KR20090098804A - 신규한 화합물, 이를 함유하는 약제학적 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

신규한 화합물, 이를 함유하는 약제학적 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20090098804A
KR20090098804A KR1020097011742A KR20097011742A KR20090098804A KR 20090098804 A KR20090098804 A KR 20090098804A KR 1020097011742 A KR1020097011742 A KR 1020097011742A KR 20097011742 A KR20097011742 A KR 20097011742A KR 20090098804 A KR20090098804 A KR 20090098804A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compound
alkyl
pharmaceutical composition
mmol
fas
Prior art date
Application number
KR1020097011742A
Other languages
English (en)
Inventor
크레이그 타운센드
프란시스 쿠하즈다
칸다사미 수부라즈
질 마리 스터디반트
Original Assignee
파스젠, 엘엘씨.
더 존스 홉킨스 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 파스젠, 엘엘씨., 더 존스 홉킨스 유니버시티 filed Critical 파스젠, 엘엘씨.
Publication of KR20090098804A publication Critical patent/KR20090098804A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/04—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
    • C07D233/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D233/30—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D233/32—One oxygen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D333/30—Hetero atoms other than halogen
    • C07D333/32—Oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Compounds Containing Sulfur Atoms (AREA)

Abstract

다음 화학식의 화합물, 당해 화합물을 포함하는 약제학적 조성물 및 당해 조성물을 사용하여 암, 비만 및 미생물 감염을 치료하는 방법을 제공한다
화학식 I
Figure 112009034309877-PCT00035
위의 화학식 I에서,
R1은 H, C1-C2O 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬 또는 알킬아릴, 시아노메틸, -OCH3, -OC(O)CH3 또는 -OC(O)CF3이고,
R2는 -OCH2C(O)NHNH-R5이고, 여기서, R5는
(a) 할로겐, C1-C8 알킬(이는 할로겐에 의해 임의로 치환된다), -OH 및 -OR6(여기서, R6은 할로겐에 의해 임의로 치환된 C1-C8 알킬이다) 중의 하나 이상에 의해 임의로 치환된 페닐,
(b) 할로겐, -OH 또는 -OR6(여기서, R6은 할로겐에 의해 임의로 치환된 C1-C8 알킬이다)에 의해 임의로 치환된 2-피리딜, 3-피리딜 또는 4-피리딜,
(c) 이미다졸, 티아졸, 벤즈이미다졸, 벤즈옥사졸, 벤즈티아졸, 테트라졸, 트리아졸 및 아미노티아졸로 이루어진 그룹으로부터 선택된 헤테로사이클 또는
(d) -C(O)R7(여기서, R7은 C1-C2O 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬 또는 알킬아릴이거나, 또는 피리딜, 이미다졸, 티아졸, 벤즈이미다졸, 벤즈옥사졸, 벤즈티아졸, 테트라졸, 트리아졸 및 아미노티아졸로 이루어진 그룹으로부터 선택된 헤테로사이클이다)이고,
R3 및 R4는 서로 동일하거나 상이하고, C1-C2O 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬 또는 알킬아릴이다.
FAS 억제제, 지방산 신타제, 암, 침투성 미생물

Description

신규한 화합물, 이를 함유하는 약제학적 조성물 및 이의 사용 방법{Novel compounds, pharmaceutical compositions containing same, and methods of use for same}
발명의 배경
지방산 신타제
지방산은 세포 생리학상 세 가지 주요 역할을 한다. 첫째, 이들은 생물학적 멤브레인의 빌딩 블록이다. 둘째, 지방산 유도체는 호르몬 및 세포간 메신저로서 작용한다. 셋째, 본 발명에 특히 중요한 것으로서 지방산은 중성 지방으로서도 알려져 있는 트리아실글리세롤로서 지방 조직에 저장될 수 있는 연료 분자이다.
지방산 합성 경로에 관여된 주요 4개의 효소, 즉 지방산 신타제(FAS), 아세틸 CoA 카복실라제(ACC), 말릭 효소(malic enzyme) 및 시트레이트 리아제가 있다. 주요 효소 FAS는 지방산을 생성하기 위한 전구체 말로닐-CoA 및 아세틸 CoA의 NADPH-의존성 축합을 촉매한다. NADPH는 일반적으로 FAS의 반응 사이클 중 2개 지점에서 필수 전자 공여체로서 작용하는 환원제이다. 나머지 3개 효소(즉, ACC, 말릭 효소 및 시트레이트 리아제)는 필수 전구체를 생성한다. 기타 효소, 예를 들면, NADPH를 생성하는 효소가 또한 지방산 합성에 관여한다.
FAS는 효소 커미션(E.C.) No. 2.3.1.85를 갖고, 지방산 신타제, 지방산 리가 제 및 이의 시스템명(systematic name) 아세틸-CoA:말로닐 CoA C-아실트랜스퍼라제(데카복시화, 옥소아실- 및 에노일-환원 및 티오에스테르-가수분해)로서도 알려져 있다. 지방산의 FAS 촉매된 합성에 관여하는 7개의 별개의 효소- 또는 촉매 도메인-이 있다: 아세틸 트랜스아실라제, 말로닐 트랜스아실라제, 베타-케토아실 신테타제(축합 효소), 베타-케토아실 리덕타제, 베타-하이드록시아실 데하이드라제, 에노일 리덕타제 및 티오에스테라제[참조: Wakil, S. J., Biochemistry, 28: 4523-4530, 1989]. 이들 7개 효소 모두는 함께 FAS를 형성시킨다.
지방산의 FAS 촉매된 합성은 하등 유기체 및 고등 유기체, 예를 들면, 사람에서 유사하지만, 몇 가지 중요한 차이점이 있다. 박테리아에서, 7개 효소 반응은 연관되지 않은 7개의 별개의 폴리펩티드에 의해 수행된다. 이는 I제I형 FAS로서 분류된다. 대조적으로, 마이코박테리아, 효모 및 사람에서의 효소 반응은 다작용성 폴리펩티드에 의해 수행된다. 예를 들어, 효모는 2개의 개별 폴리펩티드로 구성된 복합체를 갖는 반면, 마이코박테리아 및 사람에서는 7개 반응 모두 단일 폴리펩티드에 의해 수행된다. 이는 제I형 FAS로 분류된다.
FAS 억제제
다양한 화합물이 지방산 신타제(FAS)를 억제하는 것으로 밝혀졌다. FAS 억제제는 정제된 FAS의 효소 활성을 억제하는 화합물의 능력에 의해 확인할 수 있다. FAS 활성은 방사선 표지된 전구체(즉, 아세틸 CoA 또는 말로닐-CoA)의 지방산으로의 혼입을 측정하거나 NADPH의 산화를 분광광도법으로 측정함으로써 분석할 수 있다[참조: Dils, et al., Methods Enzymol., 35:74-83].
하기 기재된 표 1은 몇몇 FAS 억제제를 열거한다.
지방산 합성 경로의 효소의 대표적인 억제제
지방산 신타제의 억제제 1,3-디브로모프로판온 세룰레닌 엘만(Ellman) 시약(5,5'-디티오비스 페닐세룰레닌 (2-니트로벤조산), DTNB) 멜라르소프롤 4-(4'-클로로벤질옥시) 벤질 니코티네이트 요오도아세테이트 (KCD-232) 페닐아르신옥사이드 4-(4'-클로로벤질옥시) 벤조산(MII) 펜토스탐 2(5(4-클로로페닐)펜틸)옥시란-2- 멜리틴 카복실레이트(POCA) 및 이의 CoA 유도체 티오락토마이신 에톡시포름산 무수물
시트레이트 리아제에 대한 억제제 (-) 하이드록시시트레이트 S-카복시메틸-CoA 라디시콜 말릭 효소에 대한 억제제 퍼요오데이트-산화된 3-아미노피리딘 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) p-하이드록시머큐리벤조에이트 N-에틸말레이미드 옥살릴 티올 에스테르, 예를 들면, S-옥살 릴글루타티온 고시폴 페닐글리옥살 2,3-부탄디온 브로모피루베이트 프레그네놀론
알키닐 CoA 카복실라제에 대한 억제제 세톡시딤 9-데세닐-1-펜텐디오산 할록시포프 및 이의 CoA 에스테르 데카닐-2-펜텐디오산 디클로포프 및 이의 CoA 에스테르 데카닐-1-펜텐디오산 클레토딤 (S)-이부프로페닐-CoA 알록시딤 (R)-이부프로페닐-CoA 트리포프 플루아지포프 및 이의 CoA 에스테르 클로피브르산 클로포프 2,4-D-메코프로프달라폰 5-(테트라데사이클록시)-2-푸로산 2-알킬 글루타레이트 베타, 베타'-테트라메틸헥사데칸디오산 2-테트라데카닐글루타레이트(TDG) 트랄콕시딤 2-옥틸글루타르산 베타, 베타 프라임-메틸-치환된 헥사데칸 N6,02-디부티릴 아데노신 사이클릭 3',5'- 디오산(MEDICA 16)의 유리 또는 모노티 모노포스페이트 오에스테르 N2,02-디부티릴 구아노신 사이클릭 3',5'- 알파-시아노-4-하이드록시신나메이트 모노포스페이트 S-(4-브로모-2,3-디옥소부틸)-CoA 5-(테트라데실옥시)-2-푸로산(TOFA)의 p-하이드록시머큐리벤조에이트(PHMB) CoA 유도체 N6,02-디부티릴 아데노신 사이클릭 3',5' 2,3,7,8-테트라클로로디벤조-p-디옥신 -모노포스페이트
지방산 합성 경로의 4개의 효소 중에서, FAS는 지방산 합성 경로 내에서만 작용하는 반면, 나머지 3개의 효소는 다른 세포 작용에 관련되기 때문에 FAS가 억제에 있어서 바람직한 표적이다. 그러므로, 나머지 3개의 효소들 중 하나를 억제하면 정상 세포에 영향을 줄 가능성이 있다. FAS에 의해 수행되는 7개의 효소 단계 중에서 축합 효소(즉, 베타-케토아실 신테타제) 및 에노일 리덕타제에 의해 촉매되는 단계는 지방산 합성을 감소시키거나 중단시키는 억제제에 대한 가장 일반적인 후보였다. FAS 복합체의 축합 효소는 구조 및 기능면에서 특징이 잘 확인된다. 축합 효소의 활성 부위는 중요한 시스테인 티올을 함유하고, 이는, 예를 들면, 억제제 세룰레닌과 같은 항지질 시약의 표적이다.
축합 효소의 바람직한 억제제로는 알킬화제, 산화제 및 디설파이드 교환을 수행할 수 있는 시약을 포함하여 광범위한 화학적 화합물을 포함한다. 효소의 결합 포켓은 장쇄, E, E, 디엔을 선호한다.
원칙적으로, 측쇄 디엔과, 티올레이트 음이온과의 반응성을 나타내는 그룹을 함유하는 시약은 축합 효소의 우수한 억제제일 수 있다. 세룰레닌[(2S,3R)-2,3-에폭시-4-옥소-7,10 도데카디에노일 아미드]은, 예를 들면,
Figure 112009034309877-PCT00001
이다.
세룰레닌은 지방산 신타제의 축합 효소의 활성 부위의 중요한 시스테인 티올 그룹에 공유 결합하여 당해 핵심적인 효소 단계를 불활성화시킨다[참조: Funabashi, et al., J. Biochem., 105:751-755, 1989]. 세룰레닌이 다른 활성을 지닌 것으로 인지되지만, 이들은 사람 세포의 관련 모델일 수 없는 미생물에서 발생하거나(예: 진균에서 콜레스테롤 합성의 억제, Omura (1976), Bacteriol. Rev., 40:681-697; 또는 바이러스에서의 감소된 RNA 합성, Perez, et al. (1991), FEBS, 280: 129-133), 실질적으로 높은 약물 농도에서 발생하거나(5mg/ml로 바이러스성 HIV 프로테아제의 억제, Moelling, et al. (1990), FEBS, 261:373-377), 또는 내인성 지방산 합성 억제의 직접적인 결과일 수 있다(B 림프구 및 대식세포에서 항원 처리의 억제, Falo, et al. (1987), J. Immunol., 139:3918-3923). 일부 데이터는 세룰레닌이 단백질의 미리스토일화를 특이하게 억제하지 못함을 암시한다[참조: Simon, et al., J. Biol. Chem., 267:3922-3931, 1992].
몇몇 추가의 FAS 억제제가 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제5,614,551호에 개시되어 있다. 지방산 신타제, 시트레이트 리아제, 아세틸 CoA 카복실라제 및 말릭 효소의 억제제가 포함되어 있다.
토모다(Tomoda) 및 동료들은 트리악신 C(Triacsin C, 종종 WS-1228A라고 한다), 스트렙토마이세스종(Streptomyces sp .) SK-1894의 생성물인 천연적으로 발생하는 아실-CoA 신타제 억제제를 기재하고 있다[참조: Tomoda et.al., Biochim. Biophys. Act 921:595-598 1987; Omura el. al., J. Antibiotics 39:1211-1218 1986]. 트리악신 C의 화학 구조는 1-하이드록시-3-(E,E,E-2',4',7'-운데카트리에닐리딘) 트리아젠이다. 트리악신 C는 8.7μM로 래트 간 아실-CoA 신타제를 50% 억제하고; 관련 화합물 트리악신 A는 장쇄 지방산과 경쟁하는 메카니즘에 의해 아실 CoA-신타제를 억제한다. 아실-CoA 신테타제의 억제는 동물 세포에 대해 독성이다. 토모다는 트리악신 C가 1.0μM로 라지(Raji) 세포의 성장을 억제하고, 베로(Vero) 및 헬라(Hela) 세포의 성장을 억제하는 것으로 또한 밝혀졌음을 교시한다[참조: Tomoda et. al., J. Biol. Chem. 266:4214-4219, 1991]. 토모다는 추가로 아실-CoA 신테타제가 동물 세포에 필수적이고 당해 효소의 억제는 치명적인 효과를 가짐을 교시한다.
화합물(감마-치환된-알파-메틸렌-베타-카복시-감마-부티로락톤)류는 미국 특허 제5,981,575호(이는 본원에 참고로 인용된다)에 지방산 합성을 억제하고, 종양 세포의 성장을 억제하고, 체중 감소를 유발하는 것으로 밝혀져 있다. 미국 특허 제5,981,575호에 기재된 화합물은 치료 적용면에서 자연 생성물인 세룰레닌을 능가하는 몇 가지 이점을 갖고 있다: [1] 이는 세룰레닌의 고 반응성 에폭사이드 그룹을 함유하지 않고, [2] 이는 안정하고 수용액에 가용성이고, [3] 이는 2단계 합성 반응에 의해 생산될 수 있어 대량으로 쉽게 생산될 수 있고, [4] 이는 생화학적 및 약리학적 분석에 대해 고 특이 활성으로 쉽게 삼중수소화된다. 지방산 신타제 억제제인 이러한 부류의 화합물의 합성은, 이의 용도가 FAS를 발현하는 종양 세포를 처리하기 위한 수단 및 체중 감소를 위한 수단인 것으로 미국 특허 제5,981,575호에 기재되어 있다. 미국 특허 제5,981,575호는 또한 체중 감소를 위한 수단으로서 지방세포 덩어리(지방세포 수 또는 용적)를 체계적으로 감소시키는 임의의 지방산 신타제 억제제의 용도를 개시하고 있다.
마우스 및 사람의 지방산 합성을 위한 주요 부위는 간[참조: Roncari, Can. J. Biochem., 52:221-230, 1974; Triscari et al., 1985, Metabolism, 34:580-7; Barakat et al., 1991, Metabolism, 40:280-5], 수유 유선[참조: Thompson, et al., Pediatr. Res., 19:139-143, 1985] 및 지방 조직[참조: Goldrick et al., 1974, Clin. Sci. Mol. Med., 46:469-79]이다.
항균제로서 지방산 합성의 억제제
세룰레닌은 세팔로스포륨 새룰렌(Cephalosporium caerulens)의 배양액으로부터 잠재적인 항진균성 항생제로서 최초 분리되었다. 구조적으로 세룰레닌은 (2R,3S)-에폭시-4-옥소-7,10-트랜스,트랜스-도데칸산 아미드로 확인되었다. 이의 작용 기전은 지방산의 생합성에 필요한 축합 효소인 베타-케토아실-ACP 신타제의 비가역적 결합을 통해 억제되는 것으로 밝혀졌다. 세룰레닌은 주로 칸디다(Candida) 및 사카로마이세스 종(Saccharomyces sp .)에 대한 항진균제로서 분류되었다. 또한, 일부 시험관내 활성이 몇몇 박테리아, 악티노마이세트(actinomycete) 및 마이코박테리아에 대해 밝혀졌지만, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 대한 활성은 발견되지 않았다. 특히 지방산 합성 억제제 및 세룰레닌의 활성은 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)와 같은 원생동물 또는 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 기아르디아 람블리아(Giardia lamblia), 플라스모디움종(Plasmodium sp .), 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis), 그립토스포리디움(Cryptosporidium), 트리파노소마(Trypanosoma), 라이슈마니아(Leishmania) 및 시스토소마(Schistosoma)와 같은 기타 감염성 진핵 병원체에 대해서는 평가되지 않았다.
특히 치료에 민감한 감염성 질환은 감염된 동물의 접근가능한 외부 표면에 병변을 야기하는 질환이다. 접근가능한 외부 표면은 피부 표면 자체, 점막, 예를 들면, 코, 입, 위장 또는 비뇨생식기 표면을 덮고 있는 점막, 및 폐 표면, 예를 들면, 폐포낭을 포함하여, 비침해 수단에 의해 (피부를 절단하거나 천공시키지 않고) 도달할 수 있는 모든 표면을 포함한다. 감염되기 쉬운 질환에는 (1) 피부 진균증 또는 백선, 특히 마이크로스포룸(Microsporum), 트리코피톤(Trichophyton), 에피더모피톤(Epidermophyton) 또는 무코쿠태니어스 칸디디아시스(Mucocutaneous candidiasis)에 의해 발병된 경우, (2) 진균성 각막염, 특히 아스페르길루스(Aspergillus), 푸사리움(Fusarium) 또는 칸디다(Candida)에 의해 발병된 경우; (3) 아메바성 각막염, 특히 아칸타모에바(Acanthamoeba)에 의해 발병된 경우; (4) 위장관 질환, 특히 기아르디아 람블리아, 엔타모에바(Entamoeba), 크립토스포리디움, 마이크로스포리디움(Microsporidium) 또는 칸디다(면역손상 동물에서 가장 흔함)에 의해 발병된 경우; (5) 비뇨생식기 감염, 특히 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 또는 트리코모나스 바지날리스에 의해 발병된 경우; 및 (6) 폐 질환, 특히 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 아스페르길루스 또는 뉴모시스티스 카리니에 의해 발병된 경우를 포함한다. 지방산 합성 억제제를 사용한 치료에 민감한 감염성 유기체에는 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 특히 다수-약물 내성 균주, 및 원생동물, 예를 들면, 톡소플라스마(Toxoplasma)가 포함된다.
지방산 합성을 억제하는 어떤 화합물이든 미생물 세포 성장을 억제하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 환자에게 투여되는 화합물은 환자와 표적 미생물 세포 둘 다에 대해 동일한 독성을 가져서는 안된다. 따라서, 표적 미생물 세포에만 또는 표적 미생물 세포에 주로 영향을 미치는 억제제를 선택하는 것이 유리하다.
자체 내인적으로 합성되는 지방산에 의존하는 진핵 미생물 세포는 제I형 FAS를 발현할 것이다. 이는 FAS 억제제가 성장 억제성이라는 사실과 외인적으로 첨가된 지방산이 FAS 억제제로부터 정상 환자 세포는 보호할 수 있지만 이들 미생물 세포는 보호할 수 없다는 사실에 의해 입증된다. 그러므로, 세포에 의해 지방산의 합성을 방지하는 제제를 감염 치료에 사용할 수 있다. 진핵생물에서, 지방산은 기질 아세틸 CoA, 말로닐 CoA 및 NADPH를 사용하는 제I형 FAS에 의해 합성된다. 따라서, 이들 경로에 기질을 공급할 수 있는 기타 효소가 또한 지방산 합성 속도에 영향을 미칠 수 있어 내인적으로 합성되는 지방산에 의존하는 미생물에 있어서 중요할 수 있다. 이들 효소들 중 어느 하나의 발현 또는 활성의 억제는 내인적으로 합성되는 지방산에 의존하는 미생물 세포의 성장에 영향을 미칠 것이다.
제I형 FAS의 생성물은 다양한 유기체에서 상이하다. 예를 들면, 진균 에스. 세레비시애(S. cerevisiae)에서, 생성물은 주로 조효소-A로 에스테르화된 팔미테이트 및 스테아레이트이다. 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)에서, 생성물은 탄소수 16 내지 24의 포화 지방산 CoA 에스테르이다. 이들 지질은 흔히 추가로 처리되어 각종 지질 성분에 대한 세포 요구를 충족시킨다.
다운스트림 가공에서 핵심단계의 억제 또는 지방산의 이용은 세포가 내인성 지방산에 의존하든 세포 외부로부터 공급되는 지방산을 이용하든간에 세포 작용을 억제하므로, 이들 다운스트림 단계의 억제제는 내인성 지방산에 의존하는 미생물 세포에 대해 충분히 선택성일 수 없을 것으로 예상할 수 있다. 그러나, 제I형 지방산 합성 억제제를 이러한 미생물에 투여함으로써 이들이 다운스트림 지방산 처리 및/또는 이용의 억제제에 의한 억제에 보다 민감할 수 있음을 발견하였다. 이러한 상승작용으로 인해, 지방산 합성 억제제를 지질 생합성 및/또는 이용의 다운스트림 단계의 억제제 하나 이상과 함께 투여함으로써 내인적으로 합성되는 지방산에 의존하는 미생물 세포에 선택적으로 영향을 미칠 것이다. 바람직한 배합은 FAS의 억제제와 아세틸 CoA 카복실라제, 또는 FAS와 MAS의 억제제를 포함한다.
포유동물이 제I형 FAS를 발현하는 유기체의 세포에 의해 감염된 것으로 결정되었을 경우 또는 FAS가 환자로부터의 생물학적 유체에서 발견된 경우, 포유동물 또는 환자는 지방산 합성 억제제를 투여함으로써 치료할 수 있다(미국 특허 제5,614,551호).
암 세포의 성장을 억제하기 위해 FAS 억제제를 사용하는 것이 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제5,759,837호에 기재되어 있다. 당해 특허는 본원에 개시된 화합물을 기재하거나 개시하고 있지 않다.
FAS 억제제로서 작용할 수 있는 한 부류의 화합물이 본원에 참고로 인용된 국제 공개공보 제WO 2004/005277호에 기재되어 있다. 당해 공보는 본원에 청구된 화합물 중의 하나를 기재하거나 개시하고 있지 않다.
발명의 개요
여러 가지 치료학적으로 유용한 특성, 예를 들면, FAS 억제성, 항암성 및 항미생물성을 갖는 새로운 부류의 화합물을 밝혀냈다.
본 발명의 목적은 약제학적 희석제와 화학식 I의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함으로써 동물 및 사람의 체중 감량을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 약제학적 희석제와 화학식 I의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함으로써 동물 및 사람의 지방산 신타제 활성을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 약제학적 희석제와 화학식 I의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함으로써 동물 및 사람의 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약제학적 희석제와 화학식 I의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함으로써 동물 및 사람의 암 세포의 성장을 방지하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약제학적 희석제와 화학식 I의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함으로써 침투성 미생물 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 화합물 및 중간체를 제조하기 위한 합성 도식을 보여준다.
도 2는 본 발명의 화합물을 제조하기 위한 합성 도식을 보여준다.
본 발명의 화합물은 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다. 다수의 화합물의 합성이 실시예에 기재되어 있다. 당해 화합물은 비만, 암 또는 미생물계 감염 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 한 양태는 화학식 I의 화합물이다.
Figure 112009034309877-PCT00002
위의 화학식 I에서,
R1은 H, C1-C2O 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬 또는 알킬아릴, 시아노메틸, -OCH3, -OC(O)CH3 또는 -OC(O)CF3이고,
R2는 -OCH2C(O)NHNH-R5이고, 여기서, R5는
(a) 할로겐, C1-C8 알킬(이는 할로겐에 의해 임의로 치환된다), -OH 및 -OR6(여기서, R6은 할로겐에 의해 임의로 치환된 C1-C8 알킬이다) 중의 하나 이상에 의해 임의로 치환된 페닐,
(b) 할로겐, -OH 또는 -OR6(여기서, R6은 할로겐에 의해 임의로 치환된 C1-C8 알킬이다)에 의해 임의로 치환된 2-피리딜, 3-피리딜 또는 4-피리딜,
(c) 이미다졸, 티아졸, 벤즈이미다졸, 벤즈옥사졸, 벤즈티아졸, 테트라졸, 트리아졸 및 아미노티아졸로 이루어진 그룹으로부터 선택된 헤테로사이클 또는
(d) -C(O)R7(여기서, R7은 C1-C2O 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬 또는 알킬아릴이거나, 피리딜, 이미다졸, 티아졸, 벤즈이미다졸, 벤즈옥사졸, 벤즈티아졸, 테트라졸, 트리아졸 및 아미노티아졸로 이루어진 그룹으로부터 선택된 헤테로사이클이다)이고,
R3 및 R4는 서로 동일하거나 상이하고, C1-C2O 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬 또는 알킬아릴이고,
단, R1이 -H, -OCH3 또는 -OC(O)CF3이고, R3이 -(CH2)7CH3인 경우, R2는 -OCH2C(O)NHNH-R5(여기서, R5는 -p-C6H4Cl, -C(O)CH3 또는
Figure 112009034309877-PCT00003
이다)가 아니다.
적용되는 경우, 상기 화합물의 케토-호변이성체 형태도 화학식 I의 화합물에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
바람직한 양태에서, R1은 H이다.
또 다른 바람직한 양태에서, R5는 C1-C10 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬 또는 알킬아릴이다.
또 다른 바람직한 양태에서, R3은 -H 또는 -CH3이다.
또 다른 바람직한 양태에서, R4는 n-C6-C8 알킬이다.
또 다른 바람직한 양태에서, R6은 C1-C1O 알킬이다.
본 발명의 또 다른 양태는 약제학적 희석제와 화학식 I의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 발명의 조성물은 정제, 캡슐제, 환제, 산제, 과립제, 멸균 비경구 용액 또는 현탁액, 경구 용액 또는 현탁액, 적합한 양의 당해 화합물을 함유하는 수중유 및 유중수 유액, 좌제 및 유체 현탁액 또는 용액과 같은 단위 투여 형태로 사람 및 기타 동물에 투여하기 위해 제공될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적 희석제" 및 "약제학적 담체"는 동일한 의미를 갖는다. 경구 투여를 위해서, 고형 또는 유체 단위 투여 형태가 제조될 수 있다. 정제와 같은 고형 조성물을 제조하기 위해서, 당해 화합물을 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 인산이칼슘, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 황산칼슘, 전분, 락토즈, 아카시아, 메틸셀룰로스, 및 약제학적 희석제 또는 담체와 작용이 유사한 물질과 같은 통상적인 성분과 혼합할 수 있다. 캡슐제는 화합물을 불활성 약제학적 희석제와 혼합하고, 당해 혼합물을 적합한 크기의 경질 젤라틴 캡슐에 충전시킴으로써 제조한다. 연질 젤라틴 캡슐은 화합물과 허용되는 식물성 오일, 경질 액체 광유 또는 기타 불활성 오일과의 슬러리를 기계로 캡슐화하여 제조한다.
시럽제, 엘릭서제 및 현탁액과 같은 유체 단위 투여 형태 또는 경구 투여 형태를 제조할 수 있다. 당해 형태는 수성 비히클에 당 또는 또 다른 감미제, 방향족 향미제 및 보존제와 함께 용해시켜 시럽제를 형성시킬 수 있다. 현탁액은 수성 비히클을 사용하고 아카시아, 트라가칸트, 메틸셀룰로스 등과 같은 현탁제의 도움으로 제조할 수 있다.
비경구 투여를 위한 유체 단위 투여 형태는 화합물과 멸균 비히클을 사용하여 제조할 수 있다. 용액 제조시, 화합물을 주사용수에 용해시키고 필터 멸균시킨 후, 적합한 바이알 또는 앰풀에 충전시키고 밀봉시킬 수 있다. 국소 마취제, 보존제 및 완충제와 같은 애쥬번트를 비히클에 용해시킬 수 있다. 조성물을 바이알에 충전시킨 후에 동결시키고, 물을 진공하에 제거할 수 있다. 이어서, 동결건조된 분말을 바이알 속에서 스케일링하여 사용 전에 재구성할 수 있다.
본 발명의 화합물에 대해 계획된 임상 치료 징후는 다음을 포함한다: (1) 스타필로코시(staphylococci) 및 엔테로코시(enterococci)와 같은 침투성 미생물로 인한 감염; (2) 세포가 지방산 신타제를 과발현하는 다수의 조직에서 발생하는 암; 및 (3) 지나친 열량의 섭취로 인한 비만. 투여량 및 치료 기간은 (1) 환자의 연령, 체중 및 기관 기능(예: 간 및 신장 기능); (2) 치료될 질환 진행의 특성 및 정도 및 임의로 존재하는 중대한 동반 이환 및 복용되는 동시 약제; 및 (3) 투여 경로, 치료를 수행하기 위한 투여 빈도 및 기간, 및 약물의 치료 지수를 포함하여 다양한 인자에 좌우될 것이다. 일반적으로, 투여량은 표적 부위에서 대략 1μg/ml 내지 10μg/ml의 유효 농도를 달성하기 위해서 1ng/ml 내지 100ng/ml의 혈청 수준 을 이루도록 선택된다.
본 발명은 다음 실시예에 의해 예시되지만 이로써 제한되는 것은 아니다:
본 발명에 따르는 일련의 화합물을 아래에 설명된 바와 같이 합성하였다. 몇몇 화합물의 생물학적 활성을 다음과 같이 프로파일하였다: 화합물을 다음 중에서 적어도 몇 가지에 대해 시험하였다: [1] 정제된 사람 FAS의 억제, [2] 전 세포에서의 지방산 합성 활성의 억제 및 [3] 크리스탈 바이올렛 및 XTT 분석을 사용하여 높은 수준의 FAS 및 지방산 합성 활성을 갖는 것으로 알려진 배양된 MCF-7 사람 유방암 세포에 대한 세포독성. 세포독성 수준이 낮은 화합물을 선택한 후 Balb/C 마우스의 체중 감소에 대해 시험하였다. 몇몇 화합물은 또한 그람양성균 및/또는 그람음성균에 대한 활성에 대해 시험하였다.
화합물의 화학적 합성
O-아세트산 하이드라지드를 함유하는 TLM 유도체의 합성
Figure 112009034309877-PCT00004
옥틸 트리플레이트(1). -40℃로 냉각된 CH2Cl2(212mL) 중의 옥탄올(4.6g, 35.3mmol)에 피리딘(CaH2로부터 새로 증류, 3.28mL, 40.6mmol) 및 트리플산 무수물(6.41mL, 38.1mmol)을 가하고, 용액을 -40℃에서 20분 동안 교반시켰다. 이어 서, 반응 혼합물을 3시간에 걸쳐 서서히 실온으로 가온하였다. 백색 고형물을 셀라이트를 통해 여과하고, 펜탄(2 x 70mL)으로 세척하였다. 용매 약 5 내지 10mL가 남도록 대부분의 용매를 증발시키고, 백색 침전물을 얻었다. 고온 펜탄(70mL)을 가하고, 당해 혼합물을 여과하여 잔여 피리딘 염을 제거하였다. 여액을 다시 증발시켜 투명한 연한 오렌지색 오일 1을 수득(TLC에 의해 정량화, rf= 0.64 10% EtOAc/Hex)하고, 이를 즉시 사용하였다.
Figure 112009034309877-PCT00005
2,2,4-트리메틸-[1,3]옥사티올란-5-온(2). 0℃로 냉각된 티오락트산(14.0g, 132.0mmol)에 2-메톡시프로펜(50.5mL, 528mmol)을 첨가 깔때기를 사용하여 적가하였다. 용액을 실온으로 가온시킨 후, 48시간 동안 가열 환류시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, Et2O(200mL)를 가하고, 당해 혼합물을 Na2CO3(1N, 3 x 150mL)로 추출하고, 식염수(2 x 100mL)로 세척하였다. 합한 유기물을 건조(MgSO4)시키고, 여과한 후, 증발시켜 황색 조 오일을 수득하고, 이를 80 내지 95℃에서 증류(H2O 흡인기 압력, 25 내지 35torr)하여 순수한 2(9.9g, 52%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.56 (d, J= 6.9 Hz, 3 H), 1.72 (s, 3 H), 1.74 (s, 3 H), 4.10 (q, J= 6.9 Hz, 1 H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3 ) δ 17.9, 30.8, 31.4, 42.5, 86.2, 175.0.
Figure 112009034309877-PCT00006
2,2,4-트리메틸-4-옥틸-[1,3]-옥사티올란-5-온(3). -78℃에서 THF(47mL) 중의 LiHMDS(31.7mL, 31.7mmol, THF 중의 1M)의 혼합물에 THF(47mL) 중의 2(4.3g, 29.4mmol)를 캐뉼러로 적가하고, 생성된 황색 용액을 -78℃에서 30분 동안 교반시켰다. 이어서, 펜탄(8mL) 중의 옥틸 트리플레이트 1(9.0g, 35mmol)을 캐뉼라를 통해 -78℃의 에놀레이트 용액에 실온에서 서서히 가하였다. -78℃에서 2시간 동안 교반시킨 후, 1N HCl(200mL)을 가하고, 용액을 Et2O(3 x 75mL)로 추출하였다. 합한 유기물을 건조(MgSO4)시키고, 여과한 후, 증발시켰다. 플래쉬 크로마토그래피(2% EtOAc/헥산)를 통해 순수한 3(5.45g, 72%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.86 (bs, 3 H), 1.25 (m, 10 H), 1.63 (s, 3 H), 1.73 (s, 3 H), 1.80 (s, 3 H), 1.5-1.81 (m, 4 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 14.0, 22.6, 25.5, 29.0, 29.1, 29.3, 29.4, 31.8, 32.5, 33.5, 41.4, 58.1, 84.7, 177.7.
Figure 112009034309877-PCT00007
2-아세틸설파닐-2-메틸-데칸산 에틸 에스테르(4). EtOH(무수, 14.6mL) 중의 3(5.33g, 20.6mmol)에 NaOEt(2.1M, 12.7mL, 26.9mmol)[EtOH(24mL) 중의 Na 금 속(1.24g, 54mmol)으로부터 새로 제조]를 가하고, 용액을 실온에서 교반시켰다. 30분 후, 용액을 NH4Cl(포화)/1N HCl(100mL, 3:2)에 부어 넣고, Et2O(3 x 75mL)로 추출하였다. 이어서, 합한 유기물을 H2O로 철저히 세척하고, 건조(MgSO4)시킨 후, 여과하고, 증발시킨 다음, CH2Cl2(129mL)에 재용해시켰다. 당해 예비냉각된 용액(0℃)에 NEt3(4.3mL, 30.9mmol) 및 아세틸 클로라이드(3.2mL, 41.2mmol)를 가하였다. 0℃에서 40분 후, NH4Cl(포화)(200mL)을 가하고, 용액을 CH2Cl2(3 x 70mL)로 추출하였다. 합한 유기물을 건조(MgSO4)시키고, 여과한 후, 증발시켰다. 플래쉬 크로마토그래피(5% EtOAc/헥산)를 통해 순수한 4(3.1g, 54%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.87 (t, J= 6.9 Hz, 3 H), 1.22-1.27 (m, 15 H), 1.61 (s, 3 H), 1.75-1.84 (m, 2 H), 2.26 (s, 3 H), 4.18 (q, J= 7.1 Hz, 2 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3). δ 13.9, 14.1, 22.6, 23.4, 24.4, 29.1, 29.2, 29.6, 30.3, 31.8, 38.3, 55.8, 61.5, 173.1, 195.8. IR (NaCl) 3430, 1868, 1693, 1644 cm-1; 분석치 (C15H28O3S) C, 62.5; H, 9.78; 실측치: C, 62.6; H, 9.83.
Figure 112009034309877-PCT00008
4-하이드록시-5-메틸-5-옥틸-5-H-티오펜-2-온(5). -78℃에서 THF(155mL) 중의 4(3.11g, 10.8mmol)에 LiHMDS(13.4mL, 13.4mmol, THF 중의 1.0M)를 가하고, 용액을 2시간 동안 -5℃까지 서서히 가온시킨 후, 추가로 20분 동안 -5℃에서 유지시켰다. 이어서, 용액을 1N HCl(200mL)에 부어 넣고, Et2O(3 x 100mL)로 추출하였다. 합한 유기물을 건조(MgSO4)시키고, 여과한 후, 증발시켰다. 플래쉬 크로마토그래피(20% EtOAc/2% CH3CO2H/헥산)를 통해 5(1.2g, 46%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3)(케토-호변이성체) δ 0.86 (t, J= 6.7 Hz, 3 H), 1.19-1.24 (m, 1O H), 1.48-1.53 (m, 2 H), 1.65 (s, 3 H), 1.77-1.85 (m, 1 H), 1.94-2.01 (m, 1 H), 3.36 (s, 2 H); 1H NMR (300 MHz, MeOD) (엔올 호변이성체) 0.87-0.89 (m, 3 H), 1.29 (m, 10 H), 3.29 (s, 3 H), 1.81-1.87 (m, 2 H); 13C NMR (75 MHz, MeOD) (에놀 호변이성체) δ 14.7, 23.8, 26.4, 27.1, 30.5, 30.6, 30.8, 33.2, 39.8, 61.3, 103.1 (m), 189.8, 197.8. IR (NaCl) 3422, 1593 cm-1; 분석치(C13H22O2S), C, 64.4; H, 9.15; 실측치: C, 64.3; H, 9.10.
Figure 112009034309877-PCT00009
5-메틸-5-옥틸-2-옥소-티오펜-4-일옥시)-아세트산 3급-부틸 에스테르(7). -40℃로 냉각된 DMF(23mL) 중의 5(1.4g, 5.8mmol)에 NaH(326mg, 8.15mmol, 광유 중의 60%)를 가하고, 용액을 가온시키고, 0℃에서 30분 동안 교반시켰다. 이어서, 3급-부틸 브로모아세테이트 6(1.29mL, 8.73mmol)을 바로 가하고, 혼합물을 가온시키고, 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. NH4Cl(포화)/1N HCl(6:1, 100mL)을 가하고, 용액을 Et2O(3 x 70mL)로 추출하였다. 합한 유기물을 H2O로 세척하고, 건조(MgSO4)시킨 후, 여과하고, 증발시켰다. 플래쉬 크로마토그래피(15% EtOAc/헥산)를 통해 순수한 7(1.7g, 82%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.86 (t, J= 6.9 Hz, 3 H), 1.24 (s, 12 H), 1.49 (s, 9 H), 1.68 (s, 3 H), 1.83-1.86 (m, 2 H), 4.43 (s, 2 H), 5.19 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 14.0, 22.6, 25.2, 26.3, 28.1, 29.2, 29.3, 29.5, 31.8, 38.9, 59.7, 68.5, 83.4, 102.1, 165.2, 185.5, 193.4. 분석치(C19H32O4S) C, 64.0; H, 9.05; 실측치: C, 64.1, H, 9.08.
Figure 112009034309877-PCT00010
5-메틸-5-옥틸-2-옥소-티오펜-4-일옥시)-아세트산(8). CH2Cl2(32mL)에 용해시킨 7(1.7g, 4.7mmol)에 트리플르오로아세트산(TFA)(9.1mL)을 가하고, 용액을 실온에서 4 내지 5시간 동안 교반시켰다. 용매를 증발시키고, 조 물질을 크로마토그 래피(40% EtOAc/2% CH3CO2H/헥산)하여 순수한 8(1.1, 77%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.86 (t, J = 6.9 Hz, 3 H), 1.24 (s, 11 H), 1.47-1.48 (m, 1 H), 1.68 (s, 3 H), 1.84-1.88 (m, 2 H), 4.62 (s, 2 H), 5.31 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 14.1, 22.6, 25.1, 26.1, 29.2, 29.3, 29.5, 31.8, 38.9, 60.1, 67.7, 102.4, 169.8, 185.8, 195.4. IR (NaCl) 3442, 1645 cm-1; 분석치(C15H24O4S) C, 59.9; H, 8.05; 실측치: C, 60.0; H, 8.09.
Figure 112009034309877-PCT00011
(5-메틸-5-옥틸-2-옥소-티오펜-4-일옥시)-아세트산-N'-(4-클로로페닐)-하이드라지드(9). CH2Cl2(17.3mL) 중의 8(1.1g, 3.67mmol)의 냉각된 용액(O℃)에 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)(1.4g, 7.3mmol), 4-클로로페닐하이드라진 하이드로클로라이드(854mg, 4.77mmol), NEt3(0.51mL, 3.67mmol) 및 DMAP(67mg, 0.55mmol)를 가하였다. 당해 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반시킨 후, 실온으로 가온시키고, 12시간 동안 교반시켰다. 용액을 NH4Cl포화:HCl(1N)(4:1, 100ml)에 부어 넣고, CH2Cl2(3 x 30ml)로 추출하였다. 합한 유기물을 건조(MgSO4)시키고, 여과한 후, 증발시켜 조생성물 9를 수득하였다. 플래쉬 크로마토그래피[30% EtOAc/Hex(부산물 제거)- 이어서 35% EtOAc/Hex(500mL)- 40% EtOAc/Hex(300mL)]를 통해 순수한 9(1.2g, 77%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.86 (t, J= 6 Hz, 3 H), 1.24 (m, 11 H), 1.46-1.54 (m, 1 H), 1.71 (s, 3 H), 1.82-1.90 (m, 2 H), 4.57 (s, 2 H), 5.39 (s, 1 H), 6.75 (d, J= 8.8 Hz, 2 H), 7.18 (d, J= 8.8 Hz, 2 H), 7.38 (s, 1 H), 8.09 (s, 1 H); 13C NMR(1OO MHz, CDCl3) δ 14.1, 22.6, 25.3, 26.1, 29.2, 29.3, 29.5, 31.8, 38.8, 59.7, 69.7, 103.2, 114.7, 126.4, 145.8, 129.2, 165.9, 184.3, 193.5. IR (NaCl) 2957, 1695, 1658, 1609 cm-1.
일반적인 과정 A:
CH2Cl2(1.0mL) 중의 8(0.05mmol, 1.0당량)의 냉각된 용액(0℃)에 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)(0.1mmol, 2.0당량), 하이드라진 유도체(0.065mmol, 1.3당량) 및 DMAP(0.0075mmol, 0.15당량)를 가하고, 하이드로클로라이드 염이 반응에 사용되는 경우, 트리에틸 아민(1.0당량)을 가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반시킨 후, 실온으로 가온시키고, 12시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 CH2Cl2가 충전된 실리카 겔 컬럼으로 옮겼다. 플 래쉬 크로마토그래피(20% 에테르/CH2Cl2)를 통해 순수한 생성물을 수득하였다.
Figure 112009034309877-PCT00012
(5-메틸-5-옥틸-2-옥소-티오펜-4-일옥시)-아세트산-N'-페닐하이드라지드(10). 8(15.0mg, 0.05mmol) 및 페닐하이드라진(6.4μL, 0.065mmol)에 상기 일반적인 과정 A에 따라서 수행하여 화합물 10(15.0mg, 77%)을 오일(시스:트랜스 비 - 27:73)로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.80 (t, J= 8.0 Hz, 3 H), 1.10-1.24 (m, 11 H), 1.41-1.51 (m, 1 H), 1.66 (s, 3 H), 1.78-1.84 (m, 2 H), 4.50 (s, 2 H), 5.33 (s, 1 H), 6.75 (dd, J= 1.2, 8.0 Hz, 2 H), 6.90 (dd, J= 8.0, 16.0 Hz, 1 H), 7.20 (dd, J= 8.0, 16.0 Hz, 2 H), 8.03(s, 1 H); 시스 화합물에 대한 대표적인 피크: 1.62 (s, 3 H), 4.75 (s, 2 H), 5.13 (s, 1 H); 13C NMR (1OO MHz, CDCl3) δ 14.1, 22.6, 25.4, 26.3, 29.2, 29.3, 29.5, 31.8, 39.0, 59.4, 70.0, 103.5, 113.6, 122.0, 129.4, 147.0, 165.6, 183.9, 193.0.
Figure 112009034309877-PCT00013
(5-메틸-5-옥틸-2-옥소-티오펜-4-일옥시)-아세트산-N'-(3-메틸페닐)-하이드라지드(11). 8(15.0mg, 0.05mmol) 및 1-(3-메틸페닐)하이드라진 하이드로클로라이드(10.2mg, 0.065mmol)에 상기 일반적인 과정 A에 따라서 수행하여 화합물 11(7.0mg, 35%)을 오일(시스:트랜스 비 - 29:71)로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.87 (t, J= 8.0 Hz, 3 H), 1.19-1.29 (m, 11 H), 1.51-1.57 (m, 1 H), 1.74 (s, 3 H), 1.85-1.91 (m, 2 H), 2.30 (s, 3 H), 4.59 (s, 2 H), 5.14 (s, 1 H), 6.62-6.65 (m, 2 H), 6.77 (d, J= 8.0 Hz, 1 H), 7.07-7.19 (m, 1 H), 7.93(s, 1 H); 시스 화합물에 대한 대표적인 피크: 1.69 (s, 3 H), 2.33 (s, 3 H), 4.82 (s, 2 H), 5.23 (s, 1 H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 14.1, 21.5, 22.6, 25.0, 26.4, 29.2, 29.4, 29.6, 31.8, 38.5, 59.0, 70.0, 103.0, 110.5, 114.0, 122.5, 129.0, 139.0, 147.0, 165.0, 184.0, 193.0.
Figure 112009034309877-PCT00014
(5-메틸-5-옥틸-2-옥소-티오펜-4-일옥시)-아세트산-N'-(4-트리플루오로메틸페닐)-하이드라지드(12). 8(15.0mg, 0.05mmol) 및 1-[4-(트리플루오로메틸)-페닐]하이드라진 하이드로클로라이드(14.0mg, 0.065mmol)에 상기 일반적인 과정 A에 따라서 수행하여 화합물 12(12.0mg, 53%)를 오일(시스:트랜스 비 - 17:83)로서 수득 하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.80 (t, J= 8.0 Hz, 3 H), 1.10-1.25 (m, 11 H), 1.45-1.51 (m, 1 H), 1.68 (s, 3 H), 1.78-1.85 (m, 2 H), 4.56 (s, 2 H), 5.36 (s, 1 H), 6.29 (s, 1 H), 6.81 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.43 (d, J= 8.0 Hz, 2 H), 7.94 (s, 1H); 시스 화합물에 대한 대표적인 피크: 1.62 (s, 3 H), 4.74 (s, 2 H), 5.18 (s, 1 H).
Figure 112009034309877-PCT00015
(5-메틸-5-옥틸-2-옥소-티오펜-4-일옥시)-아세트산-N'-(4-메톡시페닐)-하이드라지드(13). 8(15.0mg, 0.05mmol) 및 1-(4-메톡시페닐)하이드라진 하이드로클로라이드(11.3mg, 0.065mmol)에 상기 일반적인 과정 A에 따라서 수행하여 화합물 13(7.0mg, 33%)을 오일(시스:트랜스 비 - 25:75)로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.80 (t, J= 8.0 Hz, 3 H), 1.08-1.24 (m, 11 H), 1.41-1.51 (m, 1 H), 1.66 (s, 3 H), 1.80-1.84 (m, 2 H), 3.69 (s, 3 H), 4.50 (s, 2 H), 5.33 (s, 1 H), 6.76 (s, 4 H), 7.90 (s, 1H); 시스 화합물에 대한 대표적인 피크: 1.63 (s, 3 H), 3.71 (s, 3H), 4.76 (s, 2 H), 5.15 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 14.1, 22.6, 25.4, 26.4, 29.2, 29.4, 29.5, 31.8, 39.0, 55.6, 59.4, 69.9, 103.5, 114.3, 114.7, 139.7, 155.3, 165.5, 183.8, 192.9.
Figure 112009034309877-PCT00016
(5-메틸-5-옥틸-2-옥소-티오펜-4-일옥시)-아세트산-N'-(2,4-디클로로페닐)-하이드라지드(14). 8(19.0mg, 0.063mmol) 및 1-(2,4-디클로로페닐)하이드라진 하이드로클로라이드(17.5mg, 0.082mmol)에 상기 일반적인 과정 A에 따라서 수행하여 화합물 14 (17.0mg, 59%)를 고체(시스:트랜스 비 - 20:80)로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.86 (t, J= 7.2 Hz, 3 H), 1.15-1.31 (m, 11 H), 1.42-1.51 (m, 1 H), 1.72 (s, 3 H), 1.82-1.90 (m, 2 H), 4.77 (s, 2 H), 5.41 (s, 1 H), 6.38 (s, 1 H), 6.76 (d, J= 8.4 Hz, 1 H), 7.14 (dd, J= 2.0, 8.4 Hz, 1 H), 7.32 (d, J= 2.0 Hz, 1 H), 8.11 (s, IH); 시스 화합물에 대한 대표적인 피크: 1.65 (s, 3 H), 4.75 (s, 2 H), 5.20 (s, 1 H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 14.1, 22.6, 25.4, 26.3, 29.2, 29.4, 29.5, 31.8, 39.0, 59.5, 69.8, 103.5, 114.4, 120.5, 126.5, 127.8, 129.4, 141.9, 165.5, 183.9, 193.0.
Figure 112009034309877-PCT00017
(5-메틸-5-옥틸-2-옥소-티오펜-4-일옥시)-아세트산-N'-(3,4-디클로로페닐)- 하이드라지드(15). 8(19.0mg, 0.063mmol) 및 1-(3,4-디클로로페닐)하이드라진 하이드로클로라이드(17.5mg, 0.082mmol)에 상기 일반적인 과정 A에 따라서 수행하여 화합물 15(12.0mg, 42%)를 반고체(시스:트랜스 비 - 17:83)로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.80 (t, J= 6.8 Hz, 3 H), 1.09-1.23 (m, 11 H), 1.36-1.53 (m, 1 H), 1.67 (s, 3 H), 1.77-1.84 (m, 2 H), 4.54 (s, 2 H), 5.35 (s, 1 H), 6.21(s, 1 H), 6.60 (dd, J= 2.4, 8.8 Hz, 1 H), 6.84 (d, J= 2.4 Hz, 1 H), 7.21 (d, J= 8.8 Hz, 1 H), 8.0 (s, 1H); 시스 화합물에 대한 대표적인 피크: 1.65 (s, 3 H), 4.73 (s, 2 H), 5.18 (s, 1 H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 14.1, 22.6, 25.4, 26.3, 29.2, 29.4, 29.5, 31.8, 39.0, 59.5, 69.8, 103.5, 113.2, 115.2, 124.8, 130.9, 133.2, 146.7, 165.9, 184.0, 193.2.
Figure 112009034309877-PCT00018
(5-메틸-5-옥틸-2-옥소-티오펜-4-일옥시)-아세트산-N'-[2-클로로-5-(트리플루오로메틸)페닐]-하이드라지드(16). 8(15.0mg, 0.05mmol) 및 1-[2-클로로-5-(트리플루오로메틸)페닐]하이드라진(13.6mg, 0.065mmol)에 상기 일반적인 과정 A에 따라서 수행하여 화합물 16(10.4mg, 42%)을 오일(시스:트랜스 비 - 14:86)로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.80 (t, J= 6.6 Hz, 3 H), 1.06-1.24 (m, 11 H), 1.41-1.50 (m, 1 H), 1.67 (s, 3 H), 1.76-1.89 (m, 2 H), 4.58 (s, 2 H), 5.37 (s, 1 H), 6.53 (d, J= 3.3 Hz, 1 H), 6.98 (d, J= 1.5 Hz, 1 H), 7.07 (dd, J= 1.8, 8.4 Hz, 1 H), 7.37 (d, J= 8.1 Hz, 1 H), 8.03 (s, 1H); 시스 화합물에 대한 대표적인 피크: 1.60 (s, 3 H), 4.77 (s, 2 H), 5.28 (s, 1 H).
Figure 112009034309877-PCT00019
(5-메틸-5-옥틸-2-옥소-티오펜-4-일옥시)-아세트산-N'-(2-벤조티아졸)-하이드라지드(17). 8(22.0mg, 0.07mmol) 및 2-하이드라지노벤조티아졸(14.6mg, 0.09mmol)에 상기 일반적인 과정 A에 따라서 수행하여 화합물 17(14.0mg, 45%)을 고체(단일 이성체)로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.88 (t, J= 6.4 Hz, 3 H), 1.26-1.83 (m, 11 H), 1.52 (m, 1 H), 1.75 (s, 3 H), 1.86-1.99 (m, 2 H), 4.86 (s, 2 H), 5.22 (s, 2 H), 5.32 (s, 1 H), 7.36 (t, J= 7.2 Hz, 1 H), 7.48 (t, J= 7.2 Hz, 1 H), 7.81 (d, J= 8.0 Hz, 1 H), 7.85 (d, J= 8.0 Hz, 1 H); 융점 151-152℃.
Figure 112009034309877-PCT00020
(5-메틸-5-옥틸-2-옥소-티오펜-4-일옥시)-아세트산-N'-[6-메틸-4-(트리플루오로메틸)-2-피리딜]-하이드라지드(18). 8(15.0mg, 0.05mmol) 및 1-[6-메틸-4-(트리플루오로메틸)-2-피리딜]하이드라진(12.5mg, 0.065mmol)에 상기 일반적인 과정 A에 따라서 수행하여 화합물 18(12.5mg, 53%)을 오일(시스:트랜스 비 - 10:90)로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.79 (t, J= 8.4 Hz, 3 H), 1.10-1.29 (m, 11 H), 1.44-1.52 (m, 1 H), 1.70 (s, 3 H), 1.82-1.89 (m, 2 H), 2.41 (s, 3 H), 4.57 (s, 2 H), 5.37 (s, 1 H), 6.59 (s, 1 H), 6.81 (s, IH), 7.31 (bs, 1 H), 8.70 (bs, 1 H); 시스 화합물에 대한 대표적인 피크: 1.62 (s, 3 H), 4.74 (s, 2 H), 5.29 (s, 1 H).
Figure 112009034309877-PCT00021
(5-메틸-5-옥틸-2-옥소-티오펜-4-일옥시)-아세트산-N'-(2-클로로페닐)-하이드라지드(19). 8(98.0mg, 0.33mmol) 및 2-클로로페닐하이드라진 하이드로클로라이드(77.0mg, 0.43mmol)에 상기 일반적인 과정 A에 따라서 수행하여 화합물 19(91.0mg, 60%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.85 (t, J= 7.0 Hz, 3 H), 1.23 (m, 11 H), 1.48-1.51 (m, 1 H), 1.69 (s, 3 H), 1.81-1.89 (m, 2 H), 4.56 (s, 2 H), 5.37 (s, 1 H), 6.49-6.51 (m, 1H), 6.84-6.94 (m, 2H), 7.12-7.35 (m, 2 H), 8.31 (d, J= 3.1 Hz, 1 H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 14.0, 22.5, 25.3, 26.2, 29.2, 29.3, 29.5, 31.7, 38.9, 59.5, 69.7, 103.3, 113.5, 119.8, 122.0, 122.7, 129.6, 142.9, 165.5, 184.1, 193.3.
Figure 112009034309877-PCT00022
(5-메틸-5-옥틸-2-옥소-티오펜-4-일옥시)-아세트산-N'-(4-피리딜)-하이드라지드(20). 8(100.0mg, 0.33mmol) 및 이소니코틴산 하이드라진(59.0mg, 0.42mmol)에 상기 일반적인 과정 A에 따라서 수행하여 화합물 20(118.0mg, 86%)을 플래쉬 크로마토그래피(5% MeOH/CHCl3) 후에 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.85 (t, J= 7.0 Hz, 3 H), 1.23 (m, 11 H), 1.44-1.45 (m, 1 H), 1.68 (s, 3 H), 1.82-1.88 (m, 2 H), 4.69 (s, 2 H), 5.42 (s, 1 H), 7.64 (d, J= 5.3 Hz, 2 H), 8.67 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 14.0, 22.5, 25.3, 26.2, 29.2, 29.3, 29.5, 31.7, 38.9, 59.5, 69.7, 103.3, 113.5, 119.8, 122.0, 122.7, 129.6, 142.9, 165.5, 184.1, 193.3.
Figure 112009034309877-PCT00023
(5-메틸-5-헥실-2-옥소-티오펜-4-일옥시)-아세트산-N'-(4-클로로페닐)-하이드라지드(21).
당해 화합물은 도 2에 도시된 반응식에 따라서 제조하였다. 26(83.0mg, 0.29mmol) 및 4-클로로페닐하이드라진 하이드로클로라이드(68.0mg, 0.38mmol)에 상기 일반적인 과정 A에 따라서 수행하여 화합물 21(34.0mg, 30%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.86 (m, 3 H), 1.26 (m, 7 H), 1.45-1.50 (m, 1 H), 1.71 (s, 3 H), 1.85-1.90 (m, 2 H), 4.57 (s, 2 H), 5.39 (s, 1 H), 6.74 (d, J= 8.8 Hz, 2 H), 7.20 (d, J= 8.8 Hz, 2 H), 7.59 (s, 1 H), 8.21 (s, 1H).
생물학적 및 생화학적 방법
ZR-75-1 사람 유방암 세포로부터 FAS의 정제
사람 FAS를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수한 배양된 ZR-75-1 사람 유방암 세포로부터 정제하였다. 문헌[참조: Linn et al., 1981, and Kuhajda et al., 1994]으로부터 변형된 과정은 저장성 용해, 연속 폴리에틸렌글리콜(PEG) 침전 및 음이온 교환 크로마토그래피를 사용한다. ZR-75-1 세포는 37℃에서 10% 소 태아 혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신을 갖는 RPMI 배지 속에서 5% CO2 하에 배양한다.
융합성 세포의 10개의 Tl50 플라스크를 용해 완충액(20mM Tris- HCl, pH 7.5, 1mM EDTA, 0.1mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF), 0.1% 이게팔(Igepal) CA-630) 1.5ml로 용해시키고, 20 스트로크 동안 얼음 위에서 다운스(dounce) 균질화한다. 용해물을 JA-20 로터(베크만(Beckman))에서 20,000rpm으로 30분 동안 4℃에서 원심분리하고, 상층액을 용해 완충액을 이용하여 42ml로 되도록 한다. 용해 완충액 중의 50% PEG 8000의 용액을 상층액에 최종 농도가 7.5%로 될 때까지 서서히 가한다. 4℃에서 60분 동안 요동시킨 후, 용액을 JA-20 로터(베크만)에서 15,000rpm으로 30분 동안 4℃에서 원심분리한다. 이어서, 고형 PEG 8000을 상층액에 최종 농도가 15%로 될 때까지 가한다. 요동 및 원심분리하는 과정을 위에서와 같이 반복한 후, 펠렛을 4℃에서 밤새 완충액 A(20mM K2HPO4, pH 7.4) 10ml에 재현탁시킨다. 0.45μM로 여과 후, 단백질 용액을 모노(Mono) Q 5/5 음이온 교환 컬럼(파마시아(Pharmacia))에 적용한다. 컬럼을 완충액 A로 15분 동안 1ml/분의 속도로 세척하고, 결합된 물질을 60분에 걸쳐 1M KCl로 선형 60-ml 구배로 용출시킨다. FAS(MW~ 270kD)는 통상적으로 0.25M KCl로 3개의 0.5ml 분획으로 용출되고, 쿠마시(Coomassie) G250 스테인(바이오-래드(Bio-Rad))으로 4-15% SDS-PAGE를 사용하여 확인된다. FAS 단백질 농도는, 쿠마시 플러스 단백질 분석 시약(Coomassie Plus Protein Assay Reagent)(피어스(Pierce))을 사용하여 표준물질로서 BSA를 사용하는 제조자 설명서(manufacturer's specification)에 따라서 측정된다. 당해 과정에 의해 쿠마시-염색된 겔에 의해 판단되는 실질적으로 순수한 FAS 제제(>95%)를 수득한다.
FAS 효소 활성의 측정 및 화합물의 IC 50 의 측정
FAS 활성을 96-웰 플레이트에서 NADPH의 말로닐-CoA 의존성 산화를 분광광도법으로 OD340에서 모니터링함으로써 측정한다[참조: Dils et al and Arslanian et al., 1975]. 각각의 웰은 2μg의 정제된 FAS, 100mM K2HPO4, pH 6.5, 1mM 디티오트레이톨(시그마(Sigma)) 및 187.5μM β-NADPH(시그마)를 함유한다. 억제제의 스톡 용액을 DMSO 중에서 2, 1 및 0.5mg/ml로 제조하고, 스톡 용액 1μl를 각각의 웰에 가하는 경우, 최종 농도는 20, 10 및 5μg/ml이다. 각각의 실험을 위해서, 세룰레닌(시그마)을 DMSO 대조군, 억제제 및 블랭크(FAS 효소 비함유)와 함께 포지티브 대조군으로서 모두 2회씩 수행한다.
분석은 몰레큘러 디바이시즈 스펙트라맥스 플러스 분광광도계(Molecular Devices SpectraMax Plus Spectrophotometer)로 수행한다. FAS 완충액, 억제제 및 대조군을 함유하는 플레이트를 37℃로 가열된 분광광도계에 위치시킨다. 반응속도 프로토콜을 사용하여, 웰을 100mM K2HPO4(pH 6.5) 100μl를 함유하는 2개의 웰로 블랭크화하고, 플레이트를 OD340에서 10초 간격으로 5분 동안 판독하여 임의의 NADPH의 말로닐-CoA 비의존성 산화를 측정한다. 당해 플레이트를 분광광도계로부터 제거하고, 말로닐-CoA(67.4μM, 웰당 최종 농도) 및 알키닐-CoA(61.8μM, 웰당 최종 농도)를 블랭크를 제외한 각각의 웰에 가한다. 플레이트를 반응속도 프로토콜에 따라서 상기와 같이 다시 판독하여 말로닐-CoA 의존성 NADPH 산화를 측정한 다. 말로닐-CoA 의존성 NADPH 산화와 비-말로닐-CoA 의존성 NADPH 산화의 ΔOD340의 차이는 비특이 FAS 활성이다. FAS 제제의 순도로 인해, 비-말로닐-CoA 의존성 NADPH 산화는 무시할만하다.
FAS에 대한 화합물의 IC50을 시험된 각각의 억제제 농도에 대한 ΔOD340을 플롯팅하고, 선형 회귀를 수행하고, 최적 맞춤선(best-fit line), r2값 및 95% 신뢰 구간을 계산함으로써 측정한다. FAS의 50% 억제를 수득하는 화합물의 농도가 IC50이다. ΔOD340 대 시간의 그래프를 각각의 화합물 농도에 대해 소프트맥스 프로(SOFTmax PRO) 소프트웨어(몰레큘라 디바이스(Molecular Devices))에 의해 작성한다. 선형 회귀, 최적 맞춤선, r2 및 95% 신뢰 구간의 계산은 프리즘 버젼(Prism Version) 3.0(그래프 패드 소프트웨어(Graph Pad Software))을 사용하여 계산된다.
크리스탈 바이올렛 세포 성장 분석
크리스탈 바이올렛 분석은 세포 성장은 측정하지만 세포독성은 측정하지 않는다. 당해 분석은 96-웰 플레이트에서의 고정 세포의 크리스탈 바이올렛 염색 후, 가용화 및 분광광도계에 의한 OD490의 측정을 적용한다. OD490은 측정된 단위 시간당 세포 성장에 상응한다. 세포를 해당 화합물 또는 비히클 대조군으로 처리하고, 각각의 화합물에 대한 IC50을 계산한다.
암 세포에 대한 특정 화합물의 세포독성을 측정하기 위해서, 10% 소 태아 혈 청, 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지 중에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 입수한 5 x 104 MCF-7 사람 유방암 세포를 24 웰 플레이트에 웰마다 플레이팅한다. 37℃에서 5% CO2 하에 밤새 배양한 후, DMSO에 용해시킨 시험될 화합물을 웰에 1μl 용량으로 50, 40, 30, 20 및 10μg/ml의 농도로 3회씩 가한다. 필요한 경우, 추가 농도를 시험한다. DMSO 1μl를 비히클 대조군으로서 3개의 웰에 가한다. C75를 10 및 5μg/ml의 농도로 포지티브 대조군으로서 3회 수행한다.
배양한 지 72시간 후, 세포를 각각의 웰에서 크리스탈 바이올렛 염색제(25% 메탄올 중의 0.5%) 0.5ml를 사용하여 염색시킨다. 10분 후, 웰을 세정하고, 공기 상에서 건조시킨 후, 2시간 동안 진탕시키면서 10% 나트륨 도데실설페이트 0.5ml로 용해시킨다. 각각의 웰로부터 100μl를 96-웰 플레이트로 옮긴 후, 플레이트를 몰레큘러 디바이시즈 스펙트라맥스 플러스 분광광도계로 OD490에서 판독한다. 평균 OD490 값을 소프트맥스 프로 소프트웨어(몰레큘라 디바이스)를 사용하여 계산하고, IC50 값을 프리즘 버젼 3.02(그래프 패드 소프트웨어, 샌디에고)을 사용하여 선형 회귀 분석으로 결정한다.
XTT 세포독성 분석
XTT 분석은 [51Cr] 방출 세포독성 분석에 대한 비방사능 대안법이다. XTT는 대사 활성 생세포에 의해서만 포르마잔 염료로 환원되는 테트라졸륨 염이다. XTT 의 환원은 OD490 - OD650으로서 분광광도법으로 측정된다.
특정 화합물의 암 세포에 대한 세포독성을 측정하기 위해서, 10% 소 태아 혈청, 인슐린, 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지 중에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 입수한 9 x 103 MCF-7 사람 유방암 세포를 96 웰 플레이트에 웰마다 플레이팅한다. 37℃에서 5% CO2 하에 밤새 배양한 후, DMSO에 용해시킨 시험될 화합물을 1μl 용량으로 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25 및 0.625μg/ml의 농도로 3회씩 웰에 가한다. 필요한 경우, 추가의 농도를 시험한다. DMSO 1μl를 비히클 대조군으로서 웰에 3회 가한다. C75를 40, 20, 10, 15, 12.5, 10 및 5μg/ml에서 삼중으로 포지티브 대조군으로서 수행한다.
72시간 동안 배양한 후, 세포를 4시간 동안 XTT 시약과 함께 제조자 지시서 (세포 증식 키트 II(Cell Proliferation Kit II)(XTT), 로슈(Roche))에 따라서 배양한다. 플레이트를 몰레큘러 디바이시즈 스펙트라맥스 플러스 분광광도계로 OD490 및 OD650에서 판독한다. XTT 시약은 함유하지만 세포는 함유하지 않는 3개의 웰은 플레이트 블랭크로서 제공된다. XTT 데이터를 OD49O - OD650으로서 보고한다. 평균 및 평균의 표준 오차를 소프트맥스 프로 소프트웨어(몰레큘라 다이나믹(Molecular Dynamics))를 사용하여 계산한다.
화합물에 대한 IC50은 대조군에 비해 OD490 - OD65O을 50% 감소시키는 약물의 농도로서 정의된다. OD490 - OD650은 각각의 화합물 농도에 대해 소프트맥스 프로 소 프트웨어(몰레큘라 디바이스)에 의해 계산된다. IC50은 선형 회귀에 의해 FAS 활성을 대조군 % 대 약물 농도로서 플로팅하여 계산된다. 선형 회귀, 최적 맞춤선, r2 및 95% 신뢰 구간을 프리즘 버젼 3.0(그래프 패드 소프트웨어)을 사용하여 결정한다.
전체 지질에 혼입된 [ 14 C]아세테이트 측정 및 화합물의 IC 50 의 결정
당해 분석은 전체 지질로의 [l4C]아세테이트의 혼입을 측정하고, 이는 시험관내에서 지방산 합성 경로 활성의 척도이다. 이는 시험관내 지방산 합성의 억제율 측정에 이용된다.
상기와 같이 배양된 MCF-7 사람 유방암 세포를 24-웰 플레이트에 웰당 5 x 104 세포로 플레이팅한다. 밤새 배양한 후, 시험될 화합물을 DMSO에 용해시키고, 5, 10 및 20μg/ml의 농도로 3회씩 가하고, 필요한 경우, 시험된 농도보다 낮은 농도를 사용한다. DMSO를 비히클 대조용으로 3개의 웰에 가한다. C75를 5 및 10μg/ml에서 포지티브 대조군으로서 3회 수행한다. 4시간 배양 후, [14C]아세테이트의 0.25μCi(10μl 용량)를 각각의 웰에 가한다.
추가로 2시간 배양한 후, 배지를 웰로부터 흡인하고, 클로로포름:메탄올(2:1) 800μl 및 4mM MgCl2 700μl를 각각의 웰에 가한다. 각각의 웰의 내용물을 1.5 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)로 옮기고, 고속 에펜도르프 마이크로원심분리기 5415D에서 2분 동안 전속력으로 회전시킨다. 수성(상부) 층을 제거한 후, 추가로 클로로포름:메탄올(2:1) 700μl 및 4mM MgCl2 500μl를 각각의 튜브에 가한 후, 1분 동안 상기한 바와 같이 원심분리한다. 수성 층을 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette)을 사용하여 제거하고, 폐기한다. 추가의 클로로포름:메탄올(2:1) 400μl 및 4mM MgCl2 200μl를 각각의 튜브에 가한 후, 원심분리하고, 수성 층을 폐기한다. 하부 (유기) 상을 신틸레이션 바이알로 옮기고, 40℃에서 N2 가스 하에 건조시킨다. 건조시킨 후, 신틸런트(APB #NBC5104) 3ml를 가하고, 바이알을 14C에 대해 계산한다. 베크만 신틸레이션 계수기(Beckman Scintillation counter)로 3회의 평균 cpm 값을 계산한다.
화합물에 대한 IC50은 대조군에 비해 지질로의 [14C]아세테이트 혼입이 50% 감소하는 약물의 농도로서 정의된다. 이는 시험된 각각의 억제제 농도에 대한 평균 cpm을 플로팅하고, 선형 회귀를 수행한 후, 최적 맞춤선, r2 값 및 95% 신뢰 구간을 계산함으로써 결정된다. 평균 cpm 값은 각각의 화합물 농도에 대해 베크만 신틸레이션 계수기(모델 LS6500)에 의해 계산된다. 선형 회귀, 최적 맞춤선, r2 및 95% 신뢰 구간의 계산은 프리즘 버젼 3.0(그래프 패드 소프트웨어)을 사용하여 계산된다.
신규한 FAS 억제제에 대한 중량 손실 스크린
Balb/C 마우스(잭슨 랩스(Jackson Labs))를 초기 중량 손실 스크리닝에 사용한다. 동물을 온도 및 12시간 낮/밤 사이클 룸에 수용하고, 마우스 차우(mouse chow) 및 물을 무제한으로 공급한다. 3마리의 마우스를 실험당 3회씩 비히클 대조군으로 시험된 각각의 화합물에 대해 사용한다. 실험을 위해서, 마우스를 시험된 각각의 화합물에 대해 우리에 세마리씩 개별적으로 수용한다. 화합물을 DMSO 중에 10mg/ml로 희석시키고, 마우스는 DMSO 약 100μl 중의 60mg/kg으로 복강내 주사되거나 비히클 단독으로 주사한다. 마우스를 관찰하고, 매일 체중을 재고; 평균 체중 및 표준 오차를 엑셀(마이크로소프트(Microsoft))로 계산한다. 처리된 동물이 이의 예비처리 체중에 도달할 때까지 실험을 계속한다.
항미생물 특성
브로쓰 미량희석법 분석을 사용하여 화합물의 항미생물 활성을 평가한다. 화합물을 2배 연속 희석시켜 시험하고, 가시적인 성장을 억제하는 농도(10%의 대조군에서 OD6O0)를 MIC로서 정의한다. 시험된 미생물은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(ATCC # 29213), 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis)(ATCC # 29212), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC # 27853) 및 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)(ATCC # 25922)를 포함한다. 당해 분석은 2개의 성장 배지, 즉 뮐러 힌톤 브로쓰(Mueller Hinton Broth) 및 트립티카즈 소이 브로쓰(Trypticase Soy Broth)에서 수행된다.
혈액(T소이/5% 양 혈액) 한천 플레이트를 10% 글리세롤을 함유하는 T 소이 브로쓰에 유지된 동결 스톡으로부터 접종하고 37℃에서 밤새 배양한다. 콜로니를 멸균 브로쓰에 현탁시켜 혼탁도가 0.5 맥파랜드(McFarland) 표준의 혼탁도에 필적하도록 한다. 접종물을 멸균 브로쓰(뮐러 힌톤 또는 트립티카즈 소이)로 1:10으로 희석시키고, 195ul를 96-웰 플레이트의 웰마다 분배시킨다. DMSO에 용해시킨 시험될 화합물을 웰에 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56 및 0.78ug/ml 농도의 5ul 용량으로 2회 가한다. 필요한 경우, 추가 농도를 시험한다. DMSO 5ul는 비히클 대조군으로서 2회 첨가했다. 포지티브 대조 화합물, 반코마이신(E. faecalis 및 S. aureus) 및 토브라마이신(E. coli 및 P. aeruginosa)의 연속 희석이 각각의 수행에 포함된다.
37℃에서 24시간 배양 후, 플레이트를 몰레큘러 디바이시즈 스펙트라맥스 플러스 분광광도계로 OD600에서 판독한다. 평균 OD600 값을 소프트맥스 프로 소프트웨어(몰레큘라 디바이스)를 사용하여 계산하고, MIC 값을 프리즘 버젼 3.02(그래프 패드 소프트웨어, 샌디에고)을 사용하는 선형 회귀 분석에 의해 결정한다. MIC는 비히클 대조군 판독치의 10%와 동등한 OD6OO 판독치를 생성하는 데 필요한 화합물의 농도로서 정의된다.
생물학적 시험 결과
Figure 112009034309877-PCT00024
Figure 112009034309877-PCT00025
Figure 112009034309877-PCT00026

Claims (25)

  1. 화학식 I의 화합물:
    화학식 I
    Figure 112009034309877-PCT00027
    위의 화학식 I에서,
    R1은 H, C1-C2O 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬 또는 알킬아릴, -OCH3, -OC(O)CH3 또는 -OC(O)CF3이고,
    R2는 -OCH2C(O)NHNH-R5이고, 여기서, R5는
    (a) 할로겐, C1-C8 알킬(이는 할로겐에 의해 임의로 치환된다), -OH 및 -OR6(여기서, R6은 할로겐에 의해 임의로 치환된 C1-C8 알킬이다) 중의 하나 이상에 의해 임의로 치환된 페닐,
    (b) 할로겐, -OH 또는 -OR6(여기서, R6은 할로겐에 의해 임의로 치환된 C1-C8 알킬이다)에 의해 임의로 치환된 2-피리딜, 3-피리딜 또는 4-피리딜,
    (c) 이미다졸, 티아졸, 벤즈이미다졸, 벤즈옥사졸, 벤즈티아졸, 테트라졸, 트리아졸 및 아미노티아졸로 이루어진 그룹으로부터 선택된 헤테로사이클 또는
    (d) -C(O)R7(여기서, R7은 C1-C2O 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬 또는 알킬아릴이거나, 피리딜, 이미다졸, 티아졸, 벤즈이미다졸, 벤즈옥사졸, 벤즈티아졸, 테트라졸, 트리아졸 및 아미노티아졸로 이루어진 그룹으로부터 선택된 헤테로사이클이다)이고,
    R3 및 R4는 서로 동일하거나 상이하고, C1-C2O 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬 또는 알킬아릴이고,
    단, R1이 -H, -OCH3 또는 -OC(O)CF3이고, R3이 -(CH2)7CH3인 경우, R2는 -OCH2C(O)NHNH-R5(여기서, R5는 -p-C6H4Cl, -C(O)CH3 또는
    Figure 112009034309877-PCT00028
    이다)가 아니다.
  2. 제1항에 있어서, R1이 H인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, R5가 C1-C1O 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬 또는 알킬아릴인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, R3이 -H 또는 -CH3인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, R4가 n-C6-C8 알킬인 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 화합물이
    Figure 112009034309877-PCT00029
    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물.
  7. 약제학적 희석제와 제1항에 따르는 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, R1이 H인 약제학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서, R5가 C1-C1O 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬 또는 알킬아릴인 약제학적 조성물.
  10. 제7항에 있어서, R3이 -H 또는 -CH3인 약제학적 조성물.
  11. 제7항에 있어서, R4가 n-C6-C8 알킬인 약제학적 조성물.
  12. 제7항에 있어서, 화합물이
    Figure 112009034309877-PCT00030
    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  13. 제7항에 따르는 약제학적 조성물의 유효량을 동물 또는 사람 대상에게 투여함을 포함하는, 동물 또는 사람 대상의 암을 치료하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 대상이 사람인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 대상이 동물인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 약제학적 조성물이
    Figure 112009034309877-PCT00031
    로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물을 포함하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 약제학적 조성물이
    Figure 112009034309877-PCT00032
    로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물을 포함하는 방법.
  18. 제7항에 따르는 약제학적 조성물의 유효량을 동물 또는 사람 대상에게 투여함을 포함하는, 동물 또는 사람 대상의 지방산 신타제 활성을 억제하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 대상이 사람인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 대상이 동물인 방법.
  21. 제7항에 따르는 약제학적 조성물의 유효량을 동물 또는 사람 대상에게 투여함을 포함하는, 동물 또는 사람 대상의 침투성 미생물 세포의 성장을 억제하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 대상이 사람인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 대상이 동물인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 화합물이
    Figure 112009034309877-PCT00033
    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  25. 제21항에 있어서, 화합물이
    Figure 112009034309877-PCT00034
    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
KR1020097011742A 2006-11-08 2007-11-08 신규한 화합물, 이를 함유하는 약제학적 조성물 및 이의 사용 방법 KR20090098804A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US85751306P 2006-11-08 2006-11-08
US60/857,513 2006-11-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20090098804A true KR20090098804A (ko) 2009-09-17

Family

ID=39364833

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097011742A KR20090098804A (ko) 2006-11-08 2007-11-08 신규한 화합물, 이를 함유하는 약제학적 조성물 및 이의 사용 방법

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20100168176A1 (ko)
EP (1) EP2086943A4 (ko)
JP (1) JP2010509335A (ko)
KR (1) KR20090098804A (ko)
CN (1) CN101611017A (ko)
AU (1) AU2007317794A1 (ko)
BR (1) BRPI0719058A2 (ko)
CA (1) CA2668840A1 (ko)
EA (1) EA200970460A1 (ko)
IL (1) IL198634A0 (ko)
MX (1) MX2009004950A (ko)
WO (1) WO2008057585A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009149066A1 (en) * 2008-06-02 2009-12-10 Fasgen, Inc. Novel compounds, pharmaceutical compositions containing same, and methods of use for same
WO2010118324A2 (en) 2009-04-09 2010-10-14 Nuclea Biotechnologies, LLC Antibodies against fatty acid synthase
WO2011140190A1 (en) 2010-05-05 2011-11-10 Infinity Pharmaceuticals Tetrazolones as inhibitors of fatty acid synthase
US11202795B2 (en) 2014-11-20 2021-12-21 Vib Vzw Means and methods for treatment of early-onset Parkinson's disease

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0000131D0 (en) * 2000-01-06 2000-02-23 Univ Cardiff Thiolactomycin analogues,compositions containing the same and uses thereof
MXPA05000365A (es) * 2002-07-09 2005-09-20 Fasgen Llc Nuevos compuestos, composiciones farmaceuticas que los contienen y metodos de uso de los mismos.

Also Published As

Publication number Publication date
EP2086943A1 (en) 2009-08-12
IL198634A0 (en) 2010-02-17
EA200970460A1 (ru) 2009-12-30
WO2008057585A1 (en) 2008-05-15
US20100168176A1 (en) 2010-07-01
BRPI0719058A2 (pt) 2013-11-26
CN101611017A (zh) 2009-12-23
MX2009004950A (es) 2009-07-27
CA2668840A1 (en) 2008-05-15
AU2007317794A1 (en) 2008-05-15
JP2010509335A (ja) 2010-03-25
EP2086943A4 (en) 2010-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101087559B1 (ko) 신규 화합물 및 이를 함유하는 약제학적 조성물
KR20070095754A (ko) 신규 화합물, 그것을 함유하는 약학 조성물, 및 그것을사용하는 방법
US20110288052A1 (en) Novel compounds, pharmaceutical compositions containing same, and methods of use for same
AU2003248810B2 (en) Novel compounds, pharmaceutical compositions containing same, and methods of use for same
JP2011521978A5 (ko)
KR20090098804A (ko) 신규한 화합물, 이를 함유하는 약제학적 조성물 및 이의 사용 방법
US20100029752A1 (en) Novel compounds, pharmaceutical compositions containing same, and methods of use for same
US20100029761A1 (en) Novel compounds, pharmaceutical compositions containing same, and methods of use for same

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid