KR20090046825A - 프로테아제 및 프로테아제 저해제 프로파일링으로 심근 경색 후 심부전을 예측하는 방법 - Google Patents

프로테아제 및 프로테아제 저해제 프로파일링으로 심근 경색 후 심부전을 예측하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 본원에서 좌심실 확장(LVD) 발병 가능성의 존재와 관련된, 개체의 체액으로부터 기질 메탈로프로테이나제(MMP) 및 기질 메탈로프로테이나제의 조직 저해제(TIMP)의 프로파일을 확인함을 포함하는, 개체에서 이완기 심부전을 검출 또는 예측하는 방법에 관한 것이다.
이완기 심부전, 심근 경색, 프로테아제, 프로테아제 저해제.

Description

프로테아제 및 프로테아제 저해제 프로파일링으로 심근 경색 후 심부전을 예측하는 방법{PREDICTING HEART FAILURE FOLLOWING MYOCARDIAL INFARCTION BY PROTEASE AND PROTEASE INHIBITOR PROFILING}
본 발명은 본원에서 좌심실 확장(LVD) 발병 가능성의 존재와 관련된, 개체의 체액으로부터 기질 메탈로프로테이나제(MMP) 및 기질 메탈로프로테이나제의 조직 저해제(TIMP)의 프로파일을 확인함을 포함하는, 개체에서 이완기 심부전을 검출 또는 예측하는 방법에 관한 것이다.
본원은 본원에 참고로 인용된 미국 특허 가출원 제 60/819,988 호(출원일: 2006년 7월 11일) 및 미국 특허 가출원 제 60/893,807 호(출원일: 2007년 3월 8일)에 기초한 우선권을 주장한다.
본 발명은 국립심장폐혈액연구원에 의해 승인된 계약 번호 PO1-HL-48788, RO1-HL-59165 및 MO1-RR-01070-251 및 재향군인 서비스국에 의해 승인된 계약 번호 VA Grant Spinale 001 하에 정부 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
심근 경색(MI) 후의 중요한 구조적 결과는 심근 벽의 세포질 구성성분 및 세포외 구성성분 내의 변화(이는 심근의 기하학적 구조의 변화, 후속적으로 LV 부피의 변화를 야기함)로서 통상적으로 정의될 수 있는 LV 리모델링이다[얼바허(Erlebacher JA) 등, 1984; 페퍼(Pfeffer MA) 등, 1990; 세인트 존 서튼(St. John Sutton M) 등, 1994]. 이 MI-후 리모델링 과정의 속도 및 정도는 이환률 및 사망률의 독립적인 예측 인자로 확인되었다[화이트(White HD) 등, 1987; 차런타이타위(Chareonthaitawee, P) 등, 1995]. 따라서, MI-후 리모델링이 발생될 위험이 가장 큰 환자를 알아내는 것과 MI-후 리모델링에 기여하는 기본 메카니즘을 알아내는 것은 진단/치료 면에서의 큰 연관성을 갖는다. 그러나, MI-후 리모델링이 발생될 위험이 가장 큰 환자를 알아내는 실행가능한 방법은 이전까지 없었다.
발명의 개요
본원에서 구체적으로 표현되고 광범위하게 기재되는 본 발명의 목적에 따라, 본 발명은 본원에서 좌심실 확장(LVD)이 발병될 가능성의 존재와 관련된 개체의 체액으로부터 기질 메탈로프로테이나제(MMP) 및 기질 메탈로프로테이나제의 조직 저해제(TIMP)의 프로파일을 알아냄을 포함하는, 개체에서 이완기 심부전을 검출 또는 예측하는 방법에 관한 것이다.
개시되는 방법 및 조성물의 추가적인 이점이 아래 상세한 설명에 부분적으로 기재되며, 부분적으로는 상세한 설명으로부터 이해되거나, 또는 개시되는 방법 및 조성물을 실행함으로써 알 수 있게 될 것이다. 첨부된 청구의 범위에서 구체적으 로 지적되는 요소 및 조합에 의해, 개시되는 방법 및 조성물의 이점을 실현 및 달성하게 될 것이다. 상기 포괄적인 기재 및 하기 상세한 설명은 둘 다 예시 및 설명하기 위한 것이며 청구되는 본 발명을 제한하지 않음을 알아야 한다.
본원에 혼입되고 본원의 일부를 구성하는 첨부 도면은 개시되는 방법 및 조성물의 몇몇 실시양태를 예시하며, 설명과 함께 개시되는 방법 및 조성물의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1은 MI-후 환자(n=32)에서 LV 이완기말 부피(상부 패널) 및 박출 계수(하부 패널)를 측정하였음을 보여준다. LV 이완기말 부피는 MI-후 1일째에 기준 대조군(reference control) 개체로부터 증가하였고, 전체 180일간의 연구 기간동안 상승된 채로 유지되었다. LV 이완기말 부피는 MI-후 1일째 값으로부터 MI-후 28일째까지 증가하였다(p=0.027). MI-후 LV 확장이 발생되었으나, LV 박출 계수는 MI-후 초기에 약간이지만 유의하게 증가한 다음 MI-후 연구 지속 기간동안 기준 대조군 값 내로 떨어졌다. 회색으로 표시된 부분은 기준 대조군 범위(평균+SEM)를 나타낸다. *기준 대조군 값에 대해 p<0.05.
도 2는 MI-후 환자에서 연속적으로 측정된 대표적인 MMP의 혈장 수준을 도시한다. MMP-2의 대용형(proform)은 기준 정상 개체와 비교하여 MI-후 환자의 혈장에서 감소하였다. 혈장 MMP-7은 추적 조사 기간 전체에 걸쳐 정상 범위 내에서 유 지되었다. MMP-8 수준은 최초 측정 시점에서 증가되었으며, MI-후 3일째에 다시 크게 증가한 것으로 보였다. MMP-9 수준은 MI-후 28일동안 내내 상승하였다. (정상 기준 범위에 대해 p<0.05).
도 3은 혈장 샘플 상에서 젤라틴 자이모그래피(zymography)를 실행한 결과 MI-후 28일동안 내내 MMP-9를 나타내는 92kDa 범위에서의 상대적인 증가를 나타내었음을 보여준다(상부 패널). 모든 혈장 샘플에서 MMP-2를 나타내는 72kDa에서의 보다 낮은 분자량 밴드가 검출되었다. MI-후 28일째에 상대적인 수준에서의 작지만 유의한 증가가 관찰되었다(하부 패널). (*100%로 설정된 정상 값에 대해 p<0.05).
도 4는 기준 정상 값과 비교할 때 MI-후의 모든 시점에서 혈장 TIMP-1 수준이 증가되었음을 보여준다. TIMP-2 수준은 MI-후 28일째에 증가하였고 나머지 추적 조사 기간동안 지속적으로 상승되었다. TIMP-4 수준은 MI-후 5일째에 상당히 감소되었고 기준 정상 값 내로 되돌아오지 못했다. MMP-9/TIMP-4 비는 MI-후 28일동안 내내 증가를 나타내었다. (정상 기준 범위에 대해 p<0.05).
도 5는 MI-후 1일째로부터 5일째까지 혈장 MMP-9 수준에서의 변화에 대한 독립적인 응답 플롯을 도시한다(상부 패널). 독립적인 MMP-9 수준에서의 혼합된 응답이 이 기간 내에 발생하였고, 따라서 독립적인 응답을 MI-후 1일째 값으로부터의 % 변화로서 산출하였다. 이어, 이들 값과 MI-후 28일째의 LV 이완기말 부피에서의 변화에 대한 관계를 나타내었다(하부 패널). MI-후 5일째에 지속적으로 상승되 거나 증가되는 MMP-9 수준을 갖는 환자에서는, 28일째에 LV 이완기말 부피에서의 훨씬 더 큰 증가가 발생하였다. (*MMP-9 수준에서의 무변화에 대해 p<0.05).
도 6은 혈장 MMP-9 수준의 초기 변화의 상대적인 크기를 MI-후 1일째로부터 5일째까지의 MMP-9 수준의 35% 증가에 기초하여 분류하였음을 보여준다. 혈장 MMP-9 수준이 MI-후 1일째 값으로부터 더 증가한 환자에서는, MI-후 90일째에 LV 이완기말 부피에서의 더 큰 % 변화가 발생하였다. (*35% 미만의 MMP-9 수준의 변화에 대해 p<0.05).
도 7(상부)은 HOCM 환자에서 격막 관통 동맥(septal perforator artery) 내로의 알콜 주사 후 혈장 총 크레아틴 키나제(CK) 농도에서의 % 변화를 도시한다. 피크 혈장 CK 수준은 주사한지 10 내지 20시간 후에 발생하였다. 도 7(하부)은 알콜 주사 후 CK MB1 동종효소 혈장 농도에서의 % 변화를 도시한다. 알콜을 주사한 후 4시간째에 CK-MB1 혈장 수준의 상당한 증가가 검출되었고, 알콜을 주사한지 24시간 후까지 CK-MB1 혈장 수준이 증가하였다. [*시간 0; 기준선(baseline) 값에 대하여 p<0.05].
도 8(상부)은 알콜을 주사한 후 4시간째에 기준선으로부터 MMP-2 혈장 수준의 작지만 상당한 변화가 관찰되었음을 보여준다. 도 8(하부)은 혈장 MMP-9에서의 상당한 증가가 알콜 주사 후에 발생되었고 주사한지 50시간 후까지 절정을 이루는 것으로 보였음을 도시한다. (*시간 0; 기준선 값에 대하여 p<0.05).
도 9(상부)는 혈장 MMP-8 수준이 HOCM 환자에서 격막 관통 동맥에 알콜을 주사한지 24시간 후까지 시간 의존 방식으로 증가하고 알콜 주사 후 더 긴 시간동안 절정을 이루었음을 도시한다. (하부) 혈장 MMP-13 수준의 감소가 알콜 주사 후 초기에 검출되었고, 24시간째에 상당하였다. (*시간 0; 기준선 값에 대하여 p<0.05).
도 10(상부)은 혈장 TIMP-1 수준이 알콜 주사 직후 변하지 않았으나 그 이후의 시간에 상승하는 경향이 있었지만, 이는 통계적 유의성(p=0.15)에 도달하지 못하였음을 보여준다. 도 10(하부)은 각각의 환자에 있어서 혈장 MMP-9/TIMP-1 수준의 비를 산출하고 기준선 값으로부터의 변화로서 플롯팅하였음을 보여준다. 알콜을 주사한지 6시간 후까지 이 비의 유의한 증가가 일어났다. (*시간 0; 기준선 값에 대하여 p<0.05).
도 11은 혈장 크레아틴 키나제 MB1 분율 및 MMP-9 수준과 관련하여 각각의 환자(n=51)에 대하여 혈장 농도-시간 곡선 아래의 면적(AUC)을 산출하였음을 보여준다. 이들 두 매개변수 사이에서 상당한 선형 관계가 관찰되었다.
도 12A는 기준선(0), 알콜을 주사한지 10, 20, 30 및 60시간 후에서 3명의 정상 환자(N1, N2 및 N3) 및 2명의 HOCM 환자(HOCM1 및 HOCM2)로부터의 혈장 샘플중 TIMP-4의 상대적인 수준을 보여주는 대표적인 면역 블롯(immunoblot)을 도시한다. 인간 TIMP-4 재조합 기준물(S)을 항체 특이성에 대한 양성 대조용으로서 사용하였다. TIMP-4의 글라이코실화된 형태(29kDa) 및 글라이코실화되지 않은 형태(23kDa)의 루프(Loop) 2의 펩타이드 서열에 상응하는 항혈청 5㎍/mL로 면역 블롯 을 배양하였다. 도 12B는 1차 항체를 치환시켜 다른 하나의 면역 블롯을 배양하였음(이로 인해 TIMP-4에 상응하는 밴드가 완전히 없어졌음)을 보여준다. 도 12C는 혈장 샘플을 사용하여 전기 영동 겔을 준비하였고 글라이코실화된 단백질에 대해 염색하였음을 보여준다. 글라이코실화된 밴드는 29kDa에서 확인되었다.
도 13은 HOCM 환자에서 기준 정상 값으로부터 혈장 TIMP-4 수준의 % 변화를 도시한다. 삽입된 것은 TIMP-4의 글라이코실화되지 않은 형태(23kDa) 및 글라이코실화된 형태(29kDa)의 대표적인 면역 블롯이다. TIMP-4의 글라이코실화되지 않은 형태 및 글라이코실화된 형태 둘 다에서, 기준 정상 값(정상 n=18; HOCM n=16)과 관련하여 TIMP-4 수준의 증가가 HOCM 환자에서 관찰되었다. 데이터는 평균±SEM으로서 제공되었다. (*정상 수준과 비교하여 p<0.05).
도 14는 알콜 주사 전후에 채취한 HOCM 환자로부터의 혈장 샘플의 TIMP-4 수준의 밀도 측정 분석을 도시한다. 값은 기준선으로부터의 % 변화로서 보고되었다. 삽입된 것은 TIMP-4의 글라이코실화되지 않은 형태(23kDa) 및 글라이코실화된 형태(29kDa)(n=16)에 대해 대표적인 면역 블롯이다. 도 14A는 기준선 및 10시간째와 비교할 때 알콜을 주사한지 30시간 후에 글라이코실화되지 않은 TIMP-4 수준의 감소가 발생하였음을 보여준다. 도 14B는 글라이코실화된 TIMP-4 수준이 30시간 및 60시간째에 기준선으로부터 감소하였음을 보여준다. 도 14C는 TIMP-4의 글라이코실화된 형태 및 글라이코실화되지 않은 형태를 조합함으로써, 전체 TIMP-4의 히스토그램이 알콜을 주사한지 30시간 후에 TIMP-4 수준의 유사한 감소를 나타냄을 보 여준다. 데이터는 평균±SEM으로서 제공되었다. (*기준선과 비교하여 p<0.05. #10시간째와 비교하여 p<0.05).
도 15는 성별에 기초한 군을 비교하는 정규화된 TIMP-4 IOD 값의 평균으로서 표현된 면역 블롯의 결과를 도시한다. 히스토그램은 TIMP-4의 글라이코실화되지 않은 형태 및 글라이코실화된 형태 둘 다에서 성별 차이를 나타낸다. 도 15(좌측)는 성별과 관계없이 HOCM 군에서 글라이코실화되지 않은 TIMP-4 IOD 값이 더 높았음을 보여준다. 또한, HOCM 여성과 HOCM 남성 사이에 TIMP-4 수준의 상당한 차이가 있었다. 도 15(우측)는 성별에 관계없이 정상 군과 비교할 때 HOCM 군에서 글라이코실화된 TIMP-4 수준이 더 높았음을 보여준다. 정상 남성과 정상 여성 사이에서도 글라이코실화된 TIMP-4의 증가가 관찰되었다. 데이터는 평균±SEM으로서 제공되었다. (*정상 여성 군과 비교하여 p<0.05. #정상 남성 군과 비교하여 p<0.05. +HOCM 여성 군과 비교하여 p<0.05).
도 16은 심근 경색: 예상 및 관리를 위한 MMP 및 TIMP 연산(algorithm)을 도시한다.
도 17은 다중 분석에 의해 결정된 MMP-9, MMP-13, TNF-α 및 IL-6의 보정 곡선을 도시한다.
특정 실시양태에 대한 하기 상세한 설명 및 그에 포함된 실시예, 및 도면 및 이들의 상기 및 하기 설명을 참조함으로써, 개시되는 방법 및 조성물을 더욱 용이하게 이해할 수 있다.
개시되는 방법 및 조성물에 사용될 수 있거나, 개시되는 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있거나, 개시되는 방법 및 조성물의 제조에 사용될 수 있거나, 또는 개시되는 방법 및 조성물의 산물인 물질, 조성물 및 성분이 개시된다. 이들 물질 및 다른 물질은 본원에 개시되어 있으며, 이들 물질의 조합, 부분집합, 상호작용, 군 등이 개시되는 경우, 이들 화합물의 다양한 개별적이고 집합적인 조합 및 변경 각각의 구체적인 인용이 명시적으로 개시되지 않을 수 있으나, 각각은 본원에서 구체적으로 계획 및 기재되는 것으로 생각된다. 예를 들어, 펩타이드가 개시 및 논의되고, 펩타이드를 포함하는 다수의 분자로 제조될 수 있는 다수의 변형이 논의되면, 펩타이드의 각각의 모든 조합과 변경 및 가능한 변형은 달리 구체적으로 표시되지 않는 한 구체적으로 계획되는 것이다. 그러므로, 분자 A, B 및 C의 군뿐만 아니라 분자 D, E 및 F의 군이 개시되고, 조합 분자 A-D의 예가 개시되면, 각각이 개별적으로 인용되지 않더라도, 각각은 개별적으로 또한 집합적으로 계획된다. 그러므로, 이 예에서는, 조합 A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E 및 C-F 각각이 구체적으로 계획되고, A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예시적인 조합 A-D의 개시내용으로부터 개시된 것으로 간주되어야 한다. 마찬가지로, 이들의 임의의 부분집합 또는 조합도 구체적으로 계획 및 개시된다. 따라서, 예를 들어, A-E, B-F 및 C-E의 아군은 구체적으로 계획되고, A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예시적인 조합 A-D의 개시내용으로부터 개시된 것으로 간주되어야 한다. 이 개념은 개시되는 조성물을 제조 및 사용하는 방법에서의 단계를 비롯한(이들로 한정되지는 않음) 본원의 모든 양태에 적용된다. 그러므로, 수행될 수 있는 다양한 추가적인 단계가 존재하는 경우, 이들 추가적인 단계 각각은 개시되는 방법의 임의의 구체적인 실시양태 또는 실시양태의 조합으로 수행될 수 있으며, 이러한 조합 각각은 구체적으로 계획되고 개시된 것으로 간주되어야 하는 것으로 생각된다.
당해 분야의 숙련자는 본원에 기재되는 방법 및 조성물의 구체적인 실시양태에 대한 다수의 등가물을 알게 되거나, 또는 통상적인 수준 이하의 실험을 이용하여 이들 등가물을 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 하기 청구의 범위에 의해 포괄하고자 한다.
기재되는 특정 방법, 절차 및 시약이 변화될 수 있기 때문에, 개시되는 방법 및 조성물은 이들 특정 방법, 절차 및 시약으로 한정되지 않는 것으로 이해된다. 또한, 본원에 사용되는 용어는 특정 실시양태를 기재하기 위한 목적으로만 사용되며, 첨부되는 청구의 범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 영역을 제한하고자 하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 본원에 기재되는 임의의 방법은 그의 단계가 특정한 순서대로 수행되어야 함을 요구하는 것으로 결코 간주되지 않는다. 따라서, 방법 청구항이 그의 단계에 의해 수행되어야 하는 순서를 실제로 인용하지 않거나 또는 단계가 특정 순서대로 한정되는 것으로 청구의 범위 및 상세한 설명에 달리 구체적으로 언급되지 않는 경우, 어떠한 관점에서도 순서를 결론적으로 나타내고자 하지 않는다. 이는, 단계의 배열 또는 작동 흐름과 관련된 논리의 문제; 문법적인 구성 또는 구두점으로부터 유래되는 분명한 의미; 및 본원에 기재되는 실시양태의 수 또는 유형을 비롯한, 해석을 위한 임의의 가능한 불분명한 근거에 적용된다. 더욱 구체적으로, 그 양이 측정되는 MMP 및 TIMP는 임의의 순서대로 취한 측정치를 가질 수 있다.
A. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 과학적 용어는 개시되는 방법 및 조성물이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재되는 것과 유사하거나 그에 상응하는 임의의 방법 및 물질을 본 발명의 방법 및 조성물의 실시 또는 시험에 사용할 수 있으나, 특히 유용한 방법, 장치 및 물질은 기재되는 바와 같다. 본원에 인용되는 간행물 및 그에 인용되는 물질은 본원에 구체적으로 참고로 인용된다. 본 발명의 이러한 개시내용보다 선행 발명이 먼저 이루어진 것으로 인정할만한 것은 없다. 임의의 참조문헌이 선행 기술을 구성하는 것으로 인정되지 않는다. 참조문헌의 논의는 그 문헌의 저자가 주장하는 것을 언급할 뿐이며, 본 출원인들은 인용된 문서의 정확성 및 적합성을 조사할 권리를 확보하고 있다.
본원 및 첨부된 청구의 범위에 사용되는 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 해석되지 않는 한 복수 인용물을 포함함에 주목해야 한다. 그러므로, 예컨대 "펩타이드"를 인용하는 경우 이러한 펩타이드 복수개를 포함하며, "그 펩타이드"의 인용은 하나 이상의 펩타이드 및 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 그의 등가물 등을 인용하는 것이다.
"임의적인" 또는 "임의적으로"는 후속 기재되는 사건, 상황 또는 물질이 일어나거나 존재할 수 있거나, 또는 일어나지 않거나 존재하지 않을 수 있음을 의미하며, 상기 기재는 사건, 상황 또는 물질이 일어나거나 존재하는 경우 및 이것이 일어나지 않거나 존재하지 않는 경우를 포함한다.
범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값으로부터 및/또는 "약" 다른 하나의 특정 값까지로서 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현되는 경우, 다른 실시양태는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 선행 용어 "약"의 사용에 의해 어림값으로서 표현될 때, 특정 값은 다른 실시양태를 형성하는 것으로 생각된다. 각 범위의 종점은 나머지 종점과 관련하여 또한 나머지 종점과 무관하게 유의한 것으로 또한 생각된다. 또한, 본원에 개시되는 다수의 값이 존재하고, 각각의 값이 또한 본원에서 그 값 자체에 덧붙여 "약" 그 특정 값으로서 개시되는 것으로도 생각된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시된다면, "약 10"도 개시된다. 또한, 하나의 값이 개시되는 경우, 당해 분야의 숙련자가 적절하게 이해하는 바와 같이, 그 값 "이하", "그 값 이상" 및 값 사이의 가능한 범위도 개시되는 것으로 생각된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되면, "10 이하" 뿐만 아니라 "10 이상"도 개시된다. 또한, 본원 전체에서 데이터는 다수의 상이한 포맷으로 제공되며, 이 데이터는 종점과 시점, 및 데이터 지점의 임의의 조합의 범위를 나타내는 것으로 생각된다. 예를 들어, 특정 데이터 지점 "10" 및 특정 데이터 지점 15가 개시되면, 10 및 15보다 큰 범위, 10 및 15 이상, 10 및 15 미만, 10 및 15 이하 및 10 및 15, 및 10 내지 15도 개시되는 것으로 생각된다. 또한, 두 특정 단위 사이의 각각의 단위도 개시되는 것으로 생각된다. 예를 들어, 10 내지 15가 개시되면, 11, 12, 13 및 14도 개시된다.
본원의 상세한 설명 및 청구의 범위 전체에서, 단어 "포함하다" 및 이의 변경 형태의 단어 예컨대, "포함하는"는 "포함하지만 한정되지는 않는다"를 의미하며, 예를 들어 다른 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하고자 하지 않는다.
"개체"는 동물, 식물, 세균, 바이러스, 기생충 및 핵산을 갖는 임의의 다른 생물체 또는 실존체를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 개체는 척추동물, 더욱 구체적으로는 포유류(예를 들어, 인간, 말, 돼지, 토끼, 개, 양, 염소, 인간이 아닌 영장류, 소, 고양이, 기니피그 또는 설치류), 어류, 조류 또는 파충류 또는 양서류일 수 있다. 개체는 무척추동물, 더욱 구체적으로는 절지동물(예컨대, 곤충 및 갑각류)일 수 있다. 이 용어는 특정 연령 또는 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 자웅과 무관하게 성체 및 신생 개체, 및 태아를 포괄하고자 한다. 환자는 질환 또는 장애에 걸린 개체를 나타낸다. 용어 "환자"는 인간 및 수의학적 개체를 포함한다.
본원에서 정의되는 "샘플"은 생물체로부터 수득되는 임의의 샘플을 말한다. 생물학적 샘플의 예는 체액 및 조직 표본을 포함한다. 샘플의 공급원은 혈액, 혈청, 혈장, 모유, 고름, 조직 부스러기, 세척액, 뇨, 조직(예: 림프절) 등과 같은 생리학적 매질일 수 있다.
본원 전체에서, 다양한 간행물이 인용된다. 이들 간행물의 개시내용은 본원이 관련된 기술 분야의 상태를 더욱 충분히 설명하기 위하여 본원에 참고로 인용된다. 개시되는 참조문헌은 또한 참조되는 문장에서 논의되는 참조문헌에 함유된 자료를 위해 개별적이고도 구체적으로 본원에 참고로 인용된다.
B. 방법
1. 이완기 심부전
본원에서 좌심실 확장(LVD) 발병 가능성의 존재와 관련된 개체의 체액으로부터 기질 메탈로프로테이나제(MMP) 및 기질 메탈로프로테이나제의 조직 저해제(TIMP)의 프로파일을 알아냄을 포함하는, 개체에서 이완기 심부전을 검출 또는 예측하는 방법이 제공된다.
심근 경색(MI; 심장 발작) 후의 기본적인 결과는 LV 리모델링이라고 불리는 좌심실(LV)의 구조적 조성 변화이다. 이는 세포질 과정 및 세포외 과정 둘 다를 포함하는 복잡한 과정이며, 이는 다수의 영상 방법에 의해 측정될 수 있는 LV의 기하학적 변화로 요약된다. MI-후 기간의 어느 시점에서 측정된 특정 단백질 분해 효소의 혈장 프로파일은 이러한 근본적인 리모델링 과정에 대한 진단 및 예상 정보 둘 다를 제공한다. LV 리모델링을 측정하는데 있어서 더욱 통상적인 영상 양식중 하나는 심초음파에 의한 것이다. 따라서, 본원에 기재되는 혈장 프로파일을 유효화하기 위하여, MI-후 환자에서 심초음파를 연속적으로 수행하였고, 통상적인 임상 측정(LV 부피)을 통해 LV 리모델링을 평가하였다. MI-후 환자에서 근본적인 LV 리모델링이 상당히 이루어지면 LV 부피가 증가될 것이다(이는 통상 LV 확장으로 불림). 따라서, 본원에서 이들 혈장 검정이 MI-후 환자에서의 근본적인 LV 리모델링을 예측한다고 하는 원리의 증거는 심초음파에 의한 LV 확장이다. 그러나, LV 리모델링에 대한 결과 측정 수단은 또한 예컨대 방사성 핵종 영상, 심실 촬영법, 자기 공명, 양전자 단층 촬영, 전산화 단층 촬영(CT scanning)과 같은 다른 영상 양식도 포함할 수 있다.
2. MMP
기질 메탈로프로테이나제(MMP)는 아연-의존성 엔도펩티다제이고; 다른 일원은 아다말리신, 세랄리신 및 아스타신이다. MMP는 메트진신 상과로 알려져 있는 더 큰 프로테아제의 부류에 속한다.
MMP는 공동 도메인 구조를 공유한다. 3개의 공동 도메인은 프로-펩타이드, 촉매 도메인 및 가요성 힌지 영역에 의해 촉매 도메인에 연결된 헤모펙신-유사 C-말단 도메인이다.
MMP는 효소가 활성이기 전에 제거되어야 하는 프로-펩타이드 도메인을 갖는 불활성 효소원으로서 최초로 합성된다. 프로-펩타이드 도메인은 "시스테인 스위치"의 일부이고, 이는 활성 부위에서 아연과 상호작용하고 기질의 결합 및 절단을 방지하여 효소를 불활성 형태로 유지시키는 보존되는(conserved) 시스테인 잔기를 함유한다. 대다수의 MMP에서, 시스테인 잔기는 보존되는 서열 PRCGxPD에 존재한다. 몇몇 MMP는 절단될 때 효소를 활성화시키는 프로호르몬 컨버타제 절단 부위(퓨린-유사)를 이 도메인의 일부로서 갖는다. MMP-23A 및 MMP-23B는 이 도메인에 막통과 구획(PMID 10945999)을 포함한다.
수개의 MMP 촉매 도메인의 X-선 결정학적 구조는 이 도메인이 35×30×30Å(3.5×3×3nm)으로 측정되는 편원 구임을 보여주었다. 활성 부위는 촉매 도메인을 가로질러 연결되는 20Å(2nm) 홈이다. 활성 부위를 형성하는 촉매 도메인의 일부에는, 촉매적으로 중요한 Zn2+ 이온이 있으며, 이는 보존되는 서열 HExxHxxGxxH에서 발견되는 3개의 히스티딘 잔기에 의해 결합된다. 따라서, 이 서열은 아연-결합 모티프이다.
MMP-2와 같은 젤라티나제는 촉매 도메인의 아연-결합 모티프 직전에 삽입된 피브로넥틴 유형 II 모듈(PMID 12486137)을 혼입한다.
촉매 도메인은 가요성 힌지 또는 연결기 영역에 의해 C-말단 도메인에 연결된다. 이는 길이가 아미노산 75개까지이고 결정가능한 구조를 갖지 않는다.
C-말단 도메인은 혈청 단백질인 헤모펙신과 구조적 유사점을 갖는다. 이는 4개의 날개가 있는 β-프로펠러 구조를 갖는다. β-프로펠러 구조는 단백질-단백질 상호작용에 관련되는 것으로 생각되는 큰 편평한 표면을 제공한다. 이는 기질 특이성을 결정하고, TIMP와의 상호작용을 위한 부위이다. 헤모펙신-유사 도메인은 MMP-7, MMP-23, MMP-26, 및 식물 및 선충에 존재하지 않는다. MT-MMP는 이 도메인을 통해 원형질막에 고정되며, 이들중 일부는 세포질 도메인을 갖는다.
MMP는 상이한 방식으로 더 나뉘어질 수 있다. MMP의 주요 서열을 비교하기 위해 생물 정보 방법을 이용하여 MMP의 하기 진화된 군을 제안한다: MMP-19; MMP 11, 14, 15, 16 및 17; MMP-2 및 MMP-9; 모든 다른 MMP.
단리시 촉매 도메인의 분석은 주요 군으로부터 한번 더 진화된 촉매 도메인이 효소의 기질 특이성에 의해서도 나타내어지는 바와 같이 분화되었음을 암시한다. 가장 통상적으로 이용되는 분류법(MMP 생물학에서의 연구자에 의해)은 부분적으로는 MMP의 기질 특이성의 역사상 평가에, 또한 부분적으로는 MMP의 세포 편재화에 기초한다. 이들 군은 콜라게나제, 젤라티나제, 스트로멜리신 및 막 유형 MMP(MT-MMP)이다. 전통적인 군중 어디에도 딱 맞지 않는 다수의 MMP가 존재하기 때문에 이러한 분류가 다소 인위적임이 점점 더 명백해지고 있다.
콜라게나제는 삼중-나선 섬유상 콜라겐을 별도의 3/4 단편 및 1/4 단편으로 열화시킬 수 있다. 이들 콜라겐은 뼈 및 연골의 주성분이고, MMP는 이들을 열화시킬 수 있는 유일한 공지의 포유동물 효소이다. 전통적으로, 콜라게나제는 MMP-1(간질 콜라게나제), MMP-8(호중구 콜라게나제), MMP-13(콜라게나제 3), MMP-18(콜라게나제 4, xcol4, 개구리 콜라게나제. 공지의 인간 상동 유전자가 없음)이다. MMP-14(MT1-MMP)도 섬유상 콜라겐을 절단하는 것으로 밝혀졌으며, 더욱 논쟁적으로는 MMP-2가 콜라겐을 분해시킬 수 있다는 증거가 있다.
스트로멜리신은 세포외 기질 단백질을 절단하는 폭넓은 능력을 나타내지만, 삼중-나선 섬유상 콜라겐을 절단할 수는 없다. 이 군의 3가지 표준적인 일원은 MMP-3(스트로멜리신 1), MMP-10(스트로멜리신 2) 및 MMP-11(스트로멜리신 3)이다. MMP-11은 MT-MMP와 더 많은 유사점을 나타내고, 컨버타제-활성화될 수 있으며, 따라서 통상적으로 컨버타제-활성화가능한 MMP와 연관되어 분비된다.
마트릴리신은 MMP-7(마트릴리신, PUMP) 및 MMP-26(마트릴리신-2, 엔도메타제)을 포함한다.
젤라티나제의 주요 기질은 유형 IV 콜라겐 및 젤라틴이고, 이들 효소는 촉매 도메인 내로 삽입된 추가적인 도메인의 존재에 의해 구분된다. 이 젤라틴-결합 영역은 아연 결합 모티프 직전에 위치하고, 촉매 도메인의 구조를 파괴하지 않는 별도의 절첩 단위를 형성한다. 이 아군의 2가지 일원은 MMP-2(72kDa 젤라티나제, 젤라티나제-A) 및 MMP-9(92kDa 젤라티나제, 젤라티나제-B)이다.
분비되는 MMP는 MMP-11(스트로멜리신 3), MMP-21(X-MMP) 및 MMP-28(에필리신)을 포함한다.
막-결합된 MMP는 유형-II 막통과 시스테인 어레이 MMP-23, 글라이코실 포스파티딜이노시톨-부착된 MMP 17 및 25(각각 MT4-MMP 및 MT6-MMP), 및 유형-I 막통과 MMP 14, 15, 16, 24(각각 MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP 및 MT5-MMP)를 포함한다.
모두 6가지의 MT-MMP는 프로-팝타이드에 퓨린 절단 부위를 갖는데, 이는 MMP-11에 의해 공유되는 특징이다.
다른 MMP는 MMP-12(대식세포 메탈로엘라스타제), MMP-19(RASI-1, 때때로 스트로멜리신-4로도 지칭됨), 에나멜리신(MMP-20) 및 MMP-27(MMP-22, C-MMP), MMP-23A(CA-MMP) 및 MMP-23B를 포함한다.
3. TIMP
MMP는 메탈로프로테이나제의 특이적인 내인성 조직 저해제(TIMP)에 의해 저해되며, 상기 저해제는 다음 4가지 프로테아제 저해제의 군을 포함한다: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 및 TIMP-4. 전체적으로, 모든 MMP는 활성화된 후 TIMP에 의해 저해되지만, 젤라티나제(MMP-2 및 MMP-9)는 효소가 잠복 형태인 경우 TIMP와 착체를 형성할 수 있다. 잠복성 MMP-2(프로-MMP-2)와 TIMP-2의 착체는 막-고정된 MMP인 MT1-MMP(MMP-14)에 의한 세포 표면에서의 프로-MMP-2의 활성화를 용이하게 하는 역할을 한다.
4. MMP / TIMP 비
심근 경색 및 고혈압성 심질환의 MMP-TIMP 프로파일링에 있어서의 독특한 특징중 하나는 심장 특이적 TIMP인 TIMP-4를 이용하고, 심근 경색 및 고혈압 환자에서 더 큰 크기로 변화하는 MMP와 이를 연관시키는 것이다. 또한, TIMP-1, TIMP-2 또는 TIMP-4와 같은 TIMP에 대한 MMP-9 또는 MMP-13과 같은 MMP의 비도 개시된다. 구체적으로, MMP-9/TIMP-4 비는 심근 경색 환자에서 100% 넘게 증가하지만, 고혈압 환자에서는 50% 넘게 감소한다. 또한, 실시예 1에서 보여지는 바와 같이, MMP-8 수준은 MI-후 초기에 증가한다. TIMP-4 수준은 이 MI-후 초기에 실제로 감소한다. 그러므로, MMP-8/TIMP-4 비는 증가하고 이들 환자에서 발생되는 유해한 심근 리모델링의 상대적인 정도에 대한 추가의 정량적인 정보를 제공한다. 이들 비 및 TIMP-4는 진단 변수로서, 또한 뚜렷하게 상이한 질환 상태를 갖는 환자를 알아내기 위하여 본원에서 처음으로 사용된다.
5. 혈장 선별
본 교시내용의 핵심적인 이점은 이 혈장 선별이 MI-후 유해한 LV 리모델링이 발병할 위험이 있는 환자를 알아낼 뿐만 아니라 이 과정이 가속화된 속도로 이루어지는 환자를 알아내기 위한 더욱 신속하고 간단해진 방법을 제공한다는 것이다. 따라서, 본원에 개시되는 방법은 혈액, 뇨, 혈장, 혈청, 눈물, 림프액, 담즙, 뇌척수액, 간질액, 수성 또는 유리액, 초유, 타액, 양수, 타액, 항문 및 질 분비물, 땀, 정액, 삼출액, 삼출물 및 활액과 같은 개체의 체액중 MMP 및 TIMP의 검출을 포함할 수 있다.
혈장은 혈액의 액체 성분이고, 이 속에 혈액 세포가 현탁되어 있다. 혈장은 혈액의 가장 큰 단일 성분이어서, 전체 혈액 부피의 약 55%를 구성한다. 혈청은 응고 인자(예컨대, 피브린)가 제거된 혈장을 말한다. 혈장은 피브리노겐, 글로불린 및 인간 혈청 알부민을 비롯한 다수의 생명에 중요한 단백질을 함유한다. 때때로 혈장은 바이러스 처리를 통해 추출되어야 하는 바이러스성 불순물을 함유할 수 있다.
혈장과 같은 체액중 특정 MMP 또는 TIMP의 수준을 평가하는 방법이 2가지 이상 있다. 예를 들어, MI-후 환자로부터 수득된 MMP/TIMP 수준을 기준 정상 값과 비교할 수 있다. 이어, 정상 값으로부터의 % 변화를 도 5 및 도 6에 도시된 것과 같은 예측 연산에 적용시킬 수 있다. 예를 들어, MI-후 MMP-9의 초기 증가를 이용하여, 환자가 심실 리모델링 및 심부전의 더욱 심각한 형태로 진행되고 있는지의 여부를 예측할 수 있다.
실시예 1에서 보여지는 방법인 반드시 상호 배타적이지는 않은 다른 방법은 MI-후의 특정 시간 간격으로 MMP/TIMP 수준을 측정하는 것이다. 이는 MI-후 초기 시점(72시간 이내)에서의 측정 및 통상적인 임상적 추적 조사(5 내지 7일)를 필요로 한다. 통상적인 임상적 화학 패널의 일부로서 MI-후 환자에서 이러한 시점에 혈액 채취가 통상적으로 이루어지기 때문에, 이들은 용이하게 수득된다. 이어, MMP/TIMP 수준에서의 변화의 상대적인 크기를 예측 연산에 이용할 수 있다.
특정 시점에서의 측정치를 수득하고 기준 대조군을 이용하는 접근법, 또는 개별적인 환자에서 연속적인 측정치를 평가하는 접근법을 알아낸 모든 MMP/TIMP 분석물에 적용한다.
MI-후 기간동안 MMP 프로파일링을 위한 이러한 절차의 임상적 적용 면에서, 진단, 예상 및 치료 개입 유도의 3가지 주요한 효용 카테고리가 있다.
6. 면역 검정
개시되는 방법에 사용될 수 있는, 당해 분야에 공지되어 있거나 또는 새롭게 발견된 MMP 및 TIMP 등의 단백질과 같은 분석물을 검출하는 방법은 다수가 존재한다. 예를 들면, 표준 면역 검출 방법을 이용하여 MMP 및 TIMP를 검출할 수 있다. 다수의 유용한 면역 검출 방법의 단계는 예컨대 각각 면역 검출 방법에 관한 교시내용이 본원에 참고로 인용되는 마지오(Maggio) 등의 문헌[Enzyme-Immunoassay, (1987)] 및 나카무라(Nakamura) 등의 문헌[Enzyme Immunoassays: Heterogeneous and Homogeneous Systems, Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1: Immunochemistry, 27.1-27.20 (1986)]과 같은 과학 문헌에 기재된 바 있다. 가장 간단하고 직접적인 의미에서 면역 검정은 항체와 항원 사이의 결합을 포함하는 결합 검정이다. 여러 유형 및 포맷의 면역 검정이 알려져 있고, 이들 모두는 개시되는 생물 마커를 검출하는데 적합하다. 면역 검정의 예는 효소 연결된 면역 흡착 검정(ELISA), 방사성 면역 검정(RIA), 방사성 면역 침전 검정(RIPA), 면역 비드 포획 검정, 웨스턴 블로팅, 도트 블로팅, 겔-시프트 검정, 유동 세포 분석법, 단백질 어레이, 다중화된 비드 어레이, 자기 포획, 생체내 영상, 형광 공명 에너지 전달(FRET) 및 광표백 후 형광 회복/편재화(FRAP/FLAP)이다.
일반적으로, 면역 검정은 경우에 따라서 면역 착체를 형성시키는데 효과적인 조건하에서, 관심있는 분자(예컨대, 개시된 생물 마커)를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 관심있는 분자의 항체와 접촉시키거나, 또는 관심있는 분자에 대한 항체(예를 들어, 개시된 생물 마커에 대한 항체)를 항체에 의해 결합될 수 있는 분자와 접촉시킴을 포함한다. 면역 착체(1차 면역 착체)를 형성시키는데 효과적인 조건하에서 면역 착체(1차 면역 착체)를 형성시키기에 충분한 시간동안 샘플을 관심있는 분자에 대한 항체와 또는 관심있는 분자에 대한 항체에 의해 결합될 수 있는 분자와 접촉시키는 것은, 일반적으로 분자 또는 항체와 샘플을 단순히 접촉시키고, 항체가 결합할 수 있는 존재하는 임의의 분자(예컨대, 항원)와 항체가 면역 착체를 형성하기에(즉, 항체가 상기 분자에 결합되기에) 충분한 시간동안 혼합물을 배양하는 문제이다. 많은 형태의 면역 검정에서는, 조직 구역, ELISA 플레이트, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯과 같은 샘플-항체 조성물을 세척하여 임의의 비-특이적으로 결합된 항체 부류를 제거함으로써, 1차 면역 착체 내에서 특이적으로 결합된 항체만 검출되도록 한다.
면역 검정은 샘플중 관심있는 분자(예를 들어, 개시된 생물 마커 또는 이들의 항체)의 양을 검출 또는 정량하는 방법을 포함할 수 있으며, 이 방법은 통상 결합 과정동안 형성된 임의의 면역 착체의 검출 또는 정량을 포함한다. 일반적으로, 면역 착체 형성의 검출은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 다수의 접근법을 적용시킴으로써 달성할 수 있다. 이들 방법은 일반적으로 임의의 방사성, 형광, 생물학적 또는 효소 택과 같은 라벨 또는 마커, 또는 임의의 다른 공지 라벨의 검출에 기초한다. 예를 들어, 각각 면역 검출 방법 및 라벨에 관한 교시내용이 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 제 3,817,837 호; 제 3,850,752 호; 제 3,939,350 호; 제 3,996,345 호; 제 4,277,437 호; 제 4,275,149 호; 및 제 4,366,241 호 참조.
본원에 사용되는 라벨은 형광 염료, 바이오틴/스트렙트아비딘과 같은 결합 쌍의 일원, 금속(예컨대, 금) 또는 착색된 기질 또는 형광을 생성시킴에 의해서와 같이 검출될 수 있는 분자와 특이적으로 상호작용할 수 있는 항원결정기 택을 포함할 수 있다. 단백질을 검출가능하게 라벨링하는데 적합한 성분은 형광 염료(본원에서는 형광 색소 및 형광 발색단으로도 알려짐) 및 측색 기질과 반응하는 효소(예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제)를 포함한다. 형광 염료가 매우 적은 양에서도 검출될 수 있기 때문에, 본 발명을 실행하는데 형광 염료를 사용하는 것이 통상적으로 바람직하다. 뿐만 아니라, 다중 항원이 단일 어레이와 반응하는 경우에는, 동시 검출을 위해 각각의 항원을 별개의 형광 화합물로 라벨링할 수 있다. 형광계를 사용하여 어레이상의 라벨링된 반점을 검출하는데, 신호의 존재는 특이적인 항체에 결합된 항원을 나타낸다.
형광 발색단은 발광하는 화합물 또는 분자이다. 전형적으로, 형광 발색단은 하나의 파장에서 전자기 에너지를 흡수하고 제 2 파장에서 전자기 에너지를 방출한다. 대표적인 형광 발색단은 1,5-IAEDANS; 1,8-ANS; 4-메틸움벨리페론; 5-카복시-2,7-다이클로로플루오레세인; 5-카복시플루오레세인(5-FAM); 5-카복시나프토플루오레세인; 5-카복시테트라메틸로다민(5-TAMRA); 5-하이드록시 트립타민(5-HAT); 5-ROX(카복시-X-로다민); 6-카복시로다민 6G; 6-CR 6G; 6-JOE; 7-아미노-4-메틸쿠마린; 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD); 7-하이드록시-4-I 메틸쿠마린; 9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘(ACMA); ABQ; 애시드 푹신; 아크리딘 오렌지; 아크리딘 레드; 아크리딘 옐로우; 아크리플라빈; 아크리플라빈 포일겐 SITSA; 애쿼린(광단백질); AFP-자동형광 단백질-[퀀텀 바이오테크놀로지스(Quantum Biotechnologies)] sgGFP, sgBFP 참조; 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 350™; 알렉사 플루오르 430™; 알렉사 플루오르 488™; 알렉사 플루오르 532™; 알렉사 플루오르 546™; 알렉사 플루오르 568™; 알렉사 플루오르 594™; 알렉사 플루오르 633™; 알렉사 플루오르 647™; 알렉사 플루오르 660™; 알렉사 플루오르 680™; 알리자린 컴플렉손; 알리자린 레드; 알로피코사이아닌(APC); AMC, AMCA-S; 아미노메틸쿠마린(AMCA); AMCA-X; 아미노악티노마이신 D; 아미노쿠마린; 아닐린 블루; 안트로실 스테아레이트; APC-Cy7; APTRA-BTC; APTS; 아스트라존 브릴리언트 레드 4G; 아스트라존 오렌지 R; 아스트라존 레드 6B; 아스트라존 옐로우 7 GLL; 아타브린; 아토-택(ATTO-TAG™) CBQCA; 아토-택™ FQ; 오라민; 오로포스핀 G; 오로포스핀; BAO 9(비스아미노페닐옥사다이아졸); BCECF(높은 pH); BCECF(낮은 pH); 버베린 설페이트; 베타 락타마제; BFP 블루 시프티드(shifted) GFP(Y66H); 청색 형광 단백질; BFP/GFP FRET; 비메인; 비스벤제마이드; 비스벤지미드[훽스트(Hoechst)]; 비스-BTC; 블랑코포어 FFG; 블랑코포어 SV; 보보(BOBO™)-1; 보보™-3; 보디피492/515; 보디피493/503; 보디피500/510; 보디피 505/515; 보디피 530/550; 보디피 542/563; 보디피 558/568; 보디피 564/570; 보디피 576/589; 보디피 581/591; 보디피 630/650-X; 보디피 650/665-X; 보디피 665/676; 보디피 F1; 보디피 FL ATP; 보디피 F1-세라마이드; 보디피 R6G SE; 보디피 TMR; 보디피 TMR-X 컨쥬게이트; 보디피 TMR-X, SE; 보디피 TR; 보디피 TR ATP; 보디피 TR-X SE; BO-PRO™-1; BO-PRO™-3; 브릴리언트 설포플라빈 FF; BTC; BTC-5N; 칼세인; 칼세인 블루; 칼슘 크림슨-; 칼슘 그린; 칼슘 그린-1 Ca2 + 염료; 칼슘 그린-2 Ca2 +; 칼슘 그린-5N Ca2 +; 칼슘 그린-C18 Ca2 +; 칼슘 오렌지; 칼코플루오르 화이트; 카복시-X-로다민(5-ROX); 캐스케이드 블루(Cascade Blue™); 캐스케이드 옐로우; 카테콜아민; CCF2[젠블레이저(GeneBlazer)]; CFDA; CFP(청록색 형광 단백질); CFP/YFP FRET; 클로로필; 크로모마이신 A; 크로모마이신 A; CL-NERF; CMFDA; 코엘렌테트라진; 코엘렌테트라진 cp; 코엘렌테트라진 f; 코엘렌테트라진 fcp; 코엘렌테트라진 h; 코엘렌테트라진 hcp; 코엘렌테트라진 ip; 코엘렌테트라진 n; 코엘렌테트라진 O; 쿠마린 팔로이딘; C-피코사이아닌; CPM I 메틸쿠마린; CTC; CTC 포마잔; Cy2™; Cy3.1 8; Cy3.5™; Cy3™; Cy5.1 8; Cy5.5™; Cy5™; Cy7™; 사이안 GFP; 환상 AMP 플루오로센서(FiCRhR); 답실; 단실; 단실 아민; 단실 카다베린; 단실 클로라이드; 단실 DHPE; 단실 플루오라이드; DAPI; 다폭실; 다폭실 2; 다폭실 3'DCFDA; DCFH(다이클로로다이하이드로플루오레세인 다이아세테이트); DDAO; DHR(다이하이도로다민 123); 다이-4-ANEPPS; 다이-8-ANEPPS(비-비례); DiA(4-Di 6-ASP); 다이클로로다이하이드로플루오레세인 다이아세테이트(DCFH); DiD-친유성 트레이서; DiD(DilC18(5)); DIDS; 다이하이도로다민 123(DHR); Dil(DilC18(3)); I 다이나이트로페놀; DiO(DiOC18(3)); DiR; DiR(DilC18(7)); DM-NERF(높은 pH); DNP; 도파민; Ds레드; DTAF; DY-630-NHS; DY-635-NHS; EBFP; ECFP; EGFP; ELF 97; 에오신; 에리트로신; 에리트로신 ITC; 브롬화에티듐; 에티듐 단독이량체-1(EthD-1); 유크리신; 유코라이트; 염화유로퓸(111); EYFP; 패스트 블루; FDA; 포일겐(파라로스아닐린); FIF(폼알데하이드 유도되는 형광); FITC; 플라조 오렌지; 플루오-3; 플루오-4; 플루오레세인(FITC); 플루오레세인 다이아세테이트; 플루오로-에메랄드; 플루오로-골드(하이드록시스틸바미딘); 플루오르-루비; 플루오르X; FM 1-43™; FM 4-46; 퓨라 레드(Fura Red™)(높은 pH); 퓨라 레드™/플루오-3; 퓨라-2; 퓨라-2/BCECF; 제나크릴 브릴리언트 레드 B; 제나크릴 브릴리언트 옐로우 10GF; 제나크릴 핑크 3G; 제나크릴 옐로우 5GF; 젠블레이저; (CCF2); GFP(S65T); GFP 레드 시프티드(rsGFP); GFP 야생형 비-UV 여기(wtGFP); GFP 야생형, UV 여기(wtGFP); GFPuv; 글록살산; 그래뉼러 블루; 헤마토폴피린; 훽스트 33258; 훽스트 33342; 훽스트 34580; HPTS; 하이드록시쿠마린; 하이드록시스틸바미딘(플루오로골드); 하이드록시트립타민; 인도-1, 높은 칼슘; 인도-1 낮은 칼슘; 인도다이카보사이아닌(DiD); 인도트라이카보사이아닌(DiR); 인트라화이트 Cf; JC-1; JO JO-1; JO-PRO-1; 레이저프로; 로로단; LDS 751 (DNA); LDS 751 (RNA); 류코포어 PAF; 류코포어 SF; 류코포어 WS; 리사민 로다민; 리사민 로다민 B; 칼세인/에티듐 단독이량체; LOLO-1; LO-PRO-1; 루시퍼 옐로우; 라이소 트랙커 블루; 라이소 트랙커 블루-화이트; 라이소 트랙커 그린; 라이소 트랙커 레드; 라이소 트랙커 옐로우; 라이소센서 블루; 라이소센서 그린; 라이소센서 옐로우/블루; 맥 그린; 마그달라 레드(플록신 B); 맥-퓨라 레드; 맥-퓨라-2; 맥-퓨라-5; 맥-인도-1; 마그네슘 그린; 마그네슘 오렌지; 말라카이트 그린; 마리나 블루; I 맥실론 브릴리언트 플라빈 10 GFF; 맥실론 브릴리언트 플라빈 8 GFF; 메로사이아닌; 메톡시쿠마린; 미토트랙커 그린 FM; 미토트랙커 오렌지; 미토트랙커 레드; 미트라마이신; 모노브로모바이메인; 모노브로모바이메인(mBBr-GSH); 모노클로로바이메인; MPS(메틸 그린 피로닌 스틸벤); NBD; NBD 아민; 나일 레드; 나이트로벤족세디돌; 노르아드레날린; 뉴클리어 패스트 레드; i 뉴클리어 옐로우; 나일로산 브릴리언트 라빈 E8G; 오레곤 그린(Oregon Green™); 오레곤 그린™ 488; 오레곤 그린™ 500; 오레곤 그린™ 514; 패시픽 블루; 파라로스아닐린(포일겐); PBFI; PE-Cy5; PE-Cy7; PerCP; PerCP-Cy5.5; PE-텍사스레드(Red 613); 플록신 B(마그달라 레드); 포와이트 AR; 포와이트 BKL; 포와이트 Rev; 포와이트 RPA; 포스핀 3R; 포토레지스트; 피코에리트린 B[PE]; 피코에리트린 R[PE]; PKH26(시그마); PKH67; PMIA; 폰토크롬 블루 블랙; POPO-1; POPO-3; PO-PRO-1; PO-I PRO-3; 프리뮬린; 프로시온 옐로우; 프로피듐 로디드(Pl); PyMPO; 피렌; 피로닌; 피로닌 B; 피로잘 브릴리언트 플라빈 7GF; QSY 7; 퀴나크린 머스타드; 레소루핀; RH 414; 로드-2; 로다민; 로다민 110; 로다민 123; 로다민 5 GLD; 로다민 6G; 로다민 B; 로다민 B 200; 로다민 B 엑스트라; 로다민 BB; 로다민 BG; 로다민 그린; 로다민 팔리시딘; 로다민:팔로이딘; 로다민 레드; 로다민 WT; 로즈 벵갈; R-피코사이아닌; R-피코에리트린(PE); rsGFP; S65A; S65C; S65L; S65T; 사파이어 GFP; SBFI; 세로토닌; 세브론 브릴리언트 레드 2B; 세브론 브릴리언트 레드 4G; 세브론 I 브릴리언트 레드 B; 세브론 오렌지; 세브론 옐로우 L; sgBFP™(슈퍼 글로우 BFP); sgGFP™(슈퍼 글로우 GFP); SITS(프리뮬린; 스틸벤 아이소티오설폰산); SNAFL 칼세인; SNAFL-1; SNAFL-2; SNARF 칼세인; SNARF1; 소듐 그린; 스펙트럼아쿠아; 스펙트럼그린; 스펙트럼오렌지; 스펙트럼 레드; SPQ(6-메톡시-N-(3-설포프로필)퀴놀리늄); 스틸벤; 설포로다민 B 및 C; 설포로다민 엑스트라; 사이토(SYTO) 11; 사이토 12; 사이토 13; 사이토 14; 사이토 15; 사이토 16; 사이토 17; 사이토 18; 사이토 20; 사이토 21; 사이토 22; 사이토 23; 사이토 24; 사이토 25; 사이토 40; 사이토 41; 사이토 42; 사이토 43; 사이토 44; 사이토 45; 사이토 59; 사이토 60; 사이토 61; 사이토 62; 사이토 63; 사이토 64; 사이토 80; 사이토 81; 사이토 82; 사이토 83; 사이토 84; 사이토 85; 사이톡스(SYTOX) 블루; 사이톡스 그린; 사이톡스 오렌지; 테트라사이클린; 테트라메틸로다민(TRITC); 텍사스 레드(Texas Red™); 텍사스 레드-X™ 컨쥬게이트; 티아다이카보사이아닌(DiSC3); 티아진 레드 R; 티아졸 오렌지; 티오플라빈 5; 티오플라빈 S; 티오플라빈 TON; 티올라이트; 티오졸 오렌지; 티노폴 CBS(칼코플루오르 화이트); TIER; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; 트라이컬러(PE-Cy5); TRITC 테트라메틸로다민엘소티오사이아네이트; 트루 블루; 트루 레드; 울트랄라이트; 우라닌 B; 유비텍스 SFC; wt GFP; WW 781; X-로다민; XRITC; 자일렌 오렌지; Y66F; Y66H; Y66W; 옐로우 GFP; YFP; YO-PRO-1; YO-PRO 3; YOYO-1; YOYO-3; 사이버 그린; 티아졸 오렌지[인터킬레이팅(interchelating) 염료]; 광자 도트와 같은 반도체 나노입자; 또는 케이징된(caged) 형광 발색단(광 또는 다른 전자기 에너지 공급원으로 활성화될 수 있음), 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
라벨링은 직접 또는 간접적일 수 있다. 직접 라벨링에서는, 검출 항체(관심있는 분자에 대한 항체) 또는 검출 분자(관심있는 분자에 대한 항체에 의해 결합될 수 있는 분자)가 라벨을 포함한다. 라벨의 검출은 검출 항체 또는 검출 분자의 존재를 나타내고, 이는 다시 각각 관심있는 분자 또는 관심있는 분자에 대한 항체의 존재를 나타낸다. 간접 라벨링에서는, 추가적인 분자 또는 잔기를 면역 착체와 접촉시키거나, 추가적인 분자 또는 잔기를 면역 착체의 부위에서 생성시킨다. 예를 들어, 효소와 같은 신호-발생 분자 또는 잔기를 검출 항체 또는 검출 분자에 부착 또는 연합시킬 수 있다. 이어, 신호-발생 분자는 면역 착체의 부위에서 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 적합한 기질이 공급될 때 효소는 면역 착체의 부위에서 눈에 보이거나 검출될 수 있는 생성물을 생성시킬 수 있다. ELISA는 이러한 유형의 간접 라벨링을 이용한다.
간접 라벨링의 다른 한 예로서, 관심있는 분자 또는 관심있는 분자에 대한 항체(1차 항체)에 결합할 수 있는 추가적인 분자(결합제라고 지칭될 수 있음), 예를 들어 1차 항체에 대한 2차 항체를 면역 착체와 접촉시킬 수 있다. 추가적인 분자는 라벨 또는 신호-발생 분자 또는 잔기를 가질 수 있다. 추가적인 분자는 항체일 수 있고, 따라서 이는 2차 항체라고 불릴 수 있다. 2차 항체가 1차 항체에 결합하면 제 1(또는 1차) 항체 및 관심있는 분자와 함께 소위 샌드위치를 형성할 수 있다. 2차 면역 착체를 형성시키는데 효과적인 조건하에서 2차 면역 착체를 형성시키기에 충분한 시간동안 면역 착체를 라벨링된 2차 항체와 접촉시킬 수 있다. 이어, 2차 면역 착체를 통상적으로 세척하여 임의의 비-특이적으로 결합된 라벨링된 2차 항체를 제거하고, 2차 면역 착체에 잔류하는 라벨을 검출할 수 있다. 추가적인 분자는 또한 바이오틴/아바딘 쌍과 같은 서로 결합할 수 있는 분자 또는 잔기의 쌍중 한쪽일 수 있거나 상기 쌍중 한쪽을 포함할 수 있다. 이러한 방식에서는, 검출 항체 또는 검출 분자가 쌍의 나머지 일원을 포함해야 한다.
간접 라벨링의 다른 방식은 2단계 접근법에 의한 1차 면역 착체의 검출을 포함한다. 예를 들어, 관심있는 분자 또는 상응하는 항체에 대한 결합 친화력을 갖는 항체와 같은 분자(제 1 결합제라고 지칭될 수 있음)를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 2차 면역 착체를 형성할 수 있다. 세척 후, 다시 면역 착체를 형성하는데 효과적인 조건하에서 상기 면역 착체를 형성하기에 충분한 시간동안 제 1 결합제에 대해 결합 친화력을 갖는 다른 분자(제 2 결합제라고 지칭될 수 있음)와 2차 면역 착체를 접촉시킬 수 있다(이에 따라 3차 면역 착체를 생성시킴). 제 2 결합제는 검출가능한 라벨 또는 신호-발생 분자 또는 잔기에 연결되어, 이렇게 형성된 3차 면역 착체를 검출할 수 있게 한다. 이 시스템은 신호 증폭을 제공할 수 있다.
단백질 또는 특정 단백질에 대한 항체와 같은 성분의 검출을 포함하는 면역 검정은 무-라벨 검정, 단백질 분리 방법(즉, 전기영동), 고체 지지체 포획 검정, 또는 생체내 검출을 포함한다. 무-라벨 검정은 일반적으로 샘플중 특정 단백질 또는 특정 단백질에 대한 항체의 존재 또는 부재를 결정하는 진단 수단이다. 단백질 분리 방법은 크기 또는 순전하와 같은 단백질의 물리적 특성을 평가하는 데에도 유용하다. 포획 검정은 통상적으로 샘플중 특정 단백질 또는 특정 단백질에 대한 항체의 농도를 정량적으로 평가하는데 더욱 유용하다. 마지막으로, 생체내 검출은 성분의 공간 발현 패턴을 평가하는데 유용하다(즉, 성분이 개체, 조직 또는 세포 내에서 발견될 수 있는 경우).
농도가 충분한 경우에는 항체-항원 상호작용에 의해 발생되는 분자 착체([Ab-Ag]n)가 육안으로 보이지만, 광 빔을 산란시키는 능력으로 인해 더 적은 양도 검출 및 측정될 수 있다. 착체의 형성은 두 반응물이 모두 존재함을 나타내고, 면역 침전 검정에서는 일정한 시약 항체 농도를 사용하여 특이적인 항원([Ab-Ag]n)을 측정하고, 시약 항원을 사용하여 특이적인 항체([Ab-Ag]n)를 검출한다. 시약이 이미 세포(혈구 응집 반응 검정에서와 같이) 또는 매우 작은 입자(라텍스 응집 검정에서와 같이) 상에 미리 코팅되는 경우에는, 훨씬 더 낮은 농도에서 코팅된 입자의 "응집"이 보인다. 오치털로니(Ouchterlony) 면역 확산 검정, 로켓 면역 전기 영동, 및 면역 비탁 및 네펠로 측정(nephelometric) 검정을 비롯한 이러한 기본 원리에 기초한 다양한 검정이 통상적으로 이용된다. 이러한 검정의 주요 제한점은 라벨을 이용한 검정에 비해 제한된 감도(더 낮은 검출 한계) 및 일부 경우에는 매우 높은 농도의 분석물이 착체 형성을 실제로 억제하여 절차를 더욱 복잡하게 만드는 안전장치를 필요로 한다는 사실이다. 이들 군 1 검정중 일부는 항체의 발견으로 거슬러 올라가며, 이들중 그 어느 것도 실제 "라벨"(예컨대, Ag-enz)을 갖지 않는다. 라벨이 없는 다른 종류의 면역 검정은 면역 센서에 의존하며, 항체-항원 상호작용을 직접 검출할 수 있는 다양한 기기가 현재 시판되고 있다. 대부분은 부동화된 리간드를 갖는 센서 표면 상에서의 소멸파 발생에 의존하며, 이는 리간드로의 결합을 연속적으로 모니터링할 수 있다. 면역 센서는 동역학적 상호작용의 용이한 조사를 가능케 하며, 보다 저렴한 비용의 특수화된 기기의 출현과 함께 미래에는 면역 분석에서 광범위하게 사용될 수 있다.
특정 단백질을 검출하기 위한 면역 검정의 이용은 전기 영동에 의한 단백질의 분리를 포함할 수 있다. 전기 영동은 전기장에 응답하여 용액중의 하전된 분자를 이동시키는 것이다. 이동 속도는 전기장의 강도; 분자의 순전하, 크기 및 형상; 및 분자가 이동하는 매질의 이온 강도, 점도 및 온도에 따라 달라진다. 분석 도구로서 전기 영동은 간단하고 신속하며 감도가 높다. 이는 하전된 단일 화합물의 특성을 연구하기 위해, 또한 분리 기법으로서 분석적으로 이용된다.
일반적으로, 종이, 셀룰로즈 아세테이트, 전분 겔, 아가로즈 또는 폴리아크릴아마이드 겔과 같은 지지 매트릭스에서 샘플을 이동시킨다. 매트릭스는 가열에 의한 대류성 혼합을 억제하고, 전기 영동 이동의 기록을 제공하는데, 이동이 끝난 후 매트릭스를 염색할 수 있고, 주사, 방사선 사진 촬영 또는 저장을 위해 사용할 수 있다. 또한, 가장 통상적으로 사용되는 지지체 매트릭스, 즉 아가로즈 및 폴리아크릴아마이드는 이들이 다공성 겔이라는 점에서 분자를 크기에 의해 분리하는 수단을 제공한다. 다공성 겔은 보다 작은 분자는 자유롭게 이동할 수 있도록 하면서 큰 거대분자의 이동을 지연시키거나 또는 일부 경우에는 완전히 차단함으로써 체로서의 역할을 할 수 있다. 묽은 아가로즈 겔이 동일 농도의 폴리아크릴아마이드보다 통상 더욱 강성이고 취급하기가 용이하기 때문에, 아가로즈를 사용하여 핵산, 큰 단백질 및 단백질 착체와 같은 보다 큰 거대분자를 분리한다. 보다 더 높은 농도에서 취급 및 제조하기가 용이한 폴리아크릴아마이드를 사용하여서는, 지연시키는데 작은 겔 공극 크기를 필요로 하는 대부분의 단백질 및 작은 올리고뉴클레오타이드를 분리한다.
단백질은 양쪽성 화합물이며; 따라서 이들의 순전하는 이들이 현탁되어 있는 매질의 pH에 의해 결정된다. 등전점보다 높은 pH를 갖는 용액에서, 단백질은 음의 순전하를 갖고 전기장에서 양극을 향해 이동한다. 등전점 미만에서는, 단백질이 양으로 하전되고 음극 쪽으로 이동한다. 단백질이 나타내는 순전하는 또한 그의 크기에 무관하다. 즉, 분자의 단위 질량(또는 소정 단백질 및 핵산이 선형 거대분자인 경우 길이)당 갖는 전하는 단백질마다 상이하다. 따라서 소정 pH에서, 또한 비-변성 조건하에서, 단백질의 전기 영동 분리는 분자의 크기 및 전하 둘 다에 의해 결정된다.
소듐 도데실 설페이트(SDS)는 폴리펩타이드 주쇄를 "둘러쌈"으로써 단백질을 변성시키는 음이온성 세제이며, SDS는 1.4:1의 질량비로 매우 특이적으로 단백질에 결합한다. 이렇게 함에 있어서, SDS는 폴리펩타이드의 길이에 비례하여 폴리펩타이드에 음전하를 부여한다. 또한, 통상 크기에 의한 분리에 필요한 랜덤-코일 형상을 채택하기 전에 단백질의 다이설파이드 가교를 감소시킬(변성시킬) 필요가 있는데; 2-머캅토에탄올 또는 다이티오트레이톨(DTT)을 사용하여 이를 수행한다. 따라서, 변성 SDS-PAGE 분리에서는, 폴리펩타이드의 내재적인 전하에 의해서가 아니라 분자량에 의해서 이동이 결정된다.
특징이 결정되어야 하는 단백질과 함께 분자량을 알고 있는 단백질의 SDS-PAGE에 의해 분자량을 결정한다. SDS-변성된 폴리펩타이드 또는 천연 핵산의 분자량의 로그와 그의 Rf 사이에는 선형 관계가 존재한다. Rf는 마커 염료-전면(dye-front)에 의해 이동된 거리에 대한 분자에 의해 이동된 거리의 비로서 계산된다. 전기 영동에 의해 상대적인 분자량(Mr)을 결정하는 간단한 방식은 log10MW에 대한 공지 샘플의 이동된 거리의 표준 곡선을 작도하고, 동일한 겔 상에서 이동된 거리를 측정한 후 샘플의 logMr을 읽는 것이다.
2차원 전기 영동에서는, 단백질을 먼저 한가지 물리적 특성에 기초하여 분별하고, 제 2 단계에서는 다른 물리적 특성에 기초하여 분별한다. 예를 들어, 1차원에서는 튜브 겔에서 편리하게 수행되는 등전점 전기영동을 이용할 수 있고, 2차원에서는 슬랩 겔에서의 SDS 전기 영동을 이용할 수 있다. 절차의 일례는 2차원 전기 영동 방법에 관한 교시내용이 본원에 참고로 인용되는 오파렐(O'Farrell, P.H.)의 문헌[High Resolution Two-dimensional Electrophoresis of Proteins, J. Biol. Chem. 250:4007-4021 (1975)]에 기재된 것이다. 다른 예는 앤더슨(Anderson, L) 및 앤더슨(Anderson, NG)의 문헌[High resolution two-dimensional electrophoresis of human plasma proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5421-5425 (1977)], 온스타인(Ornstein, L.)의 문헌[Disc electrophoresis, L. Ann. N.Y. Acad. Sci. 121:321349 (1964)]에서 발견되는 것을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않으며, 상기 두 문헌 각각은 전기영동 방법과 관련한 교시내용이 본원에 참고로 인용된다.
전기영동 방법에 관한 교시내용이 본원에 참고로 인용되는 램리(Laemmli, U.K.)의 문헌[Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227:680 (1970)]에는 SDS로 변성된 단백질을 분해하기 위한 불연속 시스템이 개시되어 있다. 램리 완충액 시스템의 선두 이온은 클로라이드이고, 추적 이온은 글라이신이다. 따라서, 분해 겔 및 축적 겔은 트리스-HCl 완충액(상이한 농도 및 pH) 중에서 제조되는 한편, 탱크 완충액은 트리스-글라이신이다. 모든 완충액은 0.1% SDS를 함유한다.
본 방법에서 계획되는 전기영동을 이용하는 면역 검정의 일례는 웨스턴 블롯 분석이다. 웨스턴 블로팅 또는 면역 블로팅에 의해, 상이한 샘플에 존재하는 단백질의 분자량을 결정하고 상대적인 양을 측정할 수 있다. 검출 방법은 화학 발광 및 크로마제닉(chromagenic) 검출을 포함한다. 웨스턴 블롯 분석의 표준 방법은 예를 들어 볼락(D.M. Bollag) 등의 문헌[Protein Methods (제2판 1996)] 및 할로우(E. Harlow) 및 레인(D. Lane)의 문헌[Antibodies, a Laboratory Manual (1988)], 미국 특허 제 4,452,901 호에서 찾아볼 수 있으며, 이들 문헌 각각은 웨스턴 블롯 방법과 관련된 개시내용이 본원에 참고로 인용된다. 일반적으로, 겔 전기영동, 통상 SDS-PAGE에 의해 단백질을 분리한다. 특수한 블로팅지, 예를 들어 나이트로셀룰로즈 시트로 단백질을 옮기는데, 다른 유형의 종이 또는 막을 사용할 수도 있다. 단백질은 겔 상에서 이들이 가졌던 것과 동일한 분리 패턴을 유지한다. 블롯을 제네릭(generic) 단백질(예컨대, 우유 단백질)로 배양하여, 나이트로셀룰로즈 상의 임의의 잔류하는 점착 위치에 결합시킨다. 이어, 그의 특이적인 단백질에 결합할 수 있는 항체를 용액에 첨가한다.
특이적인 항체의 특이적인 부동화된 항원으로의 부착은 통상 발색성 기질(예컨대, 알칼라인 포스파타제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제) 또는 화학발광성 기질을 사용하는 간접적인 효소 면역 검정 기법에 의해 용이하게 가시화될 수 있다. 프로빙에 가능한 다른 방법은 형광 또는 방사성 동위원소 라벨(예를 들어, 플루오레세인, 125I)의 사용을 포함한다. 항체 결합을 검출하기 위한 프로브는 컨쥬게이션된 항-면역글로불린, 컨쥬게이션된 스타필로코커스 단백질 A(IgG와 결합함), 또는 바이오틴일화된 1차 항체에 대한 프로브(예를 들어, 컨쥬게이션된 아비딘/스트렙트아비딘)일 수 있다.
기법의 효력은 항원성 및 분자량에 의해 특이적인 단백질을 동시 검출하는데 있다. 먼저 SDS-PAGE에서 질량에 의해 단백질을 분리한 다음, 면역 검정 단계에서 특이적으로 단백질을 검출한다. 그러므로, 이질 샘플중 관심 있는 단백질의 분자량을 어림하기 위하여 단백질 기준물(래더)을 동시에 가동시킬 수 있다.
DNA 결합 단백질과 이들의 동족 DNA 인지 서열 사이의 상호작용을 정성적인 방식 및 정량적인 방식 둘 다로 검출하는데, 겔 시프트 검정 또는 전기영동 이동성 시프트 검정(EMSA)을 이용할 수 있다. 예시적인 기법은 온스타인의 문헌[Disc electrophoresis - I: Background and theory, Ann. NY Acad. Sci. 121:321-349 (1964)] 및 마츠디아라(Matsudiara, PT) 및 버게스(DR Burgess)의 문헌[SDS microslab linear gradient polyacrylamide gel electrophoresis, Anal. Biochem. 87:386-396 (1987)]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 각각 겔-시프트 검정에 관한 교시내용이 본원에 참고로 인용된다.
일반적인 겔-시프트 검정에서는, 라벨링된(예를 들어, 32P-방사성 라벨링된) DNA 또는 RNA 프로브와 함께 정제된 단백질 또는 조질 세포 추출물을 배양한 다음, 비-변성 폴리아크릴아마이드 겔을 통해 유리 프로브로부터 착체를 분리할 수 있다. 착체는 결합되지 않은 프로브보다 겔을 통해 더 서서히 이동한다. 단백질과 결합하는 활성에 따라, 라벨링된 프로브는 이중-스트랜드 또는 단일-스트랜드일 수 있다. 전사 인자와 같은 DNA 결합 단백질을 검출하기 위해서는, 정제되거나 부분적으로 정제된 단백질 또는 핵 세포 추출물을 사용할 수 있다. RNA 결합 단백질을 검출하기 위해서는, 정제되거나 부분적으로 정제된 단백질 또는 핵 또는 세포질 세포 추출물을 사용할 수 있다. 관심 있는 단백질의 결합 부위를 함유하는 DNA 또는 RNA 단편 또는 올리고뉴클레오타이드, 또는 다른 관련되지 않은 서열을 사용하는 경쟁 실험에 의해, 추정되는 결합 부위에 대한 DNA 또는 RNA 결합 단백질의 특이성을 확립한다. 특이적인 경쟁물질 및 비특이적인 경쟁물질의 존재하에 형성된 착체의 특성 및 강도의 차이에 의해, 특이적인 상호작용을 알아낼 수 있다. 겔 시프트 방법에 관한 교시내용이 본원에 참고로 인용되는, <http://www.promega.com/faq/gelshfaq.html>(2005년 3월 25일자에 최종 방문함)에서 이용가능한 프로메가(Promega)의 겔 시프트 검정 FAQ를 참조한다.
겔 시프트 방법은 예를 들어 폴리아크릴아마이드 전기영동 겔과 같은 겔에서 단백질을 검출하기 위해 쿠마지(COOMASSIE)[임페리얼 케미칼즈 인더스트리즈, 리미티드(Imperial Chemicals Industries, Ltd)] 청색 색소의 콜로이드 형태를 사용함을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 예컨대 노이호프(Neuhoff) 등의 문헌[Electrophoresis 6:427-448 (1985)] 및 노이호프 등의 문헌[Electrophoresis 9:255-262 (1988)]에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 각각 겔 시프트 방법에 관한 교시내용이 본원에 참고로 인용된다. 상기 참조된 종래의 단백질 검정 방법에 덧붙여, 조합 세정 및 단백질 염색 조성물이 미국 특허 제 5,424,000 호에 기재되어 있다(이는 겔 시프트 방법에 관한 교시내용이 본원에 참고로 인용됨). 용액은 인산, 황산 및 질산, 및 애시드 바이올렛 염료를 포함할 수 있다.
방사성 면역 침전 검정(RIPA)은 혈청중의 특이적인 항체를 검출하기 위하여 방사성 라벨링된 항원을 사용하는 민감한 검정이다. 항원을 혈청과 반응시킨 다음, 예를 들어 단백질 A 세파로즈 비드와 같은 특수 시약을 사용하여 침전시킨다. 이어, 결합된 방사성 라벨링된 면역 침전물을 겔 전기영동에 의해 통상적으로 분석한다. HIV 항체의 존재를 진단하기 위한 확증 시험으로서 흔히 방사성 면역 침전 검정(RIPA)을 이용한다. RIPA는 또한 당해 분야에서 파르(Farr) 검정, 프레시피틴(Precipitin) 검정, 방사성 면역 프레시피틴 검정; 및 방사성 면역 침전 분석이라고도 불린다.
관심있는 특정 단백질을 분리 및 검출하기 위해 전기영동을 이용하는 상기 면역 검정에 의해 단백질 크기를 평가할 수 있으나, 이들은 단백질 농도를 평가하기에는 매우 민감하지 못하다. 그러나, 지지체상의 단백질 또는 단백질에 특이적인 항체를 검출하는 방법과 조합된, 단백질 또는 단백질에 특이적인 항체가 고체 지지체(예를 들어, 튜브, 벽, 비드 또는 세포)에 결합하여 샘플로부터 각각 항체 또는 관심 있는 단백질을 포획하는 면역 검정도 계획된다. 이러한 면역 검정의 예는 방사성 면역 검정(RIA), 효소-연결된 면역 흡착 검정(ELISA), 유동 세포 분석법, 단백질 검정, 다중화된 비드 검정 및 자기 포획을 포함한다.
방사성 면역 검정(RIA)은 특이적인 항체 또는 다른 수용체 시스템으로의 라벨링되지 않은 성분의 결합을 측정하기 위하여, 방사성 라벨링된 성분(방사성 리간드)를 직접 또는 간접적으로 사용하는 항원-항체 반응 검출용의 전통적인 정량 검정이다. 예를 들어, 생물 검정을 이용할 필요 없이 혈액중 호르몬 수준을 시험하는데 방사성 면역 검정을 이용한다. 항체 형성을 유도할 수 있는 보다 큰 담체 단백질(예를 들어, 소의 감마-글로불린 또는 인간의 혈청 알부민)에 연결되는 경우에는 비-면역원성 성분(예를 들어, 합텐)도 측정할 수 있다. RIA는 방사성 항원(이와 함께 요오드 원자를 단백질의 티로신 잔기 내로 도입할 수 있는 용이성 때문에, 방사성 동위원소 125I 또는 131I가 흔히 사용됨)과 그 항원에 대한 항체를 혼합함을 포함한다. 항체는 통상 튜브 또는 비드와 같은 고체 지지체에 연결된다. 이어, 라벨링되지 않은 또는 "처리되지 않은(cold)" 항원을 공지의 양으로 첨가하고 대체되는 라벨링된 항원의 양을 측정한다. 처음에는, 방사성 항원이 항체에 결합한다. 처리되지 않은 항원이 첨가되면, 이 둘이 항체 결합 부위에 대해 경쟁하고, 처리되지 않은 항원의 농도가 더 높으면 항체에 더 많이 결합하여 방사성 변이체를 대체한다. 결합된 항원을 용액중의 결합되지 않은 것으로부터 분리하고, 결합 곡선을 플로팅하는데 각각의 방사능을 사용한다. 기법은 극히 민감하고 특이적이다.
효소-연결된 면역 흡착 검정(ELISA), 또는 더욱 포괄적으로 칭해지는 EIA(효소 면역 검정)는 단백질에 특이적인 항체를 검출할 수 있는 면역 검정이다. 이러한 검정에서는, 항체-결합 또는 항원-결합 시약에 결합된 검출가능한 라벨이 효소이다. 그의 기질에 노출될 때, 이 효소는 예컨대 분광 광도, 형광 광도 또는 육안적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 잔기를 생성시키는 방식으로 반응한다. 검출에 유용한 시약을 검출가능하게 라벨링하는데 사용될 수 있는 효소는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 글루코즈 옥시다제, β-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 말레이트 데하이드로게나제, 스파틸로코커스 뉴클레아제, 아스파라기나제, 효모 알콜 데하이드로게나제, 알파-글라이세로포스페이트 데하이드로게나제, 트리오즈 포스페이트 아이소머라제, 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린에스테라제를 포함하지만, 이들로 국한되지는 않는다. ELISA 절차의 기재에 대해서는, 볼러(Voller, A.) 등의 문헌[J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978)]; 버틀러(Butler, J. E.)의 문헌[Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981)]; 마지오(편집)의 문헌[Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, 1980]; 버틀러의 문헌[In: Structure of Antigens, Vol. 1 (Van Regenmortel, M., CRC Press, Boca Raton, 1992, pp. 209-259]; 버틀러의 문헌[In: van Oss, C.J. 등(편집), Immunochemistry, Marcel Dekker, Inc., 뉴욕, 1994, pp. 759-803]; 버틀러(편집)의 문헌[Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, 1991]; 크로우터(Crowther)의 문헌["ELISA: Theory and Practice", In: Methods in Molecule Biology, Vol. 42, Humana Press; New Jersey, 1995]; 미국 특허 제 4,376,110 호 참조. 상기 문헌 각각은 ELISA 방법에 관한 교시내용이 본원에 참고로 인용된다.
ELISA 기법의 변형은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 한 변형에서는, 단백질에 결합할 수 있는 항체를 단백질 친화력을 나타내는 선택된 표면(예를 들어, 폴리스타이렌 미소적정 플레이트의 웰) 상에 부동화시킬 수 있다. 이어, 마커 항원을 함유하는 것으로 의심되는 시험 조성물을 웰에 첨가할 수 있다. 결합 및 비특이적으로 결합된 면역 착체를 제거하기 위한 세척 후, 결합된 항원을 검출할 수 있다. 검출가능한 라벨에 연결된, 표적 단백질에 특이적인 제 2 항원을 첨가함으로써 검출을 수행할 수 있다. ELISA의 이러한 유형은 간단한 "샌드위치 ELISA"이다. 또한, 제 2 항체를 첨가한 후 제 2 항체에 대한 결합 친화력을 갖는 제 3 항체를 첨가함으로써 검출을 수행할 수 있으며, 이 때 제 3 항체는 검출가능한 라벨에 연결된다.
다른 변형은 경쟁 ELISA이다. 경쟁 ELISA에서, 시험 샘플은 공지량의 라벨링된 항원 또는 항체와 결합에 대해 경쟁한다. 코팅된 웰에서 배양하기 전 또는 배양하는 동안 샘플을 공지의 라벨링된 부류와 혼합함으로써 샘플중 반응성 부류의 양을 결정할 수 있다. 샘플중 반응성 부류의 존재는 웰로의 결합에 이용될 수 있는 라벨링된 부류의 양을 감소시켜 궁극적인 신호를 감소시키는 작용을 한다.
이용되는 포맷과는 무관하게, ELISA는 공통적으로 특정의 특징, 예를 들어 코팅, 배양 또는 결합, 비특이적으로 결합된 부류를 제거하기 위한 세척 및 결합된 면역 착체의 검출을 갖는다. 항원 또는 항체는 플레이트, 비드, 계량봉, 막 또는 칼럼 매트릭스, 및 부동화된 항원 또는 항체에 적용되는 분석되어야 하는 샘플과 같은 고체 지지체에 연결될 수 있다. 플레이트를 항원 또는 항체로 코팅함에 있어서는, 통상적으로 플레이트의 웰을 항원 또는 항체의 용액으로 하룻밤동안 또는 규정된 시간동안 배양한다. 이어, 플레이트의 웰을 세척하여 불완전하게 흡착된 물질을 제거할 수 있다. 이어, 웰의 임의의 나머지 이용가능한 표면을 시험 항혈청과 관련하여 항원 면에서 중성인 비특이적 단백질로 "코팅"할 수 있다. 이들은 소의 혈청 알부민(BSA), 카제인 및 분유 용액을 포함한다. 코팅에 의해, 부동화 표면상의 비특이적인 흡착 부위가 차단될 수 있고, 따라서 표면상으로의 항혈청의 비특이적 결합에 의해 야기되는 백그라운드(background)가 감소될 수 있다.
ELISA에서는, 직접적인 절차보다는 2차 또는 3차 검출 수단을 또한 이용할 수 있다. 그러므로, 단백질 또는 항체를 웰에 결합시키고 비-반응성 물질로 코팅하여 백그라운드를 감소시키며 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거한 후, 부동화 표면을 면역 착체(항원/항체) 형성에 효과적인 조건하에 시험되어야 하는 임상적 또는 생물학적 대조용 샘플과 접촉시킨다. 이어, 면역 착체의 검출은 라벨링된 제 2 결합제, 또는 라벨링된 제 3 결합제와 함께 제 2 결합제를 필요로 한다.
"면역 착체(항원/항체) 형성에 효과적인 조건하에"는 이 조건이 비-특이적 결합을 감소시키고 적당한 소음에 대한 신호의 비를 얻기 위해 BSA, 소의 감마 글로불린(BGG) 및 포스페이트 완충된 염수(PBS)/트윈(Tween)과 같은 용액으로 항원 및 항체를 희석시킴을 포함한다는 의미이다.
적합한 조건은 또한 효과적인 결합에 충분한 온도에서 이러한 충분한 시간동안 배양시킴을 의미한다. 배양 단계는 전형적으로 약 20 내지 30℃에서 약 1분 내지 12시간동안일 수 있거나, 또는 약 0 내지 약 10℃에서 하룻밤동안 배양시킬 수 있다.
ELISA에서의 모든 배양 단계 후에, 착체를 형성하지 않은 물질을 제거하기 위해 접촉된 표면을 세척할 수 있다. 세척 절차는 PBS/트윈 또는 보레이트 완충과액과 같은 용액으로 세척함을 포함한다. 시험 샘플과 원래 결합된 물질 사이의 특이적인 면역 착체 형성 및 후속 세척 후, 면역 착체의 발생을 미량까지도 결정할 수 있다.
검출 수단을 제공하기 위하여, 제 2 또는 제 3 항체는 상기 기재된 바와 같이 검출을 가능케 하는 관련 라벨을 가질 수 있다. 이는 적절한 발색성 기질과의 배양시 색상을 발생시킬 수 있는 효소일 수 있다. 그러므로, 예를 들어 추가의 면역 착체 형성 발생을 촉진시키는 시간동안 그러한 조건하에서 제 1 또는 제 2 면역 착체를 라벨링된 항체와 접촉 및 배양시킬 수 있다(예를 들어, PBS-트윈과 같은 PBS-함유 용액 중에서 실온에서 2시간동안 배양).
라벨링된 항체와 함께 배양시키고 후속적으로 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거한 다음, 예컨대 효소 라벨로서 퍼옥시다제의 경우 우레아 및 브로모크레졸 퍼플 또는 2,2'-아지도-다이-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산[ABTS] 및 H2O2와 같은 발색성 기질과 함께 배양시킴으로써 라벨의 양을 정량할 수 있다. 이어, 예컨대 가시광 스펙트럼 분광광도계를 이용하여 발색 정도를 측정함으로써 정량을 달성할 수 있다.
단백질 어레이는 유리, 막, 미소적정 웰, 질량 분광계 플레이트 및 비드 또는 다른 입자를 포함하는 표면 상의 부동화된 단백질을 사용하는 고상 리간드 결합 검정 시스템이다. 검정은 매우 동시에 이루어지고(다중화) 흔히 소형화된다(마이크로어레이, 단백질 칩). 이들의 이점은 신속하고 자동화가능하며, 고감도일 수 있고, 시약 면에서 경제적이고, 단일 실험에서의 다량의 데이터 제공을 포함한다. 생물 정보 뒷받침이 중요하며; 데이터 취급은 복잡한 소프트웨어 및 데이터 비교 분석을 필요로 한다. 그러나, 소프트웨어는 하드웨어 및 검출 시스템이 훨씬 더 그러할 수 있는 것처럼 DNA 어레이에 대해 사용되는 것으로부터 적합화될 수 있다.
주요 포맷중 하나는, 통상 항체이지만 선택적인 단백질 골격(scaffold), 펩타이드 또는 핵산 압타머일 수도 있는 리간드-결합 시약을 사용하여 혈장 또는 조직 추출물과 같은 혼합물중 표적 분자를 검출하는 포획 어레이이다. 진단학에서는, 포획 어레이를 사용하여 다중 면역 검정을 동시에 수행할 수 있다(예컨대 개별 혈청중 수가지 분석물을 시험하고, 다수의 혈청 샘플을 동시에 시험함). 단백질체학에서는, 포획 어레이를 사용하여 상이한 건강 및 질환 샘플중 단백질의 수준을 정량하고 비교한다(즉, 단백질 발현 프로파일링). 특이적인 리간드 결합제 외의 단백질을, 단백질-단백질, 단백질-DNA, 단백질-약물, 수용체-리간드, 효소-기질 등과 같은 시험관내 기능적 상호작용 선별을 위한 어레이 포맷으로 사용한다. 포획 시약 자체를 다수의 단백질에 대해 선택 및 선별하는데, 이는 또한 다중 단백질 표적에 대한 다중 어레이 포맷으로 수행될 수도 있다.
어레이 구축에 있어서, 단백질의 공급원은 재조합 단백질용 세포계 발현 시스템, 천연 공급원으로부터의 정제, 무-세포 번역 시스템에 의한 시험관내 생성, 및 펩타이드 합성 방법을 포함한다. 이들 방법중 다수는 높은 처리량의 생성을 위해 자동화될 수 있다. 포획 어레이 및 단백질 기능 분석에 있어서는, 단백질이 올바르게 절첩되어야 하고 기능적이어야 하는 것이 중요하며; 이는 예를 들어 재조합 단백질이 변성 조건하에서 세균으로부터 추출되는 경우 항상 그렇지는 않다. 그럼에도 불구하고, 변성된 단백질의 어레이는 교차-반응성을 위한 항체 선별, 자기 항체의 확인 및 단백질에 결합되는 리간드의 선택에 유용하다.
단백질 어레이는 흔히 형광 판독을 이용하는, ELISA 및 도트 블로팅과 같은 친숙한 면역 검정 방법의 소형화로서 디자인되었고, 로봇 공학 및 높은 처리량의 검출 시스템에 의해 촉진되어 동시에 수행되어야 하는 다중 측정을 가능케 하였다. 통상적으로 사용되는 물리적 지지체는 유리 슬라이드, 실리콘, 마이크로웰, 나이트로셀룰로즈 또는 PVDF 막, 및 자석 및 다른 마이크로비드를 포함한다. 평면 표면 상으로 전달되는 단백질의 미소방울이 가장 친숙한 포맷이기는 하지만, 다른 구조는 미세 유체 공학의 발전에 기초한 CD 원심분리 장치[가이로스(Gyros), 미국 뉴저지주 몬마우쓰 정션] 및 플레이트의 가공된 마이크로채널[예를 들어, 더 리빙 칩(The Living Chip™, 바이오트로브(Biotrove), 미국 매사추세츠주 워번] 및 실리콘 표면상의 작은 3D 포스트[자이오믹스(Zyomyx), 미국 캘리포니아주 헤이워드]와 같은 특수화된 칩 디자인을 포함한다. 어레이의 기초로서 현탁액중 입자를 또한 사용할 수 있으나, 단 이들은 확인을 위해 코드화되며; 시스템은 마이크로비드용 컬러 코딩[루미넥스(Luminex), 텍사스주 오스틴; 바이오-라드 래보러토리즈(Bio-Rad Laboratories)] 및 반도체 나노결정용 컬러 코딩[예를 들어, 큐도츠(QDots™), 퀀텀 도트(Quantum Dot), 미국 캘리포니아주 헤이워드], 및 비드용 바코딩[울트라플렉스(UltraPlex™), 스마트비드 테크놀로지즈 리미티드(SmartBead Technologies Ltd), 영국 캠브리지 바브라햄] 및 다중금속 미소봉용 바코딩[예를 들어, 나노바코즈(Nanobarcodes™) 입자, 나노플렉스 테크놀로지즈(Nanoplex Technologies), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰]을 포함한다. 또한, 비드를 반도체 칩 상의 평면 어레이 내로 조립할 수 있다[립스 테크놀로지(LEAPS technology), 바이오어레이 솔루션즈(BioArray Solutions), 미국 뉴저지주 워렌].
단백질의 부동화는 커플링 시약 및 커플링되는 표면의 특성 둘 다에 관련된다. 우수한 단백질 어레이 지지체 표면은 커플링 절차 전후에 화학적으로 안정하고, 우수한 반점 형태를 가능하게 하고, 최소한의 비특이적 결합을 나타내며, 검출 시스템의 백그라운드에 기여하지 않으며, 상이한 검출 시스템과 양립가능하다. 이용되는 부동화 방법은 재현성 있고, 상이한 특성(크기, 친수성, 소수성)의 단백질에 적용가능하며, 높은 처리량 및 자동화에 순종적이고, 완전히 기능성인 단백질 활성의 보유와 양립가능하다. 표면-결합된 단백질의 배향은 활성 상태에서 리간드 또는 기질에 이를 제공함에 있어서 중요한 인자로서 인식되며; 포획 어레이의 경우 배향된 포획 시약(이는 통상적으로 단백질의 부위-특이적인 라벨링을 필요로 함)을 사용하여 가장 효율적인 결합 결과를 수득한다.
단백질 부동화의 공유 및 비공유 방법 둘 다가 이용되며, 다양한 이해득실을 갖는다. 표면으로의 수동적인 흡착은 방법 면에서 간단하지만, 정량적 또는 배향 제어가 거의 불가능하며; 단백질의 기능적 특성을 변화시킬 수 있거나 변화시킬 수 없으며, 재현성 및 효율이 가변적이다. 공유 커플링 방법은 안정한 연결을 제공하고, 광범위한 단백질에 적용될 수 있으며, 우수한 재현성을 가지지만; 배향이 가변적일 수 있고, 화학적 유도체화가 단백질의 기능을 변화시킬 수 있고 안정한 상호작용 표면을 필요로 한다. 단백질상의 택을 사용하는 생물학적 포획 방법은 안정한 연결을 제공하고 특이적으로 재현성 있는 배향으로 단백질에 결합하지만, 생물학적 시약은 먼저 적절하게 부동화되어야 하고, 어레이는 특수한 취급을 필요로 할 수 있고 가변적인 안정성을 가질 수 있다.
단백질 어레이의 제조를 위해 수가지 부동화 화학적 방법 및 택이 기재되어 왔다. 공유 부착용 기재는 아미노- 또는 알데하이드-함유 실레인 시약으로 코팅된 유리 슬라이드를 포함한다. 버살링스(Versalinx™) 시스템[프롤링스(Prolinx), 미국 워싱턴주 보텔]에서는, 페닐다이보론산으로 유도체화된 단백질과 지지체 표면 상에 부동화된 살리실하이드록삼산 사이의 상호작용에 의해 가역적인 공유 커플링이 달성된다. 이는 또한 낮은 백그라운드 결합 및 낮은 고유 형광을 가지며, 부동화된 단백질이 기능을 보유하도록 할 수 있다. 개질되지 않은 단백질의 비공유 결합은 3-차원 폴리아크릴아마이드 겔에 기초한 하이드로겔(HydroGel™)[퍼킨엘머(PerkinElmer), 미국 매사추세츠주 웰러슬리]와 같은 다공성 구조체 내에서 이루어지며; 이러한 기재는 높은 용량 및 단백질 기능의 보유와 함께 유리 마이크로어레이상에서 특히 낮은 백그라운드를 제공하는 것으로 보고된다. 널리 사용되는 생물학적 커플링 방법은 단백질을 적절히 개질시키면서 바이오틴/스트렙트아비딘 또는 헥사히스티딘/Ni 상호작용을 통한 것이다. 바이오틴은 이산화티탄[자이오믹스(Zyomyx)] 또는 오산화탄탈[젭토센스(Zeptosens), 스위스 비터스빌]과 같은 표면 상에 부동화된 폴리-리신 주쇄에 컨쥬게이션될 수 있다.
어레이 제조 방법은 로봇 접촉 인쇄, 잉크-제팅, 압전 스포팅 및 사진 석판술을 포함한다. 다수의 시판중인 배열장치[예를 들어, 팩커드 바이오사이언시즈(Packard Biosciences)] 및 수공 설비[브이 앤드 피 사이언티픽(V & P Scientific)]가 구입가능하다. 동일 반응계 내에서의 단백질 발현 유도를 위해 세균 콜로니를 PVDF 막 상에 로봇에 의해 격자 모양으로 설치할 수 있다.
반점 크기 및 밀도의 한계에 나노어레이가 있으며, 나노미터 공간 규모로 반점이 있어서 1mm 미만의 정사각형 단일 칩 상에서 수천개의 반응이 수행되도록 할 수 있다. 바이오포스 래보러토리즈(BioForce Laboratories)는 85제곱마이크론에 1521개의 단백질 반점을 갖는(이는 광학 검출의 한계에서 1제곱cm당 2천 5백만 개의 반점에 상응함) 나노어레이를 개발하였으며; 이들의 판독 방법은 형광 및 원자력간 현미경법(AFM)이다.
형광 라벨링 및 검출 방법이 널리 이용된다. DNA 마이크로어레이를 판독하는데 사용되는 것과 동일한 기기를 단백질 어레이에 적용할 수 있다. 분별 디스플레이를 위해, 포획(예컨대, 항체) 어레이를 두가지 상이한 세포 상태로부터의 형광 라벨링된 단백질로 시험할 수 있는데, 여기에서는 색상이 표적의 양의 변화에 대한 판독치로서 작용하도록 세포 용해물을 상이한 형광 발색단(예컨대, Cy-3, Cy-5)과 직접 컨쥬게이션시키고 혼합한다. 티라마이드 신호 증폭(TSA)[퍼킨엘머 라이프사이언시즈(PerkinElmer Lifesciences)]에 의해 형광 판독 감도를 10 내지 100배 증폭시킬 수 있다. 평면 도파관 기법[젭토센스(Zeptosens)]은 초민감성 형광 검출을 가능하게 하는데, 중간 세척 절차가 없다는 추가적인 이점도 있다. 라벨[루미넥스(Luminex)]로서 피코에리트린 또는 반도체 나노결정(퀀텀 도트)의 특성을 이용하여, 현탁액 비드 및 입자로 고감도를 또한 달성할 수 있다. 특히 상업적인 바이오테크계에서 신규의 다른 판독법이 다수 개발되었다. 이들은 표면 플라스몬 공명[에이치티에스 바이오시스템즈(HTS Biosystems), 내재성 생물 프로브, 아리조나주 템피], 롤링 써클 DNA 증폭[몰레큘라 스테이징(Molecular Staging), 미국 코네티컷주 뉴 헤이븐], 질량 분광법[내재성 생물 프로브; 시퍼젠(Ciphergen), 미국 캘리포니아주 프레몬트], 공명 광 산란[제니콘 사이언시즈(Genicon Sciences), 미국 캘리포니아주 샌 디에고] 및 원자력간 현미경법(바이오포스 래보러토리즈)의 개작을 포함한다.
포획 어레이는 진단 칩 및 발현 프로파일링용 어레이의 기초를 형성한다. 이들은 높은 처리량 방식으로 특정 표적 리간드와 결합하고 그를 검출하기 위하여 종래의 항체, 단일 도메인, 처리된 골격, 펩타이드 또는 핵산 압타머와 같은 높은 친화력의 포획 시약을 사용한다.
항체 어레이는 특이성 및 허용가능한 백그라운드와 같은 요구되는 특성을 가지며, 일부는 시판되고 있다[비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 산 호세; 클론테크(Clontech), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰; 바이오라드; 시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트 루이스]. 포획 어레이용 항체는 파지 또는 리보좀 디스플레이 라이브러리[캠브리지 안티바디 테크놀로지(Cambridge Antibody Technology), 영국 캠브리지; 바이오인벤트(BioInvent), 스웨덴 룬드; 아피테크(Affitech), 미국 캘리포니아주 월넛 크릭; 바이오사이트(Biosite), 미국 캘리포니아주 샌 디에고]로부터 선택된 후 종래의 면역화(다클론성 혈청 및 하이브리도마)에 의해 제조되거나, 또는 통상 이. 콜라이(E. coli)에서 발현되는 재조합 단편으로서 제조된다. 종래의 항체에 덧붙여, Fab 및 scFv 단편, 카멜리드(camelid) 또는 처리된 인간 상응물[도맨티스(Domantis), 미국 매사추세츠주 월텀]로부터의 단일 V-도메인도 어레이에 유용할 수 있다.
용어 "골격"은 단백질의 리간드-결합 도메인을 말하는데, 이는 특이성 및 친화력과 같은 항체-유사 특성을 갖는 다양한 표적 분자와 결합할 수 있는 다중 변이체로 처리된다. 변이체는 유전자 라이브러리 포맷으로 생성될 수 있으며, 파지, 세균 또는 리보좀 디스플레이에 의해 개별 표적에 대해 선택될 수 있다. 이러한 리간드-결합 골격 또는 뼈대는 스타필로코커스 아우레우스(Staph. aureus) 단백질 A에 기초한 '아피바디즈(Affibodies)'[아피바디(Affibody), 스웨덴 브로마], 피브로넥틴에 기초한 '트리넥틴즈(Trinectins)'[필로스(Phylos), 미국 매사추세츠주 렉싱턴] 및 리포칼린 구조체에 기초한 '안티칼린즈(Anticalins)'[피에리스 프로테오랩(Pieris Proteolab), 독일 프라이싱-바이헨스테판]를 포함한다. 이들을 항체와 유사한 방식으로 포획 어레이에 사용할 수 있으며, 이들은 강건함과 제조의 용이성과 같은 이점을 가질 수 있다.
비-단백질 포획 분자, 특히 높은 특이성 및 친화력으로 단백질 리간드와 결합하는 단일-스트랜드 핵산 압타머도 어레이에 사용된다[소마로직(SomaLogic), 미국 콜로라도주 불더]. 압타머는 셀렉스(Selex™) 절차에 의해 올리고뉴클레오타이드 라이브러리로부터 선택되며, 단백질과 이들의 상호작용은 브롬화된 데옥시우리딘 및 UV-활성화된 가교결합(광압타머)의 혼입을 통해 공유 부착에 의해 향상될 수 있다. 리간드로의 광 가교결합은 특이적인 입체 요구조건으로 인해 압타머의 교차 반응성을 감소시킨다. 압타머는 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성에 의한 제조의 용이성 및 DNA의 안정성과 강건함과 같은 이점을 가지며; 광압타머 어레이 상에서는, 다목적 형광 단백질 염색을 사용하여 결합을 검출할 수 있다.
항체 어레이에 결합하는 단백질 분석물은 직접적으로 또는 샌드위치 검정에서 2차 항체를 통해 검출될 수 있다. 상이한 색상을 갖는 상이한 샘플을 비교하기 위하여 직접 라벨링을 이용한다. 동일한 단백질 리간드에 집중되는 항체의 쌍을 입수할 수 있는 경우, 샌드위치 면역 검정은 높은 특이성 및 감도를 제공하며, 따라서 사이토카인과 같은 적은 양의 단백질을 선택하는 방법이며; 이들은 단백질 개질체의 검출 가능성도 부여한다. 질량 분광법, 표면 플라스몬 공명 및 원자력간 현미경법을 비롯한 무-라벨 검출 방법은 리간드의 변화를 피한다. 임의의 방법에서 요구되는 것은 최적 감도 및 특이성, 및 소음에 대한 신호의 높은 비를 제공하기 위한 낮은 백그라운드이다. 분석물 농도가 넓은 범위를 포괄하기 때문에, 감도는 적절하게 조정되어야 하고; 샘플의 연속적인 희석 또는 상이한 친화력을 갖는 항체의 사용이 이 문제점에 대한 해결책이다. 관심 있는 단백질은 사이토카인 또는 세포중 저발현 생성물과 같은, 흔히 체액 및 추출물에서 낮은 농도를 가져서 pg 범위 이하에서의 검출을 필요로 하는 것이다.
포획 분자의 어레이에 대한 대안은 '분자 각인' 기법을 통해 제조되는 것이며, 여기에서는 중합가능한 매트릭스에 구조적으로 상보적인 서열-특이적 강(cavity)을 발생시키기 위한 형판으로서 펩타이드(예를 들어 단백질의 C-말단 영역으로부터의)를 사용하며; 이 강은 적절한 1차 아미노 서열을 갖는 (변성된) 단백질을 특이적으로 포획할 수 있다[프로테인프린트(ProteinPrint™), 아스피라 바이오시스템즈(Aspira Biosystems), 미국 캘리포니아주 벌링게임].
진단학적으로, 또한 발현 프로파일링에 이용될 수 있는 다른 방법은 프로테인칩(ProteinChip; 등록상표) 어레이[시퍼젠(Ciphergen), 미국 캘리포니아주 프레몬트]이며, 여기에서는 크로마토그래피 표면이 혈장 또는 종양 추출물과 같은 혼합물과 유사한 전하 또는 소수성 특징을 갖는 단백질과 결합하고, SELDI-TOF 질량 분광법을 이용하여 보유된 단백질을 검출한다.
다수의 정제된 단백질을 부동화시킴으로써 대규모 기능성 칩을 구축하고, 단백질과 다른 단백질의 상호작용, 약물-표적 상호작용, 효소-기질 등과 같은 광범위한 생화학적 기능을 검정하는데 사용하였다. 일반적으로, 이들은 이. 콜라이, 효모 등의 내로 클로닝되는 발현 라이브러리를 필요로 하며, 이로부터 발현된 단백질을 예컨대 His 택을 통해 정제하고 부동화시킨다. 무세포 단백질 전사/번역은 세균 또는 다른 생체내 시스템에서 잘 발현되지 않는 단백질의 합성에 대한 실용적인 대안이다.
단백질-단백질 상호작용의 검출에 있어서, 단백질 어레이는 세포에 기초한 효모 2-하이브리드 시스템에 대한 시험관내 대안일 수 있고, 분비된 단백질 또는 다이설파이드 가교를 갖는 단백질과 관련된 상호작용과 같은 상기 2-하이브리드 시스템이 결여된 경우에 유용할 수 있다. 어레이에 대한 생화학적 활성의 고-처리량 분석은 효모 단백질 키나제, 및 효모 프로테옴의 다양한 기능(단백질-단백질 및 단백질-지질 상호작용)에 대해 기재된 바 있으며, 여기에서는 모든 효모 개방-판독 프레임의 큰 비율이 발현되어 마이크로어레이 상에 부동화되었다. 대규모 '프로테옴 칩'은 기능적 상호작용의 확인, 약물 선별 등에 매우 유용할 가망이 있다[프로테오메트릭스(Proteometrix), 미국 코네티컷주 브랜포드].
개별 요소의 2차원 디스플레이로서, 단백질 어레이를 사용하여, 항체, 합성 골격, 펩타이드 및 압타머를 비롯한 특이적인 결합 대응물을 선택하기 위하여, 파지 또는 리보좀 디스플레이 라이브러리를 선별할 수 있다. 이러한 방식으로 '라이브러리에 대한 라이브러리' 선별을 수행할 수 있다. 게놈 프로젝트로부터 확인된 단백질 표적의 어레이에 대하여 조합형의 화학적 라이브러리에서 약물 후보를 선별하는 것은 이 접근법의 다른 적용이다.
예컨대 비디(BD™) 사이토메트릭 비드 어레이(Cytometric Bead Array)와 같은 다중화된 비드 어레이는 가용성 분석물을 포획 및 정량하는데 사용될 수 있는 스펙트럼 면에서 개별적인 입자의 씨리즈이다. 이어, 형광에 기초한 발광의 검출 및 유동 세포분석 분석법에 의해 분석물을 측정한다. 다중화된 비드 어레이는 ELISA에 기초한 검정에 필적할만한 데이터를 "다중화된" 또는 동시 방식으로 생성시킨다. 임의의 샌드위치 포맷 검정에서와 같이, 즉 공지 기준물의 사용 및 표준 곡선에 대한 비-공지 물질의 플로팅을 통해, 세포분석 비드 어레이에서 비-공지 물질의 농도를 계산한다. 또한, 다중화된 비드 어레이는 샘플 부피 제한 때문에 이전에는 생각지 못했던 샘플중 가용성 분석물의 정량을 가능케 한다. 정량적인 데이터에 덧붙여, 강력한 시각적 이미지를 생성시켜, 사용자가 한눈에 추가의 정보를 제공받는 독특한 프로파일 또는 표시를 드러낼 수 있다.
본원에 개시되는 MMP/TIMP 프로파일은 개별적인 MMP 또는 TIMP의 측정에 기초한다. 분석되는 샘플에 이들중 임의의 것이 얼마나 많이 존재하는지를 허용가능하게 나타내는 것으로 알려져 있는 임의의 수단에 의해 이들의 양을 측정할 수 있다. 측정 수단의 예는 실시예에 제공된다. 분석물(예컨대, MMP 또는 TIMP)의 양을 측정하는 과정은 분석물이 존재하지 않거나 검출불가능한 양임을 측정함을 포함한다.
본 발명의 토대를 구성하는 MMP 및 TIMP를 측정하는 기법 및 접근법은 고감도 면역 검정에 기초하였다. 이들 면역 검정중 몇 가지는 본 실험실에 의해 개발되었다(즉, TIMP-4 검정 측정). 표 4에 기재된 측정치를 제공하기 위해 표준화된 면역 검정 접근법은 효소 연결된 면역-검정(ELISA)에 의해 수행되었다. 그러나, MMP 및 TIMP의 혈중 수준을 측정하기 위한 다른 더 민감하고 신속한 방법이 본 실험실에 의해 수행되었으며, 이들은 다중 검정 시스템의 사용을 포함한다. 이 예에서는, 비드에 기초한 다중 샌드위치 면역 검정을 이용하여 혈장 또는 다른 생물학적 샘플과 같은 부피가 제한된 샘플중 다중 분석물을 측정할 수 있다. 다중 분석을 위한 이 신생 기법은 ELISA의 감도를 유동 세포분석 검출과 조합하여 50㎕ 미만의 단일 샘플 내에서 100개 이하의 상이한 분석물을 특이적으로 측정할 수 있도록 하는 기술의 토대 위에서 구축된다. 이 접근법은 작은 혈액 샘플중 다중 MMP 및 TIMP의 측정을 가능케 한다. 이러한 유형의 접근법은 본원에 기재되는 진단, 예상, 예측 및 치료 모니터링 용도에 잘 맞는다. 구체적으로, 분석물 농도를 동시에 측정하기 위하여, 마이크로비드를 샘플(즉, 혈액 샘플)과 함께 배양시키고 관심 있는 특정 분석물(즉, MMP)과 착체를 형성하도록 한다. 각 분석물상의 제 2 항원결정기에 특이적인 검출 항체(바이오틴일화됨)를 혼합물에 첨가하고 분석물과 착체를 형성한 마이크로비드에 결합시킨다. 이어, 혼합물을 형광 리포터 분자(스트렙트아비딘-피코에리트린)와 함께 배양시키고, 2-레이저 유동 세포 분석 검출기를 통해 전체 샘플을 통과시킨다. 하나의 레이저는 시험되는 특정 분석물을 한정하는 마이크로비드의 정확한 형광을 검출하고, 다른 하나의 레이저는 결합된 분석물의 양에 직접적으로 비례하는 리포터 형광의 양을 검출한다. 이 과정을 다수의 MMP 및 CHF 과정에 관련될 수 있는 다른 분석물에 적용하였으며, 이들은 도 17 및 표 1에 기재된다. 이는 매우 작은 혈액 샘플로 단일 또는 다중 분석물을 측정할 수 있는 방법의 일례일 뿐이다. MMP/TIMP 분석물과 관련하여 수행된 측정의 다른 예는 방사성 면역 검정 및 면역 블로팅 검정을 포함한다. 이들 접근법도 항체에 기초한다.
Figure 112009008088546-PCT00001
7. 항체
MMP 및 TIMP에 대해 특이적인 항체는 공지되어 있고 시판되고 있다. 항체의 예가 표 2에 기재된다.
MMP/TIMP 항체
분석물 카탈로그 # 판매처
MMP-1 IM52 온코젠(Oncogene)
PC311 온코젠
IM35L 온코젠
AB806 케미콘(Chemicon)
MMP-2 AB19015 케미콘
PC342 온코젠
IM33L 온코젠
MAB3308 케미콘
AB19015 케미콘
MAB13405 케미콘
AB809 케미콘
MMP-3 PC310 온코젠
AB810 케미콘
AB811 케미콘
IM36L 온코젠
MMP-7 PC492 온코젠
AB8118 케미콘
AB8117 케미콘
MMP-8 3528-100 바이오 비전(Bio Vision)
PC493 온코젠
IM38L 온코젠
MMP-9 AB19047 케미콘
IM09 온코젠
PC309 온코젠
AB804 케미콘
MMP-11 PC467 온코젠
MMP-12 AB19051 케미콘
RPI-MMP-12 트리플 포인트 바이올로직스(Triple Point Biologics)
PC494 온코젠
MMP-13 AB8114 케미콘
PC542 온코젠
3533-100 바이오 비전
AB19055 케미콘
MMP-14 AB815 케미콘
AB8102 케미콘
RDI-MMP14 리써치 다이아그노스틱스, 인코포레이티드(Res. Diagnostics, Inc.)
MAB3317 케미콘
AB8221 케미콘
AB8103 케미콘
MMP-15 AB850 케미콘
MAB3320 케미콘
AB855 케미콘
TIMP-1 OPA1-08512 ABR
AB8122 케미콘
AB770 케미콘
AB8116 케미콘
PC500 온코젠
TIMP-2 AB801 케미콘
RP2T2 트리플 포인트 바이올로직스
IM11L 온코젠
CL1T2 세다레인(CedarLane)
MAB3310 케미콘
AB8107 케미콘
TIMP-3 CL2T3 세다레인
IM43L 온코젠
H-TIMP-3 트리플 포인트 바이올로직스
TIMP-4 AB816 케미콘
MAB974 알앤드디 시스템즈(R&D Systems)
Ab19087 케미콘
용어 "항체"는 본원에서 넓은 의미로 사용되며, 다클론 및 단클론 항체 둘 다를 포함한다. 완전한 면역 글로불린 분자에 덧붙여, "항체"라는 용어에는 또한 이들이 MMP 또는 TIMP와 상호작용하는 능력 면에서 선택되기만 하면, 이들 면역 글로불린 분자의 단편 또는 중합체 및 면역 글로불린 분자 또는 이들의 단편의 인간 또는 인간화된 형태도 포함된다. 본원에 기재된 시험관내 검정을 이용하여 또는 유사한 방법에 의해 항체를 이들의 목적하는 활성에 대해 시험할 수 있으며, 그 후에는 공지의 임상 시험 방법에 따라 생체내 치료 및/또는 예방 활성을 시험한다.
본원에 사용되는 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동질인 항체 개체군으로부터 수득되는 항체를 말한다. 즉, 개체군 내의 개별적인 항체는 항체 분자의 작은 부분집합에 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 본원에서 단클론 항체는, 이들이 목적하는 길항 활성을 나타내기만 한다면, 중질 및/또는 경질 쇄의 일부가 특정 부류로부터 유도되거나 특정 항체 군 또는 아군에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 한편, 쇄(들)의 나머지 부분이 다른 부류로부터 유도되거나 다른 항체 군 또는 아군에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 동족인 "키메라" 항체 및 이들 항체의 단편을 특별히 포함한다[미국 특허 제 4,816,567 호 및 모리슨(Morrison) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) 참조].
개시된 단클론 항체는 단일 클론 항체를 생성시키는 임의의 절차를 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 개시된 단클론 항체는 콜러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein)의 문헌[Nature, 256:495 (1975)]에 기재되어 있는 것과 같은 하이브리도마 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물을 전형적으로는 면역화제로 면역화시켜 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 생성시키거나 생성시킬 수 있는 림프구를 유도한다. 다르게는, 예컨대 본원에 기재된 HIV Env-CD4-공동 수용체 착체를 사용하여 림프구를 시험관 내에서 면역화시킬 수 있다.
단클론 항체는 미국 특허 제 4,816,567 호[카빌리(Cabilly) 등]에 기재되어 있는 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 종래의 절차를 이용하여(예를 들어, 설치류 항체의 중질 및 경질 쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써), 개시된 단클론 항체를 코딩하는 DNA를 용이하게 단리하고 서열을 결정할 수 있다. 예를 들어, 버턴(Burton) 등의 미국 특허 제 5,804,440 호 및 바바스(Barbas) 등의 미국 특허 제 6,096,441 호에 기재되어 있는 파지 디스플레이 기법을 이용하여 항체 또는 활성 항체 단편의 라이브러리를 또한 생성시키고 선별할 수 있다.
일가 항체를 제조하는 데에는 시험관내 방법도 적합하다. 당해 분야에 공지되어 있는 통상적인 기법을 이용하여, 항체를 소화시켜 그의 단편, 특히 Fab 단편을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 파파인을 사용하여 소화를 수행할 수 있다. 파파인 소화의 예는 1994년 12월 22일자로 공개된 WO 94/29348 호 및 미국 특허 제 4,342,566 호에 기재되어 있다. 항체의 파파인 소화는 전형적으로 Fab 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편(이들 각각은 단일의 항원 결합 부위를 가짐) 및 나머지 Fc 단편을 생성시킨다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원과 가교결합할 수 있는 단편을 생성시킨다.
다른 서열에 부착되거나 아니거나에 관계없이 단편은 또한 특정 영역 또는 특정 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 치환 또는 다른 선택되는 변형도 포함할 수 있으나, 단 항체 또는 항체 단편의 활성은 변형되지 않은 항체 또는 항체 단편과 비교하여 상당히 변화되거나 손상되지 않아야 한다. 이들 변형은 다이설파이드 결합할 수 있는 아미노산을 제거/부가하거나, 그의 생물-수명을 증가시키거나, 그의 분비 특징을 변화시키는 등과 같은 일부 부가적인 특성을 제공할 수 있다. 임의의 경우, 항체 또는 항체 단편은 그의 동족 항원과 특이적으로 결합하는 것과 같은 생물 활성을 가져야 한다. 항체 또는 항체 단편의 기능성 또는 활성 영역은 단백질의 특정 영역의 돌연변이 발생 후 발현 및 발현된 폴리펩타이드의 시험에 의해 알아낼 수 있다. 이러한 방법은 당해 분야의 숙련자가 쉽게 아는 것이며, 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산의 부위-특이적 돌연변이 발생을 포함한다[졸러(Zoller, M. J.), Curr. Opin. Biotechnol. 3:348-354, 1992].
본원에 사용되는 용어 "항체" 또는 "항체들"은 또한 인간 항체 및/또는 인간화된 항체도 나타낼 수 있다. 다수의 비-인간 항체(예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼로부터 유래되는 것)는 인간에서 당연히 항원성이고, 따라서 인간에게 투여될 때 바람직하지 못한 면역 반응을 야기할 수 있다. 그러므로, 방법에 인간 또는 인간화된 항체를 사용하면 인간에게 투여된 항체가 바람직하지 못한 면역 반응을 유발할 기회를 감소시키는 역할을 한다.
8. 기준 값
개체에서 LVD의 존재를 나타내거나 또는 LVD 발병을 예측하는 MMP 및/또는 TIMP의 프로파일이 제공된다. 개체에서 LVD의 존재를 나타내거나 LVD 발병을 예측하는 프로파일은 정상 값과 비교될 수 있다. 소정 분석물(MMP 또는 TIMP)의 정상 값은 상당한 심혈관 질환의 증거를 갖지 않는 것으로 확인된 연령이 일치하는 개체의 기준 값일 수 있다. 그러므로, 정상 값은 상당한 수의 건강한 개별 개체로부터 유도되는 개체군-기초된 값일 수 있다. 이들 기준 정상 값은 개체군에 기초한 연구로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 기준 군에서 표 4에 개시된 기준 대조군 값과 일치하는 약 800ng/mL까지 TIMP-1의 상대적인 수준을 확인한 큰 개체군에 기초한 연구가 이루어졌다[프래밍햄(Framingham) 심장 연구, Circulation 2004; 109:2850-2856].
다르게는, 정상 값은 소정 개체에서 정상인 것으로 간주되는 값일 수 있다. 예를 들어, 건강한 개인에 있어서 관련 분석물의 기준선을 측정할 수 있고, 이 개인으로부터 후에 수득된 측정치와 비교하여 현재의 질환 또는 LVD로의 진행을 알아내기 위해 이를 사용할 수 있다.
MMP 및 TIMP 각각 뿐만 아니라 MMP-9/TIMP 비의 기준 정상 값이 표 7에 제공된다.
추가적인 기준 정상 값 및 심근 경색 후 환자에서 발생되는 값이 표 4에 요약된다. 이들 절대값이 질환 과정에 대해 중요하고 진단성인 것으로 생각되는 이들 각 분석물에서의 예측된 % 변화임이 아래에 기재된다. 하나보다 많은 MMP 또는 TIMP 측정치는 높은 특이성으로 진단하거나 또는 최적 예상 정보를 제공하는데 특히 유용하다. 예를 들어, 100%보다 높은 MMP/TIMP 비와 조합된, MMP-9에서의 100%를 넘는 증가(MMP-2 또는 MMP-7의 변화는 없음)는 최대 감도 및 특이성을 제공한다.
예컨대 MMP-13에 대한 개별 관측은 소정 분석물의 혈장 농도와 같은 연속 변수가 양분된 변수로 전환되는 것이다. 이 특별한 경우에, +/-값이 MMP-13에 부여되는데, 10ng/mL보다 높은 값은 검출가능한 값 또는 양의 값으로 생각되고, 10ng/mL 미만의 값은 음의 값으로 간주된다.
예를 들어, 개체의 조직 또는 체액중 MMP 및/또는 TIMP 수준을 측정하고 상기 수준을 기준 값과 비교함을 포함하는, 개체에서 심근 경색의 부재를 진단하거나, 또는 개체에서 심근 경색에 특이적인 유해한 심실 리모델링으로 인한 심부전 발병 위험이 증가하지 않았음을 결정하는 방법이 제공된다. 따라서, MMP-2, MMP-9, MMP-7, MMP-13, MMP-8, TIMP-1, TIMP-2 및 TIMP-4중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8가지의 정상 값은 심근 경색의 부재를 나타낸다.
일부 양태에서, 정상 범위 내의 MMP-2 혈장 수준은 심근 경색의 부재의 지표이다. 일부 양태에서, 정상 범위 내의 MMP-9 혈장 수준은 심근 경색의 부재의 지표이다. 일부 양태에서, 정상 범위 내의 MMP-8 혈장 수준은 심근 경색의 부재의 지표이다. 일부 양태에서, 정상 범위 내의 TIMP-1 혈장 수준은 심근 경색의 부재의 지표이다. 일부 양태에서, 정상 범위 내의 TIMP-2 혈장 수준은 심근 경색의 부재의 지표이다. 일부 양태에서, 정상 범위 내의 TIMP-4 혈장 수준은 심근 경색의 부재의 지표이다.
일부 양태에서, 약 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 및 1500ng/ml를 비롯하여 약 1000ng/ml와 1500ng/ml 사이의 MMP-2 혈장 수준은 심근 경색의 부재의 지표이다.
일부 양태에서, 약 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1ng/ml 미만을 비롯하여 약 20ng/ml 미만의 MMP-9 혈장 수준은 심근 경색의 부재의 지표이다.
일부 양태에서, 약 3, 2 또는 1ng/ml 미만을 비롯하여 약 3ng/ml 미만의 MMP-8 혈장 수준은 심근 경색의 부재의 지표이다.
일부 양태에서, 약 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 20 또는 10ng/ml 미만을 비롯하여 약 1000ng/ml 미만의 TIMP-1 혈장 수준은 심근 경색의 부재의 지표이다.
방법은 둘 이상의 MMP 및/또는 TIMP의 혈장 수준을 측정함을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 MMP-2, MMP-9, MMP-7, MMP-13, MMP-8, TIMP-1, TIMP-2 및 TIMP-4중 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8가지를 측정함을 포함할 수 있다. 그러므로, 방법은 MMP-2와 MMP-9, 또는 MMP-2와 MMP-7, MMP-2와 MMP-13, MMP-2와 MMP-8, MMP-2와 TIMP-1, MMP-2와 TIMP-2, MMP-2와 TIMP-4, MMP-9와 MMP-7, MMP-9와 MMP-13, MMP-9와 MMP-8, MMP-9와 TIMP-1, MMP-9와 TIMP-2, MMP-9와 TIMP-4, MMP-7과 MMP-13, MMP-7과 MMP-8, MMP-7과 TIMP-1, MMP-7과 TIMP-2, MMP-7과 TIMP-4, MMP-13과 MMP-8, MMP-13과 TIMP-1, MMP-13과 TIMP-13, MMP-13과 TIMP-4, MMP-8과 TIMP-1, MMP-8과 TIMP-2, MMP-8과 TIMP-4, TIMP-1과 TIMP-2, TIMP-1과 TIMP-4, TIMP-2와 TIMP-4를 측정함을 포함할 수 있다. 그러므로, 방법은 MMP-2, MMP-13 및 TIMP-1; MMP-2, MMP-13 및 TIMP-2; MMP-2, MMP-13 및 TIMP-4; MMP-13, TIMP-1 및 TIMP-2; MMP-13, TIMP-1 및 TIMP-4; MMP-13, TIMP-2 및 TIMP-4를 측정함을 포함할 수 있다. 그러므로, 방법은 MMP-2, MMP-13, TIMP-1 및 TIMP-2; MMP-2, MMP-13, TIMP-1 및 TIMP-4; MMP-2, MMP-13, TIMP-2 및 TIMP-4; MMP-13, TIMP-1, TIMP-2 및 TIMP-4; MMP-2, TIMP-1, TIMP-2 및 TIMP-4를 측정함을 포함할 수 있다. 그러므로, 방법은 MMP-2, MMP-13, TIMP-1, TIMP-2 및 TIMP-4를 측정함을 포함할 수 있다. 본원에는 이들 분석물의 다른 조합이 계획되고 개시된다.
방법은 하나 이상의 MMP 또는 TIMP에 대한 하나 이상의 다른 MMP 또는 TIMP의 비를 계산함을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 TIMP-1, TIMP-2 또는 TIMP-4에 대한 MMP-9의 비를 계산함을 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 양태에서, 약 15×103, 14×103, 13×103, 12×103, 11×103, 10×103, 9×103, 또는 8×103 미만을 비롯하여 약 15×103 미만의 MMP-9/TIMP-1 혈장 수준의 비는 심근 경색의 부재의 지표이다.
일부 양태에서, 약 50×104, 40×104, 30×104, 또는 20×104 미만을 비롯하여 약 50×104 미만의 MMP-9/TIMP-2 혈장 수준의 비는 심근 경색의 부재의 지표이다.
일부 양태에서, 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2 미만을 비롯하여 약 10 미만의 MMP-9/TIMP-4 혈장 수준의 비는 심근 경색의 부재의 지표이다.
9. 진단
MI 후 초기에 MMP 및/또는 TIMP의 혈장 프로파일을 수득할 수 있다. 이는 MI 후 약 72시간 이내, 가장 통상적으로는 MI에 대한 개입(혈전 용해, 혈관 형성, 스텐트 등)시로 정의된다. 이 프로파일로부터, 붕괴된 LV 심근 기질의 정도를 평가할 수 있고, 얼마나 많은 심근이 MI에 의해 영향을 받았는지에 대한 한정적이고 유일한 척도가 제공된다. 이 MMP/TIMP 측정치 세트를, 트로포닌 또는 크레아틴 키나제 수준과 같은 MI가 발생되고 있는지를 알아내기 위한 생물 마커의 현행 사용과 조합하여 이용할 수 있다. 그러나, 이들 생물 마커와는 달리, MMP/TIMP 프로파일은 얼마나 많은 심근이 MI에 의해 영향을 받았는지(즉, 손상된 심근 및 "경계" 또는 순수한 주변 심근)를 알아낸다. 본원에 기재되는 특정 MMP/TIMP 프로파일은 MI 후 발생되는 심근에서의 구조적 변화 정도에 대한 정보를 제공할 수 있고, 이들 구조적 변화가 어떻게 심실 기하학적 형태, 즉 부피에 변화를 야기하는지에 대한 예측적인 정량 평가를 제공할 수 있다. 또한, 현재의 통상적인 생물 마커 수단과 MMP/TIMP 수준을 조합함으로써, 전체 심근 손상의 정도 및 영향을 받을 수 있는 심근의 정도에 대한 진단을 유도하는 수학적 모델을 구축할 수 있다. 예를 들어, MMP/TIMP 측정치와 결합된 트로포닌 값을 사용하여, MI-후 초기에 급성 혈역학적 보상의 위험이 높은 환자를 알아내고 분류할 수 있다. 예시를 위하여, MI-후 24시간째에 정상 값의 3배인 MMP-9 수준 및 정상 값보다 2배 낮은 TIMP-4와 결합된, 정상 값의 2.5배인 트로포닌 수준을 갖는 환자는 치명적인 부정맥의 가능성 때문에 더욱 조심스러운 감독과 추가적인 투약이 보장되어야 한다. 이 예의 합리적인 설명은, MI-후 초기에 이환률 및 사망률의 중요한 요인인 치명적인 부정맥이 비가역적으로 손상된 심근의 정도 자체에 기인하여 발생하지 않으며, 그보다는 MMP/TIMP의 변화에 의해 상당 부분 설명되는 살아있는 재관류되는 심근의 급속한 리모델링의 정도에 기인하여 발생된다는 것이다.
예를 들면, 개체의 조직 또는 체액중 MMP 및/또는 TIMP 수준을 측정하고 상기 수준을 기준 값과 비교함을 포함하는, 개체에서 심근 경색을 진단하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서는, 흉통 개시로부터 약 72시간 이내에 개체로부터 조직 또는 체액을 채취한다.
일부 양태에서, 약 1000, 990, 980, 970, 960, 950, 940, 930, 920, 910, 900, 890, 880, 870, 860, 850, 840, 830, 820, 810, 800, 790, 780, 770, 760, 750, 740, 730, 720, 710, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 또는 100ng/ml 미만을 비롯하여 약 1000ng/ml 미만의 MMP-2 혈장 수준은 심근 경색의 지표이다.
일부 양태에서, 정상 값보다 높은 MMP-9 혈장 수준은 심근 경색의 지표이다. 예를 들어, 정상 평균값보다 약 100% 이상 더 높은 MMP-9의 양은 심근 경색의 지표일 수 있다. 일부 양태에서, 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100ng/ml보다 높은 값을 비롯하여 약 20ng/ml보다 높은 MMP-9 혈장 수준은 심근 경색의 지표이다.
일부 양태에서, 정상 값보다 높은 MMP-8 혈장 수준은 심근 경색의 지표이다. 예를 들어, 정상 평균값보다 약 50% 이상 더 높은 MMP-8의 양은 심근 경색의 지표일 수 있다. 일부 양태에서, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50ng/ml보다 높은 값을 비롯하여 약 3ng/ml보다 높은 MMP-8 혈장 수준은 심근 경색의 지표이다.
일부 양태에서, 정상 값보다 높은 TIMP-1 혈장 수준은 심근 경색의 지표이다. 예를 들어, 정상 평균값보다 약 50% 이상 더 높은 TIMP-1의 양은 심근 경색의 지표일 수 있다. 일부 양태에서, 약 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400 또는 1500ng/ml보다 높은 값을 비롯하여 약 1000ng/ml보다 더 높은 TIMP-1 혈장 수준은 심근 경색의 지표이다.
일부 양태에서, 정상 범위 내의 TIMP-2 혈장 수준은 심근 경색의 지표이다. 일부 양태에서, 정상 범위 내의 TIMP-4 혈장 수준은 심근 경색의 지표이다. 일부 양태에서, 정상 범위 내의 MMP-7 혈장 수준은 심근 경색의 지표이다. 일부 양태에서, 정상 범위 내의 MMP-13 혈장 수준은 심근 경색의 지표이다.
방법은 둘 이상의 MMP 및/또는 TIMP의 혈장 수준을 측정함을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 MMP-2, MMP-9, MMP-7, MMP-13, MMP-8, TIMP-1, TIMP-2 및 TIMP-4중 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8가지를 측정함을 포함할 수 있다. 따라서, 방법은 MMP-2와 MMP-9; MMP-2와 MMP-7; MMP-2와 MMP-13; MMP-2와 MMP-8; MMP-2와 TIMP-1; MMP-2와 TIMP-2; MMP-2와 TIMP-4; MMP-9와 MMP-7; MMP-9와 MMP-13; MMP-9와 MMP-8; MMP-9와 TIMP-1; MMP-9와 TIMP-2; MMP-9와 TIMP-4; MMP-7과 MMP-13; MMP-7과 MMP-8; MMP-7과 TIMP-1; MMP-7과 TIMP-2; MMP-7과 TIMP-4; MMP-13과 MMP-8; MMP-13과 TIMP-1; MMP-13과 TIMP-13; MMP-13과 TIMP-4; MMP-8과 TIMP-1, MMP-8과 TIMP-2; MMP-8과 TIMP-4; TIMP-1과 TIMP-2; TIMP-1과 TIMP-4; TIMP-2와 TIMP-4를 측정함을 포함할 수 있다. 그러므로, 방법은 MMP-2, MMP-13 및 TIMP-1; MMP-2, MMP-13 및 TIMP-2; MMP-2, MMP-13 및 TIMP-4; MMP-13, TIMP-1 및 TIMP-2; MMP-13, TIMP-1 및 TIMP-4; MMP-13, TIMP-2 및 TIMP-4를 측정함을 포함할 수 있다. 따라서, 방법은 MMP-2, MMP-13, TIMP-1 및 TIMP-2; MMP-2, MMP-13, TIMP-1 및 TIMP-4; MMP-2, MMP-13, TIMP-2 및 TIMP-4; MMP-13, TIMP-1, TIMP-2 및 TIMP-4; MMP-2, TIMP-1, TIMP-2 및 TIMP-4를 측정함을 포함할 수 있다. 그러므로, 방법은 MMP-2, MMP-13, TIMP-1, TIMP-2 및 TIMP-4를 측정함을 포함할 수 있다. 본원에서는 이들 분석물의 다른 조합이 계획되고 개시된다.
방법은 하나 이상의 MMP 또는 TIMP에 대한 하나 이상의 다른 MMP 또는 TIMP의 비를 계산함을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 방법은 TIMP-1, TIMP-2 또는 TIMP-4에 대한 MMP-9의 비를 계산함을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 정상 값보다 높은 MMP-9/TIMP-1 혈장 수준의 비는 심근 경색의 지표이다. 예를 들어, 정상 평균값보다 약 100% 이상 더 높은 MMP-9/TIMP-1의 비는 심근 경색의 지표일 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 약 15×103, 16×103, 17×103, 18×103, 19×103, 20×103, 21×103, 22×103, 23×103, 24×103, 25×103, 26×103, 27×103, 28×103, 29×103, 30×103, 31×103, 32×103, 33×103, 34×103, 35×103, 36×103, 37×103, 38×103, 39×103, 40×103, 41×103, 42×103, 43×103, 44×103, 45×103, 46×103, 47×103, 48×103, 49×103, 50×103, 55×103, 60×103, 65×103, 70×103, 75×103, 80×103, 85×103, 90×103, 95×103, 또는 100×103보다 높은 값을 비롯하여 약 15×103보다 높은 MMP-9/TIMP-1 혈장 수준의 비는 심근 경색의 지표이다.
일부 양태에서, 정상 값보다 높은 MMP-9/TIMP-2 혈장 수준의 비는 심근 경색의 지표이다. 예를 들어, 정상 평균값보다 약 100% 이상 더 높은 MMP-9/TIMP-2의 비는 심근 경색의 지표일 수 있다. 일부 양태에서, 약 50×104, 51×104, 52×104, 53×104, 54×104, 55×104, 56×104, 57×104, 58×104, 59×104, 60×104, 65×104, 70×104, 75×104, 80×104, 85×104, 90×104, 95×104, 100×104, 105×104, 110×104, 115×104, 120×104, 125×104, 130×104, 135×104, 140×104, 또는 150×104보다 높은 값을 비롯하여 약 50×104보다 높은 MMP-9/TIMP-2 혈장 수준의 비는 심근 경색의 지표이다.
일부 양태에서, 정상 값보다 높은 MMP-9/TIMP-4 혈장 수준의 비는 심근 경색의 지표이다. 예를 들어, 정상 평균값보다 약 100% 이상 더 높은 MMP-9/TIMP-4의 비는 심근 경색의 지표일 수 있다. 일부 양태에서, 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100보다 높은 값을 비롯하여 약 10보다 높은 MMP-9/TIMP-4 혈장 수준의 비는 심근 경색의 지표이다.
일부 양태에서, 약 15×103보다 높은 MMP-9/TIMP-1 혈장 수준의 비, 약 50×104보다 높은 MMP-9/TIMP-2 혈장 수준의 비 및 약 10보다 높은 MMP-9/TIMP-4 혈장 수준의 비는 심근 경색의 지표이다.
일부 양태에서, 약 1000ng/ml 미만의 MMP-2 혈장 수준, 약 3ng/ml보다 높은 MMP-8 혈장 수준, 약 15×103보다 높은 MMP-9/TIMP-1 혈장 수준의 비, 약 50×104보다 높은 MMP-9/TIMP-2 혈장 수준의 비 및 약 10보다 높은 MMP-9/TIMP-4 혈장 수준의 비는 심근 경색의 지표이다.
10. 예상
수일간에 걸친 MI-후 초기 기간, 바람직하게는 1일째 내지 7일째 동안의 어느 기간에 MMP/TIMP 프로파일을 측정할 수 있다. 이는 매우 통상적인 추적 조사 기간이고, 따라서 MI-후 5 내지 7일째의 기간을 아래 보고되는 타당성 조사에 이용하였다. 그러나, 본원의 다른 부분에 표시되는 바와 같이, 급성 질병의 경과 또는 회복 기간 전체에 걸쳐 유용한 예상 및 진단 정보를 수득할 수 있다. 특정 MMP/TIMP 프로파일의 변화를 이용하여, 후속하는 수개월/수년에 걸쳐 심각한 유해한 LV 리모델링 및 확장의 위험이 증가된 환자를 알아낼 수 있다. 실시예에서 표시되는 바와 같이, 다수의 데이터를 수득하여 MMP/TIMP 프로파일의 예상값을 뒷받침하였다. 예를 들면, 환자에서 MI-후 7일간의 기간동안의 어느 시점에서 MMP-9, MMP-8, TIMP-1 및 TIMP-4 수준을 측정하여 특이적인 일시적 패턴을 나타내었다. 이 일시적 패턴을 이용하여 MI-후 약 1개월째에 발생되는 LV 확장의 정도를 예측할 수 있다. 이어, 이 예상 정보를 이용하여, 추가적인 영상 연구, MMP/TIMP 프로파일 및 더욱 공격적인 투약 계획의 첨가를 통해 위험이 증가된 환자를 보다 공격적으로 추적 조사할 수 있다.
예를 들어, 개체의 조직 또는 체액중 MMP 및/또는 TIMP 수준을 측정하고 상기 수준을 기준 값과 비교함을 포함하는, 심근 경색에 특이적인 유해한 심실 리모델링으로 인해 심부전이 발병할 위험이 증가된 개체를 알아내는 방법이 제공된다.
일부 양태에서, 1000, 990, 980, 970, 960, 950, 940, 930, 920, 910, 900, 890, 880, 870, 860, 850, 840, 830, 820, 810, 800, 790, 780, 770, 760, 750, 740, 730, 720, 710, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 또는 100ng/ml 미만을 비롯하여 약 1000ng/ml 미만의 MMP-2 혈장 수준은 심부전 발병 위험 증가의 지표이다.
일부 양태에서, 정상 값보다 높은 MMP-9 혈장 수준은 심부전 발병 위험 증가의 지표이다. 예를 들어, 정상 평균값보다 약 100% 이상 더 높은 MMP-9의 양은 심부전 발병 위험 증가의 지표일 수 있다. 일부 양태에서, 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100ng/ml보다 높은 값을 비롯하여 약 20ng/ml보다 높은 MMP-9 혈장 수준은 심부전 발병 위험 증가의 지표이다.
일부 양태에서, 정상 값보다 높은 TIMP-1 혈장 수준은 심부전 발병 위험 증가의 지표이다. 예를 들어, 정상 평균값보다 약 50% 이상 더 높은 TIMP-1의 양은 심부전 발병 위험 증가의 지표일 수 있다. 일부 양태에서, 약 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100ng/ml보다 높은 값을 비롯하여 약 50ng/ml보다 높은 TIMP-1 혈장 수준은 심부전 발병 위험 증가의 지표이다.
일부 양태에서, 정상 범위 내의 TIMP-2 혈장 수준은 심부전 발병 위험 증가의 지표이다. 일부 양태에서, 정상 범위 내의 TIMP-4 혈장 수준은 심부전 발병 위험 증가의 지표이다. 일부 양태에서, 약 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400 또는 1500ng/ml보다 높은 값을 비롯하여 약 1000ng/ml보다 높은 TIMP-2 혈장 수준은 심부전 발병 위험 증가의 지표일 수 있다.
일부 양태에서, 정상 범위 내의 MMP-7 혈장 수준은 심부전 발병 위험 증가의 지표이다. 일부 양태에서, 정상 범위 내의 MMP-8 혈장 수준은 심부전 발병 위험 증가의 지표이다. 일부 양태에서, 정상 범위 내의 MMP-13 혈장 수준은 심부전 발병 위험 증가의 지표이다. 일부 양태에서, TIMP-4 혈장 수준은 정상 범위 내에 있다.
방법은 둘 이상의 MMP 및/또는 TIMP의 혈장 수준을 측정함을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 MMP-2, MMP-9, MMP-7, MMP-13, MMP-8, TIMP-1, TIMP-2 및 TIMP-4중 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8가지를 측정함을 포함할 수 있다. 그러므로, 방법은 MMP-2와 MMP-9, MMP-2와 MMP-7, MMP-2와 MMP-13, MMP-2와 MMP-8, MMP-2와 TIMP-1, MMP-2와 TIMP-2, MMP-2와 TIMP-4, MMP-9와 MMP-7, MMP-9와 MMP-13, MMP-9와 MMP-8, MMP-9와 TIMP-1, MMP-9와 TIMP-2, MMP-9와 TIMP-4, MMP-7과 MMP-13, MMP-7과 MMP-8, MMP-7과 TIMP-1, MMP-7과 TIMP-2, MMP-7과 TIMP-4, MMP-13과 MMP-8, MMP-13과 TIMP-1, MMP-13과 TIMP-13, MMP-13과 TIMP-4, MMP-8과 TIMP-1, MMP-8과 TIMP-2, MMP-8과 TIMP-4, TIMP-1과 TIMP-2, TIMP-1과 TIMP-4, TIMP-2와 TIMP-4를 측정함을 포함할 수 있다. 그러므로, 방법은 MMP-2, MMP-13 및 TIMP-1; MMP-2, MMP-13 및 TIMP-2; MMP-2, MMP-13 및 TIMP-4; MMP-13, TIMP-1 및 TIMP-2; MMP-13, TIMP-1 및 TIMP-4; MMP-13, TIMP-2 및 TIMP-4를 측정함을 포함할 수 있다. 따라서, 방법은 MMP-2, MMP-13, TIMP-1 및 TIMP-2; MMP-2, MMP-13, TIMP-1 및 TIMP-4; MMP-2, MMP-13, TIMP-2 및 TIMP-4; MMP-13, TIMP-1, TIMP-2 및 TIMP-4; MMP-2, TIMP-1, TIMP-2 및 TIMP-4를 측정함을 포함할 수 있다. 그러므로, 방법은 MMP-2, MMP-13, TIMP-1, TIMP-2 및 TIMP-4를 측정함을 포함할 수 있다. 본원에서는 이들 분석물의 다른 조합도 계획되고 개시된다.
방법은 하나 이상의 MMP 또는 TIMP에 대한 하나 이상의 다른 MMP 또는 TIMP의 비를 계산함을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 TIMP-1, TIMP-2 또는 TIMP-4에 대한 MMP-9의 비를 계산함을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 약 15×103, 16×103, 17×103, 18×103, 19×103, 20×103, 21×103, 22×103, 23×103, 24×103, 25×103, 26×103, 27×103, 28×103, 29×103, 30×103, 31×103, 32×103, 33×103, 34×103, 35×103, 36×103, 37×103, 38×103, 39×103, 40×103, 41×103, 42×103, 43×103, 44×103, 45×103, 46×103, 47×103, 48×103, 49×103, 50×103, 55×103, 60×103, 65×103, 70×103, 75×103, 80×103, 85×103, 90×103, 95×103, 또는 100×103보다 높은 값을 비롯하여 약 15보다 높은 MMP-9/TIMP-1 혈장 수준의 비는 심부전 발병 위험 증가의 지표이다.
일부 양태에서, 정상 값보다 높은 MMP-9/TIMP-2 혈장 수준의 비는 심부전 발병 위험 증가의 지표이다. 예를 들어, 정상 평균값보다 약 100% 이상 더 높은 MMP-9/TIMP-2의 비는 심부전 발병 위험 증가의 지표일 수 있다. 일부 양태에서, 약 50×104, 51×104, 52×104, 53×104, 54×104, 55×104, 56×104, 57×104, 58×104, 59×104, 60×104, 65×104, 70×104, 75×104, 80×104, 85×104, 90×104, 95×104, 100×104, 105×104, 110×104, 115×104, 120×104, 125×104, 130×104, 135×104, 140×104, 또는 150×104보다 높은 값을 비롯하여 약 500보다 높은 MMP-9/TIMP-2 혈장 수준의 비는 심부전 발병 위험 증가의 지표이다.
일부 양태에서, 정상 값보다 높은 MMP-9/TIMP-4 혈장 수준의 비는 심부전 발병 위험 증가의 지표이다. 예를 들어, 정상 평균값보다 약 100% 이상 더 높은 MMP-9/TIMP-4의 비는 심부전 발병 위험 증가의 지표일 수 있다. 일부 양태에서, 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100보다 높은 값을 비롯하여 약 10보다 높은 MMP-9/TIMP-4 혈장 수준의 비는 심부전 발병 위험 증가의 지표이다.
일부 양태에서, 정상 값보다 높은 MMP-9/TIMP-1 혈장 수준의 비는 심부전 발병 위험 증가의 지표이다. 예를 들어, 정상 평균값보다 약 100% 이상 더 높은 MMP-9/TIMP-1의 비는 심부전 발병 위험 증가의 지표일 수 있다. 일부 양태에서, 약 15×103보다 높은 MMP-9/TIMP-1 혈장 수준의 비, 약 50×104보다 높은 MMP-9/TIMP-2 혈장 수준의 비 및 약 10보다 높은 MMP-9/TIMP-4 혈장 수준의 비는 심부전 발병 위험 증가의 지표이다.
일부 양태에서, 약 1000ng/ml 미만의 MMP-2 혈장 수준, 약 3ng/ml보다 높은 MMP-8 혈장 수준, 약 15×103보다 높은 MMP-9/TIMP-1 혈장 수준의 비, 약 50×104보다 높은 MMP-9/TIMP-2 혈장 수준의 비 및 약 10보다 높은 MMP-9/TIMP-4 혈장 수준의 비는 심부전 발병 위험 증가의 지표이다.
11. 치료 개입 유도
급성 MI 기간 후, LV 심근 리모델링에 대한 생물 마커로서 MMP/TIMP 프로파일의 감독을 이용할 수 있다. 이와 관련하여, 약리학적 효능의 판독치로서 MMP/TIMP 프로파일을 모니터링할 수 있다. 본원과 관련하여 구축될 수 있는 다수의 임상 예가 존재하지만, 예시적인 예가 여기에 제공된다. 현행 미심장학회(American Heart Association)/미국 심장학회(American College of Cardiology) 지침에서는, MI-후 환자에 대해 현행 약물 치료(스타틴, 안지오텐신 전환 효소 저해제, 베타 차단제 및 혈소판 길항제)를 수행해야 한다고 명확히 언급하고 있다. 이러한 약물 치료가 주장되고 있기는 하지만, 특정 환자에 대해 최적 효능을 제공하는 구체적인 투여량은 알려져 있지 않다. 뿐만 아니라, 이들 약물 치료중 몇 가지는 투여량을 증가시킬 때(상향-적정) 바람직하지 못한 부작용(저혈압, 성기능상의 부작용 등)을 증대시킬 수 있다. 따라서, MI-후 환자에서 발생되는 심근 리모델링의 정도의 지표를 제공하는 생물 마커의 신뢰할만한 세트의 사용은, 합리적인 투여 계획을 개발하는 방법을 제공한다. 치료 표적은 MI-후 기간동안 MMP 및 TIMP 수준을 정규화시키고, 이들 MMP/TIMP 수준을 연속적으로 모니터링하고 정상적인 MMP/TIMP 수준을 유지하는데 필요한 만큼 투약을 조정하는 것이다. 스타틴 및 안지오텐신 전환 효소 저해제와 같은 약물 치료가 심혈관계 내의 MMP/TIMP 수준에 영향을 끼칠 수 있음을 입증한 강력한 연구 세트가 있다. 그러므로, 현행 약물 치료가 MMP/TIMP 수준에 영향을 끼칠 수 있다는 사실과 함께 실시예 1, 2, 3 및 4에서 보여지는 데이터는 MI-후 기간에 치료 효능을 유도하는 수단으로서 MMP/TIMP 프로파일링을 이용하는 토대를 제공한다.
12. 조합
본원에 개시된 방법은 심부전의 다른 마커를 검출함을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법은 개체의 조직 또는 체액중 NT-proBNP 수준을 측정하고 상기 수준을 기준 값과 비교함을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 개시된 방법은 개체의 조직 또는 체액중 트로포닌-I 수준을 측정하고 상기 수준을 기준 값과 비교함을 추가로 포함할 수 있다.
13. 측정 시점 결정
시점 결정에는 2단계가 있다. 첫번째는, 근본 질환 과정의 존재를 포함시키거나 제외하고, 예상 정보를 제공하는 것이다. 두번째는, 선별을 위해 혈장 프로파일링을 이용하고 심부전 발병 위험이 있을 수 있는 환자를 알아내는 것이다. 아래 기재되고 진단, 예상 및 치료 모니터링을 위해 설명되는 바와 같이, 측정 시점은 각각의 경우에 특이적이다. 진단의 경우, 최초 측정 시점은 MI 개시 후 첫 72시간 내이다. 이는 환자가 MI의 징후 및 증상(흉통 등)을 경험하는 시간으로서 정의되며, 이들 증상은 MI를 표시하는 ECG에 의해 확인된다. 이어, 의사는 혈액 시험을 적용시켜 MMP/TIMP 프로파일의 이상 정도 및 MI의 결과로서 이루어지고 있는 심근 리모델링의 정도를 결정한다. 이에 따라 의사는 추가적인 진단 시험 및 치료 계획을 추진하게 된다. 혈액 샘플링 시점의 다른 예는 환자가 급성 MI에 대해 성공적으로 치료되었지만 의사가 추후 의료/개입 관리를 추진하기 위해 예상 정보를 수득하고자 할 때이다. 이 경우, MI-후 초기 기간동안(7일까지) MMP/TIMP 프로파일의 연속적인 모니터링을 LV 리모델링(이는 실시예 1에서 LV 확장으로서 정의됨)의 진행에 대한 예측 도구로서 사용할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 시험을 위한 혈액 샘플링 시점은 경우에 따라 달라진다. 이들 시험을 진단 도구로서 1회만 적용할 수 있거나, 또는 임의의 소정 환자에서 다수회 연속적으로 적용할 수 있다.
심근 경색과 관련하여, 심근 경색이 확인된 순간부터 72시간 내에 혈장 프로파일링을 개시할 수 있다. 혈장 프로파일링은 입원 기간동안(2 내지 7일간) 및 통상적으로 예정되는 추후 외래 진료시에 지속될 수 있다. 이는 MMP-9, MMP/TIMP 비에 대한 일시적인 맵(map)을 제공하고 더 높은 MMP 및 MMP/TIMP 수준을 갖는 환자를 밝혀낸다. 이들 환자는 심부전 진행시에 유해한 심실 리모델링의 위험이 증가된 것으로 생각된다. 이들 측정은 심근 경색이 발생한 후 처음 2년동안 매 분기마다 이루어질 수 있으나, 2 내지 96개월동안 매일, 매주 또는 매달 측정하는 것도 고려된다. 심근 경색(관상동맥 증후군) 후 심부전의 위험이 높은 환자를 추적하고 알아내는데 이용되는 가능한 연산의 개요가 도 16에 도시된다.
환자가 문턱 MMP, MMP-TIMP 수준을 갖는 것으로 밝혀지면, 더욱 공격적인 통상의 의료 요법이 개시될 수 있다. 이는 베타 아드레날린 작용제의 상향 적정, 안지오텐신 저해(전환 효소 및 수용체 저해), 스타틴 요법, 추가적인 혈관 재생 개입(카테터 및 외과 수술에 기초함)을 포함할 수 있다. 이어, MMP 및 MMP/TIMP 비를 1개월 기준으로 측정하고, 의료/개입 전략의 효율을 측정하는데 이용한다.
그러므로, MMP 양 및 MMP/TIMP 비를 모니터링하고, 이들 측정치 및 비에 기초하여 심부전의 위험이 있는 환자를 알아내고, 환자에게 적절한 약물 또는 적절한 약물[베타 아드레날린 작용제, 안지오텐신 저해(전환 효소 및 수용체 저해), 스타틴]의 더 높은 투여량, 또는 추가적인 혈관 재생 개입(카테터 및 외과 수술에 기초함)을 제공함을 포함하는, 개선된 심질환자 케어(care) 방법이 제공된다.
심근 경색, 심혈관 흉통 또는 다른 관상동맥 질환의 병력을 갖는 환자는 최초 케어 또는 의료 선별 대결 동안 수행된 혈장 프로파일을 가질 수 있다. MMP/TIMP 수준이 표 4에 밝혀진 것을 충족하거나 그를 초과하는 경우, 이들 환자는 더욱 공격적으로 평가될 수 있고 추가적인 추적 조사가 개시될 수 있다.
ECG 기준에 의해 MI가 확인된 후 ER/흉통 병원에 입원할 때 첫번째 샘플을 취할 수 있다. 이 시점에 MMP/TIMP 프로파일을 측정할 수 있다. 이 첫번째 측정 후 72시간 내에 두번째 MMP/TIMP 프로파일을 측정할 수 있다. 그러나, MMP/TIMP 프로파일의 일시적인 신빙성을 개선하기 위하여 1차 측정과 2차 측정 사이에 간헐적인 샘플링(8 내지 12시간 간격)을 수행할 수도 있다. 환자가 퇴원을 준비할 때, MMP/TIMP 프로파일에서의 변화의 상대적인 크기를 본원에 기재된 연산에 적용시킬 수 있다. 이는 유해한 LV 리모델링 및 심부전 발병 위험을 갖는 환자를 위험에 따라 분류할 수 있다. MMP/TIMP 프로파일에서의 변화가 보다 큰 환자는 더욱 공격적인 약물 치료 전략을 받을 수 있고 더 자주 병원에 내원할 수 있다. 병원 내원 전략은 아래에 기재된다.
환자가 MMP/TIMP 프로파일에서 상당한 변화를 갖는 것으로 진단되면, 이들 프로파일을 "정상화시키"고자 MMP/TIMP 프로파일이 측정되는 한달 간격의 반복적인 내원 및 투약 조정이 이루어질 수 있다. 이들 값이 정상화되면, 환자는 분기 간격으로 측정될 수 있다.
MMP/TIMP 프로파일 변화가 적은 것으로 진단된 환자는 2년마다 한번씩 반복적으로 측정을 받을 수 있다. 이들 프로파일이 상향 변화되면, 증가된 투약 및 샘플링 빈도와 관련하여 상기 기재된 전략이 진행될 수 있다.
MMP/TIMP 프로파일이 지표가 되는 사건 발생시(MI의 신속한 치료를 위한 입원)에 처음으로 측정되지 않은 과거 MI 병력을 갖는 환자도 이 진단 접근법에 포함될 수 있다. 이 경우, 과거 MI의 병력을 갖는, 유해한 LV 리모델링의 위험이 높은 환자는 최초 병원 내원시 샘플링할 수 있다. MMP/TIMP 프로파일을 정상 기준 범위와 비교하고, 유해한 LV 리모델링의 위험을 나타내는 높은 MMP/TIMP 프로파일의 경우에는 앞 부분에 기재된 바와 같은 공격적인 치료가 고려될 수 있다.
C. 키트
본원에 개시된 방법을 실행하는데 사용될 수 있는 시약을 갖는 키트가 본원에 개시된다. 키트는 본원에서 논의되거나 또는 개시된 방법을 실행하는데 필요하거나 유리한 것으로 생각되는 임의의 시약 또는 시약의 조합을 포함할 수 있다. 앞 부분에 기재된 바와 같이, MMP/TIMP 키트의 성분은 관심 있는 MMP 및/또는 TIMP와 착체를 형성시키는데 필요한 시약 내지 검출 시약을 포함한다. 면역 검정 접근법의 예에서는, 특정 MMP 또는 TIMP에 대해 형광 라벨링된 항체를 혈액 샘플과 함께 배양하고, 세척 및 비-특이적 결합 제거 단계를 거친 후, 상대적인 형광 정도를 측정함으로써 관심 있는 MMP 또는 TIMP에 결합된 항체의 양을 계산한다. 이는 선별에 사용될 수 있는 매우 간단한 키트, 또는 단일 샘플로부터 다중 MMP/TIPM를 측정하는 더욱 복잡한 시스템일 수 있다. 관심 있는 하나의 MMP 또는 TIMP의 측정을 다중 MMP/TIMP의 동시 측정에 등급별로 접근시킴에 있어서의 이론적 설명은 이전 부분에 기재된 바 있다. 선별 검정(즉, MMP-9)의 경우, 작은 혈액 샘플을 처리하여 혈장(원심분리)을 준비하고, 혈장을 MMP-9 표적화된 항체와 혼합한다. 혼합물을 다시 원심분리하고, MMP-9에 특이적으로 결합된 항체를 형광 분석 시스템에 의해 판독한다. 이 설비 및 측정 시스템은 작은 수트케이스 또는 탁상 시스템으로 용이하게 맞춰질 수 있다. 시스템으로부터의 판독치는 MMP-9가 특정 문턱 측정치(본원에서 한정됨) 미만인지 그보다 높은지의 여부를 나타낸다.
D. 실시예
하기 실시예는 당해 분야의 숙련자에게 본원에 청구되는 화합물, 조성물, 제품, 장치 및/또는 방법이 만들어지고 평가되는 방법에 대한 완벽한 개시 및 설명을 제공하기 위하여 기재되며, 순수하게 본 발명을 예시하고자 할 뿐, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 영역을 한정하고자 하지 않는다. 수치(예컨대, 양, 온도 등)와 관련하여 정확도를 보장하고자 노력하였으나, 약간의 오차 및 편차는 고 려되어야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 온도는 ℃ 단위이거나 또는 주위 온도이고, 압력은 대기압이거나 대기압 부근이다.
1. 실시예 1: 심근 경색 후 환자에서 기질 메탈로프로테이나제 방출의 특이적인 일시적 프로파일: 좌심실 리모델링과의 관계
결론: MMP-9 및 MMP-8의 초기 강력한 상승, TIMP-2의 말기 증가 및 심장 특이적 TIMP-4의 한결같은 하락을 포함하는 MMP/TIMP의 특이적인 일시적 패턴이 MI-후 환자에서 발생하였다. 이들 독특한 발견은 예상 및 진단상 유의성을 갖는 특정 MMP/TIMP 혈장 프로파일이 MI-후에 일어남을 보여준다.
방법
개체: 심근 경색(MI)이 확인된 환자 32명 및 기준 대조군 개체 53명을 고지에 입각한 동의를 수득한 후 이 연구에 참여시켰다. 심전도검사 및 양의 심장 효소 패널에 의해 MI를 확인하였다. MI 개체로서의 참여 기준은 응급실에 도착한지 48시간 내에 기록된 실험실 기준값보다 2.5배 더 높은 트로포닌-I 값이었다. 1) MI의 과거 병력, 2) 과거 24개월 내에 이루어진 이전 관상동맥 혈관 재생 수술, 3) 응급 관상동맥 혈관 재생 요구 예상, 4) 허혈성 심질환 외의 심질환 상태(예컨대, 유전분증, 유육종증, HIV, 유전성 비대형 폐색 심근병증, 판막성 심질환), 5) 과거 3년내에 활성 악성 종양의 병력, 6) 심각한 신장 또는 폐 기능부전, 7) 상당한 소염제, 스테로이드 또는 면역 억제제를 필요로 하는 진행중이거나 활성인 류마티즘성 질환, 8) 약물 남용의 상당한 병력이 있는 경우에는 환자를 참여로부터 배제시켰다. 후속 단락에 기재되는 연구의 시점은 응급실에 최초로 도착한 시점으로서 정의되는 지표가 되는 사건에 기초하였다. 본 연구를 위해, MI-후 1일째에 최초 측정 세트를 밝혀내었다. 본 연구의 경우, 2001년 가을부터 2002년 봄까지 참여가 개방되었다. 증상 개시에 대한 치료 개입의 평균 시간은 3.5±0.9시간이었고, 최초 연구 시점은 71±8시간이었으며, 중간값 시간은 50시간이었다. 이 MI-후 환자 무리에서, 33%는 혈전 용해 요법을 받았고, 89%는 경피적 관상동맥 개입(스텐트를 사용하거나 사용하지 않은 혈관 성형술)을 받았다. MI의 분포는 심전도검사에 의해 결정하였을 때 전부 36%, 하부 61%, 후부 3%였다. ST 구획 상승은 MI 환자의 84%에서 관찰되었고, Q파는 MI 환자의 48%에서 관찰되었다. 피크 트로포닌 수준은 166±30ng/mL였다. 입원시 평균 백혈구 계수는 10.7±0.72×103개 세포/mm3으로 약간 상승하였다.
기준 대조군은 심혈관 질환의 증거가 없는 개체로 이루어졌다. 완전한 의료 기록, 광범위한 신체적 시험, 심전도 및 심초음파를 수행함으로써 심혈관 질환을 배제하였다. 기준 대조군 및 MI 개체의 환자 인구통계 및 투약 프로파일이 표 3에 기재된다. MI 환자의 경우, 투약 프로파일은 MI-후 1일째에 실시하여 연구 기간 전체 동안 지속된 것이다. MI 환자의 투약 프로파일은 담당 의사에 의해 결정되었으며, 미심장학회/미국 심장학회 지침에 따랐다. 대조군 개체의 경우, 베타 길항제, ACE 저해제 및 안지오텐신 수용체 길항제를 사용하여 수축기 혈압의 온화한 증가를 처치하였으나, 심초음파 연구에 기초하여 비대의 증거는 없었다. 디기탈리스를 한 환자에게 제공하여 심방세동의 단독 삽화의 희미한 병력을 치료하였다. 관 절통의 통상적인 의료 관리의 일부로서 아스프린 또는 소염제를 기준 대조군에 사용하였다.
정상 대조군 개체 및 심근 경색 후 환자의 인구통계
대조군 MI p값
수 53 32 ---
남성 20(38%) 24(75%) ---
여성 33(62%) 8(25%) ---
연령(세) 59±1 58±2 p=0.65
체표면적(m2) 1.87±0.03 1.99±0.04 p=0.07
투약 프로파일(환자 샘플중 %)
ACE-I 9 72 ---
BB 9 90 ---
이뇨제 15 31 ---
스타틴 17 78 ---
ASA 23 97 ---
알파 차단제 0 6 ---
CCB 0 25 ---
디기탈리스 1 3 ---
ARB 11 3 ---
혈관 확장제 0 16 ---
소염제 11 16 ---
ACE-I=안지오텐신 전환 효소 저해제, BB=베타-차단제, ASA=아스피린, CCB=칼슘 채널 차단제, ARB=안지오텐신 II 수용체 길항제, MI-후=정상적이거나 전형적인 ECG 변화의 2.5배보다 높은 크레아틴 키나제 또는 트로포닌 I를 갖는 환자, 대조군=심근 경색 또는 심혈관 질환의 증거가 없는 환자
절차: MI 환자의 경우, 연구 참여시("MI-후 1일째")에 연구를 수행하였다. 최초 연구는 완전한 의료 기록, 광범위한 신체적 조사, 12-도선 심전도, 심초음파, 및 MMP 및 TIMP 프로파일 측정을 위한 혈장 채취를 포함하였다. 말초 정맥으로부터 혈액을 채집하고, 원심분리에 의해 혈장을 채집하였다. MI-후 2 내지 6일째 및 MI-후 28, 90 및 180일째에 MMP 및 TIMP 프로파일을 측정하기 위하여 혈장을 사용하였다. MI-후 5, 28, 90 및 180일째에는 심초음파도 수득하였다. 각각의 연구 전에는 환자를 모두 하룻밤동안 절식시켰으나 이들의 아침 투약은 처방된 대로 주었다. 대조군 개체의 경우, MI-후 1일째의 MI-후 환자의 경우와 동일하게 전체 연구를 수행하였다.
MMP 및 TIMP 프로파일: 이 연구에서는, 상이한 MMP 부류로부터 대표적인 MMP를 측정하였다. 구체적으로는, 마트릴리신 아군으로부터의 간질 콜라게나제 MMP-8, 젤라티나제; MMP-2 및 MMP-9) 및 MMP-7[스피네일(Spinale FG), 2002; 워스너(Woessner FJ), 1998; 구나싱(Gunasinghe SK) 등, 2001]. 이들 MMP 유형을 선택하는 이론적 설명은 이들이 동물 연구에서 MI-후 변화되었고 급성 손상 후 기질 리모델링에 연관되었다는 것이다[피터슨(Peterson JT)등, 2001; 크리머스(Creemers EE) 등, 2002; 더참(Ducharme A) 등, 2000; 머커지(Mukherjee R) 등, 2003; 윌슨(Wilson EM) 등, 2003; 슐츠(Schulze CJ), 2003]. MMP, TIMP-1 및 TIMP-2의 조직 저해제가 환자의 혈장에서 성공적으로 확인되었고 MI의 동물 모델에서 변화된 것으로 밝혀졌기 때문에 이 연구에서는 이들을 측정하였다[머커지 등, 2003; 윌슨 등, 2003; 브래드햄(Bradham WS) 등, 2002; 조프스(Joffs C)등, 2001; 윌슨 등, 2002]. 모든 측정 접근법은 이전에 기재된 방법을 이용하는 2-부위 효소-연결된 면역 흡착 검정[ELISA; 애머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech), 영국 버킹엄셔]을 이용하였다(브래드햄 등, 2002; 조프스 등, 2001; 윌슨 등, 2002). 간단하게, 개체를 반듯이 누운 상태로 20분간 유지시킨 후 혈액을 채취하였다. 샘플을 즉시 원심분리하고 혈장 층을 제거하였다. 분리된 혈장을 3개의 동일한 분취량으로 분할하고 -80℃에서 동결시켰다. 샘플을 해동시키지 않고 재동결시켰다. 관심 있는 MMP 또는 TIMP에 대한 항체를 함유하는 미리 코팅된 웰에 혈장 및 개별적인 MMP 기준물을 첨가하고 세척하였다. 생성된 반응을 450nm의 파장에서 판독하였다[랩시스템즈 멀티스캔(Labsystems Multiskan) MCC/340, 핀란드 헬싱키]. MMP-2 검정(애머샴, RPN 2617)은 MMP-2의 대용형 및 TIMP-2와 착체를 형성된 상기 대용형을 검출한다. MMP-9 검정(애머샴, RPN 2614)은 효소의 대용형 및 TIMP-1과 착체를 형성한 상기 대용형을 검출한다. MMP-8 검정 시스템(애머샴, RPN2619)은 대용형 및 활성 형태를 검출한다. MMP-7 검정(알앤드디 시스템즈; DMP700)은 대용형 및 활성 형태를 검출한다. TIMP-1 검정(애머샴, RPN 2611)은 유리 TIMP-1 및 MMP와 착체를 형성한 상기 TIMP-1을 검출한다. TIMP-2 검정(애머샴, RPN 2618)은 유리 TIMP-2 및 활성 MMP와 착체를 형성한 상기 TIMP-2를 검출한다. 0.016 내지 1ng/mL의 검출 범위를 갖는 고감도 검정 시스템이 있었다. 모든 샘플을 2회씩 분석하였고 평균을 구하였다. 이들 측정치의 검정내(intra-assay) 변이 계수는 6% 미만이었다. 과거 연구는 TIMP-4가 심혈관계, 특히 심근 내에서 유일하게 고도로 발현된다고 보고하였다[리(Li YY) 등, 1999; 그린(Greene J) 등, 1996]. 뿐만 아니라, 과거 연구는 이 특정 TIMP가 MI의 동물 모델에서 변화된다고 보고하였다[머커지 등, 2003; 윌슨 등, 2003; 야브로(Yarbrough WM) 등, 2003]. 본 실험실은 면역 검정 접근법을 통해 TIMP-4를 측정할 수 있다고 이미 보고한 바 있다[스트로드(Stroud RE) 등, 2005]. 따라서, 높은 특이성(다른 TIMP 또는 프로테아제와의 교차 반응성 없음)을 갖는 고감도(0.008ng/mL) ELISA를 이용하였다(알앤드디 시스템즈, 미네소타주). 이 검정은 넓은 범위의 TIMP-4 기준물(0.003 내지 0.018ng/mL)에 걸쳐 높은 직선성으로 유리 TIMP-4 및 결합된 TIMP-4 둘 다를 측정하였다. 본 실험실에 의해 이미 기재된 정량적인 면역 검정을 이용하여 이 ELISA를 교차-보정하고 유효화시켰다(스트로드 등, 2005). 정량적인 ELISA를 통해 MMP-2 및 MMP-9를 측정함에 덧붙여, 젤라틴 자이모그래피를 통해 반정량적인 측정을 수행하였다[피터슨(Peterson, JT) 등, 2001; 머커지 등, 2003; 윌슨 등, 2003; 스피네일 등, 2000].
심초음파 방법: S-4 MHz 변환기를 갖는 소노스(Sonos) 5500 시스템을 사용하여 흉강을 통한 심초음파를 수행하였다. 미국 심초음파 학회 기준[쉴러(Schiller NB) 등, 1989]을 이용하여 측정하였다. LV 부피 및 박출 계수의 측정치를 수득하기 위하여 표준 단축 촬영 및 흉골 주위 장축 촬영을 이용하여 2차원 심초음파 연구를 수행하였다. 디스크 방법(쉴러 등, 19)을 이용하여 LV 이완기말 부피 및 수축기말 부피를 계산하였다. 매 측정에 3회 박동의 평균을 사용하였다. 승모판 역류 정도를 시험 및 정량하기 위하여, 승모판의 도플러 및 색상 심초음파 연구를 수행하였다. 영상을 코딩하고 블라인드(blinded) 방식으로 판독하였으며, 연구가 종결될 때까지 이 분석을 MMP/TIMP 수준과 연결시키지 않았다.
데이터 분석: 심초음파로부터 유도된 측정치 및 MMP와 TIMP의 혈장 측정치의 분포를 편포도 및 첨도 시험에 기초하여 정상에 대하여 시험하였다. 이 평가는 데이터가 정상 분포에 따르는 것으로 나타날 수 있고 따라서 모수적 통계방법을 이용하였음을 나타내었다. 따라서, 본 연구에 제공된 MMP/TIMP 데이터는 모두 변형되지 않은 방식으로 제공되었다. 양측(2-tailed) 스튜던트(Student) t 시험을 이용하여 기준 대조군 샘플과 MI-후 환자 사이의 기준선 비교를 수행하였다. 본페로니(Bonferroni) 경계 김성수에 의해 수행되는 평균 분리와 함께 반복 측정 ANOVA를 이용하여 시간에 따른 변이를 분석하였다. MI-후 기간의 LV 부피에 대한 MMP/TIMP 수준 변화 사이의 관계를 선형 회귀 방법에 의해 조사하였다. 피크 트로포닌 수준은 정상적으로 분포하지 않았고[샤피로-윌크(Shapiro-Wilk) W 시험, p=0.001], 따라서 스피어맨(Spearman) 상관 접근법을 이용하여 MMP 수준 변화와 LV 부피 사이를 연관시켰다. 0.05 미만의 p 값은 유의한 것으로 간주되었다. 값은 모두 평균 및 평균의 표준 오차(SEM)로서 제공된다. 스타타 스태티스티컬 소프트웨어(Stata Statistical Software)[스타타코포레이션(StataCorp.), Rel 8.0, 미국 텍사스주 칼리지 스테이션]를 사용하여 모든 통계 절차를 수행하였다. 저자는 데이터에 자유롭게 접근하였고 완전무결한 상태에 대한 책임을 가졌다. 모든 저자는 문서로 작성된 원고를 읽고 동의하였다.
결과
연령이 일치하는 대조군 및 MI-후 환자의 초기 연구에서 수득된 LV 기하학적 구조 및 기능뿐만 아니라 수축기 혈압 및 심박수 측정치가 표 4에 요약된다. 이 MI-후 초기 시점에서는, 기준 대조군 개체와 비교하여 LV 이완기말 부피가 증가하였고 수축기 동맥 혈압이 감소하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, LV 이완기말 부피는 MI-후 군에서 시간 의존적인 방식으로 증가하였다. LV 이완기말 부피는 MI-후 1일째부터 MI-후 28일째까지 증가하였다. MI-후 군에서 LV 확장이 발생하였으나, LV 박출 계수는 MI-후 초기에 약간 증가한 다음, 나머지 MI-후 연구 기간동안 기준 대조군 범위 내로 떨어졌다. 도플러 연구는 MI-후 연구 기간 전체에 걸쳐 평가하였을 때 MI-후 환자의 72%에서 유의한 승모판 역류(MR)를 나타내지 않았고, 19%에서 근소한 MR을 나타내었고, MI-후 환자의 9%에서 1+ MR을 나타내었다.
기준 대조군 개체 및 심근 경색 후 환자에서의 좌심실 구조 및 기능 데이터
대조군1 MI-후 1일째2 p 값
LV 이완기말 부피(mL) 96±2 111±5 0.004
LV 수축기말 부피 33±1 35±3 0.54
LV 박출 계수(%) 65±1 69±2 0.035
심박수(bpm) 70±1 68±2 0.47
동맥 수축기 혈압(mmHg) 126±2 119±3 0.06
동맥 이완기 혈압(mmHg) 75±1 67±2 0.0008
데이터는 평균±SEM이다. 1기준 대조군 개체; n=53 2지표가 되는 사건으로부터 72시간 이내의 최초 측정치; n=32
기준 대조군 및 MI-후 군에 있어서 초기 연구 시점에서 수득된 MMP-2, MMP-7, MMP-8, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 및 TIMP-4의 혈장 수준의 절대값이 표 5에 요약된다. 이들 측정치를 또한 기준 대조군 값으로부터의 % 변화로서 계산하였다. MMP-2 수준은 MI-후 1일째에 기준 대조군 값보다 더 낮았다. 대조적으로, MMP-8 및 MMP-9 수준은 기준 대조군 값과 비교하여 MI-후 1일째에 상당히 더 높았다. 예를 들어, 혈장 MMP-9 수준은 MI-후 1일째에 기준 대조군 값보다 200% 넘게 더 높았다. 혈장 TIMP-1 수준은 MI-후 1일째에 더 높았던 반면, TIMP-2 및 TIMP-4 수준은 기준 대조군 값으로부터 변하지 않았다. 상대적인 MMP-9 및 TIMP 수준에서의 변화 사이의 화학량론적 관계를 조사하기 위하여, MMP-9/TIMP 비를 계산하였다(표 4). 기준 대조군 값과 비교할 때 MI-후 1일째에 MMP-9/TIMP-1 비는 100% 넘게 증가한 반면, MMP-9/TIMP-2 및 MMP-9/TIMP-4는 200% 넘게 증가하였다.
Figure 112009008088546-PCT00002
MI-후 환자에서 시간에 따라 측정된 MMP 프로파일이 도 2에 도시된다. MMP-2의 대용형의 혈중 수준은 상대적인 대조군 값으로부터 지속적으로 감소하였다. 전체 MMP-7의 혈장 수준은 전체 연구 기간동안 기준 대조군 값에 필적하도록 유지되었다. MMP-8 수준은 MI-후 1일째에 상당히 상승하였고, MI-후 3일째에 다시 크게 증가한 것으로 보였다. MMP-9의 대용형의 혈장 수준은 MI-후 90일째까지 지속적으로 상당히 상승하였다. 혈장 샘플을 젤라틴 자이모그래피에 적용시켰고, MMP-9 수준을 반영할 수 있는 92kDa에서 뚜렷한 단백질 분해 밴드가 관찰되었다(도 3). 이 92kDa 영역에서의 자이모그래피 활성은 MI-후 초기 시점에서 기준 정상 대조군에 비해 증가하였다. MMP-2를 반영하는 72kDa 단백질 분해 밴드는 MI-후 28일째에 증가한 것으로 보이지만, 다른 모든 MI-후 시점에서는 정상 기준값 내에 유지되었다.
TIMP 프로파일의 연속적인 혈장 측정치가 도 4에 도시된다. TIMP-1 수준은 MI-후 연구 기간 전체에 걸쳐 지속적으로 실질적으로 상승하였고, TIMP-2 수준은 MI-후 28일째 및 90일째에 기준 대조군 값으로부터 증가하였다. TIMP-4 혈장 수준은 모든 MI-후 시점에서 기준 대조군 값보다 낮게 유지되었다. MMP-9 및 TIMP-4의 시간 의존적인 변화 사이의 관계가 도 4에 도시된다. MMP-9/TIMP-4 비는 MI-후 초기 시점에서 상당히 증가하였고 MI-후 180일째에 다시 증가하였다.
MI-후 1일째로부터 5일째까지 혈장 MMP-9 수준의 변화에 대한 개별적인 응답 플롯이 도 5에 도시된다. 개별적인 MMP-9 수준에서의 혼합된 응답이 이 시간 체제 내에서 발생하였고, 따라서 개별적인 응답을 MI-후 1일째의 값으로부터의 % 변화로서 계산하였다. 이어, 이들 값을 MI-후 28일째의 LV 이완기말 부피의 변화에 대하여 연관지었다(도 5). MI-후 5일째에 지속적으로 상승 또는 증가된 MMP-9 수준을 갖는 환자에서는, 28일째에 LV 이완기말 부피의 훨씬 더 큰 증가가 발생하였다. 혈장 MMP-9 수준에서의 초기 변화의 상대적인 크기를, MI-후 1일째로부터 MI-후 5일째까지의 MMP-9 수준에서의 35% 증가에 기초하여 분류하였다. 혈장 MMP-9 수준이 MI-후 1일째 값으로부터 더 증가한 환자에서는, MI-후 90일째에 LV 이완기말 부피의 더 큰 % 변화가 발생하였다(도 6). MMP-2, MMP-7, MMP-8 또는 TIMP-1, TIMP-2 수준의 초기 변화와 LV 확장 정도 사이에서는 유의한 관계가 없었다(각각 r=0.27, 0.10, 0.04, -0.20, -0.24, 모두 p>0.20). 그러나, MMP-9의 초기 변화와 LV 확장의 변화 사이에는 유의한 관계가 있었다. 구체적으로는, MI-후 1일째 내지 3일째에 검출된 MMP-9 수준의 더욱 강력한 변화가 MI-후 90일째에 더 큰 LV 확장 정도와 관련되어 있었다(r=0.63, p=0.03). 피크 트로포닌 수준은 MMP-9 수준의 초기 변화와 관련이 없었고(r=0.01, p=0.94), LV 이완기말 부피와도 관련되지 않았다(r=-0.32, p=0.17). 다른 공동 변수와 관련하여, MI의 위치 또는 MI-후 투약에 걸쳐 분류될 때 MMP/TIMP 수준에서의 유의한 차이가 없었다(p>0.40).
본 연구에서는 MI 후 환자에서 대표적인 MMP 및 TIMP 유형의 혈장 프로파일 및 LV 기하학적 구조를 연속적으로 측정하였다. 이 연구에서의 독특하고 유의한 발견은 2가지였다. 첫째, MI-후 환자에서는 MMP 및 TIMP 방출의 상이한 일시적 패턴이 발생하였다. 구체적으로는, MI-후에 혈장 MMP-9 및 MMP-8의 급속한 상승이 일어났지만, MMP-7 및 MMP-2와 같은 다른 MMP 유형은 변하지 않고 유지되거나 또는 기준 대조군으로부터 감소되었다. 혈장 TIMP-1 수준은 증가하였지만, 심장 특이적 TIMP-4는 MI-후에 감소하였다. 둘째로, 특정 MMP 유형, 즉 MMP-9의 초기 증가와 MI-후 말기에 발생되는 LV 확장 정도 사이에서 특정 관계가 관찰되었다. 이들 결과는 MI 후 환자에서 MMP 및 TIMP 수준의 동적 변화가 발생하고, 이 단백질 분해 시스템의 추계학적 프로파일링이 MI-후 유해한 LV 리모델링과 관련하여 임상적 효능을 가짐을 입증하였다.
MI-후 기간에는 젤라티나제 아군에 속하는 MMP의 혈장 프로파일에 상이하고 분별가능한 변화가 있었다. 구체적으로, MMP-2 수준은 MI-후 초기에는 감소한 다음 보다 긴 MI-후 기간에는 정상 범위 내로 돌아왔다. 대조적으로, 혈장 MMP-9 수준은 MI-후 30일째까지 상승한 다음 정상 범위 내로 돌아왔다. MI-후 환자에서 MMP-2와 MMP-9 프로파일에서의 이러한 차이에 대한 근거는 전사 조절에서의 차이 및 이들 MMP 유형의 세포 공급원에서의 차이에 기인할 수 있다. MMP-9는 프로모터 영역 내에 다수개의 전사 인자 결합 도메인(예컨대, AP-1 결합 부위)을 함유하는데, 이들은 MMP-2 프로모터 영역에는 존재하지 않는다[보던(Borden P) 등, 2004]. 종양 괴사 인자와 같은 사이토카인이 MI-후 초기에 만들어지고, 시험관내 MMP-9 전사를 유도하는 것으로 입증되었다[에스테브(Esteve PO) 등, 2002; 에토(Etoh T) 등, 2001]. 그러나, 사이토카인 매개되는 MMP-2 전사에서의 유사한 강력한 증가는 보고되지 않았다. 그러므로, MI-후 기간동안 사이토카인 활성화 및 다른 생물 활성 분자의 생성은 MMP-9를 차별적으로 유도할 수 있다. 근세포 및 섬유아세포와 같은 모든 세포 유형이 MMP-9를 발현할 수 있지만, MMP-9의 중요한 공급원은 호중구이다[워스너(Woessner FJ), 1998; 구나싱 등, 2001]. 그러므로, MI-후 초기에 관찰되는 MMP-9의 강력한 증가는 호중구의 편재화된 보충 및 탈과립에 기인할 수 있었다.
본 연구는 혈장 MMP-9의 초기 증가를 MI-후 말기에 발생되는 유해한 LV 확장에 관련시킨다. 본 임상 보고로부터의 결과는 MI-후 초기에 관찰되는 혈장 MMP-9 수준의 강력한 증가가 MI-후 말기에 LV 확장으로 드러나는 유해한 심근 구조적 리모델링 과정의 개시를 반영할 수 있음을 나타낸다. 본 연구에서, 이 LV 리모델링은 LV 박출 계수에서의 무변화에 의해 입증되는 바와 같이 수축기 기능의 상당한 손상과 관련되지 않았다. 초기 시점에서 관찰되는 LV 박출 계수의 증가는 증가된 신경 호르몬계 활성화에 기인할 수 있었다.
MI-후 환자에서는 콜라게나제 MMP-8의 혈장 수준의 초기 증가가 검출되었다. MMP-8은 호중구 및 대식세포와 같은 염증 세포에 의해 주로 합성 및 방출되지만, 또한 심장 섬유아세포 및 근세포를 비롯한 다른 세포 유형에서 발현되는 것으로 보고된 바 있다(윌슨 등, 2003). MI-후 1일째에 밝혀낸 MMP-8의 증가된 혈장 수준은 급성 염증 과정을 반영할 수 있다. MI-후 3일째에는 매우 가변적인 두번째 피크가 발생하였다. MMP-8의 이 두번째 피크는 MI 치유 과정의 이 단계 동안 이루어지는 대식세포의 유입을 반영할 수 있다.
TIMP는 모든 MMP의 활성 촉매 도메인에 결합함으로써 효소의 단백질 분해 활성을 저해하는 저분자량 단백질 부류이다. 이는 원래 이들 저분자량 단백질의 유일한 기능인 것으로 생각되었으나, 현재는 TIMP가 세포 성장 및 활력에 대한 효과 및 MMP 활성화 다단계에의 참여를 비롯한 광범위한 추가적인 생물학적 특성을 갖는 것으로 인식되고 있다[베이커(Baker AH) 등, 2002]. 본 연구에서는, TIMP-1의 혈장 수준이 MI-후 환자에서 6개월간의 추적 조사 기간 전체에 걸쳐 상당히 증가하였다. 본 연구는 TIMP-1 또는 TIMP-2에 대한 MMP-9의 비가 MI-후 초기에 지속적으로 상승되지만(이는 연장된 MMP 활성 상태를 촉진함), 이들 화학량론적 관계가 MI-후 말기에 정상화되거나 돌아옴을 입증하였다. 이는 MI-후 환자에서 TIMP-4, 즉 심근에서 고도로 발현되는 특이적인 TIMP를 측정하는 첫번째 연구이다(그린 등, 1996; 스트로드 등, 2005). 연령이 일치하는 대조군 개체와 비교할 때 혈장 TIMP-4 수준은 감소하였고, 상대적인 MMP-9/TIMP-4 비는 증가하였다. 이들 발견은 MI-후 환자에서 심근 MMP 저해 제어의 상당하고 연장된 변화가 일어남을 보여준다.
본 연구에 포함된 MI-후 환자의 혈장에서 관찰되는 MMP 및 TIMP 수준의 일시적인 변화는 심근 내에서 이루어지는 동적 변화를 반영한다. 본 연구는 MI-후 환자에서 MMP 및 TIMP의 독특하고 일시적으로 다양한 혈장 프로파일을 정량할 수 있고, 이들 프로파일이 예상 및 진단 효능을 가짐을 입증하였다.
본원 전체에서, 다양한 간행물이 인용된다. 이들 간행물의 개시내용은 본 발명이 관련된 기술 분야의 상태를 더욱 충분히 설명하기 위하여 본원에 참고로 인용된다.
2. 실시예 2: 비대형 폐색 심근병증에서 알콜 격막 절제 후 기질 메탈로프로테이나제의 방출
본 연구에서는 비대형 폐색 심근병증(HOCM)을 앓는 환자에서 알콜 유도된 MI 전후에 특정 MMP 및 TIMP 부류의 혈장 수준을 조사하였다.
방법 및 결과: HOCM을 앓는 환자 51명(연령 55±2세)에서 MI를 유도하기 위하여 격막 관통 동맥 내로 알콜을 주사한지 60시간 후까지 연속적으로 또한 기준선에서 젤라티나제인 MMP-2 및 MMP-9, 및 콜라게나제인 MMP-8 및 MMP-13의 혈장 수준, 및 TIMP-1 프로파일(ELISA에 의해)을 수득하였다. 심근 손상을 나타내는 혈장 크레아틴 키나제(MB 동종효소)는 MI 후 18시간째에 2150% 증가하였다(p<0.05). 혈장 MMP-9는 MI-후 12시간째까지 기준선 값으로부터 400% 넘게 증가하였고, MMP-8은 100% 넘게 증가하였다(기준선에 대해 p<0.05). MMP-2 및 MMP-13에 대해서는 유사한 일시적 프로파일이 관찰되지 않았다. 또한, 혈장 TIMP-1 수준의 동시적인 증가가 MI 후에 발생되지 않았다. 그 결과, TIMP-1 매개되는 MMP-9 저해의 감소를 암시하는 MMP/TIMP 화학량론(MMP-9/TIMP-1 비)이 MI 후에 상당히 증가하였는데, 이는 세포외 심근 리모델링을 향상시킬 수 있다.
결론: 이들 독특한 결과는 특히 알콜 유도된 MI를 통한 인간에서의 제어된 심근 손상의 유도가 MI 후 초기 세팅에서 심근 리모델링을 촉진시키는 MMP/TIMP 화학량론의 종류 및 시간 의존적인 동요를 야기하였음을 입증하였다.
비대형 폐색 심근병증(HOCM)은 LV 유출관의 격막 대동맥판 하부 영역의 풍부한 심근 성장을 가장 통상적으로 그 특징으로 하는 유전적 장애이다[마론(Maron BJ), 2002]. 따라서, HOCM은 혈역학적으로 유의한 LV 유출관 폐색, 궁극적인 LV 펌프 기능부전, 및 결과적인 LV 부전 증상을 야기할 수 있다. HOCM 환자에서 LV 유출관 폐색을 경감시키기 위한 현행 접근법중 하나는 격막 대동맥판 하부 영역 내에서 MI를 선택적으로 유도하는 것이다[마론, 2002; 나구치(Naguch SF) 등, 1999a; 나구치 등, 1999b; 스펜서(Spencer WH) 등, 2000]. 격막 관통 동맥 내로 에탄올을 표적 주사함으로써, LV 유출관 폐색에 관련된 심근의 선택적인 파괴를 다수의 환자에서 성공적으로 수행하였다(나구치 등, 1999a; 나구치 등, 1999b; 스펜서 등, 2000). 개념상, 이 치료 접근법은 알콜 유도되는 MI를 야기하고, 따라서 환자에서 MMP와 심근 손상 사이의 관계에 관한 몇 가지 결정적인 문제를 해결할 유일한 기회를 제공한다. 첫째, 알콜 유도되는 MI 후 환자의 혈장중 특정 MMP 종류의 일시적인 프로파일은 무엇인가? 두번째, 알콜 유도되는 MI에 의해 유도된 심근 손상의 정도와 혈장 MMP 수준 사이에 관계가 있는가? 본 연구의 목적은 알콜 유도되는 MI의 전후에 HOCM 환자에서 MMP 및 TIMP 혈장 수준을 연속적으로 측정함으로써 이러한 특정 문제를 해결하는 것이었다.
방법
환자: HOCM으로 진단되고 수의 선택적 알콜 격막 절제가 예정된 환자(n=51)를, 고지에 입각한 동의를 수득한 후 연구에 참여시켰다. 베일러 메디칼 칼리지(Baylor Medical College) 및 메디칼 유니버시티 오브 사우쓰 캐롤라이나(Medical University of South Carolina)의 임상시험 심사 위원회가 이 절차를 조사 및 승인하였다. 환자 연령은 55±2세였고, 남성 32명과 여성 19명으로 이루어졌다. 카테터 삽입시, 기준선 LV 대 대동맥 혈압 구배는 62±6mmHg여서 상당한 LV 유출관 폐색을 나타내었다. 이미 기재된 바와 같이 알콜 격막 절제 절차를 수행하였다(나구치 등, 1999a; 나구치 등, 1999b). 간략히, 풍선 카테터를 격막 관통 동맥 내에 끼워넣고 에탄올 2 내지 5mL를 주사하였다. 주사한 후 5분간 풍선을 좌측 팽창시킨 후 제거하였다. 알콜을 주사한지 6주일 후에, 반복 카테터 삽입은 LV 유출구 폐색의 감소를 나타내는 25±4mmHg(p<0.05)의 구배를 나타내었다. 알콜 유도되는 MI 후 HOCM 환자에서의 LV 기능 및 혈역학의 변화는 잘 기재되어 있다(마론, 2002; 나구치 등, 1999a; 나구치 등, 1999b; 스펜서 등, 2000).
혈장 채취: 혈액 샘플(5cc)를 말초 정맥으로부터 냉각된 EDTA 관 내로 채취하였다. 샘플을 원심분리하고 따라낸 혈장을 분취한 다음 검정할 때까지 -70℃에서 저장하였다. 기준선(카테터 삽입 및 격막 절제 절차 전)에서 또한 알콜 주사 후 60시간까지 4 내지 6시간의 간격으로 샘플을 채집하였다.
MMP 및 TIMP 검정: 본 연구는 MMP의 두 가지 공지 부류, 즉 MMP-8 및 MMP-13을 포함하는 간질 콜라게나제, 및 MMP-2 및 MMP-9를 포함하는 젤라티나제에 초점을 맞추었다[에드워즈(Edwards DR) 등, 1996; 크리머스(Creemers EEJM) 등, 2001; 구나싱 등, 1997]. 그 특징이 가장 잘 밝혀진 TIMP는 TIMP-1이다[에드워즈 등, 1996; 빈센티(Vincenti MP), 2001]. 따라서, 본 연구에서는 TIMP-1의 측정도 수행하였다. 앞서 기재된 바와 같이 2-부위 결합 방법을 이용하는 효소 연결된 면역 흡착 검정(ELISA) 시스템(애머샴 파마시아 바이오테크, 영국 버킹엄셔)을 이용하여 MMP 및 TIMP 부류의 정량을 수행하였다(스피네일 등, 2000; 조프스 등, 2001). MMP-2(RPN 2617)의 경우, 사용되는 항혈청은 MMP-2의 대용형(proMMP-2)에 대해 반응하고, 활성 형태에 대해 반응하지 않는다. MMP-9(RPN 2614)의 경우, 항혈청은 효소의 대용형(proMMP-9)을 검출한다. MMP-8(RPN 2619)의 경우, 항혈청은 MMP-8의 프로효소 및 활성 형태 둘 다를 검출한다. MMP-13(RPN 2621)의 경우, 항혈청은 이 효소의 대용형을 검출하도록 개발되었다. TIMP-1의 경우에는, 기능성 단백질을 검출하기 위하여 항혈청을 개발하였다(RPN 2611). 이들 검정 시스템의 변이 계수는 3 내지 5%였고, 다른 프로테아제와 교차 반응하지 않았으며, 감도는 0.02ng/mL 이상이었다.
미소입자 효소 면역 검정 절차[AxSYM, 애보트 래보러토리즈(Abbot Laboratories), 일리노이주]를 이용하여 전체 혈장 크레아틴 키나제 농도 및 MB1 동종효소의 농도에 대해 혈장 샘플을 동시에 측정하였다.
데이터 분석: 치료 효과가 알콜 주사 후 시간인 분산분석(ANOVA)을 이용하여 먼저 MMP, TIMP 및 크레아틴 키나제 혈장 수준을 조사하였다. 그 후, 값을 기준선으로부터의 % 변화로서 계산하였다. 이들 결과를 ANOVA, 이어 본페로니 보정된 t-시험을 이용하여 각 시점에 대해 hoc-후 평균 분리에 적용하였다(이 때, 귀무가설은 기준선으로부터의 변화가 0과 같다는 것임). 크레아틴 키나제와 MMP 값 사이의 관계를 조사하기 위하여, 다각적 적분 연산[시그마플롯(SigmaPlot), 미국 캘리포니아주 산 라필 잔델]을 이용하여 각 환자의 농도-시간 곡선 아래의 면적을 계산하였다. 이들 점을 선형 회귀에 적용시켰다. 값은 평균±SEM으로서 표현된다. 시스탯(SYSTAT) 통계 소프트웨어[SPSS 인코포레이티드(SPSS Inc.), 미국 일리노이주 시카고]를 이용하여 모든 통계 절차를 수행하였다.
결과
51명의 HOCM 환자 모두에서 격막 관통 동맥 내로 알콜을 성공적으로 주사하였고, 혈액 샘플을 연속적으로 채집하였다. 기준선 크레아틴 키나제 및 MB1 분율이 표 6에 기재된다. 알콜 주사 후 혈장 크레아틴 키나제 및 MB1 동종효소의 변화가 도 7에 도시된다. 알콜을 주사한 후 6시간까지 혈장 전체 크레아틴 키나제 및 MB1 동종효소의 상당한 상승이 이루어지고, 약 24시간 후에 최고에 달하였다. 기준선 MMP 및 TIMP-1 혈장 수준이 표 5에 요약되고, 이들은 앞서 환자들에 대해 보고된 혈장 수준의 범위 내에 속한다[이노쿠보(Inokubo Y) 등, 2001; 조프스 등, 2001]. 알콜 주사 후 혈장 MMP-2 및 MMP-9의 변화가 도 8에 도시된다. 알콜을 주사한 후 4시간째에 혈장 MMP-2의 작지만 통계학적으로 유의한 증가가 일어났다. 대조적으로, 혈장 MMP-9의 강력한 증가가 알콜 주사 후 6시간째에 일어난 후 주사한지 50시간 후까지 상승된 상태를 유지하였다. 혈장 MMP-8 수준도 주사 후 6시간째까지 증가하였고 주사한지 60시간 후까지 상승 상태를 유지하였다(도 9). 혈장 MMP-13 수준은 알콜 주사 후의 어떤 시점에서도 상당히 증가하지 않았으나, 실제로 주사한지 24시간 후에 작지만 유의한 변화로 감소하였다(도 9). 혈장 TIMP-1 수준은 알콜 주사 후 말기 시점에 증가하는 경향이 있었으나, 이는 통계적 유의성에 달하지 못하였다(도 10; p>0.15). 그러나, 혈장 MMP-9/TIMP-1 비는 주사한지 6시간 후에 증가하였고, 알콜 주사한지 60시간 후까지 지속적으로 증가하였다(도 10). MMP-8/TIMP-1 비의 경우에는 유사한 변화가 일어났는데, 이 비는 알콜 주사 후 상당히 증가하였다. 혈장 크레아틴 키나제 MB1의 곡선 아래 면적 및 MMP-9의 시간 곡선 아래 면적을 각 환자에 대해 플롯팅하였고, 이는 도 11에 도시된다. 크레아틴 키나제 MB1 방출과 혈장 MMP-9 수준 사이에 상당한 선형 관계가 관찰되었다.
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논의
표적화된 심근 병소를 생성시킴으로써 비대형 폐색 심근병증(HOCM)에 의해 야기되는 LV 유출 폐색이 경감될 수 있다(마론, 2002; 나구치 등, 1999a; 나구치 등, 1999b; 스펜서 등, 2000). 구체적으로, LV의 비대 영역을 보충하는 관상 동맥 내로 에틸 알콜을 주사하면 혈관의 경화 및 이어 표적화된 심근의 허혈/경색을 야기한다. 그러나, HOCM 환자에서 알콜 유도되는 심근 경색(MI) 후 LV 리모델링에 기여하는 세포질 및 세포외 결과에 대해서는 알려진 것이 거의 없다. 따라서, 본 연구에서는 알콜 유도되는 MI 후 HOCM 환자에서 선택된 MMP 및 TIMP 부류의 혈장 수준 변화를 연속적으로 측정하였다. 본 연구의 새롭고 독특한 발견은 2가지였다. 첫째, TIMP-1 수준의 동시 증가를 수반하지 않은 특정 MMP 부류(MMP-8, MMP-9)의 강력한 방출이 HOCM 환자에서 알콜의 관상 동맥내 주사 후 발생하였다. 이는 심근 기질 열화를 촉진하는 MMP-TIMP 화학량론을 야기하였다. 둘째, 특정 MMP의 방출이 알콜 유도되는 MI 후 48시간까지 지속되었고, 심근 손상 정도와 관련이 있었다. 이들 발견은 인간에서 개별적인 심근 손상 후 MMP 및 TIMP 방출의 독특한 일시적 프로파일을 제공한다.
본 연구는 첫째 환자에서 알콜 유도되는 MI 후 혈장 MMP 및 TIMP 부류 수준을 프로파일링하기 위한 것이다. 본 연구는 환자에서 유도된 개별적인 심근 손상이 MMP의 시간 및 종류 의존적인 혈장 방출을 야기하였음을 입증하였다.
알콜 유도되는 MI 후 초기에는, MMP-2 혈장 수준이 약간 증가하였으나 급속하게 기준선으로 되돌아갔다. 이 약간의 상승은 심근 손상 구역으로부터의 MMP-2의 세포내 저장분의 방출에 기인하였다. MMP-2와는 대조적으로, 알콜 유도되는 MI 후 MMP-9의 혈장 수준이 강력하고 지속적으로 증가하였다. 그러므로, 알콜 유도되는 MI 후 혈장 MMP-9의 급속한 상승의 근간은 심근 손상 부위에서의 침윤 호중구 및 혈소판 응집으로부터의 MMP-9의 방출이었다. 면역 검정이 MMP-9의 대용형만을 검출하였기 때문에, 이 MMP 종류의 지속적으로 상승된 혈장 수준은 다시 합성이 이루어졌음을 암시한다. 따라서, MMP-9의 증가된 수준은 세포외 기질에 대한 근세포 계면을 변화시킴으로써 LV 리모델링을 촉진시킬 수 있다.
간질 콜라게나제 MMP-8의 혈장 수준은 알콜 유도되는 MI 후 현저하게 증가하였다. MMP-8은 주로 호중구 내에서 확인되었다[에드워즈(Edwards DR) 등, 1996; 크리머스 등, 2001; 구나싱 등, 1997; 워스너 등, 2000; 빈센티, 2001]. 그러나, 최근 데이터는 MMP-8이 다수의 심근 세포 유형에서 발현될 수 있음을 시사한다[허맨(Herman MP) 등, 2001]. 그러므로, MI 유도 후 증가된 혈장 MMP-8 수준은 급성 염증 반응 및 심근으로부터의 방출에 부수적이었다. MMP-13은 인간 LV 심근에서 검출되었고, 말기-단계 CHF 환자에서 증가된다(스피네일 등, 2000). MMP-13 혈장 수준은 알콜 유도되는 MI 후 약간 떨어진 다음 기준선 수준으로 회복되었다. MMP-13에 대한 면역 검정은 MMP-13의 대용형에 대해 유도되었다. 그러므로, 순환 MMP-13의 약간의 감소는 향상된 활성화 및 후속 제거에 기인하였다. 다수의 세포외 단백질은 원섬유성 콜라겐을 비롯하여 MMP-8 및 MMP-13의 기질인 것으로 입증되었다. 그러므로, 알콜 유도되는 MI 후 MMP의 이 부류의 활성화는 심근 세포외 구조 및 조성을 상당히 변화시킨다.
본 연구에서, TIMP-1 혈장 수준은 HOCM 환자에서 알콜 유도되는 MI 후 상당히 변화하지 않았다. TIMP에 대한 MMP의 상대적인 화학량론의 계산을 이용하여 순 MMP 단백질 분해능을 한정할 수 있다[스피네일 등, 2000; 골드버그(Goldberg GI) 등, 1989]. HOCM 환자에서 MI 유도 후 MMP-9/TIMP-1의 화학량론을 계산하였다. MI-후 12시간까지는 혈장 MMP-9/TIMP-1 비가 기준선으로부터 500% 넘게 증가하였다. MMP-9/TIMP-1 화학량론의 이러한 변화는 심근 조직 내에서의 연장된 MMP-9 활성을 촉진할 수 있다. TIMP-1이 가장 잘 특징지워진 TIMP이긴 하지만, TIMP 종류중 4가지 모두가 인간 심근 내에서 확인되었다[토마스(Thomas CV) 등, 1998; 스피네일 등, 2000; 리 등, 1998]. 특정 TIMP가 MMP의 특정 대용형에 우선적으로 결합하기는 하지만, 모든 TIMP는 활성화된 MMP에 1:1의 화학량론적 비로 결합한다.
요약: 본 연구는 알콜 유도되는 MI 후 심근 크레아틴 키나제와 MMP 방출 사이의 연관을 입증하였다. 본 연구는 알콜 유도되는 MI 후에 특정 MMP 부류의 혈장 내로의 방출이 일어났음을 명백하게 입증하였다. 이는 인간에서 개별적인 한정된 심근 손상 후 MMP 및 TIMP 수준에서의 일시적인 변화를 정량하기 위한 첫번째 연구이다. 본 연구는 심근 손상 정도에 직접적으로 관련된 환자에서의 알콜 유도되는 MI 후 혈장 내로 방출되는 MMP의 독특한 프로파일을 증명하였다. 본 연구로부터의 결과는 MMP 및 TIMP 프로파일 모니터링이 MI-후 상처 치유 및 심근 리모델링 과정을 모니터링함에 있어서 새로운 접근법을 제공함을 나타낸다.
3. 실시예 3: 비대형 폐색 심근병증에서 알콜 격막 절제 후 MMP -4의 혈장 모니터링
목적: 본 연구의 전체적인 목적은 혈장중 TIMP-4의 상대적인 양을 측정하기 위한 반정량적인 검정 절차를 개발한 다음 급성 심근 경색(MI) 후 비대형 폐색 심근병증(HOCM) 환자에서 TIMP-4 수준의 동적 변화를 결정하는데 이 접근법을 이용하는 것이었다.
방법/결과: 정상 환자(n=18) 및 알콜-유도된 MI 후 HOCM 환자(n=16)에서 혈장 TIMP-4 수준을 조사하였다(반정량적인 면역 블로팅에 의해). 혈장 TIMP-4 수준의 연속적인 측정치를 HOCM 환자에서 알콜-유도된 MI 후 60시간까지 조사하였다. 글라이코실화되지 않은 혈장 TIMP-4 수준은 정상 대조군과 비교할 때 HOCM 환자에서 250% 증가하였다. 총 혈장 TIMP-4 수준은 알콜-유도된 MI 후 30시간째에 20%까지 감소하였다.
결론: 구체적으로 알콜-유도를 통해 제어된 심근 경색을 유도하면, MI-후 초기 세팅에서 심근 리모델링을 촉진하는, 알콜-유도된 MI 후 HOCM 환자에서 혈장 TIMP-4 수준 감소를 야기하였다.
비대형 폐색 심근병증(HOCM)은 좌심실 유출관의 격막 대동맥판 하부 영역의 풍부한 심근 성장을 가장 통상적으로 그 특징으로 하는 유전적인 장애이다(마론, 2002). 격막 관통 동맥 내로 에탄올을 표적 주사함으로써, 좌심실(LV) 유출관 폐색에 관련된 심근의 선택적인 파괴를 다수의 환자에서 성공적으로 수행하였다[나구에(Nagueh SF) 등, 1999a; 나구에 등, 1999b; 스펜서, 2000). 따라서, 본 연구에서는 HOCM 환자에서 알콜-유도된 MI 후 혈장 TIMP-4 수준의 일시적인 변화가 일어난다는 가설을 시험하였다.
방법
환자: 정상 환자(n=18) 및 HOCM을 앓는 것으로 진단되고 수의 선택적인 알콜 격막 절제가 예정된 환자(n=16)를, 고지에 입각한 동의를 수득한 후 연구에 참여시켰다. 47±5세의 평균 연령을 갖는 정상 환자는 남성 9명 및 여성 9명으로 구성되었고, 심질환 또는 다른 관련 건강 문제의 부재를 보장하기 위하여 철저하게 조사하였다. HOCM 환자의 평균 연령은 53±4세였고, 남성 11명과 여성 5명으로 이루어졌다. 카테터 삽입시, 기준선 LV 대 대동맥 혈압 구배는 62±6mmHg여서, 상당한 LV 유출관 폐색을 나타내었다. 이미 기재된 바와 같이 알콜 격막 절제 절차를 수행하였다(나구에 등, 1999a; 나구에 등, 1999b). 간략하게, 풍선 카테터를 격막 관통 동맥 내에 끼워넣고 알콜 2 내지 5mL를 주사하였다. 주사 후 5분동안 풍선을 좌측 팽창시킨 다음 제거하였다. 알콜 주사후 6주일째에, 반복 카테터 삽입은 LV 유출관 폐색의 감소를 나타내는 25±4mmHg(p<0.05)의 구배를 드러내었다. 알콜-유도된 MI 후 HOCM 환자에서 LV 기능 및 혈역학의 변화는 잘 기재되어 있다(마론, 2002; 나구에 등, 1999a; 나구에 등, 1999b; 스펜서, 2000).
혈장 채집 및 준비: 혈액 샘플(5cc)을 말초 정맥으로부터 냉각된 에틸렌다이아민 테트라아세트산 관 내로 채집하였다. 샘플을 4℃에서 3,000RPM으로 10분간 원심분리시키고, 따라낸 혈장을 분할한 다음 검정할 때까지 -70℃에서 저장하였다. HOCM 환자의 샘플을 기준선(카테터 삽입 및 격막 절제 절차 전)에, 또한 알콜 주사 후 10, 20, 30 및 60시간째에 채집하였다. 먼저 혈장 샘플을 양이온 교환 칼럼[C-18 Sep-Pak; 워터스 어쏘시에이츠(Waters Associates), 메사추세츠주 밀포드] 상에서 용리시킨 다음 진공 원심분리에 의해 건조시켰다. 원심분리 후, 50mM 환원제, 트리스(2-카복시에틸)포스핀[피어스(Pierce)], 및 2배 리튬 도데실 설페이트 유동 샘플 완충액[인비트로젠(Invitrogen)]을 함유하는 용액에 샘플을 재용해시켰다. 샘플 완충액 부피에 대한 최적 혈장의 비를 결정하기 위하여 처음 일련의 희석을 수행하였다. 전체적으로는, 혈장 100μL의 초기 부피 및 샘플 완충액 36μL의 재용해 부피가 이 검정에 이상적인 것으로 결정되었다.
반정량적인 면역 블로팅 : 데이터를 획득하기 전에, 시판중인 다양한 TIMP-4 항체 상에서 여러 시험을 수행하여 감도 및 특이성을 결정하였다. 하기 항체를 선별하였다: 마우스 단클론 항-인간 TIMP-4(MAB974, 알앤드디 시스템즈), 인간 TIMP-4에 대한 토끼 항체 루프 #3[RP3T4, 트리플 포인트 바이올로직스(Triple Point Biologics)], 인간 TIMP-4에 대한 토끼 항체 루프 #1(RP1T4, 트리플 포인트 바이올로직스), TIMP-4에 대한 양 다클론 항체(PC434, 온코젠), 토끼 항-TIMP-4 다클론 항체[AB816, 케미콘(Chemicon)], 및 토끼 항-TIMP-4, 루프 #2 다클론 항체(AB19087, 케미콘). 23kDa 및 29kDa에서의 밴드를 확인하는 능력, 또는 개별적으로 TIMP-4의 글라이코실화되지 않은 형태 및 글라이코실화된 형태를 확인하는 능력에 대하여 항체를 선별하였다[라돔스키(Radomski A) 등, 2002]. 분자량 마커[씨블루 플러스(SeeBlue Plus) 2, 인비트로젠] 및 정제된 재조합 인간 TIMP-4(H-TIMP-4, 트리플 포인트 바이올로직스)를 양성 대조용으로서 모든 면역 블롯에 포함시켰다. 루프 #2 다클론 항체(AB19087, 케미콘)를 TIMP-4의 두 형태에 결합하는 그의 능력으로 인해 본 연구에 사용되는 TIMP-4 항혈청으로서 선택하였다. 최적 TIMP-4 항혈청 농도를 결정하기 위하여, 0.05 내지 0.6㎍/mL에 달하는 루프 #2 TIMP-4 항체의 상이한 농도로 다수개의 막을 배양하였다. 이들 결과는 이 면역 블롯 절차를 위한 항체의 최적 농도를 제공하였는데, 이는 루프 #2 TIMP-4 항체 0.5㎍/mL였다. TIMP-4 단백질에 대한 TIMP-4 항혈청의 응답이 선형인지의 여부를 결정하기 위하여, 재조합 TIMP-4 기준물의 농도를 변화시켰다. 10 내지 80㎍/mL의 TIMP-4 농도 사이에서 선형 관계가 확립되었다(r2=0.99).
이 프로젝트를 위해, 반정량적인 면역 블로팅에 의해 TIMP-4의 상대적인 수준을 시험하였는데, 이는 이미 상세하게 기재된 바 있다(스피네일 등, 2000). 혈장 샘플(12μL)을 4 내지 12% 비스트리스(BisTris) 겔에 로딩하고 전기영동 분리에 적용시켰다. 이어, 분리된 단백질을 나이트로셀룰로즈 막으로 옮겼다. 차단 및 세척 단계 후, TIMP-4의 글라이코실화된 형태 및 글라이코실화되지 않은 형태의 루프 2의 펩타이드 서열에 상응하는 항혈청(0.5㎍/mL)(AB19087, 케미콘) 중에서 막을 배양하였다. 2차 항체와 함께 배양한 후, 화학 발광[웨스턴 라이트닝 케미루미네슨스 리에이전트 플러스(Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus), 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)]에 의해 면역 반응 신호를 검출하였다. 또한, 각각의 면역 블롯에 대하여 음성 대조용(2차 항체 단독)을 사용하여 혈장중 다른 단백질에 대한 가능한 비특이적 결합을 조사하였다. 밀도 측정 방법에 의해 면역 블롯을 분석하여 통합된 광학 밀도(IOD) 값을 수득하였다. 또한 동일한 샘플의 반복된 IOD 값을 측정함으로써, 검정내 변이 계수가 10.5%인 것으로 결정하였다. 모든 측정은 2회 수행하였다.
데이터 분석: HOCM 개체로부터의 혈장 TIMP-4의 글라이코실화되지 않은 형태 및 글라이코실화된 형태에 대해 수득된 IOD 값을 각 면역 블롯에 포함된 기준 대조군 샘플로부터의 평균 IOD 값에 대해 정규화시켰다. 스튜던트 t-시험을 이용하여 기준 대조군과 HOCM 개체 사이에서 기준선 혈장 TIMP-4 수준을 비교하였다. 알콜-유도된 MI 동안 및 상기 MI 후의 혈장 TIMP-4 수준의 일시적인 변화를 개별적인 기준선 값에 대해 산출하고 %로 표현하였다. HOCM 개체에 덧붙여, 글라이코실화되지 않은 IOD 값 및 글라이코실화된 IOD 값의 합을 계산하여 총 혈장 TIMP-4를 결정하였다. 상이한 시점에서 기록된 혈장 TIMP-4 수준에서의 변화를, 단일-방식 분산 분석(ANOVA)을 이용하여 비교하였다. 본페로니-조정된 쌍-방식의 t-시험을 이용하여 hoc-후 평균 분리를 수행하였다. 마지막으로, 기준 대조군 및 HOCM 개체에서 혈장 TIMP-4 수준의 성별-특이적인 차이의 존재를 결정하였다. 이 비교를 위하여, 혈장 TIMP-4 IOD 값을 재조합 TIMP-4 기준물의 공지 농도에서의 IOD 값에 대해 정규화시켜, 겔-대-겔 가변성을 제거하였다. 구체적으로는, 혈장 TIMP-4 IOD 값을 성별 및 임상적 상태에 기초하여 분류하였다. 군 사이의 차이를 ANOVA에 의해 비교하였다. 이 비교를 위하여, 본페로니-조정된 쌍-방식의 t-시험을 이용하여 hoc-후 평균 분리를 수행하였다. 시스탯(Systat)(SPSS)으로 모든 통계 절차를 수행하였다. 결과는 평균±SEM으로 제공된다. p<0.05의 조정된 본페로니 확률 쌍-방식 t-시험 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과
정상 환자 및 HOCM 환자로부터의 혈장 샘플중 TIMP-4의 상대적인 수준을 나타내는 대표적인 면역 블롯이 도 12에 도시된다. 23kDa 및 29kDa에 상응하는 면역 반응 밴드가 관찰되었다. 1차 항체를 치환시키면 TIMP-4에 상응하는 밴드가 완전히 없어졌다. 혈장 샘플을 사용하여 추가적인 전기 영동 겔을 준비하였고 글라이코실화 단백질에 대해 염색하였다[웨버(Weber KT) 등, 1991]. 모든 혈장 샘플에서 29kDa에 상응하는 글라이코실화된 밴드가 관찰되었는데, 이는 글라이코실화된 TIMP-4를 반영할 수 있다(라돔스키 등, 2002). 기준 정상 대조군과 비교한 HOCM 환자의 혈장 TIMP-4가 도 13에 요약된다. HOCM 환자에서는 TIMP-4의 글라이코실화되지 않은 형태(23kDa) 및 글라이코실화된 형태(29kDa)의 수준이 둘 다 증가하였다.
알콜-유도된 MI 후 HOCM 환자에서 혈장 TIMP-4 수준에서의 시간 의존적인 변화가 도 14에 도시된다. 기준선과 비교하여, 글라이코실화되지 않은 혈장 TIMP-4 수준은 알콜-유도된 MI 후 10시간째에 증가한 다음 알콜-유도된 MI 후 30시간째에는 감소하였다. 글라이코실화된 TIMP-4의 경우, 수준은 알콜-유도된 MI 후 30시간째 및 60시간째에 기준선으로부터 감소하였다. 총 TIMP-4(글라이코실화되지 않은 형태 및 글라이코실화된 형태)도 알콜-유도된 MI 후 30시간째 및 60시간째에 감소하였다(도 14). 성별과 관련된 상대적인 혈장 TIMP-4 수준이 도 15에 도시된다. HOCM 여성 값은 글라이코실화되지 않은 TIMP-4의 경우 HOCM 남성 값에 비해 더 높았다. 글라이코실화되지 않은 TIMP-4 값은 성별과 무관하게 HOCM 군에서 상당히 더 높았다. 글라이코실화된 혈장 TIMP-4 수준에서도 유사한 경향이 관찰되었다. 그러나, 정상 남성의 글라이코실화된 TIMP-4 수준은 정상 여성보다 더 높았다.
본 연구는 첫째 환자로부터의 혈장중 TIMP-4의 상대적인 수준을 측정하는 면역 블롯 절차를 개발하기 위한 것이다. 본 연구에서, 혈장 TIMP-4 수준은 정상 대조군과 비교하여 HOCM 환자에서 더 높았다. HOCM은 LV 유출관의 격막 대동맥판 하부 영역의 풍부한 심근 성장(비대)을 그 특징으로 한다(마론, 2002). 이 LV 유출관의 폐색은 궁극적으로 전체 좌심실의 비대를 야기한다(마론, 2002). 만성 혈압 과부하에 응답하여 일어나는 LV 비대는 세포외 기질 침착(콜라겐 축적)의 증가를 포함한다[스타인버그(Steinberg TH) 등, 2001]. 본 연구에서, 혈장 TIMP-4 수준은 HOCM 환자에서 더 높았으며, 이는 심근 내에서 TIMP-4의 동시 증가를 반영할 수 있다. 그러므로, HOCM 환자에서의 TIMP-4의 증가된 수준은 심근 MMP 활성을 감소시킴으로써 콜라겐 축적을 촉진시킨다. 실제로, 심근 생검은 콜라겐 축적이 HOCM 환자에서 증가되었음을 보여주었다[누에(Nuegh SF) 등, 2001].
본 연구는 첫째 알콜-유도된 MI 후 혈장 TIMP-4 수준의 일시적인 변화를 프로파일링하기 위한 것이다. 제어된 심근 손상(예컨대, 알콜-유도된 MI)에서 MMP와 TIMP 사이의 불균형을 측정하면 본원에서 급성 심근 손상 후 발생되는 것으로 밝혀진 TIMP 방출의 일시적인 관계를 더욱 잘 이해하게 된다. 실시예 1에서 보여지는 바와 같이, 본 연구의 결과는 심근 손상의 더욱 통상적인 원인, 즉 경색과 함께 관상 동맥 폐색을 갖는 환자까지 확장될 수 있다.
흥미롭게도, 본 연구는 성별과 관련한 상대적인 혈장 TIMP-4 수준의 변화를 입증하였다. 그러나, TIMP-4에서의 이러한 변화를 조절하는 상류부문 메카니즘은 잘 알려지지 않고 있다(그린 등, 1996). TIMP-4 단백질 발현은 다른 TIMP의 발현을 조절하는 유사한 사이토카인 및 다른 생물학적 분자 스테로이드에 의해 영향을 받을 수 있다(그린 등, 1996). 과거 연구는 TIMP 종류 발현이 생리 주기 동안 변화하여 난소 스테로이드의 영향을 암시함을 입증하였다[고핀(Goffin F) 등, 2003]. 본 연구에서, TIMP-4의 혈장 수준은 남성보다 정상 여성에서 더 낮았다. 정상 여성에서의 감소된 TIMP-4 수준의 이러한 관찰은 난소 스테로이드 수준의 차이에 의해 야기될 수 있다. 그러나, HOCM 군에서는, 여성 혈장 TIMP-4 수준이 HOCM 남성보다 더 높았다. 이는 이 비대 과정을 나타내는 환자에서 TIMP-4의 상향 조절을 촉진하는 다른 우월한 생물학적 신호에 기인할 수 있다.
4. 실시예 4: 심근 경색 후 환자에서 심실 리모델링 및 심부전을 분별, 예측 및 진단하기 위한 기준
연령 범위 내의 성별에 따른 인간 개체의 정상 값의 명백한 세트가 표 7에 기재된다. 이와 같이 총괄적일 뿐만 아니라, 심혈관 질환이 없는 연령이 일치하는 개체가 포함되었기 때문에 정상 기준 범위를 제공하는 MMP/TIMP의 정상 기준값의 목록은 이전에 집약된 바 없었다. 더욱이, 후속 표에 더욱 상세하게 기재되는 바와 같이 중요한 진단 및 예상 정보를 갖는 것으로 입증되는 MMP/TIMP 프로파일의 신규 화학량론적 비가 제공된다. 이들 데이터는 100명이 넘는 개체로부터 수집 및 분석하였다.
Figure 112009008088546-PCT00004
표 8은 심근 경색(심장 발작) 후 72시간 내의 환자에서 절대항의 MMP 및 TIMP 값, 절대항의 MMP/TIMP 비, 및 절대항에 기초한 정상 기준값으로부터의 % 변화를 제공한다. 이들 값은 원 출원의 내용에 기재된 바와 같이 채집하였다. 이미 출간된 동물 연구 또는 제한된 임상 연구에서의 과거 보고서로부터 예측되지 못하는 독특한 혈장 프로파일이 나타내어진다. 이 독특한 프로파일은 MMP-2의 하락, 증가된 MMP-9 및 더욱 중요하게는 증가된 MMP-9/TIMP-4 비를 포함한다. 증가된 MMP-9/TIMP-4 비는 TIMP-4가 심혈관 공급원으로부터만 방출되기 때문에 심장 특이성을 제공한다. 따라서, 이는 심혈관 특이성을 제공하는 수단 및 심근 경색의 초기 발생 동안 MMP 및 TIMP의 독특한 프로파일을 제공하는 최초의 데이터이다. 또한, 이전 출원에서 보여지는 바와 같이, MMP 및 MMP-9/TIMP-4 비의 이러한 초기 변화는 MI-후 6개월까지 유해한 심실 리모델링 및 심부전 발병 위험 증가를 예측할 수 있었다. 이들 데이터는 말기의 유해한 결과 및 예후(심실 확장)에 대한 심혈관 특이적인 프로파일(MMP-9/TIMP-4 비)의 초기(72시간 이내) 변화의 인과관계를 실제로 연결하기 위한 종류중 첫째였다. 이들 신규 데이터를 이용하여 치료 및 임상 결정을 유도할 수 있는 방법이 최초 출원에 제공되었다.
Figure 112009008088546-PCT00005
표 9는 최초 심장 발작(심근 경색) 후(구체적으로는 1개월 후) 환자에서 발생되는 MMP/TIMP의 독특하고 분별적인 프로파일을 제공한다. 이 때, 심근 경색에 특이적인 유해한 심실 리모델링으로 인해 심부전 발병 위험이 증가된 환자를 알아내는데 이용될 수 있는 MMP 및 TIMP의 특이적이고 분별적인 변화가 일어난다. 이 경우, MMP-9는 상승 상태로 유지되고 TIMP-1 수준은 증가한다. MMP-9/TIMP-1 및 MMP-9/TIMP-4 비의 이러한 변화는 유해한 심실 리모델링, 심실 확장, 및 궁극적으로는 박출 성능의 저하(수축기 심부전) 위험이 증가된 환자의 진단에 도움이 된다.
Figure 112009008088546-PCT00006
마지막으로, 본원에 개시된 독특한 혈장 징후는 심부전을 나타내는 환자의 근본 원인을 구별하는 능력을 최초로 제공한다. 구체적으로는, 표 10에 도시되는 바와 같이, 심근 경색에 부수적인 심부전 또는 고혈압과 같은 다른 심혈관 질환 발병 위험이 있거나 또는 상기 질환을 갖는 환자로부터 독특하고 매우 상이한 혈장 프로파일이 생성된다. 이들 데이터는 본원의 기초를 형성하는 본 발명자들의 완결된 연구로부터 집약되었다. 그러므로, 이들 프로파일 및 더욱 중요하게는 더욱 특이적인 임상적 결정 및 고려되는 치료 전략에 대한 분별 진단을 내릴 수 있다. 이 프로파일의 임상적 용도의 예 및 임상 결정을 내리는데 이들을 이용하는 방법도 최초 출원에 제공되었다.
Figure 112009008088546-PCT00007
E. 참조문헌
Figure 112009008088546-PCT00008
Figure 112009008088546-PCT00009
Figure 112009008088546-PCT00010
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Figure 112009008088546-PCT00012
Figure 112009008088546-PCT00013
Figure 112009008088546-PCT00014

Claims (18)

  1. 심근 경색 후의 개체로부터의 체액에서 정상 값보다 더 높은 메탈로프로테이나제-(MMP)-9의 양을 검출함을 포함하는, 상기 개체에서 좌심실 확장을 검출 또는 예측하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    MMP-9의 양이 정상 값보다 약 100% 이상 더 높은, 방법.
  3. 심근 경색 후의 개체로부터의 체액에서 정상 값보다 더 높은 메탈로프로테이나제의 조직 저해제(TIMP)-1의 양을 검출함을 포함하는, 상기 개체에서 좌심실 확장을 검출 또는 예측하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    TIMP-1의 양이 정상 값보다 약 50% 이상 더 높은, 방법.
  5. 심근 경색 후의 개체로부터의 체액에서 TIMP-4에 대한 MMP-9의 비의 증가를 정상 비와 비교하여 검출함을 포함하는, 상기 개체에서 좌심실 확장을 검출 또는 예측하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    TIMP-4에 대한 MMP-9의 비가 정상 비와 비교하여 약 100% 이상까지 증가하는, 방법.
  7. 심근 경색 후의 개체로부터의 체액에서 TIMP-1에 대한 MMP-9의 비의 증가를 정상 비와 비교하여 검출함을 포함하는, 상기 개체에서 좌심실 확장을 검출 또는 예측하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    TIMP-1에 대한 MMP-9의 비가 정상 비와 비교하여 약 100% 이상까지 증가하는, 방법.
  9. 심근 경색 후의 개체로부터의 체액에서 TIMP-2에 대한 MMP-9의 비의 증가를 정상 비와 비교하여 검출함을 포함하는, 상기 개체에서 좌심실 확장을 검출 또는 예측하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    TIMP-2에 대한 MMP-9의 비가 정상 비와 비교하여 약 100% 이상까지 증가하는, 방법.
  11. 심근 경색 후의 개체로부터의 체액에서 정상 값보다 더 높은 MMP-8의 양을 검출함을 포함하는, 상기 개체에서 좌심실 확장을 검출 또는 예측하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    MMP-8의 양이 정상 값보다 약 50% 이상 더 높은, 방법.
  13. 심근 경색 후의 개체로부터의 체액에서 TIMP-4에 대한 MMP-9의 비의 증가 및 TIMP-4에 대한 MMP-8의 비의 증가를 정상 비와 비교하여 검출함을 포함하는, 상기 개체에서 좌심실 확장을 검출 또는 예측하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    TIMP-4에 대한 MMP-9의 비가 정상 비와 비교하여 약 100% 이상까지 증가하는, 방법.
  15. 심근 경색 후의 개체로부터의 체액에서 MMP-9의 증가, MMP-8의 증가, TIMP-1의 증가, TIMP-4에 대한 MMP-9의 비의 증가, TIMP-1에 대한 MMP-9의 비의 증가, TIMP-2에 대한 MMP-9의 비의 증가를 검출함을 포함하는, 상기 개체에서 좌심실 확장을 검출 또는 예측하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    MMP-9의 양이 정상 값보다 약 100% 이상 더 높고, MMP-8의 양이 정상 값보다 약 50% 이상 더 높으며, TIMP-1의 양이 정상 값보다 약 50% 이상 더 높고, TIMP-4에 대한 MMP-9의 비가 정상 비와 비교하여 약 100% 이상까지 증가하며, TIMP-1에 대한 MMP-9의 비가 정상 비와 비교하여 약 100% 이상까지 증가하고, TIMP-2에 대한 MMP-9의 비가 정상 비와 비교하여 약 100% 이상까지 증가하는, 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 있어서,
    체액이 혈액인, 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 있어서,
    체액이 혈장, 뇨, 활액(synovial fluid), 타액 또는 심막액(pericardial fluid)인, 방법.
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2007249620A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Musc Foundation For Research Development Detecting diastolic heart failure by protease and protease inhibitor plasma profiling
MX2009000059A (es) 2006-07-11 2009-04-28 Musc Found For Res Dev Prediccion de falla del corazon despues del infarto al miocardio mediante el perfil de la proteasa y el inhibidor de proteasa.
US8506499B2 (en) 2007-01-04 2013-08-13 Musc Foundation For Research Development Predicting atrial fibrillation recurrence by protease and protease inhibitor profiling
NZ612673A (en) * 2009-09-18 2014-10-31 Astute Medical Inc Methods and composition for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
US8592151B2 (en) 2009-11-17 2013-11-26 Musc Foundation For Research Development Assessing left ventricular remodeling via temporal detection and measurement of microRNA in body fluids
US8602996B2 (en) 2010-06-01 2013-12-10 Cardiac Pacemakers, Inc. Integrating device-based sensors and bedside biomarker assays to detect worsening heart failure
CN104159638A (zh) * 2012-01-31 2014-11-19 心脏起搏器公司 用于使用生物标记物组数据控制心脏再同步装置/疗法的系统和方法
US20130196870A1 (en) * 2012-01-31 2013-08-01 Medical University Of South Carolina Systems and methods using biomarker panel data
EP2825882A1 (en) * 2012-03-16 2015-01-21 UMC Utrecht Holding B.V. Biomarkers for adverse cardiac remodeling
PL228091B1 (pl) * 2014-02-12 2018-02-28 Inst Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk Zestaw biomarkerów transkryptomicznych do zastosowania w stratyfikacji indywidualnego ryzyka rozwoju pozawałowej niewydolnosci serca, sposób diagnozowania ryzyka wystapienia u pacjenta pozawałowej niewydolnosci serca i zastosowanie biomarkerów do diagnostyki in vitro
CN104569429B (zh) * 2015-01-04 2017-01-18 深圳市艾瑞生物科技有限公司 一种快速定量检测脑钠肽的均相荧光免疫试剂组及其制备方法
JP6142384B1 (ja) * 2016-09-14 2017-06-07 株式会社グリーンペプタイド 抗体検査用試薬
CN109303573B (zh) * 2018-12-04 2021-08-31 湖南自兴智慧医疗科技有限公司 一种根据b超检测中上彩血流图来计算孕早期胚胎胎心率的方法
KR102659088B1 (ko) * 2019-11-18 2024-04-24 서울대학교병원 Mmp 센서 기반의 실시간 구형 구축 모니터링과 치료가 가능한 유방 재건용 조직 확장기 및 이와 연계된 환자 정보 시스템
CN111272945A (zh) * 2020-02-28 2020-06-12 中国科学院海洋研究所 一种d-氨基酸检测试剂盒及其检测方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) * 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) * 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) * 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) * 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4275149A (en) * 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4277437A (en) * 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4452901A (en) * 1980-03-20 1984-06-05 Ciba-Geigy Corporation Electrophoretically transferring electropherograms to nitrocellulose sheets for immuno-assays
US4376110A (en) * 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4366241A (en) * 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US5424000A (en) * 1993-10-05 1995-06-13 West Agro, Inc. Acid cleanings and staining compositions
US7713705B2 (en) * 2002-12-24 2010-05-11 Biosite, Inc. Markers for differential diagnosis and methods of use thereof
ATE463743T1 (de) * 2004-07-23 2010-04-15 Ct De Rech Public De La Sante Überwachung von herzversagen
AU2007249620A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Musc Foundation For Research Development Detecting diastolic heart failure by protease and protease inhibitor plasma profiling
MX2009000059A (es) 2006-07-11 2009-04-28 Musc Found For Res Dev Prediccion de falla del corazon despues del infarto al miocardio mediante el perfil de la proteasa y el inhibidor de proteasa.
EP2208798B1 (de) * 2006-10-09 2013-08-07 Medizinische Hochschule Hannover MicroRNA (miRNA) zur Diagnose und Therapie von Herzerkrankungen
US20090005336A1 (en) * 2007-05-08 2009-01-01 Zhiguo Wang Use of the microRNA miR-1 for the treatment, prevention, and diagnosis of cardiac conditions
CA2693031A1 (en) * 2007-07-18 2009-01-22 The Regents Of The University Colorado Differential expression of micrornas in nonfailing versus failing human hearts
US8592151B2 (en) * 2009-11-17 2013-11-26 Musc Foundation For Research Development Assessing left ventricular remodeling via temporal detection and measurement of microRNA in body fluids

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US8445222B2 (en) 2013-05-21

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