KR20090100573A - 산마늘 추출물을 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

산마늘 추출물을 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본원 발명은 암 발생 또는 진행시에 나타나는 병리 현상인 간극 결합부의 세포내 신호전달(gap junctional intercellular communication, GJIC) 억제를 회복시켜, 암 예방 또는 치료 효과가 있는 산마늘 추출물에 관한 것이다. 본원 발명의 산마늘 추출물은 암 발생 또는 암 진행시 나타나는 GJIC의 억제를 회복시키는 효과가 있을 뿐만 아니라, 세포 독성도 없어서, 암 예방 또는 치료용 조성물의 유효 성분으로 사용될 수 있다. 또한, 산마늘은 우리나라 전역에서 서식하므로 구하기가 쉽고, 천연 식물로부터 유래하므로 합성 약물에서 나타나는 부작용이 없다.
산마늘, 추출물, GJIC, 암

Description

산마늘 추출물을 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물{Composition for prevention or treatment of cancer comprising an extract of Allium victorialis var. platyphyllum}
본원 발명은 항암 효과를 갖는 산마늘 추출물 및 이를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본원 발명은 암 발생 또는 진행시에 나타나는 병리 현상인 간극 결합부 세포내 신호전달(gap junctional intercellular communication, GJIC)의 억제를 회복시켜, 암 예방 또는 치료 효과를 갖는 산마늘 추출물 및 이를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
간극 결합(gap junctions)은 이웃하는 두 개의 세포의 세포질 구획을 직접 연결해주는 조밀하게 패킹된 간극 결합 채널이 수백 내지 수천 개 모여 이루어진 클러스터를 갖는 세포막의 특화된 대역이다. 간극 결합 채널은 이웃하는 두 개의 세포 각각에 의해 제공되는 두 개의 헤미채널(코넥손)로 이루어진다. 각각의 코넥손은 코넥신(connexin)이라 칭해지는 6개의 단백질로 구성된다. 코넥신은 4개의 트랜스막 도메인, 2개의 세포외 루프, 및 세포질 루프의 기본 구조를 함께 공유하는 단백질 군이다. 간극 결합을 통해서 전기 충격의 전달과 신호 분자들의 세포간 확산이 일어나기 때문에, 정상적인 세포간 신호전달을 위해서는 정상적으로 기능하는 간극 결합들이 필수적이다.
이러한 간극 결합부에서 일어나는 간극 결합부 세포내 신호전달(GJIC)은 세포 항상성, 증식 및 분화를 조절하는 중요한 메카니즘이다. 이러한 GJIC는 레티논산, 레티노이드 유도체 및 비타민 D 뿐만 아니라, 포르볼 에스테르(phorbol ester)와 같은 암 촉진제에 의해서 영향을 받는다. 또한, GJIC는 산화적 스트레스 및 질산화적 스트레스(nitrosative stress)에 의해 민감하고, 과산화수소 및 페록시트리트는 GJIC를 억제한다고 보고되었다.
한편, 암이 생성될 때 또는 이미 발생한 암 세포에서는 GJIC가 억제된다. 따라서, 억제된 GJIC를 회복하여 암 예방 또는 억제 효능을 갖는 성분에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 예를 들면, 카카오 콩 또는 콩껍질 분획물을 함유하는 암 예방 및 억제 효능을 갖는 식품 첨가제(대한민국 공개특허 제2004-48883호), GJIC의 억제를 저해하고, 암 세포의 DNA 합성을 저해하여 암세포의 증식을 저해하는 효능을 갖는 데오브로민(대한민국 공개특허 제2003-32484호) 등이 있다.
산마늘(Allium victorialis var . platyphyllum)은 한국, 일본, 중국 북부 등에서 널리 자생하는 식물이다. 예로부터, 산마늘은 위염 및 심장 질환을 치료하기 위한 약초로서 사용되었다. 또한, 산마늘에는 항-간독성 및 항-고지혈과 같은 약리학적 활성이 있음이 입증되었다.
본원 발명자는 산마늘 각 부위로부터 제조한 추출물이 TPA(12-O-테트라데카노일-포르볼-13-아세테이트)로 억제된 간극 결합부 세포내 신호전달을 회복시켜, 암 예방 또는 치료 효과가 있음을 확인하여 본원 발명을 완성하였다.
본원 발명은 천연 식물로부터 유래하는 항암 효과를 갖는 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본원 발명은 항암 효과를 갖는 산마늘 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.
이하, 본원 발명을 상세히 설명한다.
산마늘 추출물은 통상적인 추출 방법을 사용하여 산마늘로부터 제조할 수 있다. 통상적으로, 산마늘의 각 부분을 건조시켜 분말을 얻은 후, 에탄올, 메탄올 등과 같은 유기 용매를 첨가하여 추출물을 제조한다. 추출 효율을 높이기 위해서는, 유기 용매를 첨가한 후 환류시켜 추출물을 제조할 수 있다. 산마늘 추출물을 제조하기 위해서는, 산마늘의 꽃, 꽃 자루(flower stalk), 씨, 잎, 줄기 또는 뿌리 부분을 모두 이용할 수 있다. 바람직하게는, 산마늘의 꽃 또는 줄기로부터 추출물을 제조한다.
산마늘 추출물에 함유되어 있는 플라보노이드 성분을 분석한 결과, 케르세틴(quercetin)(하기 화학식 1 참조)과 캠페롤(kaempferol)(하기 화학식 2 참조)이 함유되어 있음을 확인하였다(실험예 2 참조).
<화학식 1>
Figure 112008020239233-PAT00001
<화학식 2>
Figure 112008020239233-PAT00002
산마늘 줄기로부터 제조된 추출물은 산마늘의 다른 부위로부터 제조된 추출물에 비해 케르세틴과 캠페롤이 가장 적게 포함되어 있었다(표 3 참조). 그러나, 산마늘의 꽃, 꽃 자루, 씨, 잎 및 뿌리로부터 제조된 추출물에 비해 강한 GJIC 억제 회복 효과를 나타내었음을 알 수 있다(도 5 참조). 특히, 산마늘 줄기로부터 제조된 추출물은 TPA로 억제된 GJIC를 농도 의존적인 방식으로 회복하였다(도 5 참 조).
본원 발명의 산마늘 추출물 또는 산마늘 각각의 부분으로부터 제조한 추출물은 억제된 GJIC를 회복시켜 발암 억제 또는 항암 효과를 갖는다.
WB-F344 세포에 TPA(12-O-테트라데카노일-포르볼-13-아세테이트)를 처리하여 인위적으로 GJIC를 억제시켰다. 그런 다음, 스크레이프 로딩 다이 트랜스퍼(scrape loading dye transfer, SLDT) 분석을 하였을 때, TPA를 처리하지 않은 WB-F344 세포에 비하여 GJIC 신호전달 세포의 수가 감소하였다. 그러나, 산마늘 각 부분으로부터 제조한 추출물을 처리한 결과, GJIC 신호전달 세포의 수가 회복되었다. 일반적으로 암 세포에서는 GJIC가 억제된다. 따라서 이것은 암 발생시에 억제되는 GJIC가 산마늘 추출물 처리에 의해 회복됨을 나타낸다. 이러한 결과는 산마늘 추출물이 발암 억제 기능 또는 이미 발생한 암에 대해 항암 효과가 있음을 나타낸다. 특히, 산마늘 부위 중 꽃 또는 줄기로부터 제조된 추출물은 TPA에 의해 억제된 GJIC 신호전달 세포 수를 농도 의존적인 방식으로 회복시켰으며, 다른 부위에 비해 탁월한 정도로 GJIC 신호전달 세포 수를 회복시켰다(실험예 4 참조).
본원 발명은 산마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본원 발명의 약학적 조성물은 산마늘의 꽃 또는 줄기로부터 제조한 추출물을 유효성분으로 함유한다.
본원 발명의 약학적 조성물은 산마늘 추출물이 GJIC를 회복시키는 기능에 의 해 폐암, 유방암 또는 위암을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본원 발명의 산마늘 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순히 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비서성 용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제, 좌제 등이 포함된다. 비수성 용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본원 발명의 약학적 조성물은 하루 0.1 내지 10 mg/kg의 투여량으로 하루 1-3회 투여될 수 있다.
본원 발명의 약학적 조성물은 전체 조성물 중량에 대해 산마늘 추출물을 10-20 중량%로 함유한다.
본원 발명의 약학적 조성물의 유효 성분인 산마늘 각 부위로부터 제조된 추출물은 세포 독성을 나타내지 않았다(실험예 3 참조).
본원 발명의 산마늘 추출물은 암 발생 또는 암 진행시 나타나는 병리 현상인 GJIC 억제를 회복시키는 효과가 있을 뿐만 아니라, 세포 독성도 없어서, 암 예방 또는 치료용 조성물의 유효 성분으로 사용될 수 있다. 또한, 산마늘은 우리나라 전역에서 나타나므로 구하기가 쉽고, 천연 식물로부터 유래하므로, 합성 약물에서 나타나는 부작용이 없다.
본원 발명을 하기 실시예에 의해 상세하게 설명한다. 그러나, 본원 발명이 하기 실시예에 의해 보다 한정되는 것은 아니다.
실시예 : 산마늘 추출물의 제조
채취한 산 마늘을 꽃, 꽃 자루, 씨, 잎, 줄기 및 뿌리의 여섯 부분으로 나누었다. 각각 분리한 부분들을 -60℃에서 24시간 동안 보관하였다. 그런 다음 72 시간 동안 동결 건조시켰고, 분쇄기(blender)(한일분쇄기)로 분쇄하여 부위별로 각각 446, 287, 252, 965, 660 및 1343g의 분말을 얻었다. 각각 얻은 분말 10 g에 70% 에탄올 1L를 첨가하였고 실온에서 2 시간 동안 환류시켰으며, 같은 과정을 3회 반복하였다. 얻은 혼합물을 와트만 6번 여과지(Whatman No. 6 paper)를 통해 여과하였다. 얻은 여과액 중 상층액을 진공에서 50℃에서 건조시켜 용매를 증발시켰다. 그런 다음 얻은 잔여물을 동결건조시켜 남아있는 용매를 완전히 제거하여, 각각의 부분으로부터 추출물 4.77, 2.58, 1.57, 3.28, 4.56 및 4.37g을 제조하였다.
실험예 1: 추출물에 들어 있는 전체 페놀성 화합물의 함량 결정
각각의 부분으로부터 제조한 추출물에 들어 있는 전체 페놀성 화합물의 함량을 색 분석 방법(colorimetric assay)(Chung et al ., Food Sci . Biotechnol . 14: 718-721(2005))에 기초하여 측정하였다.
각각의 부분으로부터 제조한 추출물을 0.1% DMSO에 녹였다. 얻은 추출물 용액 1 ml와 폴린-키오칼테우 페놀 시약(Folin-Ciocalteu's phenol reagent)(Sigma Chemical Co.) 1 ml를 혼합하였다. 3분 후에, 얻은 혼합물에 포화시킨 Na2CO3 용액 1 ml를 첨가하였고, 증류수를 첨가하여 전체 부피를 10 ml로 만들었다. 빛을 차단한 상태에서 90분 동안 반응을 진행시켰다. 그런 다음 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 0.01-0.1 mM 농도의 갈산을 사용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하여 표준 검정 곡선을 만들었다. 측정된 흡광도와 표준 검정 곡선을 이용하여 각각의 추출물에 포함된 전체 페놀성 화합물을 정량하였다. 동일 과정을 3회 반복하여, 전체 페놀성 화합물의 함량을 갈산 등가물(GAE, gallic acid equivalent)(mg)/추출물(g) 로 나타내었다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
<표 1>
추출물 제조 부위 전체 페놀성 화합물 함량 (GAE mg/추출물 g) 수득률(%)
12.50±0.01 47.7
꽃 자루 11.29±0.01 25.8
19.79±0.01 15.7
24.29±0.02 32.8
줄기 3.07±0.00 45.6
뿌리 14.93±0.01 43.7
산마늘 각 부분으로부터 제조한 추출물에는 3.07 내지 24.29 GAE mg/추출물 g의 페놀성 화합물이 포함되어 있었다.
실험예 2: 추출물에 들어있는 전체 플라보노이드 화합물의 함량 및 성분 결정
(1) 플라보노이드 화합물의 함량 결정
각각의 부분으로부터 제조한 추출물에 들어 있는 전체 플라보노이드 화합물의 함량을 Choi et al ., Food Sci . Biotechnol . 14: 700-703(2005)에 기초하여 측정하였다.
각각의 부분으로부터 제조한 추출물을 0.1% DMSO에 녹였다. 얻은 추출물 용액 1 ml와 디에틸렌 글리콜 10 ml 및 1 N NaOH 1 ml를 혼합하였다. 얻은 혼합물을 37℃에서 90분 동안 유지하여 노란색의 용액을 얻었다. 50% 메탄올 0.05 mg/ml만 들어있는 용액(blank solution)에 대해 상기 얻은 노란색 용액에 대해 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 0-0.05 mg/ml 농도의 루틴 수화물을 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하여 표준 검정 곡선을 만들었다. 측정된 흡광도와 표준 검정 곡선 을 이용하여 각각의 추출물에 포함된 전체 플라보노이드 화합물을 정량하였다. 동일 과정을 3회 반복하여, 전체 페놀성 화합물의 함량을 루틴 등가물(RE, rutin equivalent)(mg)/추출물(g)로 나타내었다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
<표 2>
추출물 제조 부위 전체 플라보노이드 화합물 함량 (RE mg/추출물 g) 수득률(%)
10.29±0.08 47.7
꽃 자루 9.29±0.07 25.8
16.29±0.13 15.7
20.00±0.15 32.8
줄기 2.53±0.02 45.6
뿌리 12.29±0.10 43.7
산마늘 각 부분으로부터 제조한 추출물에는 2.53 내지 20.00 RE mg/추출물 g의 플라보노이드 화합물이 포함되어 있었다.
(2) 플라보노이드 화합물의 성분 결정
각각의 부분으로 제조한 추출물 500 mg에, 부틸화된 히드록시아니솔(BHA, 2 g/L)을 포함하는 62.5% 메탄올 수성 용액을 혼합하였다. 그런 다음 6 M HCl 10 ml를 첨가하여, 50% 메탄올 수용액에서 1.2 M HCl을 만들었다. 얻은 혼합물을 물 배쓰(water bath) 상태로 90℃에서 2 시간 동안 환류시키면서 가열한 다음, 냉각시켰다. 얻은 가수분해 생성물 중 3 ml를 분취하여 0.45 ㎛ 여과지를 통해 여과시켰다. 얻은 여과액 중 20 ㎕를 UV 검출기가 장착된 HPLC 장치(Waters HPLC(Associates model 515; Milford, MA, USA))에 주입하였다. LC18(10x4.0 mm) 보호 컬럼(guard column)으로 보호되는 Phenyl-Hexyl(Phenomenex Co., Torrance, CA, USA) 컬럼(luna 5 ㎛, 150x4.6 mm)을 사용하였다. HPLC에서 이동상은 1% 포름산 수용액(A)과 1% 포름산 아세토니트릴 용액(B)으로 구성되며, A:B(80:20, v/v)에서 개시하여 150분에 걸쳐 A:B(50:50, v/v)이 되는 농도 구배로 실시하였고, 1 ml/분의 유속으로 흐르도록 유지하였고, 280nm와 345 nm에서 UV 흡광도를 측정하였다. 그 결과 얻은 크로마토그램을 도 1의 A에 나타내었다.
도 1의 A에서 얻은 각각의 피크에 해당되는 물질을 확인하기 위하여, LC-MS 분석을 실시하였다. 얻은 여과액 중 20㎕를 LC-MS 장치(HP-1100 HPLC and QUATTRO LC Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometer; Waters Ltd.)에 주입하였다. LC에서 이동상은 1% 포름산 수용액(A)과 1% 포름산 아세토니트릴 용액(B)으로 구성되며, 1 ml/분의 유속을 유지하였고, 16분 동안 20-55%(A)와 80-45%(B)의 농도 구배로 실시하였다. 질량 분광 분석은 전자-분무 이온화(electo-spray ionization, ESI) 모듈(module)이 있는, 연속 흐름 주입을 위한 시린지 펌프와 연결된 질량 분광기에서 수행하였다. 이로부터 얻은 각각의 피크의 잔류시간, 질량 분광 결과 및 UV-Vis 결과와, 표준 물질인 케르세틴 및 캠페롤(Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA))의 데이타를 비교하여, 각각의 피크에 해당되는 물질을 확인하였다. 그 결과를 도 2a와 도 2b에 나타내었다.
도 2a는 케르세틴의 MS(Mass Spectrometery) 결과를 나타낸 것이고, 도 2b는 캠페롤의 MS 결과를 나타낸 것이다. 산마늘 추출물에는 케르세틴과 캠페롤이 포함되어 있었다.
상기 기술된 HPLC 방법에 따라 표준 물질인 케르세틴과 캠페롤의 HPLC를 실 시하여 그 결과를 도 1의 B와 C에 나타내었다. 이것은 도 1의 A에 해당되는 각각의 피크의 잔류 시간(retention time)과 일치하였다. 따라서, 산마늘 추출물에 케르세틴과 캠페롤이 포함되어 있음을 확인하였다.
HPLC 크로마토그램을 이용한 외삽 표준화에 의해 케르세틴과 캠페롤에 해당되는 화합물의 함량을 결정하였다. HPLC 크로마토그램에 따라 확인된 케르세틴과 캠페롤의 함량을 하기 표 3에 나타내었다.
<표 3>
추출물 제조 부위 케르세틴 함량(㎍/분말 g) 캠페롤 함량(㎍/분말 g)
27.4±0.9 37.5±1.3
꽃 자루 12.9±0.0 8.4±0.1
12.1±0.1 7.9±0.4
18.6±0.5 12.1±1.0
줄기 11.6±0.1 6.0±0.3
뿌리 67.4±0.4
상기 표 3에서와 같이, 산마늘 꽃 부분으로부터 제조된 추출물에는 케르세틴과 캠페롤의 함량이 매우 높았다. 그러나, 산마늘 줄기로부터 제조된 추출물에는 케르세틴과 캠페롤의 함량이 낮았으며, 특히 케르세틴과 캠페롤 모두 산마늘 줄기로부터 제조된 추출물에서 가장 낮은 함량으로 포함되어 있었다. 케르세틴에 항암 효과가 있음은 이미 보고되어 있다. 그러나, 도 5에서 나타난 바와 같이, 산마늘 줄기로부터 제조된 추출물은 케르세틴과 캠페롤이 가장 적게 함유되어 있음에도 불구하고, 산마늘의 꽃, 꽃 자루, 씨, 잎 및 뿌리로부터 제조된 추출물에 비해 강한 GJIC 억제 회복 효과를 나타내었음을 알 수 있다. 이것은 산마늘 추출물이 케르세틴 포함 여부에 관계없이 GJIC 억제 회복 효과가 있음을 나타낸다.
실험예 3: 추출물의 세포 독성 평가
(1) 세포 배양
WB-F344 세포(한국 세포주은행)를 5% FBS(fetal bovine serum)(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)와 PSN(penicillin streptomycin neomycin)(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 혼합물(3 mL/L)을 보충한 D-배지(D-media)(Formula No. 78-5407EF)(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에서 37℃에서 5% CO2 배양기에서 유지하였다. 연속적으로 계대 배양하였다. 세포를 75 mm 조직 배양용 플레이트에서 길렀고, 배지를 이틀에 한 번씩 교체해 주었다.
(2) 세포 독성 평가
각각의 부분으로부터 얻은 추출물이 WB-F344 세포에 대해 독성이 있는지 여부를 MTT 방법에 의해 평가하였다. 각각의 추출물을 0.1% DMSO에 현탁시켰고, 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 상기 배양한 WB-F344 세포를 24-웰 마이크로플레이트에 시딩(seeding)하였고, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 밤새 배양시켰다. 플레이트에 붙어 있는 WB-F344 세포에 다른 농도의 추출물 현탁액 또는 비히클(0.1% DMSO)을 24시간 동안 처리하였고, 다시 배양하였다. 배양한 후에, MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸리움 브로마이드)(Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)) 스톡 용액(stock solution)(5 mg/ml) 50㎕를 각각의 웰에 첨가하였고, 플레이트를 37℃에서 4 시간 동안 추가로 배양하였다. 상층액을 제거하였 고, DMSO 500 ㎕를 각각의 웰에 첨가하여 생성된 불용성 포르마잔 결정을 녹였다. 그런 다음, 96-웰 마이크로플레이트로 옮겨 EL 800 마이크로플레이트 리더(microplate reader, Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA)를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 동일한 과정을 3회 실시하였고, 그 결과를 비히클을 처리한 군에 대한 세포 생존률 백분율로 나타내었다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 나타난 바와 같이, 산마늘의 잎, 꽃 자루, 씨 또는 줄기로부터 얻은 추출물을 1 mg/ml 이하의 농도로 처리하였을 때에는, 세포의 형태 및 생존률에 영향을 미치지 않았다. 꽃 또는 뿌리로부터 얻은 추출물은 250 ㎍/ml의 농도까지는 세포 생존률에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 산마늘의 각 부분으로부터 제조한 추출물은 세포 독성이 없음을 알 수 있다.
실험예 4: 산마늘 추출물이 GJIC 억제에 미치는 영향
산마늘 각 부분으로부터 제조한 추출물이 GJIC 억제에 미치는 영향을 Jong et al ., Carcinogenesis 23: 1163-1169(2002)에 따른 스크레이프 로딩 다이 트랜스퍼(scrape loading dye transfer, SLDT) 분석에 기초하여 측정하였다.
상기 실험예 3과 동일한 방법으로 배양한 WB-F344 세포에 다양한 농도의 추출물을 첨가하여 24시간 동안 처리하였다. 산마늘 뿌리 또는 꽃으로부터 제조한 추출물은 0.05(a), 0.1(b), 0.2(c) mg/ml로 처리하였다. 산마늘 꽃 자루, 씨, 잎 또는 줄기로부터 제조한 추출물은 0.1(a), 0.2(b), 0.5(c) mg/ml 농도로 처리하였 다. TPA(12-O-테트라데카노일-포르볼-13-아세테이트)(10 ng/ml)(Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA))를 첨가하여 1 시간 동안 유지하였다. 배양한 후, 세포를 PBS 2 ml로 2회 수세하였다. 수세된 세포에 형광 염료, 루시페르 옐로우(Lucifer yellow)(Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA))를 주입하였고, 외과용-강철 메스(scalpel)를 사용하여 3 개의 스크레이프 라인(scrape line)을 만들어 3분 동안 실온에서 반응시켰다. 그런 다음 다시 PBS 10 ml로 세척하였고 4% 포르말린 용액 2 ml를 첨가하여 세포를 고정시켰다. 차광하여 보관한 뒤, 형광 마이크로스코프(fluorescent microscope)(Ix70; Olympus, Okaya, Japan)를 사용하여 GJIC 신호전달 세포를 계수하였다. 대조군으로 추출물과 TPA를 처리하지 않고 0.1% DMSO만을 처리하고 동일한 방법을 실시하여 GJIC 신호전달 세포를 계수하였다. 음성 대조군으로 TPA를 처리하고 추출물을 처리하지 않고 동일한 방법을 실시하여 GJIC 신호전달 세포를 계수하였다. 대조군의 GJIC 신호전달 세포 수에 대해 측정된 GJIC 신호전달 세포의 수를 백분율로 나타내었다.
그 결과를 도 4와 도 5에 나타내었다.
도 5에서 나타난 바와 같이, WB-E344 세포에 TPA만 처리하였을 때에는, 대조군에 비해 GJIC 신호전달 세포가 70%(62.3±12.5 세포) 정도 감소하였다. 그러나, 0.05-0.5 mg/ml의 꽃 또는 줄기로부터 제조한 추출물을 처리하였을 때에는, TPA-유도된 GJIC의 억제를 농도 의존적으로 회복하는 효과가 있었다. 구체적으로, 줄기로부터 얻은 추출물(0.5 mg/ml)은 GJIC를 기본적인 수준(92%, 204±2.3 세포)까지 회복시켰고, 꽃으로부터 얻은 추출물(0.2 mg/ml)은 GJIC를 82.5%(172.6±8.3 세포) 까지 회복시켰다. 뿌리로부터 얻은 추출물은 낮은 농도 0.05 mg/ml로 처리하였을 때 GJIC를 40%까지 회복시키는 효과를 나타내었지만, 0.05 mg/ml보다 높은 농도를 처리하였을 때에는 GJIC 회복 효과를 나타내지 않았다. 이것은 뿌리로부터 얻은 추출물이 갖는 세포 독성에 기인한 것이다. 결국, 산마늘 각각의 부위로부터 얻은 추출물은 TPA 처리로 인한 감소된 GJIC 신호전달 세포의 수를 완전히 회복시켰다. 따라서, 본원 발명의 산마늘 추출물은 암 촉진 과정에서 나타나는 병리 현상인 GJIC 억제를 회복시켜, 항암 효과가 있음을 알 수 있다.
도 1은 동일한 HPLC 실시 조건에서 산마늘 추출물(A), 케르세틴(B), 켐페롤(C)을 HPLC하였을 때 얻은 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2a는 케르세틴의 MS 결과를 나타낸 것이고, 도 2b는 캠페롤의 MS 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 비히클을 처리한 군에 대한 산마늘 각 부분으로부터 제조한 추출물을 처리한 군의 세포 생존율 백분율을 나타낸 것이다.
도 4는 세포의 GJIC를 SLDT로 측정한 결과이다.
A: 대조군(0.1% DMSO만 처리한 경우)
B: TPA(10 ng/mL)만 처리한 경우
C: TPA와 산마늘 각 부위로부터 제조한 추출물을 처리한 경우(뿌리 또는 꽃 추출물의 처리 농도는 0.05mg/ml(a), 0.1mg/ml(b), 0.2mg/ml(c). 꽃 자루, 씨, 잎 또는 줄기 추출물의 처리 농도는 0.1mg/ml(a), 0.2mg/ml(b), 0.5mg/ml(c))
도 5는 대조군의 GJIC 개수에 대한 GJIC 개수의 백분율을 나타낸 것이다.

Claims (5)

  1. 산마늘(Allium victorialis var . platyphyllum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 산마늘 추출물은 산마늘 줄기, 뿌리, 꽃, 꽃 자루, 잎 또는 씨로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 산마늘 추출물은 산마늘 줄기로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 산마늘 추출물은 산마늘에 에탄올 또는 메탄올을 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 산마늘 추출물의 간극 결합부 세포내 신호전달(gap junctional intercellular communication, GJIC) 억제 회복에 의한 폐암, 유방암 또는 위암 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 조성물.
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