KR20090038430A - 크로마토그래피 칼럼, 시스템 및 방법 - Google Patents

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클라우스 게바우어
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지이 헬스케어 바이오-사이언시스 에이비
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Abstract

본 발명은 축류 크로마토그래피 칼럼, 그러한 칼럼의 사용에 의한 액체 내의 하나 이상의 분석물의 분리를 위한 방법, 및 그러한 칼럼을 채용한 시스템에 관한 것이다. 칼럼은 제1 포트 및 제2 포트를 포함하고, 제1 포트 및 상기 제2 포트는 크로마토그래피 칼럼 상의 베드 공간의 수준 위에서 사실상 동일한 수준 또는 높이이다.
크로마토그래피 칼럼, 단부 유닛, 베드 공간, 포트, 필터

Description

크로마토그래피 칼럼, 시스템 및 방법 {Chromatography Columns, Systems and Methods}
본 발명은 축류 크로마토그래피 칼럼 및 그러한 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 액체 내에 존재하는 하나 이상의 분석물을 서로 분리하는 방법에 관한 것이다.
크로마토그래피는 화학적 및 생물학적 물질들을 분리하기 위한 잘 확립되고 가치있는 기술이고, 연구 및 산업에서 널리 사용되고 있으며, 화합물 준비, 정제 및 분석에 있어서 많은 용도를 찾을 수 있다. 많은 상이한 형태의 크로마토그래피가 있고, 액체 크로마토그래피는 단백질, 펩타이드, 및 핵산의 준비, 정제 및 분석을 위해 제약 및 생명공학 산업에서 특히 중요하다.
전형적인 액체 크로마토그래피 장치는 실질적으로 보통 입상이며 다공성 매체로 구성된 충진 재료의 베드(bed)가 투과성 보유 층에 대해 놓여 있는 직립 하우징을 갖는다. 액체 이동상이 보통 다공성의 천공된 필터, 메시 또는 프릿(frit)을 통해, 예를 들어 칼럼의 상부에서 입구를 통해 진입하고, 충진 재료의 베드를 통해 이동하고, 전형적으로 제2 필터, 메시 또는 프릿을 통해 출구를 거쳐 제거된다.
액체 크로마토그래피에서 사용되는 칼럼은 전형적으로 운반 액체 또는 이동 상이 유동하는 다공성 크로마토그래피 매체를 봉입하는 튜브형 본체를 포함하고, 물질 또는 분석물의 분리가 이동상과 다공성 매체의 고정상 사이에서 발생한다. 전형적으로, 다공성 매체는 보통 칼럼의 일 단부에 위치된 중심 보어 또는 노즐로부터, 칼럼 내로 펌핑되거나 부어지거나 흡입되는 슬러리로서 공지된, 개별 입자들의 현탁액을 고화시킴으로써 대체로 형성된, 충진된 베드로서 칼럼 내에 봉입된다. 안정되고 균등한 베드의 제작은 최종 분리 공정에 대해 중요하고, 최적 결과는 칼럼 단부를 통해 중심에 위치된 보어를 사용하여 제공된다. 그러한 안정되고 균등한 베드를 제작하기 위한 시스템이 본 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 단부 유닛에 의해 베드를 압축하는 것을 포함한다.
칼럼 충진에 이어서 그를 사용하기 전에, 칼럼을 펌프, 검출기 및 입구 및 출구 매니폴드를 보통 포함하는 크로마토그래피 시스템에 연결함으로써 설치하는 것이 필수적이다. 칼럼을 설치할 때, 칼럼에서의 액체의 유출을 회피하고, 아울러 각각 칼럼 및 충진된 베드 내로의 공기의 유입을 회피하는 것이 중요하다. 또한, 칼럼을 채용하는 시스템을 칼럼의 상류에서 공기를 소기시키는 것이 필수적일 수 있다. 전형적으로, 종래 기술의 칼럼 및 시스템은 칼럼의 일 단부, 보통 그의 기부의 밸브["통기(vent)" 또는 "소기(purge)" 밸브]에 의해 칼럼 설치 및/또는 소기 또는 통기를 달성한다.
실제로, 밸브는 칼럼과 함께 사용되고, 이는 칼럼이 밸브 상류에서 시스템에 연결되고 그로부터 분리되는 것을 의미한다. 일회용 칼럼에 대해, 그러한 추가의 밸브의 유입은 비용이 든다. 밸브의 위치에 의해, 밸브는 칼럼으로부터의 액체의 사이퍼닝(siphoning)의 위험 및 또한 추가의 공기가 칼럼 내로 유입될 가능성을 증가시킨다. 또한, 밸브의 위치는 칼럼을 실험실 내에 위치시키는 것에 대해 구속을 부여하고, 칼럼의 상부 및 바닥에 대한 접근이 요구되므로, 사용자 접근성의 관점에서 문제를 일으킬 수 있다.
JP 63293456호[세끼스이 케미컬즈 코.(Sekisui Chemicals Co.)]는 고정상과 함께 준비되고 기부에서 토출 개구를 그리고 상부에서 통기 장치를 갖춘 칼럼을 지지하기 위한 칼럼 홀더를 설명한다. 칼럼 홀더는 고정상 상에서의 재료의 크로마토그래피 분리를 용이하게 하기 위한 중력 또는 원심력의 인가 시에, 고정상 위에 잔류하는 임의의 잉여 유체가 공기가 칼럼 내의 고정상으로 진입하도록 허용하지 않으면서 제거될 수 있도록 설계된다. 토출 개구는 고정상 용액의 상단부와 동일하거나 더 높은 수준인 위치에서 분지되어, 3개의 개방 단부, 토출 개구와의 연결점에서의 제1 개방 단부, 용액의 표면 수준 위의 위치에 있는 제2 개방 단부 및 토출 개구의 수준 아래에 위치된 제3 개방 단부를 갖는 도관에 연결된다. 도관은 임의의 잉여 유체가 칼럼으로부터 제3 개방 단부를 통해 제거되어 수용 용기 내에 수집될 수 있도록 구성된다.
수년 간의 크로마토그래피 분야에서의 높은 수준의 활동에도 불구하고, 통기 밸브 또는 복잡한 칼럼 홀더에 대한 필요를 제거하고 공기가 칼럼으로 진입하고 그리고/또는 액체가 칼럼으로부터 사이퍼닝할 위험을 감소시키는 간단한 축류 칼럼에 대한 필요가 여전히 있다. 오늘날, 이러한 필요를 충족시키고 그리고/또는 개선된 사용자 접근성을 제공하는 축류 크로마토그래피 칼럼은 이용 가능하지 않다.
정의
"분석물(analyte)"은 천연 또는 합성 기원의 물질, 화합물 또는 화학 물질, 또는 이들의 반응 생성물 또는 유도체 또는 대사체로서 정의된다. 불확실성을 회피하기 위해, 상기 용어는 단백질, 펩타이드, 아미노산 및 핵산과 같은 생물학적 분자, 및 약물 및/또는 전구 약물과 같은 합성 분자를 포함한다.
"분배 채널(distribution channel)"은 유체를 단면 구역으로부터 크로마토그래피 매체의 충진된 베드를 위한 봉입체 또는 베드 공간으로 유입하는 구조물을 말한다.
일회용 칼럼은 일회용이 아닌 칼럼에서 요구될 설치 및 검정 작업을 감소시키기 위한 크로마토그래피 매체의 전처리를 특징으로 한다. 최소한, 전처리는 다공성 매체의 베드의 형성을 포함한다. 추가의 전처리는 미생물 존재량의 감소, 멸균, 발열 물질 제거 등일 수 있다.
일회용 칼럼은 1회 사용 칼럼으로서 사용될 수 있고, 이는 사용자가 반복 사용 전에 충진된 베드의 검정(예컨대, 시험, 평가 등)을 요구하는 세척 절차를 수행하지 않는다는 것을 의미한다.
일회용 칼럼의 일 실시예는 크로마토그래피 매체로 미리 충진되어 운송되는 완성된 칼럼이다.
일회용 칼럼의 다른 실시예는 충진된 베드에 대해 치수 안정성을 제공하기 위한 작업 중에 충진된 베드의 하나 또는 복수의 측표면 상에 가해지는 압력 및 하중에 저항하도록 설계된 프레임 또는 용기를 나타내는 제1 장치, 및 작동을 위해 제1 장치에 부착된 다공성 매체 또는 베드를 담는 용기, 쉘, 카트리지, 백(bag) 등을 나타내는 제2 장치로 구성된다. 후자의 실시예에서, 다공성 매체는 제2 용기 내에 담기고, 프레임에 재사용 가능할 때 교체될 수 있다. 이러한 경우에, 작동을 위해 요구되는 다공성 매체의 압축도는 담겨 있는 매체를 프레임 내로 삽입한 후에 조정될 수 있다[예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2002/0166816호(알렌 & 도슨(Allen & Dawson)] 및 WO 2005/009585호[시그마-알드리히 코.(Sigma-Aldrich Co.)) 참조].
"수준(level)"은 수평 평면 또는 규정된 높이로서 정의된다.
본 발명의 목적은 종래 기술의 시스템의 결점을 극복하는 크로마토그래피 칼럼을 제공하는 것이다. 이는 청구범위 제1항에서 정의되는 바와 같은 크로마토그래피 칼럼에 의해 달성된다.
그러한 크로마토그래피 칼럼에서의 하나의 장점은 칼럼으로부터의 사이퍼닝의 위험을 감소시킨다는 것이다.
본 발명의 다른 장점은 인접한 소기 밸브를 요구하는 기존의 칼럼에 비해, 제작하기가 쉽고 저렴하다는 것이다. 이는 칼럼을 일회용 칼럼으로서 칼럼을 사용할 때 특히 중요하다.
크로마토그래피 칼럼의 추가의 장점은 이동상과 같은 액체에 대한 입구 및 출구를 제공하는 제1 포트 및 제2 포트가 칼럼의 일 단부 상의 베드 공간의 수준 위로 사실상 동일한 수준 또는 높이에 있기 때문에 종래의 칼럼보다 사용하기가 더 쉽고, 따라서 개선된 사용자 접근성을 제공하는 것이다.
몇몇 상호 연결된 요소들을 포함하는 설계의 간단함은 (일회용) 소기 밸브에 대해 요구되는 바와 같이, 부품을 죄고 이동시키거나 회전시키는 동적 시일에 대한 요구를 감소시켜서, 위생 문제로 인한 누출 또는 오염의 가능성을 감소시키는 점에 있어서 유리하다. 이러한 특징은 칼럼의 준비 (제작) 중에 미생물 존재량의 감소를 포함하며, 아울러 칼럼의 보관 및 운반 중에 그러한 조건을 유지하기 위해, 일회용 칼럼에 대해 특히 중요하다.
또 다른 장점은 칼럼 크기를 증가 또는 감소시키는 것이 예측 가능한 성능으로 이어지는 점에서 크로마토그래피 칼럼이 축소·확대될 수 있는 것이다.
본 발명의 제1 양태에 따르면,
측벽을 포함하는 하우징,
측벽에 의해 분리된, 대향하여 축방향으로 이격된 제1 및 제2 단부 유닛, 및
제1 단부 유닛에 인접한 제1 필터 및 제2 단부 유닛에 인접한 제2 필터를 포함하고,
필터들은 측벽과 함께 내부에 입상 매체의 베드를 담기 위한 봉입된 베드 공간을 형성하고,
제1 단부 유닛은 베드 공간으로 액체를 추가하거나 그로부터 액체를 제거하기 위해 봉입된 베드 공간과 유체 연통하는 제1 포트를 포함하고,
제2 단부 유닛은 베드 공간으로 액체를 추가하거나 그로부터 액체를 제거하기 위해 봉입된 베드 공간과 유체 연통하는 제2 포트를 포함하는,
축류 크로마토그래피 칼럼에 있어서,
제1 포트 및 제2 포트는 크로마토그래피 칼럼 상의 베드 공간의 수준 위에서 사실상 동일한 수준 또는 높이인 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 칼럼이 제공된다.
제2 양태에서, 내부에 입상 매체의 베드를 담고 있는, 전술한 바와 같은 축류 크로마토그래피 칼럼으로 하나 이상의 분석물을 함유하는 액체를 인가하는 단계, 하나 이상의 분석물을 이동상에 의해 용출시키는 단계, 및 칼럼으로부터 용출하는 이동상의 분획을 수집하는 단계를 포함하는, 액체 내의 하나 이상의 분석물을 서로 분리하기 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 제3 양태에서,
액체와 유체 연통하는 입구 또는 입구 매니폴드,
펌프,
전술한 바와 같은 크로마토그래피 칼럼, 및
출구 또는 출구 매니폴드를 포함하는, 액체 내의 하나 이상의 분석물을 서로 분리하기 위한 시스템이 제공된다.
본 발명의 실시예들이 종속항에서 한정되어 있다.
도 1은 종래 기술의 크로마토그래피 칼럼의 그의 기본적인 특징을 도시하는 개략적인 횡단면도이다.
도 2a, 도 2b, 및 도 2c는 종래 기술의 칼럼(도 2a 및 도 2b) 및 본 발명에 따른 칼럼(도 2c)을 도시하는 단순화된 개략도이다.
도 3은 본 발명에 따른 칼럼의 횡단면도이다.
도 4는 본 발명에 따른 크로마토그래피 칼럼의 3차원 개략도이다.
도 5a는 종래 기술에서 공지된 칼럼을 사용하는 시스템의 개략도이고, 도 5b는 본 발명에 따른 칼럼을 채용하는 시스템의 개략도이다.
도 6은 본 발명에 따른 크로마토그래피 칼럼 상에서의 아세톤의 상향 유동(점선) 및 하향 유동(실선) 모드에서의 크로마토그래피 분리를 도시하는 크로마토그램이다.
도 7은 용출 피크로부터 감소 단 높이 및 비대칭 계수를 계산하기 위한 방법을 설명한다.
도 1은 종래 기술(예를 들어, 미국 특허 제6,524,484호 참조)로부터 공지된 바와 같은 크로마토그래피 칼럼(1)의 일반적인 구성요소들을 개략적으로 도시한다. 칼럼은 예컨대, 스테인리스 강 또는 투광성일 수 있는 고강도/강화 중합체 재료의 원통형 유체 불투과성 측벽(11)을 갖는다. 측벽(11)의 개방된 상부 및 바닥 단부는 상부 및 바닥 단부 조립체 또는 유닛(12, 13)에 의해 폐쇄된다. 각각의 단부 유닛은 원통형 벽(11)의 개방부를 막기 위해 밀봉식으로 끼워지며, 바람직하게는 스테인리스 강 또는 고강도 공학 플라스틱 재료, 예컨대 폴리프로필렌으로 만들어진 유체 불투과성 단부 플레이트(3)를 갖는다. 단부 플레이트는 그의 외측 표면에 대해 지탱되어 조정 가능한 인장 로드(14)가 고정되는 보유 플랜지(22)로서 측벽을 넘어 반경방향으로 돌출하는 금속 보유 플레이트(2)에 의해 지지된다. 이들은 상부 및 단부 조립체(12, 13)를 연결하고, 높은 유체 압력에 견디기 위한 구성을 돕는다.
각각의 단부 플레이트(3)는 칼럼의 외부와 측벽(11) 및 단부 조립체(12, 13)에 의해 형성된 충진 베드 공간(9) 사이의 연통을 위한 중심 관통 개방부(31)를 갖는다. 개방부(31)를 통한 접근은 연결 매니폴드(8)를 통해 외부로 연결되는, 분리된 도관들로 분할된다.
전형적으로 여과되거나 직조된 플라스틱 또는 강철의 필터 층(4)이 단부 플레이트(3)의 내측 표면에서 베드 공간(9)의 영역을 가로질러 연장된다. 단부 플레이트(3)의 내측 표면(35)은 예컨대 도시된 바와 같이 원추형으로, 바람직하게는 필터 층(4)을 후방으로부터 지지하는 (도시되지 않은) 지지 리브를 사용하여 필터 층(4) 후방에서 리세스되어, 리브들 사이에 분배 채널(34)을 형성한다. 연통 도관들 중 하나인 이동상 도관(33)은 이러한 분배 채널(34) 내로 내측으로 그리고 매니폴드(8)의 이동상 커넥터(81)로 외측으로 개방된다.
매니폴드(8)로부터, 접근 밸브 장치(5)가 단부 플레이트 개방부(31)를 통해 내측으로 그리고 필터 층(4)의 중심 오리피스(41)를 통해 밀봉식으로 돌출한다. 접근 밸브(5)는 하나 이상의 도관의 매니폴드(8)로부터 직접 베드 공간(9)으로의 연통을 제어하여, 즉 필터 층(4)을 바이패스한다. 밸브(5)에 의해 제어되며, 매니폴드(8)의 커넥터(82)를 통해 외부로 연결되는 제1 및 제2 밸브식 도관(51, 61)이 여기에 표시되어 있다.
칼럼의 전형적인 작동 시에, 입상 고정상 재료의 충진된 베드가 상부 필터 층과 바닥 필터 층(4) 사이의 베드 공간(9)을 충전시킨다. 밸브 장치(5)가 폐쇄되면, 이동상은 이동상 커넥터(81)를 통해 내부로 공급되고(화살표 "A"), 도관(33)을 통해 분배 채널(34) 내로 그리고 필터 층(4)을 통과하여 충진된 베드를 통해 아래로 용출하여, 그의 구성성분 또는 분석물의 분리를 이룬다. 액체 용출물은 바닥 단부 조립체(13)의 필터 층(4)을 통해, 이의 이동상 커넥터(81)를 통해 외부로 통과하여 적절하게 수집된다(화살표 "B"). 이는 크로마토그래피 분리가 칼럼을 통한 이동상의 하방 이동에 의해 이루어지는 점에서 "하향 유동(downflow)" 크로마토그래피의 일례이지만, 당업자는 분리가 대안적으로 단순히 이동상을 칼럼을 통해 상방으로 펌핑하여 유동 방향을 역전시킴으로써 "상향 유동(upflow)" 크로마토그래피에 의해 달성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 모드에서, 이동상은 커넥터(81)에서 칼럼으로 진입하고(화살표 "B"), 고정상 또는 입상 매체를 통해 상방으로 이동하여, 칼럼의 상부에서 커넥터(81)로부터 수집될 것이다(화살표 "A").
칼럼을 설치할 때, 칼럼에서의 액체의 유출을 회피하고, 아울러 각각 칼럼 및 충진된 베드 내로의 공기의 유입을 회피하는 것이 중요하다. 또한, 칼럼을 채용하는 시스템을 칼럼의 상류에서 임의의 공기를 소기시키는 것이 필수적일 수 있다. 이는 칼럼의 바닥 내에 위치된 통기 밸브(5)에 의해 달성된다.
도 1 및 상기 설명은 구성요소들의 전반적인 관계 및 전형적인 작동 모드를 설명하기 위한 것이다. 당업자는 다른 특정 구성 및 작동 모드가 상이한 종류의 공정에 대해 적절할 수 있다는 것을 이해할 것이며, 이는 또한 다음의 설명으로부 터 명백해질 것이다.
도 2a 및 도 2b는 종래 기술의 칼럼의 구성의 단순화된 개략도를 도시한다. 칼럼(101)은 이동상의 유입 또는 수집을 위한 제1 포트(133) 및 제2 포트(140)를 갖는다. 칼럼의 설치 후 그리고 사용 전에, 공기가 통기/소기에 의해 칼럼으로부터 제거될 필요가 있다. 이는 (도 2b에 도시된 바와 같이) 칼럼(101)의 일체형 부분이거나 (도 2a에 도시되지 않은) 제2 부품(140)을 넘어 일 지점에서 칼럼에 연결되는 통기 출구를 갖는 통기 밸브(105)에 의해 달성될 수 있다.
도 2c는 본 발명에 따른 칼럼(101)의 구성의 단순화된 개략도이다. 이동상의 유입 또는 수집을 위해 의도된 제1 포트(133)는 (종래 기술의 칼럼에서와 같이) 칼럼(101)의 상부에 위치된다. 칼럼의 바닥과 유체 연통하는 제2 포트(140)는 제1 포트(133)와 사실상 동일한 수준 또는 높이이다. 이는 공기 또는 이동상과 같은 유체가 칼럼(101)의 바닥과 제2 포트(140) 사이에서 유동하도록 허용하는 중공 부재(160)에 의해 이루어진다. 이러한 구성은 통기 밸브에 대한 필요성을 제거하고, 칼럼으로부터 사이퍼닝 및 공기를 칼럼 내로 유입할 위험을 감소시킨다.
도 3은 본 발명에 따른 칼럼의 횡단면도를 도시한다. 칼럼(201)은 헤드(216)를 갖는 인장 로드(214)에 의해 함께 고정되어 유체 밀봉 시일을 형성하는, 튜브형 하우징(211), (부분적으로 도시된) 제1 단부 유닛(212) 및 제2 단부 유닛(213)을 포함한다. 제1 필터(204) 및 제2 필터(206)가 각각 제1 단부 유닛(212) 및 제2 단부 유닛(213)에 인접한다. 이러한 필터(204, 206)는 측벽(211)과 함께, 입상 매체의 베드를 담기 위한 베드 공간(209)을 형성한다.
하우징(211) 및 단부 유닛(212, 213)은 전형적으로 스테인리스 강 또는 폴리프로필렌과 같은 고강도 플라스틱 재료로 구성된다. 바람직한 실시예에서, 칼럼이 생물학적 활성 물질들의 분리를 위해 사용되는 경우에, 재료는 미국 약전(USP) <88> 클래스 Ⅳ에 따르면 사람에게서 면역 반응을 유도하지 않도록 생물학적으로 불활성이다. 헤드(216)를 갖는 인장 로드(214)는 단부 유닛(212, 213)을 하우징(211)에 고정시켜서, 높은 작동 압력에 견딜 수 있는 유체 밀봉 베드 공간(209)을 형성한다.
밸브 수단(220) 및 제1 포트(233)가 도면에 도시되어 있다. 제2 포트(240)는 제2 단부 유닛(213)을 통해, 액체가 추가되거나 수집될 수 있는 베드 공간(209)으로 연장되거나 (중공 부재(260)를 거쳐) 베드 공간과 유체 연통하는 통로(242)를 포함한다. 도면으로부터 명백한 바와 같이, 제2 포트(240)는 제1 포트(233)와 사실상 동일한 수준 또는 높이이고, 따라서 이동상의 칼럼으로의 추가 및 그로부터의 수집을 용이하게 한다. 이러한 배열은 칼럼의 설치를 보조하고, 사이퍼닝의 위험을 감소시키고, 칼럼 내로의 공기의 유입 가능성을 감소시키는 점에서 추가의 장점을 갖는다.
칼럼은 밸브 수단(220)을 통해 슬러리 형태의 입상 매체로 충진될 수 있고, 밸브 수단(220)은 중심 보어(221) 및 노즐(224)을 포함한다. 충진된 입상 매체의 베드는 본 기술 분야에 공지된 종래의 수단에 의해, 예를 들어 베드를 압축하기 위한 단부 유닛들 중 하나의 이동에 의해 얻어진다. 도 3에서, 노즐(224)은 그의 후퇴 위치에 도시되어 있지만, 이는 칼럼의 충전을 용이하게 하기 위해 베드 공 간(209) 내의 위치로 이동될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 베드 공간 내에서의 슬러리의 분배 및 균등 충진을 용이하게 하는 광범위한 노즐들이 사용될 수 있다. 충진 밸브 및 노즐 각각에서의 개방/폐쇄 기능을 달성하기 위한 한 가지 대안은 베드 공간 내에 고정되어 (후퇴될 수 없고), 노즐의 내부 또는 외부 상에서 그의 위치에 따라 노즐을 개방 및/또는 폐쇄하는 가동 요소 또는 슬리브에 인접하여 위치된 노즐을 갖는 것이다. 필터(204, 206)는 각각 단부 유닛(212, 213)의 내부면 상에 위치되고, [측벽(211)과 함께] 베드 공간을 형성하고 베드 공간(209)으로부터의 입상 매체의 누출을 방지하도록 작용한다.
칼럼 상에서의 분리를 위한 하나 이상의 분석물 또는 물질을 함유하는 이동상 또는 액체가 제1 포트(233)를 통해 추가된다. 액체는 그 다음 필터(204)를 통해 (도시되지 않은) 입상 매체로 충진된 베드 공간(209) 내로 통과한다. 이러한 방식으로 입상 매체 상으로 유입된 분석물(들)의 크로마토그래피 분리는 이동상의 유입에 의해 그리고 이동상에 의한 용출에 의해 이루어진다. 이동상은 마지막으로 제2 필터(206)를 통해 통로(242)를 거쳐 제2 포트(240)로 칼럼에서 배출된다. 상이한 분석물들을 함유하는 이동상의 결과적인 분획이 그 다음 수집될 수 있다.
칼럼은 전술한 바와 같은 "하향 유동" 모드 또는 이동상의 유동 방향이 역전되어 이동상이 칼럼을 따라 위로 이동하는 "상향 유동" 모드에서 작동될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 상향 유동 모드에서, 이동상은 제2 포트(240)를 거쳐 칼럼으로 진입하고, 통로(242)를 따라 베드 공간(209) 내의 입상 매체의 베드를 통해 상방으로 이동하고, 제1 포트(233)에서 수집을 위해 칼럼에서 배출될 것이다.
도시된 실시예에서, 중공 부재(260)가 칼럼의 일체형 부분이다. 그러나, 적합한 재료(예컨대, 폴리프로필렌, 폴리우레탄 등)로부터 만들어진 커넥터 및 적절한 배관에 의해, 중공 부재(260)는 칼럼과 일체일 필요가 없다는 것이 이해될 것이다.
단일 단부 유닛 상의 동일한 높이에서의 이동상의 인가 및 수집은 작업자 접근 및 취급의 관점에서 사용을 단순화하고, 공기가 시스템에 접근할 위험을 감소시키고, 칼럼을 설치하기 위해 필요한 공간을 감소시킨다.
도 3에 도시된 실시예는 입상 매체의 칼럼으로의 유입 및/또는 그로부터의 제거를 위한 밸브 수단(220)을 포함한다. 그러한 밸브는 몇몇 칼럼(예컨대, 미리 충진된, 일회용 칼럼)이 최종 사용자에 의해 수행되어야 하는 입상 매체의 추가 또는 제거를 요구하지 않을 수 있거나 그러한 밸브 수단의 사용을 요구하지 않는 상이한 기술에 의해 준비(충진)되므로, 청구되는 본 발명의 본질적인 특징이 아니라는 것이 이해될 것이다.
도 4는 도 3의 칼럼의 3차원 개략도를 나타내고, 이로부터 칼럼의 외부 특징이 명확해진다. 칼럼은 인장 로드(314) 및 헤드(316)에 의해 함께 고정되어 유체 밀봉 시일을 형성하는 제1 단부 유닛(312), 제2 단부 유닛(313) 및 하우징(311)을 포함한다. 슬러리 형태의 입상 매체가 밸브 수단(320)을 거쳐 (도시되지 않은) 베드 공간 내로 유입될 수 있다. 제1 포트(333)가 입상 매체 상에서 분리되는 분석물(들)을 함유하는 이동상 또는 액체를 위한 도관으로서 역할한다. (도시되지 않 은) 칼럼의 기부에서의 출구를 거쳐 베드 공간과 유체 연통하는 중공 부재(360)가 제2 포트(340)에서 종료하고, 이로부터 칼럼으로부터 용출된 이동상의 적절한 분획이 수집될 수 있다. 알 수 있는 바와 같이, 제2 포트(340)는 이동상이 유입 (또는 수집)될 수 있는 제2 포트(333)와 사실상 동일한 수준 또는 높이이다. 이러한 배열은 사용자 작업 및 샘플 취급을 용이하게 한다. 도 4에 도시된 실시예에서, 칼럼의 용량은 대략 10 리터이고, 전형적으로 0.1 내지 2000 리터 범위의 광범위한 칼럼 용량이 가능하다는 것이 이해될 것이다. 칼럼을 일회용 칼럼으로서 사용할 때 양호한 용량은 0.5 내지 50 리터 범위 내이다.
도 5a 및 도 5b는 일체형 통기 밸브를 갖는 종래 기술의 칼럼을 포함하는 시스템(도 5a)을 본 발명에 따른 칼럼을 사용하는 시스템(도 5b)에 대해 개략적으로 비교하고 있다. 도 5a에 도시된 통기 밸브는 회전식 밸브 타입이지만, 다른 밸브 원리(핀치 밸브, 멤브레인 밸브 등)도 통기 밸브 기능을 달성하기 위해 채용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
종래 기술의 시스템(도 5a)의 설치에 이어서, 공기가 시스템을 펌핑함으로써 시스템으로부터 제거되어야 한다. 시스템은 입구 매니폴드(408), 펌프(470), 센서(472 내지 476), 칼럼 밸브(407), 출구 매니폴드(409) 및 칼럼(401)을 포함한다[칼럼(401) 및 통기/소기 밸브(405)를 둘러싸서 도시된 점선 직사각형은 칼럼 및 통기 밸브가 통기 밸브가 칼럼을 크로마토그래피 시스템 내에 설치할 때 충진되고 프라이밍된 칼럼에 부착되도록 조합된 유닛으로서 사용된다는 것을 표시함]. 전술한 바와 같이, 통기 밸브의 목적은 칼럼을 시스템 내에 설치할 때 또는 칼럼을 시 스템으로부터 제거/분리할 때, 칼럼을 유출 및/또는 공기의 유입으로부터 보호하는 것이다. 칼럼 밸브(407)는 칼럼(401)의 입구(408) 및/또는 출구(409) 매니폴드에 대한 연결을 제어하고, 따라서 칼럼(401)이 "오프라인(offline)"인지 "온라인(online)"인지를 제어한다. 도 5a 및 도 5b에서, 칼럼 밸브는 회전식 밸브 타입이지만, 다른 밸브 원리(예컨대, 핀치 밸브, 멤브레인 밸브 등)도 칼럼 밸브 기능을 달성하기 위해 채용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 칼럼(401) 및 입구(408)/출구(409) 매니폴드와의 유체 연결은 (도면의 위치 1 내지 4에 의해 표시된 바와 같은) 밸브(407) 내의 여러 게이트웨이에 의해 제어된다. 밸브(407)가 위치 3과 위치 4, 및 위치 1과 위치 2 사이의 연결을 이룰 때, 칼럼은 바이패스된다. 회전식 밸브가 90°만큼 회전되면, 위치 3과 위치 1 사이, 위치 4와 위치 2 사이의 연결이 이루어지고, 이는 칼럼이 인라인 또는 온라인이며 상향 유동 모드/유동 방향으로 연결된다는 것을 의미한다. 전술한 바와 같이, 다른 밸브 원리(예컨대, 핀치 밸브, 멤브레인 밸브 등) 및 광범위한 다른 밸브 구성(상향 유동 및/또는 하향 유동 모드와, 복수의 칼럼들의 연결)이 칼럼 밸브 기능을 달성하기 위해 채용될 수 있다.
공기가 시스템의 프라이밍, 특히 도관(480)의 프라이밍, 및 시스템 내의 공기의 소기를 가능케 하는 통기/소기 밸브(405)에 의해 시스템으로부터 제거된다.
도 5a에 도시된 시스템은 상향 유동 모드로 사용되도록 의도되었고, 따라서 입구 매니폴드(408)로부터의 액체가 제2 포트(440)에서 도관(480)을 거쳐 칼럼(401)으로 진입하고, (도시되지 않은) 충진된 베드를 통해 상방으로 이동하여 제 1 포트(420)에서 진출한다. 액체(예컨대, 칼럼 상에서 분리되는 분석물들을 함유하는 이동상 또는 샘플)가 입구 매니폴드(408)로부터 취해지고, 칼럼 밸브(407)를 거쳐 펌프(470)에 의해 압력 하에서 칼럼(401)으로 전달된다. 센서(472 내지 476)가 시스템 내의 환경적, 물리적 및 화학적 상태(예컨대, 압력, 유동, 전도성, 온도, pH, UV 흡수율, 공기 등)를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 센서들은 예를 들어 칼럼을 통한 이동상의 유량을 조절함으로써, 칼럼의 작동을 제어하도록 사용될 수 있다. 제1 포트(420)로부터 칼럼으로부터 방출된 액체는 칼럼 밸브(407)를 거쳐 출구 매니폴드(409)로 전달되어 수집된다.
도 5b는 본 발명에 따른 칼럼을 사용하는 시스템을 예시한다. 구성 부품들은 통기/소기 밸브(405)가 없는 것을 제외하고는 도 5a에 대해 전술한 바와 동일하다. 이러한 구성에서, 칼럼 내의 (도시되지 않은) 베드 공간의 수준 위의 제1 포트(420) 및 제2 포트(440)의 수준 또는 높이는 사실상 동일하고, 제2 포트(440)는 중공 부재(460)에 의해 칼럼(401)의 기부에 연결된다. 중공 부재(460)가 본 발명에 따르면 칼럼의 일부이지만, 종래 기술의 구성을 도시하는 도 5a의 대응하는 액체 도관(480)은 크로마토그래피 시스템의 일부이다. 본 발명에 따른 칼럼은 그의 중공 부재(460)와 함께 이미 공기가 소기되어 있고, 시스템 내에 설치될 때 즉시 사용될 수 있다. 특히, 일회용의, 즉시 사용될 수 있는 칼럼에 대해, 본 발명은 각각의 개별 칼럼과 함께 운송되는 일회용 소기 밸브에 대한 필요를 제거하고, 이는 비용을 현저하게 감소시킨다.
설치에 이어서, 시스템은 칼럼(401)이 바이패스될 때 (즉, 칼럼이 "오프라 인"일 때) 칼럼 밸브(407)의 상류에서 소기된다. 칼럼을 "인라인"으로 절환할 때, 무시할 만한 양의 공기만이 칼럼 밸브(407)와 도관(480) 사이에 잔류할 것이다.
도 5b에 도시된 시스템은 그 다음 종래 기술의 시스템에 대해 전술한 바와 사실상 동일한 방식으로 사용될 수 있다. 상향 유동 모드에서, 액체는 펌프(470)에 의해 매니폴드(408)로부터 흡인되어, 밸브(407)를 거쳐 칼럼(401)의 제2 포트(440) 내로 유도될 것이다. 액체는 그 다음 (도시되지 않은) 입상 매체의 베드를 통해 칼럼을 따라 위로 이동하여 제2 포트(420)에서 진출하고, 칼럼 밸브(407)에 의해 출구 매니폴드(409)로 유도되어 수집될 것이다. 센서(472 내지 476)는 시스템 내의 환경적, 물리적 및 화학적 상태를 모니터링하여 시스템의 작동을 조절하도록 사용될 수 있다.
도 6은 하향 유동(실선) 및 상향 유동(점선) 모드에서 작동된, 본 발명에 따른 10 리터 칼럼 상에서 수행된 트레이서 펄스 실험에 의한 크로마토그래피 분리 효율을 도시한다. 칼럼은 85 ㎛ 아가로즈 입자 직경의 Capto™ Q 음이온 교환 수지[스웨덴 읍살라 소재의 지이 헬쓰케어(GE Healthcare)]의 베드로 충진되었다. 칼럼은 10.8 L의 체적, 263 mm의 직경 및 200 mm의 베드 높이를 가졌다. 아세톤(충진된 베드 체적의 1%)이 트레이서 물질로서 사용되었고, 이동상으로서 물을 사용하여 칼럼으로부터 용출되었고, 280 nm에서의 흡수율이 모니터링되었다. 아래의 표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 우수한 칼럼 효율이 하향 유동(실선) 또는 상향 유동(점선) 모드에서, 사용된 85 ㎛ 아가로즈 매체에서 관찰되었다.
표 1 및 도 6에 도시된 데이터는 횡방향 분배 채널을 더 포함하고, 제1 포트 의 출구 및 횡방향 분배 채널이 비대칭 구성을 갖는 본 발명에 따른 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 얻어졌다. 그러한 배열을 갖는 크로마토그래피 칼럼은 본 출원인[지이 헬쓰케어 바이오-사이언스 에이비(GE Healthcare Bio-Science AB)]의 공동 계류 중인 특허 출원인 본 출원과 동일자로 출원되고 발명의 명칭이 "축류 크로마토그래피 칼럼 및 방법(Axial Chromatography Columns and Methods)"인 GB 0614316.8호의 보호 대상이다.
관찰치 허용치
단/미터(N/m) 4430 > 3700 (85㎛에 대해)
감소 단 높이(h) 2.5 < 3.0
피크 비대칭성(Af) 1.14 0.8 - 1.8
표 1의 데이터는 후술하는 바와 같이 도 6의 크로마토그래피로부터 도출되었다.
칼럼 효율에 대한 척도로서, 감소 단 높이는 도 7에 도시된 바와 같이, 용출된 피크의 높이의 절반에서의 피크 폭(Wh)의 도움으로 결정된다. 이러한 절차는 가우스 형상에 대해 유효한 근사화이다. 실제로, 용출 피크는 흔히 이러한 이상적인 가우스 형상으로부터 이탈하고, 피크 경사도는 소위 비대칭 계수(Af)에 의해 정성적으로 설명되고, 여기서 RTD의 '선단(leading)'은 Af < 1에 의해 '후단(trailing)'은 Af > 1에 의해 표시된다. 비대칭 계수에 대해 일반적으로 적용되는 허용 기준은 장치의 유형에 따라, 0.8 < Af < 1.5 - 1.8이다.
Figure 112009002818114-PCT00001
Figure 112009002818114-PCT00002
(도 7 참조)
경험칙으로서, 매체의 특징적인 분산은 전형적으로 생명 공학적 다운스트림 처리에서 단백질 크로마토그래피에 대해 사용되는 고도로 다공성인 매체를 고려할 때 최적화된 유효 속도에서 h = 1.5 - 2.0 범위 내의 감소 단 높이를 제공한다. 매체의 이상적인 효율은 크로마토그래피 시스템의 실험적으로 결정된 효율에 대해 비교되어야 하고, 여기서 감소 단 높이의 증가는 주변 장치, 샘플 체적, 베드 이질성 및 분배 시스템으로부터의 추가의 분산의 결과이다. 실제로, 단백질의 이온 교환 분리 시에 사용되는 크로마토그래피 유닛의 전형적인 표준 설치 조건은 hunit , Apparent < 3.0의 실험적으로 결정된 감소 단 높이이다.
Af 비대칭 계수
dp 입자 직경
h 감소 단 높이
HETP 이론 단수
L 베드 높이, 충진된 베드
us 충진된 베드 내의 유효 속도
VR 머무름 체적
wh 최대 피크 높이의 50%에서의 피크 폭

Claims (13)

  1. 측벽을 포함하는 하우징,
    측벽에 의해 분리된, 대향하여 축방향으로 이격된 제1 및 제2 단부 유닛, 및
    상기 제1 단부 유닛에 인접한 제1 필터 및 상기 제2 단부 유닛에 인접한 제2 필터를 포함하고,
    상기 필터들은 측벽과 함께 내부에 입상 매체의 베드를 담기 위한 봉입된 베드 공간을 형성하고,
    제1 단부 유닛은 베드 공간으로 액체를 추가하거나 그로부터 액체를 제거하기 위해 봉입된 베드 공간과 유체 연통하는 제1 포트를 포함하고,
    제2 단부 유닛은 베드 공간으로 액체를 추가하거나 그로부터 액체를 제거하기 위해 봉입된 베드 공간과 유체 연통하는 제2 포트를 포함하는,
    축류 크로마토그래피 칼럼에 있어서,
    상기 제1 포트 및 상기 제2 포트는 상기 크로마토그래피 칼럼 상의 베드 공간의 수준 위로 사실상 동일한 수준 또는 높이에 있는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 칼럼.
  2. 제1항에 있어서, 제2 포트는 제2 유닛 내의 통로에 연결된 중공 부재에 의해 베드 공간과 유체 연통하는 크로마토그래피 칼럼.
  3. 제2항에 있어서, 상기 중공 부재는 칼럼의 일체형 부분인 크로마토그래피 칼럼.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 통로는 베드 공간으로부터 제2 단부 유닛의 측벽을 통해 연장되는 크로마토그래피 칼럼.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 단부 유닛은 봉입된 베드 공간과 유체 연통하는 밸브 수단을 더 포함하고, 밸브 수단은 상기 제1 필터를 통해 연장되며 내부에 통로를 갖는 종방향 부재를 포함하고, 밸브는 상기 통로를 통해 베드 공간을 입상 매체로 충전하도록 작동식으로 개방 및 폐쇄될 수 있는 크로마토그래피 칼럼.
  6. 제5항에 있어서, 상기 밸브 수단의 상기 종방향 부재는 노즐을 포함하는 크로마토그래피 칼럼.
  7. 제6항에 있어서, 상기 노즐은 베드 공간 내에 고정되거나 또는 베드 공간 외부의 위치로 후퇴될 수 있는 크로마토그래피 칼럼.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 밸브 수단은 입상 매체의 베드 공간이 비워지게 하지 않는 크로마토그래피 칼럼.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 칼럼은 입상 매체로 미리 충진된 크로마토그래피 칼럼.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 칼럼은 일회용 칼럼인 크로마토그래피 칼럼.
  11. 내부에 입상 매체의 베드를 담고 있는, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 축류 크로마토그래피 칼럼에 하나 이상의 분석물을 함유하는 액체를 인가하는 단계, 상기 하나 이상의 분석물을 이동상에 의해 용출시키는 단계, 및 칼럼으로부터 용출하는 상기 이동상의 분획을 수집하는 단계를 포함하는, 액체 내의 하나 이상의 분석물을 서로 분리하기 위한 방법.
  12. 액체와 유체 연통하는 입구 또는 입구 매니폴드,
    펌프,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 크로마토그래피 칼럼, 및
    출구 또는 출구 매니폴드를 포함하는, 액체 내의 하나 이상의 분석물을 서로 분리하기 위한 시스템.
  13. 제12항에 있어서, 칼럼 베드 공간으로 액체를 추가하거나 그로부터 액체를 제거하도록 작동식으로 개방 및 폐쇄될 수 있는 밸브를 더 포함하는 시스템.
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