KR20090090575A

KR20090090575A - 테이코플라닌을 생산하는 신규한 미생물

Info

Publication number: KR20090090575A
Application number: KR1020080015866A
Authority: KR
Inventors: 강대중; 송정민; 박준태; 이홍섭; 강재훈
Original assignee: 일동제약주식회사
Priority date: 2008-02-21
Filing date: 2008-02-21
Publication date: 2009-08-26
Anticipated expiration: 2028-02-21
Also published as: KR100965652B1

Abstract

본 발명은 테이코플라닌을 생산하는 신규한 미생물과 이를 이용하여 테이코플라닌을 생산하는 배지 조성에 관한 것이다. 이를 상세히 설명하자면 테이코플라닌을 생산하는 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ATCC31121 모균주를 UV와 NTG의 돌연변이원으로 돌연변이시켜서 균주를 개량함으로써 고농도 테이코플라닌이 들어있는 배지에서도 생육하는 테이코플라닌 저항성 돌연변이주에 관한 것이다.

또한 상기의 돌연변이주를 바탕으로 테이코플라닌의 고생산을 위해 배양 배지 조성을 최적화하였으며 특히 proline을 배지 성분에 포함함으로써 테이코플라닌의 생산성을 증대시키고 우수한 품질의 배양액을 획득하는 것을 특징으로 한다.

항생제, 테이코플라닌, 변이주, 아미노산, 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ID9303

Description

테이코플라닌을 생산하는 신규한 미생물{Novel microorganism producing teicoplanin}

본 발명은 돌연변이를 통해서 모균주(악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ATCC31121)의 형질을 변경함으로써 테이코플라닌의 생산성이 우수한 변이주(악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ID9303)와 이를 이용하여 생산 배지 조성의 최적화를 통해서 테이코플라닌의 생산성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

1940년대에 페니실린이 개발된 이 후 현재까지 10,000종 이상의 항생물질이 천연물로부터 분리되었고 또한 항생제 분야의 급속한 발전과 더불어 항생제의 사용이 급격히 증가함으로써 최근에는 항생제 과다 사용에 따른 약제 내성균의 출현으로 큰 문제가 되고 있다. 특히 대표적인 내성균주인 Staphylococcus aureus는 β-lactamase를 생산하는 균주로써 페니실린계 항생제에 대하여 내성을 갖게 된 미생물이다. 따라서 항생제에 대한 내성을 갖는 병원균에 대해서 효과적인 치료 약물의 탐색이 시도되었고 특히 독성이 적은 새로운 항생 물질에 대한 많은 연구가 행해지고 있다. 테이코플라닌은 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스의 발효 배양에 의해서 생산되는 대표적인 글라이코펩타이드계 항생 물질로써 동일 계열인 반코마이신 과 비교할 때 약효가 2~8배 더 우수하며 독성은 상대적으로 낮으며 또한 긴 반감기 때문에 1일 1회 투여 등의 특장점이 있다. 테이코플라닌의 저해 기작을 살펴 보면 N-acetylmuramic acid와 N-acetylglucosamine으로 구성되어 있는 펩티도글리칸 중 N-acetylmuramic acid에 결합하고 있는 5개의 아미노산 중에서 맨 마지막에 결합하는 D-alanyl-D-alanine의 디펩티드와 테이코플라닌이 결합함으로써 그람 양성균의 세포벽 합성과정에서 transglycosylation과 transpeptidation을 저해하여 약효를 나타내는 것이다. 따라서 테이코플라닌은 그람 음성균 외에 특히 그람 양성 병원성 세균에도 우수한 효능을 보여주고 항생제 내성 균주에 대한 우려 또한 반코마이신보다 덜하다. 따라서 테이코플라닌은 반코마이신보다 우위의 약물이며 대체 약물의 개발 이전까지는 가장 대표적인 글라이코펩타이드계 항생제이다.

테이코플라닌의 구성 물질은 극성의 차이에 따라서 구분된 A2-1, A2-2, A2-3, A2-4, A2-5의 복합체와 A2의 분리정제 과정 중에 생성되는 A3의 유효 성분으로 구성되어 있다. KP 및 JP 규정에는 A3는 15% 미만, A2 복합물이 85% 이상으로 구성되어 있어야 하는 것으로 확인되었으며 각각의 구성성분에 대한 구체적인 비율에 대한 규격은 아직 구체적이지 않다.

복합물질인 테이코플라닌은 결국 화학적 합성이 어려운 구조이고 생합성 과정도 아직 명확히 규명되지 않았기 때문에 발효에 의한 생산 외에는 다른 방법이 없다. 또한 기존의 테이코플라닌 생산 조건은 배양의 수율이 낮아서 산업적인 생산 단계까지 진행하기에는 경제성이 없고 불순물이 많은 배양액의 경우에는 낮은 품질로 인해서 분리정제 프로세스에서 많은 비용이 산출되기 때문에 경쟁력이 부족하게 된다. 따라서 고수율의 테이코플라닌과 불순물이 적은 배양액을 생산할 수 있는 새로운 균주의 개발이 필요한 상황이다. 특히 A2-3와 A2-4 사이에 존재하는 배양액 상의 불순물은 분리정제에 의해서 제거하기 힘들기 때문에 이 불순물을 최소한으로 발생시키는 균주 개발과 동시에 생산 조건을 최적화하여 고수율의 테이코플라닌 생산 방법을 발명하는 것이 가장 바람직하다.

테이코플라닌을 생산하는 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ATCC31121는 생산 수율이 현저히 낮아서 경쟁력 있는 산업적 개발을 이룰 수가 없다. 따라서 생산 수율이 높은 새로운 균주의 개발이 우선되어야 만이 경쟁력 있는 테이코플라닌 생산이 가능한 것이다.

우수한 테이코플라닌 생산 균주의 확보와 동시에 경쟁력 있는 테이코플라닌의 개발을 위해서는 고수율의 생산을 위한 배양 조건의 최적화가 필수적이다.

경제적인 테이코플라닌 개발을 위해서 고수율의 배지 조성 조건과 동시에 불순물이 적은 배양물을 제공할 수 있는 방안이 함께 모색되어야 경쟁력 있는 테이코플라닌 개발이 가능한 것이다.

본 발명은 모균주인 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ATCC31121의 테이코플라닌 생산성의 한계를 극복하는 새로운 돌연변이주인 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ID9303을 제공하고자 한다.

본 발명은 돌연변이주인 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ID9303을 발효 배양하여 고수율의 배지 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 돌연변이주인 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ID9303의 배양 시에 불순물이 적은 배양물의 제공이 가능한 것이 특징이다.

본 발명은 생산수율이 높은 돌연변이주를 확보하고 이를 이용한 테이코플라닌 배양 배지 조성물의 최적화를 완성함으로써 경쟁력 있는 테이코플라닌 생산 수율을 확보할 수 있다. 이를 구체적으로 표현하자면 돌연변이를 통해서 개량된 ID9303을 이용하여 최적 조건의 배양 방법에서 테이코플라닌을 고생산하는 방법을 제공할 수 있다. 특히 불순물이 적은 상태의 배양액을 제공할 수 있기 때문에 산업적 생산에서 테이코플라닌 생산 경쟁력을 확보하게 되는 것이다.

본 발명은 테이코플라닌을 고수율로 생산하기 위해 다단계 돌연변이원을 적용하여 개발된 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ID9303을 특징으로 한다. 균주의 동정은 Shirling과 Gottlieb의 방법(Shirling et al, 1966, Method of Characterization of Streptomyces species, Int . J. System . Bacteriol ., 16, 313-340)과 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(Williams et al, 1989, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol 4, Williams & Wilkins)에 기술된 방법을 참고로 하였다.

본 발명은 변이주 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ID9303을 배양하는 바람직한 방법으로는 당류 5-30g/L, 맥아 추출물 10-20g/L, 코튼시드 5-20g/L, 건조 효모 5-20g/L, 아미노산 0.5-2g/L, 물엿 10-40g/L, 계면활성제 1-10g/L, 금속염 0.01g/L-0.1g/L 등의 농도로 배양용 배지 조성물을 조제하는 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ATCC31121를 모균주로 하여 테이코플라 닌을 고수율로 생산할 수 있는 돌연변이 균주를 선별할 계획으로 모균주에 대해 인위적 돌연변이 유도처리를 수행하였고, 선별된 돌연변이 균주 중 높은 농도의 테이코플라닌에 노출되어도 내성이 있는 균주를 선별하여 고농도 테이코플라닌의 배양액에서 생존함으로써 고수율의 배양 상태를 유지하도록 하였다. 상기의 과정을 수회 반복하여 최종적으로 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ID9303를 선발하였다.

본 발명의 변이균주인 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ID9303을 이용한 테이코플라닌 생산용 본 배양 배지 조성을 구체적으로 표현하면 당류 , 맥아 추출물 , 코튼시드, 건조 효모 , 아미노산 , 물 엿, 계면활성제 , 금속염의 조합인 것이 특징이다.

본 발명의 배양 배지 조성 중 탄소원은 포도당, 과당, 자일로스, 맥아 추출물, 만니톨 등이 바람직하며 그 중에서 포도당, 맥아추출물이 가장 바람직한 탄소원 배지이며 1-2% 포도당, 2-3% 맥아추출물이 가장 바람직한 배지 조성이다.

본 발명의 배양 배지 조성 중 질소원은 효모 추출물, 코튼시드, 건조 효모, 소이펩톤 등이 바람직한 배지원이며 1% 코튼시드와 0.5% 건조효모가 가장 바람직한 질소원 조성이다.

특정 아미노산은 테이코플라닌의 대사 과정에도 관여하기 때문에 테이코플라닌의 생산에 있어서 아미노산은 매우 주요한 배지원이며 바람직한 아미노산으로는 valine, proline, asparagine, arginine, leucine 등이며 특히 proline이 가장 바람직한 아미노산이다.

방선균 특유의 wall growth를 억제하고 배양액의 점도를 낮춰서 배양액의 물 성을 부드럽게 하여 세포로 산소의 전달능을 증진시키는 방안으로 배지 조성물로 계면활성제를 사용하며 바람직하게는 PEG 400과 PEG 200을 사용하는 것이며 특히 PEG 400이 가장 바람직한 배지 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 배지 조성물의 배지 pH는 6.8-7.2로 조정하여 사용하며 배양 온도는 28℃로 유지한다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다.

단 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 범위가 실시예로 한정되어 지는 것은 아니다.

<실시예 1> 돌연 변이에 의한 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ID9303의 선별

모균주를 20 ㎖ 베넷 고체 배지에 도말하여 28℃에서 7일간 배양하였다. 그 후 콜로니 형태가 크고 돔 형태가 유지되는 콜로니를 선별하여 1.5 ㎖ 생리식염수로 취한 다음 오트밀 고체배지에 도말하여 28℃에서 7일간 배양하였다. 콜로니가 생성된 후 플레이트당 멸균된 식염수를 2 ㎖씩 가해 멸균된 도구로 긁어서 포자 현탁액을 수확하였다. 위의 포자 현탁액을 멸균된 유리 솜에 여과시킴으로써 균사체를 제거하고 통과한 포자 용액을 적정 농도로 희석하여 돌연변이 유도시험에 사용할 포자용액을 조제하였다.

물리적 유도처리 방법으로 자외선 조사를 수행하였고 모균주의 포자 용액에 대해 30~40 ㎼/㎠ 파장의 자외선을 거리 및 시간대 별로 조사하였다. 포자 용액을 베넷 고체 배지에 도말하고 자외선을 15㎝ 거리에서 30분 동안 조사하여 사멸율 99.9%의 조건으로 돌연 변이시킨 다음 저온 암실에서 1시간 동안 보관 후에 28℃ incubator에서 3일간 배양하여 콜로니를 생육시킨 다음 상층에 바실러스 서브틸러스를 overlay하여 시험균주의 생육 억제환(clear zone)이 모균주와 비교하여 크거나 균락의 크기에 비해 생육 억제환이 현저하게 큰 콜로니를 선별하여 재차 배양 프로세스에서 테이코플라닌을 가장 많이 생산하는 균주를 확인하고 최종 우수균주를 선별하였다.

물리적 유도처리 방법으로 확보된 우수 균주를 오트밀 고체배지에 도말하여 포자 용액 조제하는 방법과 동일하게 실시하여 두번째 화학적 돌연변이 시험에 사용하였다. 화학적 유도처리 방법으로는 포자 용액에 대해 농도 별(1.0~3.0 ㎎/㎖) N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) 처리를 수행하여 28℃에서 2~3시간 교반하여 사멸율 70%의 조건을 결정하였다. 2.5 ㎎/㎖의 NTG로 처리된 포자액을 4000 rpm의 회전 속도로 10분 동안 원심분리하여 포자를 분리한 후에 수집된 포자를 50 mM Tris-malate buffer (pH 8.0)로 3회 세척하였다. 이렇게 돌연변이 유도된 포자를 멸균된 생리 식염수로 10^-2~10^-4개/㎖이 되도록 희석한 후, 베넷 고체배지에 도말하여 저온 암실에서 1시간 동안 방치하였다. 이하 상기의 물리적 유도처리 방법과 동일한 공정을 통해서 우수한 ID9303 변이균주를 선별하였다.

ID9303 변이균주의 형태적 및 배양학적인 부분을 살펴 보면 콜로니는 둥근 모양을 나타내고 돔 형태의 융기된 모습을 띠고 있으며 배양 10일 이후부터 돔 형 태가 붕괴되고 배양 14일에는 군락의 중앙이 엷어지고 가장 자리만 남는 형태를 보여 준다. 배양 7일째 변이균주의 고체배지 상에서 특징은 표 1에서 설명하고 있다.

다양한 종류의 고체 배지 상에서의 ID9303의 특징

고체배지	생육	기균사	콜로니 색깔	색소
자팩 고체배지	++	없음	밝은 갈색	없음
포도당-건조효모 고체배지	++	없음	밝은 갈색	없음
펩톤-포도당 고체배지	+	없음	옅은 오렌지	없음
베넷 고체배지	+++	없음	오렌지	없음
ISP 1	+++	없음	노란색	없음
ISP 2	+++	없음	밝은 갈색	없음
ISP 3	+++	있음	짙은 오렌지	없음
ISP 4	+++	없음	밝은 갈색	없음
ISP 5	++	없음	밝은 갈색	없음
ISP 6	++	없음	밝은 갈색	갈색
ISP 7	+	없음	밝은 갈색	없음
ISP 8	++	없음	밝은 갈색	없음
ISP 9	++	없음	밝은 갈색	없음

Bergey's Manual의 탄소원 이용성을 바탕으로 표 2에서 발명된 변이균주의 탄소원 이용성을 보여주고 있다. 본 발명에서 변이균주는 모균주와 형태학적, 배양학적 특성 및 생리적인 현상에 있어서 상이하며, 특히 도 1에서 보는 바와 같이, 베넷 배지에서 4일 동안 생육시킨 결과 콜로니 색깔이 오렌지색으로써 회갈색을 보이는 모균주와는 확연히 다른 표현형의 특징적인 차이를 나타내었다.

변이균주의 탄소원 이용성

탄소원	이용성
자일로스	+
포도당	+
과당	+
만노오스	+
수크로스	+
라피노스	-
셀룰로스	-
젖당	+

<실시예 2> 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ID9303의 내성 증가 확보.

선별된 균주의 테이코플라닌에 대한 내성을 확인하기 위해서 배양액의 상태와 유사한 조건으로 만들어서 변이균주의 능력을 확인하였다. 이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 모균주와 변이균주를 0.05g/L-1.0g/L의 테이코플라닌이 함유된 50㎖ 액체 배지에 각각 접종하여 150rpm, 28℃에서 8일 동안 진탕 배양하였다. 표 3에서 나타난 바와 같이 ATCC31121의 경우에는 0.05g/L의 농도까지 생육하였고 이 경우는 테이코플라닌에 대한 균주 저항성이 낮다고 할 수 있다. ID9303의 경우에는 테이코플라닌에 대한 생육 저해 농도가 0.8 g/L로 모균주에 비해 16 배가 증가 되었음을 알 수 있다. 이것은 변이균주의 테이코플라닌 저항성이 모균주에 비해서 확연히 증가된 것을 보여 주고 있으며 이로 인한 효과는 ID9303 배양액에 테이코플라닌의 생산성이 증가 되어 높은 농도에 균체가 노출되더라도 균주의 적응성이 높기 때문에 생산성의 증가와 균체의 생존이 반비례하는 단점을 방지할 수 있을 것이다. 결론적으로 발명된 변이균주 ID9303은 테이코플라닌에 대한 내성이 모균주에 비해 16 배 높은 균주인 것을 확인할 수 있었다.

모균주와 변이균주의 테이코플라닌에 대한 내성 비교

Teicoplanin(g/L)	ATCC31121	ID9303
0	+	+
0.05	+	+
0.1	-	+
0.2	-	+
0.4	-	+
0.6	-	+
0.8	-	+
1.0	-	±

(-; No growth, +; Normal growth, ±; Weak growth)

변이균주의 테이코플라닌 생산 능력을 확인하기 위해서 탄소원 배지 조성 중에서 가장 중요한 포도당의 효과를 확인하였다. 이를 상세히 설명하면 모균주와 변이균주를 1%-4% 포도당, 1% 소이펩톤, 1% 효모 추출물, 0.001% 암모늄 페릭 설페이트의 균주 선별용 기본 액체 배지에서 5일 동안 배양하여 테이코플라닌 생산성을 HPLC로 비교 분석하였다. 표 4의 결과처럼 가장 생산성이 높은 포도당 2%에서는 모균주에 비해 변이균주가 5.6배 높은 생산성을 보였고 전체 농도에서는 4.3배 높은 생산성인 것을 확인하였다.

포도당 농도에 따른 모균주와 변이균주의 테이코플라닌 생산성 비교

포도당 농도(%)	ATCC31121 (mg/L)	ID9303 (mg/L)
1	31.6	180.6
2	34.9	194.1
3	28.0	92.1
4	28.7	78.2

결론적으로 자외선 및 NTG를 모균주에 적정 조건으로 처리하고 선별된 ID9303은 테이코플라닌 내성의 우월성뿐만 아니라 균주 선별용 기본 배지에서도 모균주에 비해 높은 생산성을 보임에 따라서 돌연변이에 의해 신규한 테이코플라닌 생산균주를 확보하게 되었으며 이렇게 획득한 우수한 돌연변이주인 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ID9303은 특허출원을 위해 유전자 은행(KCTC)에 균주를 기탁하였고 2008.1.18 일자로 KCTC 11259BP의 균주번호를 부여받았다.

<실시예 3> 발명 균주의 테이코플라닌 생산에 대한 배지 조성물

-72℃의 냉동기에 보관된 배양용액을 급속 해동시켜서 ISP3 평판 배지에서 28℃로 3일 동안 배양시킨 다음 가로×세로 1㎠의 균체를 취득하여 250㎖ 삼각 플라스크 내에 들어 있는 2% 포도당, 1% 대두분말, 0.4% 펩톤, 0.25% 소금, pH 7.0의 조건인 멸균 액체 배지 50㎖에 무균적으로 접종하여 28℃, 120rpm 조건의 진탕 배양기에서 3일 동안 배양하여 1차 종균배양액으로 사용하였다. 2차 종균 배지는 1차 종균 배지와 동일한 배지를 사용하였으며 2.5L 마루비시 발효조에 1.8L 액체 배지를 121℃에서 30분 동안 멸균하여 2차 종균 배지로 사용하였다. 2차 종균 배양 조건은 28℃, 350rpm, 1vvm이었고 3일 동안 무균 적으로 배양하여 2차 종균 배양액으로 사용하였다. 이때 2차 종균 배양액은 6.8±0.1의 pH 상태를 유지하고 있어야 한다. ID9303을 이용하여 테이코플라닌 생산 조건으로 설정된 본배양 배지 조성은 다음과 같다. 5L NBS 발효조 내에 1% 포도당, 2% 맥아추출물, 1% 코튼 시드, 0.5% 건조 효모, 2% 물엿, 0.001% 암모늄 페릭 설페이트, pH 7.2 조건의 3.5L 액체 배지를 121℃에서 30분 동안 멸균하여 사용하였고 2차 종균 배양액 150㎖을 무균적으로 5L NBS 발효조에 접종하여 5-10일 동안 600rpm, 1vvm의 조건으로 배양하였다. 배양액은 일자별로 3㎖씩 취득하여 아세톤 동일량을 혼합하여 30분 동안 격렬하게 혼합하고 원심분리하여 상등액을 취하여 HPLC 분석으로 테이코플라닌 순품과 일치하는 RT와 UV 패턴을 확인하고 해당 면적을 비교 계산함으로써 테이코플라닌의 생산성을 확인하였다. HPLC 칼럼은 ODS(4×180,㎜), 이동상은 48분 동안 점차 상승 (from 0% B to 40% B in A, A: 25mM NaH₂PO₄/acetonitrile = 9/1, B: 25mM NaH₂PO₄/acetonitrile=3/7, pH 6.0) 조건, 분당 2㎖의 전개 속도, 254㎚ 흡수대에서 HPLC 분석을 하였다. 실시예 3의 본배양 조건에서 배양 8일째 HPLC 정량 분석 결과 테이코플라닌의 생산성은 약 1,330㎎/ℓ이었다.

<실시예 4> 계면활성제가 테이코플라닌 생산에 미치는 영향

배양 3일째부터 점도의 상승과 더불어 방선균 특유의 wall growth가 발생함으로써 생산성이나 재현성에 많은 저해를 가져왔다. 실시예 3의 조건을 기본으로 하여 다양한 계면활성제의 효과를 확인하였다. 도 2에서 알 수 있듯이 대부분의 계면활성제가 control에 비해 동등 내지 낮은 생산성을 보였으나 PEG 400과 PEG 200의 경우에는 각각 1,805㎎/ℓ와 1,587㎎/ℓ의 생산성을 보여 주었다. 이것은 control에 비해 각각 35.6%와 19.2%의 상승한 생산성을 보여 주는 것이며 이는 배양액의 물성이 개선됨으로써 나타난 현상으로 판단하고 있다. 더욱이 배양액의 물성 개선은 낮은 점도로 인해서 배양액에서 테이코플라닌 분리 정제를 위한 후처리 공정에서 유용하게 사용될 것으로 판단하고 있다.

결론적으로 계면활성제의 배지 투입은 효과적이었고 PEG 400과 PEG 200이 바람직한 배지 조성물이었으며 이 중에서 가장 바람직한 배지 조성은 0.5% 농도의 PEG 400이었다.

<실시예 5> 아미노산이 테이코플라닌에 미치는 영향

실시예 3의 본배양 배지 조성을 기본배지로 사용하고 특정 아미노산의 첨가시 테이코플라닌의 생산에 미치는 영향을 확인하였다. 이하 아미노산의 영향을 구체적으로 언급하고자 한다. Valine의 경우에는 0.05% 농도에서 큰 폭의 테이코플라닌 생산성 상승효과를 확인하였고 특히 HPLC 분석에서 A2-2의 상대적인 비율 증가의 폭이 큰 것이 특징이었다. Asparagine의 경우에는 0.1% 농도에서 가장 높은 생산성을 보였고 이 후 농도에서 감소하는 경향을 보였지만 valine을 포함한 asparagine의 투여에 의한 테이코플라닌 생산성 증대 효과는 매우 컸다. Arginine의 경우에는 0.05%에서 가장 높은 생산성을 보여 주었고 투여 농도가 높아질수록 테이코플라닌 생산이 저해되는 양상을 보였다. Leucine의 경우에는 0.2% 농도까지 테이코플라닌 생산이 증가하다가 더 높은 농도에서는 생산이 급격히 감소하는 패턴을 보였다. ID9303의 경우에는 아미노산 0.5%에서는 생산성이 저해되는 공통적인 특징을 보였다.

<실시예 6> Proline이 테이코플라닌의 생산에 미치는 영향

실시예 3의 기본 배지에 0.5% PEG를 추가하여 proline 농도별 테이코플라닌의 생산에 미치는 영향을 확인하였다. Proline 0.05%-0.1% 농도까지 테이코플라닌의 생산성 증대가 탁월하였으며 특히 proline 0.05% 투여 조건에서 도 4의 결과처럼 배양 8일 동안 계속 생산성의 증대가 이루어졌으며 배양 8일째에 4,350㎎/ℓ의 최대 생산성을 나타내었으며 이 후로 약 6%씩의 생산성 하락이 나타났다. 도 4의 결과를 보면 cell과 filtrate에 테이코플라닌이 각각 존재하였으나 filtrate보다 cell에 테이코플라닌이 더 많이 존재하였으며 배양 8일까지 테이코플라닌의 생산량의 증가와 반대로 cell과 filtrate의 테이코플라닌 존재 비율은 10/0에서 7/3으로 바뀌었고 이 후 배양 9일과 10일째는 약 5/5의 낮은 비율로 급감하였다. 이와 동시에 유효 물질인 A2-1, A2-2, A2-3, A2-4, A2-5 이외에 많은 불순물이 생산되기 때문에 배양 8일까지 테이코플라닌을 생산하는 것이 배양액의 품질을 증가하는 방법인 것을 확인하였다. 이상의 결과는 0.05% proline를 사용했을 경우 테이코플라닌의 생산성을 증가시키는 역할이 가장 우수하다는 것을 제공하고 있다.

<실시예 7> 75L 발효조에서 테이코플라닌의 생산

실시예 6까지 확보된 배양 배지 조성을 이용하여 75L 바이오엔지니어링의 발효조에서 테이코플라닌의 생산 시험을 진행하였다. 배양 3일부터 테이코플라닌의 생산이 개시되었고 배양 8일째에 가장 높은 4,717㎎/ℓ의 테이코플라닌 생산성을 보여 주었다. 배양 3일부터 pH 또한 상승하기 시작하여 배양 11일까지 pH 7.99로 상승하는 배양 추세를 보여 주었고 DO의 경우에는 배양 2일까지 급격히 하락하다가 배양 3일째에 급격한 상승을 이루는 전형적인 방선균 배양시의 DO 패턴을 보여 주었다.

도 5는 가장 높은 생산성을 나타내는 주요 배지원인 proline과 arginine의 배양액을 HPLC로 분석한 결과이다. A2-2와 A2-3 사이에 발생하는 물질은 테이코플라닌 기준에서 벗어난 불순물로써 배양액에서 시작하는 분리정제 단계에서 분리하기 힘든 불순물이며 분리하기 위해서는 많은 비용과 함께 수율의 손실을 감안해야 하기 때문에 배양 시에 발생하지 않도록 배양액의 품질 관리가 필요한 부분이다. 따라서 높은 생산 수율과 더불어서 HPLC 분석 상에서 A2-3과 A2-4 사이에 존재하는 불순물의 함량이 낮은 품질의 배양액을 획득하는 것이 분리 비용이나 원료 품질 부문에 있어서 가장 경쟁력 있는 생산 방법이 되는 것이다. Proline 투여 조건의 배양액에 대한 HPLC 분석 결과를 보면 용매 피크를 포함한 초반부의 불순물을 제외하면 거의 대부분 A2-1, A2-1, A2-3, A2-4, A2-5 만으로 구성되어 있다는 것을 알 수 있으며 이에 비해 arginine은 A2-3와 A2-4 사이의 불순물 비율이 높으며 A2-5 뒷부분의 불순물의 비율이 높기 때문에 분리정제 시에 A2-5 부분을 분리정제하기 매우 어렵다는 것을 알 수 있으며 이것은 테이코플라닌의 품질에도 영향을 미치기 때문에 불순물로 인한 경쟁력 저하를 예상할 수 있다.

결론적으로 테이코플라닌을 생산하기 위해서 미생물 배양을 진행하게 되면 테이코플라닌 이외의 불순물은 자연스럽게 생성된다. 이 불순물은 유효 물질의 품질을 떨어뜨리고 생산 비용을 증가시키는 요인으로 작용하기 때문에 테이코플라닌의 생산에 있어서 중요한 것은 생산성의 증대뿐만 아니라 불순물이 적은 배양액의 생산이다. 테이코플라닌 생산용 배지 조성에 proline의 투여 효과는 생산성의 증가에 기여하는 것뿐만 아니라 배양이 진행되면서 발생하는 배양액 내의 불순물들의 생성을 감소시키기 때문에 테이코플라닌의 산업적 생산에서 가장 경쟁력 있는 테이코플라닌 생산 방법을 제공하는 것이다.

도1은 베넷 배지상에서 Wild-Type(ATCC31121)과 Mutant(ID9303)의 색깔비교를 보여주는 사진이다.

도2는 ID9303의 테이코플라닌 생산에 있어서 계면활성제가 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도3은 ID9303의 테이코플라닌 생산에 있어서 아미노산이 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도4는 ID9303의 테이코플라닌 생산에 있어서 proline이 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도5는 HPLC 상에서의 ID9303 배양액을 분석한 크로마토그래프이다.

Claims

테이코플라닌을 생산하는 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ID9303(기탁번호 KCTC 11259BP)
제1항의 균주를 이용하여 배양한 고품질의 배양액
제1항의 균주를 이용하여 테이코플라닌을 생산함에 있어서, 배지 조성 아미노산으로서 Proline을 투여함을 특징으로 하는 테이코플라닌의 제조방법