KR20090097873A - 효소 검출 기술 - Google Patents

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KR20090097873A
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수에동 송
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킴벌리-클라크 월드와이드, 인크.
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Abstract

효소 또는 효소 저해제의 존재 또는 양을 검출하기 위한 측방 흐름 분석 장치를 제공한다. 이 측방 흐름 분석 장치는 분자 기질을 이용하여 기질의 효소-촉매 반응에서 형성된 생성물 및/또는 기질의 검출을 통해 효소 또는 효소 저해제의 검출을 촉진한다. 예를 들어, 일 구현예에 있어서, 효소는 분자 기질과 접촉시에 분자 기질과의 반응을 촉매하고 생성물을 형성한다. 측방 흐름 분석 장치는 또한 시험 시료 내의 효소의 존재 또는 양을 측정하기 위한 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 검출가능한 물질을 포함한다. 예를 들어, 검출가능한 물질은 생성물에 대해 친화력을 가지는 특이적 결합원에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 상기 효소 촉매 반응 후에, 생성물이 검출가능한 물질과 결합하고, 이는 차례로 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있다. 이어서, 상기 물질에 의해 나타난 신호는 시험 시료 내의 효소 또는 효소 저해제의 존재 또는 양을 나타내는 데 사용될 수 있다.
검출 구역, 분자 기질, 검출가능한 물질, 특이적 결합원

Description

효소 검출 기술{ENZYME DETECTION TECHNIQUES}
시험 시료 내 특정 효소의 존재 또는 양을 측정하는 것이 종종 요구된다. 일부 경우에서는, 예를 들어 효소의 존재만으로도 조직이나 장기 손상의 존재를 나타낼 수 있다. 마찬가지로, 이상 효소 농도는 다른 상태, 예를 들어 박테리아 또는 바이러스 감염을 나타낼 수도 있다. 예를 들어, 프로테아제(예를 들어, 아스파르트산 프로테아제)와 메탈로펩티다아제는 칸디다질염("효모 감염")을 야기하는 미생물인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 병원성을 증가시키는 것으로 여겨진다. 시험 시료 내의 효소의 존재 또는 농도가 또한 일부 종류의 암 및 다른 질병의 진단 마커(marker)로서의 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 전립선-특이항원(PSA)은 전립선암의 잘 알려진 마커이다. 다른 진단 마커의 예로는 카텝신 B(암), 카텝신 G(폐공기증, 류머티스관절염, 염증), 플라미노겐 활성화인자(혈전증, 만성 염증, 암), 및 유로키나아제(암)을 들 수 있다.
효소의 존재를 검출하기 위한 하나의 통상적인 기법이 Braach-Maksvytis 등에 허여된 미국 특허 제 6,348,319 호에 기재되어 있다. Braach-Maksvytis 등은 효소에 의해 기질의 소화를 감지함으로써 기능을 한다. 예를 들어 Braach - Maksvytis 등의 도 1은 제 1 구역 (11) 및 제 2 구역 (12)를 포함하는 장치 (10)을 예시한다. 제 1 구역 (11)은 프로테아제 (16)에 의해 절단가능한 펩티드 링커 (15)에 의해서 스트렙타비딘 (14)(프로브)에 연결된 중합체 비드 (13)(담체)를 제공한다. 프로테아제 (16)의 첨가시, 스트렙타비딘 (14)이 방출되어 제 2 구역 (12)로 이동하는데, 이는 막의 임피던스 변화를 통해 스트렙타비딘의 존재를 검출하는 바이오센서 막 (17)을 포함한다(Col. 5, II, 25 ~ 30). 그러나, 공교롭게도, Braach -Maksvytis 등에 의해 기재된 기법들은 특정 종류들의 적용, 예컨대, 환자에 의한 비교적 빠른 진단(자가 진단 또는 의료진의 도움하에)을 필요로 하는 것에 대해서는 너무 비싸고 너무 복잡하다.
따라서, 시험 시료 내에 효소의 존재를 정확하게 검출하는 간편하고 저렴한 기법이 최근 요구되고 있다.
발명의 개요
일 구현예에 따르면, 시험 시료 내의 효소, 또는 이의 저해제를 검출하기 위한 측방 흐름 분석 장치가 개시된다. 이 장치는 검출 구역을 한정하는 크로마토그래프 매질, 분자 기질, 및 검출 신호를 일으킬 수 있는 검출가능한 물질을 포함한다. 예를 들어, 이 검출 신호는 검출 구역 내에서 발생하여 효소 또는 이의 저해제의 존재 또는 양이 측정될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 수용 물질은 효소 반응 생성물 또는 이의 복합체에 결합될 수 있는 검출 구역 내에서 고정화될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 크로마토그래프 매질은 또한 제 2 검출 구역을 한정할 수 있고, 여기서 제 2 검출 신호가 발생될 수 있다. 예를 들어, 제 2 수용 물질은 분자 기질 또는 이의 복합체에 결합할 수 있는 제 2 검출 구역 내에서 고정화될 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 시험 시료 내에서 효소 또는 이의 저해제를 검출하는 방법이 개시된다. 이 방법은 검출 구역을 한정하는 크로마토그래프 매질을 포함하는 측방 흐름 시험 장치를 제공하는 것을 포함한다. 상기 측방 흐름 장치는 촉매화 반응을 통해 검출 신호를 직접적이거나 간접적으로 발생하기 위한 검출가능한 물질과 생성물을 형성할 수 있는 분자 기질을 포함한다. 이 방법은 시험 시료와 크로마토그래프 매질을 접촉하는 것과 상기 검출 구역 내 검출 신호의 존재 또는 강도를 측정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 크로마토그래프 매질은 추가 구역을 한정할 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래프 매질은 시험 시료가 분자 기질을 접촉할 수 있는 적용 부분을 한정할 수 있다. 일 구현예에 있어서, 크로마토그래프 매질은 적용 부분의 하류에 있는 콘쥬게이트 구역을 한정할 수 있으며, 여기서 검출가능한 물질은 확산적으로 고정화될 수 있다. 경합적 또는 샌드위치 면역측정법은 시험 시료 내의 효소의 존재 또는 농도의 측정에 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 측면은 하기에 좀 더 상세하게 설명한다.
본 발명의 가장 최선의 방법을 포함하는, 당업자에 대한 완전하고 실시가능한 개시는 명세서의 하기에 더욱 구체적으로 진술되며, 하기의 첨부된 도면을 참조한다:
도 1은 측방 흐름 분석 장치에서 사용될 수 있는 분석 장치의 일 구현예의 투시도이고;
도 2는 측방 흐름 분석 장치에서 사용될 수 있는 분석 장치의 다른 구현예의 투시도이고;
도 3은 측방 흐름 분석 장치에서 사용될 수 있는 분석 장치의 또다른 구현예의 투시도이고;
도 4는 일 구현예에 사용될 수 있는 한 분석 기법의 개략도이고;
도 5는 일 구현예에 사용될 수 있는 다른 분석 기법의 개략도이고;
도 6는 일 구현예에 사용될 수 있는 또 다른 분석 기술의 개략도이고; 및
도 7은 본 발명에 기술된 바와 같은 분석 장치의 일 구현예에서 얻어진 결과를 도식적으로 예시한다.
본 명세서 및 도면의 참조 기호의 반복 사용은 동일하거나 유사한 특징 또는 요소를 나타내는 것을 목적으로 한다.
정의
본 발명에 사용된 용어 "시험 시료"는 일반적으로 효소 및/또는 효소 저해제를 함유한다고 짐작되는 물질을 말한다. 예를 들어, 상기 시험 시료는 혈액, 간질액, 침, 안구렌즈액, 뇌척수액, 땀, 소변, 모유, 복수액, 점액, 윤활액, 복막액, 질액, 양수 등을 포함하는 생리학적 체액과 같은 생물학적 공급원으로부터 수득되거나 유래될 수 있다. 생리학적 체액 이외에, 기타 액체 시료, 예컨대, 물, 식품 등이 환경 또는 식품 제조 분석의 수행을 위해 사용될 수 있다. 추가로, 고체 물질이 시험 시료로써 사용될 수 있다. 시험 시료는 공급원으로부터 수득된 대로 바로 사용되거나 상기 시료의 특성을 변형시키기 위한 전처리 후에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 전처리는 혈액으로부터 혈장을 준비하는 것, 점액을 희석하는 것 등이 포함될 수 있다. 전처리 방법으로는 또한 여과, 침전, 희석, 증류, 혼합, 농축, 방해성분의 비활성화, 시약 첨가 등이 포함될 수 있다. 나아가 고체 시험 시료를 변형하여 액체 매질을 형성하는 것, 효소 및/또는 효소 저해제를 방출하는 것 등이 이로울 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "분자 기질"은 일반적으로 효소-촉매 반응을 통해 생성물을 형성할 수 있는 분자 화합물을 말한다. 일 구현예에 있어서, 분자 기질은 약 3000 돌턴 (즉, 원자 질량 단위, 1 돌턴은 가장 풍부하게 존재하는 탄소 동위원소 12C의 원자량의 1/12에 상당함) 미만일 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 분자 기질은 예를 들어, 약 2000 돌턴 미만, 약 1000 돌턴 미만, 또는 약 500 돌턴 미만일 수 있다. 일 구현예에 있어서, 분자 기질은 입체적, 화학적으로 또는 임의의 기타 방식으로 분자 기질과 효소 사이의 상호작용을 방해할 수 있는 이차 화합물, 구조, 또는 물질을 포함하지 않을 수 있다 (즉, 이들에 비결합되거나 그렇지 않으면 부착됨). 예를 들어, 일 구현예에 있어서, 분자 기질이 임의 리포터, 비드, 입자, 태그 등을 포함하지 않을 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "기질 콘쥬게이트"는 일반적으로 프로브, 입자, 비드 등과 같은 이차 물질에 결합되거나 그렇지 않으면 부착된 분자 기질을 말한다.
상세한 설명
지금부터 개시된 본 발명의 다양한 구현예를 상세하게 언급할 것이고, 이의 하나 이상의 실시예를 하기에 기술할 것이다. 각 실시예는 제한이 아니라 설명의 수단으로 제공된다. 실제, 다양한 변경 및 변형이 본 발명의 범위와 취지에 벗어남이 없이 본 명세서에서 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백하다. 예를 들어, 일 구현예의 부분으로 예시되거나 서술된 특징들은 다른 구현예에서 사용되어 또 다른 구현예가 창출될 수 있다. 따라서, 본 명세서는 첨부된 청구항 및 그들의 동등물의 범위 내에 속하는 이러한 변형과 변경을 모두 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명은 일반적으로 효소나 효소 저해제의 존재 또는 양을 검출하기 위한 측방 흐름 분석 장치에 관한 것이다. 이 분석 장치는 예를 들어, 펩티드, 단백질, 또는 당단백질 기질과 같은 분자 기질을 사용하여, 효소 또는 효소 저해제의 검출을 용이하게 한다. 상기 분자 기질은 단백질 분해 효소와 같은 효소에 대한 표적을 제공한다. 구체적으로 상기 분자 기질의 접촉시, 단백질 분해 효소는 분자 기질을 절단하고 효소 반응 생성물을 방출한다. 이 분석 장치는 또한 효소와 분자 기질의 반응시 검출 신호가 발생될 수 있는 검출가능한 물질을 이용한다. 검출가능한 물질에 의해 발생된 신호는 이어서 시험 시료 내의 효소 또는 효소 저해제의 존재 또는 양을 나타내는 데 사용될 수 있다.
다양한 종류의 효소가 본 발명에 따라 검출될 수 있다. 예를 들어, 전이효소, 가수분해효소, 리아제 등이 검출될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 관심 대상 효소는 "가수분해효소" 또는 "가수분해성 효소" 이며, 이는 가수분해반응을 촉매하는 효소를 말한다. 상기 가수분해성 효소의 예로는, 프로테아제, 펩티다아제, 리파아제, 뉴클레아제, 호모- 또는 헤테로-올리고사카리다아제, 호모- 또는 헤테로-폴리사카리다아제, 포스파타아제, 설파타아제, 뉴라미니다아제, 및 에스터라아제를 들 수 있으나 이제 한정되지 않는다. 일 구현예에 있어서, 예를 들어, 펩티다아제가 검출될 수 있다. "펩티다아제"는 좀 더 짧은 펩티드에서 발견되는 펩티드 결합을 절단하는 가수분해성 효소이다. 펩티다아제의 예로는, 메탈로펩티다아제; 디펩티딜펩티다아제 I, II, 또는 IV; 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 다른 구현예에 있어서, 프로테아제가 검출될 수 있다. "프로테아제"는 좀 더 긴 펩티드 및 단백질에서 발견되는 펩티드 결합을 절단하는 가수분해성 효소이다. 프로테아제의 예로는, 세린 프로테아제(예를 들어, 키모트립신, 트립신, 엘라스타제, PSA, 등), 아스파트산 프로테아제(예를 들어, 펩신), 티올 프로테아제(예를 들어, 프로호르몬 티올 프로테아제), 메탈로프로테아제, 산 프로테아제, 및 알칼리 프로테아제를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또 다른 효소는 Bronstein 등에 허여된 미국 특허 제 6,243,980 호와 Yue 등에 허여된 제 2004/0081971 호에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조 병합된다.
상술한 바와 같은 분자 기질을 절단하는 효소 이외에, 분석 장치는 다르게는 분자 기질내 입체적 변화를 촉매하는 효소들뿐만 아니라, 분자 기질에 결합의 형성을 촉매하는 효소의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 기질에 작용기를 전달하는 전이효소, 기질에 2차분자를 공유결합시키는 리가아제, 폴리머라아제, 또는 이소머라아제가 검출될 수 있다. 검출될 수 있는 대표적인 전이효소로는 키나아제와 메틸라아제가 포함된다. 예를 들어, 프로틴 키나아제, 크레아틴키나아제, 헥소키나아제 등을 포함하는 키나아제는 기질의 인산화의 검출을 통해 검출될 수 있다. 메틸라아제 II 와 같은 메틸라아제는 기질에 하나 이상의 메틸기를 첨가함으로써 검출될 수 있다.
마찬가지로, 임의의 공지된 다양한 효소 저해제 또한 본 발명에 따라 검출될 수 있다. 예를 들어, 공지된 가수분해성 효소 저해제로는, 프로테아제, 펩티다아제, 리파아제, 뉴클레아제, 호모- 또는 헤테로-올리고사카리다아제, 호모- 또는 헤테로-폴리사카리다아제, 포스파타아제, 설파타아제, 뉴라미니다아제 및 에스터라아제의 저해제를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 프로테아제 저해제로는 예를 들어, 아스파르트산 프로테아제 저해제, 세린 프로테아제 저해제, 티올 프로테아제 저해제, 메탈로프로테아제 저해제, 산 또는 알칼리 프로테아제 저해제 등을 들 수 있다. 일부 프로테이제 저해제의 특정예로는 벤즈아미딘, 인돌, 펩스타틴, 오보마크로글로불린, 할로페리돌, 전이 상태 모방체(transition state mimetics) 등을 들 수 있다. 일부 전이효소 저해제의 특정예로는 글루타티온 S-전이효소 및 sarasar® 를 저해하는 에타크린산, 벤조사이클로헵타피리딜 파르네실 전이효소 저해제(FTI)를 들 수 있다.
상술한 바와 같이, 분자 기질은 효소 또는 효소 저해제의 존재 또는 양을 검출하는데 사용될 수 있다. 상기 분자 기질은 자연적으로 발생되거나 합성될 수 있다. 가수분해성 효소의 일부 적합한 분자 기질로는 예를 들어, 에스테르, 아미드, 펩티드, 에테르, 또는 효소적인 가수분해성 결합을 갖는 기타 화학적 화합물을 들 수 있다. 상기 효소 촉매 가수분해 반응은, 예를 들어 수산기나 아민 화합물을 하나의 생성물로, 유리 포스페이트, 아세테이트 등을 제 2 생성물로 초래할 수 있다. 분자 기질의 특정 유형으로는, 예를 들어 단백질 또는 당단백질, 펩티드, 핵산(예를 들어, DNA 및 RNA), 탄수화물, 지질, 에스테르, 이의 유도체 등을 들 수 있다. 예를 들어, 펩티다아제 및/또는 프로테아제의 일부 적합한 분자 기질 또는 펩티드, 단백질, 및/또는 당단백질, 예를 들어, 카세인(예를 들어, β-카세인, 아조카세인 등), 알부민(예를 들어 소혈청알부민(BSA)), 헤모글로빈, 미오글로빈, 케라틴, 젤라틴, 인슐린, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 엘라스틴 등을 들 수 있다. 또 다른 적합한 분자 기질은 Simonsson 등에 허여된 미국 특허 제 4,748,116 호; Diamond 등에 허여된 제 5,786,137 호; Rao 등에 허여된 제 6,197,537호 ; 및 Henderson 등에 허여된 제 6,235,464 호; Nemori 등에 허여된 제 6,485,926 호에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조 병합된다.
분자 기질과 효소의 접촉 후에, 효소 반응 생성물이 형성될 수 있다. 그런다음, 상기 분자 기질 또는 상기 효소 반응 생성물은 검출 가능한 물질과 상호작용하여 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있다. 적절한 검출가능한 물질로는 예를 들어, 크로모겐; 발광 화합물(예를 들어, 형광, 인광 등); 방사성 화합물; 시각적 화합물(예를 들어, 라텍스 또는 금속입자, 예를 들어 금); 리포좀 또는 신호 생성 물질을 함유하는 다른 소포체; 효소 및/또는 기질 등을 들수 있다. 예를 들어 검출가능한 물질로서 사용하기에 적합한 일부 효소는 Litman 등에 허여된 미국 특허 제 4,275,149 호에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조 병합된다. 효소/기질 시스템의 일례는 효소인 알칼리성 포스파타아제 및 기질인 니트로 블루 테트라졸륨-5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트, 또는 이의 유도체 또는 유사물, 또는 기질 4-메틸룸벨리페릴-포스페이트이다. 다른 적절한 검출가능한 물질은 Jou 등에 허여된 미국 특허 제 5,670,381 호, Tarcha, 등에 허여된 미국 특허 제 5,252,459 호에 기재되어 있는 것이고, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조 병합된다.
일부 구현예에 있어서, 검출가능한 물질은 광학적으로 검출가능한 신호를 생성하는 발광 화합물을 포함할 수 있다. 상기 발광 화합물은 분자, 중합체, 덴드리머, 입자 등일 수 있다. 예를 들어 적합한 형광분자로는, 형광색소, 유로퓸 킬레이트, 피코빌리단백질, 로다민, 및 그들의 유도체 및 유사물을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 다른 적합한 형광 화합물은 통상적으로 "양자점"으로 불리는 반도체 나노결정을 말한다. 예를 들어, 이러한 나노 결정은 화학식 CdX(식 중 X 는 Se, Te, S, 등임)의 코어를 포함할 수 있다. 이 나노 결정은 또한 화학식 YZ(식 중 Y 는 Cd 이거나 Zn이고, Z 는 S 이거나 Se임)의 상부 쉘로 보호될 수 있다. 또한 적합한 반도체 나노 결정의 기타 예는 Barbera - Guillem 등에 허여된 미국 특허 제 6,261,779 호, 및 Dapprich에 허여된 제 6,585,939 호에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조 병합된다.
나아가, 적합한 인광 화합물로는, 하나 이상의 금속, 예를 들어, 루테늄, 오스뮴, 레늄, 이리듐, 로듐, 백금, 인듐, 팔라듐, 몰리브덴, 테크네튬, 구리, 철, 크로뮴, 텅스텐, 아연 등의 금속 복합체를 들 수 있다. 특히 바람직한 것은 루테늄, 레늄, 오스뮴, 백금 및 팔라듐이다. 상기 금속 복합체는 수성 또는 비수성 환경에서 복합체의 용해도를 촉진하는 하나 이상의 리간드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 적합한 리간드의 예로는, 피리딘; 피라진; 이소니코틴아미드; 이미다졸; 비피리딘; 테르피리딘; 페난트롤린; 디피리도페나진; 포르피린, 포르핀, 및 이의 유도체를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 이러한 리간드는 예를 들어, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, 카르복실레이트, 카르복살데히드, 카르복사미드, 시아노, 아미노, 히드록시, 이미노, 히드록시카르보닐, 아미노카르보닐, 아미딘, 구아니디늄, 유레이드, 황-함유기, 인-함유기 및, N-히드록시-숙신이미드의 카르복실산 에스테르로 치환될 수 있다.
포르피린 및 포르핀 금속 복합체는 메틸렌 가교와 결합된 피롤기를 가져 내부 공간에 금속 킬레이트를 갖는 환형구조를 이룬다. 이들 분자 중 다수는 적합한 용매(예를 들어, 물)와 무(無)산소 환경하에, 상온에서 강한 인광성을 보여준다. 인광성을 나타낼 수 있는 일부 적합한 포르피린 복합체로는, 백금 (II) 코프로포르피린-I 및 III, 팔라듐 (II) 코프로포르피린, 루테늄 코프로포르피린, 아연(II)-코프로포르피린-I, 이의 유도체 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 유사하게, 인광성을 나타낼 수 있는 일부 적합한 포르핀 복합체로, 백금(II) 테트라-메소-플루오로페닐포르핀 및 팔라듐(II) 테트라-메소-플루오로페닐포르핀이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 또 다른 적합한 포르피린 및/또는 포르핀 복합체는 Schmidt 등에 허여한 미국 특허 제 4,614,723 호; Hendrix에 허여한 제 5,464,741 호; Soini에 허여한 제 5,518,883 호; Ewart 등에 허여한 제 5,922,537 호; Sagner 등에 허여한 제 6,004,530 호; 및 Ponomarev 등에 허여한 제 6,582,930 호에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위하여, 그 전체가 본원에 참조 병합된다.
비피리딘 금속 복합체는 또한 인광 화합물로써 이용될 수 있다. 적합한 비피리딘 복합체의 예로는, 비스[(4,4'-카르보메톡시)-2,2'-비피리딘]2-[3-(4-메틸-2,2'-비피리딘-4-일)프로필]-1,3-디옥솔란 루테늄 (II); 비스(2,2'비피리딘)[4-(부탄-1-알)-4'-메틸-2,2'-비-피리딘]루테늄 (II); 비스(2,2'-비피리딘)[4-(4'-메틸-2,2'-비피리딘-4'-일)-부티르산] 루테늄 (II); 트리스(2,2'비피리딘)루테늄 (II); (2,2'-비피리딘) [비스-비스(1,2-디페닐포스피노)에틸렌] 2-[3-(4-메틸-2,2'-비피리딘-4'-일)프로필]-1,3-디옥솔란 오스뮴(II); 비스(2,2'-비피리딘)[4-(4'-메틸-2,2'-비피리딘)-부틸아민]루테늄 (II); 비스(2,2'-비피리딘)[1-브로모-4(4'-메틸-2,2'-비피리딘-4-일)부탄]루테늄 (II); 비스(2,2'-비피리딘)말레이미도헥산산, 4-메틸-2,2'-비피리딘-4'-부틸아미드 루테늄 (II)등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 인광성을 나타낼 수 있는 또 다른 적합한 금속 복합체는 Richter 등에 허여한 미국 특허 제 6,613,583 호; Massey 등에 허여한 제 6,468,741 호; Meade 등에 허여한 제 6,444,423 호 ; Massey 등에 허여한 제 6,362,011호; Bard 등에 허여한 제 5,731,147 호; 및 Massey 등에 허여한 제 5,591,581 호에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조 병합된다.
일부 경우에 있어서, "시분해" 발광 검출 기법이 이용된다. 시분해 검출법은 하나 이상의 단펄스 광으로 발광 화합물을 여기한 다음, 통상적으로, 여기한 후 잔류 발광 신호를 측정하기 전까지 일정 시간(예를 들어, 대략 1 ~ 100 마이크로초)을 기다리는 것을 포함한다. 이런 방법으로, 임의의 짧은 수명의 인광 또는 형광의 배경 신호 및 산란된 여기 방사선이 제거된다. 대부분의 배경 신호의 제거 능력은 통상적인 형광 또는 인광보다 2 ~ 4 배 나은 감도를 가지게 할 수 있다. 따라서, 시분해 검출은 특정 발광 물질의 특성을 잘 이용함으로써 방출 공급원 또는 산란 과정 (여기 방사선의 산란으로부터 야기됨) 으로부터의 배경 신호가 감소되도록 설계되었다.
효율적인 기능을 위해 시분해 기법은 일반적으로 발광 화합물에 대해 비교적 긴 방출 수명을 요구한다. 이는 임의의 짧은 수명 배경 신호의 소산 후에 화합물이 이의 신호를 잘 방출하기 위해 요구된다. 또한, 긴 발광 수명은 시간-게이트( time-gated) 측정을 위해 저비용 회로를 사용할 수 있게 한다. 예를 들어, 검출가능한 화합물은 약 1 마이크로초 초과, 일부 구현예에 있어서 약 10 마이크로초 초과, 일부 구현예에 있어서, 약 50 마이크로초 초과, 일부 구현예에 있어서, 약 100 마이크로초 내지 약 1000 마이크로초인 발광 수명을 가질 수 있다. 상기 화합물은 또한 비교적 큰 스톡스 시프트(Stokes shift)를 가질 수 있다. 용어 "스톡스 시프트"는 일반적으로 발광 방사선의 스펙트럼 선 또는 밴드가 여기 선 또는 밴드보다 더 긴 방출 파장으로 이동하는 것으로 정의된다. 비교적 큰 스톡스 시프트는 발광 화합물의 여기 파장을 이의 방출 파장으로부터 떨어뜨리게 하고 이는 여기와 방출 파장의 큰 차이가 방출된 신호로부터 반사된 여기 방사선을 더 쉽게 제거할 수 있게 하므로 바람직하다. 추가로, 큰 스톡스 시프트는 또한 시료 내의 발광 분자로부터의 간섭 및/또는 일부 체액(예컨대, 혈액)내 존재하는 단백질 또는 콜로이드에 기인한 빛 산란을 최소화한다. 이외에, 큰 스톡스 시프트는 또한 배경 간섭을 제거하기 위한 고비용의 고정밀 여과의 필요성을 최소화 시킨다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 발광 화합물은 약 50 나노미터 초과의 스톡스 시프트를 가지고, 일부 구현예에 있어서는, 약 100 나노미터 초과, 일부 구현예에 있어서는 약 100 내지 약 350 나노미터인 스톡스 시프트를 가진다.
예를 들어 시분해 검출 기법에 사용하기 위한 형광 화합물의 적절한 한 종류로는 사마륨 (Sm (III)), 디스프로슘 (Dy (III)), 유로퓸 (Eu (III)), 및 테르븀 (Tb (III))의 란탄족 킬레이트를 들 수 있다. 이러한 킬레이트는 실질적으로 더 짧은 파장에서 킬레이트의 여기 후에 강한 적색-시프트된, 좁은 밴드의 긴 수명 방출을 나타낼 수 있다. 통상적으로 상기 킬레이트는 분자 내의 란탄족에 근접하게 위치한 발색단(chromophore)에 기인한 강한 자외선 여기 밴드를 가지고 있다. 발색단에 의해 여기한 다음에, 여기 에너지는 여기된 발색단에서 란탄족으로 이동될 수 있다. 이 후 란탄족의 특징적인 형광 방출이 이어진다. 예를 들어, 유로퓸 킬레이트는 단지 약 28 나노미터인 형광색소에 견주어 볼 때, 약 250 에서 약 350 나노미터의 예외적으로 큰 스톡스 시프트를 가진다. 또한, 이 유로퓸 킬레이트의 형광은 다른 형광성 화합물의 약 1 내지 약 100 나노초의 수명에 견주어 볼 때, 약 100 내지 약 1000 마이크로초의 긴 수명을 가진다. 추가로, 이 킬레이트들은 좁은 방출 스펙트럼, 통상적으로 약 50% 방출에서 약 10나노미터 미만의 밴드넓이를 가진다. 한 가지 적합한 유로퓸 킬레이트는 N-(p-이소티오시아나토벤질)-디에틸렌 트리아민 테트라아세트산-Eu+3이다.
나아가, 비활성이며, 안정하고, 수용액 또는 현탁액에서 본래 형광인 란탄족 킬레이트를 사용함으로써 또한 수용액 또는 현탁액에서 제한된 용해도와 켄칭(quenching) 문제점을 갖는 킬레이트를 보호하는데 종종 사용되는 마이셀 형성 시약에 대한 필요성을 없앨 수 있다. 이러한 킬레이트의 일례는 4-[2-(4-이소티오시아나토페닐)에티닐]-2,6-비스([N,N-비스(카르복시메틸)아미노]메틸)-피리딘 [참고 문헌: Lovgren, T., 등; Clin. Chem. 42, 1196-1201 (1996)]이다. 몇몇의 란탄족 킬레이트는 또한 예외적으로 높은 신호대 잡음비를 나타낸다. 예를 들어 그러한 킬레이트 중 하나가 테트라덴테이트 β-디케토네이트-유로퓸 킬레이트[참고 문헌: Yuan, J. 및 Matsumoto, K.; Anal. Chem. 70, 596-601 (1998)]이다. 상술한 형광 화합물 이외에, 사용에 적합한 기타 화합물은 Mullinax 등에 허여된 미국 특허 제 6,030,840 호; Davidson에 허여된 제 5,585,279 호; Singer 등에 허여된 제 5,573,909 호; Wieder 등에 허여된 제 6,242,268 호; 및 Hemmila, 등에 허여된 제 5,637,509 호에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조 병합된다.
상술한 바와 같이, 효소 촉매화 반응의 분자 기질 또는 생성물은 검출가능한 물질과 상호 작용하여 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있다. 예를 들어 효소 반응 생성물은 검출가능한 물질에 차례로 결합될 수 있는 화합물과 특이적인 결합을 할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 효소 반응 생성물은, 두 개의 다른 분자 중 하나는 제 2 분자에 화학적 및/또는 물리적 결합하는 특이적 결합쌍의 일원일 수 있다. 면역반응성 특이적 결합원으로는 재조합 DNA법 또는 펩티드 합성에 의해 형성된 것을 포함하여 항원, 햅텐, 항체(1차 또는 2차), 및 이의 복합체를 들 수 있다. 항체는 단일클론 또는 다클론 항체, 재조합 단백질 또는 이의 혼합물(들) 또는 단편(들) 뿐만 아니라 항체 및 기타 특이적 결합원의 혼합물일 수 있다. 상기 항체들의 제조 및 특이적 결합원으로서의 사용에 대한 이들의 적합성의 세부 사항은 당업자에게 잘 알려져 있다. 다른 통상적인 특이적 결합원으로는, 비오틴 및 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 캡타비딘, 또는 항-비오틴 항체; 단백질 A 및 G; 탄수화물 및 렉틴, 상보적인 뉴클레오타이드 서열(표적 핵산 서열을 검출하기 위해 DNA 하이브리드화 분석에 사용되는 프로브 및 포획 핵산 서열 포함); 재조합법에 의해 형성된 것을 포함하는 상보적 펩티드 서열; 작용자(effector) 및 수용체 분자; 호르몬 및 호르몬 결합 단백질; 효소 보조인자 및 효소, 효소 저해제 및 효소; 이의 유도체 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 추가로, 특이적 결합쌍으로는 원형(original) 특이적 결합원의 유사체, 유도체 및/또는 단편을 들 수 있다. 신호를 간접적으로 발생시키기 위해 사용될 경우, 특이적 결합쌍의 일원인 효소 반응 생성물은 이 특이적 결합쌍의 다른 하나에 콘쥬게이트된 검출가능한 물질과 접촉하도록 위치시킬 수 있다. 따라서, 효소 반응 생성물은 특이적 결합쌍을 통해 검출가능한 물질에 간접적으로 결합할 수 있다. 그런 다음, 신호는 종래 당업자에게 잘 알려진 기법을 사용하여 (직접적이거나 간접적으로) 쉽게 검출될 수 있다.
효소 반응 생성물 또는 미반응 분자 기질이 직접적 또는 간접적으로 검출가능한 물질과 결합하는지 여부와 상관없이, 검출가능한 물질은 입자(종종 "비드" 또는 "마이크로비드"라고 불림)와 결합하거나 함유할 수 있다. 다른 것들 중에서, 입자는 검출가능한 물질이 크로마토그래피 매질을 통해 이동하고 이후 하기에 서술한 바와 같이 검출 구역 내에서 고정화되는 능력을 향상시킨다. 예를 들어 자연 발생 입자, 예컨대, 핵, 마이크로플라즈마, 플라스미드, 플라스티드, 포유류세포(예컨대, 적혈구 고스트), 단세포 미생물(예컨대, 박테리아), 폴리사카라이드(예컨대, 아가로즈), 등이 사용될 수 있다. 추가로, 합성 입자 또한 이용될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에 있어서, 라텍스 입자는 형광 또는 유색 색소로 표지된다. 비록 임의 라텍스 입자가 사용될 수 있지만, 이 라텍스 입자는 통상적으로 폴리스틸렌, 부타디엔 스티렌, 스티렌아크릴-비닐 삼원중합체, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸메타크릴레이트, 무수 스티렌-말렌산 공중합체, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐피리딘, 폴리디비닐벤젠, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 아크릴로니트릴, 비닐클로라이드-아크릴레이트 등 또는 이의 알데하이드, 카르복실, 아미노, 히드록실, 또는 히드라지드 유도체로부터 형성된다. 기타 적합한 입자는 Jou 등에 허여된 미국 특허 제 5,670,381 호 및 Tarcha 등에 허여된 제 5,252,459 호에 기재되어 있다. 시판되는 적합한 형광성 입자의 예로는 등록 상표명 "FluoSphere" (Red 580/605) 및 "TransfluoSphere" (543/620)으로 몰리큘라 프로브스(Molecular Probes, Inc.)사에서 판매하는 형광성 카르복실화된 미소구(microspheres) 뿐만 아니라, 몰리큘라 프로브스사(유진, 오리건)에서 판매하는 "Texas Red" 및 5-및 6-카르복시테트라메틸로다민을 들 수 있다. 이외에, 시판되는 적합한 유색의 라텍스 마이크로입자의 예로는 뱅스 라보레토리(Bangs Laboratories, Inc)(피셔, 인디애나)사에서 판매되는 카르복실화 라텍스 비드를 들 수 있다.
상기 입자의 형태는 이용시에 일반적으로 다양할 수 있다. 예를 들어, 하나의 특정 구현예에 있어서, 이 입자는 구형이다. 그러나, 평판, 막대, 디스크, 바, 튜브, 불규칙 모양 등의 다른 형태 또한 본 발명에서 고려되어야 할 것이다. 추가로, 입자의 크기 또한 다양할 수 있다. 예를 들어, 입자의 평균 크기(예컨대, 직경)는 약 0.1 나노미터 내지 약 1,000 마이크로미터, 일부 구현예에서는, 약 0.1 나노미터 내지 약 100 마이크로미터이고, 일부 구현예에서는 약 1 나노미터 내지 약 10 마이크로미터의 범위가 가능하다. 예를 들어, "마이크로미터-스케일"입자가 종종 바람직하다. 상기 "마이크로미터-스케일"입자는 이용시에 약 1 마이크로미터 내지 약 1000 마이크로미터의 평균 크기, 일부 구현예에서는 약 1 마이크로미터 내지 약 100 마이크로미터의 평균 크기이고, 일부 구현예에서는 약 1 마이크로미터 내지 약 10 마이크로미터의 평균 크기를 가질 수 있다. 마찬가지로 "나노-스케일" 입자 또한 이용될 수 있다. 이러한 "나노-스케일" 입자는 약 0.1 내지 약 10 나노미터, 일부 구현예에서는 약 0.1 내지 약 5 나노미터, 일부 구현예에서는 약 1 내지 5 나노미터의 평균 크기를 가질 수 있다.
사용시, 사용자는 시험 시료를 일정 기간 동안 분자 기질과 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 당업자는 효소 촉매 반응을 확실하게 하기 위한 반응물 사이의 접촉 시간은 관심 대상 효소의 활성도에 따라 다르며, 이는 다시 온도, pH, 기질 농도, 저해제 존재(경쟁적(효소 결합), 비경쟁적(효소-기질 복합체에 결합), 또는 비경쟁적(효소 및/또는 효소-기질 복합체에 결합) 등에 따라 다소 좌우됨을 쉽게 인식할 것이다. 이들 요소는 필요에 따라, 접촉 시간을 증가 또는 감소시키도록 선택적으로 제어될 수 있다. 예를 들어 접촉 시간이 약 1 분 초과, 일부 구현예에서는 약 5 내지 약 50 분이고, 일부 구현예에 있어서 약 10 내지 약 25 분일 수 있다. 마찬가지로, pH 를 선택적으로 제어하여 효소 활성도를 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 시험 시료 내 높은 수준의 염기 물질(예를 들어, 아민)은 일부 효소의 최적의 활성에 대해 너무 높은 pH, 예를 들어 8 초과의 pH를 초래할 수 있다. 구체적으로, 효소는 약 3 내지 약 8의 pH 수준에서, 일부 구현예에 있어서, 약 4 내지 약 7의 pH 수준에서 최적의 활성을 가질 수 있다. 따라서, 필요하다면, 완충액 또는 기타 pH-변경 화합물을 사용하여 요구되는 pH를 유지할 수 있다. 유사하게, 가열 또는 냉각 시스템을 사용하여 온도를 선택적으로 제어하여 효소 활성을 촉진시킬 수 있다.
접촉후, 시험 시료 내 존재하는 임의 효소는 통상적으로 기질 분자의 적어도 한 부분과 상호 작용한다. 결과적으로, 효소 반응 생성물, 부분 절단된 복합체(예컨대, 효소-기질 복합체), 미반응 기질 분자, 및 효소-촉매 반응의 이차 반응물 및 생성물을 포함하여 다양한 종이 형성될 수 있다. 예를 들어, 가수분해성 효소의 경우에는, 기질 분자의 효소-촉매 절단시 형성된 둘 이상의 생성물(동일하거나 상이할 수 있음)이 혼합물에 포함될 수 있다. 기질상에 새 결합이 형성되는 효소 촉매 반응을 고려할 때, 혼합물내 포함된 물질에는 상기 반응에 포함된 기타 반응물(예컨대, ATP, 메틸-공여성 반응물, 모노머 예컨대, 아미노산, 및 폴리머라아제 또는 리가아제에 의해 기질에 첨가될 수 있는 뉴클레오티드 등)뿐만 아니라 효소-촉매 반응에서 형성된 이차 생성물(예컨대, ADP)이 포함될 수 있다.
더 긴 접촉시간과 더 높은 효소 농도는 생성 혼합물내 더 높은 농도의 효소 반응 생성물을 초래할 수 있으며, 예를 들어, 다단계 효소 반응의 경우, 긴 접촉시간이 다중반응을 종료에 이르기까지 더욱 진행할 수 있게 한다. 따라서, 일부 구현예는 상기 과정의 성분의 접촉 시간을 선택적으로 제어하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 분자 기질과의 접촉 후에, 시험 시료는 다양한 성분의 접촉 시간을 선택적으로 제어하도록 임의 유동 제어 수단(예컨대, 장치의 물리적 설계를 통한 유동 제한, 장치의 재료 선택 등)에 따라 장치의 한 영역에 함유될 수 있다.
분자 기질과 접촉하는 동안 및/또는 접촉한 후에, 시험 시료는 검출가능한 신호를 발생할 수 있는 검출가능한 물질과 접촉될 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 물질은 효소 반응 생성물과 생성된 대로 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 일반적으로 말하면, 효소 농도가 시험 시료 내에 증가하기 시작함에 따라, 더 많은 효소 반응 생성물이 혼합물 내에 형성될 것이다. 결론적으로, 효소 농도는 혼합물의 효소 반응 생성물의 양과 연관된다. 효소 반응 생성물이 검출 신호(예컨대, 발광 화합물, 유색 색소 등)을 발생시키는 검출가능한 물질과 직접적으로 결합할 수 있다면, 검출 신호의 존재 또는 강도가 비교적 용이하게 정성적, 정량적, 또는 세미-정량적으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 효소의 양은 검출가능한 물질에 결합된 효소 생성물의 신호 강도에 정비례한다. 필요하다면, 신호 강도는 공지된 효소 농도 범위의 효소 농도에 대해 플롯팅하여 강도 곡선을 산출할 수 있다. 미지의 시험 시료 내 효소의 양을 측정하기 위해 신호 강도를 이 강도 곡선에 따라 효소 농도로 변환시킬 수 있다.
일부 경우에는, 일정 시간 후에 시험 시료를 검출가능한 물질과 접촉시키는 것이 바람직한데, 그 시간 동안 시험 시료가 분자 기질 및 임의의 기타 요구되는 반응물 예컨대, 완충액 등과 상호 작용한다. 예를 들어 효소 반응 생성물 이외의 성분을 이용하여 검출 신호의 존재 또는 강도를 측정하는 것이 바람직할 수 있다. 일 구현예에 있어서, 검출가능한 물질이 혼합물의 분자 기질에 직접적이거나 간접적으로 결합될 수 있다. 따라서, 시험 시료 내의 효소가 분자 기질과 반응할 수 있는 접촉 기간 후에, 이 시험 시료를 검출가능한 물질과 접촉시킬 수 있다. 상기 구현예에 있어서, 효소량이 검출가능한 물질에 결합된 기질의 신호 강도에 반비례할 수 있다.
임의의 경우, 개시된 검출 방법은 이중증폭 효소 검출법을 제공할 수 있다. 특히, 방법은 제 1 효소 반응 증폭에 이어 제 2 신호 증폭을 포함할 수 있다. 이 두 단계 증폭법은 검출의 감도 및/또는 정확성을 향상시킬 수 있다. 더욱이, 이 개시된 방법은 효과적인 반응시간 및 시료량 제어 방식을 가진 효소 반응 증폭법을 제공할 수 있다. 또한, 이 개시된 방법은 이전에 공지된 많은 효소적 분석에서 요구되는 것과 같은 불활성화단계에 대한 요구 없이 편리한 분석법으로 효소의 활성과 비활성 형태를 구별할 수 있다.
이에 관하여, 검출을 촉진하는데 임의로 사용되는 분석 장치의 다양한 구현예를 하기에 더욱 상세하게 기재할 것이다. 예를 들어, 도 1을 참조하면, 분석 장치 (20) 의 일 구현예는 지지체 (21)에 의해 담지된 크로마토그래프 매질 (23)을 함유하는 것을 보여주고 있다. 이 크로마토그래프 매질 (23)은 임의의 다양한 물질, 예컨대 유체 채널, 다공성 막 등으로 제조되며, 이를 통해 유체가 통과될 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래프 매질 (23)이 물질들, 예컨대, 천연, 합성, 또는 합성적으로 개질된 자연발생적 물질 예컨대, 다당류(예컨대, 종이와 같은 셀룰로오스 물질 및 셀룰로오스 아세테이트 및 니트로셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체); 폴리에테르 술폰; 폴리에틸렌; 나일론; 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF); 폴리에스테르; 폴리프로필렌; 실리카; 무기 물질, 예컨대, 비활성 알루미나, 규조토, MgSO4, 또는 비닐클로라이드, 비닐클로라이드-프로필렌 공중합체, 및 비닐클로라이드-비닐아세테이트 공중합체와 같은 중합체를 가진 다공성 중합체 매트릭스 내에 불균일하게 분산된 세분된 기타 무기 물질; 천, 자연 발생 천(예컨대, 면)과 합성 천(예컨대, 나일론 또는 레이온) 모두 포함; 다공성 젤, 예컨대, 실리카젤, 아가로오스, 덱스트란, 및 젤라틴; 고분자 필름 예컨대, 폴리아크릴아미드; 등 (그러나 이에 한정하지 않음) 으로부터 형성되는 다공성 막일 수 있다. 하나의 특정 구현예에 있어서, 크로마토그래프 매질은 니트로셀룰로오스 및/또는 폴리에테르 술폰 물질로부터 형성된다. 용어 "니트로셀룰로오스"가 셀룰로오스의 질산에스테르를 말하며, 이는 니트로셀룰로오스 단독이거나 질산과 다른 산, 예컨대, 1 ~ 7 탄소수를 가진 지방족 카르복실산의 혼합 에스테르를 가리키는 것으로 이해된다. 비록 요구되지는 않지만, 화학적 분리를 위한 크로마토그래프 매질 (23)의 사용이 원심분리와 같은 다른 통상적인 분리 기법에 비하여 향상된 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래프 매질 (23)은 일회용 키트가 요구되는 경우를 포함하여 많은 소비 적용분야에 있어서 그 결과 생성된 측방 흐름 분석 장치의 비용을 감소하고 간편화시킬수 있다.
지지체 (21)은 크로마토그래프 매질 (23)을 담지할 수 있는 임의 물질로부터 형성될 수 있다. 비록 요구되지 않지만, 이 지지체 (21) 는 빛이 쉽게 통과할 수 있도록 투명할 수 있다. 이외에, 상기 지지체 (21) 는 매질을 통해 흐르는 유체가 지지체 (21)를 통해 새지 않도록 하기 위해 액체-비투과성인 것이 또한 일반적으로 요구된다. 이 지지체에 적합한 물질의 예로는, 유리; 중합체성 물질, 예컨대 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르(예컨대, Mylar® 필름), 폴리부타디엔, 폴리비닐클로라이드, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 에폭사이드, 메타크릴레이트, 및 폴리멜라민; 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 크로마토그래프 매질 (23)이 지지체 (21) 위에 캐스트(cast)될 수 있고, 여기서 생성된 적층은 요구되는 크기와 모양으로 다이컷 (die-cut) 될 수 있다. 이와 달리, 크로마토그래프 (23) 가 지지체 (21)에 예를 들어, 접착제로 간단하게 적층될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 니트로셀룰로오스 또는 나일론 다공성 막은 Mylar®필름에 부착된다. 예컨대 감압 접착제 등의 접착제를 사용하여 상기 Mylar®필름에 다공성 막을 결합시킨다. 이 유형의 적층 구조는 밀리포어(Millipore Corp.)(베드포드, 메사추세츠)사에서 시판되고 있다고 여겨진다. 적절한 적층 구조의 또 다른 예는 Durley,III 등에 허여된 미국 특허 제 5,075,077 호에 기재되어 있고, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조 병합된다.
분석 장치 (20) 는 또한 흡수제 물질 (28)을 이용할 수 있다. 흡수제 물질(28)은 일반적으로 전체 크로마토그래프 매질 (23)을 통해 이동된 유체를 수용한다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 흡수제 물질 (28)은 모세관 현상의 촉진을 도울 수 있고 유체는 매질 (23)을 통해 흐른다.
도 1 에 예시된 구현예에 있어서, 시험 시료가 콘쥬게이트 패드 (22)에 직접적으로 적용될 수 있다. 공급된 시약으로는 하나 이상의 분자 기질, 보조 인자, 완충액, 저해제, 또는 효소 반응을 촉진하는 데 유용한 기타 시약을 들 수 있다. 예를 들어 유리하게는, 희석제를 요구하는 시험 시료를 분석하기 위해, 공급된 시약은 다른 시약 이외에 소정량의 희석제를 포함할 수 있다. 시험 시료가 희석제에 첨가되어 효소 반응을 개시시킬 수 있다. 상기 공급된 시약은 필요에 따라 함께 제공되거나 독립적으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 희석제가 다른 시약과 물리적으로 분리될 수 있다. 희석제에 시험 시료를 첨가한 후에, 예를 들어 장치상에 잘 형성된 혼합으로, 상기 혼합물을 추가의 시약과 접촉시킬 수 있다. 예시된 구현예에 있어서, 접촉은 콘쥬게이트 패드에 제공된 시약과 시험 시료의 혼합 동안 및 이 후에 수행된다.
콘쥬게이트 패드 (22)는 다공성 막 (23)과 유체로 소통하며, 이것을 통해 혼합물이 도 1 에 화살표 "L"에 의해 보여진 방향으로 이동될 수 있다. 콘쥬게이트 패드 (22)를 형성하는데 사용될 수 있는 일부 적합한 물질로는, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 다공성 폴리에틸렌 패드, 및 유리 섬유 필터종이를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 이 콘쥬게이트 패드 (22)는 그 위에 확산적으로 고정된 검출가능한 물질을 포함할 수 있으며, 여기에 혼합물의 성분이 차별적으로 (직접적이거나 비직접적으로) 결합될 수 있다. 예를 들어, 콘쥬게이트 패드 (22)는 검출 가능한 물질로 표지된 확산적으로 고정된 프로브를 포함할 수 있고, 이 프로브는 효소 반응 생성물, 분자 기질, 또는 다른 혼합물 성분에 대한 특이적 결합제를 추가적으로 포함한다. 따라서, 검출가능한 물질과 혼합물의 성분을 포함하는 콘쥬게이트 프로브가 형성될 수 있다. 효소 반응 생성물과 같은 혼합물의 성분은 예컨대, 상술된 바와 같은 방법으로 공유결합 및/또는 물리적 흡착 등의 공지된 다양한 기법을 사용하여 프로브에 콘쥬게이트될 수 있다. 하나의 특정 구현예에 있어서, 상기 프로브의 카르복실기는 활성화되고 효소 반응 생성물의 아미노기와 반응하여 아미드 결합을 형성한다. 또한 필요하다면, 콘쥬게이트 패드 (22)는 완충액, 저해제 등과 같은, 그 위에 확산 또는 비확산적으로 고정화된 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다.
그럼에도, 크로마토그래프 매질(23)은 검출 구역 (31)을 한정하는데, 여기서 콘쥬게이트된 프로브가 포획 및 검출될 수 있다. 콘쥬게이트된 프로브가 포획되는 방법은 프로브의 성질에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 생물학적 수용 물질이 생물학적 성분을 포획하기 위해 검출 구역 (31) 내에 고정화될 수 있다. 상기 생물학적 수용 물질은 당업계에 잘 알려져 있고, 항체, 항원, 햅텐, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 캡타비딘, 단백질 A, 단백질 G, 탄수화물, 렉틴, 뉴클레오티드 서열, 펩티드 서열, 작용자 및 수용체 분자, 호르몬 및 호르몬 결합 단백질, 효소 보조인자 및 효소, 효소 저해제 및 효소, 이의 유도체를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
물론 콘쥬게이트된 프로브를 포획하고 검출하기 위한 임의의 다른 적합한 기법 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 비-생물학적 수용 물질이 프로브 포획을 위한 검출 구역 (31) 내에 고정화될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에 있어서, 수용 물질은 고분자전해질(polyelectrolyte)이다. 고분자전해질은 일반적으로 중성인 알짜 전하뿐 아니라, 알짜 양전하이거나 음전하를 가질 수도 있다. 알짜 양전하를 갖는 고분자전해질의 일부 적합한 예들로는, 폴리리신 (세인트 루이스, 미주리주의 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich Chemical Co., Inc.)에서 시판), 폴리에틸렌이민; 에피클로로히드린-작용기화 폴리아민 및/또는 폴리아미도아민, 예컨대 폴리(디메틸아민-코-에피클로로히드린); 폴리디알릴디메틸-염화암모늄; 양이온성 셀룰로오스 유도체, 예컨대 4차 암모늄 수용성 단량체로 그래프트된 셀룰로오스 유도체 또는 셀룰로오스 공중합체; 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 하나의 특정 구현예에 있어서, CelQuat® SC-230M 또는 H-100(내셔널 스타치 & 케미컬(National Starch & Chemical.Inc)사 시판)이 이용될 수 있으며, 이는 4차 암모늄 수용성 단량체를 포함하는 셀룰로오스 유도체이다. 더욱이, 알짜 음전하를 갖는 고분자전해질의 일부 적합한 예로는, 폴리아크릴산, 예컨대, 폴리(에틸렌-코-메타크릴산, 나트륨염) 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 기타 고분자전해질, 예컨대 양쪽성 고분자전해질(즉, 극성 및 비극성 부분을 가짐) 또한 개시된 방법으로 이용될 수 있다고 이해된다. 예를 들어, 적합한 양쪽성 고분자전해질의 일부 예로는, 폴리(스티릴-b-N-메틸 2-비닐 피리디늄 요오드) 및 폴리(스티릴-b-아크릴산)을 들 수 있으나 이에 한정되지 않고, 이 둘 다 캐나다 도르발의 폴리머 소스(Polymer Source, Inc)사로부터 시판된다. 고분자전해질의 추가 예들로는 Song , 등에 허여된 미국 특허 공보 제 2003/0124739 호에 더욱 상세하게 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조 병합된다.
비록 임의 고분자전해질이 일반적으로 이용될 수 있지만, 특정 적용 분야에 대해 선택된 고분자전해질은 콘쥬게이트된 프로브의 성질에 따라서 달라질 수 있다. 구체적으로, 고분자전해질의 분산된 전하는 반대 전하를 가진 기질에 결합될 수 있게 한다. 따라서, 예를 들어, 알짜 양전하를 갖는 고분자전해질이 종종 음전하를 띄는 콘쥬게이트 프로브(예컨대, 착색된 입자)와의 결합이 더 잘 되는 반면에 알짜 음전하를 갖는 고분자전해질은 종종 양전하를 띄는 콘쥬게이트 프로브와의 결합력이 더 좋다. 따라서, 이런 경우에는, 이 분자들 사이의 이온결합이 검출 구역 (31) 내에서 요구되는 결합을 일으킨다. 그럼에도, 비록 이온결합이 필요한 결합을 이루는 데 우선적으로 사용되나, 고분자전해질이 유사한 전하를 가진 프로브와 결합될 수 있다는 것 또한 발견되었다.
일 구현예에 따르면, 검출가능한 물질을 포함하는 프로브에 콘쥬게이트된 효소 반응 생성물이 검출 구역 (31) 내의 수용 물질에 대해 친화력을 가질 수 있다. 이 경우에는, 검출가능한 물질에 의해 발생된 신호가 검출되도록 하기 위해 효소 반응 생성물과 수용 물질 사이의 특이적 결합을 통해 콘쥬게이트된 프로브가 검출 구역 (31) 내에 고정화될 수 있다. 예를 들어, 효소 반응 생성물은 제 1 특이적 결합위치를 통해 프로브에 결합될 수 있고, 효소 반응 생성물이 수용 물질에 대한 특이적 친화력을 보이는 제 2 특이적 결합 위치를 포함할 수 있다.
검출 구역 (31)은 일반적으로 사용자가 시험 시료 내 효소의 농도를 더 잘 측정하도록 임의 수의 뚜렷한 검출 영역을 제공할 수 있다. 이용시에, 각 영역은 동일하거나 상이한 수용물질을 함유할 수 있다. 예를 들어, 검출 구역 (31)이 둘 이상의 뚜렷한 검출 영역(예를 들어, 선, 점 등)을 포함할 수 있다. 둘 이상의 뚜렷한 검출 영역의 사용은 반응성 복합체나 기타 물질들의 과잉에 기인하는 잠재적인 거짓 양성(false positive)의 저해 및/또는 세미-정량의 촉진과 같은 특정한 이점을 제공할 수 있다. 검출 영역은 크로마토그래피 매질 (23)을 통한 시험 시료의 흐름 방향에 실질적으로 수직 방향의 선의 형태로 배치될 수 이다. 마찬가지로, 일부 구현예에 있어서, 검출 영역은 매질 (23)을 통한 시험 시료의 흐름에 실질적으로 평행 방향인 선의 형태로 배치될 수 있다.
도 1 에 나타난 구현예에 있어서, 시험 시료 내에 효소의 농도가 증가됨에 따라, 더 많은 콘쥬게이트 프로브가 형성되고 검출 구역 (31)에 고정화된다. 검출 구역 (31)에서 검출가능한 효소 반응 생성물의 증가량은 신호 강도의 증가를 초래한다. 이 신호 강도의 증가로부터, 효소의 존재 또는 농도가 쉽게 측정될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 효소량은 검출 구역 (31)에서의 신호 강도, I1에 정비례한다. 필요하다면, 공지된 효소 농도 범위에 있어서 신호 강도 I1을 효소 농도에 대하여 플롯팅하여 강도 곡선을 산출할 수 있다. 미지의 시험 시료 내의 효소를 정량하기 위해, 신호 강도를 강도 곡선에 따라 효소 농도로 변환시킬 수 있다.
검출 구역 (31)의 하나 이상의 뚜렷한 영역이 신호 강도와 효소 농도 사이의 상술된 관계를 나타낼 수 있음을 알 수 있다; 그러나 각각의 뚜렷한 영역이 이러한 관계를 보일 필요는 없다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 다수의 뚜렷한 영역 중 하나만이 효소의 농도에 정비례하는 신호 강도를 나타낼 수 있다. 다른 뚜렷한 영역의 신호 강도, 예를 들어, 거짓 양성 감소에 사용된 것은 일정하게 남아있거나, 신호 강도의 증가 및/또는 감소를 보여줄 수 있다. 검출 구역 (31)의 뚜렷한 영역 중 적어도 하나 이상이 직접적 관계를 만족시키는 한, 검출 구역 (31)에 의해 나타난 신호 강도는 효소 농도에 정비례한다고 여겨진다.
개시된 본 발명의 특정 구현예는 분석 장치상의 시료 적용 부위를 사용할 수 있다. 따라서, 시험 시료는 콘쥬게이트 패드 (22)의 업스트림에 있는 장치에 직접 적용될 수 있다. 이와 관련하여, 시료 적용 부위를 포함하여 장치에 시험 시료를 적용하는 다양한 구현예를 지금부터 더욱 상세히 기재할 것이다. 예를 들어, 도 2를 참조하여, 분석 장치 (120)는 지지체 (121)상에 위치한 크로마토그래피 매질 (123), 흡수제 물질 (128), 및 시료 적용 패드 (124)를 포함함을 보여준다. 시험 시료는 시료 적용 패드(124)에 직접적으로 적용된다. 시료 적용 패드 (124)는 확산 또는 비확산적으로 이에 고정된 하나 이상의 분석 전처리 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 시료 적용 패드 (124)가 하나 이상의 분자 기질, 보조인자, 완충액, 저해제, 또는 효소 반응을 촉진하는데 유용한 기타 시약을 함유할 수 있다. 시험 시료를 시료 적용 패드 (124)에 적용시에 형성된 혼합물 내에서 상기 기질과 효소가 서로 접촉하여 상호작용할 수 있다. 따라서, 시료 적용 패드 (124)는 효과적으로 장치상의 반응 구역을 한정할 수 있다. 일부 구현예에서, 접촉 시간/반응 시간이 시료 적용 패드 (124)의 이용을 통해 더욱 구체적으로 제어될 수 있다. 예를 들어, 시료 적용 패드 (124)의 다공성을 조절하여 시료 적용 패드 (124)로부터 장치 (120)의 인접 섹션까지의 혼합물의 유속을 조절할 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 시료 적용 패드 (124)는 배리어(barrier)를 통해 장치 (120)의 인접 부위로부터 일시적으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 시료 적용 패드는 혼합물이 형성되고 유지될 수 있는 웰을 한정할 수 있다. 요구되는 접촉 기간 후에, 일시적 배리어, 예컨대 게이트를 제거할 수 있고 혼합물이 다공성 막, 유체 채널 등을 통해 콘쥬게이트 패드 (122)로 흘러갈 수 있다.
검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 프로브가 혼합물의 성분에 결합하도록 배열된 콘쥬게이트 패드 (122)에 확산적으로 고정화될 수 있다. 예를 들어, 상기 프로브가 상술된 바와 같은 검출가능한 물질을 포함할 수 있다. 프로브들은 또한 표지되거나 그렇지 않으면 검출가능한 물질이 적용된 입자를 함유할 수 있다. 일부 경우에는, 어떤 방법으로 프로브를 개질하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 프로브가 특이적 결합원으로 개질되어 효소 반응 생성물, 분자 기질, 또는 다른 혼합 성분에 대해 특이적 친화력을 가진 프로브가 형성될 수 있다. 특이적 결합원은 일반적으로 임의 다양한 공지된 기법들, 예를 들어 상술한 바와 같은 방법으로 공유결합 및/또는 물리 흡착법을 사용하여 프로브에 적용될 수 있다. 하나의 특정 구현예에 있어서, 프로브 표면상의 카르복실기가 활성화되고 특이적 결합원의 아미노 기와 반응하여 아미드 결합을 형성한다.
이의 특정 배열과 관계없이, 분석 장치 (120)가 통상적으로 혼합물의 성분, 예를 들어 효소 반응 생성물이 포획되고 검출될 수 있는 검출 구역 (131)을 포함한다. 효소 반응 생성물이 다양한 분석 포맷을 이용하여 검출 구역 (131)내애서 검출될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 예를 들어, "샌드위치"분석 포맷이 사용되며, 이는 프로브의 특이적 결합원이 효소 반응 생성물에 대한 친화력을 갖는 것으로 선택된다. 효소 반응 생성물, 예를 들어, 항체, 항원 등이 통상적으로 둘 이상의 결합위치(예컨대, 에피토프)를 가진다. 이 결합위치 중 하나는 프로브의 특이적 결합원이 차지하여 콘쥬게이트 프로브가 형성된다. 그러나, 효소 반응 생성물의 자유 결합 위치는 이어서 제 1 검출 구역 (131) 내에 고정화된 수용 물질에 결합되어 새로운 삼원의 샌드위치 복합체가 형성된다. 이와달리, 효소 반응 생성물이 직접 또는 간접 "경쟁적" 분석 포맷을 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 경우에는, 프로브의 특이적 결합원이 효소 반응 생성물의 유사물이거나 동일할 수 있다. 따라서, 검출 구역 (131)에 도달시, 검출 프로브와 효소 반응 생성물이 고정화된 수용 물질의 이용가능한 결합 위치를 두고 경쟁한다. 물론 다른 임의 분석 포맷 또한 사용하기에 적합하다.
도 2에 보여진 구현예에 대해서, 효소 농도가 시험 시료 내에서 증가하기 시작함에 따라, 더 많은 효소 반응 생성물이 혼합물 내에서 형성된다. 따라서, 샌드위치 분석 포맷이 사용된다면, 더 많은 효소 반응 생성물이 검출가능한 프로브와 결합하여 콘쥬게이트 프로브를 형성하여, 효소량이 검출 구역 (131)에서 신호 강도에 정비례한다. 반면에, 경쟁적 분석 포맷이 사용된다면, 효소량은 검출 구역 (131)에서 신호 강도에 반비례한다. 필요하다면, 신호 강도를 공지된 효소 농도 범위의 효소 농도에 대해 플롯팅하여 강도 곡선을 산출할 수 있다. 미지의 시험 시료 내의 효소량을 측정하기 위해, 신호 강도는 강도 곡선에 따라서 효소 농도로 변환될 수 있다.
본 발명에 개시된 분석 장치는 장치상 추가 구역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 3을 참조로 하여, 분석 장치 (120)은 검출 구역 (131)의 하류에 위치한 제 2 검출 구역 (135)를 포함하는 것을 제외하고는 도 2의 분석 장치 (120)과 동일하게 예시되었다. 제 2의 검출 구역 (135)는 하나 이상의 뚜렷한 영역(예컨대, 선, 점 등)을 제공할 수 있고, 혼합물의 흐름에 대해 임의 방향에 위치할 수 있다. 제 2 수용 물질이 제 2 검출 구역 (135) 내의 매질 (123)상에 고정화된다. 제 2 수용 물질은 제 1 검출 구역 (131)내 결합되지 않는 임의의 검출가능한 물질에 대한 고정적 결합 위치의 역할을 할 수 있다. 예를 들어, "직접" 경쟁적 분석이 사용되는 일 구현예에 있어서, 제 1 수용 물질이 효소 반응 생성물과 프로브 둘다에 대한 특이적 결합 친화력을 갖는 항체를 함유할 수 있다(즉, 효소 반응 생성물의 것과 동일 또는 유사한 특이적 결합원이 결합되어 있음). 제 2 수용 물질은 프로브에 대해 특이적 결합 친화력을 갖는 고분자전해질을 함유한다. 혼합물의 효소 반응 생성물은 존재시에 제 1 수용 물질의 이용 가능한 결합 위치를 두고 프로브와 경쟁한다. 임의의 잔류 비결합 프로브는 제 1 검출 구역 (131)을 지나 제 2 검출 구역 (135)로 이동한다. 프로브가 제 2 수용 물질에 대한 특이적 친화력을 가지고 있기 때문에, 이들은 제 2 검출 구역 (135) 내에서 고정화된다.
마찬가지로, "간접" 경쟁적 분석이 사용되는 다른 구현예에 있어서, 효소 반응 생성물은 특이적 결합원(예컨대, 비오틴)을 함유할 수 있고 프로브는 효소 반응 생성물에 대한 친화력을 갖는 상보적 결합원(예컨대, 스트렙타비딘)과 결합된 착색된 입자일 수 있다. 제 1 수용 물질은 효소 반응 생성물의 유사물이거나 동일한 특이적 결합원을 함유함으로써, 프로브에 대한 친화력을 가진다. 제 2 수용 물질은 역시 프로브에 대한 결합 친화력을 갖는 고분자전해질을 함유한다. 효소 반응 생성물은 존재시에 프로브에 결합하여 콘쥬게이트된 프로브를 형성함으로써, 그렇지 않으면 제 1 수용 물질과 결합할 수 있었을 프로브의 양을 감소시킨다. 대신에, 효소 반응 생성물과 복합체를 이룬 상기 콘쥬게이트된 프로브는 제 1 검출 구역 (131)을 통과해 제 2 검출 구역 (135)로 이동한다. 프로브는 선택된 고분자전해질에 대한 특이적 친화력을 가지고 있기 때문에, 이들은 제 2 검출 구역 (135) 내에서 고정화된다.
상기 경쟁적 분석 구현예에 있어서, 효소의 농도가 증가함에 따라, 제 2 검출 구역 (135)의 신호 강도 I2 또한 혼합물내 효소 반응 생성물의 존재로 인하여 증가하기 시작한다. 상기 신호 강도의 증가로부터, 효소의 존재 또는 농도를 쉽게 측정할 수 있다. 예를 들어 일 구현예에 있어서, 효소의 양은 제 2 검출 구역 (135)에서의 신호 강도 I2에 정비례한다. 필요하다면, 신호 강도 I2 를 공지된 효소 농도 범위의 효소 농도에 대하여 플롯팅하여 강도 곡선을 산출할 수 있다. 미지의 시험 시료의 효소량을 결정하기 위해, 신호 강도를 강도 곡선에 따라 효소 농도로 변환할 수 있다. 제 1 검출 구역 (31) 및/또는 (131)에 관하여 상술한 바와 같이, 제 2 검출 구역 (135)의 하나의 뚜렷한 영역이 정비례 관계를 만족시키는 한, 제 2 검출 구역 (135)에 의해 나타난 신호 강도는 효소 농도에 정비례하는 것으로 여겨진다고 이해된다.
또한, 상기에 참조된 구현예에 있어서, 검출 구역 (131) (I1) 과 제 2 검출 구역 (135) (I2) 에서의 신호 강도 사이에 반비례 관계가 존재할 수 있다. 예를 들어, 소정의 프로브가 존재하기 때문에, 제 2 검출 구역 (135)에서의 포획량은 검출 구역 (131)에서의 포획량과 반비례한다. 이 반비례 관계의 결과, 일부 경우에서는, 효소의 농도가 두 검출 구역 모두에서의 신호 강도를 비교함으로써 광범위에 걸쳐 더 효과적으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에 있어서, 효소량은 신호 강도 "I1" 에 대한 신호 강도 "I2" 의 비에 정비례한다. 이 비율이 속하는 범위를 기초로, 효소에 대한 일반적인 농도 범위를 측정할 수 있다. 필요하다면, I1 에 대한 I2 비를 공지된 효소 농도 범위의 효소 농도에 대하여 플롯팅하여 강도 곡선을 산출할 수 있다. 미지 시험 시료 내의 효소량을 측정하기 위해서, 이 신호 강도비를 강도 곡선에 따라서 효소 농도로 변환될 수 있다. I1 와 I2 사이의 대체 수학적 관계를 효소 농도에 대해 플롯팅하여 강도 곡선을 산출할 수 있음을 주목한다. 예를 들어, 일 구현예에 있어서, I2/(I2+I1)의 값을 효소 농도에 대하여 플롯팅하여 강도 곡선이 산출될 수 있다.
장치는 추가적인 검출 구역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 장치는 혼합물의 제 2 성분이 검출될 수 있는 검출 구역을 포함할 수 있다. 수용 물질이 혼합물의 제 2 성분에 대한 특이적 결합원인 상기 제 2 검출 구역 내에서 고정화될 수 있다. 예를 들어, 효소 반응 생성물이 제 1 검출 구역에서 결합 및 검출될 수 있고, 분자 기질이 제 2 검출 구역에서 결합 및 검출될 수 있다. 장치 상에 포함될 수 있는 기타 구역으로는 예를 들어, 상기 장치가 적절하게 작동하게 하기 위한 대조군 구역, 상기 장치에 내부 보정 능력을 제공하기 위한 하나 이상의 보정 구역 등이 포함될 수 있다.
상술한 바와 같이, 신호 강도는 정성적, 정량적, 및/또는 세미-정량적으로 측정될 수 있다. 정량적 결과가 필요한 구현예에 있어서, 신호 강도는 당업계에 공지된 임의의 다양한 기법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서 형광 검출 기법이 이용된다.
상기 검출 기법은 효소와의 관계에서 구체적으로 설명된다. 그러나 상술한 바와 같이, 현재 개시된 장치는 시험 시료 내의 효소 저해제의 존재나 양을 검출하는 데 있어서 동등하게 적합하다. 시험 시료 내 효소 저해제의 존재를 검출하기 위해서, 소정량의 상응하는 효소를 시험 시료에 혼합하고 인큐베이션시킨다. 특정량의 효소 저해제의 존재하에서, 효소-촉매 반응은 검출가능한 속도로 진행되지 않는다. 따라서, 효소 저해제 농도와 신호 강도 사이의 관계는 효소 농도와 신호 강도 사이의 관계와 반대일 수 있다. 예를 들어, 예시로서 도 1을 사용하여, 효소-촉매 반응이 특정량의 저해제 존재하에는 일어나지 않을 것이다. 따라서, 효소 반응 생성물은 형성되지 않을 것이고 검출 구역 (31)은 검출가능한 신호를 발생시키지 못할 것이다. 반면에, 효소 저해제의 양이 감소하면, 효소는 상술한 바와 같이 효소 반응을 형성하게 한다. 따라서 검출 구역 (31)에서 발생된 신호 강도는, 효소 반응 생성물의 존재하에서의 상응하는 증가로 인해 증가하기 시작한다. 따라서, 이 특정 구현예에 있어서, 시험 시료 내 효소 저해제의 양은 검출 구역 (31)에서의 신호 강도에 반비례한다.
도 4를 참조하여, 지금부터 형광을 사용하여 프로테아제의 존재를 검출하기 위한 방법의 일 구현예를 더욱 상세히 기재한다. 초기에, 프로테아제 P가 함유된 시험 시료를 시료 적용 패드 (124)에 적용하며, 여기서 시료가 분자 기질 (47)(예컨대, 단백질 또는 당단백질)과 접촉한다. 분자 기질(47)이 프로테아제 P와 접촉하여, 분자 기질 (47)과 프로테아제 P 사이의 효소-촉매 반응의 효소 반응 생성물인 폴리펩티드 (42) 및 (43)을 포함하는 혼합물을 형성한다. 상기 혼합물은 또한 미반응 분자 기질 (47), 및 프로테아제 P 를 포함한다. 혼합물은 화살표가 가리키는 대로 콘쥬게이트 패드 (122)로 흐른다.
검출가능한 물질 및 효소 반응 생성물 (43)에 대한 특이적 결합원을 포함하는 프로브 (44)가 콘쥬게이트 패드 (122)에 확산적으로 고정화된다. 콘쥬게이트 패드 (122)에서 프로브 (44)와 상기 혼합물의 상호작용시, 효소 반응 생성물 (43)이 특이적으로 프로브 (44)와 결합하여 콘쥬게이트 프로브 (45)를 형성한다. 프로브 (44)는 콘쥬게이트 패드 (122)에 확산적으로 고정화되었으므로, 콘쥬게이트 프로브 (45)를 포함하는 혼합물은 검출 구역 (131)로 이동한다. 효소-촉매 반응에 의해 생성된 효소 반응 생성물 (43)의 제 2 결합 위치에 대해 특이적인 수용 물질 (90)이 검출 구역 (131) 내에 고정화된다. 따라서, 검출 구역 (131) 내의 이용가능한 결합 위치에는 콘쥬게이트된 프로브 (45)가 결합할 수 있다.
일단 포획되면, 콘쥬게이트된 프로브 (45)의 신호 강도를 검출 구역 (131)에서 측정할 수 있다. 형광 검출은 일반적으로 여기 광자로부터 방출 광자를 분리하는 파장 필터링, 및 방출 광자를 기록하고 통상적으로 전기신호 또는 영상으로서 기록가능한 출력을 생산하는 검출기를 이용한다. 사용되는 적당한 형광 검출기의 하나가 플루오로로그 III 스펙트로플루오로미터(FluoroLog III Spectrofluorometer)이며, 이는 뉴져지, 에디슨 소재의 SPEX 사(SPEX Industries, Inc.) 에서 판매한다. 적당한 형광 검출기의 다른 예는 Song 등의 미국 특허 공보 제 2004/0043502 호에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조 병합된다. 비록 이 특정 구현예에서는 형광이 이용되나, 임의의 다른 공지된 검출 기법 또한 이용될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 기타 적절한 광학 검출 기법으로는, 인광, 회절, 반사율, 투과도 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 광학 판독기는 빛을 방출시킬 수 있고 또한 검출 신호(예컨대, 투과 또는 반사된 빛, 방출된 형광 또는 인광 등)을 기록할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에 있어서, 반사 분광광도계 또는 판독기를 이용하여 가시적인 색을 나타내는 리포터 (예, 착색된 라텍스 미소입자) 의 존재를 검출할 수 있다. 적절한 반사율 판독기 중 하나는 예를 들어, Kaylor 등에 허여된 미국 특허 출원 공보 제 2003/0119202 호에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위하여 그 전체가 본원에 참조 병합된다.
신호 강도를 측정하기 위해 사용된 기법과 관계없이, 프로테이제 P의 존재 또는 양은 검출 구역 (131)에서의 신호 강도에 의해 확인할 수 있다.
도 5를 참조하여, 경쟁적 유형 분석을 통해 형광을 이용하여 전이효소의 존재를 검출하기 위한 방법의 일 구현예를 하기에 더욱 상세히 기재할 것이다. 우선, 전이효소 T 를 함유하는 시험 시료를 분자 기질 (67)(예컨대, 폴리펩티드)를 함유하는 시료 적용 패드 (124)에 적용한다. 분자 기질 (67)을 전이효소 T와 충분한 시간 동안 접촉시켜 전이 효소의 표적이 되는 부분(예컨대, 인)을 제공할 수 있는 성분 (64)(예컨대, ATP)를 포함하는 혼합물을 형성한다. 단순히 시료 적용 패드(124)로부터 콘쥬게이트 패드 (122)로의 유동을 위한 시간일 수 있는 접촉 시간후에, 혼합물은 미반응 분자 기질 (67), 전이 효소 T 및 효소-촉매 반응에 의해 생성된 생성물 (68) (예를 들어, 인산화 폴리펩티드) 을 포함할 수 있다. 상기 혼합물은 화살표가 가리키는 바와 같이 콘쥬게이트 패드 (122) 로 흐른다. 효소 촉매 반응의 생성물 또는 이의 유사물을 포함하는 검출가능한 프로브 (70)은 콘쥬게이트 (122) 내 또는 표면상에 확산적으로 고정화된다. 혼합물이 시료 적용 패드 (124) 에서 검출 구역 (131)로 이동할 때, 검출가능한 (70) 이 골라내져서 혼합물과 함께 이동한다. 효소-촉매 반응에 의해 생산되는 생성물 (68)에 대해 특이적인 수용 물질 (91)이 검출 구역 (131) 내에 고정화된다. 따라서 혼합물 내에서 형성된 생성물 (68) 및 검출가능한 프로브 (70) 이 검출 구역 (131) 내의 이용가능한 결합 위치를 두고 경쟁한다. 일단 포획되면, 신호 강도는 본 발명에 기재된 다른 구현예에 설명된 바와 같이 측정 및 분석될 수 있다. 구체적으로 이 구현예에 있어서, 더 큰 신호는 시험 시료 내의 낮은 전이효소 T 농도를 나타내게 되는데, 이는 검출 구역 (31) 내의 다수의 이용가능한 결합 위치를 검출가능한 프로브 (70) 이 차지하게 되기 때문이다.
도 6은 대조군 구역 (136)을 포함하는 시험 장치의 다른 구현예를 예시하고 있다. 이 구현예에 따르면, 효소 E 를 포함하는 시험 시료를 시료 적용 패드 (124)에서 장치에 적용할 수 있다. 상기 시료 적용 패드 (124)는 분자 기질 (147)을 포함하는 효소 촉매 반응의 시약을 포함한다. 시험 시료는 시료 적용 패드 (124)의 시약과 결합하여 혼합물을 형성하는데, 상기 혼합물 내에서 효소-촉매 반응이 일어나 하나 이상의 효소 반응 생성물 (143)을 형성할 수 있다. 시험 시료는 상술한 바와 같이 일정 시간 동안 시료 적용 패드 (124)에서 유지되거나 또는 컨쥬게이트 패드 (122) 로 직접 이동할 수 있다. 검출가능한 물질 및 분자 기질 (147)에 대한 특이적 결합원을 포함하는 프로브 (144)는 콘쥬게이트 패드 (122)에 확산적으로 고정화된다. 콘쥬게이트 패드 (122)에서 시험 시료와 프로브 (144)의 상호작용시에, 혼합물 내에 잔류하는 미반응 분자 기질 (147)은 프로브 (144)와 특이적으로 결합하여 기질 콘쥬게이트 (145)를 형성한다. 프로브 (144)가 콘쥬게이트 (122)에 확산적으로 고정화됨에 따라, 임의의 기질 콘쥬게이트 (145)를 포함하는 혼합물은 검출 구역 (131)로 이동한다. 분자 기질 (147)의 제 2 결합 위치에 대해 특이적인 수용 물질 (190)은 검출 구역 (131) 내에 고정화된다. 따라서, 검출 구역 (131) 내의 이용가능한 결합 위치에는 기질 콘쥬게이트 (145)가 결합될 수 있다. 일단 포획되면, 기질 콘쥬게이트 (145)의 신호 강도를 검출 구역 (131)에서 측정할 수 있다. 예를 들어, 큰 신호 강도는 혼합물 내에 미반응 분자 기질 (147)의 고농도를 나타할 수 있고, 따라서 시험 시료 내에는 효소가 없거나 거의 없음을 나타낸다. 도 6의 구현예는 또한 분석이 적절히 실행되고 있다는 신호를 사용자에게 제공하는 대조군 구역 (136)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 대조군 구역 (136) 은 기질 콘쥬게이트 프로브 (145) 및 프로브 (144) 둘 다를 포함할 수 있는 프로브를 포획하기 위한 대조군 구역 (136) 내에 고정화된 고분자전해질 수용 물질 (170) 을 포함한다.
하나의 예시적인 적용에 있어서, 분석 장치는 RAS 단백질 활성 사이클에 포함되는 전이 효소의 존재를 측정하기 위해 사용될 수 있다. RAS 단백질은 광범위한 신호 경로에 대한 중요한 분자 스위치로서 기능한다. 이 경로는 세포골격 완전성, 세포접착 및 이동, 및 세포사멸(apoptosis)을 포함하는 과정을 조절한다. RAS 단백질은 활성형(RAS-GTP)과 비활성형 (RAS-GDP) 사이를 순환한다.
RAS 단백질은 종종 암에서 제어되지 않고 그 결과 세포사멸의 감소 뿐만 아니라, 침입과 전이의 증가를 가져온다. 따라서, RAS-GTP를 이의 비활성형인 RAS-GDP로 되돌리는 GTP 가수분해의 속도를 증가시키는 GTPase-활성화 단백질(GAPs)의 존재를 측정하는 데 상기 분석 장치를 이용할 수 있다. 예를 들어, GAP를 함유하는 시험 시료를 RAS-GTP 분자 기질과 혼합할 수 있다. 상기 분자 기질을 충분한 시간 동안 시험 시료와 접촉시켜서 미반응 분자 기질(RAS-GTP), GAP, 및 효소-촉매 반응에 의해 생산된 생성물(RAS-GDP)을 포함할 수 있는 혼합물을 형성한다. 상기 혼합물을 분자 기질(RAS-GTP) 또는 효소-촉매 반응의 생성물(RAS-GDP) 중 어느 하나에 대해 특이적인 결합제로 표식된 검출가능한 프로브를 함유한 콘쥬게이트 패드로 흐르게 한다. 예를 들어, 프로브는 특정 대사 경로에서 RAS-GTP에 의해 활성화된 MAP 키나아제로 표지될 수 있다. 혼합시에, 상술한 바와 같이, 미반응 분자 기질은 MAP 키나아제-표식된 프로브에 특이적으로 결합하여 기질 콘쥬게이트를 형성할 수 있고, 이어서 혼합물은 검출 구역으로 이동한다. RAS-GTP에 대해 특이적인 제 2 수용 물질, 예를 들어 제 2 MAP 키나아제는 상기 검출 구역에서 고정화된다. 따라서 상기 검출 구역 내의 이용가능한 결합 위치를, 미반응 기질을 포함하는 콘쥬게이트 패드에서 형성된 기질 콘쥬게이트가 차지할 수 있다. 따라서 검출가능한 프로브에 연결된 형광 입자 또한 검출 구역에 결합될 것이다. 일단 포획되면, 신호 강도를 본원에 기재된 다른 구현예에서 상술한 바와 같이 측정 및 분석하여 시험 시료 내의 GAPs의 존재를 측정할 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 측방 흐름 분석 장치를 이용하여 RAS 활성화 단백질의 존재를 측정할 수 있다. 예를 들어, 측방 흐름 분석 장치를 이용하여 RAS-GDP의 이의 활성형인 RAS-GTP로의 재활성화를 촉매하는 G 교환 인자(GEF)(예컨대, CDC25, SOS1, SOS2)의 존재를 확인할 수 있다. 이 구현예에 따르면, 분자 기질은 단백질의 비활성형인 RAS-GDP 일 수 있다. 활성화 GEF를 함유하는 시험 시료와 상기 분자 기질이 접촉시에, RAS-GDP는 RAS-GTP 형으로 활성화될 수 있다. 이 경우 생성물(RAS-GTP)가 콘쥬게이트 패드에서 검출가능한 기질과 콘쥬게이트될 수 있고, 이어서 검출 구역에 고정화된 특이적 결합제, 예컨대 MAP키나아제에 의해 포획되어, 시험 시료 내 GEF 의 존재 또는 양을 측정할 수 있다.
측방 흐름 분석 장치의 다른 적용의 예는 시험 시료 내 엔지오텐신(angiotensin)-전환 효소(ACE)의 존재의 측정일 수 있다. ACE 는 엔지오텐신 I의 엔지오텐신 II로의 전환을 촉매하는 엑소펩티다아제이다. 엔지오텐신I 이 주로 엔지오텐신II의 전구체로서 존재하는 것으로 나타나는데 반해, 엔지오텐신 II는 강력한 혈관수축제이고 고혈압, 심장병 및 당뇨성 신장해와 같은 질환에서 중요한 역할을 한다고 여겨진다. 이 특정 구현예에 있어서, 측방 흐름 분석 장치는 엔지오텐신 I와 같은 분자 기질을 포함할 수 있다. ACE를 함유하는 시험 시료와 분자 기질의 접촉시에, 엔지오텐신 I이 엔지오텐신 II 로 전환될 수 있다. 측방 흐름 분석 장치의 검출 구역은 그 안에서 고정화된, 예컨대 AT1 또는 AT2 수용체와 같은 엔지오텐신 II 에 대한 특이적인 수용 물질을 포함할 수 있다. 검출 구역 내 검출가능한 프로브 (예컨대, 콘쥬게이트 패드에서 형성된 엔지오텐신 II 콘쥬게이트된 프로브) 의 결합 및 검출이 시험 시료 내 ACE의 존재를 나타낼 수 있다.
본 발명에 기재된 측방 흐름 분석 장치가 효소 또는 이의 저해제의 현장 시험을 빠르게 수행하기 위한 비교적 간단하고 비용면에서 효율적 방법을 제공할 수 있다. 상기 장치는 신뢰도 높고 일관된 시험 결과에 도움이 되는 시험 조건 하에서 신속한 방식으로 시험을 수행하는 실험자가 쉽게 관찰할 수 있도록 가시적인 시험 결과를 제공할 수 있다. 측방 흐름 분석 장치는 또한, 필요하다면 시험 종료시에 폐기될 수 있도록 일회용일 수 있다.
하기 실시예를 참조하여 본 발명을 더 잘 이해할 수 있다.
실시예 1
기질을 준비하기 위해서, 헤모글로빈을 EX-LC-비오틴(Pierce Biotechnology로부터 입수가능)을 사용하여 붕산염 완충제 중에서 비오틴화시켰다. 상기 비오틴화 헤모글로빈을 투석으로 정제하였다.
측방 흐름 장치를 하기와 같이 제조하였다:
시료 패드를 형성하기 위하여, 유리 섬유 패드에 수크로오스/Tween-20 함유 PBS 완충액에 용해된 상기 정제된 비오틴화 헤모글로빈이 스며들게 하였다. 이어서 상기 유리 섬유 패드를 37℃에서 건조시켰다.
콘쥬게이트 패드를 형성하기 위하여, 제 2 유리 섬유 패드에 Bangs Laboratories, Inc. 에서 입수가능한 스트렙타비딘으로 태그된 블루 입자, 수크로오스 및 Tween-20 을 함유한 용액이 스며들게 하였다. 이어서 상기 제 2 유리 섬 유 패드를 건조시켰다.
니트로셀룰로오스 막 카드에 항-비오틴 항체를 줄무늬 형태로 적용시켜 검출 구역을 형성하고 폴리리신을 줄무늬 형태로 적용시켜 대조군 구역을 형성하였다. 상기 물질의 적용 후에 니트로셀룰로오스 막 카드를 건조시켰다.
그런 다음, 콘쥬게이트 패드 및 셀룰로오스 패드를 검출 구역과 대조군 구역을 가진 니트로셀룰로오스 막의 양쪽 말단에 적층시켰다. 무(無)시약 유리 섬유 패드와 헤모글로빈-적재 유리 섬유 패드도 니트로셀룰로오스 막 카드에 적층시켰다. 구체적으로, 무 시약 유리 섬유 패드를 콘쥬게이트 패드와 헤모글로빈-적재 시료 패드 사이에 적층시켜서 효소 반응 시간을 조절하였다. 그런 다음, 조립된 카드를 몇 개의 각각 대략 4mm 너비의 장치로 절단했다.
분석은 상기 형성된 장치로 수행하였다. S. Griseus 의 프로테아제를 다양한 농도로 PBS 완충액에 희석하고 헤모글로빈-적재 시료 패드에 직접 적용하였다. 이렇게 형성된 혼합물은 시료 패드로부터 무 시약 유리 섬유 패드 및 콘쥬게이트 패드 상으로, 검출 구역 및 대조군 구역으로 각각 흘렀다.
통상적인 작동에 대한 결과는 도 7에 도식적으로 예시하였다. 예시된 분석 장치의 선 1 ~ 4 는 각각 30㎍/mL, 0.3㎍/mL, 0.03㎍/mL 농도의 프로테아제 및 대조군 0.0㎍/mL 로 처리하였다. 적용 후 대략 20분에, 프로테아제가 없거나 거의 포함하지 않은 시료가 적용된 선 3 및 4 의 검출 구역에서 두 개의 강한 블루 밴드가 관찰되었다. 대조적으로, 선 1 및 2 - 고농도의 프로테아제를 포함하는 시료 -의 검출 구역에서는 약한 밴드 또는 전혀 밴드가 발견되지 않았다.
본 발명을 이의 구체적인 구현예에 관하여 상세히 기재하였지만, 당업자라면 상기 내용을 이해하고 상기 구현예의 변경, 변화 및 동등예를 용이하게 구상할 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항과 이의 임의의 동등물의 것으로서 평가되어야 한다.

Claims (25)

  1. 검출 구역을 한정하는 크로마토그래프 매질, 촉매화 반응을 거쳐 생성물을 형성할 수 있는 분자 기질, 및 추가로 검출 신호를 발생시킬 수 있는 검출가능한 물질을 포함하며, 여기서 효소, 또는 이의 저해제의 존재 또는 양이 상기 검출 구역 내의 상기 검출 신호로부터 측정될 수 있는 것인, 시험 시료 내의 효소, 또는 이의 저해제의 존재 또는 양의 검출을 위한 측방 흐름 분석 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분자 기질이 제 1 특이적 결합원을 포함하고, 상기 생성물이 제 2 특이적 결합원을 포함하는 측방 흐름 분석 장치.
  3. 제2항에 있어서, 상기 검출가능한 물질이 제 3 특이적 결합원에 직접 또는 간접적으로 결합되는 측방 흐름 분석 장치.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제 3 특이적 결합원이 상기 제 1 특이적 결합원 및 상기 제 2 특이적 결합원 중 하나에 대해 친화력을 갖는 측방 흐름 분석 장치.
  5. 제3항에 있어서, 상기 제 3 특이적 결합원이 상기 제 1 특이적 결합원 및 상기 제 2 특이적 결합원 중 하나와 동일하거나 또는 이의 유사물인 측방 흐름 분석 장치.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래프 매질이, 상기 검출가능한 물질이 확산적으로 고정화된 콘쥬게이트 구역을 추가로 한정하며, 여기서 상기 분자 기질 및 상기 생성물 중 하나 이상이 상기 콘쥬게이트 구역 내의 상기 검출가능한 물질과 접촉하는 측방 흐름 분석 장치.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래프 매질이, 상기 분자 기질이 확산적으로 고정화된 적용 부위를 추가로 한정하며, 여기서 상기 시험 시료가 상기 적용 부위 내의 상기 분자 기질과 접촉하는 측방 흐름 분석 장치.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 수용 물질이 상기 검출 구역 내에 고정화되고, 상기 제 1 수용 물질이 상기 분자 기질 및 상기 생성물 중 하나와 결합되는 측방 흐름 분석 장치.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 매질이, 제 2 검출 신호가 발생될 수 있는 제 2 검출 구역을 추가로 한정하는 측방 흐름 분석 장치.
  10. 제9항에 있어서, 제 2 수용 물질이 상기 제 2 검출 구역 내에 고정화되며, 여기서 상기 제 2 수용 물질이 상기 제 2 검출 신호를 발생시킬 수 있는 검출가능 한 물질과 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있는 측방 흐름 분석 장치.
  11. 제10항에 있어서, 시험 시료 내의 효소량이 상기 제 2 검출 신호의 강도에 정비례하는 측방 흐름 분석 장치.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 효소가 가수분해효소인 측방 흐름 분석 장치.
  13. 제12항에 있어서, 가수분해효소가 프로테아제 또는 펩티다아제인 측방 흐름 분석 장치.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자 기질이 카세인, 알부민, 헤모글로빈, 미오글로빈, 케라틴, 젤라틴, 인슐린, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 엘라스틴, 또는 이의 유도체인 측방 흐름 분석 장치.
  15. 검출 구역을 한정하는 크로마토그래프 매질을 포함하는 측방 흐름 장치를 제공하고;
    크로마토그래프 매질과 시험 시료를 접촉시키고;
    상기 검출 구역 내 상기 검출 신호의 존재 또는 강도를 측정하는
    것을 포함하며, 상기 측방 흐름 장치는 분자 기질 및 검출가능한 물질을 포 함하고, 상기 검출가능한 물질은 검출 신호를 발생시킬 수 있고, 상기 분자 기질 및 검출 가능한 물질은 크로마토그래프 매질과 유체 소통하며, 여기서 상기 분자 기질은 촉매화 반응을 거쳐 생성물을 형성할 수 있는 것인, 시험 시료 내의 효소, 또는 이의 저해제의 존재 또는 양의 측정 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 분자 기질이 제 1 특이적 결합원을 포함하고, 상기 생성물이 제 2 특이적 결합원을 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 검출가능한 물질이 제 3 특이적 결합원에 직접 또는 간접적으로 결합되어 있고, 상기 제 1 특이적 결합원 및 상기 제 2 특이적 결합원 중 하나를 상기 제 3 특이적 결합원에 결합시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래프 매질이 추가로 적용 부위를 한정하며, 분자 기질을 상기 적용 부위 내의 시험 시료와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 크로마토그래프 매질이 상기 적용 부위의 하류에 있는 콘쥬게이트 구역을 추가로 한정하며, 여기서 검출가능한 물질이 상기 콘쥬게이트 구역 내에 확산적으로 고정화된 것인 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 시료 내의 효소량이 상기 검출 신호의 강도에 정비례하는 방법.
  21. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 시료 내의 효소량이 상기 검출 신호의 강도에 반비례하는 방법.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 효소가 가수분해효소인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 가수분해효소가 프로테아제 또는 펩티다아제인 방법.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자 기질이 단백질, 당단백질, 펩티드, 핵산, 탄화수소, 지질, 에스테르, 또는 이의 유도체인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 분자 기질이 카세인, 알부민, 헤모글로빈, 미오글로빈, 케라틴, 젤라틴, 인슐린, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 엘라스틴, 또는 이의 유도체인 방법.
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