KR20090039275A - 인공피부 배양액 첨가제 및 인공피부 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 인공피부 배양액 첨가제 및 인공피부 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 인공피부를 배양하여 제조함에 있어서, 세포의 분화를 촉진시키고, 기저막 형성을 촉진하는 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 배양액에 첨가하는 인공피부 배양액 첨가제와 이를 사용하는 인공피부 제조방법에 대한 것이다.

인공피부, KGRKR

Description

인공피부 배양액 첨가제 및 인공피부 배양방법 {ADDITIVE FOR CULTURE MEDIUM FOR ARTIFICIAL SKIN AND CULTIVATION PROCESS USING THE SAME}

본 발명은 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 인공피부 배양액 첨가제 및 인공피부 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 인공피부를 배양하여 제조함에 있어서, 세포의 분화를 촉진시키고, 기저막 형성을 촉진하는 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 배양액에 첨가하는 인공피부 배양액 첨가제와 이를 사용하는 인공피부 제조방법에 대한 것이다.

피부는 최상부의 표피와 표피 아래층에 존재하는 진피로서 이루어져 있으며, 표피는 각질형성세포가 대부분을 차지하는 중층 편평상피로서 진피로부터 기저층, 유극층, 과립층, 각질층 순의 4층으로 이루어져 있다. 기저층에서 각질형성세포의 분열이 일어난 후 각질형성세포는 피부의 표면으로 이동하면서 여러 단계의 분화과정을 거치게 된다.

이러한 피부가 화상을 입거나 피부궤양 등의 경우에 피부이식을 위해서 인공피부가 개발되었다. 현재 개발되어 있는 인공피부 모델 배양방법 가운데 대표적인 예는 섬유모세포가 포함된 콜라겐 기질 위에서 인체 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법(living skin equivalent, LSE)이 있다(Bell E et al, J Invest Dermatol.1983;81:2s-10s). 인공피부 배양방법이 발전함에 따라 인공피부는 형태학적으로 인체 피부와 매우 유사할 뿐만 아니라 생화학적으로, 그리고 기능적으로 인체피부와 상당히 유사해 졌다 (Asselineau D et al, J Invest Dermatol.1986;86: 181-186; Ponec M. Toxicol in Vitro. 1991;5: 597-606 ; Ponec M et al, J Invest Dermatol. 1997;109: 348-355).

배양액은 원하는 세포나 조직을 인공적으로 배양할 때 생장에 꼭 필요한 다량원소와 미량원소 (유기물과 무기물)로 이루어진 영양공급원으로서 쓰이는 것을 말한다. 세포의 화학성분은 다양하여 어떤 세포는 단백질을 많이 함유하고 있는 반면 어떤 세포는 단백질의 함량이 매우 적다. 어떤 세포는 다량의 지방질을 함유하는 등 다른 세포에서는 볼 수 없는 독특한 형태를 취하고 있으나 뇌세포에는 지방이 함유되어 있지 않다. 세포는 세포를 구성하고 있는 화학성분에 따라 요구하는 영양소도 다르며 필요한 모든 영양소는 체액을 통해서 공급된다. 각 세포는 영양적 요구가 각각 다르다. 그러므로, 세포마다 배양액의 조성이 각기 다르며 자기 배양액에서만 생존, 번식할 수 있다. 만일 배양액의 조성이 부적당하면 세포는 죽거나 혹은 생존은 가능하지만 번식이 불완전 내지 불가능하게 된다.

인공피부의 배양과 관련하여 첨가제로서 성장인자가 널리 사용되고 있으며, 성장 인자는 특정 표적 세포군의 광범위한 생물학적 반응, 즉 DNA 합성, 세포 분열, 특이한 유전체의 발현 등을 일으키는 폴리펩티드이다. 다수의 상이한 성장 인자군은 전이 성장 인자 베타군(TGF-βs), 상피 성장 인자와 전이 성장 인자 알파 군(the TGF-αs), 혈소판 유래 성장 인자(PDGFs), 섬유원 세포 성장 인자군(FGFs) 그리고 인슐린 유사 성장 인자-I과 인슐린 유사 성장 인자-II를 포함하는 인슐린 유사 성장 인자군(IGFs)으로 구분된다.

그 중에서 인슐린유사 성장인자는 인슐린과 유사한 활성을 가지며, 신경 조직 세포의 분열을 발생하게 하는 물질이다. 대부분의 모든 인슐린 유사 성장 인자는 인슐린 유사 성장 인자-I, 인슐린 유사 결합 단백질-3, 산 분해성 서브유닛 (ALS)으로 명명된 좀 더 넓은 범위의 단백질 서브유닛으로 이루어진 비공유결합적 복합체를 형성하여 체내를 순환한다. 따라서, 유리된 인슐린 유사 성장 인자-I은 거의 발견되지 아니한다. 삼원 복합체는 몰랄 농도가 각각 같은 세 종류의 성분으로 구성된다. 비록 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3이 인슐린 유사 성장 인자가 없이도 쥐의 산 분해성 서브유닛와 결합할 수 있다는 몇몇 보고가 있지만(Lee et al., Endocrinology 136:4982-4989, 1995), 산 분해성 서브유닛은 인슐린 유사 성장 인자와 직접 결합하지 않고 인슐린 유사 성장 인자/인슐린 유사 성장 인자결합 단백질-3 복합체에 결합하여서만 나타난다 (Baxter et al., J. Biol. Chem 264(20):11843-11848, 1989).

인슐린 유사 성장 인자/인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3/산 분해성 서브유닛의 삼원소 복합체의 분자량은 약 150kDa이다. 이 삼원소 복합체는 "유리 인슐린 유사 성장 인자 농도의 급속한 변화를 차단하는 인슐린 유사 성장 인자-I과 인슐린 유사 성장 인자-II의 저장소나 완충용액"(Blum et al.(1991), " 혈장내의 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3의 수준을 나타내는 임상적 지표" in MODERN CONCEPTS OF INSULINE-LIKE GROWTH FACTORS, pp. 381-393, E.M. Spencer, ed., Elsevier, New York)으로 작용한다고 여겨진다.

순환계에는 초과량의 결합하지 않은 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3은 존재하지 않는 반면 초과량의 유리 산분해성 서브유닛은 상당량 존재한다(Baxter, J.Clin. Endocrinol. Metab. 67: 265-272, 1988).

인슐린유사 성장인자 결합 단백질 (insulin like growth factor-binding protein, IGFBP) 은 6가지 종류가 있으며 인슐린유사 성장인자(insulin like growth factor)와 결합한다(Firth SM and Baxter RC. Cellular actions of the insulin-like growth factor binding proteins. Endocrine Reviews 23(6):824-54, 2002/ Sitar T, Popowicz GM, Siwanowicz I, Huber R, Holak TA. Structural basis for the inhibition of insulin-like growth factors by insulin-like growth factor-binding proteins. PNAS 103(35): 13028-33).

이 가운데 IGFBP-3와 IGF-1 수용체가 피부의 기저층과 증식층에서 발현됨으로 IGFBP-3가 표피에서 중요한 작용을 하는 것으로 알려지고 있다 (EdmondsonSR, Thumiger SP, Kaur P et al. Insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3) localizes to and modulates proliferative epidermal keratinocytes in vivo. Br J Dermatol 152(2):225-30, 2005).

IGFBPs는 IGF의 생체활성, 분포 등을 조절하는데 IGF와의 결합은 N과 C-말단의 양쪽 끝에 위치하는 것으로 알려져 있으며 이 부분이 분해되면 (proteolytic cleavage) 결합능력이 낮은 N과 C-말단 조각을 만들어 IGF 수용체와 경쟁하지 못한 다는 사실이 알려져 있다 (Bunn RC, Fowlkes JL. Insulin-like growth factor binding protein proteolysis. Trends Endocrinol Metab 14(4):176-81, 2003). 그러나 최근 연구에 의하면 분해된 N과 C-말단 조각이 여전히 IGF의 작용을 억제하며 때로는 전혀 새로운 작용을 함이 보고되고 있다(J. Biol. Chem., Vol. 279, Issue 51, 53232-53240, December 17, 2004). 특히, KGRKR은 Lys-Gly-Arg-Lys-Arg 아미노산 서열을 갖는 IGFBP-3의 C-말단부로 단독 효능은 알려진 바 없다.

특허출원공개 제2003-0063344호의 청구항 제17항에서 아미노산 서열 KGRKR을 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 단백질 복합체(발명의 명칭: 성장인자 복합체)를 제시하고 있지만, 이는 헤파린 결합도메인(HBD)과 비트로넥틴의 복합체를 공개하고 있는 것이며, HBD의 특성을 한정하고 있다. 이 특허출원공개(제2003-0063344호)는 근본적으로는 청구항 제1항에 기재된 바와 같이 성장인자 결합단백질과 비트로넥틴을 포함하는 분리된 단백질 복합체를 제공하는 것을 목적으로 하므로, 본 발명이 목적으로 하는 KGRKR 펩티드의 단독적인 효과를 규명하고 있지 아니하다. 결론적으로 본 발명은 인공피부의 배양시에 세포의 분화 촉진 및 기저막 형성을 촉진하는 KGRKR 펩티드의 효과를 규명한 것이다.

본 발명자들은 IGFBP-3의 C-말단부 펩티드인 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 인공피부 배양액 첨가제로서 사용되면 인공피부의 분화에 도움이 되고 기저막 형성도 촉진시키는 효과를 나타낸다는 사실을 구체적으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 기본적인 목적은 인공피부 배양액 첨가제로서, KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 인공피부의 세포 분화를 향상시키고 기저막 형성을 촉진시키는 효과를 갖는 배양액 첨가제를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 인공피부를 배양하여 제조함에 있어서,KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 배양액에 첨가하는 것을 특징으로 하는 인공피부 배양을 위한 신규한 방법을 제공하는 것이다.

첫째,본 발명의 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 갖는 첨가제를 사용하면 인공피부 배양시 세포의 분화를 개선시키고 기저막 형성을 촉진시켜 물성과 내구성이 향상된 인공피부를 보다 용이하게 배양할 수 있다.

둘째, 본 발명의 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 갖는 첨가제를 화상, 창상 및 피부궤양 더 나아가 당뇨병성 족부궤양 등의 피부이식에 사용할 경우 우수한 효과를 나타낼 수 있어서, 의학적 이식 용도로 매우 유용할 뿐 아니라, 피부 독성 검사 등의 각종 피부 실험용으로도 적용 가능하다.

전술한 본 발명의 기본적인 목적은 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 인공피부 배양액 첨가제를 제공함으로써 달성될 수 있다. 인공피부 배양액 은 피부의 기저세포를 배양해 인공피부를 만드는 데는 사용되는 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 하고, 다시 특수한 목적을 위한 물질을 넣어 혼합한 것을 말한다. KGRKR은 IGFBP-3의 C-말단부로, 인공피부 배양시 분화를 개선시키고 기저막 형성 촉진의 효과를 갖는다. 본 발명은 이러한 KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함한 인공피부 배양액 첨가제로 하는 것이다.

전술한 본 발명의 또 다른 목적은 인공피부를 배양하여 제조함에 있어서, KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 배양액에 첨가하는 것을 특징으로 하는 인공피부 배양 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.

현재 개발되어 있는 인공피부 모델 배양방법 가운데 대표적인 예는 섬유모세포가 포함된 콜라겐 기질 위에서 인체 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법

(living skin equivalent, LSE)이다.

본 발명에서 인공피부를 배양하기 위한 목적으로 섬유모세포가 포함된 콜라겐으로 구성된 진피 대응물 위에 각질형성세포를 배양하여 수득한 인공피부는 형태학상으로 인체 피부의 표피와 매우 유사하게 기저층, 유극층, 과립층, 각질층을 갖는 중층의 표피이다.

이를 위하여 피부조직으로부터 섬유모세포 및 각질형성세포를 분리하여 배양하고, 콜라겐 기질에 섬유모세포를 첨가하여 진피 대용물을 제조하고, 상기 진피 대용물 상에 각질형성세포를 접종하고 배양하는 단계를 포함한다.

상기 섬유모세포 및 각질형성세포는 인간을 포함하는 포유류의 피부 조직으로부터 분리 및 배양한 것이 바람직하다.

상기 진피 대용물 제조 단계에 있어서, 콜라겐 mL 당 섬유모세포 10,000 내지 100,000,000 개를 혼합하는 것이 바람직하다.

각질형성세포는 상기 진피 대용물 상에 배양하며, 생체 피부와 동등 내지 유사한 성상의 피부를 만들기 위하여, 상기 진피 대용물 1 개 (6 ㎠) 당 각질형성세포 10,000 내지 100,000,000개를 접종 및 배양하는 것이 바람직하다.

상기 각질형성세포 배양 단계에 있어서, 배양 조건은 일반적인 생체 세포배양 조건을 따르며, 배지 또한 생체 세포배양에 사용 가능한 것이면 특별한 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, 배양 온도는 37℃로 하고, 배양 기간은 7 내지 10일 동안으로 한다. 본 발명에 있어서, 각질형성세포의 배양은 초기 16 내지 24 시간 동안은 배지에 침지시켜 배양하고, 그 후에는 공기 중에 노출시켜 배양하는 것이 좋다.

이하, 다음의 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리 범위를 이들 실시예에 기재된 내용으로 한정하거나 제한 해석하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 섬유아세포와 각질형성세포의 배양

각질형성세포와 섬유아세포는 어린아이의 포경수술을 통하여 얻어진 포피에서 분리하였다. 피부조직에서 잔여 피하지방을 제거 후 잘게 절개하여 서몰리신 (thermolysin) 용액에서 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응시킨 조직을 핀셋을 이 용하여 표피와 진피로 분리하여 각 각을 트립신용액에 담아 37℃에서 15분간 반응 후 단일 세포로 분리되도록 진탕하였다. 배양은 'Rheinwald and Green (Cell, 1975)'의 방법을 따라 수행하였다. 분리한 각질형성세포는 각질형성세포 성장 배지(KGM, Clonetics, San Diego, CA, USA)에서 배양하였고, 섬유모세포는 10% 소의 혈청이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco, N.Y., USA)에서 배양하였다. 각질형성세포 및 섬유아세포 배양시, 배양 온도는 37℃, 배양 기간은 7일 내지 10일로 하였다.

실시예 2: 진피 대용물의 제조

진피보형물은 쥐꼬리로부터 분리 채취한 콜라겐 10 g을 4℃의 1/1000 빙초산(glacial acetic acid) 용액 1000 mL에 48시간 동안 교반하여 녹인 I형 콜라겐 용액과 10 x DMEM과 완충액(0.05 N NaOH, 0.26 mM NaHCO3, 및 200 mM HEPES)을 8:1:1 (부피비)로 혼합하여, 콜라겐 기질을 제조하였다. 이와 같이 얻어진 콜라겐 기질 3.5 mL를 밀리셀(millicell)에 나누어 넣고, 각 밀리셀 당 섬유아세포 5x105 개를 첨가하여 혼합하였다. 그리고 나서, 상기 혼합액을 30 mm의 밀리셀에 3.5 ml씩 넣어 37℃, 5% CO2 배양기에서 굳히는 과정으로 진피 대용물을 제조하였다.

실시예 3: 인공피부의 구축

상기 실시예 2에서 제조된 진피 대용물 6 ㎠ 위에 1x106 개의 각질형성세포를 접종하고, 1일간 배지 침지시켜 배양한 다음 다시 12일간 공기에 노출시켜 배양 하였다. 이때, 배양 온도는 37℃로 하였다. 상기 배지는 5 % FBS, 0.4 mg/ml 하이드로코르티손, 1 mM 이소프로테레놀, 25 mg/ml 아스코르빈산 및 5 mg/ml 인슐린이 포함된 DMEM 배지와, 함스 영양 혼합물 F12(Ham's nutrient mixture F12)을 3:1의 비율로 혼합한 혼합 용액을 사용하였다. 1일간 침지 배양시에는 저농도 EGF (Epidermal Growth Factor, Invitrogen, carlsbad, CA, 1 ng/ml)를 첨가하였고, 12일간의 공기 노출 배양시에는 고농도 EGF (10 ng/ml)를 첨가하였다. 배지는 일주일에 3회 교환하였고, 상기 실험은 동일조건으로 최소 2번 반복 실시하였다. 이러한 기본 조건에 아스코르빈산 (25ug/ml, Sigma, St Louis, USA)을 첨가하였으며 그 외 실험조건에는 rh-IGFBP-3 (200 ng/ml, #675-B3, R&D Systems, MN, USA), KGRKR (30 mg/ml, Thermo Electron GmbH, Germany)을 각각의 조건에 맞도록 첨가하였다. 배양 후, 얻어진 조직을 카르노이스 용액(Carnoy's solution, ethanol/ chloroform/ acetic acid 6:3:1)으로 고정시키고, 파라핀 블록으로 제조하여, 헤마톡실린과 에오신으로써 염색하였다 (Sigma chemical, St. Louis, USA). 상기 염색 결과를 도 1에 나타내었다.

실시예 4: 면역조직화학 염색

면역조직화학 염색의 일차항체로서 involucrin, filaggrin (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)에 대한 항체를 이용하였다. 면역조직화학 염색은 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합 기법(avidin-biotin-peroxidase complex techniques)을 사용하여 수행하였다. 4주 간 배양한 면역조직화학염색에서 인볼루 크린(involucrin)과 필라그린(filaggrin)의 발현양상을 비교해 보았다. 인볼루크린(involucrin)과 필라그린(filaggrin)은 표피분화와 연관된 표지자로 알려져 있다.

2주 간 배양시킨 결과인 도 1에서 모델 간의 큰 차이는 없는 것으로 생각되었다. 그러나 4주 간 배양시킨 결과를 살펴보면 대조군과 IGFBP-3 군의 각질층에서 핵이 관찰되어 파라케라토시스(parakeratosis)가 일어나고 있음을 보여주고 있으며 반면 KGRKR 모델의 각질층에서는 핵을 관찰할 수 없었다. 또한 인볼루크린 (involucrin)과 필라그린 (filaggrin)의 발현양상을 비교해 보면 인볼루크린(involucrin)의 발현이 대조모델과 IGFBP-3 처리 모델에서 비교적 넓게 특히 각질층에서 염색이 된 반면에 KGRKR 모델에서는 기저층과 각질층이 거의 염색되지 않아 분화상태가 좋음을 알 수 있었으며 대조군에 비하여 필라그린 (filaggrin)의 발현도 확연하게 관찰되었다.

특히 중요한 점은 도 3에서 볼 수 있듯이 인테그린 베타-1 (integrin beta-1)과 인테그린 알파-6 (integrin alpha-6)의 발현이 다른 모델에 비하여 높게 나타났다. 인공피부는 기저막 형성에 장애가 있는 것으로 알려져 있으므로 이 모델은 이러한 단점을 크게 개선하였고 기계적 물성이나 내구성도 개선되었다.

도 1은 섬유모세포(Fb)를 포함하는 인공피부(control), IGFBP-3를 첨가하여 배양한 인공피부 (IGFBP-3), 본 발명의 KGRKR을 첨가하여 배양한 인공피부 (KGRKR)를 비교하여 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 모습을 보여주는 사진이다.

도 2는 섬유모세포(Fb)를 포함하는 인공피부, IGFBP-3를 첨가하여 배양한 인공피부, 본 발명의 KGRKR을 첨가하여 배양한 인공피부를 비교하여 분화표지자인 인볼루크린(involucrin), 필라그린(filaggrin)의 분포를 항원항체반응으로 염색한 모습을 보여주는 사진이다.

도 3은 섬유모세포(Fb)를 포함하는 인공피부, IGFBP-3를 첨가하여 배양한 인공피부, 본 발명의 KGRKR을 첨가하여 배양한 인공피부를 비교하여 인티그린 (integrin)의 분포를 항원항체반응으로 염색한 모습을 보여주는 사진이다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION <120> ADDITIVE FOR CULTURE MEDIUM FOR ARTIFICIAL SKIN AND CULTIVATION PROCESS USING THE SAME <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Gly Arg Lys Arg 1 5

Claims (14)

1. KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 인공피부 배양액 첨가제.
2. 제1항에 있어서, 상기 인공피부가 콜라겐 기질과 섬유아세포를 포함하는 진피인 것임을 특징으로 하는 인공피부 배양액 첨가제.
3. 제1항에 있어서, 상기 인공피부가, 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000개를 포함하는 진피 대용물인 것임을 특징으로 하는 인공피부 배양액 첨가제.
4. 제1항에 있어서, 상기 인공피부가, 콜라겐 기질 및 섬유모세포를 포함하는 진피 대용물 또는 상기 진피 대용물 상에 배양된 각질형성 세포를 포함하는 인공피부인 것임을 특징으로 하는 인공피부 배양액 첨가제.
5. 제4항에 있어서, 상기 인공 피부의 상기 각질형성세포가 상기 진피 대용물 개당 10,000 내지 100,000,000개인 인공 피부인 것임을 특징으로 하는 인공피부 배양액 첨가제.
6. 제1항에 있어서, 상기 인공피부가, 피부 연구 또는 피부 독성 검사에 사용되는 인공피부를 포함하는 것임을 특징으로 하는 인공피부 배양액 첨가제.
7. 제1항에 있어서, 상기 인공피부가, 의학적 이식용으로 사용되는 인공피부를 포함하는 것임을 특징으로 하는 인공피부 배양액 첨가제.
8. 인공피부를 배양하여 제조함에 있어서, KGRKR 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 배양액에 첨가하는 것을 특징으로 하는 인공피부 배양 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 인공피부가 콜라겐 기질과 섬유아세포를 포함하는 진피인 것임을 특징으로 하는 인공피부 배양 방법.
10. 제8항에 있어서, 상기 인공피부가, 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000개를 포함하는 진피 대용물인 것임을 특징으로 하는 인공피부 배양 방법.
11. 제8항에 있어서, 상기 인공피부가, 콜라겐 기질 및 섬유모세포를 포함하는 진피 대용물 또는 상기 진피 대용물 상에 배양된 각질형성 세포를 포함하는 인공피부인 것임을 특징으로 하는 인공피부 배양 방법.
12. 제8항에 있어서, 상기 인공피부의 상기 각질형성 세포가 상기 진피 대용물 개당 10,000 내지 100,000,000개인 인공피부인 것임을 특징으로 하는 인공피부 배양 방법.
13. 제8항에 있어서, 상기 인공피부가, 피부 연구 또는 피부 독성 검사에 사용되는 인공피부를 포함하는 것임을 특징으로 하는 인공피부 배양 방법.
14. 제8항에 있어서, 상기 인공피부가, 의학적 이식용으로 사용되는 인공피부를 포함하는 것임을 특징으로 하는 인공피부 배양 방법.

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