KR20090081125A - 이중가닥 ｍｉＲＮＡ를 유효성분으로 포함하는 항암제 - Google Patents
이중가닥 ｍｉＲＮＡ를 유효성분으로 포함하는 항암제 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20090081125A KR20090081125A KR1020080007032A KR20080007032A KR20090081125A KR 20090081125 A KR20090081125 A KR 20090081125A KR 1020080007032 A KR1020080007032 A KR 1020080007032A KR 20080007032 A KR20080007032 A KR 20080007032A KR 20090081125 A KR20090081125 A KR 20090081125A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- seq
- double
- mir
- stranded mirna
- rna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 title claims abstract description 82
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 title claims abstract description 82
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 108091025686 miR-199a stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 39
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 75
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 66
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 34
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 24
- 101150105382 MET gene Proteins 0.000 abstract description 19
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 abstract description 12
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 abstract description 12
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 abstract description 11
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 abstract description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 7
- 101000876610 Dictyostelium discoideum Extracellular signal-regulated kinase 2 Proteins 0.000 abstract description 3
- 101001052493 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase 1 Proteins 0.000 abstract description 3
- 101150011585 MAT gene Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 111
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 27
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 21
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 21
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 21
- 108010024605 neurotensin mimic 2 Proteins 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 12
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 12
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 8
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 208000003445 Mouth Neoplasms Diseases 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 208000012987 lip and oral cavity carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 108010024603 neurotensin mimic 1 Proteins 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 4
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 4
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 3
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 101150034941 AURKB gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 2
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 2
- 102100032306 Aurora kinase B Human genes 0.000 description 2
- 101150017888 Bcl2 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 101000798306 Homo sapiens Aurora kinase B Proteins 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 2
- 102000003714 TNF receptor-associated factor 6 Human genes 0.000 description 2
- 108090000009 TNF receptor-associated factor 6 Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(C=2N=CN=C(NC=3C=CC(OC(F)(F)F)=CC=3)C=2)=C1 WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000852483 Homo sapiens Interleukin-1 receptor-associated kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010072621 Interleukin-1 Receptor-Associated Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000006940 Interleukin-1 Receptor-Associated Kinases Human genes 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100036342 Interleukin-1 receptor-associated kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012790 adhesive layer Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000004611 cancer cell death Effects 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- YLMAHDNUQAMNNX-UHFFFAOYSA-N imatinib methanesulfonate Chemical compound CS(O)(=O)=O.C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 YLMAHDNUQAMNNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 108091023663 let-7 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091063478 let-7-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091049777 let-7-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 108091032320 miR-146 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091024530 miR-146a stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091043612 miR-146b stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091057645 miR-15 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091027943 miR-16 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091091751 miR-17 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091069239 miR-17-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 210000002374 sebum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 150000004917 tyrosine kinase inhibitor derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
본 발명은 메트(Met) 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 메트 유전자의 발현을 억제하고 암세포 성장을 저해할 수 있는 이중가닥 miRNA 및 그를 유효성분으로 포함하는 항암제에 관한 것이다. 본 발명의 항암제는 메트 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 메트 유전자의 발현을 억제하고 암세포 성장 및 전이를 저해할 수 있는 miR-199a(서열번호 1) 또는 miR-199a*(서열번호 2)을 단일가닥으로 포함하는 이중가닥 miRNA를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 항암제는 암세포의 성장 및 전이를 유발시키는 메트 유전자 및 하위 작동기인 ERK2 유전자의 발현을 억제할 수 있으므로, 범용적인 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
마이크로 RNA, miR-199a, miR-199a*, 항암제
Description
본 발명은 암세포 성장 및 전이를 억제하는 이중가닥 miRNA 및 그를 유효성분으로 포함하는 항암제에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 메트(Met) 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 메트 유전자의 발현을 억제하고 암세포 성장을 저해할 수 있는 이중가닥 miRNA 및 그를 유효성분으로 포함하는 항암제에 관한 것이다.
특정 유전자의 발현을 억제하는 기술은 질병치료를 위한 치료제의 개발과 표적 검증을 위한 중요한 도구가 된다. 종래에는 특정 유전자를 억제하기 위하여 특정 유전자에 대한 전이유전자(transgene)를 도입하는 기술을 사용하였으며, 이 기술은 프로모터를 기준으로 역방향(antisense)으로 전이유전자를 도입하는 방법(참조: Sheehy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:8805-8808, 1988; Smith, et al., Nature, 334:724-726, 1988)과 프로모터를 기준으로 정방향(sense) 으로 전이유전자를 도입하는 방법을 사용하였다(참조: Napoli, et al., Plant Cell, 2:279-289, 1990; van der Krol, et al., Plant Cell, 2:291-299, 1990; 미국특허 제 5,034,323호; 미국특허 제 5,231,020호; 및, 미국특허 제 5,283,184호).
마이크로 RNA(microRNA: 이하, 'miRNA'라 함)는 길이가 19 내지 25개의 뉴클레오티드(nucleotide: 이하, 'nt'라 함)를 가지는 짧은 단일가닥 리보핵산(RNA)으로, 세포내에서 발현되어 여러 유전자의 발현을 조절하고(참조: Bartel DP., Cell, 116(2):281-97, 2004; He L., Hannon GJ., Nat. Rev. Genet., 5(7):522-31, 2004), 현재까지 인간에서 약 500종의 miRNA가 발견되었으며, 약 1000종까지 존재할 것으로 예측되고 있다(참조: Bentwich, et al., Nat. Rev. Genet., 37(7):766-70, 2005; Berezikov, et al., Cell, 120(1):21-4, 2005).
miRNA는 세포내에서 자연적으로 만들어지며, 일차 miRNA(primary miRNA)로 전사된 후, 드로샤(drosha) 등에 의해 전구체 miRNA(precursor miRNA)로 절단되면, 핵에서 세포질로 이동하고, 세포질내에서 다이서(dicer) 효소에 의하여 단일 가닥의 miRNA로 만들어진다(참조: Lee, et al., Nature, 425(6956):415-9, 2003; Gregory, et al., Nature, 432(7014):235-40, 2004; Yi, et al., Genes & Dev., 17:30113016, 2003; Bohnsack, et al., RNA, 10:185191, 2004; Hutvagner, et al., Science, 293:834838, 2001; Ketting, et al., Genes & Dev., 15: 26542659, 2001).
이러한 miRNA는 표적 mRNA의 3'-UTR(untranslated region)의 염기서열에 상보적으로 결합하여 리보솜에 의해 mRNA가 단백질로 번역되는 과정을 억제 또는 mRNA가 분해되도록 하여 유전자의 발현을 억제한다. 또한, 하나의 miRNA가 여러 종류의 mRNA를 조절하는 것이 가능하기 때문에, 인간 유전자의 30%가 miRNA에 의해 조절될 것이라고 보고되었다(참조: Lewis, et al., Cell, 120(1):15-20, 2005).
최근에는 많은 종류의 암에서 miRNA 발현에 변화가 있어, 암 발병 기작과 강한 연관성이 있을 것으로 예측되었고, 여러 종류의 miRNA가 암 억제인자 또는 발암인자로 작용하고 있음이 밝혀졌다(참조: Iorio, et al., Cancer Res., 65(16):7065-70, 2005; Yu, et al., DNA Cell Biol., 26(5):283-92, 2007; Soifer, et al., Mol. Ther., 15(12):2070-2079, 2007). 예를 들어, miRNA의 일종인 let-7 miRNA는 정상 세포에서는 RAS 발암 유전자의 활성을 억제하고, 폐암세포에서는 발현이 억제되어 RAS 발암 유전자를 활성화시키며(참조: Johnson, et al., Cell, 120(5):635-47, 2005), miR-15 및 miR-16은 정상 세포에서는 발암 유전자인 Bcl2의 발현을 억제하고, 혈액암의 일종인 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia) 환자의 골수세포에서는 발현이 억제되어 상기 Bcl2의 발현량을 증가시킴으로써, 상기 백혈병을 심화시키는 것으로 보고되었다(참조: Cimmino, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 102(39):13944-9, 2005).
한편, 상기 각각의 암세포에 상기 각 miRNA를 도입하면, 상기 각 암세포들이 사멸하거나 또는 암세포의 성장이 현저하게 억제됨이 보고되었다(참조: Cimmino, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 102(39):13944-9, 2005; Takamizawa, et al., Cancer Res., 64(11):3753-6, 2004). 이와 같이 miRNA를 이용하여 유전자의 발현을 억제하는 개념은 특정 세포내에서 특정한 유전자의 발현을 억제시켜, 이에 의한 변화를 관찰함으로써, 특정 세포에서의 유전자 기능을 규명하는 연구에 유용할 뿐 아니라, 감염성 바이러스 또는 암세포 등에서 특정한 유전자의 기능을 억제하여, 해당 질병을 치료하는 방법을 개발하는데 유용하게 활용될 수 있는 바, 시험관내(in vitro) 연구 및 실험 동물을 이용한 연구를 수행한 결과, miRNA를 이용하여 목적 유전자의 발현을 억제하는 것이 가능하였다(참조: Cimmino, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 102(39):13944-9, 2005; Takamizawa, et al., Cancer Res., 64(11):3753-6, 2004; Akao, et al., Biol. Pharm. Bull., 29(5):903-6, 2006; Scott, et al., J. Biol. Chem., 282(2):1479-86, 2007; Chan, et al., Cancer Res., 65(14):6029-33, 2005; Si, et al., Oncogene, 26(19):2799-803, 2007; Krutzfeldt, et al., Nature, 438(7068):685-9, 2005). 예를 들면, 미국특허공개 제 2007/0232553호에는 miR-146a와 miR-146b를 도입하여 인터루킨-1 수용체결합 인산화효소(IL-1 receptor associated kinase 1, IRAK1)와 종양괴사인자 수용체 결합인자 6(TNF receptor associated factor 6, TRAF6)의 발현을 억제하여 면역 질환을 치료하는 방법이 개시되어 있고, 미국특허공개 제 2006/0189557호에는 마이크로 RNA를 암세포에 도입하여 RAS 발암유전자를 억제하여 암세포를 치료하는 방법이 개시되어 있으며, 국제특허공개 WO 06133022호에는 miR17 클러스터의 miRNA들을 억제하여 암세포를 치료하는 방법이 개시되어 있다.
아울러, 암세포는 세포자살(apoptosis)의 속도가 감소하고 세포주기가 비정상적으로 변화되기 때문에, 세포주기를 정상화시키거나 또는 세포자살 속도를 회복시켜서, 목적하는 암세포의 성장을 억제하는 표적 치료법(targeted therapy)이 새 로운 항암치료 방법으로 대두되고 있다. 상기 표적 치료법에 이용되는 의약은 대체로 다양한 암세포 성장인자들의 수용체 티로신 키나제(receptor tyrosine kinase)의 기능을 억제시켜서, 결과적으로는 암세포의 성장 또는 증식을 저해한다. 예를 들어, 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia)의 치료제인 글리벡(Glivec™)은 백혈병에서 항상 활성화되어 있는 BCR-ABL 결합단백질의 수용체 티로신 키나제의 ATP 결합부위에 결합하여 티로신의 인산화를 억제하여 암세포의 성장을 저해하고, 유방암에 대한 면역 치료제인 허셉틴(Herceptin™)은 Her-2의 수용체 티로신 키나제에 의한 인산화를 억제하여 암세포의 증식을 저해한다(참조: Fabbro, et al., Pharmacol. Ther., 93(2-3):79-98, 2002; Radford, Curr. Opin. Investig. Drugs, 3(3):492-9, 2002; Miles, Breast Cancer Res., 3(6):380-4, 2001).
상술한 수용체 티로신 키나제 중 하나인 메트 수용체(Met receptor)는 간 세포 성장 인자(hepatocyte growth factor)에 대한 수용체로서, 세포 성장, 운동성(motility), 침윤(invasion), 전이(metastasis) 등에 관여한다고 알려져 있다(참조: Gherardi, E., Stoker, M., Cancer Cells, 3(6):227-32, 1991; Birchmeier, et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 4(12):915-25, 2003). 상기 메트 단백질은 많은 암세포에서 유전자의 증폭 또는 돌연변이에 의해 활성화되기 때문에, 이를 억제하여 범용적으로 암세포의 성장 및 전이를 저해하려는 연구가 활발히 진행되어 왔다(참조: Benvenuti, S., Comoglio, PM., J. Cell Physiol., 213(2):316-25, 2007; Takayama, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94(2):701-6, 1997; Schmidt, et al., Nat. Rev. Genet., 16(1):68-73, 1997; Kuniyasu, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 189(1):227-32, 1992; Kijima, et al., Oncology, 62(1):60-5, 2002; Miller, et al., Oncogene, 25(3):409-18, 2006). 상기 저해방법으로는 항체나 펩티드와 같은 수용체의 길항제 또는 티로신 키나제 억제제 등의 사용이나, 안티센스 RNA(antisense RNA)나 siRNA 등을 이용한 메트 단백질의 발현억제 등이 고려되었으나(참조: Matsumoto, K., Nakamura, T., Front Biosci., 13:1943-51, 2008; Burgess, et al., Cancer Res., 166(3):1721-9, 2006; Kim, et al., Clin. Cancer Res., 12(4):1292-8, 2006; Smolen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 103(7):2316-21, 2006; Kong-Beltran, et al., Cancer Cell, 6(1):75-84, 2006; Michieli, et al., Cancer Cell, 6(1):61-73, 2004; Shinomiya, et al., Cancer Res., 64(21):7962-70, 2004; Taulli, et al., Cancer Res., 66(9):4742-9, 2006; Lutterbach, et al., Cancer Res., 67(5):2081-8, 2007; Corso, et al., Oncogene, 6; 1-10, 2007; Salvi, et al., Int. J. Oncol., 31(2):451-60, 2007), 현재까지 그 성과는 미미한 수준으로, 메트 단백질의 발현을 조절하여 효과적으로 암세포를 치료할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 메트 단백질의 발현을 조절하여 효과적으로 암세포를 치료할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 공지된 miRNA의 일종인 miR-199a 및 miR-199a*를 모방체(mimetic) 형태로 직접 암세포에 도입시킬 경우, 암세포내의 메트 유전자의 발현을 억제시켜서 암세포를 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 메트 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 메트 유전자의 발현을 억제하고 암세포 성장 및 전이를 저해할 수 있는 이중가닥 miRNA를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 메트 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 메트 유전자의 발현을 억제하고 암세포 성장 및 전이를 저해할 수 있는 이중가닥 miRNA를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항암제를 제공하는 것이다.
본 발명은 본 발명은 메트(Met) 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 메트 유전자의 발현을 억제하고 암세포 성장을 저해할 수 있는 이중가닥 miRNA 및 그를 유효성분으로 포함하는 항암제를 제공한다. 본 발명의 항암제는 암세포의 성장 및 전이를 유발시키는 메트 유전자 및 하위 작동기인 ERK2 유전자의 발현을 억제할 수 있으므로, 범용적인 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
본 발명자들은 miRNA는 목적하는 유전자의 발현을 억제시키는 효과를 나타내므로, 목적하는 유전자가 활발하게 발현되는 세포에서, 정상세포보다 낮은 수준으로 나타나는 miRNA는 목적하는 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 가능성이 있다는데 주목하여, 메트 유전자의 발현을 억제하는 방법을 개발하고자 하였다. 구체적으로, 휴지기 상태의 세포에 비하여 메트 유전자가 활발하게 발현되는 성장기의 세포에서 낮은 수준으로 발현되는 miRNA를 스크리닝하였다.
그 결과, miRNA인 miR-199a(서열번호 1) 또는 miR-199a*(서열번호 2)가 휴지기 세포보다 성장기 세포에서 그의 수준이 저하되고, 상기 각 miRNA의 수준을 폐암세포에서 측정한 결과, 매우 낮은 수준으로 존재함을 알 수 있었다. 또한, 상기 각 miRNA를 성장기 세포에 처리한 결과, 메트 유전자의 발현이 현저하게 감소하고, 이에 따라 성장기 세포가 정상적으로 성장하지 못함을 확인하였다. 이러한 결과로부터, 상기 각 miRNA를 암세포에 처리하면, 메트 단백질의 발현이 억제되어 암세포의 성장 또는 증식을 억제할 수 있을 것으로 예측하였다.
이어, miRNA는 이중가닥 RNA 형태로 합성되고, 단일가닥으로 분리된 후에야 세포내에서 실질적으로 활성을 나타내므로, 본 발명자들은 상기 miR-199a 또는 miR-199a*를 실제적으로 이용할 수 있도록, 상기 각 miRNA의 염기서열(sense) 및 이에 대하여 상보적인 각각의 안티센스(antisense) 염기서열을 포함하는 이중가닥의 형태로 상기 각 miRNA를 제조하고자 하였다. 이때, 상기 miR-199a 또는 miR- 199a*에 상보적인 염기서열을 갖는 안티센스 염기서열은 miRNA의 안정성을 증대시킬 수 있는 3' 오버행(overhang)을 포함하도록 하였다.
또한, 상기 miR-199a 또는 miR-199a*과 완벽하게 상보성을 갖는 안티센스를 포함하는 이중가닥 miRNA를 사용한 경우보다는, 3' 또는 5' 말단의 일부가 미스매치된 안티센스를 포함하는 이중가닥 miRNA가 보다 효과적으로 메트 단백질의 발현을 억제할 수 있음을 확인하고, 이를 반영하여 안티센스 서열을 결정하였다.
이에 따라, 상기 miR-199a 또는 miR-199a*의 염기서열 및 본 발명자들이 결정한 상기 각 miRNA에 상보적인 안티센스 RNA의 염기서열은 다음과 같다:
miRNA 염기서열
miR-199a
5'-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3' (MIMAT0000231, 서열번호 1)
miR-199a*
5'-UACAGUAGUCUGCACAUUGGUU-3' (MIMAT0000232, 서열번호 2)
miR-199a(서열번호 1)에 대응하는 안티센스(antisense) RNA :
5'-ACAGGUAGUCUGAACACUGGGUU-3' (서열번호 3)
5'-ACAGGUAGUCUGAACACUGUAUU-3' (서열번호 4)
miR-199a*(서열번호 2)에 대응하는 안티센스(antisense) RNA :
5'-CCAAUGUGCAGACUACUGUACA-3' (서열번호 5)
5'-CCAAUGUGCAGACUACUAUACA-3' (서열번호 6)
상기 서열 중에서, miR-199a(서열번호 1)는 서열번호 3의 안티센스 RNA와 결합된 이중가닥 miRNA(199a 모방체-1) 또는 서열번호 4의 안티센스 RNA와 결합된 이중가닥 miRNA(199a 모방체-2)를 형성할 수 있고, miR-199a*(서열번호 2)는 서열번호 5의 안티센스 RNA와 결합된 이중가닥 miRNA(199a* 모방체-1) 또는 서열번호 6의 안티센스 RNA와 결합된 이중가닥 miRNA(199a* 모방체-2)를 형성할 수 있다.
본 발명자들은 상기 형성된 각각의 이중가닥 miRNA를 실험실적 조건에서 암세포에 도입시킬 경우, 세포내에서 메트 단백질의 양이 저하되고, 암세포의 증식이 억제됨을 확인할 수 있었다.
아울러, 암세포를 이식한 실험동물에 상기 각 이중가닥 miRNA들을 피하주사하여 도입시킬 경우, 실험동물의 체내에서 암세포가 사멸하거나 또는 이의 증식이 억제됨을 확인하였으므로, 본 발명의 이중가닥 miRNA를 항암제의 유효성분으로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다. 특히, 상기 각 이중가닥 miRNA 중에서도 199a* 모방체-2는 암세포의 증식을 가장 효과적으로 억제할 수 있음을 실험적으로 확인하였다.
결국, 본 발명의 항암제는 메트 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 메트 유전자의 발현을 억제하고 암세포 성장 및 전이를 저해할 수 있는 miR-199a(서열번호 1) 또는 miR-199a*(서열번호 2)을 단일가닥으로 포함하는 이중가닥 miRNA를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 이때, 이중가닥 miRNA는 특별히 이에 제한되지 않으나, miR-199a(서열번호 1)와 서열번호 3의 서열을 갖는 RNA가 결합된 것, miR-199a(서열번호 1)와 서열번호 4의 서열을 갖는 RNA가 결합된 것, miR-199a*(서열번호 2)와 서열번호 5의 서열을 갖는 RNA가 결합된 것 또는 miR-199a*(서열번호 2)와 서열번호 6의 서열을 갖는 RNA가 결합된 것을 사용함이 바람직하다.
한편, 본 발명의 항암제는 메트 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 메트 유전자의 발현을 억제하고 암세포 성장 및 전이를 저해할 수 있는 이중가닥 miRNA를 주사용 조성물과 혼합하여 종양이 발생한 부위에 주사형태로 투여하거나, 겔 조성물 또는 경피흡수용 점착 조성물과 혼합하여, 직접 환부에 바르거나 붙여서 투여할 수 있도록 구현함이 바람직하다. 이때, 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 상기 조성물은 멸균되고/되거나, 보조제(예를 들면, 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 및/또는 리포좀 제제)를 함유하며, 겔 조성물은 카르복시메틸 셀룰로오즈, 메틸 셀룰로오즈, 아크릴산 중합체, 카르보폴(carbopol) 등의 겔 제제와 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 리포좀 제제를 함유하며, 경피흡수용 점착제제는 유효성분층이 점착제층, 피지흡수를 위한 흡착층 및 치료약물층을 포함하고, 치료약물층은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 리포좀 제제를 함유한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 이중가닥 miRNA의 제조
공지된 방법에 따라, 서열번호 1 내지 6의 염기서열을 갖는 RNA를 합성하고, 이들을 결합시켜 이중가닥 miRNA를 제조하였다(참조: Sinha, et al., Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984).
즉, RNA 합성기(Perseptive Biosystems 8909, PE Biosystems, USA) 및 합성촉매로서 β-시아노에틸 포스포라미다이트(β-cyanoethyl phosphoramidite)를 사용하여, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 산화(oxidation) 및 캡핑(capping)으로 이루어지는 일련의 과정을 반복하여 서열번호 1 내지 6의 염기서열을 갖는 각각의 RNA를 합성하고, 다이소젤(Daisogel C18, Daiso, Japan)을 사용하는 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan) 및 MALDI-TOF 질량 흡광분석 기(Shimadzu, Japan)를 이용하여 서열번호 1 내지 6의 염기서열을 갖는 각각의 RNA를 분리하여 수득하였다.
그런 다음, 서열번호 1과 3, 서열번호 1과 4, 서열번호 2와 5 및 서열번호 2와 6의 RNA를 각각 혼합하고, 이들을 90℃로 10분동안 가열한 다음 상온까지 서서히 냉각시켜서, 하기와 같은 각각의 이중가닥 miRNA를 제조하였다.
miR-199a에 대한 이중가닥 miRNA-1(199a 모방체-1):
센스 RNA 가닥 5'-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3' (서열번호 1),
안티센스 RNA가닥 3'-UUGGGUCACAAGUCUGAUGGACA-5' (서열번호 3)
miR-199a에 대한 이중가닥 miRNA-2(199a 모방체-2):
센스 RNA 가닥 5'-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3' (서열번호 1),
안티센스 RNA가닥 3'-UUAUGUCACAAGUCUGAUGGACA-5' (서열번호 4)
miR-199a*에 대한 이중가닥 miRNA-1(199a* 모방체-1):
센스 RNA 가닥 5'-UACAGUAGUCUGCACAUUGGUU-3' (서열번호 2),
안티센스 RNA가닥 3'-ACAUGUCAUCAGACGUGUAACC-5' (서열번호 5)
miR-199a*에 대한 이중가닥 miRNA-2(199a* 모방체-2):
센스 RNA 가닥 5'-UACAGUAGUCUGCACAUUGGUU-3' (서열번호 2),
안티센스 RNA가닥 3'-ACAUAUCAUCAGACGUGUAACC-5' (서열번호 6)
실시예 2: 이중가닥 miRNA로 형질전환된 암세포의 제조
상기 실시예 1에서 제조된 각각의 이중가닥 miRNA를 폐암세포 및 구강암세포에 도입하여, 각각의 형질전환된 암세포를 제조하였다.
먼저, 미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 폐암세포(A549) 및 구강암세포(KB)를 10%(v/v) 우태아 혈청, 100units/ml 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA)에서 6-웰 플레이트의 각 웰당 2.5 X 105개의 세포를 분주하여, 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건하에서 24시간 동안 배양하였다.
한편, 실시예 1에서 제조한 각각의 이중가닥 miRNA를 최종 농도 100nM(100 pmol/ml)이 되도록 250㎕ Opti-MEM 배지와 혼합한 시약 1 및 3.5㎕ RNAiMAX(Invitrogen, USA)와 250㎕ Opti-MEM 배지를 혼합하여 실온에서 5분간 반응시킨 시약 2를 각각 수득하고, 상기 시약 1 및 2를 동량으로 혼합한 다음, 상온에서 20분동안 반응시켜서 형질전환 용액을 수득하였다.
상기 배양된 폐암세포(A549) 및 구강암세포(KB)를 Opti-MEM 배지(GIBCO/Invitrogen, USA)로 세척하고, 상기 수득한 형질전환 용액 500㎕와 Opti-MEM 배지 500㎕를 분주한 다음, 6시간 동안 배양하고, 배지를 RPMI 배양배지 2.0㎖ 로 교체하고, 다시 72시간 동안 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건하에 배양하여, 각각의 형질전환 세포를 제조하였다.
실시예 3: 이중가닥 miRNA의 폐암세포 사멸 및 폐암세포 증식억제 효과
본 발명의 이중가닥 miRNA가 암세포의 사멸 및 증식을 억제할 수 있는지를 확인하고자 하였다.
즉, 상기 실시예 2에서 제조한 이중가닥 miRNA로 형질전환된 각각의 폐암세포를 현미경으로 세포형태를 관찰하고(참조: 도 1a), 상기 각 폐암세포를 세포자살이 유도되는 세포의 세포막 외면을 염색할 수 있는 형광염료인 애넥신 V(annexin V)로 염색한 후 이들의 형광발색의 정도를 관찰하여 세포사멸의 정도를 판단하였으며(참조: 도 1B), 헤마사이토미터(hemacytometer)를 이용하여 상기 각 폐암세포의 세포수를 측정하고, 대조군의 세포수에 대한 비율로서 각 폐암세포의 생존율을 산출하였다(참조: 도 1c). 이때, 대조군으로는 세포내에서 단백질의 발현을 전혀 억제하지 못하는 NC 모방체(negative control mimic, CN-001000-01; Dharmacon Inc., USA)로 형질전환된 암세포를 사용하였다.
도 1a는 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환시킨 인간 폐암세포 A549의 세포형태를 나타내는 현미경 사진이다. 도 1a에서 보듯이, 199a 모방체-1(서열번호 1 및 3), 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4), 199a* 모방체-1(서열번호 2 및 5) 및 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)가 형질전환된 실험군의 경우, 형질전환되지 않은 대조군과 비교하였을 때, 둥근 형태의 단일세포(round form single cell)로 존재하고 있는 세포가 증가되어 있음을 확인할 수 있었으며, 이는 상호 부착(adhesion)되어 성장하는 암세포의 성질에 부합하지 않는 현상이므로, 상기 결과는 암세포가 사멸하는 것으로 분석되었다.
또한, 도 1b는 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환시킨 인간 폐암세포 A549의 세포자살 현상이 유도된 세포를 나타내는 현미경 사진이다. 도 1b에서 보듯이, 세포자살이 유도되는 세포의 세포막 외면을 염색하는 형광염료인 애넥신 V(annexin V)에 의해 염색되어진 세포의 수가 대조군 NC보다 실험군에서 더 많이 관찰되었다. 이러한 사실에 의해, 세포사멸이 유도되었음을 확인할 수 있었으며, 특히, 199a* 모방체-1(서열번호 2 및 5) 또는 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)에 의한 사멸 효과가 199a 모방체-1(서열번호 1 및 3) 또는 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4)에 의한 것보다 우수함을 알 수 있었다.
아울러, 도 1c는 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환시킨 인간 폐암세포 A549의 세포 수 변화를 나타내는 그래프이다. 도 1c에서 보듯이, 헤마사이토미터를 이용하여 세포수를 측정한 결과, 199a* 모방체-1(서열번호 2 및 5) 또는 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)를 처리한 실험군의 경우, 대조군을 처리한 세포에 비하 여 세포수가 현저히 적어 암세포 증식이 효과적으로 억제됨을 알 수 있었다.
상기 각 결과를 종합하면, 본 발명의 이중가닥 miRNA는 폐암세포를 사멸시키거나 또는 폐암세포의 증식을 억제하는 효과를 나타내므로, 항암제의 유효성분으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: 메트와 어크2(ERK2) 단백질에 대한 웨스턴 블럿(Western blot) 분석
실시예 2에서 제조된 각각의 형질전환된 폐암세포를 대상으로 하여, 메트와 어크2 단백질에 대한 항체를 이용하여, 웨스턴 블럿을 수행하였다.
구체적으로, 형질전환한 후 72시간이 경과한 폐암세포로부터 단백질 추출키트(CelLytic-M cell lysis reagent, Sigma, USA)를 이용하여, 전체 세포내 단백질을 추출하였다. SDS 샘플 완충용액(Santa Cruz Biotechnology, USA)을 추출된 전체 단백질 30㎍에 처리한 후, 4 내지 20% SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-PAGE)에 적용하였다. 이어, 항-메트와 항-어크2 단일클론 항체(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)를 1차 항체로 하고, 호스래디시페록시다제(horseradish peroxidase)가 결합된 항-마우스(메트) 또는 항-래빗(어크2) 항체(Pierce, USA)를 2차 항체로 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다(참조: 도 2).
도 2는 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환된 세포에서 발현된 메트(Met) 및 어크2(ERK2)의 단백질 수준을 나타내는 웨스턴블롯 사진이다. 도 2에서 보듯이, 199a* 모방체-1(서열번호 2 및 5) 또는 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)를 처리한 경우, 메트와 어크2 단백질의 발현량이 현저히 감소된 것을 알 수 있었다.
실시예 5: 구강암세포가 이식된 누드마우스에서 이중가닥 miRNA의 구강암세포 증식억제 효과
생체내에서도 이중가닥 miRNA가 암세포의 증식을 억제할 수 있는지를 확인하고자 하였다.
실시예 1에서 제조한 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4) 또는 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)를 이용하여, 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4), 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6), 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4)와 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)의 동량 혼합물 또는 대조군인 NC 이중가닥 RNA로 형질전환된 인간 구강암세포(KB)를 24시간 배양한 후, 3 X 106개의 세포를 24마리의 누드마우스(BALB/c SIC-nu/nu Mice, female, SLC Inc., Japan)의 좌측 경배부에 각 시료당 6두씩 피하주사하여 이종이식을 시행하였다. 이때, 누드마우스는 생후 5-6주령의 체중이 평균 18g 내외의 암컷을 사용하였다.
종양크기는 이식 후, 5일, 9일, 12일, 14일, 16일 및 19일에 측정하였고, 장경과 단경을 측정하여 '평균 종양크기 = [(단경)x(단경)]x(장경)/2 (mm3)'로 계산하 였으며, 각 실험군과 대조군의 날짜별 종양크기를 평균하여 그래프로 나타내고 각 그룹 간의 종양크기 차이를 확인하였다(참조: 도 3). 이때, 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4), 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6), 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4)와 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)의 동량 혼합물이 형질전환된 암세포 접종군 또는 대조군인 NC 이중가닥 RNA가 형질전환된 암세포 접종군 간의 종양크기 변화의 통계적 유의성 검증은 컴퓨터 프로그램(One way ANOVA)으로 분석하였고, 사후검증은 쉐페의 다중비교 검정(Scheffe's multiple comparison test, SPSS software ver.12, SPSS Inc., USA)을 이용하였으며, 유의확률(P value)이 0.05이하일 때, 통계적 유의성이 있는 것으로 인정하였다.
도 3은 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환된 암세포가 이식된 누드마우스에서 시간의 경과에 따른 종양크기의 변화를 나타내는 그래프로서, (◇)는 199a 모방체-2에 의해 형질전환된 암세포가 이식된 누드마우스를 나타내고, (●)는 199a* 모방체-2에 의해 형질전환된 암세포가 이식된 누드마우스를 나타내며, (▲)는 199a 모방체-2와 199a* 모방체-2의 동량 혼합물에 의해 형질전환된 암세포가 이식된 누드마우스를 나타내고, (□)는 대조군을 나타낸다.
도 3에서 보듯이, 이식 후 6일까지는 각 실험군에서 큰 차이를 확인할 수 없었으나, 6일 이후, 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4), 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6), 199a 모방체-2(서열번호 1 및 4)와 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)의 동량 혼합물이 형질전환된 암세포 접종군의 종양크기가 대조군의 종양크기와 비교하 여 현격히 작은 것을 관찰할 수 있었다. 특히, 199a* 모방체-2(서열번호 2 및 6)만을 형질전환시킨 암세포 접종군에서 종양성장의 현저한 억제활성을 확인할 수 있었다.
도 1a는 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환시킨 인간 폐암세포 A549의 세포형태를 나타내는 현미경 사진이다.
도 1b는 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환시킨 인간 폐암세포 A549의 세포자살 현상이 유도된 세포를 나타내는 현미경 사진이다.
도 1c는 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환시킨 인간 폐암세포 A549의 세포 수 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환된 세포에서 발현된 메트(Met) 및 어크2(ERK2)의 단백질 수준을 나타내는 웨스턴블롯 사진이다.
도 3은 본 발명의 이중가닥 miRNA로 형질전환된 암세포가 이식된 누드마우스에서 시간의 경과에 따른 종양크기의 변화를 나타내는 그래프이다.
<110> bioneer
<120> miRNAs for Inhibiting Tumour Cell Proliferation and Metastasis
<160> 6
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic RNA
<400> 1
cccaguguuc agacuaccug uuc 23
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic RNA
<400> 2
uacaguaguc ugcacauugg uu 22
<210> 3
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic RNA
<400> 3
acagguaguc ugaacacugg guu 23
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic RNA
<400> 4
acagguaguc ugaacacugu auu 23
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic RNA
<400> 5
ccaaugugca gacuacugua ca 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic RNA
<400> 6
ccaaugugca gacuacuaua ca 22
Claims (9)
- miR-199a(서열번호 1)와 서열번호 3의 서열을 갖는 RNA가 결합된 이중가닥 miRNA.
- miR-199a(서열번호 1)와 서열번호 4의 서열을 갖는 RNA가 결합된 이중가닥 miRNA.
- miR-199a*(서열번호 2)와 서열번호 5의 서열을 갖는 RNA가 결합된 이중가닥 miRNA.
- miR-199a*(서열번호 2)와 서열번호 6의 서열을 갖는 RNA가 결합된 이중가닥 miRNA.
- miR-199a(서열번호 1) 또는 miR-199a*(서열번호 2)을 단일가닥으로 포함하는 이중가닥 miRNA를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암 제.
- 제 5항에 있어서,이중가닥 miRNA는 miR-199a(서열번호 1)와 서열번호 3의 서열을 갖는 RNA가 결합된 것을 특징으로 하는항암제.
- 제 5항에 있어서,이중가닥 miRNA는 miR-199a(서열번호 1)와 서열번호 4의 서열을 갖는 RNA가 결합된 것을 특징으로 하는항암제.
- 제 5항에 있어서,이중가닥 miRNA는 miR-199a*(서열번호 2)와 서열번호 5의 서열을 갖는 RNA가 결합된 것을 특징으로 하는항암제.
- 제 5항에 있어서,이중가닥 miRNA는 miR-199a*(서열번호 2)와 서열번호 6의 서열을 갖는 RNA가 결합된 것을 특징으로 하는항암제.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080007032A KR101325186B1 (ko) | 2008-01-23 | 2008-01-23 | 이중가닥 ｍｉＲＮＡ를 유효성분으로 포함하는 항암제 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080007032A KR101325186B1 (ko) | 2008-01-23 | 2008-01-23 | 이중가닥 ｍｉＲＮＡ를 유효성분으로 포함하는 항암제 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20090081125A true KR20090081125A (ko) | 2009-07-28 |
| KR101325186B1 KR101325186B1 (ko) | 2013-11-07 |
Family
ID=41292147
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020080007032A Expired - Fee Related KR101325186B1 (ko) | 2008-01-23 | 2008-01-23 | 이중가닥 ｍｉＲＮＡ를 유효성분으로 포함하는 항암제 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101325186B1 (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2594275A4 (en) * | 2010-07-08 | 2014-04-23 | Takeda Pharmaceutical | Prophylactic or therapeutic agent for diabetes |
| WO2018038558A1 (ko) * | 2016-08-24 | 2018-03-01 | (주)바이오니아 | 마이크로 rna를 포함하는 이중나선 올리고 rna 구조체 |
| CN113633656A (zh) * | 2015-02-25 | 2021-11-12 | 柏业公司 | 包含微小核糖核酸作为活性成分的用于治疗癌症的药物组合物 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101585794B1 (ko) | 2014-10-07 | 2016-01-18 | 가톨릭대학교 산학협력단 | miRNA를 이용한 안과 질환의 예방 또는 치료 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2587189A1 (en) | 2004-11-12 | 2006-12-28 | Asuragen, Inc. | Methods and compositions involving mirna and mirna inhibitor molecules |
-
2008
- 2008-01-23 KR KR1020080007032A patent/KR101325186B1/ko not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2594275A4 (en) * | 2010-07-08 | 2014-04-23 | Takeda Pharmaceutical | Prophylactic or therapeutic agent for diabetes |
| US9006201B2 (en) | 2010-07-08 | 2015-04-14 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Prophylactic or therapeutic agent for diabetes |
| CN113633656A (zh) * | 2015-02-25 | 2021-11-12 | 柏业公司 | 包含微小核糖核酸作为活性成分的用于治疗癌症的药物组合物 |
| WO2018038558A1 (ko) * | 2016-08-24 | 2018-03-01 | (주)바이오니아 | 마이크로 rna를 포함하는 이중나선 올리고 rna 구조체 |
| US11123361B2 (en) | 2016-08-24 | 2021-09-21 | Bioneer Corporation | Double-stranded oligo RNA structure comprising miRNA |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101325186B1 (ko) | 2013-11-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107454843B (zh) | 包含微小核糖核酸作为活性成分的用于治疗癌症的药物组合物 | |
| US20200056177A1 (en) | Long non-coding rna used for anticancer therapy | |
| KR101718297B1 (ko) | Ｈｓｆ1-관련 질환을 치료하기 위한 유기 조성물 | |
| CN102076853A (zh) | 通过miRNA增强药物疗法 | |
| CN104583406A (zh) | 治疗kras相关疾病的有机组合物 | |
| US20080287383A1 (en) | Nucleic acid compounds for inhibiting erbb gene expression and uses thereof | |
| US20110293625A1 (en) | Inhibition of vegf-a secretion, angiogenesis and/or neoangiogenesis by sina mediated knockdown of vegf-c and rhoa | |
| JP2013515498A (ja) | ｃ−Ｍｅｔの発現を阻害するｓｉＲＮＡ及びこれを含む抗癌組成物 | |
| KR101325186B1 (ko) | 이중가닥 ｍｉＲＮＡ를 유효성분으로 포함하는 항암제 | |
| EP2283846A1 (en) | miRNA compounds for treatment of prostate carcinoma | |
| US9075064B2 (en) | Method for decreasing radioresistance and growth, metastasis and infiltration of cancer cells through regulating expression or activity of TM4SF4 in non-small cell lung cancer | |
| CN108866058B (zh) | 靶向KRAS的siRNA及其在制备胰腺癌治疗药物中的应用 | |
| EP4025696A1 (en) | Chimeric complex and therapeutic uses thereof | |
| WO2014066498A1 (en) | Treatment of metastatic breast cancer | |
| KR20100095206A (ko) | 세포사멸 관련 유전자의 전사체에 결합하는 ｓｉＲＮＡ 및 이를 이용한 암 치료용 조성물 | |
| KR100694804B1 (ko) | 작은 헤어핀 ｒｎａ 분자를 포함하는 자궁 내막암 치료또는 예방용 조성물 및 그를 이용한 자궁 내막암 치료 또는예방 방법 | |
| WO2011074652A1 (ja) | HIF-2αの発現を抑制する核酸 | |
| KR102707587B1 (ko) | miR-4487를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성 증진용 조성물 | |
| KR101862247B1 (ko) | serpinb5에 대한 약물반응성을 가지는 마이크로 RNA를 함유하는 암치료용 의약조성물 및 이의 적용 | |
| KR101206374B1 (ko) | 이중가닥 마이크로 ｒｎａ를 유효성분으로 포함하는 항암제 | |
| JP2010529852A (ja) | 癌治療のためのＮｕＭＡのＲＮＡｉ媒介ノックダウン | |
| KR101993894B1 (ko) | 마이크로 rna를 포함하는 이중나선 올리고 rna 구조체 | |
| KR101861738B1 (ko) | 마이크로 rna를 포함하는 이중나선 올리고 rna 구조체 | |
| KR101852771B1 (ko) | 신규한 ｍｉＲＮＡ ｈｃ－ｓｍＲ－Ｓ２－３ 및 이의 용도 | |
| KR100635453B1 (ko) | 텔로머라제 억제 ｓｉＲＮＡ 발현 벡터 및 이를 이용한유전자 치료제 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20080123 |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| A201 | Request for examination | ||
| PA0201 | Request for examination |
Patent event code: PA02012R01D Patent event date: 20120221 Comment text: Request for Examination of Application Patent event code: PA02011R01I Patent event date: 20080123 Comment text: Patent Application |
|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20130904 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20131029 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20131029 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160912 Year of fee payment: 4 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20160912 Start annual number: 4 End annual number: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170907 Year of fee payment: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20170907 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190909 Year of fee payment: 7 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20190909 Start annual number: 7 End annual number: 7 |
|
| PC1903 | Unpaid annual fee |
Termination category: Default of registration fee Termination date: 20230809 |