KR20090045454A - 결빙방지물질을 생산하는 피라미모나스 속 극지 미세조류 - Google Patents

Abstract

본 발명은 결빙방지 활성을 가지는 피라미모나스 속(Pyramimonas genus) 극지 미세조류에 관한 것으로, 본 미세조류는 결빙방지 물질을 생산, 분비하여 결빙을 방지하는 활성을 가지므로 그 배양액을 결빙방지용 첨가제로 사용할 수 있는 유용한 균주이다.

결빙방지, 피라미모나스 속, 극지, 미세조류, 결빙방지제

Description

결빙방지물질을 생산하는 피라미모나스 속 극지 미세조류 {Antarctic microalgae Pyramimonas genus producing antifreezing molecules}

본 발명은 결빙방지 활성을 가진 물질을 생산, 분비하는 피라미모나스 속 (Pyramimonas genus) 극지 미세조류에 관한 것이다.

구체적으로는, 결빙방지 물질을 생산, 분비하여 결빙방지 활성을 가지는 피라미모나스 속 미세조류 및 그 배양액을 결빙방지용 첨가제로 이용하는 피라미모나스 젤리디콜라 미세조류의 이용방법에 관한 것이다.

극지 생물을 이용한 결빙방지 물질 탐색 및 이용 기술은 분자생명공학기술 분야에 해당하며 극한지 생물자원을 활용하여 실생활에 이용하고자하는 특징을 가진다 (Fletcher, G. L. et al . (2000) Annual Review of Physiology 63: 359-390; Gordon, M. S. et al . (1962) Biological Bulletin 122: 52-62).

결빙방지 단백질 (Antifreeze proteins; 이하 “AFPs”로 약칭)이란 얼음과 결합하여 얼음 결정의 성장을 저해하는 특징을 가진 단백질로서 얼음결합 단백질 (Ice-binding proteins; 이하 “IBPs”로 약칭) 또는 온도 이력 단백질 (Thermal Hysteresis proteins) 이라고도 알려져 있다. 이 단백질들은 생물이 냉해를 극복하 기 위한 기작으로 만들어 내는 물질들 중의 하나라고 할 수 있다 (DeVries, A. L. et al . (1969) Science 163: 1074-1075; DeVries, A. L. et al . (1970) Journal of Biological Chemistry 245: 2901-2913).

AFPs는 얼음 결정의 표면에 수소결합을 통해 단단히 결합하는데 그 결과, AFPs가 결합하지 않는 부분만 비정형적으로 얼음 결정이 성장한다. 따라서 얼음 표면에는 깊은 골 (pit)이 생기며, AFPs가 결합 부위와 결합하지 않은 부위에 뚜렷한 경계를 관찰할 수 있다.

AFPs가 처음 밝혀진 것은 1971년으로, 해산 어류로부터 결빙방지 물질의 존재가 알려진 이후로 꾸준한 연구를 통해 한 종류의 AFGPs (Antifreeze Glycoproteins)와 네 종류의 AFPs의 존재 및 구조가 밝혀졌다 (DeVries, A. L. et al . (1969) Science 163: 1074-1075; DeVries, A. L. et al . (1970) Journal of Biological Chemistry 245: 2901-2913; Fletcher, G. L. (1981) Canadian Journal of Zoology 59: 193-201; Chao, H. et al . (1994) Protein Science 3 (10): 1760-1769; Fletcher G. L. et al . (1982) Canadian Journal of Zoology 60: 348-355; Davies, P. L. and Hew, C. L. (1990) FASEB Journal 4(8): 2460-2468; Xue, Y. Q. et al . (1994) J. Mol. Biol. 237 (3): 351-353).

현재, 대구와 넙치를 비롯한 17종의 어류에서 결빙방지물질이 생산되는 것이 알려져 있으며, 당근 및 민들레를 비롯한 27종 이상의 고등 식물에서도 결빙방지 물질이 생산되는 것이 알려져 있다 (DeVries, A. L. et al. (1970) Journal of Biological Chemistry 245: 2901-2913; Hincha, D. K. et al . (1992) J. Plant Physiol. 140: 236-240; Sun, X. Y. et al . (1995) Can. J. Microbiol. 41 (9): 776-784; Griffith, M. et al . (1997) Physiologia Plantarum. 100 is. 2: 327-332; Smallwood, M. et al . (1999) Biochemical Journal. 340: 385-391).

일반적으로 얼음이 녹는 과정에서 녹는점보다 낮은 온도에서 다시 얼음의 결정이 생기는 재결정화(re crystallization)현상이 일어나는데, 이때 성장한 얼음 결정은 생체 세포에 비가역적인 손상을 가하게 된다. 월동의 혹한을 지내야 하는 식물이 생산하는 AFPs의 주요한 역할은 얼음의 재결정 과정을 저해하여 냉동으로 야기될 수 있는 조직과 세포의 손상을 최소화하는 것이다. 반면 남극 해양 어류의 AFPs는 얼음 결정 성장을 조절하여 어류 체내의 물의 어는점을 낮추는 부가적인 온도 이력 (thermal hysteresis) 활성을 가진다.

AFPs의 응용 범위는 원핵생물 혹은 진핵생물을 유전적으로 AFPs를 생산 할 수 있도록 형질전환 시켜서 추운 겨울나기 또는 저온환경에서 살아갈 수 있게하는 유전자 조작, 결빙방지단백질의 대량생산을 통한 결빙방지용 첨가제 개발, 초저온 수술의 첨가제등으로 사용하기까지에 이른다. 특히 AFPs가 유용하게 쓰일 수 있는 부분은 여러 생물자원들의 장기 동결보존 분야이다. 각종 세균, 효모, 혈소판, 적혈구, 난자 및 정자, 배 등의 전세포 (whole cell)의 장기 보존 시에 동결방지제로 AFPs를 첨가하여 동결시키면, 해동시 AFPs의 얼음 재결정 저해 활성에 의한 세포 파괴 현상으로부터 더 효율적으로 보호할 수 있다고 보고 되고 있다.

AFPs는 미세 결정 구조가 요구되는 아이스크림, 해동 시 우수한 식품상태가 요구되는 냉동 과일과 같은 냉동식품 보존에 유용하게 사용될 수 있다. 얼음의 재 결정화는 냉동식품의 맛과 조직에 부정적인 영향을 끼치는 것으로 알려져 있다.

국제공개 제 WO 92/22581호에는 식물에서 분리한 AFPs를 아이스크림에서 얼음 결정형태를 조절하는 데 사용하는 방법이 개시되어 있다. 또한 국제공개 제WO 99/37782호에는 화본과 초본에서 AFPs를 분리하고 이를 아이스크림이나 냉동 요구르트와 같은 냉동식품에 사용하는 방법을 개시하고 있다. 특히 흥미로운 것은 Lolium AFPs는 고온에서도 안정하다는 것이다. 따라서 파스테리제이션과 같은 고온 처리로 미생물의 증식을 막는 식품 산업분야에도 적용될 수 있다. 또한 AFPs는 냉동보관된 정육의 육질과 향을 보존하는 데에도 이용가능하다.

결정 구조의 조절능이 요구되는 또 다른 분야는 의료 분야이다. AFPs는 세포 손상을 촉진시키는 헥사고날 바이피라미드(hexagonal bipyramids)를 형성하는 성질이 있는데, 이 단백질을 종양에 투여하여 초저온 수술을 할 수도 있다. 이러한 형태의 치료는 수술에 의존하지 않아도 되며 전통적인 화학요법과 관련된 부작용을 수반하지 않기 때문에 특히 흥미롭다고 할 수 있다. 통풍이나 신장 결석과 같은 질환에서 결정을 형성하는 것을 조절하는 데에도 적용될 수 있다.

앞서 나열한 바와 같이, 결빙방지 물질 및 신기능성 물질 개발은 향후 의학 및 신소재 산업의 변화에 편승하여 그 수요가 증가할 것임에 틀림없다. 결빙방지 물질은 고부가가치 산물로서 의료, 군수, 냉동식품 산업, 향장 산업, 식물 분자육종, 및 냉해방지 농작물 저장법 등 매우 다양하게 이용될 수 있을 것으로 생각하기 때문이다.

현재 생산되고 있는 결빙방지 물질은 어류로부터 추출하고 있으며, 1g 당 1000 만원의 고가로 판매되고 있다. 하지만, 고가의 결빙방지제는 실제 응용할 수 있는 범위가 매우 광대함에도 불구하고 비용에 따른 부담으로 실질적으로 응용되지 못하고 있는 실정이다.

활용도가 높은 결빙방지 단백질의 가격을 낮추기 위해서는 대량생산 체제를 갖추어야 한다. 현재의 어류를 이용한 분리 방법은 극히 비효율적이며 결빙방지 단백질을 생산하는 새로운 대안 생물을 찾아야 할 것이다.

극지방에 서식하는 호냉성 (好冷性) 녹조류 중 일부는 아주 저온의 해수에서 적응 기작중의 하나로 결빙방지 물질을 만들어 낼 것으로 추정된다. 따라서 본 발명자들은 북극에 서식하는 미세조류 중에서 결빙방지 활성을 가진 종을 탐색하던 중 피라미모나스 속 미세조류가 결빙방지 물질을 생산함을 확인하고 이를 분리, 동정하여 본 발명을 완성하였다. 본 명세서에 기재된 참고 문헌은 그 전체로서 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 피라미모나스 속 (Pyramimonas genus) 미세조류 또는 그 배양액의 일부가 포함된 결빙방지용 첨가제를 제공한다.

본 발명은 피라미모나스 속 미세조류 또는 그 배양액을 이용하여 일정 온도에서 시료의 결빙을 방지하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 피라미모나스 속 미세조류를 이용하여 결빙방지 물질을 대량으로 수득하는 방법을 제공한다.

본 발명은 피라미모나스 속 미세조류 또는 그 배양액을 포함한 결빙방지용 첨가제를 제공한다.

본 발명에 따른 피라미모나스 속 미세조류는 결빙방지 물질을 생산함으로써 결빙방지 활성을 가지게 되고, 이때 결빙방지 물질은 AFPs 또는 IBPs이다.

또한 이 균주는 저온 배양 시 유사 결빙방지물질 (Antifreeze like ice-binding molecules, IBMs)을 분비한다.

일반적으로 AFPs는 식물, 어류, 곤충 및 세균을 포함한 많은 종류의 생물에서 발견되었다. AFPs는 모두 IBPs이지만 그 구조나 아미노산 서열은 생물체간에 서로 다르다.

AFPs 또는 IBPs는 얼음에 결합하여 얼음 결정의 성장을 저해한다. 즉, AFPs 또는 IBPs는 얼음에 부착하여 그 자리에서 (in situ) 얼음의 재결정을 저해하고 수 용액의 어는점을 단백질 농도에 비례하여 낮추는 특이 생리작용을 가진다. 따라서 이러한 AFPs 또는 IBPs의 작용은 얼음의 미세구조를 관찰함으로써 확인할 수 있다 (Raymond (2000) Polar Biology 23:721-729).

본 발명에 따른 피라미모나스 속 미세조류는 북극 스발바드 군도 (Svalbard islands) 연안지역에서 해수와 빙하의 접경지역(sea-ice margin)의 해수를 채집하여 모세관 분리법으로 단일 세포로 분리하고 이를 피라미모나스 속 KOPRI AnM0046 (Pyramimonas sp. KOPRI AnM0046) 으로 명하였다. 채집종의 동정을 위하여 시료를 산으로 처리한 후 전자현미경으로 검경하여 Kozlova 문헌에 따라 피라미모나스 젤리디콜라 (Pyramimonas gelidicola)로 동정하였다(Kozlova. O.G. (1962) Trudy Inst. Okeanol. 61:1-18).

본 발명에 따른 피라미모나스 젤리디콜라 (KOPRI AnM0046)를 2007년 4월 6일에 한국생명공학연구원 부설 생물자원센터에 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 11115BP).

피라미모나스 젤리디콜라 미세조류가 결빙방지 활성을 가진다는 사실을 확인하기 위하여, 상기에서 분리 동정한 피라미모나스 젤리디콜라를 배양한 배지의 결빙방지 활성을 측정하여 피라미모나스 젤리디콜라가 결빙방지 물질인 AFPs 또는 IBPs을 합성하는지 관찰하였다.

구체적으로 북극에서 분리한 미세조류 피라미모나스 젤리디콜라가 결빙방지 물질인 AFPs 또는 IBPs 을 합성하는지 관찰하기 위하여, 2주간 0 내지 4.5℃에서 배양한 뒤 세포는 원심분리기를 통해 분리해내고 배양액을 -4℃에서 동결시켜 얼음 의 미세구조의 변화를 관찰함으로써 결빙방지 활성을 측정하였다.

그 결과 피라미모나스 젤리디콜라를 배양한 배지에서는 AFPs 또는 IBPs가 얼음에 결합하여 얼음결정의 모양을 변화시키는 것으로 확인되었다. 본 미세조류 배양 배지에서 얼음과 결합하여 얼음에 골 (pit)을 내는 현상을 확인하였(도 4a 참조).

또한 이 균주는 2 ~ 4.5℃에서 최대성장을 보이며 -2.5 내지 4.5℃에서 지속적인 성장이 관찰되는 저온성 균주로 유사 결빙방지물질을 합성하는 것이 처음으로 밝혀졌다(도 5 참조).

피라미모나스 속 미세조류에서 결빙방지 물질이 생산된다는 사실은 지금까지 알려진 바 없으며, 따라서 본 발명은 피라미모나스 속 극지 미세조류의 결빙방지 활성을 처음으로 확인한 것이다.

또한 본 발명은 피라미모나스 젤리디콜라의 계통 분류학적 지위를 알아보고자 18S rRNA의 유전자 염기서열을 분석하였다. 일반적으로 18S rRNA는 종에 따라 특이서열을 가지고 있으므로 분류에 널리 이용되고 있다 (Nelson et al. (2001) Cryptogamie Algologie 22: 263-284).

본 발명은 피라미모나스 속 미세조류를 이용하여 결빙방지 물질을 대량으로 수득하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 결빙방지 물질을 대량으로 수득하는 방법은 ⅰ) 피라미모나스 속 미세조류를 배양배지에 접종하는 단계; ⅱ) (i)을 0 내지 +5℃에서 배양하는 단계; 및 ⅲ) (ⅱ) 단계로부터 배양액을 수득하는 단계를 포함한다.

배양용 배지로는 조류 (algae)의 배지 모두가 이용가능하나 ASW 배지, Aquil 배지 (Price, N. M. et al . (1988/89) Biol. Oceanogr. 6:443-462), F/2 배지 (Guillard, R. R. P et al . (1962) Com. J. Microbiol. 8:229-239), F/5 배지 , F/10 배지 및 이들을 변형한 배지로 이루어진 군에서 선택하여 사용하는 것이 바람직하다. 또한 성장률의 급격한 감소 및 사멸 등의 이유로 ASW (artificial sea water) 배지보다는 남극 해수를 포함하는 F/2 배지에서 배양하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 (ⅱ) 단계의 배양온도는 조건은 -3 ~ +7.5℃에서 배양가능한데, 0 ~ +5℃에서 배양하는 것이 바람직하다. 극지 미세조류는 호냉성 이므로 7℃ 이상의 온도에 장기간 노출되면 세포가 사멸하기 때문에 세포의 배양온도는 매우 중요하다. 저온 배양시 세포의 성장률은 다소 감소하나 세포가 AFPs 또는 IBPs의 합성을 촉진한다.

배양 시간에는 제한이 없으나 세포가 지수성장기 (exponential growth stage) 후반부 또는 정지기 (Stationary Phase) 초기까지 배양하는 것이 바람직하다. 배양 조건으로는 12 ~ 24시간 광주기로 맞추는 것이 바람직하다.

구체적으로 최대 배양이 이루어지게 하기 위해서 배양조건을 +2 ~ +4.5 ℃에서 24시간 광주기로 14일 이상으로 하는 것이 바람직하며, 세포가 광원과 접할 수 있는 확률을 높여주고 가스 교환이 잘 일어날 수 있도록 교반하여 배양하는 것이 바람직하다.

상기 ⅲ) 단계의 배양액은 미생물을 분리해낸 후 수득한 것을 말한다. 즉 본 발명의 피라미모나스 속 극지 미세조류는 결빙방지 물질을 생산하여 분비하므로 배양액을 획득하여 결빙방지 물질을 대량으로 확보할 수 있다. 미생물을 분리해 낸 후 배양액을 수득하는 방법으로는 원심분리, 필터링 또는 사이펀 (siphon)을 이용하여 미생물을 배양액으로부터 제거할 수 있다.

본 발명에 따른 피라미모나스 속 극지 미세조류는 AFPs 또는 IBPs를 생산하여 세포외로 분비하기 때문에, 특히 세포를 파쇄하지 않고 연속 배양하면서 AFPs 또는 IBPs를 수득할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 피라미모나스 젤리디콜라 미세조류를 이용하여 결빙방지 물질을 대량으로 수득하는 또 다른 방법은 ⅰ) 피라미모나스 젤리디콜라의 AFPs를 코딩하는 유전자를 이용하여 다른 원핵생물이나 진핵생물을 유전적으로 변형시키는 단계; 및 ⅱ) 상기 형질전환체를 배양하여 이로부터 AFPs를 대량으로 수득하는 단계를 포함한다.

이 때 상기 ⅰ) 단계의 피라미모나스 젤리디콜라의 AFPs를 코딩하는 유전자의 서열에 대한 정보는 본 발명에 따른 피라미모나스 젤리디콜라가 분비하는 단백질의 아미노산 서열을 분석하여 인위적으로 합성할 수 있다.

또한 본 발명은 시료에 피라미모나스 속 미세조류 또는 그 배양액을 첨가하여 일정 온도에서 시료의 융해과정에서 재결정화를 방지하는 방법을 제공한다.

이 때 상기 일정 온도라 함은 시료 어는점 (주로 0 ℃임) 보다 0 - 10℃ 낮은 온도를 말한다. 이러한 온도에서 피라미모나스 속 미생물이 생산한 결빙방지 물질은 얼음이 재결정화 되는 것을 저해하여 시료의 결빙을 저해한다.

상기 시료로는 냉동 식품, 약품, 농화학제, 색소 및 생물학적 재료 등을 포함한다. 이 때 냉동식품으로 아이스크림, 냉동 과일, 정육 등 낮은 온도에서 보관이 필수적인 식품을 말한다.

구체적으로 아이스크림, 얼려먹는 요거트, 아이스블렌드, 슬러리 등의 냉동 디저트류에서 AFPs는 시료의 어는 점 이하의 온도에서 얼음 재결정화로 인해 큰 얼음 결정이 생성되는 것을 방지함으로써 냉동식품의 얼음 결정 구조를 미세하게 유지하여 냉동식품의 맛과 질을 향상시킨다.

또한 냉동 과일, 냉동 야채 및 정육 등의 냉동 혹은 저온보관 식품에서 냉동 상태에서 융해되면서 큰 결정이 형성되어 식품의 원상태가 파괴됨으로써 식품의 맛과 질이 현저히 떨어지는데 AFPs가 재결정화를 저해함으로써 이를 방지해준다.

혈장 및 조직 배양을 위한 포유동물 세포 등과 같은 생물학적 재료에는 냉동과 해동 과정이 세포의 생존을 크게 감소시키는데, 장기 이식 시에도 조직을 냉동시키면 조직의 기능을 심각하게 손상시킨다. 식물의 냉해는 농업에 심각한 문제를 발생시킬 뿐 아니라, 약물은 엄격한 온도 조건에서 보존되지 않으면 약효가 파괴되거나 오히려 위험해질 수 있다. 이러한 경우 AFPs는 얼음 재결정 저해 활성을 통하여 생물학적 시료가 급격한 온도 변화에 저항할 수 있게 해 준다.

본 발명에 따른 피라미모나스 속 극지 미세조류는 저온환경을 극복하기 위한 기작중 하나로서 얼음에 결합하는 특성을 갖는 유사 결빙방지물질을 분비하는 것으로 확인되었다.

따라서 상기 미생물을 배양하여 결빙방지 물질을 대량으로 수득할 수 있고, 피라미모나스 속 미세조류 혹은 그 배양액은 의료, 군수, 냉동식품 산업 및 냉해방지를 위한 농작물 저장법등 다양한 산업에 결빙방지 첨가제로서 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위가 이에 한정되지 않음은 자명하다.

<실시예 1> 미세조류의 분리와 배양

북극 스발바드 군도 주변 해역에서 채집한 미세조류는 즉시 냉암소에 보관하여 실험실로 운반하였다. 이들을 현미경아래에서 파스퇴르 파이펫을 이용하여 한 개의 세포들로 분리 (isolation) 하였다. 분리된 세포들은 세척 (washing)을 하여 이물질을 제거하고, 100㎍ 페니실린으로 처리하여 무균상태의 미세조류를 획득하였고 이를 피라미모나스 속 KOPRI AnM0046 로 명하였다.

상기에서 분리한 단일 세포들을 우선 F/10 배지와 F/5 배지로 세척한 뒤, 121℃, 1.5 기압에서 20분간 멸균한 F/2 배지 (Guillard, R. R. L. and J. H. Ryther (1962) Com. J. Microbiol., 8: 229-239)에서 장기간 배양하였다.

모든 배양은 동일한 조건인 2℃ 배양기 (incubator)에서 행하였으며, 한국해양연구원 부설 극지연구소로 운반된 종은 +2 ℃ 저온배양기에서 계속적으로 배양되고 있다.

<실시예 2> 미세조류의 동정과 분류

형태학적인 종의 동정을 위하여 시료를 산으로 처리한 후, 전자현미경 (SEM, Philips 515)으로 관찰하였다. 그 결과 채집한 미세조류는 피라미모나스 젤리디콜라 (Pyramimonas gelidicola) 로 확인되었다(도 1 참조). Pyramimonas gelidicola는 아원통형이며, 길이는 8 - 18 ㎛, 지름 7 - 9 ㎛이다. 몸통은 세 종류의 껍질을 갖고 있다. 외부에는 왕관모양의 껍질이며 내부로는 닫힌 상자형태의 껍질이고 다른 하나는 족적형태의 껍질이다. 편모는 가늘며, 세포의 몸통의 길이보다 더 길다. 입모양의 엽록소 1개를 갖고 있으며 안점이 있는 피레노이드를 포함하고 있다 (McFadden G. I. and Wetherbee R. 1982 Protoplasma 111(1) 79-82).

분자적 동정은 다음과 같이 시행하였다. 지수 성장기에 있는 미세조류 일부를 채취하여 전체 유전자를 추출한 다음, 18S rRNA 유전자를 Polymerase Chain Reaction으로 증폭하여 그 염기서열을 분석하였다. 구체적인 분석방법은 세포를 원심분리기를 통해 수확한 뒤 0.1 M tris-buffer로 씻어주고, vortexing 하여 세포를 깨고 전체 DNA 추출 키트 (genomic DNA extraction kit)를 이용하여 순수 DNA를 얻었다. 추출한 DNA는 PCR을 통해 18S rRNA 만을 증폭시켜서 벡터에 클로닝 하였다. 18S rRNA를 포함하고 있는 벡터를 소량 정제한 다음 염기서열분석법으로 18S rRNA의 일부 염기 서열을 획득하였다(도 2 참조). 그 결과, 피라미모나스 속 KOPRI AnM0046 (Pyramimonas sp. KOPRI AnM 0046)의 18S rRNA 염기서열이 NCBI에 등록된 EU141942과 일치함을 확인하였다.

<실시예 3> 배양 종의 저온적응성 측정

실시예 1에서 분리된 종의 결빙방지물질 합성 여부는 종을 배양한 배지를 이 용해 결빙방지 활성을 측정함으로서 결정할 수 있다. 배양되는 종의 저온적응 기작의 존재 여부를 판단할 수 있는 가장 기본적인 방법은 최적 배양온도보다 낮은 온도에서 배양을 실시하여 비교하여 보는 것이다.

실시예 1에서 분리한 종을 - 2.5 ℃와 18.5 ℃와 같은 온도 폭을 가진 북극 환경 조건에 따라 연속 배양하면서 피라미모나스 sp. KOPRI AnM 0046 성장 패턴을 분석하였다. 성장패턴 분석방법으로는 식물플랑크톤의 생물량 지수가 되는 클로로필(Chl a) 농도 측정법을 사용하였다. 클로로필의 농도는 Fluorometer (10-AU)를 이용한 형광분석을 통해 측정하였다.

배양 결과를 보면 -2.5 ℃에서 +4.5 ℃까지 배양이 모두 지속적으로 이루어 졌으며 +4.5 ℃ 부근에서 최대 배양이 이루어졌으며, -2.5 ℃에서는 최대배양까지 2일이 더 소요되었다(도 5 참조).

<실시예 4> 배양 종의 결빙방지 활성 측정

실시예 1에서 분리한 북극 미세조류 피라미모나스 속 균주가 유사결빙방지 물질 (Antifreeze like ice-binding molecules, IBMs)을 합성하는지 관찰하기 위하여 2주간 2℃에서 배양 뒤 세포는 원심분리기를 통해 분리해내고 배양액의 결빙방지 활성을 측정하였다. 측정방법은 레이몬드의 방법을 변형하여 사용 하였다 (Raymond (2000) Polar Biology 23:721-729). 레이몬드 법은 배양된 시료를 이용하지 않고 현장에서 채집한 mixed population에서 측정을 하였기 때문에 배양액을 이용한 결빙방지 활성을 측정할 수 없었다. 본 실험을 통해서는 배지를 분리하고 배지의 염분을 측정한 뒤 레이몬드의 방법과 동일하게 측정하였다. 대조구로 남극 미 세조류인 Fragilaria striatula을 이용하였다.

그 결과 본 발명에 기술한대로 배양한 피라미모나스 속 균주의 경우, 세포외로 결빙방지 활성 물질을 분비하는 것으로 밝혀졌다. AFPs나 IBPs에 의하여 생기는 골이 넓은 분포로 관찰되어 결빙방지 활성이 높은 것으로 확인되었으며 이 종은 AFPs나 IBPs를 합성하는 것으로 밝혀졌다 (도 4a 참조). 반대로 대조구인 Fragilaria striatula 는 AFPs나 IBPs에 의한 ice pitting 이 발견되지 않아 결빙방지 활성이 낮거나 없는 것으로 보인다(도 4b 참조).

도 1a 및 1b는 결빙방지 활성을 가진 피라미모나스 젤리디콜라 (Pyramimonas gelidicila; KOPRI AnM 0046)의 전자현미경 사진이다.

도 2는 피라미모나스 젤리디콜라의 SSU 부분 염기 서열 데이터이다.

도 3은 18S rRNA 염기서열을 바탕으로 한 피라미모나스 젤리디콜라의 분류학적 위치를 나타내는 도면이다.

도 4a는 피라미모나스 젤리디콜라의 결빙방지능을 보여주는 도면이고, 4b는 대조군인 프라질라리아 스트리아튤라(Fragilaria striathla)의 도면이다.

도 5는 피라미모나스 젤리디콜라의 최적 성장 온도를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

Claims (6)

1. 피라미모나스 젤리디콜라(Pyramimonas gelidicola; KCTC 11115BP) 또는 그 배양액을 포함하는 결빙방지용 첨가제인 결빙방지용 첨가제.
2. (ⅰ) 피라미모나스 젤리디콜라(Pyramimonas gelidicola; KCTC 11115BP)를 배양 배지에 접종하는 단계;

   (ⅱ) (i)을 0 내지 +5℃에서 배양하는 단계; 및

   (ⅲ) 상기 (ⅱ)단계로부터 배양액을 수득하는 단계를 포함하는 피라미모나스 젤리디콜라를 배양한 배양액을 결빙방지 물질로서 대량으로 수득하는 방법.
3. 제2 항에 있어서, 상기 (ⅰ) 단계의 배양배지는 ASW 배지, Aquil 배지, f/2 배지, f/5 배지, f/10 배지 또는 이들의 변형배지로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 방법.
4. 시료에 피라미모나스 젤리디콜라(Pyramimonas gelidicola; KCTC 11115BP) 또는 그 배양액을 첨가하여 일정 온도에서 시료의 결빙을 방지하는 결빙방지 방법.
5. 제4 항에 있어서, 상기 일정 온도는 시료 혹은 시료보관을 위한 용액의 어는점보다 0 내지 10°낮은 온도인 결빙방지 방법.
6. 제4 항에 있어서, 상기 시료는 식품, 약품, 색소, 농화학제 및 생물학적 재료로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 방법.

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