JP4922548B2 - 体性幹細胞の同定および単離ならびにその使用 - Google Patents

Description

本発明は特定細胞タイプ集団の同定に関し、特に造血幹細胞、間葉幹細胞およびケラチノサイト幹細胞を含む体性幹細胞における特定細胞タイプ集団の同定に関する。本発明は、また単離方法および該方法から派生する幹細胞の使用も提供する。

豊富化細胞集団を得るために特定の細胞タイプを同定することには極めて大きな利益がある。豊富化集団を入手できれば、特定細胞タイプをより明確に理解することができる、あるいは移植、遺伝子治療、白血病のような癌および乳癌を含む新生癌を含む疾患の治療、または組織および皮膚の修復術を含む様々な状況における使用にさえ提供でき得る。

幹細胞ならびにそのような細胞の単離および同定は数多くの利点を提供する。これらの細胞は、制限なく分裂し、分裂して幹細胞または非可逆的に分化して新規のタイプの細胞を産生する細胞のどちらかを産生できる非最終分化細胞であると定義されている。単一タイプの細胞を発生させる幹細胞は単能性細胞と呼ばれる；多数の細胞タイプを発生させる幹細胞は多能性細胞と呼ばれる。

幹細胞は、定義上はすべての自己再生組織中に存在する。これらの細胞は長寿命であると考えられており、細胞分裂に対して優れた能力を有し、最終的には定常状態組織のホメオスタシスを担うものである。幹細胞には以下のような数多くの特性がある：幹細胞は、超微細構造的および生化学的には余り分化されていない；幹細胞は大きな増殖能力を有し、長期間にわたる組織の維持および再生を担っている；幹細胞は、恐らくはその増殖能力を保存し、複製中に発生し得るＤＮＡエラーを最小限に抑えるために、通常は「ゆっくりと分裂する」；幹細胞は創傷および一定の成長刺激に反応して増殖するように刺激することができる；幹細胞はしばしば（１）幹細胞から（２）ＴＡ細胞そして（３）最終的には分化細胞へのスキームにおいて一過性増幅細胞（「ＴＡ」）に相当する急速に増幅する細胞集団の極めて近傍に位置する；そして幹細胞は、通常はしっかり保護され高度に血管分布および神経分布した領域内で見いだされる。

幹細胞の明確な同定は、体性幹細胞特異的な免疫学的または生化学的マーカーが知られていないので、これまで困難であった。幹細胞は通常「ゆっくりと分裂する」ので、同定方法が限定される。

幹細胞は、遺伝子治療の重要な標的であり、挿入された遺伝子は幹細胞が移植された個体の健康を促進する。更に、幹細胞を単離できれば、幹細胞を骨髄または末梢血内の腫瘍細胞から精製し、骨髄抑制的または骨髄破壊的化学療法後に患者に再注入する、リンパ腫および白血病、ならびに他の新生腫瘍状態の治療において役立つ。そこで、実質的に純粋な形で幹細胞を単離することに向けて世界的に努力が重ねられてきた。

幹細胞は、多能性細胞の総数のほんのわずかなパーセンテージしか占めていない。多能性細胞は、様々な細胞表面マーカーの存在によって同定できる。そのようなマーカーは、特定の系統または前駆細胞に特異的であるか、または２つ以上の細胞タイプ上に存在することがある。現時点では、分化細胞に関連するどのくらいの数のマーカーが幹細胞上にも存在するのかは分かっていない。

幹細胞である骨髄または末梢血中の細胞総数の比率が小さいこと、より分化した細胞と区別する幹細胞に関連するマーカーの不確定さ、および幹細胞を生物学的にアッセイする際の総合的な難しさのために、幹細胞の同定および精製はなかなか達成できなかった。

体性幹細胞は、最終的には植物または動物の様々な部分に寄与する細胞を産性する。一般に、体細胞は造血幹細胞、間葉幹細胞またはケラチノサイト幹細胞に分裂できる。

哺乳類造血細胞は、極めて広範囲の活動を担っている。それらはリンパ系、骨髄系および赤血球系を含む数種の系統に分裂する。Ｂ細胞およびＴ細胞を含むリンパ系統は、抗体を産生し、細胞免疫を調節し、血液中の病原微生物のような外来物質を検出する。単球、顆粒球、および巨核球を含む骨髄系統は、血液を異物について監視し、新生腫瘍細胞から保護し、異物を清掃し、血小板を産生する。赤血球系統には、酸素を運搬する赤血球が含まれる。

造血幹細胞が相対的に少量であることは、一般に幹細胞および造血性分化に関する広範な研究を妨げてきた。造血幹細胞が豊富な細胞集団が入手し易くなれば、幹細胞挙動に影響を及ぼす生物学的修飾因子の同定が可能となり得る。例えば、これまでのところ（１）幹細胞が特定系統へ特定化する初期工程；（２）そのような特定化の防止；および（３）幹細胞増殖を制御する能力、に関連する成長因子については発見されていないと思われる。

豊富化集団中で十分な数の幹細胞を入手できれば、例えば癌化学療法のような幹細胞を破壊する治療法を受けている患者において造血を再構築する際にも、極めて有用となり得る。

間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、特に骨髄、血液、皮膚および骨膜中で見いだされる形成多能性細胞であり、サイトカインのような生理活性因子からの様々な影響によって、２つ以上の特定タイプの間葉または結合組織（すなわち、例えば脂肪、骨、間質、軟骨、弾性および線維性結合組織のような特殊な要素を支持する身体の組織）に分化できる。ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）は、ＳＨ２、ＳＨ３およびＳＨ４として知られる一定のモノクローナル抗体と反応する。

ケラチノサイト幹細胞は、皮膚細胞および表皮の細胞を産生する。ケラチノサイト幹細胞は、潰瘍、急性創傷の治療および急性創傷に対する移植術において有用である。

しかし、細胞表面マーカーによるこれらの特定細胞タイプの同定は、一般に最も優れた同定手段であることが証明されている。細胞表面抗原の更なる同定は、候補幹細胞の同定、単離および更なる特徴付けにおいて明らかに重要な価値があろう。

したがって、本発明の１つの目的は先行技術の問題の一部を克服または軽減することである。

発明の開示
本発明の１つの態様では、幹細胞を同定する方法であって：
幹細胞を含む細胞サンプルを得る工程；
配列ＬＦＱＥＬＱＰＬＹＬ（配列番号１）を有するペプチド配列またはその等価物の存在を検出する工程；および
該配列またはその等価物を有する幹細胞を同定する工程、を含む方法が提供される。

本発明のまた別の態様では、幹細胞を同定する方法であって：
幹細胞を含む細胞サンプルを得る工程；
配列ＥＡＤＤＦＦＴＳ（配列番号２）を有するペプチド配列またはその等価物の存在を検出する工程；および
該配列またはその等価物を有する幹細胞を同定する工程、を含む方法が提供される。

ここで配列番号１または配列番号２と記載するペプチド配列は、幹細胞上で特異的に発現することが見いだされている。該配列は、大きなタンパク質の一部分または幹細胞によって発現した１配列であってよい。これらの配列は、幹細胞を同定または単離するために単独で、または組み合わせて使用することができる。

本出願人らは、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）が幹細胞中で発現することを見いだした。ＡＣＥは、アンジオテンシン−Ｉからアンジオテンシン−ＩＩへの変換において作用する。アンジオテンシン−ＩＩは血圧を上昇させ、本態性高血圧の主因であると見なされている。ここに記載する配列はＡＣＥの一部分であってよい。

したがって、本発明のまた別の態様では、幹細胞を同定する方法であって：
幹細胞を含む細胞サンプルを得る工程；
細胞上のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）またはそのフラグメントの存在を検出する工程；および
ＡＣＥまたはそのフラグメントを有する幹細胞を同定する工程、を含む方法が提供される。

ＡＣＥを同定するあらゆる手段を使用できる。しかし、本発明の好ましい態様では、幹細胞を同定する方法であって：
幹細胞を含む細胞サンプルを得る工程；
該サンプルをアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に対する抗体と結合させる工程；
ＡＣＥまたはそのフラグメントの存在を検出する工程；および
該幹細胞上の該抗体の存在を検出することによりＡＣＥを有する幹細胞を同定する工程、を含む方法が提供される。

好ましくは、該抗体はＡＣＥに対して特異的ないずれかの抗体である。本発明に使用する抗体は、ＡＣＥまたはＡＣＥを表示するそのフラグメントに特異的に結合するための十分な特異性を保持している、天然または組み換え、合成または天然由来の、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであるあらゆる抗体またはそのフラグメントを含んでいる。好ましくは、該抗体はＢＢ９ＡＣＥ抗体である。

本発明は更にまた、幹細胞が豊富な細胞集団を得るための方法であって：
幹細胞を含む細胞集団を得る工程；
細胞上のＡＣＥまたはそのフラグメントの存在を検出する工程；および
該細胞上のＡＣＥの存在によって同定される細胞を選択する工程、を含む方法を含んでいる。

本発明の好ましい態様では、造血幹細胞が豊富な細胞集団を得るための方法であって：
幹細胞を含む細胞集団を得る工程；
該細胞集団をＡＣＥに対する抗体と結合させる工程；および
該細胞上のＡＣＥの存在によって同定される細胞を選択する工程、を含む方法が提供される。

同様に、また別の好ましい実施形態では、集団から幹細胞を除去する方法であって：
幹細胞を含む細胞集団を得る工程；
細胞上のＡＣＥまたはそのフラグメントの存在を検出する工程；および
該細胞上のＡＣＥの存在によって同定されるそれらの細胞を選択して除く工程、を含む方法が提供される。

本明細書に記載する方法は、細胞集団から幹細胞を単離するため、またはそのような集団中の幹細胞含量を測定するためにも使用できる。

幹細胞が単離または同定されると、それらは幹細胞関連症状を治療または診断する方法において使用できる。

好ましくは、単離される幹細胞は造血幹細胞、間葉幹細胞またはケラチノサイト幹細胞である。しかし、神経細胞、幹細胞および膵細胞もまた含むことができよう。最も好ましくは、該幹細胞は造血幹細胞である。

幹細胞集団が単離されると、また別の単離方法を使用して該幹細胞を含む小集団を単離することができる。間葉またはケラチノサイト細胞のための特異的マーカーを使用すると、様々な細胞系統を同定および単離することができる。

発明を実施するための最良の形態
本発明の１つの態様では、幹細胞を同定する方法であって：
幹細胞を含む細胞サンプルを得る工程；
配列ＬＦＱＥＬＱＰＬＹＬ（配列番号１）を有するペプチド配列またはその等価物の存在を検出する工程；および
該配列またはその等価物を有する幹細胞を同定する工程、を含む方法が提供される。

本発明の別の態様では、幹細胞を同定する方法であって：
幹細胞を含む細胞サンプルを得る工程；
配列ＥＡＤＤＦＦＴＳ（配列番号２）を有するペプチド配列またはその等価物の存在を検出する工程；および
該配列またはその等価物を有する幹細胞を同定する工程、を含む方法が提供される。

配列番号１または配列番号２とここで記載するペプチド配列は、幹細胞上で特異的に発現することが見いだされている。該配列は、大きなタンパク質の一部分または幹細胞によって発現した１配列であってよい。

本明細書で使用する用語「等価物」とは、類似の方法であるが該配列の活性または機能を実質的には変化させない欠失、追加または置換を有し得る配列を意味する。このため、該配列の機能性を実質的に変化させずに少なくとも１つのアミノ酸が該ペプチド配列内に欠失していても、追加されても、または置換されてもよい。そこで、変異を有する該ペプチド配列は該幹細胞を同定するために依然として検出可能なはずである。

本発明のまた別の態様では、幹細胞を同定する方法であって：
幹細胞を含む細胞サンプルを得る工程；
細胞上のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）またはそのフラグメントの存在を検出する工程；および
ＡＣＥまたはそのフラグメントを有する幹細胞を同定する工程、を含む方法が提供される。

本出願人らは、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）が幹細胞中で発現することを見いだした。ＡＣＥはアンジオテンシン−Ｉからアンジオテンシン−ＩＩへの変換において作用する。アンジオテンシン−ＩＩは血圧を上昇させ、本態性高血圧の主因であると見なされている。

ペプチジルジペプチダーゼＡ（ＥＣ３．４．１５．１）およびキナーゼＩＩとも呼ばれるＡＣＥは、メタロペプチダーゼ、より詳細にはアンジオテンシンや例えばブラジキニン等のキニン類のような生物学的に活性なポリペプチドを加水分解する亜鉛ペプチダーゼである。ブラジキニンは、少なくとも一部には血管拡張剤であるプロスタグランジンを誘発することによって作用し、ＡＣＥによる加水分解で不活性化される血管拡張剤である。そこで、ＡＣＥは少なくとも一部には血管収縮薬であるアンジオテンシンＩＩを産生することによって、血管拡張薬であるブラジキニンを不活性化させることによって血圧を上昇させる。ブラジキニンは、更にまた疼痛および炎症反応の媒介を含む他の生物活性にも関係している。

しかし、この酵素は以前は幹細胞にもそれらの同定にも関連付けられていなかった。

ＡＣＥまたはそのフラグメントは、幹細胞上で検出されることがある。好ましくは、ＡＣＥ分子が検出される。しかし、ＡＣＥ分子のフラグメントもまたＡＣＥの性質を示すことがある。このようなフラグメントには、配列番号１または配列番号２またはそれらの等価物によってコードされる配列を有するペプチド配列が含まれることがある。

本出願人らは、配列番号１および配列番号２がＡＣＥアミノ酸配列内で見いだされ、引き続いてＡＣＥ抗体によって同定されることを見いだした。

本明細書の説明および請求項を通して、用語「含む（comprise）」および例えば「含んでいる（comprising）」および「含む（comprises）」のようなこの用語の変形は、他の添加物、構成要素、完全体または工程を排除することを意図していない。

本発明の幹細胞およびここに記載した幹細胞には、無制限に分裂することができ、１つまたは数種の細胞タイプを産生することのできる、胚または成体中の本質的に未分化の細胞である、すべての幹細胞が含まれる。本発明の幹細胞には体性幹細胞が含まれるがそれらに限定しないことが好ましい。これらは造血幹細胞、間葉幹細胞、ケラチノサイト幹細胞、神経細胞、肝細胞および膵細胞を含む群から選択することができる。最も好ましくは、肝細胞はリンパ系統、骨髄系統または赤血球系統の幹細胞へ分化することのできる造血幹細胞である。しかし、本出願人らは本方法が間葉幹細胞とケラチノサイト幹細胞とを区別するためにも有用であることを見いだした。

幹細胞のサンプルは、胚起源または成体起源を含むあらゆる起源に由来してよい。好ましくは、幹細胞源は腸骨稜、脛骨、大腿骨、脊椎、骨膜、骨内膜またはその他の骨小腔を含む骨髄、血液、胚卵黄嚢、胎児肝、脾臓、末梢血液、皮膚、真皮、肝、脳、膵臓または腎臓からである。

サンプルは、組織サンプルまたは細胞懸濁液または幹細胞を同定するためにＡＣＥに対するマーカーの相互作用を許容するインビトロで増殖させたいずれかの起源に由来する細胞であってよい。

骨髄を単離するためには、胎児ウシ血清（ＦＣＳ）またはその他の天然に存在する因子を一般には約５〜２５ｍＭの低濃度にて、許容できる緩衝液とともに適宜補給した食塩液を含むがそれに限定されない適切な溶液を使用して骨をフラッシュ洗浄することができる。好適な緩衝液には、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液および乳酸緩衝液が含まれるが、それらに限定されない。または、骨髄は従来型技術によって骨から吸引することができる。

ＡＣＥまたは特異的配列である配列番号１または配列番号２を検出する方法は、幹細胞を含むサンプルのタイプによるであろう。一般に、サンプルはマーカーと細胞との相互作用を促進するような方法でＡＣＥまたは配列に対するマーカーに暴露される、またはそれらと結合させられる。例えば、サンプルが血液サンプル中と同様に細胞懸濁液である場合は、マーカーは細胞懸濁液へ単純に添加すればよい。これは、マーカーがＡＣＥまたは該配列を物質的に同定することが意図される場合に適用できる。

ＡＣＥまたは該配列に対するマーカーには、ＡＣＥまたは該配列を同定するあらゆる手段が含まれてよいが、好ましくは細胞表面上でＡＣＥまたは該配列を同定するマーカーであり、ＡＣＥまたは該配列に対する抗体、ＡＣＥまたは該配列に対するアゴニストおよびアンタゴニスト、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはＡＣＥタンパク質いずれかの存在によってＡＣＥまたは該配列の発現を検出できる核酸検出系、およびＡＣＥに対する酵素アッセイ、蛍光アッセイまたは比色定量アッセイを含むがそれらに限定されない。検出方法は、選択されるマーカーのタイプにより、当業者には明白であろう。

該マーカーには、該マーカーの同定を強化するための標識を添加することができる。例えば、検出を強化するために当業者が熟知している蛍光、放射性または酵素マーカーを該マーカーへ結合させることができる。

本発明の好ましい態様では、幹細胞を同定する方法であって：
幹細胞を含む細胞サンプルを得る工程；
該サンプルをアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に対する抗体と結合させる工程；
ＡＣＥまたはそのフラグメントの存在を検出する工程；および
該幹細胞上の該抗体の存在を検出することによりＡＣＥを有する幹細胞を同定する工程、を含む方法が提供される。

好ましくは、該抗体はＡＣＥに対して特異的ないずれかの抗体である。本発明において使用する抗体には、ＡＣＥまたはＡＣＥを表示するそのフラグメントに特異的に結合するための十分な特異性を保持している、天然または組み換え、合成または天然由来の、モノクローナルまたはポリクローナルいずれかであるあらゆる抗体またはそのフラグメントが含まれる。本明細書で使用する用語「抗体」または「複数の抗体」には、抗体全体およびその機能的部分を含有する抗体フラグメントが含まれる。用語の「抗体」には、それに対して抗体全体が結合特異性を有するエピトープへの結合を可能とするために、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域の十分な部分から構成されるあらゆる単一特異性または二重特異性化合物が含まれる。フラグメントは、少なくとも１つの重鎖または軽鎖免疫グロブリンペプチドの可変領域を含むことができ、ＦａｂフラグメントＦ（ａｂ′）₂フラグメント、およびＦｖフラグメントが含まれるが、それらに限定されない。

組み換え抗体は、当該分野において既知のあらゆる組み換え手段によって製造することができる。このような組み換え抗体には、定常領域の大部分がヒト抗体定常領域によって置換されている細菌および非ヒト抗体中で生成するフラグメントが含まれるが、それらに限定されない。更に、このような「ヒト化」抗体は、組み換え抗体を発現させるために遺伝子操作された宿主脊椎動物によって入手できる。

更に、単一特異性ドメインは、当該分野において既知のいずれかの方法によって別の適切な分子化合物へ付着させることができる。この付着は、例えば化学的であっても、または遺伝子操作によってでもよい。

抗体は、酵素、磁性ビーズ、コロイド状磁性ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物または薬物を含むがそれらに限定されない他の適切な分子および化合物へ結合させることができる。抗体に結合させることのできる酵素には、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼおよびβガラクトシダーゼが含まれるが、それらに限定されない。抗体に結合させることのできる蛍光色素には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、フィコエリトリン、アロフィコシアニンおよびテキサスレッドが含まれるが、それらに限定されない。抗体に結合させることのできる追加の蛍光色素については、Ｈａｕｇｌａｎｄ Ｒ． Ｐ．の「分子プローブ：蛍光プローブおよび研究用化学薬品のハンドブック（１９９２−１９９４）（Molecular Probes:Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, (1992-1994）」を参照されたい。抗体に結合させることのできる金属化合物には、フェリチン、コロイド状金、および特にはコロイド状超磁性ビーズが含まれるが、それらに限定されない。抗体に結合させることのできるハプテンには、ビオチン、ジゴキシゲニン、オキサザロン、およびニトロフェノールが含まれるが、それらに限定されない。抗体に結合させることのできる、または抗体内に組み込むことのできる放射性化合物は当該分野において知られており、テクネチウム９９ｍ、¹²⁵Ｉ、ならびに¹⁴Ｃ、³Ｈおよび³⁵Ｓを含むがそれらに限定されないいずれかの放射性核種を含むアミノ酸を含むが、それらに限定されない。

ＡＣＥ抗体は、抗体またはそれらの機能的部分を産生するために当該分野において既知の方法によって入手できる。使用した特定方法はここに提示した実施例の項に記載したが、抗体産生の当該分野において既知のあらゆる方法を使用できる。このような方法には、所望の特異性をもつ細胞表面抗体を用いてＢ細胞を分離する方法、軽鎖および重鎖の可変領域を発現するＤＮＡをクローン化する方法、および適切な宿主細胞中で組み換え遺伝子を発現させる方法が含まれるが、それらに限定されない。抗体が不死化抗体産生ハイブリドーマ細胞から得られる、標準的なモノクローナル抗体生成法を使用できる。これらのハイブリドーマは、動物を幹細胞により免役し、好ましくは免役した宿主脾臓から単離した免疫動物からのＢリンパ球を、好ましくはＢ細胞骨髄腫である適合性不死化細胞と融合させることによって産生させることができる。

ＡＣＥ抗体はいずれの起源からも入手できる。ＡＣＥ抗体は市販で入手できる。効率的には、細胞上のＡＣＥの存在を検出するあらゆる手段は本発明の範囲内に含まれる。

本発明のまた別の好ましい態様では、幹細胞を同定する方法であって：
幹細胞を含むサンプルを得る工程；
該サンプルをアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に対して特異的な抗体ＢＢ９と混合する工程；
ＢＢ９またはそのフラグメントの存在を検出する工程；および
該幹細胞上の抗体ＢＢ９の存在を検出することにより幹細胞を同定する工程、を含むが方法が提供される。

モノクローナル抗体（ＭＡｂ）であるＢＢ９は、本出願人らによって、ヒト成人骨髄（ＢＭ）中の単核球の小さな小集団である間質細胞への結合およびそれに対応する末梢血（ＰＢ）中の白血球との反応性の欠如に基づいて同定された。ＢＢ９は、高レベルのＣＤ３４抗原およびＴｈｙ−１発現、ＣＤ３８の低発現から発現欠如、ローダミン１２３の低残留およびＫｉ６７を用いた標識の欠如によって証明される静止期状態を特徴とするＢＭ ＣＤ３４⁺細胞の小さな小集団に結合した。ＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺細胞は、ＣＤ３４⁺ＢＢ９^-細胞とは対照的に、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦおよびＳＣＦの組み合わせによって刺激された前ＣＦＵ培養中で好ましくも造血を維持する能力を証明した。ＢＢ９は更にまた、流動する末梢血（ＰＢ）からのＣＤ３４⁺細胞へ結合することも証明した。

ＢＢ９は、初期抗体スクリーニング中には成人ＢＭおよび末梢血（ＰＢ）中の単核球への結合の欠如によって、引き続いてのフローサイトメトリー解析ではＢＭ ＣＤ３４⁺細胞の小さな小集団への結合によって同定された。これらの細胞は、間質細胞を含まない液体培地中で長期間の造血を維持すること、そして表現型解析により初期造血前駆細胞（ＨＰＣ）に特徴的なマーカーを発現することが証明されている。

この抗体の単離については、実施例の中で詳細に記載した。

ＢＢ９は、好ましくは造血幹細胞を同定するために使用される。しかし本出願人らは、ＢＢ９が間葉幹細胞およびケラチノサイト幹細胞を同定するために有用であることを見いだした。

ここに概説した方法は、細胞集団から幹細胞を同定するために特に有用である。しかし、幹細胞全般の集団内で更に小集団を区別するためには追加のマーカーを使用できる。

例えば、間葉幹細胞は更にＳＴＲＯ−１、ＳＨ２、ＳＨ３およびＳＨ４を含むがそれらに限定されないマーカーによって同定できる。これらのマーカーは、間葉幹細胞を同定するために単独で、または組み合わせて使用できる。

ケラチノサイト幹細胞は、サイトケラチン１４、α−６インテグリン（ＣＤ４９Ｆ）およびＣＤ７１を含むがそれらに限定されないマーカーによって同定できる。これらのマーカーは、ケラチノサイト幹細胞を同定するために単独で、または組み合わせて使用できる。

追加のマーカーを使用する工程は、単独で、またはＡＣＥマーカーと組み合わせて適用できる。

本発明のまた別の態様では、幹細胞が豊富な細胞集団を得るための方法であって：
幹細胞を含む細胞集団を得る工程；
細胞上のＡＣＥまたはそのフラグメントの存在を検出する工程；および
該細胞上のＡＣＥの存在によって同定される細胞を選択する工程、を含む方法が提供される。

そこで本発明には、集団の幹細胞を豊富化する方法が含まれる。これらの方法には、幹細胞の混合物と、好ましくは該抗体がＡＣＥに結合することを許容する条件下でＡＣＥを認識かつ結合する抗体とを混合する工程、および実質的に幹細胞が豊富である集団を得るために該抗体によって認識された細胞を分離する工程が含まれる。しかし、上記のようなＡＣＥの他の形態の同定方法も使用できる。これらの方法は、サンプル中で幹細胞の数についての診断アッセイとして使用できる。細胞および抗体は、該抗体がＡＣＥおよびその後定量される幹細胞へ特異的に結合するのを許容するために十分な条件下で混合され、定量化される。幹細胞は単離、または更に精製できる。

上記のように、細胞集団は上記のようなサンプルを含むいずれかの幹細胞起源から入手できる。

ＡＣＥの存在の検出は、細胞上のＡＣＥを同定するいずれかの方法で実行できる。好ましくは、検出はＡＣＥに対するマーカーの使用による。ＡＣＥに対するマーカーは、上記のマーカーのいずれかであってよい。しかし、ＡＣＥに対する抗体は、ＡＣＥに対するマーカーとして特に有用である。より好ましくは、該抗体はＢＢ９である。

上記のように、ＡＣＥまたはＡＣＥのフラグメントを検出できる。好ましくは、ＡＣＥの全分子が検出される、または配列番号１または配列番号２に対応するフラグメントまたはその等価物を検出できる。

最初に分化拘束された系統の細胞を除去することによって細胞を分離または豊富化するために様々な技術を使用できる。モノクローナル抗体は、細胞系統および／または分化工程を同定するために特に有用である。抗体は、粗分離のために固体支持体へ付着させることができる。使用される分離方法は、収集される分画の生存度の保持率を最大化しなければならない。「比較的に粗雑な」分離を得るために、種々の有効性を有する様々な方法を使用できる。使用される特定方法は、分離の有効性、関連する細胞毒性、実施の容易さおよび速度、ならびに高性能の装置および／または専門技術の必要性による。

分離または豊富化のための方法には、抗体コーティング磁性ビーズを使用した磁気分離、親和性クロマトグラフィー、相補体およびサイトトキシンを含むがそれらに限定されないモノクローナル抗体に結合した、またはモノクローナル抗体と一緒に使用される細胞毒性物質、および例えばプレートのような個体基質に付着した抗体を用いての“パンニング”、エルトリエーションまたはいずれか他の好都合な方法が含むことができるがそれらに限定されない。

分離または豊富化の方法の使用には、物理的特性（密度勾配遠心分離および向流遠心分離エルトリエーション）、細胞表面特性（レクチンおよび抗体親和性）、および生体染色特性（ミトコンドリア結合色素であるｒｈｏ１２３およびＤＮＡ結合色素であるヘキスト３３３４２）における差に基づく方法が含まれるがそれらに限定されない。

正確な分離を提供する方法には、例えば複数のカラーチャンネル、低角度および鈍角散乱光検出チャンネル、インピーダンスチャンネル等のような様々な洗練度を有するＦＡＣＳが含まれるがそれに限定されない。

典型的には約１×１０^8-9、好ましくは約５×１０^8-9cellsで開始する最初の分離では、ＡＣＥ抗体は１つの蛍光色素を用いて標識できるが、他方様々な分化拘束された系統に対する抗体は少なくとも１つの相違する蛍光色素と結合させることができる。これらの系統の各々は別個の工程で分離できるが、望ましくはこれらの系統は、１つはＡＣＥおよび／または他の幹細胞マーカーに対してポジティブに選択されるように同時に分離される。これらの細胞は、死細胞（ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含むがそれに限定されない）と関連する色素を使用することによって、死細胞に対して選択することができる。好ましくは、これらの細胞は２％のＦＣＳを含む培地中で収集する。

本発明にとって分離の特定順序は不可欠ではないと考えられるが、ここに指示した順序が好ましい。好ましくは、細胞は最初に粗分離によって分離され、その後ＡＣＥ抗体を用いたポジティブ選択を用いて微細分離が行われる。

本発明の好ましい態様では、造血幹細胞が豊富な細胞集団を得るための方法であって：
幹細胞を含む細胞集団を得る工程；
該細胞集団をＡＣＥに対する抗体と混合する工程；および
該細胞上のＡＣＥの存在によって同定される細胞を選択する工程、を含む方法が提供される。

好ましくは、該抗体はＢＢ９である。しかし、ＡＣＥに対する他の抗体も同等に有効となり得る。細胞を単離するために抗体を使用するあらゆる分離法を利用することができ、これらの方法は当業者によく知られている。

いずれかの細胞集団を更に豊富化させるためには、それらの細胞集団に対する特異的マーカーを使用できる。例えば、ＳＴＲＯ−１、ＳＨ２、ＳＨ３およびＳＨ４を含むがそれらに限定されない間葉細胞に対する特異的マーカーは、これらの細胞について、またはそれらに反して豊富化するために使用できる。

同様に、サイトケラチン１４、α−６インテグリン（ＣＤ４９Ｆ）およびＣＤ７１を含むがそれらに限定されないケラチノサイト幹細胞に対する抗体特異的マーカーはそれらの細胞について、またはそれらに反して豊富化するために使用できる。

これらのマーカーは、更にまた間葉幹細胞またはケラチノサイト幹細胞を除去または選択して除くことによって造血幹細胞を豊富化するためにも使用できる。

同様に、また別の好ましい実施形態では、集団から幹細胞を除去する方法であって：
幹細胞を含む細胞集団を得る工程；
細胞上のＡＣＥまたはそのフラグメントの存在を検出する工程；および
該細胞上のＡＣＥの存在によって同定されるそれらの細胞を選択して除く工程、を含む方法が提供される。

豊富化と同一方法で、実質的に幹細胞を含まない集団を提供するためにＡＣＥの使用は逆転させることができる。ＡＣＥを発現する細胞を選択するために上記で使用した方法は、幹細胞を選択して除き幹細胞が除去された集団を残すために使用できる。

好ましくは、ＡＣＥはＡＣＥまたはそのフラグメントに対する抗体を使用することによって検出される。該フラグメントは、配列番号１または配列番号２またはそれらの等価物によってコードすることができる。好ましくは、該抗体はＢＢ９である。

上記に記載した方法には、更にまた他の幹細胞特異的マーカーに対するポジティブ選択による細胞の豊富化工程を含むことができる。適切なポジティブ幹細胞マーカーには、ＣＤ３４⁺、Ｔｈｙ−１⁺、およびｃ−キット⁺が含まれるがそれらに限定されない。好ましくは、幹細胞はヒト由来であるが、いずれかの適切な動物に由来することができる。特定因子を用いての適切な選択ならびに幹細胞の自己再生およびそれらのマーカーについての幹細胞のスクリーニングを許容するバイオアッセイの開発によって、様々な目的のために、生育可能な幹細胞が豊富な組成物を製造することができる。

本発明のまた別の態様では、幹細胞を単離する方法であって：
幹細胞を含む細胞集団を得る工程；
細胞上のＡＣＥまたはそのフラグメントの存在を検出する工程；および
該細胞上のＡＣＥの存在によって同定されるそれらの細胞を選択する工程；および
ＡＣＥの存在によって同定されたそれらの細胞を単離する工程、を含む方法が提供される。

該幹細胞は、該幹細胞を単離する追加の工程を提供することにより、上記のような豊富化のために使用される方法のいずれかによって単離できる。有用な方法には、抗体コーティング磁性ビーズを使用した磁気分離、親和性クロマトグラフィー、相補体およびサイトトキシンを含むがそれらに限定されないモノクローナル抗体に結合した、またはモノクローナル抗体と一緒に使用される細胞毒性物質、および例えばプレートのような個体基質に付着した抗体を用いての「パンニング」、エルトリエーションまたはいずれか他の好都合な方法が含まれる。当業者は、これらの方法に習熟しており、ＡＣＥが選択されることを提供するいずれかの既知の方法を使用できる。

別の好ましい態様では、幹細胞を単離する方法であって：
幹細胞を含む細胞集団を得る工程；
該細胞集団をＡＣＥに対する抗体と混合する工程；
ＡＣＥに対する抗体によって同定されたそれらの細胞を選択する工程；および
該抗体によって同定されたそれらの細胞を単離する工程、を含む方法が提供される。

好ましくは、該抗体はＢＢ９である。しかし、ＡＣＥに対して特異的である現在入手可能なあらゆる抗体を使用できる。

好ましくは、単離された該幹細胞は造血幹細胞、間葉幹細胞またはケラチノサイト幹細胞である。しかし、神経細胞、幹細胞および膵細胞もまた含むことができよう。最も好ましくは、該幹細胞は造血幹細胞である。

幹細胞集団が単離されると、また別の単離方法を使用して該幹細胞を含む小集団を単離することができる。上記の間葉またはケラチノサイト細胞のための特異的マーカーを使用すると、様々な細胞系統を同定および単離することができる。

また別の態様では、ここに記載した方法によって単離された幹細胞が提供される。好ましくは、該幹細胞は造血幹細胞、間葉幹細胞および／またはケラチノサイト幹細胞である。最も好ましくは、該幹細胞は造血幹細胞である。

本発明は、更にまた別の態様では幹細胞が豊富な組成物を提供する。好ましくは、該豊富化幹細胞は豊富な造血幹細胞、間葉幹細胞またはケラチノサイト幹細胞を含む。

組成物が幹細胞豊富である場合は、これらは自家移植片に使用できる。更に、自家幹細胞を使用すれば移植片対宿主疾患を回避し得る。更に、これらの細胞は遺伝的欠陥を修正するため、または幹細胞または、個体または幹細胞全般のいずれかに関し、それらの子孫において天然に欠如している遺伝的能力を提供するために、適切な遺伝子導入によって修飾できる。更に、該幹細胞組成物を使用すると、それらの再生および分化に関連する因子を単離かつ定義することができる。

本発明のまた別の態様では幹細胞含量を測定する方法であって：
幹細胞を含む細胞集団を得る工程；
ＡＣＥの指標を用いて細胞上のＡＣＥまたはそのフラグメントの存在を検出する工程；
ＡＣＥを有する細胞または細胞上のそのフラグメントを選択する工程；および
選択前の該細胞集団中の細胞の量に比較して選択した細胞を定量する工程、を含む前記方法が提供される。

本発明のまた別の好ましい態様では、幹細胞含量を測定する方法であって：
幹細胞を含む細胞集団を得る工程；
該細胞集団をＡＣＥに対する抗体と混合する工程；
ＡＣＥに対する抗体によって同定されたそれらの細胞を選択する工程；および
選択前の該細胞集団中の細胞の量に比較してＡＣＥ抗体を使用して選択した細胞の量を定量する工程、を含む前記方法が提供される。

選択した幹細胞の量を定量する工程は、白血病、癌または肉腫または一般感染症を含むがそれらに限定されない症状であり、特に造血幹細胞集団、より特別にはそれらの集団のリンパ系統における幹細胞の活性の上昇を惹起し得る症状を診断する手段を提供する。特に、その定量は抗体の産生、細胞免疫系の調節、血液中の外来物質の検出、宿主にとって異質である細胞の検出等を提供する、リンパ系統から分化するＢ細胞およびＴ細胞の表示を提供することができる。単球、顆粒球、巨核球ならびにその他の細胞が含まれる骨髄系統は、血流中の異物の存在を監視し、新生細胞に対する保護を提供し、血流中の外来物質を清掃し、血小板を産生する等をする。赤血球系統は、酸素担体として機能する赤血球を提供する。

本発明の更にまた別の態様では、集団中の幹細胞を検出するための組成物が提供されるが、前記組成物はＡＣＥまたはそのフラグメントの指標および担体を含む。

ＡＣＥの指標は、幹細胞上のＡＣＥを同定できるいずれかの検出手段を含むことができる。好ましくは、該指標はＡＣＥまたはそのフラグメントに対する抗体である。好ましくは、該抗体は上記のとおりであり、ＢＢ９であってよい。

該抗体は、ＡＣＥの全分子を検出できる、またはＡＣＥ内に含有される特異的ペプチド配列を検出できる。好ましくは、該抗体は配列番号１または配列番号２またはそれらの等価物を検出し得る。

該組成物は、更に間葉細胞とケラチノサイト細胞を識別するための追加のマーカーを含むことができる。間葉幹細胞のためには、追加のマーカーはＳＴＲ０、ＳＨ２、ＳＨ３またはＳＨ４を含むがそれらに限定されない群から選択されるいずれかのマーカーを含むことができる。ケラチノサイト幹細胞のためには、マーカーはサイトケラチン１４、α−６インテグリン（ＣＤ４９Ｆ）およびＣＤ７１を含むがそれらに限定されない群から選択できる。

本発明は、細胞集団における幹細胞タイプの存在を同定することにより幹細胞に関連する症状を診断する方法を提供する。例えば、造血幹細胞のレベルの上昇または減少は血液中の異常を表示し得る。これは、白血病のような疾患において重要なことがあり、同様に、上昇は、感染症を意味するＴ細胞およびＢ細胞を含むリンパ系統へ分化する幹細胞の上昇であると言い換えることができる。その他の方法は、白血病または他の悪性腫瘍上のＡＣＥ発現を測定することができる。

本発明のまた別の態様では、幹細胞の豊富化集団を含む有効量の組成物を投与する工程を含む幹細胞関連症状を治療する方法が提供されるが、このとき前記幹細胞は該症状に関連しており、前記幹細胞の豊富化集団はここに記載した方法によって調製する。

本明細書で使用する「幹細胞関連症状」とは、幹細胞との相互作用の結果として生じるあらゆる症状を意味する。

ここに記載した方法によって単離された幹細胞を含む本発明の組成物は、多数の方法で利用できる。

造血幹細胞については、これらの細胞は照射を受けた宿主および／または化学療法を受ける宿主のような免疫不全の宿主を十分に再構築するために；またはエリスロポエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子、ＩＬ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８等のようなインターロイキン等を含むがそれらに限定されない多数の因子、または特定系統へと分化拘束される幹細胞に関連する間質細胞、もしくはそれらの増殖、成熟および分化とともに用いて、それらの成熟、増殖および１つもしくは２つ以上の選択される系統への分化を提供することによって特定系統のための細胞起源として使用できる

造血幹細胞は更にまた、造血細胞の分化および成熟に関連する因子の単離および評価に使用することができる。そこで、本発明は条件培地のような培地の活性を決定するため、または細胞増殖活性、特定系統の分化拘束の関与等について液体を評価するための造血幹細胞の使用を含んでいる。

造血幹細胞は、遺伝病の治療に使用することができる。そこで、本発明は遺伝的欠陥を修正するための自家または同種異系の幹細胞の遺伝的修飾による造血細胞に関連する遺伝病の治療を含んでいる。例えば、βサラセミア、鎌状細胞貧血、アデノシンデアミナーゼ欠損症、リコンビナーゼ欠損症、リコンビナーゼ調節遺伝子欠損症等を含むがそれらに限定されない疾患は、相同的またはランダム組み換えのいずれかにより、造血幹細胞内への野生型遺伝子の導入によって修復することができる。

遺伝子療法のその他の応用は、化学療法中に選択的圧力に曝される正常幹細胞にとって利するように、薬剤耐性遺伝子を導入することである。適切な薬剤耐性遺伝子には、多剤耐性（ＭＤＲ）タンパク質をコードする遺伝子が含まれるがそれに限定されない。

造血細胞に関連する疾患以外の疾患もまた遺伝的修飾によって治療でき、該疾患はホルモン、酵素、インターフェロン、成長因子等を含むがそれらに限定されない特定分泌産物の欠如に関連する疾患である。適切な開始調節領域を使用することによって、不足するタンパク質の誘導産生を達成することができるので、たとえ通常はそのようなタンパク質を産生する細胞タイプとは相違する細胞タイプにおける産生であっても、該タンパク質の産生は自然産生と平行し得る。特定遺伝子産物または疾患、特に血液リンパ親和性疾患への罹病性を抑制するためにリボザイム、アンチセンスまたはその他のメッセージを挿入することも可能である。

追加の態様では、本発明は治療および／または診断目的で本発明の方法によって同定および単離または豊富化されたヒト間葉幹細胞を利用する様々な方法に向けられる。例えば、ヒト間葉幹細胞は：（１）急性傷害、異常な遺伝的発現または後天性疾患を通して、損傷している間葉組織を再生させること；（２）小アリコートの骨髄の除去、それらの間葉幹細胞の単離および損傷した組織部位へＭＳＣを送達するために適合する生体適合性担体と結合したＭＳＣを用いて損傷した組織を治療することによって、損傷した間葉組織を有する宿主を治療すること；（３）様々な間葉組織を産生すること；（４）ＭＳＣ自己再生および分化拘束された間葉系統への分化に関係する増殖因子を検出および評価すること；（５）ＭＳＣ分化拘束および特定の間葉系統への分化を調節する阻害因子を検出および評価すること；および（６）間葉細胞系統を発達させ、間葉組織の発達に関連する因子をアッセイすること、において利用される。

本発明は更にまた、欠落または損傷した骨格組織の再生のような結合組織障害を修正、または修飾するために、また、間葉幹細胞の活性化およびその後の分化後において自然な骨または粘性の架橋を作り出すように、補綴具または様々な三カルシウムもしくはヒドロキシアパタイトセラミックのビヒクルまたは担体の多孔面上に単離した間葉幹細胞を付着させることを通して、様々なプラスチック製または金属製補綴具の植え込みを強化するために間葉幹細胞を利用する方法に向けられる。

更に、本発明は骨髄移植中に造血細胞貯蔵量の割合を強化するために間葉幹細胞の複合移植片を使用することに向けられる様々な方法に関する。本発明の追加の実施形態は、造血幹細胞の蓄積を産生するための触媒として、ヌードマウスの皮下部位内へのような宿主内に植え込まれる間葉幹細胞の複合移植片およびセラミックを使用するための様々な方法に関する。

別の態様では、本発明は結合組織損傷を修復させるための方法に関する。本方法は、修復に必要な結合組織のタイプへ細胞を分化させるために適切な条件下で、間葉幹細胞または前駆細胞を含有する抽出物を結合組織損傷の領域へ適用する工程を含む。

間葉幹細胞を含有する本発明による組成物は、特に結合組織欠損の修復、再構築および／または再生を促進するために有用である。本明細書で使用する結合組織には、骨、軟骨、靱帯、腱、間質および筋肉が含まれる。結合組織欠損には、外傷、疾患、年齢、先天的欠損症、外科的介入術等に起因して発生することのある正常結合組織と比較したあらゆる損傷または不規則性が含まれる。本明細書で使用する結合組織欠損は、更にまた美容上の強化だけが望ましい非損傷領域にも適用される。ここに開示した方法および物質は、特に整形外科、歯科、口腔顎顔面、歯周およびその他の外科手技において使用するために適合する。

好ましい実施形態では、間葉幹細胞は使用前に培養によって増殖することができるが、培養増殖を行わずにそのような間葉幹細胞を使用することも可能である。例えば、間葉幹細胞は骨髄から取り出し、そこから血球を分離した後に増殖させずに使用することができる。したがって、例えば間葉幹細胞を使用した結合組織を修復するための外科処置中に、患者から骨髄を入手し、血球を除去してＡＣＥ抗体を使用する単離によってヒト間葉幹細胞を豊富化させ、処置中に患者へ再導入することができる。本質的に血球を含んでいない間葉幹細胞を含有する骨髄由来細胞を使用すると、その後、患者の結合組織を修復することができる。

結合組織を修復するためにヒト間葉幹細胞を送達するためには、様々なビヒクルを使用できる。該組成物は、新規の骨または軟骨形成のための嵩および足場を提供するために損傷組織のためのパッチとして設計することができる。本発明によるここに記載した様々な組成物、方法および物質は、骨折直後の修復、癒着不能骨折の修復を刺激するため、脊椎固定を促進するために使用できる。同様に、軟骨およびその他の筋骨格組織の修復も達成できる。脊椎固定術の場合は、このような組成物、方法および物質は後方では椎弓板および横突起に沿った質量固定を促進するため、器具を用いてまたは用いずに使用できる、前方では椎体間固定を促進するため、固定ケージを充填するために使用できる。

本発明において単離されたケラチノサイトもまた熱傷を治療する際に使用するための体外培養のために；インスリン、レプチンを含むがそれらに限定されない治療薬を全身性送達するための遺伝子治療のためのビヒクルとして使用でき、またそれらは治療用途のために他の組織へと再プログラミングできる幹細胞起源としても使用できる。

文献、作用、物質、装置、製品等の考察は、本発明の内容を提供する目的でのみ本明細書に含まれている。これらのいずれかまたはすべてが本出願の各請求項の優先日前にオーストラリアに存在しており、先行技術の基礎の一部を形成し、または本発明に関連する分野における共通の一般知識であったとは示唆されても意味されてもいない。

下記では、本発明に使用した方法の実施例についてより十分に説明する。しかしながら、以下の説明は例示だけを目的としており、決して上記に記載した本発明の一般性に対する制限であると見なすべきではないと理解されなければならない。

実施例１
ＢＢ９抗体の単離および特性付け
（ａ）骨髄および末梢血からの細胞の単離
骨髄は、王立アデレード病院のヒトを対象とした治験審査委員会によって承認された手順書にしたがって、インフォームド・コンセントを得た後に健常人の胸骨および後腸骨稜から保存剤を含まないヘパリン中へ吸引した。骨髄単核球（ＢＭＭＮＣ）は、フィコール（リンホプレップ、１．０７７ｇ／ｄＬ；Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ ＡＳ、オスロ、ノルウェー）で４００ｇで遠心分離し、２０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３５および５％の胎児ウシ血清（ＦＣＳ；ＰＡ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、シドニー、ニュー・サウス・ウェールズ州、オーストラリア）を補給した４℃のＨＨＦ（ハンクス平衡塩類溶液）（ＨＢＳＳ；Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、グレンウェイバリー、ビクトリア州、オーストラリア）中での遠心分離により２度洗浄した後に単離した。

流動する末梢血（ＰＢ）を採取し、前述したとおりに凍結保存した［１７］。細胞は、使用時まで液体窒素中に保存した。免疫標識およびセルソーティング（細胞選別）の実施日に、細胞のアンプルを３７℃で急速解凍した。細胞が解凍したら、それらは直ちに１０ｍＬ解凍液（２％のＢＳＡ、１０ｍＭのクエン酸および５０ ｋｕｎｉｔｚ単位／ｍＬのＤＮＡ分解酵素を補給したＨＢＳＳ）を含有する丸底管（Ｆａｌｃｏｎ ２０５９；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、リンカーンパーク、ニュージャージー州）中へ移した。細胞を室温で１０分間放置し、その後で遠心してＨＨＦ中で２度洗浄した。非生存物質を除去するために、上記のとおりにフィコールで遠心分離した後に単離した。本試験では２コホートの患者からの細胞を使用し、それらは７ｍｇ／ｍ^２の用量での高用量シクロホスファミド（ＨＤＣ）にＧ−ＣＳＦ（アフェレーシスが完了するまで第２日から５μｇ／ｋｇを１日１回皮下注射）を加えたものおよびＨＤＣにＧＭ−ＣＳＦ（同様にアフェレーシスが完了するまで第２日から５μｇ／ｋｇ／日でｓｃ）を加え流動させたものである[１８]。

末梢血白血球（ＰＢＬ）は、健常人ドナーＰＢから単離して保存料を含まないヘパリン中へ単離した。手短には、予備加温したペンタスパン（Ｐｅｎｔａｓｐａｎ、Ｂｏｏｔｓ Ｃｏ．，ウェリントン、ニュージーランド）をペンタスパン６．６ｍＬ対ＰＢ １０ｍＬの比率でＰＢへ添加した。これらを反転させて混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。このインキュベーション中に、赤血球が沈殿したので、ＰＢＬを含有する上層を採取した。この層からの細胞を遠心分離し、ＨＨＦ中で２度洗浄した。その後、上記に記載した方法に類似するフィコール法を使用してこれらの細胞を単核球および顆粒球に分離した。顆粒球および混入している赤血球はフィコールによりペレット化し、０．８３％塩化アンモニウム中での低張性溶解により混入している赤血球を除去した後、この方法で調製した白血球は通常は＞９５％の好中性顆粒球を含んでいた。

（ｂ）ヒト造血細胞系の培養
Ｊｕｒｋａｔ、Ｈｕｔ ７８、ＣＥＭ ＶＬＢ−１００およびＭｏｌｔ−４（全Ｔ細胞系）、ＨＬ６０（前骨髄球性白血病）、Ｋ５６２（赤白血病性）、Ｍｅｇ−０１（巨核球）、Ｈｉ Ｍｅｇ（巨核球／白血病）、Ｎａｌｍ−６（Ｂ細胞系）、ＫＧ１（骨髄芽球性白血病細胞系）、ＫＧ１ａ（骨髄芽球性）、Ｕ９３７（骨髄系）、ＨＥＬ−ＤＲ⁺（赤白血病性）、およびＲＣ２Ａ（ＡＭＬ）細胞はすべて、１０％のＦＣＳ、ペニシリン（最終濃度１００ｉ．ｕ．／ｍＬ）、硫酸ゲンタマイシン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）および２ｍＭのグルタミンを補給したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、グレンウェバリー、ビクトリア州、オーストラリア）中で増殖させた。ＵＴ７（巨核球／赤白血病性）およびＴＦ−１細胞は上記と同様にペニシリン、ゲンタマイシンおよびグルタミンを含む１０％のＦＣＳおよび２ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（アムジェン、サウザンドオークス市、カリフォルニア州の好意による寄贈）を補給したＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させた。Ｍ０７ｅ細胞は、上記と同様にペニシリン、ゲンタマイシンおよびグルタミンおよび５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３（アムゲン、サウザンドオークス、カリフォルニア州）を含む１０％のＦＣＳを補給したαＭＥＭ（α改良イーグル培地）中で増殖させた。

（ｃ）ヒト非造血細胞系の培養
ＨＦＦ２（線維芽細胞）およびＭＣＦ−７（乳腺細胞癌）は１０％のＦＣＳ、ペニシリン、硫酸ゲンタマイシンおよびグルタミンを補給したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中で増殖させた。ＭＧ６３（骨肉腫細胞）は、上記と同様にペニシリン、ゲンタマイシンおよびグルタミンとともに１０％のＦＣＳを補給したαＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中で増殖させた。

（ｄ）骨髄間質細胞
免疫のために使用した骨髄間質細胞は前述したようにＦＡＣＳによって精製したヒトＳＴＲＯ−１⁺ ＢＭＭＮＣから単離した［１９］。これらの細胞は、２０％のＦＣＳ、ペニシリン（１００ｉ．ｕ．／ｍＬ）、硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびグルタミン（２ｍＭ）ならびにＬ−アスコルビン酸の長寿命誘導体、アスコルビン酸２−ホスフェート（ＡＳＣ−２Ｐ、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミシガン州、米国）を補給したα培地中で培養した。細胞は、週に１回培地を交換しながら、数週間に渡り３７℃、５％ＣＯ₂の加湿インキュベーター内で培養した。

（ｅ）モノクローナル抗体の生成
抗体ＢＢ９は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６ Ｅ６／Ｅ７オープンリーディングフレーム（ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７ｏｒｆ）を含有する両種指向性レトロウイルスを用いたＳＴＲＯ−１⁺間質細胞の感染の結果として生じたＨＰＶ／ＭＳＣと指名された一連のヒト独立由来骨髄間質細胞を用いてのＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫後に発生させた［２０−２２］。手短には、ＢＡＬＢ／ｃマウスはアジュバントとして５０μｇのムラミールジペプチド（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中の２〜１０×１０⁶cellsのＨＰＶ／ＭＳＣ細胞を用いて腹腔内（ＩＰ）免役した。マウスは、３週間間隔で、ＩＰ投与したのと同一用量の細胞を用いて２回、および融合前４日間に、１０⁶cellsを静脈内投与し追加免役した。免役したマウスから単離した脾細胞は、標準的な方法［２３］によってＮＳ−１マウス骨髄細胞系と融合させ、ＨＡＴを含有する培地中で結果として生じたハイブリドーマを選択した［２４］。

融合により発生したハイブリドーマは、最初はＨＰＶ／ＭＳＣ間質細胞と反応性の抗体の産生についてスクリーニングした。これは、９６ウェルプレート内で増殖した新鮮な固定されていない間質細胞についての間接的免疫蛍光アッセイによって実施した。この間質細胞系と反応性である抗体について、ＰＢＬと反応性の抗体を除去するためにネガティブスクリーニングを行った。これは、ハイブリドーマ上清およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）複合Ｆ（ａｂ）₂ヒツジ抗マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）（ＤＤＡＦ試薬：Ｓｉｌｅｎｕｓ、メルボルン、オーストラリア）を用いてＰＢＬを連続的に染色することにより実施した。染色は、丸底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ Ａ／Ｓ、カムストラップ、デンマーク）中で実施し、各インキュベーション工程後の洗浄は低温ＨＨＦを添加した後に実施し、その後で遠心分離を行った。最終洗浄後、ＰＢＬは事前にポリ−Ｌ−リシン（１：１０で希釈；Ｓｉｇｍａ）でコート（室温で３０分間）した平底９６ウェルプレートに移し、細胞接着を促進するために再び遠心分離した。過剰なＨＨＦを除去した後、１００μＬのＦＡＣＳ固定液（ＰＢＳ中の１％ホルマリン、２％グルコースおよび０．０２％アジ化ナトリウム）を添加することによりin situで固定し、引き続き蛍光顕微鏡（オリンパスＢＨ２−ＲＦＣＡ、オリンパス光学、東京、日本）下での検査により抗体反応性について視覚的にスコア付けした。ＰＢＬと非反応性である抗体についてはその後、下記に記載するようにフローサイトメトリー解析によってＢＭＭＮＣへの結合について試験した。抗体ＢＢ９は、最初はリンパ芽球細胞の小さな小集団との反応性に基づいて、引き続いてのアッセイではＣＤ３４⁺細胞の小集団への結合によって選択した。その同定後、ＢＢ９ハイブリドーマは限界希釈により３回クローニングし、市販キット（ベーリンガーマンハイム、キャッスルヒル、ニュー・サウス・ウェールズ州、オーストラリア）を使用して抗体のアイソタイプを決定した。ＢＢ９はＩｇＧ₁アイソタイプであることが証明された。その後の試験はすべて、製造業者の推奨にしたがってタンパク質Ａ−セファロース（ファルマシア、ノースライド、ニュー・サウス・ウェールズ州，オーストラリア）を使用して使用済み組織培養上清から単離した精製ＢＢ９抗体を用いて実施した。標準条件下でＢＢ９をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはビオチンのアミン反応性誘導体とを共役結合させる試みは、該抗体の結合活性の消失を生じさせた。結果として、ＢＢ９の一次造血細胞および様々な造血系統に代表的な細胞系への結合パターンについてのすべての解析は間接的免疫蛍光染色によって実施した。

（ｆ）フローサイトメトリー解析および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）のための造血細胞の免疫標識
免疫標識の前に、一次造血細胞（ＢＭＭＮＣ、ＰＢＭＮＣ、ＰＢＬ）または造血細胞系は、Ｆｃ受容体をブロックするために氷上で３０分間、４％正常ヒト血清（Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ、アデレード、南オーストラリア；ＨＨＦ−ＮＨＳ）を補給したＨＨＦ中でインキュベートした。その後細胞は、単独抗体または同時にどちらもＨＨＦ中の最終濃度２０μｇ／ｍＬとなるよう希釈した抗ＣＤ３４ ＭＡｂ ４３Ａ１（マウスＩｇＧ₃；Ｔｕｂｉｎｇｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈ−Ｊ． Ｂｕｈｒｉｎｇ博士の好意による寄贈）［２５］および抗体ＢＢ９（マウスＩｇＧ₁）の組み合わせを用いてのどちらかで標識した。追加のサンプルは、単独または適切な４３Ａ１とＢＢ９抗体の様々な組み合わせのどちらかでアイソタイプが適合する非結合対照ＩｇＧ₃（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）、バーミンガム、アラバマ州）またはＩｇＧ₁（アデレード大学微生物学部のＧｒａｈａｍ Ｍａｙｅｒｈｏｆｅｒ博士の好意で提供されたＭＡｂ １Ｂ５、抗ジアルジア）抗体を用いて平行染色した。すべての抗体のインキュベーションは氷上で４５分間実施し、その後ですべての場合に４℃の過剰なＨＨＦ中で２回洗浄した。特異的に結合したモノクローナル抗体は、マウス−ＩｇＧ₁（フィコエリトリンに結合、ＰＥ）およびマウスＩｇＧ₃（ＦＩＴＣに結合、どちらもＣａｌｔａｇ；サンフランシスコ、カリフォルニア州）に対する最適に滴定したアイソタイプ特異的ヤギ抗体の組み合わせと共にインキュベーションを行った。更にＨＨＦ中で２回洗浄した後、細胞はＦＡＣＳ−ＦＩＸ（フローサイトメトリー解析用）またはＦＡＣＳ用の低温ＨＨＦのどちらかに約１０⁷／ｍＬで懸濁させた。

ＣＤ３４⁺ＢＭ細胞の規定小集団上でＢＢ９によって同定された抗原の発現を検討するために、３カラーフローサイトメトリー解析を実施した。これらの解析の大多数は、非分別ＢＭＭＮＣを使用して実施したが、一部は以前に説明したように［２６］、５６１−ダイナビーズ（Ｄｙｎａｌ、オスロ）によって予備的に豊富化したＣＤ３４⁺細胞を使用して実施した。ＢＢ９発現によって分別されたＣＤ３４⁺細胞による超生体蛍光色素ローダミン１２３（Ｒｈ１２３）の残留を検討するために、ＢＭＭＮＣを用いて追加の試験を実施した。細胞は、最初に０．１μｇ／ｍＬの最終濃度でＲｈ１２３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、オレゴン州）を補給したＨＨＦ中において３７℃で４５分間インキュベートした。低温ＨＨＦ中で２回洗浄した後、細胞は更に１５分間３７℃でインキュベートして結合していないＲｈ１２３を流出させ、更に低温ＨＨＦ−ＮＨＳ中で洗浄した。免疫染色は、４３Ａ１をビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ₃特異的抗体およびストレプトアビジンートリカラー（ＳＡＶ−ＴＣ；どちらもＣａｌｔａｇ）との連続的インキュベーションによって検出した以外は、上記のとおり４３Ａ１とＢＢ９を使用して実施した。ＣＤ３４／ＣＤ３８／ＢＢ９およびＣＤ３４／ＣＤ９０／ＢＢ９の共分布は、最初は細胞を４３Ａ１およびＢＢ９と一緒にインキュベートし、その後に上記のとおりに抗マウスＩｇＧ₃−ＦＩＴＣおよび抗マウスＩｇＧ₁−トリカラー（ＴＣ）（どちらもＣａｌｔａｇ）とインキュベートすることによって評価した。細胞は、抗マウスＩｇＧ₁―ＴＣ上の過剰な部位をブロックするために非結合マウスＩｇＧ₁抗体３Ｄ３［２７］を含有する過剰な腹水と一緒にインキュベートし、その後Ｌｅｕ１７−ＰＥまたはＰＲ１３_BIOTIN（ＩｇＧ₁ 抗ＣＤ９０；Ｓｙｓｔｅｍｉｘ Ｉｎｃ．、パロアルト、カリフォルニア州のＢｅｔｈ Ｈｉｌｌ博士およびＢｅｎ Ｃｈｅｎ博士の好意による寄贈）のどちらかを添加して更に４５分間インキュベートした。結合したＰＲ１３_BIOTINはＳＡＶ−ＰＥ（Ｃａｌｔａｇ）との最終インキュベーションによって局在化した。細胞のアリコートもまた、遮断工程の有効性を評価するために、ＩｇＧ₁−ＰＥまたはＩｇＧ₁−_BIOTIN（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて平行染色した。ＢＭＭＮＣの細胞周期解析は、最初は４３Ａ１とＢＢ９を用いて細胞を標識化し、その後は上記のとおりにビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ₃特異的抗体およびＳＡＶ−ＴＣおよびＰＥ−複合ヤギ抗マウスＩｇＧ₁とのインキュベーションによって実施した。細胞は、過剰な無関係のマウスＩｇＧ₁腹水を用いて３０分間遮断し、ＨＨＦ中で２回洗浄し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、氷温７０％エタノールを用いて１０分間透過処理した。細胞はＰＢＳ中で２回洗浄し、更にＰＢＳ中の３％ヤギ血清を用いて３０分間かけて遮断した。ＦＩＴＣ複合Ｋｉ６７ ＭＡｂ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、マルセイユ、フランス）またはＩｇＧ₁−ＦＩＴＣ対照を細胞懸濁液に１：１０の最終希釈率で添加し、細胞は氷上で４５分間インキュベートした。

フローサイトメトリー解析は、ＰｒｏｆｉｌｅＩＩまたはＥＰＩＣＳ ＸＬ−ＭＣＬフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．、ハイアリーア、フロリダ州）を使用して実施した。１サンプルあたり２万回のイベントをリストモード・データとして収集し、クールターＥＬＩＴＥソフトウエアを使用して解析した。セルソーティングは、２００〜２５０ｍＷで４８８ｎｍの光線を発光するアルゴンレーザーを装備したＦＡＣＳｔａｒＰＬＵＳセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して実施した。細胞選別は、それらの光散乱特性に基づいて規定のリンパ球／芽細胞ウィンドウ内に入った細胞に限定した［４］。ソートゲートを選択するための閾値は、アイソタイプ対照抗体を用いて得た染色レベルに基づいた。細胞は、５％ＦＣＳを補給したＩｓｃｏｖｅの改良Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を含有する試験管内へ収集した。選択した集団の純度は、選別した細胞のアリコートの分析により評価したが、通常は９８％より高かった。

（ｇ）ＢＢ９抗体を用いたＢＭ間質細胞の染色
上記に由来する骨髄間質細胞はＢＢ９ ＭＡｂを用いてin situで染色した。細胞は、染色前に３７℃で一晩、ガラス製８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）中で増殖させた。細胞は、氷上で４５分間、ＢＢ９またはＩｇＧ₁アイソタイプ対照抗体１Ｂ５（どちらもＨＨＦ中で２０μｇ／ｍＬの最終濃度で）を用いて染色し、ＨＨＦを用いて２回洗浄した。特異的に結合した抗体は、暗所の氷上で３０分間、ＨＨＦ中で１：５０の希釈率のＦＩＴＣ複合抗マウスＩｇＧ₁モノクローナル抗体（Ｃａｌｔａｇ）を使用して暴露した。２回の最終洗浄後、細胞はＦＡＣＳ ｆｉｘを用いて固定し、蛍光顕微鏡（オリンパスＢＨ２−ＲＦＣＡ）を用いて観察した。

（ｈ）磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）を使用したＢＭＭＮＣからのＢＢ９⁺細胞の精製
ＢＢ９抗原と共発現する系統特異的抗原の発現を評価するために、ＢＢ９⁺ＢＭＭＮＣを磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によって単離した［２８］。手短には、ＢＭＭＮＣ（０．５〜１×１０⁸cells）を氷上で４５分間かけて０．５ｍＬのＢＢ９抗体（２０μｇ／ｍＬの最終濃度）中に懸濁させた。その後、細胞はＨＨＦ中で２回洗浄し、１／５０の希釈率のビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ₁（Ｃａｌｔａｇ）を含有する０．５ｍＬのＨＨＦ中に４℃で３０分間再懸濁させた。これらの細胞はＭＡＣＳバッファ（１％のＢＳＡ、５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡおよび０．０１％のアジ化ナトリウムを補給した単一強度のＣａ²⁺およびＭｎ²⁺を含まないリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）を含有する）中で３回洗浄し、それに１００μＬのストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ベルギッシュ・グラートバッファ、ドイツ）を添加した９００μＬのＭＡＣＳバッファ中に再懸濁させた。４℃で３０分間インキュベートした後、ＳＡＶ−ＰＥ複合体（１／５０；Ｃａｌｔａｇ）を添加し更に１５分間インキュベートした。細胞はＭＡＣＳバッファ中で２回洗浄し、フローサイトメトリー解析のために小アリコートを除去した。残りの細胞は、製造業者の推奨にしたがって磁気ステンレススチール・ウールカラム（カラム容量１０⁸cells；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）上で分離した。ＢＢ９^-細胞はカラム溶出液として収集したが、ＢＢ９⁺細胞は磁気基質に付着して残留した。ＢＢ９⁺細胞を得るために、カラムを磁石から取り出し、その後ＭＡＣＳバッファを用いて別の試験管内へフラッシュ洗浄した。小サンプルは、各フラクション中の細胞の回収率および純度を試験するためのサイトメトリー解析のためにＢＢ９⁺およびＢＢ９^-細胞集団各々から採取した。

ＭＡＣＳカラムから得たＢＢ９⁺細胞は上記のとおり非結合マウスＩｇＧ₁抗体を含有する過剰な腹水と一緒にインキュベートした。細胞はその後、次のとおりにＦＩＴＣ複合系統マーカー：ＩｇＧ₁ ＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ Ａ／Ｓ、グロストラップ、デンマーク）、ＣＤ７ ＦＩＴＣ（ＢＤＩＳ）、ＣＤＳ ＦＩＴＣ（ＢＤＩＳ）、ＣＤ１０ ＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ）、ＣＤ１９ ＦＩＴＣ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、ＣＤ３３ ＦＩＴＣ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ１４ ＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ）、ＣＤ１５ ＦＩＴＣ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、ＣＤ３４ ＦＩＴＣ（ＢＤＩＳ）、ＣＤ６１ ＦＩＴＣ（ＢＤＩＳ）、グリコホリンＡ ＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ）およびＣＤ７１ ＦＩＴＣ（ＢＤＩＳ）の添加によって４℃で４５分間かけて染色した。細胞はＨＨＦ中で２回洗浄し、ＦＳＣＳ ｆｉｘ中で固定し、フローサイトメトリー解析はＥＰＩＣＳ ＸＬ−ＭＣＬフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ、ヒアルリー、フロリダ州）を使用して実施した。１サンプルあたり２万回のイベントをリストモード・データとして収集し、クールターＥＬＩＴＥソフトウエアを使用して解析した。

（ｉ）造血前駆細胞クローン原性アッセイ
顆粒球マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤血球前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、および多能性コロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）は前述したとおりにアッセイした［２９］。手短には、３５ｍｍ径の培養皿中の０．９％のメチルセルロース、３０％のＦＣＳ、１％のＢＳＡ（フラクションＶ；Ｓｉｇｍａ）、３ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、および５×１０^-5ｍｍｏｌ／Ｌの２−メルカプトエタノールを補給したＩＭＤＭ中で１ｍＬの培養物を３組確立した。コロニーの増殖は、ヒト組み換えインターロイキン３（ＩＬ−３）、ＩＬ−６、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）（すべての因子はＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ボストン、マサチューセッツ州およびＡｍｇｅｎ、サウザンドオークス、カリフォルニア州の好意によって提供された）および４０単位のエリスロポエチン（Ｅｐｒｅｘ；Ｊａｎｓｓｅｎ Ｃｉｌａｇ、オークランド、ニュージーランド州）各１０ｎｇの添加によって刺激した。ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｍｉｘは標準的基準にしたがって第１４日に計数した。全培養は培養皿１枚あたり５００細胞ずつをプレーティングすることにより３回ずつ確認した。

（ｊ）前ＣＦＵの培養
これは、ＣＦＵ−ＧＭの前駆細胞（前ＣＦＵ）の指標としてＣＦＵ−ＧＭの新規生成を測定する、当研究所によって以前に報告された間質細胞フリーのサイトカイン依存性懸濁液培養系［２９］である。アッセイは、ＢＭまたは流動ＰＢのいずれかからのＦＡＣＳによって単離された１０³ ＣＤ３４⁺、ＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺およびＣＤ３４⁺ＢＢ９^-細胞を用いた２４ウェルプレート中での３組の培養１ｍＬ中で行った。各１ｍＬの培養はＩＭＤＭ、３０％のＦＣＳ、１％のＢＳＡ、３ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、５×１０^-5ｍｍｏｌ／Ｌの２−メルカプトエタノールを含んでおり、以下の組み換え成長因子が補給された：ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｇ−ＣＳＦおよびＳＣＦ（各々、１００ｎｇ／ｍＬで）。追加の因子は、同一最終濃度で第７日、更に第１４、２１、２８、３５および４２日に添加し、培養は成長因子を含有する新鮮培地中に１：１０で分割した。培養の１４、２１、２８、３５および４２日後に存在しているＣＦＵ−ＧＭを上記のとおりに計数し、所定の時点での細胞およびＣＦＵ−ＧＭの累積数は、全培養期間にわたる培養に対する累積希釈係数を考慮に入れることによって計算した。

（ｋ）ＢＢ９抗原のプロテアーゼ感受性
ＢＢ９によって認識された抗原の性質を調査する目的で、ＢＢ９に結合することが見いだされたヒト造血細胞系は、抗体結合の消失を生じさせたものを同定するためにin vitroで様々なプロテアーゼを用いて処理した。酵素処理に先立ち、細胞はＨＢＳＳ（血清の不在下で）中で洗浄し、その後以下のプロテアーゼを含有する同一培地中において３７℃で１時間、１０⁶cells／ｍＬでインキュベートした：最終濃度２０μｇ／ｍＬのブロメライン、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、プロナーゼ、サーモリシンおよびトリプシン、１００Ｕ／ｍＬのキモパパイン、４ｍｇ／ｍＬのジスパーゼおよび１μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ。パパイン（Ｓｉｎｇｍａ）およびキモパパイン（Ｂｏｏｔｓ、プール、英国）を除くすべての酵素は、ベーリンガーマンハイム（マンハイム、ドイツ）から入手した。プロテアーゼ処理後、細胞はＨＨＦ中で２回洗浄し、上記のとおりに免疫蛍光解析を使用してＢＢ９抗原の発現についてアッセイした。ＵＴ７細胞のキモパパイン処理は、抗原遊離の特異的な性質を評価するために、抗ＣＤ７１（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）および９Ｂ３（抗ＭＨＣクラスＩ抗体）を含む様々な対照抗体を使用して繰り返した。

（ｌ）免疫沈降解析
ＵＴ７細胞はリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中で２回洗浄し、同一バッファ中に１ｍＬ当たり２×１０⁸cellsの割合で再懸濁させた。細胞は、触媒としてラクトペロキシダーゼ［３０］を使用して室温で１５分間、２ｍＣｉ ¹²⁵Ｉにより表面標識し、その後ＰＢＳ中で４回洗浄した。ＵＴ７細胞は、プロテアーゼ阻害剤のＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、ＴＰＣＫ（Ｌ−（トシルアミド−２−フェニル）エチルクロロメチルケトン）、ＴＬＣＫ（１−クロロ−３−トシルアミド−７−アミノ−Ｌ−２−ヘプタノン）およびＮＰＧＢ（ｐ−ニトロフェニル−Ｐ’−グアニジノ−ベンゾエート−ＨＣｌ）（すべてＳｉｇｍａから購入）を含有する１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．５ｍＭのＣａＣｌ₂、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４（ＣＨＡＰＳバッファ）中の１％のＣＨＡＰＳ洗剤（Ｓｉｇｍａ）を用いて１ｍＬ当たり２×１０⁷cellsの最終濃度で、氷上で３０分間かけて溶解させた。核および非溶解細胞物質は１８，０００ｇで２０分間の遠心分離によりペレット化し、溶解液はヒツジ抗マウスＩｇダイナビーズ（Ｄｙｎａｌ）を用いて一晩予備洗浄した。１Ｂ５（アイソタイプ適合ネガティブコントロール）およびＢＢ９を使用した各免疫沈降のために１．５ｍＬの溶解液を使用した。抗体は、１ｍＬのＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡ中、５０μＬ（２×１０⁷）のビーズとともに５０μｇの抗体を使用してＭ４５０ラット抗マウスＩｇＧ₁ダイナビーズへ、一晩予備結合させた。ビーズは、細胞溶解液に添加する前にＰＢＳ／ＢＳＡを用いて２回、ＣＨＡＰＳバッファを用いて１回洗浄した。細胞溶解液およびビーズは４℃で２〜３時間回転させ、その後ダイナルＭＰＣ−６磁石を用いて除去し、ＣＨＡＰＳバッファを用いて３回洗浄し、ゲルサンプルバッファ（０．０６２５ＭのＴｒｉｓ ｐＨ６．８、１０％のグリセロール、２０％のＳＤＳおよび０．００１２５％のブロモフェノールブルー）中で５分間煮沸し、４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でランした。ゲルは８〜１０ｍＡで一晩ランし、メタノール：酢酸：水（５：１：４）中で３０分間固定し、真空下で乾燥させ、ホスホイメージ解析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｃ．、サニーベール、カリフォルニア州）または−７０℃でのオートラジオグラフィーによって評価した。

１． モノクローナル抗体（ＭＡｂ）ＢＢ９はＣＤ３４⁺ ＢＭＭＮＣの小さな小集団に結合する
マウスモノクローナル抗体ＢＢ９は、ヒトＢＭ由来間質細胞の免疫後に生成させ、免疫原との反応性およびＰＢＭＣへの有意な結合の欠如に基づいて初期ハイブリドーマスクリーニングにおいて同定した。蛍光顕微鏡による免疫標識幹細胞の検査により、ＢＢ９発現の繊細な点状パターンが明らかになったが、これは細胞表面に限定されているように見えた。フローサイトメトリー解析により、ＰＢＭＣとの極めて低レベルの反応性が確証されたが、低い前方散乱光および低い垂直散乱光特性を特徴とする成人ヒトＢＭ中の細胞の小さな小集団へのＢＢ９の結合（平均９．９±２．２％；ｎ＝１０）が証明された（図１Ａ）。引き続いてのＢＢ９および抗ＣＤ３４抗体と成人骨髄由来単核球との２カラー免疫蛍光解析により、ＢＢ９がＣＤ３４⁺細胞の小集団へ結合することが明らかになった（平均２２．４；範囲８．３〜４０．８％、ｎ＝１０）。重要なことに、ＢＢ９染色の強度は最高ＣＤ３４抗原密度を示した細胞上で最大であった（図１Ｂ）。更に、ＣＤ３４^-細胞の小集団はＢＢ９を発現したが、これらの細胞上でのＢＢ９染色の強度は一貫してＣＤ３４⁺細胞により発現した強度より低かった。

同様にＢＢ９に結合した他の（ＣＤ３４^-）細胞の同一性を決定するために、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によってＢＢ９⁺細胞をＢＭＭＮＣから単離し、その後特定造血系統に対して特異的である１区画のＭＡｂの各々を用いて染色した。表１に示したように、ＢＢ９によって同定されたＢＭＭＮＣの約３分の１（３９．８％±２０．５％；ｎ＝３）は、それらのＣＤ１９の発現によって証明されたようにＢリンパ球である。有意な比率のＢＢ９⁺細胞もまたＴリンパ球抗原ＣＤ７（１８．８％±７．６％；ｎ＝３）、骨髄性マーカーＣＤ３３（１０．６％±６．１％；ｎ＝３）を共発現し、更に細胞の１１．７％は抗ＣＤ７１抗体を用いて染色された。もっと低い比率（細胞の１〜６％）はＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ６１およびグリコホリンＡを共発現した。

ＢＢ９⁺細胞は、上記のとおりにＭＡＣＳを使用してＢＭＭＮＣから精製した。細胞は、ＢＢ９を検出するためには抗マウスＩｇＧ₁−ビオチンおよびＳＡＶ−ＰＥを使用して、他の系統抗原についてはＦＩＴＣへ直接結合した抗体を用いて染色した。これらのマーカーとＢＢ９との共発現は、クールターＥｌｉｔｅソフトウエアを用いた解析を使用して可視化した。各サンプルについて２０，０００イベントを解析した。データは、各系統抗原を共発現するＢＢ９⁺細胞の比率（％、３つの独立ＢＭサンプルの平均値±ＳＥＭ）を表している。

ＢＢ９によって同定されたＣＤ３４⁺細胞の性質を調べる目的で、図２に示したソート領域にしたがってＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺およびＣＤ３４⁺ＢＢ９^-小集団を単離するために２カラーＦＡＣＳを使用した。各小集団を標準半固体培養中でのクローン原性造血前駆細胞の含量についてアッセイした。８回の実験からのデータ（表２に要約した）は、骨髄前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）がＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺およびＣＤ３４⁺ＢＢ９^-小集団のどちらにも存在することを証明している。これらの２つの小集団間、またはいずれかの小集団と未分画ＣＤ３４⁺細胞との間（ＣＤ３４⁺対ＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺ ｐ＝０．４４；ＣＤ３４⁺対ＣＤ３４⁺ＢＢ９^- ｐ＝０．８７）でＣＦＵ−ＧＭの発現率における有意差（ｐ＝０．６３）は明らかにならなかった。同様に、赤血球前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）もまた両方の小集団中で検出されたが、全ＣＤ３４⁺細胞（ｐ＝０．０３、対ｔ−検定）またはＣＤ３４⁺ＢＢ９^-フラクション（ｐ＝０．０１）のどちらと比較してもＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺フラクション内のＢＦＵ−Ｅの発現率が相対的に低かった。

正常骨髄ドナー（ｎ＝８）または流動末梢血サンプル（ｎ＝６、ＨＤＣ＋Ｇ−ＣＳＦからの３例およびＨＤＣ＋ＧＭ−ＣＳＦからの３例）からのＣＤ３４⁺細胞をＢＢ９⁺およびＢＢ９^-サブフラクションに分離した。細胞は、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦおよびＥｐｏを含有するメチルセルロース培養中において３７℃／５％ ＣＯ₂で１４日間プレーティングした。コロニーをin situで同定し、それらのタイプを次のように略記した：ＣＦＵ−ＧＭ＝顆粒球および／またはマクロファージ；ＢＦＵ−Ｅ＝赤血球系；ＣＦＵ−Ｍｉｘ＝赤血球系および骨髄細胞および／または巨核球を含有する混合コロニー。数値データは、プレーティングした各表現型の１，０００cells当たりのコロニー平均数（±標準偏差）を表している。

多能性前駆細胞（ＣＰＵ−Ｍｉｘ）もまたＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺およびＣＤ３４⁺ＢＢ９^-フラクションの両方で同定されたが、いずれの小集団においてもそれらの発現率に関して一貫した傾向は観察されなかった（表２）。ＣＤ３４⁺集団内のＢＢ９⁺およびＢＢ９^-小集団の発現率について修正すると、ＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺小集団中のＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−ＥおよびＣＰＵ−Ｍｉｘの回収率は各々３３．８±６．２％、１３．８±３．９％および２４．５±１２．８％であった。

２． 階層的に初期のＨＰＣ（造血前駆細胞）はＢＢＳによって同定される抗原を発現する
階層的に初期のＨＳＣ（造血幹細胞）上でのＢＢ９の発現を調査するために、一連の３カラー免疫標識方法を実施した。図２のパネルＢに示したように、ＢＢ９抗原の発現はＣＤ３８の発現と逆相関しており、最高レベルはＣＤ３４⁺ＣＤ３８^-細胞上で、最低レベルはＣＤ３４⁺ＣＤ３８⁺集団上でみられた。更に、図２のパネルＣに示したように、ＢＢ９の結合はＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）の結合と有意な程度に共分布する；ＣＤ３４⁺ＣＤ９０⁺はＬＴＣ−ＩＣの大部分および致命的に照射された免疫不全マウスに移植する能力を含む細胞を含有することが以前に証明されている表現型を表している［７］。低Ｒｈ１２３残留を示すＣＤ３４⁺細胞（ＣＤ３４⁺Ｒｈ１２３^dull）は実質的に全部がＢＢ９⁺であり、更に、ＣＤ３４⁺Ｒｈ１２３^bright細胞よりも顕著に高レベルのＢＢ９抗原発現を示す（図２、パネルＡ）。ＢＢ９抗原を共発現しているＣＤ３４⁺細胞の細胞周期状態を調査するために、Ｋｉ６７ ＭＡｂと組み合わせてＢＭＭＮＣの３カラーフローサイトメトリー解析を実施した。Ｋｉ６７は増殖中の細胞の細胞周期のＧ₁、Ｓ、Ｇ₂およびＭ期にのみ存在するが、Ｇ₀では存在しない核抗原を検出する［３１］。図３Ａに示したように、Ｋｉ６７はＣＤ３４⁺細胞のほぼ５５％に結合する。Ｋｉ６７に結合できない残りのＣＤ３４⁺細胞（図３Ａの領域Ｒ１）はＧ₀細胞と定義される。リストモード・データファイルの解析により、ＣＤ３４⁺Ｋｉ６７⁺細胞（Ｒ２内）およびＣＤ３４⁺Ｋｉ６７^-細胞（Ｒ１内）上でのＢＢ９発現パターンの試験が可能になった。図３のパネルＢは、非増殖性造血前駆細胞（ＣＤ３４⁺Ｋｉ６７^-；図３ＡのＲ１内）がＢＢ９発現の最高レベルを示すことを示しおり、７９％がＢＢ９⁺であると考えられる。これとは対照的に、増殖性細胞（Ｋｉ６７⁺、図３ＡのＲ２内）はＢＢ９の低レベルの発現を示している（図３Ｃ）。

これらをまとめると、このためこれらのデータはＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺細胞が以前には初期ヒトＨＰＣに帰せられていた多数の表現型特性を示すことを証明している。階層的に初期のＨＰＣ（前ＣＦＵ）上でのＢＢ９抗原の発現を詳細に調査するために、ＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺およびＣＤ３４⁺ＢＢ９^- ＢＭＭＮＣ小集団を、前述したように間質細胞を含まないサイトカイン依存性懸濁液中で造血を開始かつ維持する能力についてアッセイした。ソーティングしたフラクションをＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦおよびＳＣＦ（３６ＧＳ）の組み合わせ中で培養し［２９］、ＣＦＵ−ＧＭおよび成熟骨髄細胞の産生について６週間にわたり１週間間隔でアッセイした。図４は、１０回の実験からのデータの要約である。ＣＦＵ−ＧＭの産生（パネルＡ）は、第３５日を除いて測定した全時点（ｐ値の範囲０．０００４〜０．００８）でＣＤ３４⁺ＢＢ９^-小集団からよりＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺からの方が有意に多かった。培養の停止時（第４２日）に、１０³ ＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺細胞から生成したＣＦＵ−ＧＭの平均数は２．２×１０⁵±１．２×１０⁵であったが、同一数のＣＤ３４⁺ＢＢ９^-細胞は平均７，８１２個のコロニーしか産生しなかった。これを踏まえると、成熟骨髄細胞の対応する産生量は、全時点で第４２日に平均２．５×１０⁸cellsの生成をもたらしたＢＢ９⁺小集団からより多かった（ｐ値の範囲０．０２７〜０．５５）。このためこれらのデータは、これらの培養条件下で造血を開始かつ維持する能力を含む初期ＨＰＣはＭＡｂ ＢＢ９によって同定されたＣＤ３４⁺細胞の小集団に限定されることを示している。

３． ＢＢ９によって同定された抗原は流動末梢血中でＣＤ３４⁺細胞によって高レベルで発現する
ＣＤ３４⁺細胞へのＢＢ９の結合パターンを定常状態血液中および流動末梢血（ＭＰＢ）中で解析した。これらの試験は、正常ドナー、または高用量シクロホスファミド（ＨＤＣ）およびＧ−ＣＳＦまたはＨＤＣ＋ＧＭ−ＣＳＦのどちらかの投与後に血液前駆細胞動員が誘発された患者から入手したサンプルを使用して実施した。定常状態血液の解析により、ＢＢ９がＣＤ３４⁺細胞の約５％（５．０８％±０．５８；ｎ＝４）に結合することが明らかになったが、これは定常状態ＢＭ ＣＤ３４⁺細胞について以前に観察されたものより有意に低い比率であった（ｐ＝０．０２６）。これとは対照的に、流動末梢血中ではより高い比率のＣＤ３４⁺細胞がＢＢ９に結合することが見いだされた（図５）。ＨＤＣ＋Ｇ−ＣＳＦにより引き出されたＣＤ３４⁺細胞の４８．４％±４．３（ｎ＝３）およびＨＤＣ＋ＧＭ−ＣＳＦの組み合わせによって流動したＣＤ３４⁺細胞の５４．７％±２．９（ｎ＝３）は、定常状態ＢＭから単離したＣＤ３４⁺集団で観察された比率（表３を参照）の約２倍、そして定常状態血液中に存在する比率（ｐ＝０．００１３）の４〜５倍有意に高いＢＢ９抗原を示した。更に、流動ＣＤ３４⁺細胞の両集団上のＢＢ９抗原密度は定常状態末梢血中のＣＤ３４⁺細胞上での抗原密度より高かった。

サンプルは、抗ＣＤ３４ Ｍａｂ ４３Ａ１（ＩｇＧ₃）およびＢＢ９（ＩｇＧ₁）を用いて、またはアイソタイプ適合対照Ｍａｂを用いて平行に標識し、その後マウスＩｇＧ₃（ＦＩＴＣへ結合）およびマウスＩｇＧ₁（ＰＥへ結合）に対するアイソタイプ特異的抗体を用いた標識化により視認した。少なくとも２０，０００cellsからのデータを獲得し、クールターＥＬＩＴＥソフトウエアを使用して解析した。データは、各ドナー起源から単離した細胞から指示した抗原を発現する細胞の比率（％、平均値±ＳＥＭ）を示している（高用量シクロホスファミド［ＨＤＣ］＋Ｇ−ＣＳＦまたは＋ＧＭ−ＣＳＦの投与後の流動血；正常成人骨髄；または定常状態成人末梢血）。

６例の流動血サンプル各々からＦＡＣＳによって単離したＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺およびＣＤ３４⁺ＢＢ９⁻小集団について実施したクローン原性アッセイは、ＢＭ中で所見されたものに質的に類似するＢＢ９⁺およびＢＢ９^-フラクション内へのＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅの分配を示した（表２）。ＣＦＵ−ＧＭは、ＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺およびＣＤ３４⁺ＢＢ９^-フラクション内の両方において類似の発現が所見された。しかし、ＢＭサンプルと一致して、ＢＦＵ−ＥはＣＤ３４⁺ＢＢ９^-細胞フラクションと比較してＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺細胞フラクション中では有意に欠乏していた（ｐ＝０．０３３）。ＨＤＣ＋Ｇ−ＣＳＦサンプルについては、ＣＦＵ−ＧＭの４９．４％±１２．８（範囲２５．８〜７０．０％）およびＢＦＵ−Ｅの２１．３％±１３．２（範囲０〜４５．４％）がＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺小集団中で回収された。同様に、３例のＨＤＣ＋ＧＭ−ＣＳＦサンプルについて、ＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺小集団は平均して６５．９％±１．９（範囲６２．２〜６８．０％）のＣＦＵ−ＧＭおよび３６．６％±９．３（範囲１９．５〜５１．３％）のＢＦＵ−Ｅを含有していた。

ＢＭ細胞について示したように、ＭＰＢから単離したＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺およびＣＤ３４⁺ＢＢ９^-細胞の前ＣＦＵアッセイは全測定時点で、ＢＢ９^-小集団に比較してＢＢ９⁺からのＣＦＵ−ＧＭ（パネルＡ、図６）および成熟骨髄細胞（パネルＢ、図６）の両方のより多い生成を示した。培養の停止時（第３５日）に、１０³個のＣＤ３４⁺ＢＢ９^-細胞から生成したＣＦＵ−ＧＭの平均数は１２，４９７±７，７６４であったが、同一数のＣＤ３４⁺ＢＢ９^-細胞は平均１１９±８２個のコロニーしか産生しなかった。成熟骨髄細胞の対応する産生は、全時点でＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺小集団においてより多く、ＣＤ３４⁺ＢＢ９^-細胞からの１．２×１０⁶と比較して第３５日に平均７．５×１０⁶cellsの生成をもたらした（図６）。このためこれらのデータは、ＢＭ中と同様に流動ＰＢ中では、初期ＨＰＣがＭＡｂ ＢＢ９によって同定されたＣＤ３４⁺細胞の小集団に限定されることを証明している。

４． ＢＢ９は分子量１６０ｋＤａのキモパパイン感受性糖タンパク質を同定する。
様々な造血系統およびその他の細胞系を代表する白血球細胞系へのＢＢ９の結合についても調査した。図示したように（表３）、ＢＢ９はＨＬ６０、Ｋ５６２、Ｍｅｇ−０１、ＵＴ７、ＭＧ６３および皮膚線維芽細胞を含む数種の細胞系に高レベルで結合した。ＫＧ１、ＲＣ２ＡおよびＭＣＦ−７細胞系上およびＢ細胞系Ｎａｌｍ−６上でＢＢ９抗原の低〜中間の発現が観察されたが、ＫＧ１ａ、ＭＯ７ｅおよびＴ細胞系Ｊｕｒｋａｔ、Ｈｕｔ ７８、ＧＥＭ ＶＬＢ−１００およびＭｏｌｔ−４はすべてネガティブであった。ＢＢ９抗原の最高レベルの発現はＧＭ−ＣＳＦ依存性ＵＴ７細胞上で一貫して観察されたので、この抗原の性質を調査するためにその後の全試験ではこの細胞系を使用した。ＢＢ９がタンパク質エピトープを同定するかどうかを決定するために、フローサイトメトリーによって、その後のＢＢ９の結合を防止するものを同定するために様々なプロテアーゼを用いてＵＴ７細胞を処理した。ブロメライン、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、プロナーゼ、プロテイナーゼＫ、トリプシンおよびサーモリシンはすべて本アッセイで効果がなかったが、キモパパインは本アッセイでポジティブコントロールとして使用したＣＤ７１について見られたように（データは示していない）、ＢＢ９による特異的標識を完全に阻害した。更に、ＵＴ７細胞からＣＤ５９およびＣＤ９０を効率的に除去しながらのＰＩ−ＰＬＣによる処理（データは示していない）は、ＢＢ９の結合を変化させず、これはＢＢ９エピトープがＧＰＩ結合糖タンパク質上で発現しないことを証明していた。最後に、ＢＢ９は還元条件下で１６０ｋＤａの見掛けの分子量を有する表面¹²⁵Ｉ標識ＵＴ７細胞から糖タンパク質を免疫沈降させた（図７）。

成熟造血細胞上では広範囲の様々な細胞表面分子が同定されているが、ヒト造血組織中の造血幹細胞および造血前駆細胞に限定されている表面抗原を同定することははるかに困難であることが明らかになっている。これは、一部には免疫およびスクリーニングのために利用できるＨＰＣ（造血前駆細胞）の数が限定されることのような実際的な制約のためと、しかし同等に重要には、広範囲の様々な表面抗原が初期および成熟両方の造血細胞上で共発現することが明確に実証されていることの両方に起因し得る。様々な表面抗原が免役するＨＰＣ集団上に存在すると、結果として免疫応答を支配し、そのためＨＰＣに限定した抗原の同定をほとんど見込みがないものとさせる。これらの問題を回避することを試みて、我々は成熟造血細胞が共有する多数の抗原は欠如するがＣＤ３４［１２、１３］、ＣＤ９０［１４］、ＣＤ１６４［１５］およびマウス中ではＳｃａ−１［１６］などの造血幹細胞および造血前駆細胞上で発現する多数の細胞表面抗原を備えている免疫のための豊富な細胞起源である骨髄間質細胞を用いて、マウスを免役することを選択した。このため我々は、骨髄間質細胞を用いた免疫はこれらの細胞および初期ＨＰＣによって共発現した追加の抗原に対する抗体を導き出すことができるという仮説を立て、この仮説を実現するためにモノクローナル抗体ＢＢ９を開発した。

我々は、ＢＢ９が約１０％の骨髄単核球に結合し、その６０％はＴまたはＢリンパ球限定抗原を示し、約２０％はＣＤ３４を共発現することを証明した。表現型は様々ではあるが、全体としてのＢＢ９⁺集団は、低〜検出不能なレベルのＣＤ７１発現および細胞周期のＧ₁、Ｓ、Ｇ₂およびＭ期中でのみ存在してＧ₀期には存在しない核抗原を検出するＫｉ６７を用いた免疫染色の欠如によって証明されるように非増殖性である。重要なことに、ＢＭ ＣＤ３４⁺集団内でＢＢ９抗原を示すのはたった２０％の細胞にすぎないが、この小集団内にはＣＤ３８の欠如［６］、Ｒｈ１２３の低残留［３２］およびＣＤ９０の発現［８］によって同定されるように候補造血幹細胞表現型を含む大多数の細胞が含まれる。これらのデータに一致して、機能的アッセイは更に、サイトカイン依存性の間質細胞を含まない培養中で造血を開始かつ維持する能力を含む初期ＨＰＣがＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺小集団へ限定されることを証明した。２種のレジメンによって流動化血液幹細胞のサンプルを用いて類似の観察を行ったが、これはＢＭ中で見られた初期ＨＰＣに対するＢＢ９の特異性が流動末梢血に及ぶことを示唆している。注目すべきことに、ＭＰＢ中のＣＤ３４⁺細胞は定常状態ＰＢ中のＢＢ９⁺より有意に高い比率で所見されたが、これは調査した２種のレジメンがＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺細胞を特異的に動員することを示唆した。類似のことは、同様にＢＭ中よりも流動血中で有意に高い比率のＣＤ３４⁺細胞上で発現するＣＤ９０に関して以前に観察されている。

ＢＢ９によって同定されたエピトープは、ＰＩ−ＰＬＣによってもキモパパインを除く様々なプロテアーゼを用いた処理後にも遊離しなかった１６０ｋＤａ細胞表面糖タンパク質上に存在することが証明された。ＢＢ９抗原の計算分子量は、初期ヒトＨＰＣによって発現することが以前に証明されている［３４］１７０ｋＤａ糖タンパク質であるＭＤＲ−１の分子量と類似である。しかし、ＢＢ９の末梢血白血球（ＰＢＬ）との反応性の欠如は、ＰＢＬの４０〜６５％によって発現するＭＤＲ−１の分子量から区別する。更に、そのビンブラスチン耐性表現型と一致して、Ｔリンパ球系ＶＬＢ−１００［３６］はＭＤＲ−１の高レベルの発現を示すが、ＢＢ９に検出可能なレベルでは結合しないことが証明された。このためこれらのデータはＢＢ９がＭＤＲ−１を同定しないことを示唆している。ＢＢ９によって同定される抗原について初期ヒトＨＰＣ上に限定される、表面上類似の発現パターンを含むその他の細胞表面糖タンパク質には、ＣＤ９０［８］、ＡＣ１３３［９，１１］、Ｆｌｔ３／ｆｌｋ−２（ＣＤ１３５）［３７］、Ｔｉｅ−１［３８］、ＫＤＲ［３９］、ＴＥＫ［１１］が含まれる。しかし、これらは分子量における差（Ｔｈｙ−１［７，８］、ＡＣ１３３［４０］、Ｔｉｅ−１［４３］、ＴＥＫ［４１］、ＫＤＲ［４２］）および初期造血細胞［３７，４４］および造血細胞［３８］の両方の上での発現パターンを含む数種の基準に基づくと、ＢＢ９抗原と一致するとは考えにくい。

造血組織内、すなわち初期造血前駆細胞および骨髄間質細胞内のＢＢ９抗原の限定された分布は興味深く、発現パターンは更にまたＣＤ３４［１２，１３］、ＣＤ９０［１４］、ＣＤ１６４［１５］およびＳｃａ−１［１６］を含む数種の他の抗原によっても示された。これらの糖タンパク質中少なくとも３種には接着特性があることを前提とすると［４５−４８］、ＢＢ９が接着分子としても機能できるのではないかと推測することは魅力的である。初期の実験では、ＢＢ９が脾臓、胸腺および扁桃腺のような造血組織中の血管内皮細胞にも結合することを証明しており、提案された接着機能とは矛盾しない所見である。しかし、ＭＡｂ ＢＢ９はin vitroでのＣＤ３４⁺細胞の骨髄間質細胞への接着を混乱させない（ＨＲ、ＰＪＳ；未公表の観察所見）。造血系中でのＢＢ９抗原が果たす役割の疑問に対する答えは、糖タンパク質の詳細な生化学的特性付けおよび最終的には抗原に対応するｃＤＮＡの単離の両方から利益を得られる。このような試験は現在進行中である。

ＢＢ９発現を評価するために間接免疫蛍光法を使用した。細胞は２０μｇ／ｍＬのＢＢ９ ＭＡｂと４５分間およびＰＥ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ₁二次抗体とインキュベートした。試験した各細胞系についてクールターＸＬフローサイトメーター上で最低１０，０００イベントを獲得し、ＢＢ９ポジティブ細胞の比率を次のとおりに定量した：−＝０−２％、＋／−＝２−５％、＋＝５−３５％、＋＋＝３５−８０％、＋＋＋＝８０−１００％．

要約すると、我々は成人ＢＭおよび流動血内で骨髄間質細胞および初期ヒトＨＰＣによって共発現した細胞表面糖タンパク質に対する特性を含むモノクローナル抗体のＢＢ９について記載した。臍帯血、胎児肝内および胚性造血中のＢＢ９抗原の発現は現在調査中である。これに関連してＢＢ９が幹細胞活性を含むＣＤ３４-細胞への結合を示す可能性は特に興味深い。

実施例２
ＢＢ９抗体によって同定された単離細胞および細胞の移植。
単核球は、標準的方法によってＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（密度１．０７７ｇ／ｍＬ）上での密度沈降によってヒト臍帯血のサンプルから単離した。免疫標識の前に、臍帯血単核球（ＣＢＭＮＣ）はＦｃレセプターを遮断するために氷上で３０分間、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ；Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および１００μｇ／ｍＬの凝集正常ヒトガンマグロブリン（Ｓａｎｄｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を補給したＰＢＳ中でインキュベートした。その後、細胞は個別抗体または同時にどちらもＰＢＳ−ＨＳＡ中の最終濃度２０μｇ／ｍＬへ希釈した抗ＣＤ３４ ＭＡｂ ４３Ａ１（マウスＩｇＧ₃；Ｔuｂｉｎｇｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈ−Ｊ． Ｂuｈｒｉｎｇ博士の好意による寄贈）および抗体ＢＢ９（マウスＩｇＧ₁）の組み合わせを用いてのどちらかで標識した。追加のサンプルは、単独または適切な４３Ａ１とＢＢ９抗体の様々な組み合わせのどちらかでアイソタイプ適合非結合対照ＩｇＧ₃（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、バーミンガム、アラバマ州）またはＩｇＧ₁（アデレード大学微生物学部のＧｒａｈａｍ Ｍａｙｅｒｈｏｆｅｒ博士の好意により提供されたＭａｂ １Ｂ５、抗ジアルジア）抗体を用いて平行染色した。すべての抗体のインキュベーションは氷上で４５分間実施し、その後ですべての場合に４℃の過剰なＰＢＳ−ＨＳＡ中で２回洗浄した。特異的に結合したモノクローナル抗体は、適宜に滴定したマウス−ＩｇＧ₁（フィコエリトリンに結合、ＰＥ）およびマウスＩｇＧ₃（ＦＩＴＣに結合、どちらもＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；バーミンガム、アラバマ州、米国）に対するアイソタイプ特異的ヤギ抗体の組み合わせと共にインキュベーションを行った。ＰＢＳ−ＨＳＡ中で更に２回洗浄した後、細胞はＦＡＣＳのために低温ＰＢＳ−ＨＳＡ中の約１０⁷cells／ｍＬで懸濁させた。

細胞は、指示したゲートにしたがってＣＤ３４⁺、ＣＤ３４⁺／ＢＢ９⁺およびＣＤ３４⁺／ＢＢ９^-フラクションに選別した。選別した細胞は、担体細胞としての１０⁷照射ＣＤ３４枯渇ＣＢＭＮＣと一緒に、マウス１匹当たり５０〜１００，０００cellsの線量で照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（４００ｃＧｙ）に移植した。移植については、移植６週間後に、アイソタイプＩｇＧ₁−ＰＥ、ＣＤ１１ｂ−ＰＥ、ＣＤ１９−ＰＥまたはＣＤ３４−ＰＥ（全試薬はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから）いずれかとの組み合わせでヒト特異的抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣを用い、移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスからの骨髄および末梢血のフローサイトメトリー解析（図８）によって評価した。結果は下記の表５に要約した。

SEQUENCE LISTING

<110> The Peter MacCallum Cancer Institute
Simmons, Paul J

<120> Identification and Isolation of Somatic Stem Cells and Uses Thereof

<130> 649197

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence

<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(10)
<223>

<400> 1

Leu Phe Gln Glu Leu Gln Pro Leu Tyr Leu
1 5 10


<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence

<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(8)
<223>

<400> 2

Glu Ala Asp Asp Phe Phe Thr Ser
1 5

最後に、ここに説明した本発明の精神から逸脱することなく、様々な他の変形および／または変更を加えることができることが理解されよう。

図１は、正常ヒト骨髄上のＣＤ３４およびＢＢ９の発現を示した図である。パネルＡは、ＢＭＭＮＣ上の垂直光散乱（側方散乱）についてのＢＢ９の発現を描出している。長方形の領域は、ＢＢ９⁺であって低い側方散乱を示している細胞を取り囲んでいる。パネルＢは、ＣＤ３４およびＢＢ９の発現を示す。ＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺（右上の４分の１区）およびＣＤ３４⁺ＢＢ９^-（右下の４分の１区）を規定する長方形の領域は、クローン原性アッセイおよび前ＣＦＵアッセイに使用するためＦＡＣＳによって細胞を単離するために使用された領域の典型であった。 図２は、ＢＢ９が初期造血前駆細胞へ優先的に結合することを示した図である。ＢＭ由来ＣＤ３４⁺細胞上へのＢＢ９の結合と比較した、ＲＨ１２３残留（パネルＡ）、ＣＤ３８（パネルＢ）およびＣＤ９０（Ｔｈｙ−１：パネルＣ）発現の３カラーフローサイトメトリー解析。最高レベルのＢＢ９抗原発現は、ＣＤ３４⁺ ＢＭＭＮＣ上に存在しており、これはＣＤ９０を共発現し、低から検出不能なＣＤ３８発現を示し、ＲＨ１２３^dullである。各プロットは、リストモード・データとして収集された少なくとも１０⁴のＣＤ３４⁺イベントから生成した。 図３は、ＢＢ９がヒト成人ＢＭ内のＣＤ３４⁺集団中で静止（Ｇ₀）細胞を同定することを示した図である。Ｋｉ６７、ＣＤ３４およびＢＢ９発現の３カラーフローサイトメトリー解析を成人ＢＭについて実施した。パネルＡは、ＢＭＭＮＣのＫｉ６７およびＣＤ３４発現を示す。領域１（Ｒ１）は、低／ネガティブＫｉ６７発現を示すＣＤ３４⁺細胞を同定するが、Ｒ２は高Ｋｉ６７を示すＣＤ３４⁺細胞を同定する。パネルＢは、Ｒ１によって規定された細胞によるＢＢ９の発現を示し（Ｋｉ６７低：静止細胞）、パネルＣはＫｉ６７ポジティブ（増殖）細胞のＢＢ９発現を示す。 図３は、ＢＢ９がヒト成人ＢＭ内のＣＤ３４⁺集団中で静止（Ｇ₀）細胞を同定することを示した図である。Ｋｉ６７、ＣＤ３４およびＢＢ９発現の３カラーフローサイトメトリー解析を成人ＢＭについて実施した。パネルＡは、ＢＭＭＮＣのＫｉ６７およびＣＤ３４発現を示す。領域１（Ｒ１）は、低／ネガティブＫｉ６７発現を示すＣＤ３４⁺細胞を同定するが、Ｒ２は高Ｋｉ６７を示すＣＤ３４⁺細胞を同定する。パネルＢは、Ｒ１によって規定された細胞によるＢＢ９の発現を示し（Ｋｉ６７低：静止細胞）、パネルＣはＫｉ６７ポジティブ（増殖）細胞のＢＢ９発現を示す。 図４は、前ＣＦＵ培養中のＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺およびＣＤ３４⁺ＢＢ９^-ＢＭ細胞からのＣＦＵ−ＧＭおよび有核細胞生成を示した図である。ＣＦＵ−ＧＭ（パネルＡ）および有核細胞（パネルＢ）ならびに４種のＨＧＦ（ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦおよびＧ−ＳＣＦ）を用いて刺激した前ＣＦＵ培養中の１０００個のＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺またはＣＤ３４⁺ＢＢ９^-ＢＭ細胞からの生成。第１４日およびその後は１週間毎の間隔で、これらの培養物は１０分割中の１つに分けられ、新鮮培地およびＨＧＦが再供給された。相違するＢＭ源を用いた１０回の個別実験からの平均値および標準誤差を提示した。 図５は、定常状態および流動末梢血球上でのＣＤ３４およびＢＢ９の発現を示した図である。定常状態造血に相当する健常人ドナーからの末梢血単核球（パネルＡおよびＢ）、および高用量シクロホスファミン（ＨＤＣ）＋Ｇ−ＣＳＦ（パネルＣ）またはＨＤＣ＋ＧＭ−ＣＳＦ（パネルＤ）を用いた患者からの流動末梢血単核球をＣＤ３４およびＢＢ９に対する抗体を用いて免疫標識した。各パネルはＣＤ３４（水平軸）およびＢＢ９（垂直軸）の発現を示しており、各４分の１区内の数は各４分の１区内の細胞の比率を表している。パネルＢ内に示したドットプロットは、定常状態血液からのＣＤ３４⁺細胞についてのＣＤ３４およびＢＢ９発現を示す。これらのデータは、相違する細胞源からの少なくとも４サンプルを代表するデータである。 図６は、前ＣＦＵ培養中の流動ＰＢ ＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺およびＣＤ３４⁺ＢＢ９^-細胞からのＣＦＵ−ＧＭおよび有核細胞生成を示した図である。パネルＡおよびＢは、各々４種のＨＧＦ（ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦおよびＧ−ＳＣＦ）を用いて刺激した前ＣＦＵ培養中の１０００個のＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺またはＣＤ３４⁺ＢＢ９^-ＢＭ細胞からのＣＦＵ−ＧＭおよび有核細胞の生成を示している。第１４日およびその後は１週間毎の間隔で、これらの培養は１０分割中の１つに分けられ、新鮮培地およびＨＧＦが再供給された。各時点に、ＨＤＣ＋ＧＭ−ＣＳＦを用いて流動した３例およびＨＤＣ＋Ｇ−ＣＳＦを用いて流動した３例の、患者６例からの結合データについての平均値および標準誤差を提示した。 図７は、ＢＢ９が１６０ｋＤａのタンパク質を同定しているのを示した図である。表面¹²⁵Ｉ標識ＵＴ７細胞の免疫沈降解析。レーン１、ネガティブコントロール抗体。レーン２、ＢＢ９；ＢＢ９は１６０ｋＤａのタンパク質を免疫沈降させた。分子量マーカーの位置は左側に示した。 図８は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植されたＣＤ３４⁺ＢＢ９⁺細胞を示した図である。

配列表

Claims (21)

1. 幹細胞を同定する方法であって：
   幹細胞を含む細胞サンプルを提供する工程；
   細胞上のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）またはそのフラグメントの存在を検出する工程；
   ＳＴＲＯ−１、ＳＨ２、ＳＨ３及びＳＨ４、サイトケラチン１４、α−６インテグリン（ＣＤ４９Ｆ）およびｃ−ｋｉｔを含む群から選択される少なくとも一つの幹細胞特異的マーカーの存在を検出する工程；
   および
   ＡＣＥまたはそのフラグメントおよび幹細胞特異的マーカーを有する幹細胞を同定する工程、
   を含む方法。
2. ＡＣＥが、配列ＬＦＱＥＬＱＰＬＹＬ（配列番号１）を有するペプチドの存在によって検出される、請求項１記載の方法。
3. ＡＣＥが、 配列ＥＡＤＤＦＦＴＳ（配列番号２）を有するペプチドの存在によって検出される、請求項１記載の方法。
4. ＡＣＥが、配列番号１および配列番号２の配列を有するペプチドの存在によって検出される、請求項１記載の方法。
5. 前記幹細胞が造血幹細胞である、請求項１から４いずれか１項記載の方法。
6. 前記幹細胞が間葉幹細胞である、請求項１から４いずれか１項記載の方法。
7. 前記幹細胞がケラチノサイト幹細胞である、請求項１から４いずれか１項記載の方法。
8. ＡＣＥの検出が、ＡＣＥまたはそのフラグメントに対する抗体を使用して実施される、請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
9. 前記抗体が抗体ＢＢ９である、請求項８記載の方法。
10. 幹細胞豊富な細胞集団を得るための方法であって：
    幹細胞を含む細胞集団を提供する工程；および
    前記細胞上のＡＣＥまたはフラグメントおよび前記細胞上のＳＴＲＯ−１、ＳＨ２、ＳＨ３及びＳＨ４、サイトケラチン１４、α−６インテグリン（ＣＤ４９Ｆ）およびｃ−ｋｉｔを含む群から選択される少なくとも一つの幹細胞特異的マーカー
    の存在によって同定される細胞を選択する工程；
    を含む方法。
11. 幹細胞を単離する方法であって：
    請求項１０に記載の方法によって細胞集団を提供する工程であって、前記方法が、ＡＣＥ及び幹細胞特異的マーカーの存在によって同定されたそれらの細胞を単離する追加の工程を含む工程；
    を含む方法。
12. ＡＣＥが、配列番号１および／または配列番号２の配列を有するペプチドの存在によって検出される、請求項１０または１１記載の方法。
13. ＡＣＥの存在が、ＡＣＥまたはそのフラグメントに対する抗体によって検出される、請求項１０から１２のいずれか１項記載の方法。
14. 抗体が、抗体ＢＢ９である、請求項１３記載の方法。
15. 幹細胞が、造血幹細胞である請求項１０から１４のいずれか１項記載の方法。
16. 幹細胞が、間葉幹細胞である、請求項１０から１４のいずれか１項記載の方法。
17. 幹細胞が、ケラチノサイト幹細胞である、請求項１０から１４のいずれか１項記載の方法。
18. 請求項１０および１２から１７のいずれか１項記載の方法によって調製される、幹細胞豊富化集団であって、前記細胞集団が、細胞上にＡＣＥまたはフラグメントおよび前記細胞上にＳＴＲＯ−１、ＳＨ２、ＳＨ３及びＳＨ４、サイトケラチン１４、α−６インテグリン（ＣＤ４９Ｆ）およびｃ−ｋｉｔを含む群から選択される少なくとも一つの幹細胞特異的マーカーを発現する、幹細胞豊富化集団。
19. 請求項１１から１７のいずれか１項記載の方法によって調製された幹細胞であって、前記細胞が、細胞上にＡＣＥまたはフラグメントおよび前記細胞上にＳＴＲＯ−１、ＳＨ２、ＳＨ３及びＳＨ４、サイトケラチン１４、α−６インテグリン（ＣＤ４９Ｆ）およびｃ−ｋｉｔを含む群から選択される少なくとも一つの幹細胞特異的マーカーを発現する、幹細胞。
20. 患者における造血細胞、間葉細胞またはケラチノサイト関連症状の処置における使用のための請求項１８記載の幹細胞豊富化集団を含む組成物。
21. 患者における造血細胞、間葉細胞またはケラチノサイト関連症状の処置における使用のための請求項１８記載の幹細胞集団。

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