피부는 물리적 및 화학적 자외선 방어 인자를 갖추고, 다양한 광화학 반응에 의한 피부장애를 최소한으로 방지하기 위한 작용을 갖고 있다. 각질층은 자외선을 반사 및 확산시킴에 의하여 그 에너지를 감쇄시킨다. 또한 멜라닌색소, SOD(superoxide dismutase), 그 외의 항산화 성분 등은 피부 내부에 침투한 자외선을 흡수하고, 그 에너지를 감쇄시키거나 자외선이 이차적으로 발생시키는 활성산소를 소거함에 의하여 피부에 대한 장애를 방어한다.
그러나, 상기와 같은 방어인자의 능력을 초과하는 다량의 자외선을 생체가 받게 되거나, 나이가 들어감에 따라 그 능력이 저하되는 경우 여러 가지 피부장애가 일어난다.
피부에는 대식세포, 랑게르한스세포(Langerhans cells) 등 생체계에서 면역을 담당하고 있는 여러 가지 세포가 존재한다. 자외선의 조사에 의하여 이러한 세포는 수적인 감소만이 아니고, 기능적으로도 장애를 받게 된다. 피부색 결정 요인 중에서 가장 큰 부분을 차지하는 것이 피부 중 멜라닌의 분포상태 및 양이다. 멜라닌(melanin)은 멜라노사이트(melanocyte)에서 생성이 되는데 이 멜라노사이트에는 티로시나제 등의 효소가 존재하며, 이들이 함께 작용하여, 생체내에 항상 존재하는 티로신(tyrosine)이라는 아미노산을 기질로 중합화 산화반응을 함으로 흑갈색의 색소인 멜라닌을 형성하게 된다. 이렇게 형성된 멜라닌은 멜라노사이트의 수지상 돌기를 통하여 케라티노사이트(keratinocyte)라는 표피 세포로 이동한다. 여기서 멜라닌은 핵주변에 모자와 같은 구조를 형성하여 자외선으로부터 유전자를 보호하고 자유 라디칼(free radical)을 제거하여 세포 내 단백질을 보호하는 등 중요한 역할을 하게 된다.
생체 내에는 멜라닌을 분해하는 효소가 없고 다만 케라티노사이트가 표피에서 떨어져 나갈 때 같이 피부에서 떨어져나가는 것으로 제거된다. 하지만 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미나 주근깨, 점 등과 같은 과색소침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다.
멜라닌 생산에 영향을 미치는 인자는 여러 가지가 알려져 있는데, 자외선에 의하여 일어나는 멜라닌 생산의 항진 그리고 이에 따른 색소 침착이 화장품 분야에서 아주 중요하다. 색소 침착의 예방 목적으로 미백화장품에 배합되는 약제의 기본적인 메커니즘은 티로시나아제(tyrosinase) 작용 억제, 티로시나아제 생성 억제, 멜라닌 생성 미디에이터의 억제, 기존 멜라닌의 환원 및 광산화 억제, 멜라닌 배설의 촉진, 및 자외선 커트 등이다.
자외선 노출 환경속에서도 하얀 피부를 갖고자 하는 여성들의 욕구에 따라서 피부 색소 이상 증상과 과색소 침착등의 예방과 개선에 대한 니즈가 더욱 늘어 나고 있으며 이에 과도한 멜라닌 생성을 막는 미백제품 개발이 필요하게 되었고 그 동안 많은 노력들이 이루어졌다. 그 구체적인 예를 들면, 코지산(kojic acid), 알부틴(arbutin) 등과 같은 티로시나제 활성을 저해하는 억제제들, 하이드로퀴논(hydroquinone), 비타민 A, 비타민 C 및 이들의 유도체 등이 있다. 그러나, 이들은 피부에 대한 안전성의 문제, 제형 내에서의 안정성 문제 및 미백효과의 불충분으로 인해 그 사용이 제한되고 있다. 이에 대해 피부 미백에 효능이 높으면서도 피부에 안전한 천연물 유래의 원료들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
본 발명에서 유효성분으로 사용된 백화사설초는 한의학뿐만 아니라, 민간요법으로도 널리 알려지고 사용되어온 한방 약제의 하나이다. 백화사설초는 중국의 남부, 동남아시아, 제주도의 울창하고 그늘진 숲속에서 자생하는 꼭두니서과(Rubiaceae) 식물이다. 백화사설초에 함유된 성분으로는 베툴린(Betulin), 베툴릭산(Betulinic acid), 우루솔릭산(Ursolic acid), 올레아놀릭산(Oleanolic acid), 스티그마스테롤(Stigmasterol), 베타-시토스테롤(β-Sitosterol), 베타-글리시레티닉산(β-Glycyrretinic acid), 펜타-쿠마릭산(ρ-Coumaric acid), 글루코사이드(Glucoside), 헨트리아콘테인(Hentriacontane) 등이 있으며 항염, 해독, 항산화, 항균 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 사용된 백화사설초 추출물 제조방법은 특별히 한정되지 않으며 당업계에서 사용되는 방법들 중 어느 하나에 따라 제조될 수 있다. 예컨대, 건조된 백화사설초 전초를 60 내지 80℃로 가온된 정제수에 가하여 이따금 저어주면서 10 내지 20분동안 세척한다. 세척된 백화사설초 전초를 80~85℃로 가온된 정제수에 가하여 이따금 저어주면서 2 내지 4시간동안 추출한다. 추출된 이 액을 20 내지 30℃까지 냉각하여 여과하고 고형분을 제거함으로써 백화사설초 추출물을 얻을 수 있다.
상기와 같이 제조된 백화사설초 추출물은 조성물의 총중량을 기준으로 0.001~10중량%, 바람직하게는 0.005 ~ 5.0중량%가 적당하다. 0.001중량% 미만의 농 도에서는 뚜렷한 효과를 기대할 수 없었고, 10.0중량%을 초과하면 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 보이지 않았다.
대황은 금문대황(Rheum palmatum Linne), 등고특대황(Rheum tanguticum Maximowicz), 약용대황(Rheum officinale Baillon), 국산대황(Rheum coreanum Nakai), 또는 그것들의 종간 잡종(Polygonaceae)의 뿌리줄기이며, 중국, 한반도에 분포하는 다년생의 초본이다. 또한 마디풀과의 여러해살이풀 약용대황(Rheum officiale BAILLON), 장엽대황(Rheum palmarum LINNE var. palmatum) 또는 대황(Rheum undulatum LINNE)의 뿌리이다. 주요성분으로는 에모딘(Emodin), 크리소파몰(Chrysophamol), 레인(Rhein), 알로에-에모딘(Aloe-emodin), 글루코갈린(Glucogallin) 및 라폰티신(Rhaponticin) 등을 포함하고 있으며, 항균 작용, 항바이러스 작용, 면역 복합체 정화 촉진 작용, 간세포 장해 억제 작용, 세균성 콜라겐 분해효소 저해 작용 등의 약리 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 유효성분으로 사용된 대황 추출물의 제조 방법은 특별히 한정되지 않고 당업계에 사용되는 방법들 중 어느 하나에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 건조된 대황을 에탄올에 가하여 이따금 저어주면서 5일간 침적 추출한다. 이 액을 여과하여 고형분을 제거하고 진공 증류하여 에탄올 혼합물을 얻는다. 이 액에 정제수를 혼합하여 석출시킨 뒤 여과 정제한다. 이 액을 진공건조 하여 대황추출물 분말을 얻을 수 있다.
본 발명에서 상기와 같이 제조된 대황 추출물은 조성물의 총중량을 기준으로 0.001~ 5.0중량%의 양으로 함유함을 특징으로 한다. 0.001중량% 미만의 농도에 서는 기대하는 효과를 나타낼수 없고, 5.0중량%을 초과하면 내용물의 변색, 제형내 침전 발생 등의 이유로 화장료로 적합하지 않기 때문이다.
본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면 유연화장수, 영양화장수, 유액, 마사지크림, 영양크림, 팩, 패취, 젤, 스틱, 분무제 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있다.
이하, 실시예, 시험예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 하기 실시예, 시험예 등으로 한정되는 것은 아니다.
[제조예 1: 백화사설초 추출물의 제조]
건조된 백화사설초 전초 100g을 70℃로 가온된 정제수 0.8L에 가하여 이따금 저어주면서 15분동안 세척하였다. 세척된 백화사설초 전초를 80~85℃로 가온된 정제수 1L에 가하여 이따금 저어주면서 3시간동안 추출하였다. 추출액을 25℃까지 냉각하여 여과하고 고형분을 제거하여 백화사설초 추출물을 액상으로 약 1L를 얻었다.
[제조예 2: 대황 추출물의 제조]
건조된 대황 1kg을 에탄올 6L에 가하여 이따금 저어주면서 5일간 침적 추출하였다. 이 액을 여과하여 고형분을 제거하고 진공 증류하여 약 1L정도의 에탄올 혼합물을 얻었다. 이 액에 정제수 1L를 혼합하여 석출 시킨 뒤 여과 정제하였다. 이 액을 진공건조 하여 대황추출물을 분말 형태로 30g을 얻었다.
[제조예 3: 복합 유효성분의 준비]
하기 표 1의 조성으로 BD complex Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ를 제조하였다. 각 복합체는 미백 유효성분인 백화사설초 추출물과 대황 추출물을 특정 중량비율로 혼합하였다.
시험예
1: 멜라닌 생성억제 효과 측정
인간 멜라노마 세포인 HM3KO 세포(Y. Funasaka, Department of dermatology, Kobe university school of medicine, 5-1 Kusunoki-cho 7-chrome, Chuo-ku, Kobe 650, Japan)를 우태아혈청이 10% 들어간 Minimum Essential Medium (MEM)에 넣어 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 이렇게 배양한 세포를 세포수가 각 플라스크 당 3 ×105이 되게 75 플라스크에 깔고, 하룻밤 동안 세포가 기벽에 붙기를 기다린 다음, 세포가 잘 붙은 것을 확인한 후 배지를 하기 표 1의 각 시험물질이 10ppm 들어 있는 새배지로 갈아주었다. 대조구는 DMSO가 들어 있는 배지를 사용하였다. 이런 식으로 2~3일에 한번씩 시료가 들어 있는 새배지로 갈아주면서 세포가 플라스크에 꽉 찰 때까지 배양하였다. 세포가 다 성장하면 모아서 대조구와 각각 처리구의 세포 색깔을 비교하였다. 또한, 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 후 1N 수산화나트륨으로 녹여 500㎚에서 흡광도를 측정한 후 하기 수학식1에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
멜라닌 생성 억제율 (%) = 100 - (각 시험물질의 흡광도/대조군의 흡광도 X 100)
시험 물질 |
멜라닌 생성 억제율(%) |
백화사설초 추출물(제조예1) |
21.7 |
대황 추출물(제조예2) |
29.1 |
코지산 |
28.5 |
BD complex Ⅰ [백화사설초 추출물(제조예1):대황 추출물(제조예2)의 중량비=7:3] |
29.8 |
BD complex Ⅱ [백화사설초 추출물(제조예1):대황 추출물(제조예2)의 중량비=5:5] |
34.5 |
BD complex Ⅲ [백화사설초 추출물(제조예1):대황 추출물(제조예2)의 중량비=3:7] |
35.3 |
상기 표 1의 결과로부터 백화사설초 추출물 단독 또는 대황 추출물 단독 사용 경우보다 BD 복합체를 이루어 사용한 경우가 우수한 미백효과를 나타냈다. 또한 미백효과가 우수한 것으로 알려진 코지산보다 BD 복합체 I, II, III 가 모두 미백효과가 더욱 우수하였다. 즉 백화사설초 추출물의 단독 사용 또는 대황 추출물의 단독 사용시 보다 함께 사용함으로써 미백 효과가 높아지는 시너지 효과가 있다는 결론을 얻었다.
시험예
2 : 동물수준에서의 미백 효과 평가
갈색 몰모트(Tortoiseshell guinea pigs; Brown guinea pigs)는 사람과 같이 자외선, PUVA, 알레르기 반응 등에 의해 색소침착이 생기는 동물이며, 털과 피부의 빛깔이 동일하기 때문에 털의 빛깔이 균일하고 갈색인 것을 고르면, 털을 제거한 뒤에 광범위한 부위를 사용할 수 있다. 하기에 열거한 방법으로 색소침착을 생기게 하고, 그 색소침착 부위에 미백 조성물을 도포하는 방법에 의해, 색소침착의 개선효과를 검증할 수 있다. 또한, 이 방법으로 효과가 인정된 물질은, 사람의 자외선 색소반에서의 평가에도 효과가 나타날 확률이 높기 때문에 일차 생체 내 검색법으로 유용하게 사용된다.
1. 자외선 색소반의 제작법
자외선(UVB)에 의한 색소침착의 제작은, 갈색 몰모트 배후의 털을 제거한 피부에 3cm×3cm의 정방형의 창문이 6개 뚫린 차광용 알루미늄 호일을 접착시킨 후, SE 램프(파장 290~320nm, Toshiba)로 자외선(UVB)을 조사하였다. 총 조사 에너지량은 1350mJ/cm2이었다. 조사 후 알루미늄 호일을 벗겨내고 아래와 같은 방법의 도포방법으로 시험물질의 미백효과를 평가하였다. 자외선 조사 후 색소침착은 2-3일 뒤에 나타나며, 약 2주 후에 최고에 달한다. 생성된 자외선 색소반의 색조가 동일하며 얼룩이 생기지 않는 것이 중요하고, 자외선 색소반의 형성이 좋지 않은 개체는 좋은 결과를 위해 쓰지 않는 편이 좋다.
2. 조성물의 도포방법
자외선 조사 후 하기 표 2의 조성물을 색소침착이 최고가 되는, 즉 색소침착이 형성된지 약 14일 뒤에 도포하기 시작하였다. 도포회수는 l일 2회로 50일간 계속하였다. 조성물은 프로필렌글리콜:에탄올:물=5:3:2의 혼합용매에 용해 및 희석되었으며, 면봉으로 도포하고, 다른 부위에 반드시 용매만을 도포하는 대조부위를 마련하였다. 효과 판정과 함께 누적자극성 여부도 관찰하였다.
3. 효과의 판정
색차계(미놀타 CR2002)를 사용하여 피부의 흑백정도를 측정하여 효과를 판정하였다. 색을 표시하는 데에는 L*a*b* 표색계를 사용하며, 본 발명에서는 주로 L* 값(명도)을 지표로 하였다. L* 값은 표준 백판으로 교정하며, 측정은 1개 부위에 5회 이상 측정을 되풀이함으로써 색소침착부를 균등하게 측정하였다. 도포 시작시점과 완료시점에서의 피부색의 차이(△L*)를 하기 수학식 2에 따라 계산하고, 이를 표 3에 나타내었다. 미백효과는 시료 도포 부위와 대조군 부위의 △L*의 비교로 판정하는데, △L*값이 2정도일 경우는 침착된 색소의 미백화가 뚜렷한 경우이고, 1.5정도 이상이면 미백효과가 있다고 판정할 수 있다.
ㅿL* = 도포 후 50일 후의 L*값 - 도포 개시할 때 L*값
성분 |
함량 중량% |
대황 추출물 |
50 |
백화사설초 추출물 |
50 |
물질 처리농도 (%) |
미백 효과 (ㅿL) |
미백 조성물 1.0% |
1.78 |
미백 조성물 0.5% |
1.53 |
미백 조성물 0.1% |
1.17 |
코지산 1.0% |
0.95 |
대조군 |
0.78 |
표 3의 결과로부터, 본 발명의 조성물은 1.0%의 농도에서 침착된 색소의 미백화가 뚜렷하고 0.1%의 농도에서도 미백효과를 나타냄을 알 수 있었다.
[제조 예 4 : 실시예 1-3, 비교예 1-3]
인체 피부에 대한 미백효과를 실험하기 위해 하기 표 4의 원료 1-9를 혼합하고 70℃에서 용해하여 물파트로 하였다. 한편, 원료 10-16을 70℃에서 용해하여 오일파트로 하였다. 오일파트를 물파트에 첨가하고 호모믹서(일본 Tokushu Kika 社)로 교반하여 1차 유화하고, 원료 17을 첨가하여 점증하였다. 기포를 제거한 후, 실온으로 냉각시켜 실시예 1-3 및 비교예 1-3으로 사용하였다. 표 4의 수치들은 모두 중량%를 나타낸다.
성분 |
실시예1 |
실시예2 |
실시예3 |
비교예1 |
비교예2 |
비교예3 |
1. 정제수 |
To100 |
To100 |
To100 |
To100 |
To100 |
To 100 |
2. 글리세린 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
3. 부틸렌 글라이콜 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
4. 베타 글루칸 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
5. 히아루론산 추출물 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
6. 카보머 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
7. 대황추출물 |
0.3 |
0.5 |
0.7 |
1.0 |
- |
- |
8. 백화사설초 추출물 |
0.7 |
0.5 |
0.3 |
- |
1.0 |
- |
9. 코지산 |
- |
- |
- |
- |
- |
1.0 |
10. 카프릴릭 카프릭 트리 글리세라이드 |
8.0 |
8.0 |
8.0 |
8.0 |
8.0 |
8.0 |
11. 하이드로지네이티드 폴리데센 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
12. 세테아릴 글루코사이드 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
13. 소르비탄 스테아레이트 |
0.4 |
0.4 |
0.4 |
0.4 |
0.4 |
0.4 |
14. 세테아릴 알코올 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
15. 받부제 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
16. 향 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
17. 트리에탄올 아민 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
시험예
3 : 인체 피부에 대한 미백 효과 시험
건강한 12명의 남자를 대상으로 피검자의 윗팔뚝 부위에 직경 1.5cm의 구멍 6개가 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose)의 1.5 - 2 배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도하고, 시험물질들을 도포하여 두 달 후에 색차계를 이용하여 피부의 명암을 측정하였다. 그 12명의 남자에게 상기 실시예 1-3 및 비교예 1-3의 피부 외용제를 아침, 저녁 2회씩 매일 바르게 하였다.
효과의 판정은 동물시험에서와 마찬가지로 피부의 명암를 나타내는 "L"값을 구하여 결정하였다. 참고로, 인위적으로 태우지 않은 한국인 피부색은 일반적으로 50-70의 값을 나타낸다.
시험물질을 도포하여 효과가 있는 경우는 L값이 점차 증가하게 되며 시험물질들 사이의 비교는 도포 시작시점과 완료시점에서의 피부색의 차이(△L)를 상기 수학식 2에 따라 계산하고, 이를 표 5에 나타내었다.
시험 물질 |
미백 효과 (△L) |
실시예 1 |
3.19 |
실시예 2 |
3.52 |
실시예 3 |
3.75 |
비교예 1 |
2.62 |
비교예 2 |
2.14 |
비교예 3 |
2.26 |
대조군 |
1.27 |
상기 표 5에서 알 수 있듯이, 백화사설초 추출물과 대황 추출물을 단독으로 사용한 것보다 백화사설초 추출물과 대황 추출물을 함께 사용한 혼합물 조성에서 미백 효과가 더욱 높은 것으로 나타났으며 미백효과가 우수한 것으로 알려진 코지산 보다 높은 효과를 나타내었다. 상기 결과를 바탕으로 조성물의 미백 효과에 있어 백화사설초 추출물과 대황 추출물의 병용에 의한 시너지 효과가 있음을 알 수 있다.