KR20090048063A - 나노에멀젼을 유효성분으로 포함하는 치주질환의 치료용조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비타민 C, E 및 프로폴리스 추출물을 내포하는 나노에멀젼을 유효성분으로 포함하는 치주질환의 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 유효성분인 나노에멀젼에 내포되는 비타민 C, E 및 프로폴리스 추출물은 치주질환(잇몸질환)에 있어 염증관련 사이토카인을 효과적으로 억제하여 우수한 항염증 효과, 세포 내 산화적 손상을 억제하는 우수한 항산화 효과 및 우수한 항균 효과를 가진다. 또한, 유효성분인 나노에멀젼은 잇몸 경피 흡수율 및 빠른 흡수성을 개선함으로써 약리 성분의 단순 혼합물 보다 상승적(synergic)인 항염증, 항산화 및 항균 효과를 가진다. 본 발명의 조성물은 세포독성 및 피부 부작용이 없어 약제학적 조성물, 치약(toothpaste), 구강 치료용 및 구강 보호용 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

잇몸질환, 비타민 C, 비타민 E, 프로폴리스, 나노에멀젼

Description

나노에멀젼을 유효성분으로 포함하는 치주질환의 치료용 조성물{Composition for Treating of Gingival Disorders Comprising Nano-emulsion as an Active Ingredient}

본 발명은 비타민 C, E 및 프로폴리스 추출물을 포함하는 나노에멀젼을 유효성분으로 포함하는 치주질환의 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 제품 안정성이 우수하고 피부에 대한 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있으며 비타민 C, E 및 프로폴리스 추출물을 나노에멀젼에 포함시킴으로써 보다 상승적(synergic)인 항염증, 항산화 및 항균 효과를 가지는 치주질환의 치료용 조성물에 관한 것이다.

구강 내에는 여러 종류의 원인에 의해서 구강 질환이 발생하며, 그 구강 질환 중에는 잇몸 질환 및 치주 질환이 가장 높은 발병률을 나타낸다. 일반적으로 구강 내 발생 질환은 외부적인 요인 즉 흡연 및 환경에 의하여 구강암과 같은 질환 및 잇몸질환이 발생 한다(1-5). 특히 잇몸질환은 식생활의 서구화 및 바쁜 현대 생활에서의 오는 스트레스에 의한 잇몸질환의 유병율이 높아지고 있으며, 노인성 질환으로 나이가 들면서 잇몸을 지지하는 뼈의 약화 및 잇몸의 손상으로 일상생활 을 하는데 있어서 많은 불편을 가져오는 질환으로 인식되고 있다(6-7).

이러한 잇몸질환을 간단하게나마 보호하고 균형을 맞추면서 치료할 수 있는 것은 아직까지 비스테로이드(NSAIDs) 호르몬과 같은 약물들이 대부분을 차지하고 있다(8-10). 이와 같은 약물은 전통적으로 효과가 검증되었고 많은 임상을 거쳐 많은 사람들이 사용하고 있다. 그러나 약물이 가지고 있는 또 다른 부작용도 있어 이에 대한 보완 및 대체가 되는 약물이 필요하다고 할 수 있다. 이러한 부작용이 없고 잇몸 질환에만 효과가 있는 약물을 개발하고자 많은 나라에서는 막대한 투자를 하면서 연구를 하고 있다(11-12).

잇몸 염증의 발생시에 다른 인체의 방어 기작과 마찬가지로 인체의 방어 시스템이 가장 중요한 역할을 한다(13). 염증의 발생에는 다음과 같은 원인이 존재한다. 국소성 손상에 의한 염증 반응, 미생물 감염, 과민반응, 물리적 반응, 화학적 반응, 조직의 괴사 및 정신적 스트레스에 대한 복합적인 요인 및 많은 요인에 의하여 염증에 대한 생체의 대응이라고 할 수 있으며, 혈관과 혈구 세포를 중심으로 발생하는 과정중의 하나이다(14-15).

특히 잇몸과 같은 구강 내의 습한 환경에서는 플라그 또는 치석 안에 존재하는 세균들이 만들어 내는 독소가 잇몸 속으로 침투하여 잇몸에 염증을 유발 시킬 수도 있다(16). 또한 40대 이후에는 인체 저항력이 떨어지고 조직 재생 능력이 감소하면서 세균의 활동이 더욱 활발하게 활동하기 때문에 생활수준의 향상에 따른 인구의 고령화가 될수록 유병율이 높아지는 질환이라고 할 수 있다. 또한 잇몸질환은 본인이 자각을 못할 정도로 서서히 진행하다가 본인이 통증을 느낄 때면 치아 를 빼야 할 정도로 잇몸의 손상이 심각하게 진행되어 있는 경우가 많이 있다(17-18).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 생체친화적인 성분을 이용하여 부작용이 없으면서도 질환이 있는 치주(잇몸)에 신속하게 흡수되어 약리학적 효과를 발휘할 수 있는 물질을 개발하고자 노력하였고, 그 결과 비타민 C, E 및 프로폴리스 추출물을 포함하는 나노에멀젼을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제조하면 그 효능과 안전성이 우수한 치주질환, 바람직하게는 잇몸 염증 질환 치료용 조성물을 제공할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 치주질환의 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 비타민 C 또는 그의 유도체, (ⅱ) 비타민 E 또는 그의 유도체 및 (ⅲ) 프로폴리스 추출물을 내포하는 나노에멀젼을 유효성분으로 포함하는 치주질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 생체친화적인 성분을 이용하여 부작용이 없으면서도 질환이 있는 치주(잇몸)에 신속하게 흡수되어 약리학적 효과를 발휘할 수 있는 물질을 개 발하고자 노력하였고, 그 결과 비타민 C, E 및 프로폴리스 추출물을 포함하는 나노에멀젼을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제조하면 그 효능과 안전성이 우수한 치주질환, 바람직하게는 잇몸 염증 질환 치료용 조성물을 제공할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 조성물에 이용되는 비타민 C 또는 그의 유도체는 약제학적 원료로서 개발된 종래의 어떠한 비타민 C 유도체도 포함한다. 예를 들어, 상기 비타민 C 또는 그의 유도체는 아스코르브산, 아스코르브산의 다양한 염(예: 소듐 아스코베이트, 마그네슘 아스코베이트, 소듐 아스코빌 포스페이트 및 아스코빌 마그네슘 포스페이트) 및 아스코르브산의 에스테르(예: 아스코빌 아세테이트, 아스코빌 프로피오네이트, 아스코빌 팔미테이트 및 아스코빌 스테아레이트)를 포함한다.

또한, 본 발명의 조성물에 이용되는 비타민 E 또는 그의 유도체는 약제학적 원료로서 개발된 종래의 어떠한 비타민 E 유도체도 포함한다. 예를 들어, 상기 비타민 E 또는 그의 유도체는 α, β, γ, δ-토코페롤, 토코페롤 숙시네이트 및 토코페롤 포스페이트를 포함한다.

본 명세서에서, 비타민 C, E 또는 그의 유도체를 언급하면서 사용되는 용어 “안정”은 열, 빛 및 산소와 같은 산화-유발 인자에 의해 비타민 C, E 또는 그의 유도체가 산화되는 것을 억제하는 작용을 의미한다.

본 발명의 조성물에 이용되는 프로폴리스는 봉지(蜂脂)라고도 하며, 발삼향을 내는 수목이나 다른 여러 유실수의 수피 또는 꽃수술에서 분비되는 물질에 꿀벌 자신의 분비물, 예를 들어 밀랍 등을 가하여 단자를 만들고 다시 타액을 개어 합치는 동안에 효소에 의해 처리됨으로써 생성되는 물질이다.

프로폴리스 추출물은 당업계에 공지된 다양한 추출 방법을 이용하여 수득할 수 있으며, 바람직하게는, 추출온도 0℃ 내지 50℃에서 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름 또는 (g) 1,3-부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 수득할 수 있다.

필요한 경우, 본 발명의 프로폴리스 추출물을 얻기 위하여, 상기의 추출용매 처리 이후에 추가적인 정제 과정을 거쳐 얻을 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 프로폴리스 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명의 복합 유효성분인 비타민 C, E 및 프로폴리스 추출물은 다양한 제형(예: 에멀젼, 리포좀, 현탁액 등)으로 제조될 수 있으나, 바람직하게는 에멀젼 제형을 갖으며, 가장 바람직하게는 나노에멀젼 제형을 갖는다. 본 명세서에서, 용어 "나노에멀젼"은 통상적인 에멀젼의 형태를 갖는 것으로서 평균 입자 지름이 1-200 nm인 에멀젼을 의미한다.

본 발명의 복합 유효성분이 에멀젼 제형을 갖는 경우, 본 발명의 에멀젼 제형은 레시틴, 증점제, 폴리올 및 오일 성분을 포함할 수 있다.

에멀젼의 제조에 이용되는 폴리올은 특히 제한되지 않으며, 바람직하게는 프 로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메칠프로판디올, 이소프렌글리콜 및 펜틸렌글리콜을 포함하며, 가장 바람직하게는 글리세린이다. 그 사용량은 조성물 총 중량에 대하여 10-80 중량%, 바람직하게는 15-40 중량%이다.

본 발명의 조성물의 제조에 이용되는 오일은 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 예를 들어 광물유, 식물유, 에스터오일, 하이드로카본계오일 및 실리콘오일이 사용될 수 있고, 바람직하게는 에스터오일이 사용된다. 오일의 사용량은, 일반적으로 조성물 총 중량에 대하여 1-20 중량%이고, 바람직하게는 2-10 중량%이다.

본 발명의 조성물의 제조에 이용되는 또 다른 성분인 인지질은 양쪽 친화성 지질로 이용된 것으로서, 천연 인지질(예: 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질(예:디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하며, 바람직하게는 레시틴이다. 보다 바람직하게는, 상기 레시틴은 대두 또는 난황에서 추출한 천연 유래의 불포화 레시틴 또는 포화 레시틴이다. 통상적으로 천연 유래의 레시틴은 포스파티딜콜린의 양이 23-95%, 그리고 포스파티딜에탄올아민의 양이 20% 이하이다. 본 발명의 조성물의 제조에 있어서, 레시틴의 사용량은 총 중량에 대하여 0.5-20 중량%이며, 바람직하게는 2-8 중량% 이다.

본 발명의 조성물의 제조에 이용되는 점증제는 당업계에 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 예를 들어 셀룰로오스, 폴리사카라이드 등의 점증제를 포함하며, 바람직하게는 폴리사카라이드가 사용된다. 그 사용량은 조성물의 총 중량에 대하여 0.01-10중량%이고 바람직하게는 0.5-5 중량%이다.

본 발명의 조성물의 제조에 이용되는 보존제 또한 당업계에 사용하는 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 그 사용량은 조성물의 총 중량에 대하여 0.5-5 중량%이고, 바람직하게는 0.1-1.0 중량%이다.

본 발명의 조성물의 제조에 이용되는 정제수는 일반적으로 탈이온화된 증류수이며, 그 사용량은 조성물의 총 중량에 대하여 30-70 중량%이다.

나노에멀젼 제형을 갖는 조성물의 제조는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있으나, 가장 바람직하게는 상기 성분들을 포함하는 혼합물을 고압미세혼합기(high pressive homomixer)에 적용하여 제조된다. 고압미세혼합기(high pressive homomixer)에 의한 조성물의 제조는 소망하는 입자 크기에 따라 다양한 조건(예: 압력, 횟수 등)으로 실시 할 수 있으며, 바람직하게는 600-1200 bar 압력 하에서 1-5회 고압미세혼합기(high pressive homomixer)를 통과하도록 하여 조성물을 제조한다.

본 명세서에서 용어 “치주질환” 또는 “잇몸 질환”은 동일한 의미로 사용된다.

본 명세서에서 용어 “안정성”은 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다.

본 발명의 조성물에 이용되는 비타민 C, E 및 프로폴리스 추출물을 나노에멀젼으로 보호되어 있으므로 우수한 열안정성을 나타내며, 또한 산과 알칼리 등의 물리화학적 인자에 대한 안정성이 우수하다. 따라서 본 발명의 나노에멀젼은 장기 보존성이 뛰어나므로, 의약품, 의약외품 및 구강용품과 같은 장기간 저장이 요구되는 제품에 유리하게 적용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) (ⅰ) 비타민 C 또는 그의 유도체, (ⅱ) 비타민 E 또는 그의 유도체 및 (ⅲ) 프로폴리스 추출물을 내포하는 나노에멀젼의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

용어, “약제학적 유효량”은 상술한 나노에멀젼의 약리학적 효과를 나타내는 데 필요한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 치주질환의 치료 효능을 가지며, 상기 조성물은 치약(toothpaste), 구강청정용 조성물 또는 구강보호용 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “치주질환용 치료용 조성물”은 “구강보호용 조성물(composition for tooth and mouth care)”또는 “구강청정용 조성물(composition for tooth and mouth cleaning)”로 대체될 수 있다.

본 발명의 나노에멀젼은 잇몸 조직의 섬유아세포의 생리활성을 촉진하고 신속한 잇몸 상처의 치유를 통하여 손상된 잇몸 조직을 재생시킴으로써, 치주질환을 치료 또는 예방할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해서 치료 또는 예방되는 치주질환은 잇몸 염증이다. 상세하게는, 염증관련 사이토카인을 효과적으로 억제하여 우수한 항염증 효과, 세포 내 산화적 손상을 억제하는 우수한 항산화 효과 및 우수한 항균 효과에 의해 치주질환(잇몸질환)을 효과적으로 치료할 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 유효성분인 나노에멀젼의 평균 입자 지름은 50-150 nm이고, 보다 바람직하게는 70-130 nm, 가장 바람직하게는 90-110 nm이다. 나노에멀젼의 평균 입자 지름이 150 nm를 초과하는 경우에는 본 발명에서 달성하고자 하는 효과, 즉 약리성분의 잇몸 경피 흡수율 및 빠른 흡수성 개선이 미약하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유효성분으로 이용되는 나노에멀젼은 전체 조성물을 기준으로 하여 0.01-70.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.1-50.0 중량%, 가장 바람직하게는 5-20.0 중량%이다. 나노에멀젼의 유효성분의 중량이 0.01 중량% 미만인 경우에는 그 효과가 나타나기 어렵고, 70.0 중량%를 초과하는 경우에는 함량 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약하고, 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명의 조성물은 비타민 C, E 및 프로폴리스 추출물을 내포하는 나 노에멀젼을 유효성분으로 포함한다.

(ⅱ) 유효성분인 나노에멀젼에 내포되는 비타민 C, E 및 프로폴리스 추출물은 치주질환(잇몸질환)에 있어 염증관련 사이토카인을 효과적으로 억제하여 우수한 항염증 효과, 세포 내 산화적 손상을 억제하는 우수한 항산화 효과 및 우수한 항균 효과를 가진다.

(ⅲ) 또한, 유효성분인 나노에멀젼은 잇몸 경피 흡수율 및 빠른 흡수성을 개선함으로써 약리 성분의 단순 혼합물 보다 상승적(synergic)인 항염증, 항산화 및 항균 효과를 가진다.

(ⅳ) 본 발명의 조성물은 세포독성 및 피부 부작용이 없어 약제학적 조성물, 치약(toothpaste), 구강 치료용 및 구강 보호용 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 비타민 C, E 및 프로폴리스 추출물을 내포하는 나노에멀젼을 유효성분으로 포함하는 치주질환의 치료용 조성물을 제공한다. 유효성분인 나노에멀젼에 내포되는 비타민 C, E 및 프로폴리스 추출물은 치주질환(잇몸질환)에 있어 염증관련 사이토카인을 효과적으로 억제하여 우수한 항염증 효과, 세포 내 산화적 손상을 억제하는 우수한 항산화 효과 및 우수한 항균 효과를 가진다. 또한, 유효성분인 나노에멀젼은 잇몸 경피 흡수율 및 빠른 흡수성을 개선함으로써 약리 성분의 단순 혼합물 보다 상승적(synergic)인 항염증, 항산화 및 항균 효과를 가진다. 본 발명의 조성물은 세포독성 및 피부 부작용이 없어 약제학적 조성물, 치약(toothpaste), 구강 치료용 및 구강 보호용 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실험재료 및 실험방법

1. 비타민 C, E 및 프로폴리스 추출물을 포함하는 나노에멀젼의 제조

나노에멀젼은 5% 레시틴, 3% 유화제, 15% 글리세린, 20% 비타민 C, E 및 프로폴리스와 정제수를 혼합한 다음 호모믹서(Tokushukika, Japan)를 사용하여 실온에서 30분간 혼합하였다. 1차로 혼합된 에멀젼 상태에 고압미세혼합기(high pressive homomixer)(Tokushukika HS8110, Japan)를 사용하여 압력 1000 bar에서 3 회 연속 통과 시켜 크기 50-100 nm 정도의 나노에멀젼을 제조하였다.

2. 인 비트로 인간 치은 섬유아세포(Human Gingival Fibroblast: HGF) 세포 실험

본 실험에 사용된 HGF 인체 잇몸유래 상피세포는 ATCC(ATCC No CRL-2014, Manassas, VA, 미합중국)으로부터 구입하였다. 10% 우태아 혈청(FBS)이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(Gibco, Grand Island, NY, 미합중국)를 사용하여 온도 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 80%의 컨플루어신(confluency)에서 0.01% 트립신-EDTA를 사용하여 계대 배양하였다. 헤모사이토미터를 사용하여 세포수를 측정하였으며, 인터루킨-1β(interleukin-1β)는 Santacruz 회사(미합중국)에서 구입하였다. 소듐 니트로프루시드(SNP)는 Simga-Aldrich (미합중국)에서 구입하였으며, 멸균된 증류수에 용해하여 10 mM 스톡 용액으로 제조한 뒤 적정 농도로 희석하여 실험에 사용하였다. SNP는 산화성 손상을 일으키는 강력한 물질로 알려져 있다. 각 세포에 SNP 최종 농도 100 μM을 처리하였으며, SNP을 처리하고 1시간 뒤에 각 실험군을 처리하여 세포 반응을 관찰하였다.

2. MTT 분석을 이용한 세포 생존율 검사

세포의 활성 및 생존율을 검사하기 위하여, MTT celltiter 96 Aqueous one solution 세포 증식 분석 키트(Promega, Madison, WI, 미합중국)를 사용하여 측정 을 실시하였다. HGF 세포 4 X 10³ 개를 96 웰 플레이트에 분주한 뒤 24시간 동안 안정화 시켰다. 각각의 웰에 100 μM의 SNP를 첨가하여 1시간 동안 반응을 유도하였다. 그 다음 각 웰에 실험군을 처리하고 24시간 동안 반응을 유도한 후 ELISA 리더(Modecular Devices, Sunnyvale, CA, 미합중국)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모두 세 번의 실험을 실시하였으며, 그에 대한 평균값과 오차를 시그마 플롯 4.0 프로그램(SPSS Ins, CA, 미합중국)을 이용하여 계산하였다.

3. ELISA 분석

세포내에 존재하는 프로스타글란딘(PEG₂)의 활성을 측정하기 위하여, ELISA 분석을 실시하였다. ELISA 분석법은 세포가 특정 물질에 반응하여 세포 밖으로 배출되는 단백질의 정량적인 값을 측정하기 위한 방법이며, 보통 항원-항체 반응이라고 한다. 이와 같은 실험을 실시하기 위하여 PEG₂ 정량 키트를 Amersham Bioscience(미합중국)으로부터 구입하여 사용하였다. 실험은 구입한 PEG₂ 키트 설명서에 따라 수행하였다.

인터루킨-1β(interleukin-1β)를 50 ng/mL 농도로 인간 치은 섬유아세포(Human Gingival Fibroblast; HGF)에 처리하여 염증 관련 PEG₂의 활성을 유도하였다. 그 다음 인간 치은 섬유아세포를 96-웰 플레이트에 2 X 10⁴ cell/웰 씩 각각 분주하였다. 이어 각각의 실험물질을 첨가한 다음 24시간 동안 방치하여 반응을 유도하였다. 세포 반응이 끝난 다음 100 ㎕/웰에 세포 파쇄 완충액(cell lysis buffer)를 첨가하고 실온에서 10-30분 동안 충분히 방치한 다음, 다시 50 ㎕씩 96-웰 플레이트에 분주하였다. 그 다음 각 웰에 50 ㎕의 항체를 첨가하여 실온에서 10분 동안 반응을 유도하였다. 이어 각 웰에 50 ㎕ 컨쥬게이트를 분주한 다음 1시간 동안 실온에서 흔들어 주면서 반응을 유도하였다. 1시간 후 효소기질 150 ㎕를 분주하여 30분 동안 실온에서 흔들어 주면서 반응을 유도하였다. 항원-항체 반응의 정지를 위하여 100 ㎕의 1 M 황산을 첨가하여 반응을 중지한 다음 ELISA 리더(Moleuclar Device, CA, 미합중국)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, PEG₂ 표준곡선을 이용하여 농도를 계산하였다.

4. In vivo 염증 유도된 마우스 실험

20 g 내외 6주령 웅성 ICR 마우스(샘타코, 청주, 한국)를 구입하여 실험기간 중 고형사료와 물은 자유롭게 공급하였고, 사육실은 온도 22± 2℃, 습도 50± 5%로 유지하였으며 일정한 조도와 광주기 및 암 주기를 12시간 조절하여 생활주기에 맞추어 1주일간 적응시킨 후 실험에 이용하였다. TRI 시약, 총 RNA 추출 키트(Promega, CA, 미합중국), 클로로포름, 이소프로판올 알코올, 에탄올, 아세톤(MERCK Inc., HA, 독일), 올리고뉴클레오티드(제노텍, 대전, 한국), 4% 파라포름알데히드(Sigma-Aldrich, CA, 미합중국), 디에틸 피로카보네이트(Sigma, CA, 미합 중국), Maxime RT-PCR 프리믹스 키트(iNtRON BIOTECHNOLOGY, 서울, 한국), 아가로스(BIO-RAD, CA, 미합중국) 및 TAE 완충액(트리스-아세틱-EDTA 완충액)을 이용하였고 DNFB(2,4-디니트로플루오로 벤젠, St. Louis, MO, 미합중국)와 같은 재료를 실험에 이용하였다. DNFB는 염증을 유발하는 강력한 화합물로 알려져 있다. 유전자 발현을 확인하기 위하여 전기영동 키트를 이용하였으며, UV 일루미네이트(Bio-Rad, CA, 미합중국)에서 확인하였다. 스펙트로포토미터(Bio-RAD, CA, 미합중국)를 이용하여 260 nm에서 농도를 확인하였다.

5. RNA 추출 및 RT-PCR

경추 탈골 법으로 희생시킨 마우스의 귀 조직을 채취하여 액화질소에 넣어 동결시키고 막자사발에서 분말 형태로 만든 후 튜브에 보관하였다. 채취한 귀 조직에 TRI 시약 800 ㎕를 첨가하여 잘 혼합한 다음 추가적으로 클로로포름 100 ㎕를 첨가하였다. 그 다음 볼텍싱하여 11,000 rpm에서 20 분 동안 원심분리를 실시하였다. 원심분리가 끝난 후 상층액을 새 튜브에 옮기고 동량의 이소프로판올을 넣고 인버팅을 실시한 다음 실온에 10 분간 두었다. 이어 10,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리를 한 다음 펠릿 외에 상등액을 버렸다. 70% DEPC 에탄올 1 ml 첨가하여 잘 혼합하여 세척한 다음 10,000 rpm에서 10 분 정도 세척하였다. 실온에서 건조 시킨 후 DEPC 증류수를 100 ㎕ 넣어 RNA 펠릿을 녹였다. 녹인 RNA 샘플을 각 새 튜브에서, RNA 농도를 측정하기 위하여 스펙트로포토미터를 이용하여 260 nm에서 흡광도를 측정하여 RNA 농도를 확인하였다. Maxime RT-PCR 프리믹스 튜 브(iNtRON BIOTECHNOLOGY Inc., 서울, 한국)에 샘플 총 RNA 주형과 인터루킨-1β 프라이머를 넣었다. 그 다음 Maxime RT-PCR 프리믹스 튜브 별로 RNA 농도가 1 ㎍이 되도록 증류수 및 총 RNA 샘플을 넣은 후 인터루킨-1β 프라이머(10 pmol/㎕) 2 ㎕ 넣어 총 24 ㎕를 만들었다. 그 다음 동일한 조건으로 PCR 장치(Hybaid, CA, 미합중국)를 이용하여 반응을 시켰다. RT-PCR이 끝나면 1.5% 아가로스 젤에 로딩하고 100 볼트에서 30분 동안 반응을 시켰다. 이어 반응이 끝난 젤을 ET-BR 염색시약에서 10분 동안 반응시켜 인터루킨-1β DNA 유전자의 발현 양상을 관찰하였다. 젤을 UV 일루미네이트 램프로 인터루킨-1β의 발현을 확인하였다.

6. 항균테스트 실험

황색포도상구균(Staphylococcus aureus, ATCC 6538)을 항균테스트의 실험군으로 이용하였고, 실험 전에 황색포도상구균을 37℃ 및 습도 50%에서 충분히 24시간 동안 진탕 배양하여 세균의 활동성 및 기능을 왕성하게 유도하였다. 그 다음 세균의 균수가 2 X 10⁵ 개가 되도록 처리하였다. 항균테스트를 측정하기 위하여 아가 혼합 페트리디쉬에 황색포도상구균을 도말하여 도포하고, 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 방치하였다. 세균을 도말한 페트리디쉬에 일정한 크기의 원형(지름: 7 mm, 폭: 3.5 mm) 영역을 만들어 실험군 및 대조군 샘플 200 ㎕를 처리하고 37℃ 인큐베이터에서 16 시간 방치하여 항균력을 측정하였다. 샘플을 처리한 플레이트 영역에서의 항균력 범위를 측정하였다.

7. 잇몸질환 환자에 대한 다형연쇄상구균(Streptococcus mutans)의 항균테스트

다형연쇄상구균을 선택적으로 배양하기 위해 기존의 배지에 1% Tellurite 용액(Sigma, 미합중국) 1 ml와 200 유닛의 바시트라신(bacitracin, Sigma, 미합중국) 1 ml 을 첨가하여 평판배지를 제조하였다. 환자의 잇몸에서 추출된 추출물과 생리식염수와 혼합하여 제조된 100배 희석액을 제조하였다. 오염을 방지하기 위하여 냉장보관을 실시하였다. 그런 다음 제조된 배지에 100 ㎕의 희석액을 도말하여 37℃ 및 48시간 동안 무산소 배양을 실시하였다.

8. 전자현미경 사진

세포의 크기가 가진 기능 및 구조의 관계를 더욱 자세히 알아보고자 전자현미경 관찰을 실시하였다. 원형의 유리로 코팅된 커버글라스(직경: 12 mm) 위에서 시료를 유도시킨 후 커버글라스 전체를 4% 파라포름알데히드-글루타알데히드(4℃, 0.1 M 포스페이트 완충액, pH 6.8)에 1시간 동안 전 고정하고, 인산완충용액(4℃, 0.1 M 포스페이트 완충액, pH 6.8)으로 세척한 다음, 얼음 위에서 1% OsO(0.1 M 포스페이트 완충액, pH 6.8)로 1시간 동안 후 고정하였다. 고정액과 완충용액의 농도, pH, 온도 및 고정시간을 항상 정확하게 유지하였다. 모든 고정이 끝난 시료는 동일 인산완충용액으로 충분히 세척한 후, 에탄올 농도 상승 순으로 탈수하였다. 그런 다음 이온 코팅기(Ion coater, RMC-Eiko, 미합중국)를 이용하여 2분 동안 7 mM에서 금 코팅을 하였다.

실험 결과

1. MTT 분석 결과

세포 생존률 검사를 이용하여 HGF 세포에 대한 SNP의 영향을 조사하였다. 세포생존률 검사에서 있어, 540 nm 파장에서 최대가 되고, 이 파장에서 측정된 흡광도는 세포의 생존을 나타내며, 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영하므로 조사 대상 세포의 증식기에 미치는 특정 물질의 영향을 비교하여 세포수의 생존율을 측정하였다.

도 1에서 확인 할 수 있듯이, HGF 세포에 대한 SNP의 처리에서 24시간 후 SNP만 처리한 세포보다 본 발명의 유효성분인 나노에멀젼을 처리한 군에서 유의할 만한 감소를 보이지 않으므로, 나노에멀젼이 SNP와 같은 산화성 손상을 유발하는 독성 물질의 존재 하에서도 세포의 감소를 억제하는 효과를 가짐을 알 수 있었다.

2. 인터루킨-1β의 mRNA 발현 분석 결과

염증의 병인으로서 잘 알려진 인터루킨-1β에 대한 발현 양을 조사함으로써, 선택적인 약물이 염증의 감소에 얼마나 특이적으로 작용 하는지를 인터루킨-1β의 mRNA 발현 RT-PCR 실험을 통하여 알 수 있었다. 염증유발 화학물질을 이용하여 7일 동안 염증을 유발시킨 마우스에 각 실험군을 아침 및 저녁 두 번 도포하여 5일 동안 실험을 진행하였다.

도 2에서 확인할 수 있듯이, 1번 정상조직의 경우 염증 유발 시에만 발현되 는 인터루킨-1β의 발현이 거의 확인 되지 않았으며, 2번 염증을 유발시킨 후 아무것도 처리하지 않은 마우스의 경우 인터루킨-1β의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다. 3번은 양성 대조군으로서, 염증만 유발시킨 2번과 동일한 발현 양을 보임을 확인할 수 있었다. 4번 나노에멀젼의 경우 2 및 3번보다 50% 이상 감소된 발현 양을 보임을 확인할 수 있었으며, 1번 정상과 비교해서 거의 차이가 나지 않을 만큼 인터루킨-1β의 감소를 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과로 볼 때 염증 전구물질의 감소는 염증이 감소되어있다는 것을 나타낸 것이라고 할 수 있다.

3. 항균테스트

본 발명의 유효성분인 나노에멀젼 처리에 의한 황색포도상구균 및 대장균의 항균 효과에 대한 상관성을 알아보기 위하여 대표적인 그람 양성 및 그람 음성의 대표적인 세균인 황색포도상구균 및 대장균에 대하여 항균테스트를 실시하였다. 일반적으로 사용되고 있는 아가 배양접시에 일차적으로 세균들을 각각 도말하여 37℃ 항온기에서 1시간 방치하여 세균의 안정을 유도한 다음 각 실험군을 처리하였다.

도 3에서 확인할 수 있듯이, 농도-의존적으로 항균능력이 증가되는 것을 볼 수 있었다. 특히 황색포도상구균의 항균실험에서 200 ㎕ 나노에멀젼 조건에서 유의할 만하게 높은 항균효과를 나타내었다.

4. 주사전자현미경 관찰

각 조직에 염증이 생기면서 피부조직의 부풀어 오름과 같은 부종의 크기를 관찰하고 조직의 부종에 대한 현미경 관찰을 하였다. 고리처럼 생긴 것이 세포와 세포를 이어주는 결합조직으로서, 부종이 생기면서 마우스의 조직이 부풀어 올라 커진 것을 볼 수 있다(도 4).

도 4에서 확인 할 수 있듯이, a는 정상조직, b는 염증 유발 군으로서 조직의 크기가 정상보다 커진 것을 확인할 수 있었고, c 또한 b와 마찬가지로 조직의 크기가 커져 있음을 확인할 수 있었으며, d는 b 및 c보다 조직의 감소를 확인 할 수 있었다.

결론적으로, 전자현미경 관찰 사진으로 조직의 부종 감소를 확인 할 수 있었다.

5. 다형연쇄상구균의 항균테스트 결과

구강 내 서식하는 유해 세균 중에서 다형연쇄상구균에 대한 항균테스트를 실시하여 환자에 대한 직접적인 항균테스트를 실시하였다. 대조군은 나노에멀젼을 처리하기 전, 잇몸추출물을 얻어 대조군으로 사용하였다. 총 3개의 군으로 나누었으며, 대조군(도 5a), 나노에멀젼 처리 후 30초(도 5b) 또는 60초(도 5c) 후의 잇몸 추출물을 얻어 배지에서 테스트를 실시하였다. 도 5에서 확인할 수 있듯이, 처리 후 30초 까지는 어느 정도 세균을 확인할 수 있었으나 60초 후 잇몸에서 얻어진 추출물에 대한 항균실험 결과 항균력이 있음을 확인할 수 있었다. 항균력을 발휘하는데 최소 60초의 시간이 필요하다는 결론을 얻을 수 있었다.

6. ELISA 분석 관찰 결과

항염증 관련 PEG₂의 발현 상태를 항원-항체 반응을 이용하여 관찰하였다. 양성대조군으로는 NSAID 약물중의 하나인 아세트아미노펜, 비교예로는 비타민 C, 비타민 E, 프로폴리스 추출물 단독 및 비타민 C, E, 프로폴리스의 단순 혼합물을 사용하였으며, 각각의 실험을 통하여 항염증 중요 요소인 PEG₂의 발현 양을 확인하여 항염증 관련 관찰을 실시하였다.

그 결과 도 6에서 확인할 수 있듯이, 음성대조군(315 pg/well)에 비교하여 NSAID 약물인 양성대조군인 아세트아미노펜(110 pg/well)은 65% 감소하였고, 비타민 C(205 pg/well)는 35% 감소, 비타민 E(187 pg/well)는 41% 감소, 프로폴리스(152 pg/well)는 52% 감소 그리고 단순 혼합물 처리군(213 pg/well)은 32% 감소하였으나, 본 발명의 유효성분인 나노에멀젼(90 pg/well)은 음성대조군과 비교하여 72% 감소하였음을 확인 할 수 있었다.

즉, 본 발명의 유효성분인 나노에멀젼 처리군은 비타민 C, 비타민 E 및 프로폴리스 추출물 단독 처리군에 비하여 최대 2배 이상 및 최소 20% 염증을 감소시켰고, 단순 혼합물 처리군 보다는 2배 이상 염증을 감소시켰으며, 처리하지 않은 음성대조군에 비해서는 72% 까지 감소시켰음을 확인하였다. 또한 양성대조군인 아세트아미노펜보다도 7% 정도 더 감소시켰음을 알 수 있었다. 이와 같은 결과로 볼 때 본 발명의 유효성분인 나노에멀젼 처리군의 항염증 작용이 비타민 C, 비타민 E 또는 프로폴리스 추출물 단독, 아세트아미토펜 및 단순 혼합물 처리군 보다 우수하다는 것을 확인 할 수 있었다. 또한, 비타민 C, 비타민 E 또는 프로폴리스추출물 단독, 및 비타민 C, E 및 프로폴리스의 단순 혼합물보다 상기 성분을 유화시켜 나노에멀젼으로 제조함으로써 보다 상승된 효과를 가짐을 알 수 있었다.

제형예 1: 치약

상기 실시예에서 제조된 비타민 C, E 및 프로폴리스를 포집한 나노에멀젼을 포함하는 하기 조성으로 이루어진 치약제를 일반적인 치약제 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예의 나노에멀젼	6
일불소인산나트륨	0.4
이산화규소	15
트리클로산	0.1
글리세린	9.11
D-소르비톨	25.2
폴리에칠렌글리콜1500	1.02
카르복시메칠셀룰로오스 나트륨	0.52
라우릴황산나트륨	2.0
키토산올리고당	0.05
자일리톨	0.01
삭카린나트륨	0.12
페퍼민트오일	적량
L-멘톨	적량
안식향산나트륨	0.1
정제수	적량
합계	100

제형예 2: 구강청정제

상기 실시예에서 제조된 비타민 C, E 및 프로폴리스를 포집한 나노에멀젼을 포함하는 하기 조성으로 이루어진 구강청정제를 일반적인 구강청정제 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예의 나노에멀젼	3
에탄올	17
글리세린	12
폴리옥시에칠렌경화피마자유	2.5
삭카린	0.21
안식향산 나트륨	0.06
향료	적량
인산2수소나트륨	0.12
착색제	적량
정제수	0.05

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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도 1a-1d는 MTT 분석 결과를 보여준다. 도 1a에서, 나노에멀젼 처리군(3번)의 경우 세포 생존율이 조금 감소하였으나 SNP 처리군(2번)은 세포 생존율이 크게 감소하였다. 1번은 대조군을 나타낸다. 도 1b-1d는 위상차현미경을 이용하여 촬영한 배양 세포의 형태론을 보여주는 사진이다. 도 1b는 24시간 후 대조군 HGF 섬유아세포, 도 1c는 24시간 후 SNP를 처리한 HGF 섬유아세포 및 도 1d는 24시간 후 SNP 및 나노에멀젼을 처리한 HGF 섬유아세포를 보여준다.

도 2a-2b는 인터루킨-1β의 발현 패턴을 보여주는 젤 사진 및 그래프이다. S.M은 사이즈 마커, 1은 대조군, 2는 DNFB 처리군(양성 대조군), 3은 바세린 처리군 및 4는 나노 에멀젼 처리군을 나타낸다. 나노 에멀젼 처리군은 DNA 발현 정도가 감소하였으나 바세린 처리군 및 양성 대조군은 발현 정도가 증가하였다.

도 3a-3b는 황색포도상구균 및 대장균에 대한 항균 효과를 보여준다. 도 3a에서, 황색포도상구균에 대조군(a), 나노에멀젼 50 ㎕(b), 나노에멀젼 100 ㎕(c) 및 나노에멀젼 200 ㎕(d)를 처리하였고, 도 3b에서, 대장균에 나노에멀젼 50 ㎕(b), 나노에멀젼 100 ㎕(c)을 처리하였다.

도 4a-4d는 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 관찰한 사진이다. 귀조직의 부풀어 오름을 관찰할 수 있었으나 나노에멀젼 투여군은 정상 상태로 회복하였다. a는 대조군, b는 DNFB 처리군, c는 바세린 처리군 및 d는 나노에멀젼 처리군을 나타낸다.

도 5a-5c는 다형연쇄상구균에 대한 항균 효과를 보여준다. 도 5a는 본 발 명의 유효성분이 나노에멀젼을 처리하기 전, 잇몸추출물(대조군)을 처리한 배지, 도 5b는 상기 대조군에 나노에멀젼을 처리 한 다음 30초 경과한 배지, 도 5c는 상기 대조군에 나노에멀젼을 처리한 다음 60초 경과한 배지를 보여준다.

도 6은 ELISA 분석법을 이용하여 PEG₂의 활성도를 보여주는 그래프이다. X축에서, 1은 음성대조군, 2는 양성대조군으로 아세트아미노펜 처리군, 3은 비타민 C 단독 처리군, 4는 비타민 E 단독 처리군, 5는 프로폴리스 추출물 단독 처리군, 6은 비타민 C, E, 프로폴리스의 단순 혼합물 처리군 및 7은 본 발명의 비타민 C, E 및 프로폴리스 추출물을 포집시킨 나노에멀젼 처리군을 나타내고, Y축은 프로스타글란딘(PEG₂)의 발현양(pg/well)을 나타낸다.

Claims (6)

1. (ⅰ) 비타민 C 또는 그의 유도체, (ⅱ) 비타민 E 또는 그의 유도체 및 (ⅲ) 프로폴리스 추출물을 내포하는 나노에멀젼을 유효성분으로 포함하는 치주질환의 예방 또는 치료용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 (a) (ⅰ) 비타민 C 또는 그의 유도체, (ⅱ) 비타민 E 또는 그의 유도체 및 (ⅲ) 프로폴리스 추출물을 포함하는 나노에멀젼의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 치주질환의 치료 효능을 가지며, 상기 조성물은 치약(toothpaste), 구강청정용 조성물 또는 구강보호용 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 치주질환은 잇몸 염증인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노에멀젼은 평균 입자 지름이 50-150 nm인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노에멀젼은 전체 조성물을 기준으로 0.1-50.0 중량% 인 것을 특징으로 하는 조성물.

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