1A 유전자의 결실을 함유한다. 본 발명의 표적 HIV-1 유전자 (하기 기재되어 있고 도 3에 도시되어 있음)가 삽입된 부위는 이러한 결실된 유전자 영역에 존재한다. 이러한 재조합 바이러스는 트랜스로 E1A 단백질을 제공하는 복제허용 세포주 (예를 들어, 293 세포)에서 시험관내에서 고역가로 증식될 수 있지만, 생산 세포주 외부에서는 단일 주기를 넘어서 복제될 수 없다 (이는 생체내에서 백신접종된 숙주에서 아데노바이러스 벡터가 세포내로 진입하여 요망되는 단백질을 생성할 수 있지만 자손 아데노바이러스 입자를 생성시키지 않다는 것을 의미함). 이는 rAd 시스템에 대한 안전성 및 제어의 추가적 척도를 제공한다.
이러한 연구에 사용하기 위해, 본 발명자들의 실험실은 전체 5개의 복제결함 rAd 벡터를 생성하였다. 각각의 벡터는 HIV-1 또는 HIV-2의 gag 유전자가 삽입된 E1A 결실된 Ad5 백본 및 바이러스의 상이한 영역으로부터 선택된 일련의 HIV-1 특이적 중화 또는 T-세포 에피토프로 구성된다 (도 3).
HIV-1의 gag 유전자는 전형적으로 55 kDa 폴리프로테인을 생성시키는데, 후속하여 이는 이러한 영역에서 또한 엔코딩되는 바이러스 프로테아제에 의해 바이러스 캡시드 (p24), 매트릭스 (p17) 및 p6/9 구조 단백질로 절단된다. 그러나, 본 발명자들의 실험실은 바이러스 프로테아제를 엔코딩하는 gag의 영역의 결실 및 rAd 벡터로부터의 이의 후속 발현이 rAd 감염된 세포에서 바이러스 유사 입자 (VLP)의 형성을 가능하게 함을 발견하였다. 따라서, 트렁케이팅된 HIV gag 유전자 (rAd-Gag)를 함유하는 복제결함 rAd 입자로 감염된 경우, Gag 단백질이 생성될 뿐만 아니라 이는 아데노바이러스 벡터에 의한 임의의 바이러스 복제의 결여에도 불구하고 감염된 세포로부터 후속하여 분비되는 비리온 유사 구조로 자체 조립될 수 있다. 또한, 선택된 HIV 에피토프가 혼입되어 이러한 결실된 영역내로 융합될 수 있는데 (rAd-Gag-폴리에피토프), 이는 숙주 세포에서 발현되는 경우 HIV Gag 에피토프를 지닐 뿐만 아니라 선택된 중화 또는 T-세포 에피토프를 지니는 VLP를 생성시킨다. 이러한 주기, 즉, 감염- 단백질 생성 - VLP 형성 - 방출은 이러한 백신접종 유형의 면역원성의 중요한 일면을 나타낸다.
전형적으로, 항원이 숙주 세포내에서 내부적으로 발현되는 경우 (예를 들어, rAd 벡터로부터), 이는 세포에 의해 프로세싱되고 1형 또는 세포 매개된 세포독성 T-림프구 (CTL) 반응을 유도하는 데에 관여하는 주요 조직적합성 클래스 I (MHC I) 시스템을 통해 면역계에 제공된다. 이러한 유형의 반응은 HIV 감염의 초기 단계의 제어에 불가결한 것으로 제안되었는데, 이는 이것이 감염된 세포의 제거를 초래하기 때문이다. 반대로, 숙주 세포가 외인적으로 항원을 수용하는 경우 (예를 들어, VLP의 형태로), 이는 세포에 의해 프로세싱되어, 2형 또는 항체 매개된 체액성 반응을 유도하는 데에 관여하는 MHC II 시스템을 통해 면역계에 제공된다. 이러한 유형의 반응은 세포의 최초 HIV 감염을 예방하기 위한 중화 항체의 생성 뿐만 아니라 제거를 위한 바이러스 입자의 항체 매개된 표적화에 중요하다. 따라서, rAd 시스템은 세포성 면역 뿐만 아니라 체액성 면역을 생성시키는 능력을 지니며, 이러한 능력 둘 모두는 HIV-1 감염에 대한 방어 면역 반응의 생성에서 중요한 역할을 하는 것으로 예측된다.
이러한 실험을 위해 생성된 복제결함 rAd 벡터의 패널은 2개의 범주로 나뉠 수 있는데, 하나는 HIV-1 중화 에피토프를 함유하는 것들이고, 나머지 하나는 HIV-1 CTL 에피토프를 함유하는 것들이다. rAd 벡터 1, 2 및 3은 다수의 HIV-1 서브타입으로부터의 gp120 가변 영역 3 및 불변 영역 3 둘 모두로부터의 중화 에피토프와 융합된 HIV-2 gag 유전자 (체액성 반응을 향상시키도록 설계됨)를 함유한다. 또한, rAd 벡터 3는 바이러스 융합 단백질인 gp41의 보존된 중화 에피토프 (CNE)를 함유한다. rAd 벡터 4 및 5는 Tat, Rev, Nef, 바이러스 역전사효소 (RT) 및 gp120 당단백질을 포함하는 수 개의 바이러스 단백질로부터 선택된 서브타입 B HIVHXB2 바이러스의 T-세포 에피토프와 융합된 HIV-1 gag 유전자 (세포성 면역 반응을 향상시키도록 설계됨)를 함유한다. dsDNA 플라스미드로서 최초로 구성된 이러한 복제결함 rAd 벡터는 감염성 rAd 입자를 회수하기 위해 아데노바이러스 복제에 필요한 E1A 유전자를 공급하는 헬퍼 293 세포내로 트랜스펙션되었다. 그 후, HIV-1 Gag-폴리에피토프 융합 단백질의 발현을 확인하기 위해 회수된 바이러스를 DNA 시퀀싱 및 단백질 발현 분석에 의해 스크리닝하였다. 이러한 선택된 면역우세 에피토프를 광범위한 HIV-1 서브타입 뿐만 아니라 바이러스 단백질 표적도 아우르는 rAd 벡터내로 통합시킴으로써, 본 발명자들은 단지 하나가 아닌 다수의 HIV 균주에 대한 면역 반응을 유도하는 백신의 능력을 최적화시켰다. 또 다시 이것은 하나의 감염된 개체내에서도 수 가지 종으로서 존재할 수 있는 바이러스에 대해 방어를 제공해야 하는 백신에 대한 중요한 고려사항이다.
실시예 3: 백신접종 전략
본 실시예에서 수행된 전체 백신접종 전략은 2배 프라임-부스트 방법이다. 프라임-부스트 시스템에서, 숙주가 먼저 한 가지 유형의 항원/벡터에 노출된 후 또 다른 유형에 노출된다 (예를 들어, 본 발명의 시스템에서는 비활성화된 전사멸된 바이러스 및 복제결함 rAd). 이러한 유형의 방법은 상이한 바이러스 에피토프를 사용하여 면역계를 공격할 뿐만 아니라 그렇게 하기 위해 상이한 경로 및 제공 방법을 이용한다. 이는 보다 확고한 면역을 초래하여 면역계의 체액성 및 세포성 병기(arms) 둘 모두의 반응을 증폭시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, 투여 경로에 따라, 점막 면역이 또한 발생할 수 있다. 효과적인 애쥬번트와 병용되는 경우, 프라임-부스트 방법은 이의 성분 항원/벡터 단독을 사용한 반복 백신접종을 통해 수득된 면역 반응 보다 훨씬 강력하고 광범위한 면역 반응을 자극할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
실시예 4: 백신 제형화
본 실시예에 기재된 실험에 있어서, 본 발명의 프라임-부스트 전략을 위한 2가지 성분은 1) 비활성화된 전사멸된 바이러스 항원 및 2) 복제결함 rAd 벡터를 포함한다.
본 발명의 비활성화된 전사멸된 바이러스 항원을 제조하기 위해, 본 발명의 유전적으로 변형된 HIV-1 NL4-3 T 바이러스를 사용하여 A3.01 세포 (인간 T-세포주)를 감염시켰다. 바이러스를 고역가로 성장시켜서, 배양물을 증식시키고 2일째 마다 배지를 교체하였다. 감염 후 8일째에서 시작하여, 바이러스 함유 상층액을 수거하고, 신선한 배지 및 감염되지 않는 A3.01 세포를 감염된 세포 배양물에 첨가하여 바이러스 생성을 지속하고 유지시켰다. 이를 모든 배양 상층액이 풀링(pooling)되는 시점인 감염 후 16일째까지 48시간 마다 지속하였다. 700xg에서 10분간 원심분리함으로써 바이러스 함유 상층액으로부터 세포 잔해물을 1회 정화시킨 후, 0.45 μm 필터를 통과시킴으로써 정화시켰다. 그 후, 이러한 정화된 상층액을 초원심분리하여 바이러스를 펠릿화시키고 농축시켰다. 이제는 바이러스를 비함유하는 상층액을 분리하고, 펠릿을 화학제인 알드리티올-2 (AT-2)이 1000 μM의 최종 농도로 첨가된 적은 소부피의 PBS에 재현탁시켰다. AT-2 처리는 확고한 레트로바이러스 비활성화 방법인 것으로 밝혀졌다. 이는 배위된 아연의 방출 및 감염력의 상실을 초래하는 바이러스 누클레오캡시드 단백질의 아연-핑거(zinc-finger) 도메인을 변형시킴으로써 작용한다 (바이러스는 세포와 결합하여 세포내로 진입할 수 있지만, 역전사 프로세스를 시작할 수는 없다). 열 노출 또는 포르말린 처리와 같은 다른 비활성화 방법과는 달리, AT-2 비활성화는 이와 관련하여 바이러스 당단백질의 구조 및 형태에 대해 부정적인 효과를 나타내지 않는 부가된 이점을 지니는데, 상기 당단백질은 완전히 무손상된 상태로 유지된다. 이러한 이유로 그리고 레트로바이러스에 대한 선택된 비활성화 방법으로서 AT-2를 확립하는 데에 있어서 지속적인 노력 및 평가로, 상기 화합물이 이를 위해 본 발명자들의 실험에서 선택되었다. AT-2 처리된 바이러스 스톡(stock)을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켜서 완전한 바이러스 비활성화를 가능하게 하였다. 그 후, 바이러스를 20% 수크로오스 쿠션상에 적층시키고, 다시 초원심분리하여, 바이러스를 추가로 농축시키고 이를 잔류 단백질 및 화학적 오염물 (예를 들어, AT-2)로부터 분리하였다. 바이러스를 500 μl 분취액에서 1 mg/ml의 최종 농도로 재현탁시키고, 백신접종 프로토콜에서 사용할 준비가 될 때까지 -80℃의 온도에서 저장하였다 (따라서, 각각의 분취액은 500ul PBS 중에 500 μg의 전체 바이러스 단백질을 함유하였음). 비활성화된 바이러스 스톡의 수 개의 분취액을 취하고 MAGI 검정에 의해 시험하여 임의의 잔류 감염력이 남아있는 지를 결정하였다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 시험된 각각의 샘플에서, 바이러스 감염력은 완전히 제거되었고, 오염시키는 감염성 바이러스의 징후는 없었다.
본 발명의 복제결함 rAd 바이러스 스톡을 제조하기 위해, 5개의 벡터 각각을 사용하여 복제허용 293 세포 배양물을 감염시키고, 고역가로 성장시켰다. 감염된 세포를 수거하고, 용해시키고, CsCl 구배를 통한 초원심분리에 의해 밴딩(banding)함으로써 바이러스 입자를 정제하였다. 바이러스 밴드를 분리하고, PBS2+와 10% 글리세롤에 대한 광범위한 투석에 의해 잔류 CsCl를 분리하였다. 그 후, 이러한 스톡 바이러스를 역가측정하고, 1x1010개의 감염성 입자/ml의 최종 농도로 재현탁시켰다. 이로부터, 500 μl 분취액을 제조하였는데, 이는 각각 5개의 바이러스 스톡 각각으로부터 100 μl 를 함유하였다 (따라서, 각각의 분취액은 10% 글리세롤이 함유된 500 μl PBS2+ 중의 전체 5x109개의 감염성 입자에 대해 5개의 rAd 각각의 1x109개의 감염성 입자를 함유하였다). 그 후, 이러한 분취액을 백신접종 프로토콜에 사용할 준비가 될 때까지 -80℃에서 저장하였다. 복제결함 rAd 입자가 -80℃에서 동결시킨 후 감염성인 상태로 남아있음을 보장하기 위해, 개개의 바이러스 스톡 및 분취된 혼합형 바이러스 현탁액 둘 모두로부터의 샘플을 293 세포를 발현하는 E1A상에서 플라크 검정에 의해 감염성을 시험하였다. 감염성의 상실은 동결된 rAd 스톡 중 어느 것에서도 관찰되지 않았다.
실시예 5: 애쥬번트 선택
백신 제형화의 중요한 부분은 적절한 애쥬번트의 선택이다. 애쥬번트가 반드시 면역 반응 자체를 유도시키는 것은 아니라고 하더라도 이는 공동 투여된 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 작용을 한다. 애쥬번트는 항체 역가를 상승시키거나, CTL 반응을 개선시키거나, 점막 면역을 향상시키는 것과 같은 효과를 나타낼 수 있다. 실제로, 선택된 애쥬번트에 따라, 특정 항원에 대해 생성되는 면역 반응은 상이한 방향으로 진행될 수 있다. 예를 들어, 인간 용도에 대해 최근 허가된 주요 애쥬번트는 명반인데, 이는 면역계를 2형 항체 매개된 반응쪽으로 향하게 한다. 그러나, 본 발명의 목적상, 명반은 비교적 약한 애쥬번트 효과를 제공하며, 항체 반응 단독은 레트로바이러스 감염에 대해 방어적인 것으로 여겨지지 않는다. 통상적인 백신 애쥬번트에 대한 비교적 신규한 대안은 소위 CpG 모티프 또는 면역자극 올리고데옥시누클레오티드 (ODN)을 개발하는 것이다. CpG 모티프는 규정된 서열을 지닌 면역자극성 세균 DNA의 짧은 스트레치(stretch)이다. 이는 표적 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위해 숙주의 고유 면역계를 자극함으로써 작용한다. 명반과 달리, CpG DNA는 항체 매개된 반응의 발생 뿐만 아니라 강력한 CTL 반응 (이는 HIV 감염을 제어하는 데에 있어서 특히 중요한 것으로 믿어짐)을 또한 자극하는 것을 향해 훨씬 강력한 면역학적 반응을 유도시킬 수 있다. CpG 모티프의 다양한 서열의 패널이 비인간 영장류 숙주에서 시험되어 이들의 효능에 대해 최적화되었고, 이들은 시판된다. 붉은털 원숭이를 포함하는 비인간 영장류에서 체액성 및 세포성 면역 반응 둘 모두를 유도해내는 능력으로 인해, 서열 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'의 CpG ODN이 이러한 실험에서 애쥬번트로서 사용하기 위해 선택되었다. 본 실시예에서 사용된 ODN이 숙주 누클레아제에 의해 분해되지 않도록 포스포로티오에이트 백본상에서 합성되었고, 이에 따라 생체내 반감기가 연장되었음이 주목된다.
실시예 6: 백신접종 계획 및 실험 대요
본 백신 연구를 위한 시험 피검체는 데이비스(Davis)에 소재한 유니버시티 오프 캘리포니아(University of California)의 캘리포니아 리져날 프라이메이트 리서치 센터(California Regional Primate Research Center)에 수용된 18마리의 붉은털 원숭이 (Macaca mulatto) 였다.
2가지 유형의 항원을 프라임-부스트 방법 백신접종 전략에서 사용하였는데, 둘 모두의 항원은 숙주 동물내로 투여되기 전에 CpG ODN 애쥬번트와 배합되었다:
AT-2 비활성화된 전사멸된 바이러스 항원: 생성되어 정제되고 AT-2 비활성화된, 유전적으로 변형된 HIV-1 NL4-3 T 바이러스. 면역화를 위해, 지정된 동물에게 500 μl PBS 중에 현탁된 500 μg의 항원을 투여한다 (500 μl의 애쥬번트를 사용하여 제형화됨).
복제결함 재조합 아데노바이러스 항원 (rAd 항원): 다수의 선택된 중화 및 T-세포 에피토프와 회합된 HIV-1 gag 유전자를 발현하는 5개의 rAd 벡터의 고역가 스톡이 제조되고 정제되었다. 면역화를 위해, 지정된 동물에게 전체 500 μl의 부피 중의 각각의 재조합 바이러스 1x109개의 감염 단위 (1x109개의 감염 단위 x 5개의 재조합 바이러스 = 5x109개의 감염 단위)를 투여한다 (500 μl의 애쥬번트를 사용하여 제형화됨).
CpG 올리고데옥시누클레오티드 (ODN) 애쥬번트: 콜리 파마슈티컬즈(Coley pharmaceuticals)로부터 수득된 서열 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'의 정제된 포스포로티오에이트 올리고데옥시누클레오티드. 500 μg의 이러한 ODN을 상기 기재된 각각의 항원과의 제형화를 위해 전체 500 μl 부피의 PBS 중에 현탁시킨다.
도 4에 나타나 있는 바와 같이, 후속하여 동물들을 3개 군으로 나누었는데 (1군, 2군 및 대조군으로 명명됨), 각각의 군은 전체 6마리의 붉은털 원숭이를 함유하였다. 접종 시점, 항원/애쥬번트의 유형 및 양을 포함하는 각각의 동물군에 대한 면역화 계획이 하기 기재되어 있다. 모든 면역화는 근내 투여로 수행되었다.
1군
0주째 - 500 μl 비활성화된 전사멸된 바이러스 항원과 500 μl CpG 애쥬번트
3주째 - 500 μl rAd 항원과 500 μl CpG 애쥬번트
8주째 - 500 μl rAd 항원과 500 μl CpG 애쥬번트
16주째 - 500 μl rAd 항원과 500 μl CpG 애쥬번트
2군
0주째 - 500 μl rAd 항원과 500 μl CpG 애쥬번트
3주째 - 500 μl rAd 항원과 500 μl CpG 애쥬번트
8주째 - 500 μl rAd 항원과 500 μl CpG 애쥬번트
16주째 - 500 μl 비활성화된 전사멸된 바이러스 항원과 500 μl CpG 애쥬번트
대조군
대조군 동물은 HIV 항원 또는 공격용 바이러스에 대한 항원 노출이 없었다.
백신접종 후, 동물들을 공격 일자를 기초로 하여 추가로 세분하였다 (도 4). 12마리의 초기 그룹 (1군, 2군 및 대조군으로부터 각각 4마리 - WOV01으로 명명됨)을 1차 면역화 후 33주째에서 하이브리드 시미안-인간 면역결핍 바이러스 (SHIV)를 사용하여 정맥내 경로로 공격하였다. SHIV 공격은 각각의 바이러스에 대해 100의 조직 배양 감염 투여량 50 (TCID50)에서 투여된 SHIV89.6과 SHIVSF162p4의 복합 감염으로 구성되었다. 나머지 6마리 동물 (1군, 2군 및 대조군으로부터 각각 2마리 - WOV02로 명명됨)을 동일한 복합 SHIV 접종물을 사용하여 1차 면역화 후 39주째에 공격하였다.
군들의 이러한 분리가 동물 33226을 포함시키는 데에 필요하였다. 33주째 공격 전의 의학적 검사에서, 동물 33226은 상승된 CBC 수를 포함하는 붉은털 원숭이 관절염의 일부 임상적 증상을 나타내었다. 백신접종 프로토콜과 무관하다고 하더라도, 상기 상태는 면역학적 결과 및 공격 결과에 영향을 미칠 수 있었다. 담당 수의사와 상의한 후, 이의 상태를 모니터링하기 위해 6주간 상기 동물의 공격을 지연시키기로 결정하였다. 통계적인 이유로, 각각의 군으로부터의 2마리 동물 (2군으로부터의 33226을 포함함)을 남겨두어 이들을 39주째에 공격한 반면, 나머지 동물들은 계획된 대로 33주째에 공격하였다.
백신접종 프로토콜에 대한 면역 반응을 평가하기 위해 혈액 샘플을 면역화 전 및 후 둘 모두의 시점에서 각각의 동물로부터 취하고, 그 후 공격시까지 매달 취하였다. 또한, 바이러스 공격에 대한 면역 반응을 평가할 뿐만 아니라 바이러스 부하 및 잠재적 질병 진행을 모니터링하기 위해, 샘플을 공격 후 1주, 2주 및 5주째에 취하고, 그 후 매달 취하였다. 동물들을 안락사시키고, 공격 후 약 6개월째에 검시를 수행하고, 혈액, 비장 및 액와 림프절을 포함하는 추가의 샘플을 수집하였다.
실시예 7: 동물 건강 및 백신 감내(tolerance)
연구 과정에 걸쳐, 건강 및 안녕을 평가하기 위해 모든 동물을 규칙적으로 모니터링하였다. 이는 전반적 신체 검사 뿐만 아니라 체중의 주기적 측정을 포함하였다. 모든 동물은 백신접종 및 공격을 잘 감내하였는데, 측정가능한 성가신 부작용은 없었다. 도 5 (A 내지 D)에 도시된 바와 같이, 1군 및 2군으로부터의 모든 동물은 0주째, 3주째, 8주째 및 16주째에서의 백신접종에 걸쳐 공격시까지 체중의 일정한 증가를 나타내었다. 공격 후 즉시 2개의 백신접종군내의 일부 동물은 체중의 약간의 감소를 나타내었지만 (0.5 kg 미만), 신속히 회복되었고 검시할 때까지 체중의 일정한 증가를 나타내며 건강한 상태를 계속 유지하였다. 유사하게는, WOVOl (도 5E) 및 WOV02 (도 5F) 하위군 둘 모두에 대한 대조군 동물의 일부가 공격 후 즉시 체중의 약간의 변동을 나타내었지만, 회복되어 검시할 때까지 일정한 체중을 유지하였다.
33주째의 계획된 공격 전에, 1마리의 동물 (33226)이 붉은털 원숭이 관절염으로 통상적으로 일컬어지는 상태의 증상을 나타내는 것으로 확인되었다. 이는 붉은털 원숭이에서 보기 드문 상태가 아니며, 백신접종 프로토콜에 의해 발생하거나 유도된 것으로 간주되지 않아야 한다. 이러한 상태로 인해, 상기 동물을 39주째까지 모니터링하였고, 이 시점에서 담당 수의사와 상의한 결과 연구를 계속하기에 적합한 것으로 간주되었고, 상기 동물을 하위군 WOV02의 5마리의 나머지 잔류 동물과 함께 공격하였다.
모든 동물을 공격 후 약 6개월째에 안락사시키고, 검시를 수행하였다. 동물들은 림프절의 육안(gross) 병변 또는 비대를 나타내지 않았다. 체중 손실 또는 전체 혈구수(complete blood count, CBC) 비정상의 징후는 없었다.
전체적으로, 결과는 1군 및 2군 둘 모두에 대해 계획된 프로토콜이 안전함을 제시하는데, 이는 모든 백신접종이 잘 감내되었고 부정적인 부작용이 관찰되지 않았기 때문이다. 동물들은 실험 과정에 걸쳐 건강하게 존재하였고, 유의할 만한 문제 또는 체중 손실의 징후는 없었다.
실시예 8: 질병 진행의 임상적 징후
사용된 공격용 바이러스 (SHIV89.6 및 SHIVSF162p4) 둘 모두가 비병원성 균주이었지만, 임의의 동물이 임상적 질병 진행의 징후를 나타내는 지를 결정하기 위해 혈중 CD4+ 및 CD8+ 세포의 수준을 측정하고 CD4:CD8 비를 모니터링하였다. 건강한 동물은 정상적으로 1 이상의 CD4:CD8 비를 유지하지만, SIV 또는 SHIV 감염의 결과로써 시미안 AIDS로 진행하는 동물은 CD4+ 세포의 현저한 감소 및 이에 따른 감소된 CD4:CD8 비를 나타낼 수 있다.
1군 (도 6A 내지 6B) 및 2군 (도 6C 내지 6D) 백신접종된 동물 둘 모두의 경우, CD4:CD8 수준은 예상된 바와 같이 비교적 일관되게 유지되었으며, 공격 후 CD4+ 세포의 현저한 감소는 없었다. 유사하게는, 백신접종되지 않은 대조군 동물 (도 6E)은 공격 후 비교적 건강하게 존재하였고, 안정한 CD4:CD8 비를 유지하였다.
실시예 9: 림프구 증식
백신접종 후 T-세포가 HIV-1 특이적 클론 증식에 대해 프라이밍되었는 지의 여부를 결정하기 위해, 림프구 증식 검정을 수행하였다. 샘플을 1군 및 2군 동물 둘 모두 뿐만 아니라 공격 후 대조군에 대해 공격 전 (도 7A) 및 공격 후 (도 7B) 둘 모두의 다양한 시점에서 수집하였다. 세포를 6일간 AT-2 비활성화된 HIV-1MN 바이러스에 의해 자극시키고, CD4+ 림프구의 증식을 방사성표지된 티미딘의 혼입에 의해 측정하였다. 2의 자극 지수 (즉, 자극된 세포 대 비자극된 세포의 증식)을 컷오프 값으로서 설정하였다. 도 6A에 도시된 바와 같이, 1군 및 2군 동물 둘 모두는 백신접종 단계 동안 HIV-1 항원에 대해 현저한 반응을 나타내었다. 최초 비활성화된 바이러스 백신접종에 이어 3회의 재조합 아데노바이러스 부스트를 투여받은 1군 동물은 7/10 시점 (70%)을 통해 신속하고 지속적인 증식 반응을 나타내었다. 또한, 최초 재조합 아데노바이러스 백신접종에 이어 2회의 후속 재조합 아데노바이러스 및 1회의 최종 비활성화된 바이러스 부스트를 투여받은 2군 동물은 또한 10개의 시점 중 4개 (40%)를 통해 강력한 증식 반응을 나타내었고, 이는 특히 3주째, 8주째 및 16주째의 백신접종 시점과 일치한다.
공격 후 (도 7B), 1군 및 2군 동물 모두는 HIV-1 항원에 대해 즉각적이고 장기적인 증식 반응을 나타내었다. 둘 모두의 군은 7/8 (88%) 시점을 통해 양의 자극 지수를 나타내었는데, 1군의 백신접종된 동물이 약간 더 강력한 반응을 나타내었다. 공격 전에 HIV-1 특이적 증식의 징후를 나타내지 않았던 대조군 동물은 SHIV 공격용 바이러스에 노출된 후 1주째에 HIV-1 항원에 대해 다소 약한 반응을 나타내기 시작하였다. 이러한 반응은 공격용 바이러스 자체내에 존재하는 바이러스 에피토프로 인한 것임이 거의 확실하다. 공격 후 17주째에 대조군 동물에서 관찰된 HIV-1 특이적 T-세포 자극의 명백히 높은 수준은 동물 TB 시험과 상호관련되지만 암시적인 것으로 간주되지 않아야 하는데, 이는 모든 대조군 동물이 이 시점에서 상승된 CBC를 나타내었기 때문이다.
결과는 수행된 백신접종 방법이 HIV-1 특이적 T-세포 증식 반응을 유도할 수 있었음을 나타낸다. 시험된 2가지 프로토콜 중에서, 1군 동물은 2군 동물에 비해 보다 강력하고 더욱 장기적인 면역 반응을 나타내는 것으로 여겨졌는데, 이는 비활성화된 바이러스 프라이밍에 이은 재조합 아데노바이러스 부스트가 강력한 면역 반응을 유도하기 위한 보다 효과적인 방법일 수 있음을 제시한다.
실시예 10: 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응
HIV-1 감염을 제어하는 데에 필요한 것으로 믿어지는 면역 반응의 한 가지 일면은 세포 매개성 면역 반응의 일부로서 CD8+ 세포독성 T 림프구 (CTL)의 발생이다. 백신접종된 동물에서 CTL 반응을 평가하기 위해, 인터페론-감마 (IFN-γ) ELISPOT 검정을 수행하였다. HIV-1 Gag 단백질의 보존된 에피토프를 나타내는 20개 (15량체) 펩티드의 푸울(pool)을 사용하여 공격 전 및 공격 후 둘 모두의 시점에서 1군 및 2군 동물로부터 분리된 PBMC에 의한 IFN-γ 생성을 자극시켰다. HIV-1 혈청양성 도너로부터의 PBMC가 이러한 실험을 위한 양성 대조군으로서의 역할을 하였다.
IFN-γ ELISPOT 검정의 결과는 도 8에 요약되어 있다. 둘 모두의 동물군은 선택된 HIV-1 Gag 펩티드 푸울에 대해 약간의 반응을 나타내었지만, 대부분은 백만개의 PBMC 당 50개의 IFN-γ 분비 세포의 컷오프 값 미만이었다. 단지 1군 동물이 지속적인 면역 반응을 나타내었는데, 특히 바이러스 공격 후에 그러하였다 (3/4 동물은 공격 후 5주째인 38주째에 양성 ELISPOT 반응을 나타내었다). 이는 림프증식 검정의 결과 (도 7)와 일치하는데, 2군 동물에 비해 HIV-1 특이적 항원에 대한 1군 동물의 보다 확고한 반응을 나타내었다.
1군 및 2군 둘 모두에 의해 나타나는 이러한 비교적 약한 반응은 부분적으로 에피토프 선택으로 인한 것일 수 있다. 선택된 20개의 HIV-1 Gag 펩티드의 푸울은 분리된 PBMC로부터 IFN-γ 분비를 자극하기에 충분치 않았을 수 있거나 동물의 면역 반응에 의해 표적화되는 영역에 특이적이지 않았을 수 있다. 도 8에 도시된 바와 같이, 1군 및 2군 둘 모두로부터의 백신접종된 동물은 공격 후에 백신접종되지 않은 대조군 보다 효과적으로 바이러스를 제거하였는데, 이는 활성 CTL 반응의 존재를 간접적으로 제시해준다.
실시예 11: 혈장 바이러스 부하 측정
이러한 실험에서 사용된 SHIV 공격은 2개의 비병원성 균주인 SHIV89.6 및 SHIVSF162p4이 복합된 것이다. 이들의 비병원성 특성으로 인해, 임상적 질병 진행의 측정은 백신접종의 임의의 방어 효과를 모니터링하기에 불충분할 것이다. 그 대신, 바이러스 RNA의 수준을 분지 DNA (bDNA) 검정에 의해 측정하였는데, 이는 혈장의 ml 당 존재하는 바이러스의 카피수를 측정하는 것이었다. 이는 혈액에 존재하는 바이러스의 양을 Log 2.1 카피/ml의 검출 한계까지 정확히 측정해준다
1군 및 2군 동물은 유사한 질병 과정을 나타내었는데 (도 9A 내지 9B), 바이러스 부하는 공격 후 2주째까지 ~105 내지 106개 카피/ml에서 피크에 도달하였다. 그 후, 혈장 vRNA의 수준이 5주째까지 103개 미만의 카피/ml로 급격히 감소되었고, 9주째까지는 검출 한계 미만으로 감소하였다. 또한, 백신접종되지 않은 대조군 동물은 2주째에 피크 바이러스 부하를 나타내었는데, 106 내지 107개 카피/ml의 약간 상승된 수준이었다 (도 9C). 또한, 바이러스 부하는 백신접종된 동물에서 보다 더 서서히 감소하였는데, 대조군은 공격 후 5주째에 103 내지 105개 카피/ml의 수준을 여전히 나타내었지만 결국 대부분의 동물에서 9주째까지 점점 적어져 갔다.
전반적으로, 모든 3개 군의 조합된 데이터 및 비교 (도 9D)는 1군 및 2군으로부터의 백신접종된 동물이 백신접종되지 않은 대조군 보다 현저하게 더 신속히 바이러스를 제거하였음을 나타내는데, 이는 공격 후 5주째의 감소된 혈장 vRNA 수준에 의해 입증된다.
실시예 12: 항체 반응
HIV-1 감염을 제어하는 데에 필요한 면역 반응의 다른 중요한 일면은 강력한 체액성 또는 항체 매개된 반응의 발생이다. 백신접종 후 그리고 바이러스 공격에 반응하여 일어나는 HIV-1 특이적 항체의 발생 및 생성을 평가하기 위해, 혈청 샘플을 효소결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 분석하였다. 포획 항원으로서 정제된 HIV-1IIIB 바이러스 용해물을 사용하여 HIV-1 특이적 항체를 검출하였다.
1군의 동물 (도 10A)은 최초 비활성화된 바이러스 프라임 및 재조합 아데노바이러스 부스트 후에 강력한 HIV-1 특이적 항체 반응 (104-105)을 신속히 발생시켰다. 이러한 반응은 8주째 및 16주째의 후속 재조합 아데노바이러스 부스트에 의해 추가로 증가되었다 (>105). 33주째의 SHIV 공격 후, 항체 반응은 ~106으로 추가로 증가하였다. 2군 동물 (도 10B)은 12주째까지 103 내지 104로 보다 지연된 항체 발생을 나타내었다. 그러나, 16주째의 비활성화된 바이러스 부스팅은 수 개월 동안 항체 역가의 현저하고 장기적인 증가를 유도하였다. 또 다시, 33주째의 SHIV 공격 후, 항체 수준은 ~106으로 상승하였는데, 이는 기억 반응의 존재를 나타낸다. 반대로, 대조군 동물은 SHIV 공격에 반응하여 HIV-1 특이적 항체 생성을 나타내지 않았다 (도 10C).
이러한 결과는 백신접종이 강력하고 지속하는 항체 매개된 체액성 면역 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다. 특히, 1군 동물에 적용된 프로토콜 (비활성화된 바이러스 프라임에 이은 재조합 아데노바이러스 부스팅)은 수 개월 동안 그리고 공격 후에 지속되는 신속하고 확고한 반응을 유도해내었다. 이러한 유형의 강력한 항체 반응은 방어 면역을 확립하는 데에 있어서 중요한 인자이고, 앞서 논의된 공격 후 바이러스 감염을 제어하고 제거하는 백신접종된 동물의 능력에 기여할 수 있다 (본문 및 도 9D 참조).
실시예 13: 결론
본 발명의 결과는 전체(whole) AT-2 비활성화된 HIV-1 프라이밍에 이은 B- 또는 T-세포 에피토프와 융합된 HIV gag 유전자를 함유하는 재조합 아데노바이러스에 의한 2회 또는 3회의 부스트 면역화가 체액성 및 세포성 면역 반응 둘 모두를 유도해낸다는 것을 강력하게 제시한다. 이러한 유형의 백신접종은 HIV-1 감염을 예방하기 위해 사용될 뿐만 아니라 여전히 면역적격(immunocompetent)인 HIV-1 감염된 개체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 프라임-부스트 백신접종을 이용한 인간 임상 실험이 적극 권고된다.
참고문헌
하기 열거된 참고문헌을 포함하는 본원에 언급된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되어 있는 것과 같이 그 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 출원의 기재가 우선한다.
등가물
당업자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 구체예에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 단지 정례적인 실험을 이용하여 이러한 등가물을 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 특정 구체예가 논의되었지만, 상기 설명은 예시적인 것으로서 제한하는 것이 아니다. 본 발명의 다수의 변형물이 본 발명의 상세한 설명을 숙지한 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 전체 범위는 청구의 범위를 이의 전체 등가 범위와 함께 참조하고, 상세한 설명을 그러한 변형물과 함께 참조함으로써 결정될 수 있다. 이러한 등가물은 하기 청구의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE UNIVERSITY OF WESTERN ONTARIO <120> HIV COMBINATION VACCINE AND PRIME BOOST METHOD <130> UWA-015.25 <140> PCT/IB2008/000668 <141> 2008-01-11 <150> 60/880,103 <151> 2007-01-12 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 1 Met Arg Val Lys Glu Lys Lys Thr Gln His Leu Trp Arg Trp Gly Trp 1 5 10 15 Arg Trp Gly Thr Met Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or Phe <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or Phe <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or Phe <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, Ile, 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Claims (16)

  1. 렌티바이러스 감염을 예방하거나 치료할 필요가 있는 환자에게, 당단백질 120 신호 서열을 지닌 재조합 렌티바이러스를 포함하는 유효량의 백신 (a)과 렌티바이러스 단백질을 엔코딩하는 핵산을 포함하는 유효량의 재조합 복제결함(replication-defective) 아데노바이러스 벡터 (b)를 투여하는 것을 포함하여 렌티바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법으로서, 상기 당단백질 120 신호 서열은 SEQ ID NO: 3 내지 6으로 제시된 폴리펩티드 서열, 또는 이의 작용성 단편 또는 변이체로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 작용성 단편 또는 변이체는 단지 1개의 양하전된 아미노산을 함유하는 것인, 렌티바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, (b)가 상기 환자에게 투여되기 전에 (a)가 상기 환자에게 투여되는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 치료 또는 예방 과정에 걸쳐 (b)가 상기 환자에게 1회를 초과하여 투여되는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, (a)가 이를 필요로 하는 상기 환자에게 투여되고, (a)를 투여한 후 약 3주, 8주 및 16주째에 (b)가 이를 필요로 하는 상기 환자에게 투여되는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 렌티바이러스 감염이 HIV 감염인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, (a)가 재조합 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1)이고, 여기서 상기 바이러스의 HIV-1 외피 당단백질 gp120의 천연 신호 서열(natural signal sequence, NSS)이 멜리틴 신호 서열(melittin signal sequence, MSS) 및 인터류킨 3 신호 서열(interleukin 3 signal sequence, ILSS)로 구성된 군으로부터 선택된 신호 서열로 대체된 것인 방법.
  7. 제 6항에 있어서, (a)의 유효량이 약 0.10 mg/kg 내지 약 0.23 mg/kg인 방법.
  8. 제 5항에 있어서, (b)가 결실된 E1A 유전자 영역을 지닌 Ad5 게놈을 포함하는 복제결함 재조합 아데노바이러스 벡터이며, 여기서 상기 E1A 영역에 HIV 유전자가 삽입되어 있는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, HIV 유전자가 HIV-1 gag 또는 HIV-2 gag인 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 E1A 영역에 HIV 유전자 및 하나 이상의 중화(neutralizing) 또는 T-세포 에피토프가 삽입되어 있는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, HIV 유전자가 HIV-1 gag 또는 HIV-2 gag인 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 하나 이상의 중화 또는 T-세포 에피토프가 SEQ ID NO:14 내지 34 중 어느 하나로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  13. 제 8항에 있어서, (b)의 유효량이 약 8.46x108 mg/kg 내지 약 2.21x109 mg/kg인 방법.
  14. 당단백질 120 신호 서열을 지닌 재조합 렌티바이러스를 포함하는 유효량의 백신의 투여분(dose) (a)과 렌티바이러스 단백질을 엔코딩하는 핵산을 포함하는 유효량의 재조합 복제결함 아데노바이러스 벡터의 1회 이상의 투여분 (b)을 포함하는 키트로서, 상기 당단백질 120 신호 서열은 SEQ ID NO: 3 내지 6으로 제시된 폴리펩티드 서열, 또는 이의 작용성 단편 또는 변이체로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 작용성 단편 또는 변이체는 단지 1개의 양하전된 아미노산을 함유하는 것인 키트.
  15. 제 14항에 있어서, (a)와 (b)가 약제학적으로 허용되는 담체중에서 제형화되는 키트.
  16. 제 14항에 있어서, 사용 설명서를 추가로 포함하는 키트.
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