KR20090058497A - 프리온 단백질에 대한 신규의 항체 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전체적으로 자연 조건 하에서 질환 관련 형태의 프리온 단백질(PrPSc)에 선택적으로 결합하는 신규의 항체 및 프리온 질환 검출, 치료 방법 및 질환 연구에서 그것의 용도에 관한 것이다.

Description

프리온 단백질에 대한 신규의 항체 및 그 용도{NOVEL ANTIBODIES AGAINST PRION PROTEIN AND USES THEREOF}
본 발명은 전체적으로 자연 조건 하에서 질환 관련 형태의 프리온 단백질(PrPSc)에 선택적으로 결합하는 신규의 항체 및 프리온 질환 검출, 치료 방법 및 질환 연구에서 그것의 용도에 관한 것이다.
프리온 질환 또는 전염성 해면체성 뇌병증(TSE)은 신경 세포 손실, 해면체 변화, 신경아교증 및 비정상 단백질 응집체의 침착을 특징으로 하는 급속하게 진행하고 치명적인 신경변성 질병의 그룹이다. 동물의 프리온 질환은 양의 스크라피(scrapie), 소와 외래 유제류 동물(exotic ungulate)의 소 해면체성 뇌병증(BSE) 및 사슴과 엘크의 만성 체력소모 질환, 및 국산 및 외래 고양이의 전염성 밍크 뇌병증 및 고양이과 해면체성 뇌병증을 포함한다[Prusiner S. B. 등 (1998) Cell 93:337-348]. 인간에게서, 알려진 프리온 질환은 구루병, 산발성 크로이츠펠트-야콥 질환(sCJD), 가족성 크로이츠펠트-야콥 질환(fCJD), 게르스트만 슈투로이슬러 샤인커 증후군(GSS), 치명적 가족성 불면증 및 변종 CJD(vCJD)을 포함한다 [Prusiner S. B. 등 (1998) Cell 93:337-348]. CJD는 오염된 시체 뇌하수체 호르 몬, 경질막 이식, 신경외과 도구 및 각막 이식에 의해 인간들 간에서 감염되어왔다[Brown P. 등 (2000) Neurology 55: 1075-1081]. 보다 최근에는 수혈에 의한 vCJD 전염의 증거가 보고되었으며[Llewelyn CA. 등 (2004) Lancet 363: 417-421; Peden A. H. 등 (2004) Lancet 364: 527-529; Health Protection Agency (2006) CDR weekly 16 (6)], 이는 이식 및 수혈 서비스 모두에 대한 큰 우려를 불러일으켰다. 조직 및 혈액에서 vCJD 감염성을 검출할 수 있는 매우 민감하고 특이적인 분석을 개발하기 위한 필요성이 매우 커졌다. 그러한 분석은 세포 및 조직 손상 전에 감염된 숙주에서 조기의 치료적 개입을 가능하게 하는 질환의 진단용으로 중요할 뿐 아니라, 수혈, 혈액 제품, 수술, 치과 의술 및 조직/세포 식피술(grafting)/이식(transplantation)에도 중요하다.
프리온 질환은 정상의 α-나선형이 풍부한 구조에서 비정상의 β-시트형이 풍부한 구조(PrPSc)로의, 대부분의 조직에서 발견되는 정상의 세포 프리온 단백질(PrPC)의 입체형태적 변이를 특징으로 한다. PrPC와는 달리, PrPSc는 쉽게 응집하고, 비이온성 세정제에 불용성이며, 프로테이나아제 K 내성 코어(PrPres)의 형성에 기인하여 제한된 프로테이나아제 K 분해에 부분적으로 내성을 가진다[Prusiner S. B 등 (1998) Cell 93: 337-348]. PrPSc의 존재는 프리온 질환의 특징으로 여겨지고, 감염성과 밀접하게 관련되며, 현재까지 알려진 유일한 직접적이고 명백한 질환-관련 마커이다[Morel N. 등 (2004) J. Biol. Chem. 279: 30413-30149]. 따라서 PrPSc의 검출은 인간 및 동물 적용에 대해 현재 개발된 대다수의 진단 테스트 및 스크리닝 분석의 기본이 된다. 테스트 샘플이 자연 조건 하에서 두 형태를 구분할 수 있는 PrPc 및 PrPSc 시약을 함유하는 것은 분석법 개발에 유용한 도구가 될 것이다. 많은 그러한 시약이 plasminogen [Fischer M. 등 (2000) Nature 408: 479-483], RNA aptamers [Rhie A. 등 (2003) J. Biol. Chem. 278: 39697-39705; Sayer N.M. 등 (2004) J. Biol. Chem. 278: 13102-13109]], anti-DNA antibodies and a DNA binding protein [Zou W. Q. 등 (2004) PNAS 101 : 1380- 1385] 및 motif-grafted antibodies containing the replicative interface of PrPC[Moroncini G. 등 (2004) PNAS 101 : 10404-10409]를 포함하는 문헌에 기재되어 있다. 그러나, 분석법 개발에서 가장 유용한 시약은 PrPSc에 특이적으로 결합하는 항체일 것이다.
현재 이용가능한 많은 항-PrP 항체는 자연 조건 하에서 PrPc 및 PrPSc 모두와 교차 반응(예를 들어, mAb 6H4 [Korth C. 등 (1997) Nature 390: 74-77])하거나, 또는 자연 조건 하에서는 PrPc 에만 결합하지만, 가열에 의해, 또는 강력한 세정제, 무질서 유발제에서 변성에 이어 PrPc 및 PrPSc 모두와 결합(예를 들어 mAb 3F4 [Kascsak R. J. 등 (1987) J. Virol 61 : 3688- 3693])한다. 또한, 이러한 항체 결합 특성은 소위 입체형태 의존성 면역분석(CDI)의 개발에 사용되어 왔다 [Safar.J. 등 (1998) Nat. Med. 4:1157-1165]. 그러나, PrPc 및 PrPSc 를 명확하게 구분하기 위해서는 테스트 샘플을 프로테이나아제 K로 전처리하여, PrPc 를 완전히 분해하고, 샘플 중에 존재하는 임의의 PrPres의 검출을 가능하게 하는 것이 필요하다. 근래 PrPSc 의 프로테이나아제 K 민감성 형태가 또한 존재하고[Safar J. 등 (2005) PNAS 102: 3501-3506], 이들 형태가 질환 전염에 밀접하게 관련된다[Yakovleva O. 등 (2004) 수혈44: 1700-1705]는 증거들이 계속해서 나오고 있다. 따라서 프로테이나아제 K 분해를 필요로 하지 않고 PrPC 및 모든 형태의 PrPSc를 구별할 수 있는 항체가 요구된다.
항체는 독특한 아미노산 결정기 또는 에피토프를 통해 단백질을 특이적으로 인식한다. 이들 에피토프는 선형 아미노산 서열 또는 삼차원 공간에 있는 아미노산에 의해 형성된 별개의 입체형태로 될 수 있다. PrPC 의 PrPSc로의 전환이 단백질 입체형태의 큰 변화와 관련있다는 것을 고려하면, 전환시에 독특한 에피토프들이 형성되거나 또는 나타나게 될 것이다. 정제된 PrPSc로의 면역화에 의해 천연의 PrPC 에 대해 특이적인 항체를 제조하기 위한 시도는 일반적으로 실패해왔고, 이들 항체들은(예를 들어 3F4 [Kascsak R. J. 등 (1987) J. Virol. 61 : 3688-3693]) 자연 조건 하에서 PrPSc에 대해 친화성이 거의 없거나 전혀 없었다. 그러나, 몇몇 보고된 PrPSc 특이적 항체가 최근 알려졌으며, 전체 길이 재조합 소 PrP에 대해 생성 된 mAb 15B3[Korth C. 등 (1997) Nature 390: 74-77], 인간 PrP의 아미노산 잔기 214-226에 상응하는 합성 펩티드에 대해 생성된 mAb V5B2[Serbec V. C. 등 (2004) J. Biol. Chem. 279: 3694-3698] 및 PrP에서 발견된 티로신-티로신-아르기닌 모티프를 포함하는 합성 펩티드에 대해 생성된 항체[Paramithiotis E. 등 (2003) Nat. Med. 9: 893-899]가 있다. 그러나, 이들이 생성되는 연구소 외부에서 이들 항체의 용도는 제한되며, 추가의 PrPSc 특이적 항체의 생성은 가치있는 것이다.
아미노산 잔기 106-126(인간 PrP 서열에 따른 넘버링, Swiss-Prot 1차 수납 번호 P04156)에 이르는 영역은 PrPC 및 PrPSe 사이의 입체형태적 변화가 개시되는 핵심 영역 중 하나일 것이라는 증거들이 계속해서 나오고 있다. 천연의 PrPSe 코팅된 마이크로비드로 면역화된 마우스들은 PrP 아미노산 잔기 101-120 사이의 영역을 타겟팅하는 우세한 IgM 면역 반응을 보이는 것으로 나타났고, 이것은 이 영역이 천연의 PrPSc의 주요 면역원성 영역임을 나타내는 것이다[Tayebi M. 등 (2004) Mol. Med. 10: 104-1 11]. 또한, 아미노산 잔기 109-112 사이에 위치된 에피토프에 결합하는 항체 3F4[Kascsak R. J. 등 (1987) J. Virol 61 : 3688-3693]는, 천연의 PrPC에는 결합할 수 있지만, 천연의 PrPSc에는 결합하지 않으며, 이는 전환시에 이 영역에서 주요한 입체형태적 변화가 있음을 나타내는 것이다. 연구들은 아미노산 잔기 106-126(PrP106-126)을 포함하는 합성 펩티드가 PrPSc와 관련된 특성의 일부를 보이는 것을 나타내고 있다. 예를 들어, PrP106-126은 pH-의존성 랜덤 코일되어 β-시트로 변형되고, 응집하여 프로테이나아제 K로 소화되는데 부분적으로 내성을 가지는 아밀로이드 피브릴을 형성하고[Selvaggini F. 등 (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun.194: 1380-1386, DeGioia L. 등 (1994) J. Biol. Chem. 269: 7859-7862], PrP106-126 마이크로 응집체에 대한 인간 신경 세포주의 노출은 PrPSc와 몇몇 특성을 공유하는 아밀로이드성 형태로, 내재성 PrPC의 응집을 촉매하고[Singh N. 등 (2002) Front. Biosci. 7: 60-71; Gu. Y. 등 (2002) J. Biol. Chem. 277:2275-2286], 프리온 독성과 유사한 특성을 가진 세포독성을 가져온다. 이론에 국한되려는 것은 아니지만, 본 발명자들은 응집된 PrP106-126으로 동물의 면역화 후에 생성된 일부 항체들이, 응집시 형성된 독특한 입체형태 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고, 이들 에피토프가 PrPSc에 또한 존재할 수 있다는 것을 주장한다. 이러한 이론은 알츠하이머 질환 펩티드 Aβ(l-40)의 아밀로이드 피브릴 상태에는 결합하지만, 가용성 모노머의(monomeric) 펩티드에는 결합하지 않는 입체형태-특이적 모노클로날 항체(mAb)의 생성을 기술하는 논문의 공개에 의해 부분적으로 지지된다 [O'Nuallin B. 등 (2002) PNAS 99: 1485-1490].
본 발명은 동물을 면역화하기 위하여, 아미노산 잔기 106-126으로부터의 인간 프리온 단백질 아미노산 서열에 상응하는 합성 펩티드 서열을 포함하는 응집체의 용도에 일부 기반하며, 샘플의 사전 프로테이나아제 K 처리에 대한 필요성 없이 자연 조건 하에서 PrPSc를 특이적으로 검출할 수 있지만, PrPC는 검출하지 않는 특정의 항체의 생산을 가져온다.
따라서, 제1 측면에서는 그에 대해 특이적인 항체 및 특히 PrPSc에는 결합 가능하지만, PrPC에는 결합하지 않는 항체를 키우기 위하여, 인간 PrP의 잔기 106-126 사이에서 발견되는 아미노산 보존 서열 또는 다른 종으로부터의 상응하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 구성된 응집된 펩티드의 용도가 제공된다. 추가의 측면에서, 본 발명은 응집된 PrP106-126 및 비정상 질환 관련 PrPSc에는 선택적으로 결합가능하지만, 모노머의(monomeric) PrP106-126 및 정상 숙주 PrPC에는 결합하지 않는 항체를 제공한다.
본 발명에 따른 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있고, IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 이소형 또는 그들의 단편으로 될 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 인간화될 수도 있고(Thompson, K.M. 등 (1986) Immunology 58, 157 - 160) 및/또는 단일 도메인 항체 형태로 될 수도 있다(Ward, E.S. 등 (1989) Nature 341, 544 - 546).
본 발명에 따른 항체는 사전의 프로테이나아제 K 분해에 대한 필요성 없이 PrPC의 존재 중에서 vCJD 및 산발성 CJD (sCJD)의 타입 1 및 타입 2 PrPSc에 선택적으로 결합 가능하여, PrPSc 및 PrPC를 구별한다. 질환의 전염에서 PrPSc의 프로테이나아제 K 민감성 형태의 존재 및 이들 형태의 연관 가능성에 대한 증거들이 계속해서 나오고 있기 때문에, 사전 프로테이나아제 K 분해에 대한 필요성 없이 PrPSc 및 PrPC를 구별가능한 시약이 크게 요구된다.
통상적으로 본 발명에 따른 항체는 모노머의 펩티드에서는 발견되지 않는 PrP 펩티드 단편의 응집시에 형성된 입체형태적 에피토프에 대해 생성된다. 바람직하게는 상기 펩티드는 인간 PrP의 잔기 106-126(Swiss-Prot 1차 수납 번호 P04156) 사이에서 발견되는 아미노산 보존 서열 또는 다른 종으로부터의 상응하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 구성된다. 예를 들어, 상기 상응하는 서열은, 마우스에서 아미노산 잔기 105-126(Swiss-Prot 1차 수납 번호 P04925) 사이에 있고, 양에서 잔기 109-129(Swiss-Prot 1차 수납 번호 P23907) 및 소에서 잔기 117-137 (Swiss-Prot 1차 수납 번호 P 10279)에 있다. 당업자들은 다른 종으로부터 상응하는 서열을 쉽게 동정할 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드는 표준의 펩티드 합성 기술에 의해, 예를 들어, 표준의 9-플루오레닐-메톡시카르보닐(F-Moc) 화학, 표준의 부틸옥시카르보네이트(T-Boc) 화학 또는 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)/tert-부틸 시스템을 사용하여 합성될 수 있다[Atherton E. and Sheppard R. C. (1998) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Oxford, IRL Press). 보통 85%를 넘을 것인 순도는 주의깊게 체크해야하며, 다양한 크로마토그래피 기법, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피, 및 분광 분석, 예컨대 라만 분광법(Raman spectroscopy)이, 예를 들어 이러한 목적으로 채택될 수 있다. 펩티드는 적절한 버퍼, 예를 들어 PBS pH7.0에 재현탁될 수 있으며, 실온에서 16시간동안 인큐베이션되어 적절한 동물의 면역화 전에 응집체를 형성할 수 있다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 모노클로날 항체를 생성할 수 있는 하이브리도마 세포주를 제조하였다. 인간 PrP의 아미노산 서열 106-126(PrP106-126)에 상응하는 합성 펩티드를 응집시켰다. 이러한 응집된 펩티드를 사용하여 마우스를 면역화하였다. 상기 면역화된 마우스로부터의 비장 세포를 공지의 기법에 따라 선택된 적절한 마우스 골수종 파트너 및 하이브리도마 세포주에 융합하였다[Hawlow E. and 레인 D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Lab. Press, Plainview, NY]. ELISA에 의해 응집된 PrP106-126 및 모노머의 PrP106-126에 결합시키기 위해서 이들 하이브리도마 세포주로부터의 상청액 샘플을 스크린하였다. 응집된 PrP106-126와는 결합하지만 모노머의 PrP106-126에는 결합하지 않는 항체를 분비하는 그러한 하이브리도마 세포주를 이어서 단일 세포 클로닝하고, 상기 세포주의 냉동 스톡(frozen stock)을 만들었다.
따라서, 본 발명의 제3 측면에서는, 본 발명에 따른 모노클로날 항체(IgM 이소형)를 분비할 수 있는 하이브리도마 세포주(Pl:1)가 제공된다. 이 하이브리도마 세포주는 부타페스트 조약에 따라 2006년 6월 6일자로 ECACC에 기탁되었으며, 수납 번호 06060601 하에서 입수가능하다.
본 발명에 따른 항체는, 특히 사전 프로테이나아제 K 분해에 대한 필요성 없이 PrPC의 존재 중 조직(예를 들어, 뇌, 편도 또는 비장 조직 생검 추출물) 및 체액(예를 들어 혈액, CSF)에 있는 질환-관련 PrPSc의 존재를 검출하는 방법에 유용하다. 따라서, 샘플 중 PrPSc를 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 하기 단계:
a) 조직 또는 체액의 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 샘플을 본 발명에 따른 항체와 접촉시켜서, 상기 항체를 상기 샘플 중에 존재하는 임의의 PrPSc와 결합할 수 있도록 하는 단계; 및
c) 항체-PrPSc 면역-복합체의 검출에 의해 PrPSc가 상기 샘플에 존재하는지 여부를 검출하는 단계:
를 포함한다.
항체-PrPSc 면역-복합체의 검출에 관해서, 당업자들은 당해 기술분야에 공지된 다양한 면역분석 기법, 특히, ELISA, DELFIA, RIA, 면역침전에 이어서 웨스턴 블롯 및 흐름 세포측정을 인식할 것이다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 직접적으로 또는 간접적으로 관찰될 수 있는 임의의 방사성, 형광, 발색성(예를 들어 알칼리 포스파타아제 또는 당근 과산화효소), 화학발광 또는 합텐(예를 들어 비오틴)을 포함하는 어떠한 적절한 표지라도 이러한 면역분석에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 면역분석에서의 사용을 위해 직접적으로 표지될 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 항체 및 PrPSc에 의해 형성된 복합체는 적절하게 표지된 항-마우스 면역글로불린 또는 적절히 표지된 항-PrP 항체를 사용하여 간접적으로 검출될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제4 측면은 동물에서, 특히 본 발명의 항체를 적어도 부분적으로 포함하는 인간 조직 및 체액에서 질환 관련 PrPSc의 검출을 위한 방법 또는 키트를 제공한다.
상이한 종에서 펩티드 서열의 상대적 보존을 가정하면, 본 발명의 항체가 다른 종으로부터의 PrPSc와 교차반응할 것이라는 것이 예측된다. 이러한 이론을 테스트하기 위하여, 본 발명자들은 본 발명으로부터의 항체가 면역블롯에 의해 응집된 재조합 마우스 PrP에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 모노머의 재조합 마우스 PrP에는 결합할 수 없다는 것을 보일 수 있었다.
따라서, 본 발명의 제5 측면은 본 발명에 따른 항체를 사용하여 다른 종으로부터 PrPSc를 검출하는 방법을 제공하며, 적어도 본 발명의 항체를 포함하는 모든 방법/키트를 포함한다.
본 발명의 제6 측면은 잠정의 프리온 질환 치료제의 효능을 측정하기 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다. 본 발명의 항체는 특히 잠재적인 치료제가 세포 배양 및 동물 모델 양자에서 감염을 치료하거나, 그 발생을 예방할 수 있는지 여부를 측정하기 위해 PrPSc의 검출을 위한 분석에서 사용될 수 있다.
다수의 문헌들은 최근들어 생체 내[White A. R. 등 (2003) Nature 422: 80-83; Sigurdsson E. M. 등 (2003) Neuroscience Letters 336: 185-187] 및 시험관 내[Feraudet C. 등 (2005) J. Biol. Chem. 280: 1 1247-11258] 모두에서 어떠한 항-PrP 항체가 프리온 복제를 억제할 수 있고, 프리온 질환의 전개를 지연시킬 수 있다는 것을 보고하고 있다. 따라서 본 발명의 제7 측면에서는 인간 및/또는 다른 종에서 프리온 질환을 치료 또는 예방하는 약제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 임의의 형태의 항체의 용도를 제공한다.
상세한 설명
본 발명을 이제 도면을 참조하여 실시예에 의해 상세히 설명할 것이다. 이들 실시예들은 본 발명의 특정 구체예를 도시하기 위한 것으로, 본 발명을 이들로 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
도 1은 PrP106-126 응집체의 생성 및 PrP 무(null) 마우스의 면역화를 도시한다.
a) 실온에서 0시간, 1시간 인큐베이션 후 및 16시간 인큐베이션 후에 취한 샘플에 대한 600nm에서의 증가하는 혼탁도에 의해 모니터링된 PrP106-126 응집체의 형성의 시간 과정.
b) 예비-면역(pre-immune) 혈청 샘플(흰색 막대) 및 테스트 출혈 혈청 샘플(회색 막대)에 대하여 ELISA에 의해 응집된 PrP106-126 코팅된 마이크로웰에 결합하는 혈청 항체에 의해 측정된 응집된 PrP106-126로 면역화된 각 마우스의 면역 반응. 예비-면역 혈청 샘플 대비 테스트-출혈 혈청 샘플에 대해서 얻어진 흡광도 값의 증가는 양성 면역 반응을 나타낸다.
도 2는 응집된 PrP106-126에 특이적으로 결합하는 mAb들의 동정(identification)을 나타낸다.
a) mAb Pl:1, Pl:2 및 Pl:3을 PrP106-126 펩티드의 부재 중(흰색 막대), 모노머의(monomeric) PrP106-126-NH2의 존재 중(회색 막대), 응집된 PrP106-126의 존재 중(검은색 막대) 예비 인큐베이션하고, 이어서 ELISA에 의해 응집된 PrP106-126 코팅된 마이크로웰에 결합하는 항체에 대해 스크린하였다. 모든 세가지 mAb에 대한 결과를 표준화하기 위하여 얻어진 결과를 % 최대 흡광도로 표현하였다. 모노머의 및 응집된 PrP106-126 양자로 예비-인큐베이션 후 Pl:2 및 Pl:3의 결합은 억제되었다. 반면 mAb Pl:1의 결합은 응집된 PrP106-126로 예비-인큐베이션 후에만 억제되었다.
b) ELISA는 응집된 PrP106-126에 결합하기 위한 정제된 mAb Pl:1의 특이성을 나타낸다. mAb Pl:1을 PrP106-126 펩티드의 부재 중에서, 100배 몰 과량의 모노머의 PrP106-126-NH2에서, 100배 몰 과량의 응집된 PrP106-126에서 예비-인큐베이션하고, 이어서 응집된 PrP106-126 코팅된 마이크로웰에 대한 결합을 위해 스크린하였다. 결합의 억제는 100배 몰 과량의 응집된 PrP106-126로 예비 인큐베이션 후에만 검출되었다.
도 3은 인간 뇌 클로닝하고네이트(homogenate)로부터의 PrP C , PrP Sc 및 PrP res 의 면역침전을 나타낸다.
a) 알츠하이머 질환의 신경학적 대조군 뇌(레인 2) 및 vCJD 뇌(레인 3 및 4) 로부터의 1% 뇌 호모제네이트를 1Oμg mAb Pl:1으로 면역침전시켰다. 레인 4에 대하여, 면역침전에 앞서 vCJD 뇌 호모제네이트를 프로테이나아제 K(PK)로 처리하였다. 분자량 마커(레인 1)와 함께 SDS-PAGE 및 PVDF 막 상으로 전기이동(electrotransfer) 후, mAb 3F4로 상기 막을 탐침검사하여 PrPC, PrPSc 및 PrPres를 검출하였다.
b) 레비소체 치매(Lewy body dementia)(레인 2), 알츠하이머 질환(레인 3), 아밀로이드 혈관병증(레인 4), vCJD (레인 5 및 6), sCJD MMl (레인 7 및 8) 및 sCJD VV2A(레인 9 및 10) 뇌로부터 얻은 1% 호모제네이트를 mAb Pl:1로 면역침전하였다. 레인 6, 8 및 10 뇌 호모제네이트를 면역침전에 앞서 PK로 소화시켰다. 분자량 마커(레인 1)와 함께 SDS-PAGE 및 PVDF 막 상으로 전기이동 후, mAb 3F4로 상기 막을 탐침검사하여 PrPC, PrPSc 및 PrPres를 검출하였다.
도 4는 recMoPrP 응집체의 제조와, 모노머의 및 응집된 recMoPrP에 대한 mAb Pl:1의 결합의 비교를 나타낸다.
a) PBS (대조군) 또는 PBS + 0.2% SDS(SDS-처리된)에서 α-나선형 recMoPrP를 제조하고, 실온에서 10분간 인큐베이션하였다. 이어서 양 샘플을 PBS 중에서 20배 희석하고, 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 각 샘플의 부분표본(aliquot)을 14,000xg에서 30분간 스핀다운시키고, 상청액을 수집하였다. 각각의 샘플 원심분리 전(흰색 막대) 및 상청액 원심분리 후(회색 막대)에서 BCA 단백질 분석에 의해 단백질 함량을 측정하였고, 이때 평균 흡광도 570nm 표시도수로서 표현된 결과가 얻어졌다. 원심분리 전 표시도수 대비 SDS-처리된 샘플 원심분리 후에 대해 얻어진 흡광도 570nm 표시도수에서의 감소는 불용성 recMoPrP 응집체가 형성되었다는 증거이다.
b) 전술한 바와 같이, 응집된(슬롯 A) 및 모노머의(슬롯 B) 재조합 마우스 PrP의 부분표본을 니트로셀룰로오스 막 상으로 슬롯 블롯팅하고, mAb Pl:1 (블롯 1) 또는 음성 대조군으로서 비-PrP 관련 마우스 IgM(블롯 2)으로 탐침검사하였다. mAb Pl:1는 응집된 recMoPrP에 특이적으로 결합하였다.
실시예 1. PrP106-126 아밀로이드 피브릴의 제조
인간 PrP106-126 (KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG) 및 PrP106-126-NH2(KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG-NH2)에 상응하는 합성 펩티드를 Sigma Genosys로부터 입수하였다. 응집된 PrP106-126을 제조하기 위해, PrP106-126(2mg)을 1ml 20OmM 포스페이트 버퍼에 가하고(pH 7.0), 실온에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 시간 0, 1시간 및 16시간에 부분표본(125μl)을 채취하고, 포스페이트 버퍼에서 1ml 최종 부피로 희석하고, 포스페이트 버퍼 블랭크에 대해 600nm에서 혼탁도를 측정하여 응집체 형성을 모니터링하였다. 전술한 바와 같이 응집된 PrP106-126을 형성하고, 600nm에서 혼탁도의 변화를 측정하여 응집체 형성을 모니터링하여(도 1(a)), PrP 무 마우스(PrP null mouse)를 면역화하는데 사용하였다.
실시예 2. 마우스의 면역화
세마리의 PrP 무(PrP-/-) 마우스(Neuropathogenesis Unit, IAH, Edinburgh에 의해 제공)[Manson J. C. 등 (1994) MoI. Neurobiol. 8: 121-127]를 프로인트 완전 항원보강제(Complete Freunds adjuvant)에서 50μg의 응집된 PrP106-126으로 피하로 각각 면역화하고, 이어서 28일 간격으로 프로인트 불완전 항원보강제에서 50μg 의 응집된 PrP106-126으로 두 번의 추가의 효능촉진(booster) 피하 면역화를 행했다. 최종 면역화 후 7일 째 테스트 출혈을 행하고, 결과로 얻어지는 혈청 샘플을 전술한 바와 같이 ELISA에 의해 응집된 PrP106-126 코팅된 마이크로웰에 결합하는 항체에 대하여 스크린하였다.
96-웰 Immulon 4 HXB 마이크로타이터 플레이트[Thermo Labsystems] 의 웰을 1OmM 포스페이트, 2.7mM KCl, 137mM NaCl, pH 7.4(PBS)에서 밤새 37℃에서 lOOng 응집된 PrP106-126으로 코팅하였다. 상기 웰을 0.05% (v/v) Tween 20 (PBST)을 함유하는 포스페이트 버퍼의 염수로 3번 세척하고, 블롯 건조하고, 37℃에서 60분 동안 PBST (200μl/웰)에서 5% 우태아혈청(FCS)으로 블록하고, 상기 웰을 PBST로 2번 세척하고, 블롯 건조하였다. PBST + 1% FCS에서 1/1000 희석으로, 세 테스트 마우스로부터의 테스트 혈청 및 예비-면역(pre-immune) 혈청의 부분표본(lOOμl/웰)을 3개조(triplicate)의 웰에 가하고, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하고, 상기 웰을 PBST로 4회 세척하고, 블롯 건조하였다. 염소 항-마우스 다가 Ig HRP 컨주게이트(Sigma)를, PBST + 1% FCS (lOOμl/웰)에서 1/2000 희석으로 모든 웰에 가하고, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하고, 상기 웰들을 PBST로 4회 세척하고, 블롯 건조하였다. SureBlue TMB 마이크로웰 페록시다아제 기질(Microwell Peroxidase Substrate)(Insight Biotechnology Ltd)[lOOμl/웰]을 모든 웰에 가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 30분이 되었을 때 0.18M 황산 정지액 [lOOμl/웰]을 가하고, 마이크로플레이트 판독기(Dynex MRX)를 사용하여 450nm에서의 흡광도를 측정하였다. PrP106-126 피브릴 코팅된 웰에 대해 항-마우스 다가 Ig HRP의 비-특이적 결합에 대한 평균 흡광도에 대해 보정된 각각의 테스트 샘플에 대해서 450nm에서 평균 흡광도로서 결과를 계산했다.
모든 세개의 면역화된 마우스들은 응집된 PrP106-126 코팅된 마이크로웰에 대한 항체 결합에 대하여 각각의 마우스로부터의 예비-면역 및 최종 테스트 출혈 혈청 샘플의 ELISA 스크리닝에 의해 측정된 바와 같이 응집된 PrP106-126에 대해 면역 반응을 개시했다(도 1(b)).
실시예 3. 모노클로날 항체의 제조
하이브리도마 제조를 위해 선택된 마우스는 PBS 중 50μg 응집된 PrP106-126의 최종적인 정맥내 추가 접종을 받았고, 4일 후 도살하였다. 면역화된 마우스로부터의 비장 세포를 종래의 폴리에틸렌글리콜(PEG) 1500 융합 프로토콜을 사용하여SP2/0-Agl4 마우스 골수종 세포(ECACC No. 85072401)와 융합하고, 결과로 얻어지는 하이브리도마를 HAT 배지에서 선택했다[Hawlow E. and Lane D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Lab. Press, Plainview, NY]. 하이브 리도마 상청액을, PBST + 1% FCS 중 1/2 희석으로 상청액 샘플을 스크리닝한 것을 제외하고는, 면역 반응을 측정하기 위해서 전술한 바와 같이 필수적으로 ELISA에 의해 응집된 PrP106-126에 대해 결합하는 mAb의 분비에 대해 통상적으로 스크린하였다. 응집된 PrP106-126에 대해 결합하는 mAb를 분비하는 하이브리도마는 3번 단일 세포 클론되었고, 각각의 세포주의 냉동 스톡을 마련하였다. Isostrip 마우스 모노클로날 항체 이소형 키트(Roche Diagnostics)를 사용하여 키트에 제공된 사용설명서에 따라서 생성된 mAb의 이소형들을 결정하였다.
시드된 360 웰 중에서, SP2/0 마우스 골수종 세포에 마우스 No.3으로부터의 비장 세포의 융합 후, 4개의 웰이 응집된 PrP106-126 코팅된 마이크로웰에 결합하는 항체를 분비하는 활성적으로 분리하는 하이브리도마를 포함하는 것으로 확인되었다(결과는 도시되지 않음). 이들 4개의 웰로부터의 세포를 단일 세포 클로닝하고, 각각 P1:1 , Pl:2, Pl:3 및 Pl:4로 명명하였다. 클로닝 도중 세포주 Pl:4는 매우 천천히 성장하고, 일단 상기 세포주의 냉동 스톡이 만들어지면 이 세포주로 추가의 작업은 수행되지 않는다는 것을 주목한다.
하이브리도마 Pl:2 및 Pl:3은 모두 IgGl, 카파 이소형 항체를 분비하는 것으로 나타났다. 하이브리도마 Pl:1은 IgM, 카파 이소형 항체를 분비하였지만, 이것은 이 세포주로 매우 약한 IgGl 신호 또한 검출되었고, 단일 세포 클로닝의 추가의 라운드 후에도 제거될 수 없었는데, 현재 본 발명자들은 이것이 로체 이소형 스트립(Roche isotyping strip)과 비-특이적 상호작용에 의해 유발되는 것으로 추측하고 있다.
실시예 4. 응집된 PrP106-126에 특이적으로 결합하는 mAb의 동정
각 하이브리도마 상청액의 부분표본을 PBST +1% FCS, PBST + 1% FCS 중 응집된 PrP106-126 (lOμg/ml 최종 농도) 또는 PBST + 1% FCS 모노머의(monomeric) PrP106-126-NH2(lOμg/ml 최종 농도)와 1 : 1로 혼합하고, 60분간 실온에서 롤러 믹서에서 인큐베이션하고, 14,000xg에서 10분간 스핀다운시켰다. COOH-말단 아미드화(amidation)는 응집체를 형성하는 PrP106-126의 경향을 감소시키는 것으로 보고되었으며[Salmona M. 등 (1999) Biochem. J. 342:207-214; Bergstrom A.L. 등 (2005) J. Biol. Chem. 280: 23114-23121]], 그러므로 특히 사용 바로 전에 새롭게 제조될 때 펩티드 PrP106-126-NH2가 응집체를 형성하지 않을 것으로 간주되었다. 각각의 상청액의 부분표본(lOOμl)은 응집된 PrP106-126 코팅된 마이크로타이터 플레이트의 3개조의 웰로 옮기고, 전술한 바와 같이 ELISA를 수행하였다. 모노머의 PrP106-126-NH2와는 예비인큐베이션하지 않고 응집된 PrP106-126와 예비인큐베이션 후 항체 결합의 상당한 증가를 보이는 하이브리도마를 추가의 분석을 위해 취하였다.
얻어진 결과로부터(도 2(a)), 응집된 PrP106-126 및 PrP106-126-NH2 모노머의 펩티드 모두와의 예비인큐베이션이 응집된 PrP106-126 코팅된 마이크로웰에 대한 mAb Pl:2 및 Pl:3의 결합을 억제했다는 것이 명백하다. 이는 mAb Pl:2 및 Pl:3이 응집된 및 모노머의 PrP106-126 모두에 존재하는 에피토프에 결합한다는 것을 제시한다. 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)에 컨주게이트된 펩티드와 마우스의 면역화 후에 PrP106-126에 대해 이전에 제조된 mAb에 비해 이들 두 mAb가 유사한 특성을 가지는 것으로 나타났다[Hanan E. 등 (2001) Cell MoI. Neurobiol. 21 : 693-703].
응집된 PrP106-126 코팅된 마이크로웰에 대한 mAb Pl:1의 결합은 응집된 PrP106-126와의 예비인큐베이션 후에만 억제되고, 모노머의 펩티드와의 예비인큐베이션 후에는 억제되지 않는다(도 2(a)). 따라서 mAb Pl:1은 응집된 PrP106-126에 대해 특이적인 입체형태적 에피토프에 결합하는 것으로 나타났다. mAb Pl:1 (IgM, 카파)의 이소형이 알츠하이머 펩티드 Aβ(l-40) 피브릴에 특이적으로 결합하는 것으로 이전에 보고된 두 mAb와 동일하다는 것을 주목하는 것은 흥미롭다[O'Nuallain B. 등 (2002) PNAS 99:1485-1490].
이들 결과에 기초하여, 일단 각각의 세포주의 냉동 스톡이 만들어지면 하이브리도마 Pl:2 및 Pl:3에서 모든 작업을 중지하고, 하이브리도마 Pl:1에 집중하는 것으로 결정했다. lμg/ml mAb Pl:1의 농도에서, 응집된 PrP106-126에 대한 정제된 mAb Pl:1의 특이적 결합을 ELISA에 의해 확인했다(도 2(b)). 일부 우려는 상대적으로 낮은 흡광도 값이 얻어지는 것이며, 억제제의 부재 중 최대 흡광도 표시도수가 0.205이다. 이러한 낮은 표시도수는, mAb Pl:1이 단지 그 타겟에 대해 낮은 친화도를 가진다는 사실에 기인할 수 있으며, 이는 IgM 이소형 항체에 대해 드문 일이 아니다. 그러나, 이용가능한 특이적 에피토프가 적다는 점 또는 입체구조적 장애를 경시해서는 안되고, 추가의 연구가 요구된다.
실시예 5. IgM 이소형 모노클로날 항체의 정제
50% 포화 황산암모늄으로 침전시키고 이어서 Superose 6 컬럼(Amersham Biosciences)에서 PBS 버퍼로 크기 배제 크로마토그래피에 의해 폐기 하이브리도마 배양 상청액(200ml)으로부터 IgM 이소형 mAb를 정제하였다. 정제된 IgM 농축액을 이어서 다음과 같이 ELISA에 의해 측정하였다.
pH 9.6 4℃에서 밤새, 5OmM 탄산염/중탄산염 코팅 버퍼 중 lOOng/웰 항-마우스(μ-사슬 특이적) IgM (Sigma)으로 96-웰 Immulon 4 HXB 마이크로타이터 플레이트의 웰을 코팅하였다. 상기 웰을 PBST로 3회 세척하고, 블롯 건조하고, 37℃에서 60분 동안 200μl/웰 PBST + 5% FCS로 블록하고, PBST로 2회 세척하고, 블롯 건조하였다. 마우스 IgM 표준(Sigma)의 2배 시리얼 희석액을 200ng/ml 내지 1.56ng/ml의 범위에서 만들고, 상기 테스트 샘플의 두 배 시리얼 희석액을 1/1000에서 16,000 희석으로 만들고, 이 때 모든 희석액은 PBST + 1% FCS에서 만들었다. 각각의 표준 및 테스트 샘플의 부분표본(lOOμl)을 3개조로 항-마우스 IgM 코팅된 마이크로타이터 플레이트의 웰로 옮기고, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하고, 상기 웰을 PBST로 4회 세척하고, 블롯 건조하였다. PBST + 1% FCS 중 1/2000 희석에서 염소 항-마우스(μ-사슬 특이적) IgM HRP 컨주게이트(lOOμl/웰)를 모든 웰에 가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 상기 웰을 PBST로 4회 세척하고, 블롯 건조하였다. TMB 기질(lOOμl/웰)을 모든 웰에 가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 10분이 되었을 때 산 정지액 [lOOμl/웰]을 가하고, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 표준 및 테스트 샘플의 평균 흡광도를 계산하고 각각의 표준에 대한 평균 흡광도를 상승하는 IgM 농도에 대해 플롯하여 테스트 샘플에서 IgM 농도가 결정되는 표준 커브를 만들었다.
전술한 바와 같이 mAb Pl:1를 정제하여 200ml 폐기 하이브리도마 배지로부터 1.36mg IgM를 회수했다. 정제된 IgM의 최종 농도는 PBS로 lmg/ml로 조정하고, 말토오스 10% (w/v) 및 아지드화 나트륨 0.001%(w/v)를 가하고, 정제된 IgM을 -40℃에서 1OOμl 부분표본에 저장하였다.
실시예 6. 인간 뇌 호모제네이트로부터 PrP C , PrP Sc 및 PrP res 의 면역 침전
알츠하이머 질환의 신경학적 대조군 뇌 및 vCJD 뇌로부터의 뇌 호모제네이트(10%)를 0.5% NP-50, 0.5% 디옥시콜산 나트륨, Tris 버퍼 염수(TBS), pH7.4에서 만들었다. 호모제네이트를 200 rpm 에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하였다. 프로테이나아제 K 분해 (PK)에 대하여, 50μg/ml의 최종 농도에서 정화된 호모제네이트에 PK를 가하고, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하고, Pefabloc(1mM 최종 농도)의 첨가에 의해 소화를 중지하였다. 알츠하이머 질환의 신경학적 뇌 호모제네이트(PK 비처리) 및 vCJD 뇌 호모제네이트(PK 비처리 및 PK 처리 모두)로부터의 10% 뇌 호모제네이트의 부분표본(lOμl)을 1OmM 포스페이트, 2.7mM KCl, 137mM NaCl, pH 7.4(PBS)의 lOOμl 최종 부피에서 lOμg mAb Pl:1과 혼합하고, 40℃에서 밤새 로터리 믹서에서 인큐베이션하였다. 랫트 항-IgM 컨주게이트된 Dynabead(lOμl)[Dynal]를 각각의 샘플에 가하고, 실온에서 60분 동안 로터리 믹서에서 혼합하였다. 이어서 상기 비드를 PBS 중 3회 세척하고, 25μl 1 X NuPAGE LDS 샘플 버퍼(Invitrogen)에 재현탁하고, 10분간 가열했다.
면역침전물을 NuPAGE Novex 10% Bis-Tris 겔(Invitrogen)에 로드하고, 200V 정전압에서 45분 동안 전기영동하고, 30V 정전압에서 60분 동안 PVDF 막 상으로 전기 이동하였다. 상기 막을 4℃에서 밤새 1OmM Tris-HCl, 15OmM NaCl, 0.05% (v/v) Tween 20, pH 7.5 (TBST) 중 5% 건조 분유에서 블록하였다. TBST에서 2회 세척 후(세척당 3분), 상기 막을 실온에서 60분 동안 TBST에서 1/1000 희석으로, mAb 3F4 (Dako)에서 인큐베이션하고, 이어서 TBST에서 3회 세척하였다(세척당 3분). 상기 막을 이어서 실온에서 60분 동안, TBST에서 1/40,000 희석으로, 염소 항-마우스 IgG (Fab-특이적) 페록시다아제 컨주게이트(Sigma)에서 인큐베이션하였다. TBST에서 3회 세척(세척당 3분) 후, 상기 막을 실온에서 5분 동안 ECL Plus 시약 (Amersham Biosciences)에서 인큐베이션하고, 상기 막을 배출하고, 두 장의 투명 필름 사이에 두고, Hyperfilm ECL (Amersham Biosciences)에 30초, 3분 및 10분 노출시켰다. 이어서 하이퍼프로세서(Hyperprocessor)를 사용하여 하이퍼필름(Hyperfilm)을 현상하였다. 다른 PK 비처리 신경학적 대조군(아밀로이드 혈관병증 및 루이 소체 치매), sCJD MMl (PK 비처리 및 PK 처리 모두) 및 sCJD VV2(PK 비처리 및 PK 처리 모두) 뇌 호모제네이트를 사용하여 모든 후속의 면역침전 실험은 전술한 바와 같이 수행하였다.
최초 실험(도 3(a))은 mAb Pl:1이 PK 비처리 vCJD 뇌 호모제네이트(도 3(a), 레인 3)로부터의 PrPSc 및 PK 처리 vCJD 호모제네이트(도 3(a), 레인 4)로부터의 소량의 PrPres를 면역침전했다는 것을 나타냈다. 어떠한 PrPC도 알츠하이머 질환 뇌 호모제네이트로부터 면역침전되지 않았다(도 3(a), 레인 2). 이들 데이터에 기초하여, mAb Pl:1이 vCJD 뇌로부터 전체 길이 PrPSc를 선택적으로 면역침전하지만, PK 분해 후 PrPres를 면역침전하지 않는 것으로 나타났다. 이러한 관찰은 PrPSc에 특이적으로 결합하는 것으로 보고된, 전체 길이 재조합 소 PrP에 대해 생성된 mAb인, mAb 15B3 [Korth C. 등 (1997) Nature 390:74-77]에 대해 행해진 것과 유사했다. mAb 15B3은 PK 분해된 PrPres에 비해 무손상 PrPSc를 더욱 효과적으로 면역침전하는 것으로 나타났고, 이것은 PK 분해가 15B3 에피토프를 마스크할 수 있는 큰 응집체(스크라피-관련 피브릴)의 형성을 가져온다는 사실에 기인하는 것이라는 것이 제안되었다. 비록 이러한 설명은 mAb Pl:1에 대해서도 맞을 수 있지만, 다른 가능한 설명이 고려될 필요가 있다. 한 가능성은 면역침전에 앞서 PK 분해가 PrPSc에 비해 PrPres의 입체형태를 변경할 수 있고, 그에 따라 mAb Pl:1에 의해 인식되는 입체형태적 에피토프를 파괴한다는 것이다. 또다른 더욱 흥미를 자아내는 가능성은 mAb Pl:1이 vCJD 뇌 호모제네이트에 존재하는 PrPSc의 PK 민감성 형태를 특이적으로 면역침전할 수 있다는 것이다.
이러한 가능성들을 더 조사하기 위하여, 본 발명자들은 vCJD 뇌 호모제네이 트로부터 뿐만 아니라 sCJD MMl 및 sCJD VV2 뇌 호모제네이트로부터 PrPSc 및 PrPres의 면역침전을 시도했다. 또한 PrPSc에 대한 mAb Pl:1의 특이성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 알츠하이머 질환 뇌 호모제네이트와 함께, 두 개의 추가적인 신경학적 대조군 뇌 호모제네이트(아밀로이드 혈관병증 및 레비소체 치매)를 포함했다. 얻어진 결과(도 3(b))는 mAb Pl:1이 어떠한 신경학적 대조군 뇌 호모제네이트(도 3(b), 레인 2, 3 및 4)로부터도 PrPC를 면역침전할 수 없음을 입증했다. mAb Pl:1은 PK 분해가 없을 때 vCJD 뇌(도 3(b), 레인 5), sCJD MMl 뇌(도 3(b), 레인 7) 및 sCJD VV2 뇌 (도 3(b), 레인 9) 호모제네이트로부터 전체길이 PrPSc를 면역침전했다. PK 분해에 이어, mAb Pl:1은 vCJD 뇌(도 3(b), 레인 6) 및 sCJD VV2 뇌 호모제네이트(도 3(b), 레인 10)으로부터 소량의 PrPres 만을 면역침전했지만, 상당히 많은 PrPres가 sCJD MMl 뇌 호모제네이트(도 3(b), 레인 8)로부터 면역침전되었다. 따라서 mAb Pl:1가 타입 1 및 타입 2 전체 길이 PrPSc 모두 및 타입 1 PrPres에는 우선적으로 결합하고, 타입 2 PrPres에는 매우 약하게 결합하는 것으로 나타날 것이다. 이러한 관찰은 PrPSc 및 PrPres에 대한 mAb Pl:1의 결합이 PrP NH2-말단 영역(아미노산 23-97)에 의해 영향을 받는 것을 제시하는 것으로 나타났다. 타입 1 및 타입 2 PrPSc 간의 큰 차이점 중 하나는 1차 PK 절단 부위의 위치이며, 타 입 1 PrPSc에 대해서는 잔기 82에, 타입 2 PrPSc에 대해서는 잔기 97에 위치된다[Parchi P. 등 (2000) PNAS 97: 10168-10172]. 따라서, PK 분해 후, 타입 1 PrPres는 타입 2 PK PrPres보다 약간 더 긴 NH2-말단을 가질 것이다. mAb Pl:1로 얻어진 결과에 기초하면, PK 분해가 전체 길이 PrPSc에 비해 결과물인 PrPres의 입체형태의 변화를 가져오고, 게다가 입체형태에서의 그러한 변화가 잔기 단백질 구조의 명백한 전환(reshuffling)에 기인한 것으로 이전에 보고되었고[Safar J. 등 (1993) J. Biol. Chem. 268: 20276-20284], 입체형태에서의 이러한 변화가 PK 절단의 1차 부위에 의해 영향을 받는 것으로 나타났다.
실시예 7. 재조합 PrP 피브릴에 결합하는 항체
0.2% SDS에 용해된 재조합 PrP에 대하여, 재조합 PrP가 0.01% 미만까지 SDS 함량의 감소 및 실온에서 연장된 인큐베이션 시에 프로테이나아제 K 내성을 나타내는 큰 멀티머(multimer)를 형성하는 입체형태적 변화를 겪는 것으로 보고되었다[Post K. 등 (1998) Biol. Chem. 379: 1307-1317]. 따라서 본 발명자들은 전술한 방법[Trieschmann L. 등 (2005) BMC Biotechnol. 5: 26-30]을 응용하여 모노머의 α-나선형 recMoPrP로부터 재조합 마우스 PrP (recMoPrP) 응집체를 만들었다. α-나선형 재조합 마우스 PrP (Dr Andy Gill, IAH, Compton으로부터 입수)를 PBS 및 PBS + 0.2% (w/v) SDS 양자에서 준비하여 lOOμg/ml의 최종 recMoPrP 농도를 얻 고 실온에서 10분간 인큐베이션하였다. SDS와 함께 또는 없이 양 샘플을 PBS 중에서 20배 희석하고, 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. recMoPrP 응집체의 형성을 다음과 같이 측정하였다 : 각 샘플의 부분표본(1ml)을 14,000xg에서 30분간 스핀다운하고, 결과로 얻어지는 상청액을 수집하였다. 이어서 Pierce BCA 단백질 분석 키트에 제공된 시약을 사용하여 샘플 원심분리 전 및 상청액 원심분리 후의 단백질 분포를 측정하였다. 요약하면, 25μl의 각각의 원심분리 전 샘플 및 원심분리 후 상청액 샘플을 200μl BCA 시약에 가하고, 37℃에서 30분간 인큐베이션하고, 570nm에서 흡광도를 구했다. SDS 처리 후 용액으로부터는 recMoPrP가 스핀다운될 수 있지만, PBS 단독에서 인큐베이션 후 용액으로부터는 스핀다운될 수 없다는 사실(도 4(a))로 불용성 recMoPrP 응집체가 SDS 처리 후에 형성되었다는 것을 확인했다.
모노머의 α-나선형 recMoPrP 또는 recMoPrP 응집체의 부분표본(500ng)을 매니폴드 진공 여과 유닛을 사용하여 Hybond-ECL 니트로셀룰로오스 막(Amersham Biosciences) 상으로 슬롯 블롯했다. 상기 막을 1OmM Tris-HCl, 15OmM NaCl, 0.05% (v/v) Tween 20(TBST)로 2회 세척 후, 실온에서 60분 동안 5%(w/v) 탈지 건조 분유를 포함하는 TBST에서 블록하였다. 이어서 상기 막을 실온에서 60분 동안 TBST에서 5μg/ml의 농도로, 1차 항원, mAb Pl:1 또는 비-PrP 관련 마우스 IgM (Sigma)에서 인큐베이션하고, 이어서 TBST에서 3회 세척하였다(세척당 5분). TBST에서 1/1000 희석으로, 토끼 항-마우스 Ig HRP 컨주게이트(DAKO)를 상기 막에 가하고, 상기 막을 실온에서 60분 동안 인큐베이션하고, 이어서 TBST로 3회 세척하고(세척당 5분), 최종적으로 1-Step TMB Blotting 기질(Pierce)에서 전개하고, 실온 에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 얻어진 결과로부터(도 4(b)) mAb Pl:1가 응집된 recMoPrP에 특이적으로 결합하고, 모노머의 recMoPrP에 대해서는 거의 또는 전혀 결합이 검출되지 않음이 명백했다. 비-PrP 관련 IgM은 응집된 또는 모노머의 recMoPrP에 결합하지 않았다. 이러한 관찰은 mAb Pl:1가 다른 종으로부터의 PrPSc에 또한 특이적으로 결합할 수 있고, 그에 따라, 일반적으로 TSE 진단 및 TSE 연구 모두에서 mAb Pl:1의 잠재적인 유용성을 확장할 수 있다는 것을 의미한다.

Claims (18)

  1. 인간 PrP의 잔기 106-126 사이에서 발견되는 아미노산 보존 서열 또는 다른 종으로부터의 상응하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 구성된 응집된 펩티드의 용도로서, 상기 응집된 펩티드에 특이적인 항체 및 특히, PrPSc에는 결합 가능하지만 PrPC에는 결합할 수 없는 항체를 생성하기 위한 응집된 펩티드의 용도.
  2. 응집된 PrP106-126 및 비정상 질환 관련 PrPSc와 선택적으로 결합가능하지만, 모노머의(monomeric) PrP106-126 및 정상 숙주 PrPC에는 결합할 수 없는 항체.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날 또는 모노클로날이고, IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 이소형(isotype) 또는 그들의 단편인 항체.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 타입 1 및 타입 2 PrPSc에 선택적으로 결합 가능한 항체.
  5. 청구항 2 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체를 제조할 수 있는 하이브리도마 세포주.
  6. 청구항 5에 기재된 하이브리도마 세포주의 제조 방법으로서, 하기 단계 :
    a) 인간 PrP의 아미노산 서열 106-126(PrP106-126)에 상응하는 합성 펩티드를 제공하고 이를 응집시키는 단계;
    b) 상기 응집된 펩티드로 마우스를 면역화하는 단계;
    c) 상기 면역화된 마우스로부터의 비장 세포를 적절한 마우스 골수종 파트너에 융합하는 단계; 및
    d) 응집된 PrP106-126와는 결합하지만 모노머의 PrP106-126에는 결합하지 않는 항체를 분비하는 것에 기초하여 적절한 하이브리도마 세포주를 선택하는 단계
    를 포함하는, 하이브리도마 세포주의 제조 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 단계 d)의 하이브리도마 세포주로부터 얻어진 항체를 인간화하는(humanizing) 단계를 추가로 포함하는, 하이브리도마 세포주의 제조 방법.
  8. 부타페스트 조약에 따라 2006년 6월 6일자로 ECACC에 기탁되고, 수납 번호 06060601 하에서 입수가능한 하이브리도마 세포주 Pl:1.
  9. 청구항 8에 기재된 하이브리도마 세포주로부터 얻을 수 있는 항체.
  10. 사전 프로테이나아제 K 분해에 대한 필요성 없이 PrPC의 존재 중 조직(예를 들어, 뇌, 편도 또는 비장 조직 생검 추출물) 및 체액(예를 들어 혈액, CSF)에 있는 질환-관련 PrPSc의 존재를 검출하는 방법에서, 청구항 2 내지 청구항 5, 또는 청구항 9 중 어느 한 항에 기재된 항체의 용도.
  11. 샘플 중 PrPSc를 검출하는 방법으로서, 하기 단계:
    a) 조직 추출물 또는 체액의 샘플을 제공하는 단계;
    b) 항체가 상기 샘플 중에 존재하는 임의의 PrPSc와 결합할 수 있도록, 상기 샘플을 청구항 2 내지 청구항 5, 또는 청구항 9 중 어느 한 항에 기재된 항체와 접촉시키는 단계; 및
    c) 항체-PrPSc 면역-복합체의 검출에 의해 PrPSc가 상기 샘플에 존재하는지 여부를 검출하는 단계:
    를 포함하는 PrPSc의 검출 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 항체가 직접적으로 표지된 것인, PrPSc의 검출 방법.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 항체가 적절히 표지된 항-마우스 면역글로불린 또는 적절히 표지된 항-PrP 항체를 사용하여 간접적으로 검출되는 것인, PrPSc의 검출 방법.
  14. 동물에서, 특히 청구항 2 내지 청구항 5, 또는 청구항 9 중 어느 한 항에 기재된 항체를 적어도 부분적으로 포함하는 인간 조직 및 체액에서 질환 관련 PrPSc를 검출하기 위한 방법 또는 키트.
  15. 청구항 2 내지 청구항 5, 또는 청구항 9 중 어느 한 항에 기재된 항체를 사용하여 다른 종으로부터 PrPSc를 검출하는 방법.
  16. 잠정의(putative) 프리온 질환 치료제의 효능을 측정하기 위한, 청구항 2 내지 청구항 5, 또는 청구항 9 중 어느 한 항에 기재된 항체의 용도.
  17. 인간 및/또는 다른 종에서 프리온 질환의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한, 청구항 2 내지 청구항 5, 또는 청구항 9 중 어느 한 항에 기재된 항체의 용도.
  18. 인간 및/또는 다른 종에서 프리온 질환을 치료 또는 예방하기 위한 청구항 2 내지 청구항 5, 또는 청구항 9 중 어느 한 항에 기재된 항체.
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