BR102020015881A2 - Saliva artificial carregadas com nanopartículas micelares de própolis vermelha e usos clínicos - Google Patents

Abstract

São propostas salivas artificiais carregadas com nanopartículas micelares de própolis vermelha e usos clínicos das mesmas. A invenção trata de uma composição de saliva artificial carregada com nanopartículas micelares de própolis vermelha demonstrou pelos ensaios in vitro estabilidade da formulação acima de 70 dias, baixa a moderada citotoxicidade frente a células epiteliais e atividade antibacteriana e antifúngica de amplo espectro frente a bactérias e fungos patogênicos presente na cavidade bucal de pacientes com sintomas de hipossalivação e xerostômicos com câncer de boca. Além de tratar infecções bacterianas orais, carcinomas espinocelular em região de cabeça e pescoço. Em outra modalidade de invenção saliva artificial base contendo extrato de natural hortelã, adicionada ou não de própolis vermelha, pode ser utilizada como agente promotor de analgesia com propriedades terapêuticas para tratar hipossalivação, xerostomia e infecções bacterianas bucais associada a câncer de boca, carcinomas espinocelular, uso de certos medicamentos promotores de xerostomia, equilibra a flora bacteriana bucal, reduz a proliferação de microorganismos oportunistas causadores de diversas doenças orais como cárie dental, halitoses, mucosites, úlceras da mucosa bucal, estomatites, além de aliviar sintomas de irritações, coceiras, sensação de secura e de queimação na mucosa oral responsáveis pela disgeusia, disfonia e disfagia, podendo ser utilizada na área médico-odontológica.

Description

SALIVA ARTIFICIAL CARREGADAS COM NANOPARTÍCULAS MICELARES DE PRÓPOLIS VERMELHA E USOS CLÍNICOS

[001] A presente invenção se insere no campo do desenvolvimento de produtos médicos e odontológicos, com potencial antisséptico bucal e repositor de salivar artificial, em pacientes com dificuldade de produzir saliva, em estados de hiposalivação dentre eles pacientes xerostômicos. Trata-se da preparação do sistema nanomicelar carregado com extrato de própolis vermelha para evitar incompatibilidades para a formulação de saliva artificial. Trata-se também do desenvolvimento de saliva artificial reformulada combinada com extrato de própolis vermelha de Alagoas, afim de agregar efeito antimicrobiano in situ e estabelecer aplicabilidade terapêutica, antisséptica e confortante da saliva artificial, contribuindo para a promoção de saúde bucal e para a qualidade de vida de pacientes xerostômicos e/ou com hipossalivação. Adicionalmente, são propostas as indicações do uso da saliva artificial com própolis vermelha, pelas excelentes propriedades antimicrobianas e baixa à moderada citotoxicidade apresentadas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] A saliva pode ser caracterizada pelo estado metabólico, emocional, hormonal, imunológico e nutricional do indivíduo (MANDEL, I. D. The diagnostic uses of saliva. J Oral PatholMed, v, 19, n. 3, p. 119- 25, 1990).

[003] Dentre as propriedades da saliva, destacam-se as funções de lubrificação da mucosa oral e dos epitélios orofaríngeo e gastrointestinal, formação do bolo alimentar, digestão de carboidratos (PEDERSEN, A.M. et al. Saliva and gastrointestinal functions of taste, mastication, swallowing and digestion. Oral Dis. V.8, p. 117-129, 2002) e atividades de proteção imunológica e antimicrobiana (ABIKO, Y et al. Defensins in saliva and the salivary glands. Med Electron Microsc. V.36, p. 247-252, 2003.

[004] A hipossalivação ou redução do fluxo salivar pode provocar a sensação de boca seca ou xerostomia (Palma L.F. et al. A novel method to evaluate salivary flow rates of head and neck cancer patients after radiotherapy: a pilot study. Brazilian journal of otorhinolaryngology. V. 84 n.2. p.227-31, 2018). Esta disfunção salivar pode gerar grande desconforto oral, disfonia, disfagia, disgeusia, reduzindo a qualidade de sono, além de aumentar a predisposição dos indivíduos para o desenvolvimento de doenças da cavidade bucal, como a cárie dental, mucosites e halitose. A longo prazo, a redução de fluxo salivar associada às mucosites e ulcerações da mucosa bucal podem afetar a ingestão de alimentos, levando a perda de peso e problemas nutricionais capazes de agravar o quadro de saúde geral do indivíduo e reduzindo significativamente a qualidade de vida dos pacientes (PINNA R. et al. Xerostomia induced by radiotherapy: an overview of the physiopathology, clinical evidence, and management of the oral damage. Therapeutics and clinical risk management. v.11, p.171, 2015).

[005] A hipossalivação pode ser causada por diversos fatores etiológicos como: doenças endócrinas como a diabetes tipos 1 e 2, hipo e hipertireoidismo; doenças autoimunes como a Síndrome de Sjogren, Lupus Eritematoso Sistêmico, Doença de Crohn, Sarcoidose, Amiloidose, Colite ulcerativa; doenças genéticas como Displasia Ectodérmica e Fibrose Cística; doenças crônicas como HIV/AIDS, hipertensão e fibromialgia; além de estar relacionada com o uso crônico de medicamentos como anticolinérgicos, anti-hipertensivos, analgésicos, antiretrovirais e antidepressivos. Em adição, diferentes graus de disfunção acinar podem ser diagnosticados em indivíduos com disfunções neurológicas (Doença de Parkinson e Alzheimer) e nutricionais (anorexia, bulemia, anemia e alcoolismo). (Tschoppe, P. et al. Etiologic factors of hyposalivation and consequences for oral health. Quintessence International. v. 47, n. 4, p. 321-33, 2010).

[006] Ressalta-se o alto grau de disfunção salivar principalmente em pacientes submetidos à radioterapia em região de cabeça e pescoço (Pinna R. et al. Xerostomia induced by radiotherapy: an overview of the physiopathology, clinical evidence, and management of the oral damage. Therapeutics and clinical risk management. v.11, p.171, 2015). A hipossalivação e xerostomia em pacientes irradiados pode permanecer por longos períodos, reduzindo significativamente a qualidade de vida dos pacientes (LAL, P et al. Objective and subjective assessment of xerostomia in patients of locally advanced head-and-neck cancers treated by intensity-modulated radiotherapy. Journal of Cancer Research and Therapeutics. V. 14, n.6, p.1196-201, 2018).

[007] Pesquisa de Llena-Puy (2006) (LLENA-PUY, C. The role of saliva in maintaining oral health and as an aid to diagnosis. Med Oral Patol Oral CirBucal., v. 11, n. 5, p. E449-455, 2006) afirmou que a saliva tem importante papel contra o desenvolvimento da cárie dental, pelas capacidades de eliminação de açúcares, de tamponamento, de atividade antimicrobiana e de equilíbrio no processo de remineralização do esmalte dentário. Assim, a saliva é um fluído de extrema importância na homeostase e garante a preservação da saúde bucal.

[008] Além do papel de remineralização do esmalte dental, capacidade tamponante, formação de película adquirida e lubrificação da mucosa bucal, a saliva possui importante papel antimicrobiano, uma vez que é composta por substâncias como aglutininas, histatinas, cistatinas, estaterinas, defensinas, imunoglobulinas, lisozimas, lactoferrinas e lactoperoxidases (GARDNER, M.S. et al. Comprehensive defensin assay for saliva. Anal Chem. V. 81, p. 557-566, 2009; DAWES, C. Salivary flow patterns and the health of hard and soft oral tissues. J. Am. Dent. Assoc. v.139, p. 18-24, 2008; ELIASSON L. et al. Minor salivary gland secretion rates and immunoglobulin A in adults and the elderly. Eur. J. Oral Sci. V.114, p. 494-499, 2006; Van NIEUW AMERONGEN, A. et al. Salivary proteins: protective and diagnostic value in cariology? Caries Res. V 38., p.247-253, 2004). Desta forma, a saliva contribui para o equilíbrio da microbiota bucal e consequentemente para a saúde (ELIASSON, L. et al. Dental plaque pH and micro-organisms during hyposalivation. Journal of Dental Research. V. 85, n.4, p.334-8, 2006; HUMPHREY, S.P. / WILLIAMSON, R.T. A review of saliva: normal composition, flow, and function. The Journal of Prosthetic Dentistry. V. 85, n.2, p.162-9, 2001).

[009] Quando ocorre a redução do fluxo salivar, há o desequilíbrio microbiano e redução da capacidade de limpeza, possibilitando a proliferação de bactérias oportunistas e patogênicas como Streptococcus, Staphylococcus, Actinomyces e Lactobacillus, além de fungos da espécie Candida (ALMSTAHL A. / WIKSTROM, M. Microflora in oral ecosystems in subjects with radiation-induced hyposalivation. Oral Dis. v. 14, p. 541-549, 2008; PARVINEN, T. / LARMAS, M. The relation of stimulated salivary flow rate and pH to lactobacillus and yeast concentrations in saliva. Journal of Dental Research. v. 60, n.12, p. 1929-35, 1981; BROWN, L.R. et al. Effect of radiation-induced xerostomia on human oral microflora. J. Dent. Res., v. 54, p. 740-750, 1975). O desequilíbrio da microbiota bucal pode aumentar a predisposição para o desenvolvimento infecções orais e sistêmicas de origem bucal (VISSINK, A. et al. Clinical management of salivary gland hypofunction and xerostomia in head-and-neck cancer patients: successes and barriers. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. V. 78, n.4, p. 983-91, 2010; KALUZNY, J. et al. Radiotherapy induced xerostomia: Mechanisms, diagnostics, prevention and treatment-Evidence based up to 2013. Otolaryngologia polska. V. 68, n.1, p.1-14, 2014).

[010] O diagnóstico de hiposalivação baseia-se na queixa principal do paciente em relatar sinais e sintomas de xerostomia, que podem incluir o desconforto bucal, a disgeusia, disfagia e disfonia. A causa etiológica da xerostomia pode ser investigada na anamnese em associação de exames laboratoriais das doenças correlatas. Além da queixa principal e identificação de possíveis causas etiológicas da hiposalivação, pode-se confirmar o diagnóstico de hipofunção de glândulas salivares, pela medida do fluxo salivar, que corresponde ao volume de saliva estimulada ou não estimulada produzido em 1 minuto. A medida do fluxo salivar é o método mais utilizado por clínicos e pesquisadores. Volumes inferiores à 0,1 ml/min e 0,5 ml/min de saliva não estimulada e estimulada, respectivamente, são característicos de indivíduos com hipofunção acinar, e podem justificar a necessidade de tratamento paliativo da disfunção (CHIAPPIN, S. et al. Saliva specimens: A new laboratory tool for diagnostic and basic investigation. Clin Chim Acta v. 383, p. 30-40, 2007; HAN, P. et al. Dose/Volume histogram patterns in Salivary Gland subvolumes influence xerostomia injury and recovery. Scientific reports. V. 9, n. 1, p.3616, 2019).

[011] Muitos tratamentos paliativos têm sido descritos na literatura, buscando reduzir os efeitos adversos da hipossalivação, e consequentemente, suas complicações (HAN, P. et al. Dose/Volume histogram patterns in Salivary Gland subvolumes influence xerostomia injury and recovery. Scientific reports. V. 9, n. 1, p.3616, 2019). Pode-se indicar a estimulação mecânica das glândulas salivares, por meio da mastigação de gomas de mascar sem açúcar, uso de sialogogos sistêmicos, como a pilocarpina, que estimula o sistema nervoso parassimpático (PINNA R. et al. Xerostomia induced by radiotherapy: an overview of the physiopathology, clinical evidence, and management of the oral damage. Therapeutics and clinical risk management. v.11, p.171, 2015) ou transplante cirúrgico das glândulas salivares, acupuntura, laserterapia de baixa potência (PALMA, L.F. et al. Impact of low-level laser therapy on hyposalivation, salivary pH, and quality of life in head and neck cancer patients post-radiotherapy. Lasers in Medical Science v. 32, n. 4, p. 827-32, 2017; GONNELLI, F.A. et al. Low-level laser therapy for the prevention of low salivary flow rate after radiotherapy and chemotherapy in patients with head and neck cancer. Radiol Bras. V. 49, n. 2, p. 86-91, 2016; LONCAR, B. et al. The effect of low-level laser therapy on salivary glands in patients with xerostomia. Photomedicine and Laser Surgery. V. 29, n.3, p.171-5, 2011) e utilização de salivas artificiais (SILVA M.P. et al. Influence of artificial saliva in biofilm formation of Candida albicans in vitro. Brazilian Oral Research v. 26, n.1, p. 24-8, 2012; NIEUW, A.; VEERMAN, E.C. Current therapies for xerostomia and salivary gland hypofunction associated with cancer therapies. Support Care Cancer, v. 11, p. 226-231, 2003). Qualquer tratamento para hipossalivação deve ser associado às instruções de higiene bucal.

[012] Existem várias formulações disponíveis no mercado, como sprays, pastilhas, géis e os enxaguantes bucais contendo carboximetilcelulose de sódio, gomas, mucina ou outras moléculas de ligação à água, assim como os líquidos oleosos ou géis. Geralmente a saliva artificial não apresenta efeitos colaterais graves a longo prazo (MOMM, F. et al. Different saliva substitutes for treatment of xerostomia following radiotherapy. Strahlentherapie und Onkologie. V. 181, n.4, p. 231-6, 2005). A saliva artificial é indicada como uso tópico para pacientes com hipossalivação (hipofunção salivar) e xerostomia (sensação de secura bucal) com o intuito de umedecer a boca, aliviar irritações, coceiras, sensação de secura e de queimação na mucosa oral, visando, principalmente, melhorias na disgeusia, disfonia e disfagia. Dependendo do grau de xerostomia, é necessário o uso frequente da saliva artificial, por vezes a cada hora (FEIO, M.; SAPETA, P. Xerostomia em cuidados paliativos. Acta Med Port.v.18, p. 459-466, 2005).

[013] Como discutido anteriormente, a saliva natural possui diversas propriedades físico-químicas que auxiliam no controle da microbiota bucal, entretanto, há poucas evidências sobre o papel antimicrobiano da saliva artificial, na literatura. Segundo HAHNEL et al. (HAHNEL, S. et al. Influence of saliva substitute films on initial Streptococcus mutans adhesion to enamel and dental substrata. Journal of Dentistry v. 36, n. 12, p. 977-83, 2008), algumas formulações de saliva artificial foram produzidas com a adição de proteínas, enzimas e/ou carboidratos com propriedades antimicrobianas, como a lisozima, lactoferrina, lactoperoxidase e seus substratos (tiocianato e peróxido de hidrogênio), visando maior efeito antimicrobiano in vitro e in vivo.

[014] No presente relatório, propõe-se a validação de uma formulação de saliva artificial contendo nanomicelas de própolis vermelha de Alagoas. A própolis é uma mistura complexa, formada por material resinoso, coletada pelas abelhas a partir de várias partes de plantas para proteção contra a proliferação de micro-organismos e assepsia da colmeia (PORTILHO, Débora R. et al. Avaliação da atividade antibacteriana e antifúngica da própolis produzida no estado do Tocantins. Revista Científica do ITPAC, v. 6, n. 2, abr. 2013). As própolis brasileiras foram divididas em 13 grupos principais, sendo o grupo da Mata Atlântica de Alagoas classificado como própolis vermelha (grupo 13). O extrato de própolis vermelha apresenta potente ação biológica, e alguns estudos apontam atividade antioxidante, antitumoral, antiviral, antiúlceras, cicatrizante e antibiótica, sendo as bactérias Gram positivas mais sensíveis aos extratos (OLIVEIRA-JÚNIOR, R. G. et al. Phytochemical screening, antioxidant and antibacterial activity of extracts from the flowers of Neoglazioviavariegata (Bromeliaceae). Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, Rajasthan, v. 4, n. 10, p. 4.489-4.494, 2012).

[015] A própolis vermelha possui compostos biologicamente ativos diferentes de outras própolis e de acordo com (ALENCAR S. M. et al. Chemical composition and biological activity of a new type of Brazilian propolis: red propolis. Journal of Ethonopharm v.113, n.2, p.278-283, 2007) o extrato de própolis vermelha tem sete compostos diferentes, sendo quatro deles, flavonoides: homopterocarpina, medicarpina, 4', 7-dimetoxi-2'- isoflavonol e 7,4'-dihidroxiisoflavona. Além destes, novos compostos foram identificados por Awaleet al., sendo eles: (6- S , 11- S ) -6a-ethoxymedicarpan, 2- (2 4’-di-hidroxifenil) -3-metil-6-metoxibenzofurano, e 2,6-di-hidroxi-2 - [(4-hidroxifenil metil] -3-benzofuranona.

[016] Compostos fenólicos como a Liquiritigenina, a Isoliquiritigenina e a Formononetina apresentam propriedades bioquímicas e farmacológicas, incluindo propriedades anti-inflamatórias, de hepatoproteção, antioxidante, propriedades anticancerígenas, além de comprovada atividade antimicrobiana, antifúngica, antiviral, e atividades antialérgicas (ZHU, X. et al. Liquiritigenin attenuates high glucose-induced mesangial matrix accumulation, oxidative stress, and inflammation by suppression of the NF-kB and NLRP3 inflammasome pathways. Biomedicine & Pharmacotherapy, 106, 976-982. 2018; KONG, W. et al. Antibacterial evaluation of flavonoid compounds against E. coli by microcalorimetry and chemometrics. Applied Microbiology and Biotechnology, 99(14), O trabalho de Lopes (2014) (LOPES, B. G. Análise da composição de amostras de própolis vermelha do Brasil por espectrometria de massas com ionização por eletrospray e cromatografia líquida de ultra-eficiência (UPLC-ESI-MS) e avaliação da atividade antioxidante e antimicrobiana. 2014. 117 f. Dissertação - Mestrado Profissional em Ciências, Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, 2014) demonstra a análise da composição química de 17 amostras de própolis vermelha coletadas de diferentes regiões do Brasil, Cuba, México e Venezuela, através da metodologia de espectrometria de massas com ionização por eletrospray e cromatografia líquida de ultra-eficiência (UHPLC). Em ambos os métodos de avaliação da composição química, foi identificado marcadores de compostos isoflavanoides, como a biochanina A, a formononetina, a daidzeina e marcadores de flavanona, como a pinocembrina. Nesta mesma dissertação foi realizado o teste de atividade biológica (antibacteriana e antioxidante) destas amostras, onde todas apresentaram atividade antimicrobiana, com destaque para a amostra coletada no estado de Alagoas, com maior atividade entre as própolis testadas. Entretanto, a maioria das própolis necessita de uma maior concentração para ter atividade antifúngica. Estes resultados, assim como os referidos anteriormente, neste trabalho, enfatizam a importante e potencial atividade terapêutica da própolis vermelha.6049-6058. 2015).

[017] Os compostos químicos encontrados na própolis vermelha de Alagoas, como os flavonoides, o ácido cafeico, o ácido benzoico e o ácido cinâmico, provavelmente, agem na membrana ou parede celular bacteriana dissolvendo a parte lipofílica, causando danos às células (SCAZZOCCHIO F.; D'AURIA F. D.; ALESSANDRINI D.; PANTANELLA F. Multifactorial aspects of antimicrobial activity of propolis. Microbiological Research. v.4, p.327-333, 2005). A outra parte é atribuída à flavononapinocembrina, ao flavonol galangina e ao éster feniletil do ácido cafeico, inibindo possivelmente a RNA-polimerase microbiana (UZEL A. et al. 2005. Chemical compositions and antimicrobial activities of four different Anatolian propolis samples. Microbiol Res 160: 189-195). Desta forma, seu efeito antimicrobiano acontece devido a um sinergismo de compostos, visto que, diferentes compostos presentes na própolis apresentam propriedades antimicrobianas (SILVA, B. B. et al. The effect of seasons on Brazilian red propolis and its botanical source: chemical composition and antibacterial activity. Natural Product Research, 31(11), 1318-1324. 2016).

[018] O papel antimicrobiano da própolis contra fungos dermatófitos e Candida spp. deve-se em parte ao seu alto teor de flavonoides. Em alguns estudos, pôde ser observado que a galangina, um tipo de flavonoide encontrado em amostras de própolis, demonstrou atividade inibitória contra Aspergillus tamarii, A. flavus, Cladosporium sphaerospermum, Penicillium digitatum e Penicillium italicum (AFOLAYAN A. J., MEYER J. J. The antimicrobial activity of 3,5,7 trihydroxyflavone isolated from the shoots of Helichrysumaureonitens. J Ethnopharmacol., v.53, n.3, p. 177-181, aug. 1997; CUSHNIE, T.; LAMB, A. Antimicrobilal activity of flavonoids. International Journal of Antimicrobial Agents, v. 20, p. 343-356, 2005).

[019] A atividade antibacteriana da própolis vermelha é mais limitada contra bactérias Gram negativas. Suspeita-se que essa maior resistência se deva ao fato dessas bactérias possuírem uma parede celular quimicamente mais complexa e membrana externa com alto teor lipídico, que de algum modo dificultaria a ação dos componentes ativos da própolis. Desta forma, os resultados do nosso estudo, assemelham-se com os já encontrados na literatura, onde a atividade da própolis vermelha apresenta-se mais efetiva contra micro-organismos Gram positivos quando comparado com Gram negativos (DANTAS S. R. P. et al. Antioxidant, antimicrobial, antiparasitic, and cytotoxic properties of various Brazilian propolis extracts. PLoS ONE 12 (3): e0172585. 2017).

[020] O trabalho de Cabral (2009) (CABRAL, I. S. R. et al. Composição fenólica, atividade antibacteriana e antioxidante da própolis vermelha brasileira. Química Nova. v. 32, n. 6, p. 1523-1527, 2009) avalia a ação antimicrobiana da própolis vermelha contra cepas de Staphylococcus aureus. A avaliação foi realizada por meio da determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) e as concentrações de própolis utilizadas variaram de 3,9 a 500 μg/mL. O extrato etanólico de própolis demonstrou potencial antibacteriano em baixas concentrações, com CIM que variou entre 62,5 e 125 μg/mL e CBM entre 250 e 500 μg/mL. Os resultados obtidos também revelaram que o potencial antimicrobiano foi aumentando à medida que os extratos foram fracionados. Esta atividade superior das frações pode ser explicada em função da maior quantidade relativa dos componentes biologicamente ativos em relação aos componentes totais.

[021] A pesquisa de Almeida et al. (2006) (ALMEIDA, F. R. et al. Associação entre doença periodontal e patologias sistêmicas. PortClin Geral 2006; 22:390-90.) verifica a atuação da própolis sobre biofilmes e doença periodontal, bem como significante redução dos níveis salivares de Streptococcus mutans, em crianças com cárie ativa, demonstrando que a solução de própolis é eficiente no controle químico do biofilme dental, enfatizando sua atuação como agente antimicrobiano e anticariogênico.

[022] A pesquisa de Holetz et al. (2002) (HOLETZ, F. B. et al. Screening of some plants used in the Brazilian folk medicine for the treatment of infectious diseases. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 97, n. 7, p. 1027-1031. 2002) classifica os extratos pela Concentração Inibitória Mínima (CIM) inferior a 100 μg/mL como tendo excelente atividade antimicrobiana; entre 100 e 500 μg/mL com atividade antimicrobiana moderada; entre 500 e 1000 μg/mL com limitada atividade bacteriostática; e acima de 1000 μg/mL foram considerados inativos (sem atividade antimicrobiana). No presente estudo, o extrato testado foi considerado com atividade inibitória muito alta (com a CIM de até 125 μg/mL), alta (entre 125-250 μg/mL), moderada (entre 250-500) e baixa atividade (acima de 500 μg/mL). A CIM foi determinada por espectrofotometria e foi definida como a menor concentração capaz de inibir 100% (CIM 100%) ou 50% (CIM 50%) do crescimento microbiano, em relação ao controle. Demonstrou-se que concentrações de até 125 μg/mL de nanopartículas de própolis vermelha pode ser efetivo contra diferentes espécies de bactérias Gram positivas oportunistas, tais como lactobacilos, enterococos, estafilococos e estreptococos, isolados da cavidade bucal, tendo atividade antimicrobiana considerada muito alta. Já contra leveduras oportunistas como espécies de Candida e espécies de bactérias Gram negativas, o extrato de própolis vermelha apresentou atividade antimicrobiana mais moderada à baixa, in vitro.

[023] Historicamente, os extratos vegetais sempre foram utilizados para o tratamento e prevenção de diversas patologias. A literatura relata que uma média de 50% dos novos medicamentos lançados no mercado, de alguma forma derivam de produtos naturais. E para que sejam garantidas a segurança e eficácia destes extratos, faz-se necessário a realização de testes de estabilidade e citotoxicidade (ORTMANN, C. F. Avaliação da estabilidade de extrato, fração e flavonoides C-glicosídeos presentes em Cecropiaglaziovii. 2013. 122 Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Universidade Federal de Santa Catarina, Florinanópolis).

[024] A estabilidade se define como o tempo em que o extrato ou matéria-prima, mantém dentro dos limites especificados e durante todo o período de estocagem e uso, as mesmas propriedades de quando foi fabricada. De acordo com a legislação, diversos fatores podem influenciar a estabilidade do produto, dentre eles estão: temperatura, umidade e luz, propriedades físicas e químicas de substâncias ativas e excipientes farmacêuticos, forma farmacêutica e sua composição, processo de fabricação, tipo e propriedades dos materiais de embalagem (ORTMANN, C. F. Avaliação da estabilidade de extrato, fração e flavonoides C-glicosídeos presentes em Cecropiaglaziovii. 2013. 122 Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Universidade Federal de Santa Catarina, Florinanópolis).

[025] Desta forma, os estudos de estabilidade são necessários para avaliar as propriedades do extrato produzido e a qualidade das formulações farmacêuticas com o intuito de prever, determinar ou acompanhar o seu prazo de validade, além de auxiliar na melhor escolha dos excipientes presentes na formulação, visto que, eles também são capazes de alterar a estabilidade do produto (SINGH, M. V. et al. Desenvolvimento farmacotécnico e avaliação da estabilidade de gel com extrato aquoso de camomila para uso bucal. Rev. Bras. Farm., 89 (2). 2008).

[026] A pesquisa de Vautier (2011) (VAUTIER, P. Desenvolvimento farmacotécnico de cápsulas contendo mistura de extratos tipificados de própolis verde e vermelha. 2011. 86 f. Dissertação- Mestrado Profissional em Farmácia, Universidade Bandeirante de São Paulo, São Paulo, 2011) ao desenvolver cápsulas contendo extratos de própolis vermelha e verde, notou uma diminuição no teor de fenóis totais e um aumento na capacidade antioxidante das formulações.

[027] Além disso, produtos químicos, convencionalmente, utilizados nos antissépticos ou colutórios bucais apresentam elevado potencial citotóxico, como é o caso do triclosan, do digluconato de clorexidina, do cloreto de cetilperidíneo, etanol, óleos essenciais e detergentes (MÜLLER H.-D. EICK S. MORITZ A. LUSSI A. GRUBER R. Citotoxicity and antimicrobial activity of oral rinses in vitro. BioMed Research International. 2017; 1-9). Nos últimos anos, tem-se reduzido o uso do triclosan em produtos de higiene e produtos odontológicos, devido aos efeitos citotóxicos e de pressão seletiva do antisséptico. O digluconato de clorexidina é um antisséptico de padrão ouro, com amplo espectro antimicrobiano, entretanto, o uso é limitado pois pode reduzir a sensibilidade gustativa, pode causar pigmentação de esmalte dentário e de restaurações estéticas, além de causar e pressão seletiva de micro-organismos resistentes (VARONI E. TARCE. M.. LODI. G.. CARRASI. A. Chlorhexidina (CHX) in dentistry: state of the art. Minerva Estomatol. 2012; 61: 399-419).

[028] Após uma ampla pesquisa sobre saliva artificial e outros produtos que levem em sua formulação a própolis vermelha como potencial antimicrobiano, o resultado revelou a existência de algumas aplicações da própolis em produtos farmacêuticos e odontológicos, exceto em saliva artificial, na forma de patentes.

[029] A própolis vermelha tem sido amplamente estudada como matéria-prima no desenvolvimento de produtos tecnológicos, tais como: desenvolvimento de verniz dentário de própolis vermelha para controle de cárie dentária; nanoesferas do extrato de própolis vermelha e composições dermocosméticas contendo as mesmas; composição farmacêutica semissólida para tratamento da leishmaniose tegumentar, além de método de utilização e composição à base de extrato hidroalcóolico de própolis vermelha, a base de isoflavonas, ácidos orgânicos com efeito quimiopreventivo e quimioterápico em neoplasias malignas. Os produtos tecnológicos à base de Própolis Vermelha de Alagoas listados acima possuem os respetivos números de registro: BR 10 2016 019014 2, BR 10 2016 018124, BR 10 2015 031753 0 e BR 10 2015 017528 0.

[030] Existe também algumas aplicações, tais como: saliva artificial com uso de aminoácido básico em forma livre ou de sal para o tratamento da xerostomia; formulação de colutório contendo combinação sinérgica dos ativos eugenol, extrato de salvia officinalis e triclosan; formulação de pomada para uso odontológico em orabase contendo combinação sinérgica dos ativos eugenol, extrato de saliva officinalis e triclosan. E estes produtos possuem os respectivos números de registros: US2009033291 2009, BR 10 2014 030116 0 e BR 10 2014 030115 1.

[031] A presente invenção saliva artificial carregadas com nanomicelas de própolis vermelha apresenta amplo espectro de inibição in vitro sobre diferentes espécies de micro-organismos, como bactérias Gram positivas, Gram negativas e leveduras da espécie de Candida, isolados da cavidade bucal de indivíduos com hipossalivação ou com xerostomia.

[032] A presente invenção saliva artificial carregadas com nanomicelas de própolis vermelha também apresenta boa estabilidade quanto à atividade antimicrobiana, mantendo esta atividade muito alta, alta à moderada, após 70 dias à temperatura ambiente;

[033] Esta invenção demonstra de baixa à moderada citotoxicidade da saliva artificial carregadas com nanomicelas de própolis sobre células epiteliais, nas concentrações de 15,62 a 500 μg/mL em relação aos antissépticos bucais (clorexidina, triclosan, álcool e detergentes, fluoretos), os quais apresentam elevado potencial citotóxico podendo induzir à perda da sensibilidade gustativa, à pigmentação dentária e ao aumento da pressão seletiva.

[034] A patente proposta reivindica saliva artificial associada ao extrato de própolis vermelha, combinadas ou não de outros adjuvantes naturais, além de diminuir o sintoma de secura bucal, exercerá papel antimicrobiano frente às bactérias e fungos patogênicos, prevalentes na cavidade bucal de indivíduos imunocomprometidos, e portanto, demonstra efetividade desse antisséptico natural e sua aplicabilidade prática na área odontológica e médica.

[035] A invenção proposta neste documento de patente busca o preenchimento da lacuna tecnológica existente no que se refere ao desenvolvimento de saliva artificial com potente atividade antibacteriana. Por ser associada com antisséptico natural, própolis vermelha de Alagoas combinadas ou não de essência de hortelã, nossa tecnologia se difere dos vários tipos de salivas artificiais existentes no mercado, sendo mais efetiva na redução de micro-organismos oportunistas e assim, a reposição de fluídos e eletrólitos poderia também equilibrar o microbioma bucal.

[036] A utilização de uma nova composição contendo nanomicelas de própolis vermelha pode atuar no alívio de sintomas como disgeusia, disfagia e dificuldades na mastigação. Sendo assim, constitui em uma boa alternativa de intervenção clínica odontológica-oncológica de reduzido custo e alto eficácia de tratamento.

[037] Além disso, as composições de saliva artificial base com essência de hortelã podem ser utilizada para reduzir ou aliviar os desconfortos de pacientes com problemas de câncer de boca, carcinoma espinocelular em região de cabeça e pescoço durante tratamento radioterápico ou quimioterápico pelas propriedades citotóxicas contra células de câncer, pode auxiliar no tratamento de células malignas bucal associada a infecções bacteriana orais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[038] A invenção trata de uma composição de saliva artificial carregada com nanomicelas de própolis vermelha demonstrou pelos ensaios in vitro estabilidade da formulação acima de 70 dias, baixa a moderada citotoxicidade frente a células epiteliais e atividade antibacteriana e antifúngica de amplo espectro frente a bactérias e fungos patogênicos presente na cavidade bucal de pacientes com sintomas de hipossalivação e xerostômicos com câncer de boca. A presente invenção apresenta saliva artificial carregadas com nanomicelas de própolis vermelha apresentam aplicabilidade na área médica e odontológica para tratar problemas de patologias bucais relacionadas a hipossalivação, xerostomia, infecções bacterianas orais, carcinomas espinocelular em região de cabeça e pescoço. Em outra modalidade de invenção saliva artificial base contendo extrato de natural hortelã, adicionada ou não de própolis vermelha, pode ser utilizada como agente promotor de analgesia também apresenta propriedades terapêuticas para tratar hipossalivação, xerostomia e infecções bacterianas bucais associada a câncer de boca e hipossalivação, carcinomas espinocelular, dentre outros problemas decorrentes de hipossalivação como, uso de certos medicamentos promotores de xerostomia, equilibra a flora bacteriana bucal, reduz a proliferação de microorganismos oportunistas causadores de diversas doenças orais como cárie dental, halitoses, mucosites, úlceras da mucosa bucal, estomatites, além de aliviar sintomas de irritações, coceiras, sensação de secura e de queimação na mucosa oral responsáveis pela disgeusia, disfonia e disfagia, podendo ser utilizada na área médico-odontológica.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[039] A modalidade da invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser explicadas e compreendidas mediante referência aos desenhos em anexo e a seguinte descrição:

[040] A Figura 1 anexa apresenta distribuição da frequência de cepas de diferentes espécies, isoladas da cavidade bucal, quanto aos valores de CIM 100% da saliva artificial com diferentes concentrações de própolis vermelha. Classificação da atividade antimicrobiana: muito alta (CIM 15,62 - 125 μg/mL); atividade alta (CIM 125-250 μg/mL); atividade moderada (CIM 250-500 μg/mL) e baixa (CIM ≥ 500 μg/mL).

[041] A saliva contendo própolis vermelha teve alta atividade inibitória em concentrações de até 125 μg/mL, inibindo 100% do crescimento de enterococos, estafilococos, estreptococos mutans e lactobacilos, que neste estudo, representam o grupo das bactérias Gram positivas. Adicionalmente, com base nestes resultados, a própolis vermelha pode exercer um importante papel no controle de micro-organismos cariogênicos, como lactobacilos e estreptococos.

[042] Houve alta suscetibilidade de bactérias Gram positivas orais à saliva artificial com própolis vermelha. Na concentração de até 125 μg/mL de própolis todas as espécies de bactérias orais Gram positivas foram inibidas em 100% em relação ao controle (Figura 1), sugerindo que nesta concentração não haveria pressão seletiva sobre estes microorganismos, in vivo, durante a utilização do extrato.

[043] A Figura 2 anexa apresenta porcentagem de inibição de micro-organismos isolados da cavidade bucal de indivíduos oncológicos, quanto aos valores de CIM 100% da saliva artificial com diferentes concentrações de própolis vermelha. Classificação da atividade antimicrobiana: muito alta (CIM 15, 62 - 125 μg/mL); atividade alta (CIM 125-250 μg/mL); atividade moderada (CIM 250-500 μg/mL) e baixa (CIM ≥ 500 μg/mL).

[044] Cerca de 31% do total de 89 cepas testadas não foram inibidas em 100%, na concentração máxima de 500 μg/mL de própolis em saliva artificial (Figura 2). Estas cepas corresponderam a cerca de 40% das bactérias Gram negativas e 50% das leveduras testadas.

[045] A Figura 3 anexa apresenta distribuição da frequência de cepas de diferentes espécies, isoladas da cavidade bucal, quanto aos valores de CIM 50% da saliva artificial com diferentes concentrações de própolis vermelha. Classificação da atividade antimicrobiana: muito alta (CIM 15, 62 - 125 μg/mL); atividade alta (CIM 125-250 μg/mL); atividade moderada (CIM 250-500 μg/mL) e baixa (CIM ≥ 500 μg/mL).

[046] A Figura 4 anexa apresenta porcentagem de inibição de micro-organismos isolados da cavidade bucal de indivíduos oncológicos, quanto aos valores de CIM 50% da saliva artificial com diferentes concentrações de própolis vermelha. Classificação da atividade antimicrobiana: muito alta (CIM 15, 62 - 125 μg/mL); atividade alta (CIM 125-250 μg/mL); atividade moderada (CIM 250-500 μg/mL) e baixa (CIM ≥ 500 μg/mL).

[047] cerca de 95% dos isolados clínicos foram inibidos em 50% do crescimento com concentrações de até 250 μg/mL de própolis vermelha e apenas 4,49% com concentrações de até 500 μg/mL, evidenciando que para a maioria dos patógenos orais a própolis apresenta atividade antimicrobiana muito alta ou alta.

[048] A Figura 5 anexa apresenta distribuição da frequência de micro-organismos Gram positivos e Gram negativos quanto aos valores de CIM com 100% de inibição, nos testes realizados em T1 (tempo 0), T2 (70 dias após T1) e T3 (140 dias após T1).

[049] Para observar e confirmar a estabilidade da ação antimicrobiana do extrato de própolis utilizado neste estudo, repetiu-se duas vezes (em 70 dias e 140 dias) o teste da Concentração Inibitória Mínima (CIM 100%) e comparou-se com os resultados obtidos anteriormente (T1 = tempo 0).

[050] No primeiro teste realizado (T2 = 70 dias), 46% das cepas testadas mantiveram o valor de CIM inicial, ou seja, obtido em T1, e cerca de 53% foram inibidas em concentrações superiores, indicando perda parcial da atividade antimicrobiana. No segundo teste, realizado em 140 dias após T1, 62% das cepas apresentaram o mesmo CIM obtido em T2 .

[051] A Figura 6 anexa apresenta porcentagem de viabilidade de células epiteliais de mucosa NOK-si em monocamada, após tratamento por 12 h com (1) veículo (PCL, acetona e pluronic), (2) veículo contendo 15,62; 31,25; 62,5; 125; 250 ou 500 μg/mL de nanopartículas de própolis vermelha, (3) triclosan a 0,03% ou (4) controle (meio de cultura sem veículo). Classificação de toxicidade: Baixa citotoxicidade: de 50-90% de viabilidade celular em relação ao controle; Moderada toxicidade: de 20 a 49% de viabilidade celular em relação ao controle; Alta toxicidade: abaixo de 20% de viabilidade celular em relação ao controle.

[052] O veículo contendo PCL, pluronic e acetona não foi tóxico às células da linhagem NOK-si (FIGURA 6). O mesmo veículo contendo de 15,62 a 125 μg/mL de nanopartículas de própolis vermelha apresentou baixa citotoxicidade, e nas concentrações de 250 à 500 μg/mL apresentou moderada toxicidade celular. A toxidade da própolis vermelha foi menor do que a citotoxicidade do triclosan a 0,03%, que comumente é utilizado em colutórios ou enxaguantes bucais.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[053] A saliva artificial carregada com nanomicelas de extrato acetato de etila de própolis vermelha, aqui chamados de saliva artificial carregada com nanomicelas de própolis vermelha, e usos clínicos descritos na presente invenção podem ser melhor detalhados e compreendidos mediante referência às figuras presentes neste documento e a seguinte descrição:

ESTUDO IN VITRO Preparação da Saliva Artificial Base

[054] A saliva artificial base foi planejada e produzida no Laboratório de Bacteriologia Molecular e Clínica, situado no Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde (ICBS) -Universidade Federal de Alagoas (UFAL), coordenado pela Profa. Dra. Regianne Umeko Kamiya. A saliva artificial base foi estabelecida também após estudo sensorial com os próprios usuários do CACON-HUPAA durante estudo clínico piloto, que definiu então a seguinte composição:

[055] Foi realizada a pesagem dos seguintes componentes utilizados como adjuvantes farmacêuticos: KCl (0,96g); NaCl (0, 674g); MgCl2 (0,041g); K2HPO4 (0,116g); metilparabeno (1,0g); goma xantana (3,5g) e sorbitol (20,0g). Ambos os adjuvantes farmacêuticos foram homogeneizados com mixer em 1,0 L de água ultrapura e colocados em recipiente para etapa de esterilização.

[056] A saliva artificial foi esterilizada em autoclave a 121°C, 1 atm, por 15 minutos.

[057] Após a esterilização adicionou-se 0,5mL de essência de hortelã e então a saliva artificial foi distribuída, assepticamente, em frascos tipo spray, previamente, esterilizados em imersão com ácido peracético a 2% e higienizados com água destilada estéril.

[058] Na composição de saliva artificial base, o adjuvante farmacêutico sorbitol apresenta função edulcorante; o adjuvante farmacêutico, goma xantana, apresenta função espessante para melhorar a viscosidade da saliva artificial; os sais apresentam função de ajuste da isotonicidade da solução e o metilparabeno, apresenta função conservante da saliva artificial.

Preparação de nanomicelas carregadas com extrato de própolis vermelha

[059] O extrato bruto foi obtido pesando-se 100 gramas de própolis vermelha de Alagoas e extraída por maceração com solução hidroalcoólica 800 mL por 72 horas. Em seguida, foi rotaevaporada para evaporação do solvente e concentração da massa sólida solúvel em solução hidroalcoólica, obtendo-se 60 gramas de extrato bruto.

[060] A fração acetato de etila, a qual foi obtida por particionamento de solvente do extrato hidroalcolico 80% e acetato de etila proporção de 20:80, usando 20 g de extrato bruto, 300 mL de solução hidroalcoólica e 700 mL de acetato de etila. Após o particionamento, a fase acetato de etila foi rotaevaporada e a massa sólida (8 g) foi obtida livre de solvente.

[061] O sistema nanomicelar foi preparado utilizando poli-s-caprolactona (PCL, peso molecular 10.000) e pluronic F108 (peso molecular 14.000) na proporção de (70:30, massa:massa) foi preparado pesando 70 mg de PCL e 30 mg de pluronic e adicionado 100 mg de extrato acetato de etila de própolis vermelha. O sistema nanomicelar foi solubilizado em acetona 5 mL.

Preparação de saliva artificial carregadas com nanomicelas de própolis vermelha

[062] Foi utilizada a mesma metodologia de elaboração da saliva artificial base (descrita anteriormente, sem o acréscimo de essência de hortelã).

[063] Após a esterilização, o sistema nanomicelar solubilizado em acetona, conforme etapa anterior, diluído para 20 mL com saliva artificial base para obter concentração de 500 μg/mL de sistema nanomicelar de extrato de própolis vermelha.

[064] Adicionou-se o sistema nanomicelar de extrato de própolis vermelha na concentração de 500 μg/mL para realização do teste de solubilidade e 563,64 μg/mL para avaliação dos componentes do extrato na saliva artificial carregadas com nanomicelas de própolis vermelha, por cromatografia HPLC (estudos in vitro). Para análise do efeito antimicrobiano sobre patógenos orais, citotoxicidade sobre células epiteliais de mucosa oral e estabilidade do produto, foram utilizadas concentrações de 15,62 a 500 μg/mL do sistema nanomicelar de extrato própolis vermelha.

Teste de solubilidade do nanomicelas de extrato de própolis vermelha em saliva artificial base

[065] Utilizou-se policaprolactona (PCL) como promotor de formação do sistema micelar e Pluronic como estabilizante do extrato de própolis vermelha, proveniente da fração acetato de etila, à saliva artificial, conforme descrito anteriormente, já que o composto natural apresenta baixa solubilidade em água, em razão das características apolares da maior parte das substâncias que a compõem. Para o teste de solubilidade, utilizou-se saliva artificial contendo o extrato de própolis vermelha na concentração de 500 μg/ml, dissolvido em acetona, pluronic e PCL. Após completa solubilização, observou-se a presença ou ausência de precipitação do extrato em saliva, nos períodos de 24h, 48h, 72h, 1 semana, 30 dias, 70 dias e 140 dias após a solubilização inicial. Para tanto, o material solubilizado foi mantido à temperatura ambiente, em superfície estática e protegido de luminosidade, durante todo o período de experimentação.

Determinação dos marcadores de própolis vermelha presentes nas composições: sistema nanomicelar de própolis vermelha e saliva artificial carregadas com nanomicelas de própolis vermelha

[066] A identificação e quantificação de marcadores no extrato de acetato de etila, nanocomposito micelar a 0.56% e saliva artificial carregadas com nanomicelas de própolis vemelha foram realizadas em cromatografia líquida de Ultra Performance, juntamente com detector de matriz de diodos (UPLC-DAD) de Shimadzu® (Tóquio, Japão) (ALMEIDA E. T. C. et al. Chemical and microbiological characterization of tinctures and microcapsules loaded with Brazilian red propolis. J Pharmaceutical Analysis 2017).

[067] A separação de flavonoides foi realizada em coluna de fase reversa (C18, 150 mm, 4,6 mm, 5μm), uma fase móvel que consistiu no solvente A (água Milli-Q) e no solvente B (acetonitrila), bombeado a um caudal de 0,3 mL / min. O gradiente de eluição inicial consistiu em 70% de água (A) e 30% de acetonitrila (B) (V / V). A coluna foi eluída com uma variação (B) da seguinte forma: 0 a 2 min 30% de B, 2 a 5 min 36% de B, 5-8 min 46% 14 de B, 8-11 min 52% de B, 11-14 min 52% de B, 14-17 min 57% de B, 17-20 min 62% de B, 20-24 min 62% de B, 24-28 min 68% de B, 28-32 min 72 % de B, 3236 min 90% de B, 36-42 min 97% de B, 42-50 min 100% de B, 50-55 min 100% de B, 55-57 minutos, a acetonitrila foi reduzida para 30 % e esta condição foi mantida até 60 min. O volume de injeção foi de 2μL. Em seguida, o padrão analítico de flavonoides descrito como marcadores (daidzeína, liquiritigenina, pinocembrina, pinobanskina, isoliquiritigenina, formononetina e bioquanina A), extrato de acetato de etila e nanocompositomicelar de 1% foram preparados em solução de reserva de 10000 μg/mL usando acetona como solvente e diluído para a concentração de 563,64 μg/mL.

Efeito antimicrobiano: Espectro antimicrobiano da saliva artificial carregadas com nanomicelas de própolis vermelha

[068] Foi testada o extrato acetato de etila de própolis vermelha nas concentrações seriadas de 15,62 a 500 μg/ml diluída em saliva artificial e meio de cultura BHI, contra 89 micro-organismos Gram positivos e negativos, oportunistas, isolados, preliminarmente, da cavidade bucal de pacientes oncológicos e xerostômicos. Antissépticos convencionais, como triclosan 0,2% e gluconato de clorexidina a 0,12%, foram utilizados como controles.

[069] Preliminarmente, as cepas foram reisoladas em seus respectivos meios semisseletivos: para Staphylococcus spp.: Ágar Manitol Salgado; Candida spp.: meio BCG com adição de cloranfenicol (0,5 g/L); Lactobacillus spp.: meio MRS (Man Rogosa and Sharpe); Streptococcus spp. o meio Agar Mitis Salivarius com Bacitracina e para Enterococcus spp.: Agar KFS com trifeniltetrazólio 1%. Colônias puras e isoladas de micro-organismos, crescidas em meios semisseletivos, foram ressuspendidas em 5 mL de NaCl a 0,9%, igualando-se a absorbância da escala 0,5 MacFarland, correspondente a cerca de 108 UFCmL-1 de bactérias. Cerca de 20 μL da suspensão bacteriana, contendo cerca de 105 UFCmL-1 foi adicionada à cada microdiluição seriada do extrato (15,62 a 500 μg/mL) em saliva artificial e meio BHI, totalizando 100 μL em cada poço. Os solventes ou veículos da própolis vermelha (acetona, PCL e pluronic) diluídos em saliva artificial foram usados como placebo (controle positivo). Clorexidina 0,12% e triclosan 0,2% foram utilizados como controles.

[070] Os testes foram realizados em quadruplicata. Foi determinada a Concentração Inibitória Mínima (CIM), por espectrofotometria em leitor de Elisa a 560-630 nm (CLSI, 2010. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standard for antimicrobial susceptibility testing. M100-S20-U. CLSI, Wayne, PA, 2010); (LIMA, B, A. et al. Halistanol sulfate A and rodriguesines A and B are antimicrobial and antibiofilm agents against the cariogenic bacterium Streptococcus mutans. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 24, p. 651-659, 2014). A CIM foi definida como a menor faixa de concentração do antimicrobiano capaz de inibir 100% (CIM 100%) ou 50% (CIM 50%) do crescimento microbiano, em relação ao controle positivo, que corresponde ao inóculo do micro-organismo crescido em solvente, saliva artificial e meio de cultura, sem o extrato.

Espectro antimicrobiano da saliva artificial carregadas com nanomicelas de própolis vermelha sobre fungos e bactérias da cavidade bucal

[071] Para o teste antimicrobiano foram reativadas cepas de Staphylococcus aureus, Staphylococcus não aureus, Lactobacillus spp., Enterococcus faecalis, Estreptococos grupo mutans, Bacilos Gram Negativos (BGN), Candida spp., isoladas, em estudos prévios, da cavidade bucal de indivíduos oncológicos.

[072] A atividade antimicrobiana da saliva artificial carregada com nanomicelas de própolis vermelha foram testadas contra 89 cepas isoladas da cavidade bucal de indivíduos oncológicos. Foram testadas 32 bactérias Gram positivas, sendo: 3 Enterococcus faecalis. 4 Streptococcus grupo mutans (EGM); 11 Lactobacillus spp. e 14 Staphylococcus spp. Adicionalmente, 21 cepas de Candida spp. e 36 isolados de Bacilos Gram Negativos (BGN) foram testados. Não houve crescimento microbiano detectável, em clorexidina 0,12% e triclosan 0,2%.

Avaliação da estabilidade da saliva artificial carregadas com nanomicelas de própolis vermelha

[073] Para a avaliação da estabilidade da saliva artificial contendo extrato de própolis vermelha foi desenvolvida uma formulação-teste e avaliou-se a atividade a antimicrobiana (como descrito no item 6.3.1) em intervalos de 0 (T1), 70 (T2) e 140 (T3) dias, sendo T1 no dia 18/07/17, T2 dia 26/09/17 e T3 dia 06/12/17. A formulação foi preservada à temperatura ambiente, protegida da luminosidade, em recipiente fechado e esterilizado.

Efeito citotóxico

[074] Foram realizados testes para testar o efeito citotóxico do extrato de própolis, sobre células epiteliais de mucosa oral, in vitro, com a colaboração da Profa. Dra. Marlise Inêz Klein da Universidade do Estado de São Paulo, campus Araraquara(UNESP - Araraquara).

Cultura de células

[075] Linhagens NOK-si (CASTILHO R. M. et al. Rac1 is required for epithelial stem cell function during dermal and oral mucosal wound healing but not for tissue homeostasis in mice. PLoS ONE. v. 5, 2010) em meio DENEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, ou DMEM, GIBCO, Grand Island, NY, EUA) com 2,0 mmol/L-1 de glutamina; contendo 10% de soro fetal bovino (SFB, GIBCO, Grand Island, NY, EUA), penicilina G (10,000 μg.mL-1), estreptomicina (10,000 μg.mL-1) e anfotericina (25 μg.mL-1) (Invitrogen) foram obtidas em incubadora, contendo CO2 a 5% e a 37°C. As células foram cultivadas até atingirem a confluência (90%), lavadas com tampão fosfato PBS 1X (NaCl 140 mmol.L-1, KCl 3,0 mmol.L-1, Na2HPO4 4,30 mmol.L-1, KH2PO4 1,40 mmol.L-1), removidas com solução de tripsina (0,05%)/EDTA (0,53 mmol.L-1) (Invitrogen) e então submetidas a centrifugação a 400 x g por 5 minutos. As células foram ressuspendidas em meio de cultura e replaqueadas. O meio foi trocado a cada dois ou três dias. Para os experimentos foram usadas células entre a 3a e 8a passagem. As células foram contadas em câmara de Neubauer e plaqueadas de 4,5 x 105 células/poço.

Ensaio de viabilidade celular - MTT

[076] A citotoxidade resultante da presença do agente sobre as células foi determinada pelo ensaio colorimétrico de viabilidade celular MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl) 2,5-difeniltetrazolio brometo] (Sigma-Aldrich).

[077] O ensaio de MTT consiste na detecção da viabilidade celular, de acordo com a capacidade de conversão do sal tetrazolio MTT em um produto de coloração roxa que pode ser medido em espectrofotômetro (Figura 10). O princípio desse método consiste no fato de que as células viáveis possuem mitocôndrias competentes, que promovem a respiração celular e liberam no meio, espécies redutoras provenientes da cadeia respiratória celular, o que promove a redução do sal MTT amarelo no produto corado, roxo (MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods, Amsterdam, v. 65, p. 5563, 1983); (VISTICA D. T. et al. Tetrazolium-based Assays for Cellular Viability: A Critical Examination of Selected Parameters Affecting Formazan Production. Cancer Res 51:2515-2520. 1991).

[078] O ensaio foi realizado em cultura de células em monocamadas, com 12 horas de contato com própolis vermelha, PCL, pluronic e acetona (em concentrações de 15,62 a 500 μg/mL de própolis) e com controles (Triton-X, meio RPMI ou PCL, pluronic e acetona sem a própolis e triclosan a 0,03%), suplementado com SFB 10%, penicilina G (10.000 μg/mL), estreptomicina (10.000 μg/mL) e anfotericina (25 μg/mL). Após o período de incubação, as células foram lavadas com 500 μL de PBS (pH 7,4), e incubadas por 4 horas a 37°C com 250 μL de solução de MTT (5,0 mgmL-1). Em seguida os cristais de formazam foram solubilizados em 250 μL de 2-propanol foram adicionados a cada poço. As medidas espectrofotométricas foram realizadas em comprimento de onda de 562 nm (Reader 400 EZ - Biochrom).

[079] O veículo contendo PCL, pluronic e acetona não foi tóxico às células da linhagem NOK-si. O mesmo veículo contendo de 15,62 a 125 μg/mL de nanomicelas carregadas com extrato de própolis vermelha apresentou baixa citotoxicidade, e nas concentrações entre 250 e 500 μg/mL apresentou moderada toxicidade celular. A toxidade da própolis vermelha foi menor do que a citotoxicidade do triclosan a 0,03%, que comumente é utilizada em colutórios ou enxaguantes bucais.

[080] Manuscrito de MÜLLER et al. 2017 (MÜLLER H.-D. EICK S. MORITZ A. LUSSI A. GRUBER R. Citotoxicity and antimicrobial activity of oral rinses in vitro. BioMed Research International. 2017; 1-9), ao testar a citotoxidade e atividade antimicrobiana de 12 colutórios ou enxaguantes bucais comerciais demonstrou que cerca de 80% dos produtos testados apresentaram alta toxicidade, inibindo mais de 80% de células epiteliais e de fibroblastos após 1 min e 12 horas de exposição. Os colutórios continham diferentes tipos de antimicrobianos como digluconato de clorexidina, óleos essenciais, detergentes, fluoretos ou etanol.

ESTUDO IN VIVO Tipo de Estudo

[081] Realizou-se um ensaio clínico, prospectivo e longitudinal, envolvendo 14 pacientes oncológicos, previamente, submetidos à radioterapia em região de cabeça e pescoço e com sintomas de xerostomia. Os pacientes utilizaram a saliva artificial base com essência de hortelã, produzida no Laboratório da UFAL. Antes e após a utilização do produto, os pacientes responderam ao questionário validado de avaliação da qualidade vida da Universidade de Washington-EUA. Após a boa aceitação da saliva artificial pelos usuários, realizou-se a incorporação da própolis vermelha de Alagoas à formulação de saliva artificial utilizada, previamente, objetivando-se agregar ao produto, atividade antimicrobiana. O produto gerado foi testado in vitro, quanto: (1) à avaliação da composição do extrato de própolis vermelha por HLPC, (2) quanto à solubilidade, (3) atividade inibitória sobre micro-organismos bucais oportunistas, (4) citotoxicidade e (5) estabilidade. Critérios de inclusão: após aprovação pelo CEP da UFAL e assinatura do TCLE, foram incluídos, no estudo, pacientes atendidos no Centro de Assistência de Alta Complexidade em Oncologia (CACON) do Hospital Universitário Professor Alberto Antunes/Universidade Federal de Alagoas, diagnosticados com carcinoma espinocelular, em região de cabeça e pescoço, após tratamento radioquimioterápico.

Local do Estudo

[082] O trabalho foi desenvolvido no (1) Centro de Assistência de Alta Complexidade em Oncologia (CACON) do Hospital Universitário Professor Alberto Antunes/Universidade Federal de Alagoas, (2) Laboratório de Bacteriologia Molecular e Clínica, do Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde (ICBS) da UFAL, (3) na ESENFAR (Escola de Enfermagem e Farmácia) da UFAL e na (4) Faculdade de Odontologia de Araraquara da Universidade Estadual Paulista (UNESP).

ESTUDO IN VIVO: Efeitos do uso da saliva artificial base contendo essência de hortelã sobre a qualidade de vida de pacientes com hipossalivação

[083] Foi avaliado o efeito da saliva artificial base com essência de hortelã e (sem extrato de própolis) sobre a aceitação e melhoria dos sintomas da hipossalivação e qualidade de vida de 14 pacientes oncológicos. Os pacientes foram orientados a utilizar a saliva artificial em spray, num intervalo de 2-3 horas, principalmente 5 minutos antes das refeições, antes de dormir e após higienização bucal, por 2 semanas ininterruptas. Foi utilizado um questionário validado, da Universidade de Washington, Seattle - EUA, para a avaliação da qualidade de vida dos pacientes antes e após, o uso da saliva artificial reformulada. Os domínios relacionados com a saliva, como: mastigação, disgeusia, disfagia e disfonia foram comparados, antes e após tratamento com saliva artificial, usando o teste Wilcoxon, com nível de significância de 5%.

Exemplos

[084] Tabela 1. Determinação dos marcadores (1) Extrato Acetato de Etila de Própolis Vermelha, (2) Solução Nanomicelar de Extrato de Própolis Vermelha e (3) Saliva Artificial carregada com nanomicelas de extrato da própolis vermelha na concentração aproximada de 563,64 μg/mL.

[085] Tabela 2. Detalhamento dos escores obtidos no Questionário de Avaliação de Qualidade de Vida da Universidade de Washington para os domínios. Wilcoxon, p < 5%. (*diferença estatisticamente significativa).

[086] Houve melhoras na qualidade de vida dos pacientes, após o uso da saliva artificial base contendo essência de hortelã, nos domínios deglutição, mastigação, fala e salivação, exceto para o paladar (Tabela 2).

[087] A capacidade tamponante, limpante e hidratante da saliva artificial podem ter contribuído para a melhoria de sintomas relacionados com a hipossalivação e xerostomia, impactando na melhoria da qualidade de vida, na maioria dos domínios avaliados (Tabela 2).

Claims (10)

1. Saliva artificial carregadas de nanomicelas de compostos bioativos caracterizado pelo fato de compreender:

   • a) Edulcorante em proporção entre 10 e 30%, preferencialmente entre 15 e 25%;
   • b) Espessante em proporção entre 1 e 8%, preferencialmente entre 2 e 4,5%, e mais preferivelmente entre 2,5 e 4,0%;
   • c) Sais de NaCl, KCL, MgCl2 e K2HPO4 promotores de isotonicidade em proporção entre 0,70 e 2,5%, preferencialmente entre 0,9 e 1,85%;
   • d) conservante em proporção entre 0,05 e 0,20%, preferencialmente entre 0,08 e 0,15%;
   • e) Sistema de Nanomicelas carregadas de extrato de própolis vermelha de Alagoas em proporção entre 0,5 e 3,5%, preferencialmente entre 2,2 e 2,7%, e mais preferivelmente 2,5% de extrato de própolis vermelha na composição;
   • f) Essência de hortelã em proporção entre 0,01 e 0,2%, preferencialmente 0,05%, sendo opcional na composição.
2. Saliva artificial carregada com nanomicelas de compostos bioativos, conforme reinvindicação 1, caracterizado por compreender princípios ativos derivados de extrato de própolis vermelha de Alagoas.
3. Saliva artificial carregada com nanomicelas de compostos bioativos da própolis vermelha, conforme reinvindicações 1 e 2, caracterizado por apresentar na composição do extrato de própolis vermelha os marcadores liquiritigenina, formononetina, biochanina A, pinobanksin, pinocembrina e isoliquiritigenina.
4. Saliva artificial carregada com nanomicelas de compostos bioativos da própolis vermelha, conforme reinvindicações 1 e 2, caracterizado por apresentar atividade antibacteriana muito alta e alta com CIM 100% para microrganismos das espécies Enterococcus faecalis, Staphylococcus spp e Lactobacillus spp da flora bucal de pacientes hospitalizados com câncer bucal.
5. Saliva artificial carregada com nanomicelas de compostos bioativos da própolis vermelha, conforme reinvindicações 1 e 2, caracterizado por apresentar atividade antibacteriana muito alta e alta com CIM 50% para microrganismos das espécies Enterococcus, Streptococcus grupo mutans (EGM), Bacilos Gram Negativos (BGN), Staphylococcus spp, Lactobacillus spp e Candida spp. da flora bucal de pacientes hospitalizados com câncer bucal.
6. Saliva artificial carregada com nanomicelas de compostos bioativos da própolis vermelha, conforme reinvindicações 1 e 2, caracterizado por apresentar estabilidade da composição em período de 70 dias de armazenamento e mantendo atividade antibacteriana muito alta, alta e moderada contra microrganismos presentes na flora bucal de paciente com câncer de boca.
7. Saliva artificial carregada com nanomicelas de compostos bioativos da própolis vermelha, conforme reinvindicações 1 e 2, caracterizado por apresentar ausência de citotoxicidade em células epiteliais de mucosa NOK-si em ensaio de monocamada.
8. Uso da saliva artificial base contendo essência de hortelã caracterizado por apresentar melhoras na qualidade de vida dos pacientes com câncer de boca nos domínios deglutição, mastigação, fala e salivação.
9. Uso da saliva artificial base contendo essência de hortelã caracterizado por apresentar capacidade tamponante, limpante e hidratante contribui com melhoras nos sintomas de hipossalivação e xerostomia dos pacientes com câncer de boca.
10. Uso da saliva artificial base contendo essência de hortelã, conforme reinvindicação 9, caracterizado pelo fato de equilibrar a flora bacteriana bucal, reduz a proliferação de microorganismos oportunistas causadores de diversas doenças orais como cárie dental, halitoses, mucosites, úlceras da mucosa bucal, estomatites, além de aliviar sintomas de irritações, coceiras, sensação de secura e de queimação na mucosa oral responsáveis pela disgeusia, disfonia e disfagia.

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