KR20090055964A - 골수유래 중간엽 줄기세포의 분리방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 골수유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 골수로부터 골수세포를 분리한 후 트립신/EDTA 용액을 처리하여 배양용기에 부착-배양하고, PE-결합된 Sca-1 항체 및 항-PE 마그네틱비드를 결합시켜 자석활성 칼럼을 이용하여 골수유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 중간엽 줄기세포의 분리에 이용될 수 있는 새로운 마커로서 Sca-1 단백질을 이용하는 경우 골수로부터 중간엽 줄기세포를 고순도로 분리할 수 있음을 확인하였다. 또한 이렇게 분리된 골수 유래 중간엽 줄기세포가 심근세포, 혈관내피세포, 지방세포, 골세포 등으로 분화됨을 확인함으로써 줄기세포를 이용한 치료 가능성을 높일 수 있을 것으로 기대된다.

골수, 골수세포, 중간엽 줄기세포, Sca-1, 자석활성 칼럼

Description

골수유래 중간엽 줄기세포의 분리방법 {Methods for isolating mesenchymal stem cells from bone marrow}

본 발명은 골수유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 골수로부터 골수세포를 분리한 후 트립신/EDTA 용액을 처리하여 배양용기에 부착-배양하고, PE-결합된 Sca-1 항체 및 항-PE 마그네틱비드를 결합시켜 자석활성 칼럼을 이용하여 골수유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법에 관한 것이다.

최근 성인의 골수 내에는 골격근세포, 심근세포, 간세포, 신경세포, 혈관세포와 같은 다양한 세포 계통으로 분화할 수 있는 성체 줄기세포가 존재한다는 연구 결과가 보고 되었다. 성체 줄기세포는 기내 및 생체 내에서 다양한 세포계통으로의 분화가 가능함을 나타내었고, 동물실험을 통해 심혈관 질환, 뇌신경계 질환, 골형성부전증, 당뇨병 등의 치료가 가능함을 보여주었다. 특히 골수 내에 존재하는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 자가 자생능력을 가지고 있고, 다양한 세포 계통으로 분화가 가능하고, 세포 용기에 부착하는 특성을 갖고 있기 때 문에 세포내로의 유전자 도입이 용이하여 유전자 치료 및 줄기세포 치료를 위하여 널리 이용되어져 오고 있다.

성인의 골수 성분 중 약 0.001 - 0.01% 만이 중간엽 줄기세포로 알려져 있기 때문에(Pittenger MF 등 1999, Science 284:143-147), 이러한 낮은 비율로 존재하는 중간엽 줄기세포를 효율적으로 분리하기 위하여 다양한 방법들이 시도되고 있다. 예를 들면, 퍼콜 용액(Percoll)을 사용하여 밀도구배 원심분리(density gradient centrifugation)에 의해 중간엽 줄기세포를 포함하고 있는 부분을 회수하는 방법(Majumdar MK 등 1998, J Cell Physiol 176:57-66; Majka SM 등 2003, J Clin Invest 111:71-79)을 이용하거나 조혈모세포와는 달리, 세포용기에 부착되어 증식하는 중간엽 줄기세포의 특성을 이용하여 분리하는 방법 등이 시도되어 왔다. 그러나 상기 기술한 방법을 이용하여 중간엽 줄기세포를 분리하였을 때 다양한 세포 특성을 가진 이질적인 세포들이 포함되어 있기 때문에 분리방법에 따라, 또는 연구자들에 따라 연구결과가 상이하고 편차가 심해 중간엽 줄기세포를 이용한 세포 치료 연구의 발전을 저해하고 있다. 때문에 세포 특성이 동일한 중간엽 줄기세포를 고순도로 분리할 수 있는 특정한 마커에 대한 필요성이 대두되고 있고, 이를 이용한 중간엽 줄기세포를 고순도로 분리할 수 있는 기술의 개발은 줄기세포 연구의 진전에 크게 기여할 것이다.

일반적으로 중간엽줄기세포는 CD29+, CD44+, CD90+이고, 조혈모세포 마커인 CD34-, CD45-는 발현하지 않는 것으로 보고 되고 있으나, 중간엽 줄기세포가 분리된 조직에 따라서 또는 종(species)에 따라 세포 표면 단백질의 발현에 대한 상이 성이 보고 되는 등 완전히 확립되지 않은 상황이다. 또한, 중간엽 줄기세포에 양성반응을 나타내는 CD29, CD44, CD90 등은 줄기세포에서만 발현되는 특이한 마커라기 보다는 일반 체세포에서도 광범위하게 발현되는 것으로 세포 접촉, 인지 등과 관련된 기능을 하는 분자이기 때문에 중간엽 줄기세포만을 순수하게 분리하기 위한 마커로는 적절치 않다.

최근 심혈관 질환, 뇌신경 질환, 골형성부전증, 당뇨병 등 동물 실험과 임상 연구를 통해 줄기세포를 이용한 치료 가능성에 대한 긍정적인 연구 결과에도 불구하고, 임상에 적용하기 위해서는 아직 만족할만한 수준에 이르지 못하고 있다. 최근에는 줄기세포의 기능을 증진시킬 수 있는 유전자를 세포내로 도입하여 세포 치료 효과를 극대화하려는 시도가 진행되고 있다. 예를 들면, 심혈관질환의 세포 치료 시 VEGF 유전자를 줄기세포내로 도입하였을 때 혈관신생성의 증진 및 심장 기능 개선 효과가 줄기세포만 이식한 군에 비해 높게 나타났다고 보고하고 있다(Matsumoto R 등 2005, Arterioscler Thromb Vasc Biol 25:1168-1173; Wang Y 등 2006, J Mol Cell Cardiol 40:736-745). 또한, 줄기세포의 세포 생존성을 높이기 위하여 Akt 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 이식에 의해 심근경색 모델에서 줄기세포만 이식한 그룹에 비해 세포 사멸의 억제, 심근 보호 기능의 증진 및 심장 기능이 증진됨이 알려져 있다(Mangi AA 등 2003, Nat Med 9:1195-1201; Gnecchi M 등 2006, FASEB J 20:661-669).

중간엽 줄기세포를 이용한 세포 치료법이 임상에 안정적으로 적용되기 위해서는 동일한 세포 특성을 갖는 중간엽 줄기세포의 고순도 분리방법의 확립, 체외 증식방법의 확립, 특정한 세포계통으로의 분화 조절 조건의 확립 및 생체내로 줄기세포 이식 후 세포치료 효과와 더불어 안전성 확보에 관한 연구 등이 이루어져야 할 것이다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 중간엽 줄기세포의 분리에 이용될 수 있는 새로운 마커로서 Sca-1 단백질을 이용하는 경우 골수로부터 중간엽 줄기세포를 고순도로 분리할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 새로운 마커로서 Sca-1 단백질을 이용하여 중간엽 줄기세포를 고순도로 분리할 수 있는 골수유래 중간엽 줄기세포의 분리방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 골수유래 중간엽 줄기세포의 분리방법을 제공한다:

a) 골수로부터 골수세포를 분리한 후, 배양용기에 부착-배양하는 단계;

c) 상기 부착-배양된 골수세포를 트립신/EDTA 용액을 처리하고, 트립신/EDTA 처리에 의해 분리된 세포들을 다른 배양용기에 부착-배양하는 단계;

d) 상기 부착-배양된 골수세포에 링커화합물(linker)-결합된 Sca-1 항체를 반응시키는 단계;

e) 상기 링커화합물-결합된 Sca-1 항체와 결합한 골수세포에 다시 항-링커화합물 마그네틱비드를 결합시키는 단계; 및

f) 상기 항-링커화합물 마그네틱비드와 결합한 골수세포를 자석활성 칼럼을 이용하여 분리하는 단계.

본 발명에서는 중간엽 줄기세포의 특징적 마커 부재로 인한 줄기세포 연구의 제한점을 해결하기 위하여 중간엽 줄기세포를 고순도로 분리할 수 있는 특정한 마 커를 발견하는데 초점을 두었다. 종래 보고 된 쥐, 동물 및 인간 유래 골수 중간엽 줄기세포는 CD29+, CD44+, CD90+이고, 조혈모세포 마커인 CD34-, CD45-는 발현하지 않는 것으로 보고 되고 있으나, 세포 표면 단백질의 발현에 대한 상이성이 보고 되는 등 완전히 확립되지 않고 있다. 비록 CD29, CD44, CD90과 같은 세포 표면 단백질이 중간엽 줄기세포에 양성을 나타내지만, 이들 마커들은 조혈모세포를 분리하는 데 있어서 많이 이용되고 있는 CD34, CD117, CD133과 같은 특징적인 마커들과는 달리 일반세포에서도 세포 접촉, 인지 등과 관련하여 발현되는 것으로 보고 되고 있다. 따라서 본 발명에서는 골수세포를 분리한 후 세포용기에 부착된 세포들의 세포 표면 특성을 파악한 후 골수 중간엽 줄기세포를 순도 높게 분리할 수 있는 특정한 세포 표면 마커를 찾고자 하였으며, Sca-1을 새로운 마커로서 사용하였다.

본 발명에 있어서, Sca-1(Ly-6A.2/Ly-6E.1, Ly6A/E; GenBank #NM_010738) 단백질은 Ly-6 다중유전자군에 속하며, 18 키로달톤의 크기의 포스포이노시톨기가 부착된 단백질로서 두 Ly-6 haplotype (Ly-6.1, Ly-6.2) 골수의 조혈모세포에서 발현되는 것으로 알려져 있다. Sca-1의 기능은 B 세포와 T 세포의 면역반응을 조절하는 것으로 알려져 있으며, T 세포 수용체를 매개로 한 T 세포 활성화시에도 작용하는 것으로 알려져 있다. Sca-1 (Ly6A/E)은 Ly6.2 haplotype 마우스 품종의 골수 세포, 말초혈액 B 임파구, 말초혈액 T 임파구에서 발현되는 것으로 보고 되어 있다. Ly6.1 haplotype 마우스 품종에서는 Sca-1(Ly6A/E)은 휴지기 말초혈액 임파구(resting peripheral lymphocytes)에서는 발현양이 많지 않은 것으로 알려져 있다. 그러나, 임파구가 활성화되면 두 haplotype (Ly6.1, Ly6.2) 모두에서 Sca-1의 발현이 크게 증진되는 것으로 알려져 있다.

또한, Ly-6 유전자좌는 2번 염색체에 존재하며 주로 T 임파구와 B 임파구에서 발현되어 항원 특이성 (antigenic specificities)를 결정하는 하는 것으로 알려져 있다. 다양한 품종의 마우스는 각 마우스의 세포에서 발현되는 이들 알로항원특이성(alloantigenic specificities), 즉 Ly-6 type에 따라 크게 Ly6.1 haplotype (BALB/c, CBA, C3H/He, DBA/1, NZB )과 Ly6.2 haplotype (AKR, C57BL, C57BR, C57L, C58, DBA/2, PL, SJL, SWR, 129)의 두 그룹으로 구분된다. Ly-6 유전자좌는 알로항원특이성에 따라 다시 Ly-6A, B, C, D, E로 구분되는데, 예를 들면, Ly-6A.2 알로항원특이성은 휴지기 비장세포, 림프 노드 세포, 활성화 된 모든 임파구에서 발견된다.

본 발명의 방법에서, 상기 a)단계에서 부착-배양은 세포용기에 부착된 세포만을 6-7일 동안 추가적으로 배양하여 세포밀도가 배양용기의 80-95%가 되도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서, 상기 세포밀도 범위는 여러 밀도로 실험을 하였을　때 목적세포로의 분화가 활발한 농도이며, 이들 범위 외에서는 분화가 안 되거나 사멸하는 경우가 발생한다. 세포를 배양접시에 부착하여 증식시킬 때 세포의 포화정도에 따라 세포 간 신호전달에 의하여 원하지 않는 방향으로 분화가 일어나거나 사멸할 수 있기 때문에, 본 발명에서와 같이 이러한 점들을 고려하여 적절한 세포 밀도를 유지하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서, 상기 c)단계에서 트립신/EDTA 처리에 의해 크고 납작한 형태의 골수세포만을 분리하는 것이 바람직하다. 상기 골수세포의 형태적 특징에 따른 골수세포의 분리는 본 발명자의 연구 진행과 차후 다른 연구자들의 보고를 검토하여 크고 납작하면서 섬유아세포 형태를 나타내는 세포가 중간엽 줄기세포라고 판단하게 되었고, 이러한 세포만을 분리하여 연구한 결과 다능성을 보유하였음을 확인하였다.

본 발명의 방법에서, 상기 c)단계에서 트립신/EDTA는 5-15분간 처리하는 것이 바람직하다. 상기 처리 시간을 초과하는 경우에는 두 가지 단점이 발견되었다. 첫 번째로는, 트립신/EDTA를 5-15분간 이상 처리하였을 때 중간엽 줄기세포가 아닌 다른 형태의 세포들도 세포 용기에서 떨어져서 혼입되는 비율이 높아졌다. 두 번째로는, 트립신/EDTA는 5-15분간 이상 처리하게 되면 중간엽 줄기세포의 세포 생존성이 저하되었다. 이는 중간엽 줄기세포뿐만 아니라 일반세포들도 트립신/EDTA 처리를 최소화하는 것이 세포 생존성을 높이는 방법으로 알려져 있다.

본 발명에서, 상기 트립신/EDTA 처리 후 형태적으로 분리한 골수세포를 계대배양하게 되는데, 여기서 말하는 계대배양은 트립신/EDTA 1회 처리 후 크고 납작한 중간엽 줄기세포만을 회수하여 새로운 세포 용기에 부착시키고, 다음 날 상기 용액을 2번 째 처리하여 크고 납작한 중간엽 세포만을 회수하여 새로운 세포 용기에 부착시키고, 마지막으로 상기 용액을 3번째 처리하여 크고 납작한 중간엽 세포만을 회수하여 새로운 세포 용기에 부착시키는 과정을 말한다. 즉 크고 납작한 세포의 순도, 비율을 높이기 위한 과정을 뜻하는 것이다.

본 발명의 방법에서, 바람직하게는 상기 d)단계의 링커화합물-결합된 Sca-1 항체 반응과 e)단계의 항-링커화합물 마그네틱비드의 반응은 0-10℃에서 10-20분간 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명에서, 바람직하게는 상기 d)단계의 링커화합물(linker)로서 PE(phycoerythrin) 또는 바이오틴(biotin)을 사용할 수 있다. 상기 링커화합물이란 Sca-1 항체에 결합되고 이 링커화합물에 친화성을 갖는 항-링커화합물 마그네틱 비드를 통해 세포를 분리할 수 있게 해주는 연결화합물을 의미한다.

상기 링커화합물의 또 다른 예로서, Miltenyi Biotech사의 Anti-Biotin MicroBeads, Streptavidin MicroBeads, Anti-Fluorochrome MicroBeads, Monoclonal 또는 Polyclonal Anti-Ig MicroBeads 등이 있다. 이러한 방법을 보통 항원-항체 반응을 이용한 세포 분리방법이라고 하는데, 항원-항체 결합의 기초를 형성하는 비공유 상호작용은 수소결합, 이온결합, 소수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 등을 포함한다. 항원항체 반응은 상기 여러 가지 비공유 상호작용들을 통하여 결합하는 것으로 알려져 있다. 이 중 Biotin 분자는 자연 상태에서 avidin 또는 streptavidin과 강한 비공유결합을 하는 것으로 알려져 있어 biotin-결합된 항체는 anti-biotin microbeads를 이용한 항원-항체 반응법 이외에도 streptavidin MicroBeads를 사용하여서도 또한 분리할 수 있다.

본 발명에 사용된 상기 링커화합물과 마이크로 비드는, Sca-1 항체에 링커화합물을 부착함으로써 Sca-1에 양성을 나타내는 세포를 본 발명에서와 같이 링커화합물 성분을 인지하는 항-링커화합물 마그네틱비드에 의해서도 분리가 가능하고, 유세포 분석기를 이용하여서도 링커화합물에 결합된 세포만을 선별, 분리할 수 있 는 중요한 연결고리의 역할을 한다. 마그네틱 비드는 자석칼럼을 이용하여 링커화합물-Sca-1 양성 세포만을 분리할 수 있게 한다.

본 발명에서, 상기 f)단계에서 자석활성 칼럼을 이용하여 분리하는 과정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 자석활성분리기(MACS separator)에 자석활성 칼럼을 장착한 후 MACS 완충용액(MACS buffer, PBS + 0.5 % BSA + 2 mM EDTA)으로 칼럼을 평형시킨 후 링커화합물-비드가 결합된 중간엽 줄기세포를 포함하고 있는 골수 세포를 자석활성 칼럼에 통과시킨다. 자석활성분리기의 자기장(margetic field)에 의해 링커화합물-비드가 결합된 중간엽 줄기세포만이 자석활성 칼럼 내에 남게 되고, 비드가 결합되지 않은 세포는 MACS 완충용액을 사용한 세정 과정을 통해 자석활성칼럼 밖으로 흘러나오게 된다. 세정 단계가 끝난 후 링커화합물-비드가 결합된 중간엽 줄기세포를 포함하고 있는 자석활성칼럼을 자석활성분리기로부터 탈착한 후 MACS 완충용액을 자석칼럼 내에 채운 후 주사기를 사용하여 링커화합물-비드가 결합된 중간엽 줄기세포만을 분리한다. 상기 f) 단계를 3-4번 정도 반복함으로써 약 90% 순도의 Sca-1+ 중간엽 줄기세포만을 분리할 수 있다.

본 발명에서, 골수로부터 골수세포를 분리한 후 약 7일 동안 기내 배양 후 세포용기에 부착된 세포들의 형태를 관찰하였을 때 크고 납작한 모양, 작은 스핀들 형태의 세포(spindle-shaped cells), 작은 구형의 세포 등 대략 3 종류의 세포가 존재함을 확인하였다(도 1a, Scale bars = 50 μm). 계대배양을 하기 위해 트립신/EDTA 용액을 처리하였을 때 크고 납작한 형태의 세포들은 세포 용기에서 10분 이내에 분리되는 반면, 상기 기술한 나머지 2 종류의 세포들은 세포 용기에 단단히 부착되어져 있음을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 트립신/EDTA 용액을 10분 동안 처리하는 조건으로 계대 배양을 3회 실시함으로써 세포 용기에 부착하는 세포 특성 차이를 토대로 하여 대부분 크고 납작한 형태의 세포들만을 분리하였다(도 1b, Scale bars = 50 μm). 계대배양 3회 단계에서 본 발명자들은 세포 용기에 부착된 크고 납작한 형태의 세포들의 표면 특성을 조사하기 위하여 다양한 세포 표면 마커들(CD14, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD71, CD90, CD106, CD117, CD133, Sca-1)을 사용하여 유세포분석과 면역형광염색법을 실시하였다. 유세포분석에 의하여 계대배양 3회 단계의 세포 용기에 부착되고 크고 납작한 형태를 띤 세포들은 CD44와 Sca-1 세포 표면 마커에 강양성을 나타내었고, CD29와 CD106 마커에는 약양성 반응을 나타내었다(도 1c). 반면 다른 마커들(CD14, CD31, CD34, CD45, CD71, CD90, CD117, CD133)에는 음성 반응을 나타냄을 확인하였다(도 1c).

또한, 면역형광염색법에서도 유세포 분석에서와 유사한 결과를 확인하였다(도 1d, Scale bars = 50 μm). 중간엽 줄기세포에 강한 양성을 나타내는 마커 중 히알루로난(hyaluronan, HA) 수용체로 알려져 있는 CD44의 경우에는 줄기세포에서의 특징적 발현보다는 세포인지, 응집, 이동과 관련하여 일반 세포에서도 폭넓게 발현되기 때문에 본 발명자들은 Sca-1 마커가 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있는 새로운 마커일 수 있음에 가능성을 두었다. Ly-6 계(Ly-6 family)에 속하는 Sca-1은 기존에 조혈모세포 표면 마커로서만 보고되었으나(van de Rijn M 등 1989, Proc Natl Acad Sci 86:4634-4638), 골수유래 중간엽 줄기세포에서의 특이적 마커로서는 보고된 바 없다. 이에 본 발명자들은 종래 논문 보고와 본 발명에서의 골수 유래 중간엽 줄기세포에서의 강한 Sca-1 발현을 토대로 Sca-1이 조혈모세포뿐 아니라 골수유래 중간엽 줄기세포에 특이적으로 발현되는 마커일 가능성에 착안하여 자석활성법(magnetic activated cell sorting, MACS)을 이용하여 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포만을 분리한 후 유세포분석법을 통해 90% 수준의 순도로 분리되었음을 확인하였다(도 1e).

본 발명에 있어서, Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포만을 분리한 후, Sca-1 양성세포가 중간엽 줄기세포로서의 역가를 가지고 있는가를 검증하기 위해 5-아자시티딘 처리에 의해 심근세포로, VEGF 처리에 의해 혈관내피세포로 분화를 유도한 후 면역형광염색법에 의해 심근세포 및 혈관내피세포 특이적 항체들에 양성 반응을 나타내는 세포들로 분화되었음을 증명하였다 (도 2a 및 2b, Scale bars = 50 μm). 또한, Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포가 지방세포 및 골세포로의 분화능을 갖는가를 확인하기 위해 특정한 분화 유도용액에서 지방세포로 분화 유도 후 오일 레드 O (Oil Red O) 염색법에 의해 지방세포로 분화된 세포들을 확인하였고(실시예 5 참조), 골세포로 분화 유도 후에 알리자린 레드 S(Alizarin Red S) 염색에 양성 반응을 나타내는 골세포로의 분화가 이루어졌음을 각각 확인하였다 (도 2c 및 2d, Scale bars = 50 μm).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법으로 분리된 골수유래 중간엽 줄기세포를 제공한다. 상기 중간엽 줄기세포는 목적으로 하는 세포로의 분화를 위해 특정의 분화유도 용액을 이용하여 다양한 세포로 분화될 수 있으며, 이렇게 분화된 세포는 세포대체요법용 세포 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다. 본 발명의 방법으로 분리된 중간엽 줄기세포를 목적 세포로 분화시켜 치료할 수 있는 질환은 특별히 한정되지 않으며, 일례로서 실시예 5에서와 같이 본 발명의 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화를 유도하여, 상기 분화된 골세포를 유효성분으로 하는 치료용 조성물이 제조될 수 있다. 또한 상기 치료용 조성물은 공지의 방법에 따라 환자의 환부 직접주입 되거나, 3차원 배양 후 스캐폴드와 함께 이식될 수도 있으며(Kim, G. et al, J. Vet. Med. Sci., 66:263, 2004, Lee, J.W. et al., Yonsei Med. J., 30:41, 2004), 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경료, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련인자를 고려하여 투여하는 세포 수를 조절하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Sca-1에 대한 항체를 포함하는 골수유래 중간엽 줄기세포 분리용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에서, 상기 Sca-1에 대한 항체는 다클론 항체 또는 모노클론 항체 일 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 미국 BD Pharmingen사의 D7 단일클론항체를 사용하였다. 상기 D7 단일클론항체는 다음과 같이 제조되었다. 동량의 complete Freund's adjuvant와 혼합한 60× 10⁶ CTL-L 세포를 레비스 래트(Lewis rat)에 주사하였으며, 약 2달 뒤에 2차 면역을 위해 RPMI 1640 배양액과 혼합한 60 × 10⁶ CTL-L 세포를 레비스 래트의 복강에 주사하였다. 항체가 항원 특이적인 것을 확인 한 후에 항원을 추가접종한지 4일 후에 쥐를 희생시킨 후 비장(spleen)을 적 출하여 B cell (1× 10⁸)을 얻어낸 후 골수종 세포(myeloma cell; SP2-0-Ag14 세포주; 1× 10⁸)과 폴리에틸렌글리콜 (PEG 4000, Sigma) 를 이용하여 융합시켰다. 융합된 세포는 HAT (hypoxanthine- aminopterinthymidine) 미디아에서 2 주 동안 배양하였다. 배양액을 HT 미디아로 바꾸고 2주 동안 재배양하였다. 배양된 상등액을 이용하여 Sca-1에 특이적인 항체를 선별하기 위하여 제한 희석법(limiting dilution method)에 의하여 클로닝하여 D7 단일클론을 얻었다. D7 단일클론항체는 Ouchterlony 분석에 의해 래트 IgG 항체임을 확인하였으며, 마우스 항-래트 K chain 단일클론을 이용한 면역결합칼럼(immunoaffinity column)을 사용하여 정제하였다. D7 단일클론항체의 Sca-1 단백질에 대한 특이적인 결합 반응을 조사한 결과 Ly-6 대립유전자군 중 Ly-6A.2과 Ly-6E.1을 발현하는 세포를 특이적으로 인지하였다. 즉 D7 단일클론항체는 Ly-6.1 haplotype에서 발현되는 Ly-6E.1과 Ly-6.2 haplotype 품종에서 발현되는 Ly-6A.2를 모두 인지하기 때문에 마우스 품종에 상관없이 Ly-6 haplotype (Ly-6.1, Ly-6.2)를 인식할 수 있는 nonpolymorphic Ly-6 특이성을 갖는 항체라고 할 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 상기 Sca-1에 대한 항체는 본 발명의 실시예에서와 같이, 항체가 결합된 세포를 분리해내기 위한 하나의 방법인 자석활성법(magnetic activated cell sorting, MACS)을 위하여 PE(phycoerythrin)가 결합된 것이 바람직하다. 또한 상기 조성물에는 Sca-1에 대한 항체 외에 일반적인 항체 시판 시 첨가되는 안정화제 또는 버퍼 등이 더 포함될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 골수세포의 분리

마우스 대퇴골로부터 주사기를 사용하여 관류함으로써 내부의 골수세포를 분리한 후 70 μm 세포 메쉬를 사용하여 조직파편 등을 제거하고 개개의 분리된 세포만을 회수하였다. 골수세포는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) + 10% 우태아혈청 + 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 배지를 사용하여 0.1% 젤라틴 코팅된 세포용기(10cm)에서 3일 동안 배양하였다. 배양 3일후에 세포 용기에 부착되지 않은 세포를 제거하기 위하여 배양액을 교환한 후 세포밀도가 배양 용기의 80% 이상 될 때 까지 6-7일간 더 배양하였다. 부착-배양된 골수유래 세포들의 형태학적 특징은 도 1a와 같다.

실시예 2. 유세포 분석기를 사용한 골수세포의 세포표면 특성 분석

세포의 생존성을 유지하면서 개개의 세포로 분리할 수 있는 최적 농도 조건으로 알려져 있는 0.25% 트립신/1 mM EDTA 용액(Gibco-BRL, Grand Island, NY)을 사용한 계대배양 3회 후에 세포용기에 부착된 골수세포들은 형태적으로 큰 섬유아세포를 나타내었다(도 1b). 세포 배양용기에 부착된 골수세포의 세포 표면 특성 분석을 0.25% trypsin/1 mM EDTA 용액을 사용하여 세포를 분리한 후 2% 파라포름알데히드 고정액으로 10분 처리, PBS + 2% 우태아혈청 용액으로 세정, CD14, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD71, CD90, CD106, CD117, CD133, Sca-1 항체(BD Biosciences)를 사용하여 30분 배양, PBS + 2% 우태아혈청 용액으로 세정, 2차 항체로서 FITC-연결된 염소 항-래트 항체(Sigma)와 30분 배양, PBS + 2% 우태아혈청 용액으로 세정 후에 유세포 분석기(FACScaliber, Becton Dickinson Immunocytometry Systems)를 사용하여 세포 표면 특성을 분석하였다(도 1c).

실시예 3. 면역형광염색법에 의한 골수 세포의 세포표면 특성 분석

0.25% trypsin/1 mM EDTA 용액을 사용한 계대배양 3회 후에 3× 10⁴ 골수세포들을 0.1% 젤라틴 코팅된 커버슬립 위에 파종한 후, 24시간 후에 다양한 세포 표면 항체들을 사용한 면역염색법을 실시하였다. 구체적으로 골수 세포들은 2% 파라포름알데히드 고정액으로 15분 처리, PBS + 0.1% Tween용액(PBST)으로 세정, 5% 염소 혈청으로 1시간 배양, CD14, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD71, CD90, CD106, CD117, CD133, Sca-1 항체를 사용하여 30분 배양, PBST 용액으로 세정, 2차 항체로서 Alexa-488 연결된 항-래트 IgG(Molecular Probes, USA)와 30분 배양, PBST용액으로 세정 후 마운팅 용액(DAKO)을 사용하여 형광현미경하에서 관찰하였 다(도 1d).

실시예 4. 자석 활성법에 의한 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포의 분리

세포 배양용기에 부착된 골수세포로부터 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포는 자석 활성법을 사용하여 분리하였다. 구체적으로 0.25% trypsin/1 mM EDTA 용액을 10분 동안 처리하여 3회의 계대배양을 실시하여 대부분 크고 납작한 형태(도 1b)를 나타낸 세포들을 회수한 후에 PE-결합된 Sca-1 항체(D7 단일클론항체, BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)와 15분 동안 4℃에서 반응, 세정액(PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA)으로 세정, 다시 항-PE 마그네틱비드(anti-PE microbeads, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany)와 15분 동안 4℃에서 반응, 세정액으로 세정 후 자석활성법 칼럼(Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany, MACS Separation Column, LS Columns Cat # 130-042-401)을 통과시켜 Sca-1+ 세포만을 분리하였다. 세포 분리 순도를 증진시키기 위하여 자석활성법 칼럼을 통과시키는 단계를 4회 반복하였다. 골수세포로부터 분리된 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포의 분리 순도는 유세포 분석을 실시하여 검증하였다(도 1e).

실시예 5. Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포의 다분화능 검증

자석활성법에 의해 분리된 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포가 다양한 세포계통으로 분화할 수 있는가를 검증하기 위하여 심근세포, 혈관내피세포, 지방세포 및 골세포 계통으로 각각 분화를 유도하였다.

구체적으로 심근세포로의 분화 유도를 위하여, 실시예 4에서 분리한 Sca-1 + 골수 중간엽 줄기세포(2× 10⁴ 세포/well)를 0.1% 젤라틴 코팅된 커버슬립이 놓인 24-well 세포용기에 파종하였다. 배양 24 시간 후에 DMEM + 10% 우태아혈청을 포함한 배양액으로 2회 세정 후에 1 μM 농도로 5-아자시티딘(5-AZACYTIDINE, Sigma, St. Louis, MO, USA, Cat # A-2385)을 처리한 후 14일 동안 배양하여 심근세포로의 분화를 유도하였다. 5-아자시티딘을 함유한 배양액은 3일마다 교환하였다. 분화 처리된 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포를 2% 파라포름알데히드 고정액으로 15분 처리, PBST용액으로 세정, 0.25% Triton X-100 용액으로 30분 처리, PBST용액으로 세정, 5% 염소 혈청으로 1시간 배양, 1차 항체인 미오신 중쇄 항체(MHC, Simga) 및 트로포닌-I 항체(Abcam)를 사용하여 1시간 배양, PBST용액으로 세정, 2차 항체인 Alexa 488 항체(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)와 1시간 배양, PBST용액으로 세정, 핵 염색을 위해 DAPI 용액과 1시간 배양, PBST용액으로 세정 후 형광현미경 하에서 관찰하였다(도 2).

혈관내피세포로의 분화를 유도하기 위하여 Sca-1+ 골수 중간엽줄기세포(2× 10⁴ 세포/well)를 0.1% 젤라틴 코팅된 커버슬립이 놓인 24-well 세포용기에 파종하였다. 배양 24 시간 후에 DMEM + 10% 우태아혈청을 포함한 배양액으로 세정 후에 20ng/ml VEGF 존재 하에 DMEM + 10% 우태아혈청 배지에서 14일 동안 분화를 유도하였다. 20ng/ml VEGF(vascular endothelial growth factor, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)를 함유한 배양액은 3일마다 교환하였다. 혈관내피세포로 분화 처 리된 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포를 2% 파라포름알데히드 고정액으로 15분 처리, PBST용액으로 세정, 0.25% Triton X-100 용액으로 30분 처리, PBST용액으로 세정, 5% 염소 혈청으로 1시간 배양, 1차 항체인 Flk-1 항체(Santa Cruz Biotechnology)와 Tie-2 항체(Upstate)를 사용하여 1시간 배양, PBST용액으로 세정, 2차 항체인 Alexa 594 항체(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)와 1시간 배양, PBST용액으로 세정, 핵 염색을 위해 DAPI 용액과 1시간 배양, PBST용액으로 세정 후 형광현미경 하에서 관찰하였다(도 2).

지방세포로의 분화를 유도하기 위하여 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포(4× 10⁴ 세포/well)를 24-well 세포용기에 파종 후 지방세포 분화용액(DMEM + 5% 우태아혈청 + 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토미신, 1 μM 덱싸메타손, 10 μg/ml 인슐린, 100 μM 인도메타신, 0.5 μM 메틸-이소부틸싼틴)에서 7일 동안 배양하였다. 지방세포로의 분화 검증을 위해 세포내 지방 축적을 확인하기 위한 오일 레드 O 염색법을 실시하였다. 구체적으로 지방세포로 분화 처리된 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포를 4% 파라포름알데히드 고정액으로 15분 처리, 60% 이소프로파놀로 세정, 0.3% 오일 레드 용액으로 10분 동안 염색, 증류수로 3회 세정 후에 100% 이소프로파놀로 탈염과정을 실시하였다.

골세포로의 분화를 유도하기 위하여 Sca-1+ 골수 중간엽줄기세포(2× 10⁴ 세포/well)를 24-well 세포용기에 파종 후 골세포 분화용액(DMEM + 1% 우태아혈청 + 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토미신, 0.1 μM 덱싸메타손, 50 μM 아스코 빅 산, 10 mM 베타-글리세로포스페이트)에서 3주 동안 배양하였다. 골세포로의 분화 검증을 위해 알리자린 레드 S 염색법을 실시하였다. 구체적으로 골세포로 분화 처리된 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포를 4% 파라포름알데히드 고정액으로 15분 처리, PBS 용액으로 세정, 2% 알리자린 레드 S 용액으로 10분 동안 염색, 증류수로 5회 세정을 실시하였다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포는 심근, 혈관내피, 지방 및 골세포로 분화할 수 있는 분화능을 나타내어 Sca-1 세포 표면 마커가 골수 중간엽 줄기세포를 분리하는데 효과적으로 이용될 수 있음을 입증하였다. 종래 심혈관 질환의 세포치료 연구를 위하여 골수 유래 중간엽 줄기세포가 널리 이용되어져 왔으나 균일한 세포 특성을 갖는 중간엽 줄기세포만을 순수하게 분리할 수 있는 특징적 마커의 부재로 연구의 발전에 제약을 받아 온 상황에서 균일한 골수 중간엽 줄기세포를 고순도로 분리할 수 있는 본 발명은 줄기세포 연구의 진전에 크게 기여할 것으로 사료된다. 또한, 골수뿐만 아니라 발생기 및 다른 성체 조직에서 중간엽 줄기세포를 분리하는 데 있어서 Sca-1 마커를 사용함으로써 높은 파급 효과를 가질 것으로 기대된다.

도 1a는 계대배양 전의 골수유래 세포들의 형태적 특성을 나타낸다.

도 1b는 계대배양 후에 골수 세포의 형태적 특성을 나타낸다.

도 1c는 유세포 분석에 의한 세포표면 특성을 나타낸다.

도 1d는 면역염색법에 의한 세포표면 특성을 나타낸다.

도 1e는 자석활성법에 의해 분리된 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포의 순도를 유세포 분석에 의해 측정한 그래프이다.

도 2a는 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포를 심근세포계통으로 분화유도 후 세포 특이적인 항체를 사용하여 분화가 유도되었음을 면역염색법으로 확인한 사진이다.

도 2b는 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포를 혈관내피세포계통으로 분화유도 후 세포 특이적인 항체를 사용하여 분화가 유도되었음을 면역염색법으로 확인한 사진이다.

도 2c와 2d는 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포를 각각 지방세포 및 골세포로의 분화를 확인한 사진이다.

<110> Korea University Industry and Academy Cooperation Foundation <120> Methods for isolating mesenchymal stem cells from bone marrow <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 134 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Asp Thr Ser His Thr Thr Lys Ser Cys Leu Leu Ile Leu Leu Val 1 5 10 15 Ala Leu Leu Cys Ala Glu Arg Ala Gln Gly Leu Glu Cys Tyr Gln Cys 20 25 30 Tyr Gly Val Pro Phe Glu Thr Ser Cys Pro Ser Ile Thr Cys Pro Tyr 35 40 45 Pro Asp Gly Val Cys Val Thr Gln Glu Ala Ala Val Ile Val Asp Ser 50 55 60 Gln Thr Arg Lys Val Lys Asn Asn Leu Cys Leu Pro Ile Cys Pro Pro 65 70 75 80 Asn Ile Glu Ser Met Glu Ile Leu Gly Thr Lys Val Asn Val Lys Thr 85 90 95 Ser Cys Cys Gln Glu Asp Leu Cys Asn Val Ala Val Pro Asn Gly Gly 100 105 110 Ser Thr Trp Thr Met Ala Gly Val Leu Leu Phe Ser Leu Ser Ser Val 115 120 125 Leu Leu Gln Thr Leu Leu 130

Claims (8)

1. 하기 단계들을 포함하는 골수유래 중간엽 줄기세포의 분리방법:

   a) 골수로부터 골수세포를 분리한 후, 배양용기에 부착-배양하는 단계;

   c) 상기 부착-배양된 골수세포를 트립신/EDTA 용액을 처리하고, 트립신/EDTA 처리에 의해 분리된 세포들을 다른 배양용기에 부착-배양하는 단계;

   d) 상기 부착-배양된 골수세포에 링커화합물(linker)-결합된 Sca-1 항체를 반응시키는 단계;

   e) 상기 링커화합물-결합된 Sca-1 항체와 결합한 골수세포에 다시 항-링커화합물 마그네틱비드를 결합시키는 단계; 및

   f) 상기 항-링커화합물 마그네틱비드와 결합한 골수세포를 자석활성 칼럼을 이용하여 분리하는 단계.
2. 제 1항에 있어서, 상기 a)단계에서 부착-배양은 세포용기에 부착된 세포만을 6-7일 동안 추가적으로 배양하여 세포밀도가 배양용기의 80-95%가 되도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 c)단계에서 트립신/EDTA 처리에 의해 크고 납작한 형태의 골수세포만을 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 c)단계에서 트립신/EDTA는 5-15분간 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 d)단계에서 링커화합물은 PE(phycoerythrin) 또는 바이오틴(biotin)인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 상기 d)단계의 링커화합물-결합된 Sca-1 항체 반응과 e)단계의 항-링커화합물 마그네틱비드의 반응은 0-10℃에서 10-20분간 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Sca-1에 대한 항체를 포함하는 골수유래 중간엽 줄기세포 분리용 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 상기 Sca-1에 대한 항체는 PE(phycoerythrin)가 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.

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