KR20090033384A - 과다 혈관신생의 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 줄기 세포 및/또는 이의 자손 세포의 투여에 의한 혈관형성 관련 질병의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.

Description

과다 혈관신생의 치료 방법{TREATMENT OF EXCESSIVE NEOVASCULARIZATION}
본 발명은 줄기 세포 및/또는 이의 자손 세포 투여에 의한 혈관형성 관련 질환의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
혈관형성
혈관형성(또는 혈관신생)은 새로운 혈관의 생성 및 분화이다. 혈관형성은 일반적으로 건강한 성체 조직이나 성숙형 조직에서는 이루어지지 않는다. 그러나, 상처나 상해를 입은 후 상처를 치유하고 조직으로의 혈액 흐름을 복원시키기 위해, 건강한 신체에서도 이루어진다. 여성의 경우, 혈관형성은 월경 주기나 임신 중에 이루어진다. 이러한 과정에서, 새로운 혈관 생성은 엄격하게 조절된다.
혈관형성 및 질환
많은 중증 질환 상태에서, 체중 감소가 혈관형성을 통제한다. 과도한 혈관형성은 암, 황반 변성(macular degeneration), 당뇨병성 망막증, 관절염 및 건선과 같은 질환에서 발생한다. 이러한 상태에서, 새로운 혈관이 질병에 걸린 조직에 공급되어, 정상 조직을 파괴시키며, 암의 경우, 새로운 혈관은 종양 세포를 순환계로 유입시켜 다른 장기에 정착가능하게 한다(종양 전이).
종양 증식이 혈관형성-의존적이라는 가설은 1971년에 최초로 제안되었 다(Folkman, 1971). 간단하게, 이러한 가설은 종양 체적이 특정 단계 이상으로 증가하는데에는 새로운 모세 혈관의 유도가 필요함을 제시하는 것이다. 예로, 마우스에서, 초기 전혈관 단계(prevascular phase)에서의 폐의 미세 전이는 조직 단편에 대한 고출력 현미경에 의한 방법 외에는 검출할 수 없었다. 게다가, 종양 증식이 혈관형성에 의존적이라는 개념을 뒷받침하는 간접적인 증거들도 미국 특허 5,639,725, 5,629,327, 5,792,845, 5,733,876 및 5,854,205에서 확인되었다.
혈관형성을 자극하기 위해, 종양은 섬유모세포 증식 인자(αFGF 및 βFGF)(Kandel et al., 1991), 혈관 내피 세포 증식인자/혈관 투과성 인자(VEGF/VPF) 및 HGF 등의 다양한 혈관형성 인자의 생성을 상향 조절한다. 그러나, 다수의 악성 종양들 역시 안지오스타틴 단백질 및 트롬보스폰딘 등의 혈관형성 저해자를 만들어 낸다(Chen et al., 1995; Good et al., 1990; O'Reilly et al., 1994). 혈관형성 표현형은 혈관신생의 양성 및 음성 조절자들 간의 전체적인 균형의 결과인 것으로 가정된다(Good et al., 1990; O'Reilly et al., 1994). 모두 종양의 존재와 관련있는 것은 아니지만, 그외 혈관형성의 내인성 저해자들도 몇개 동정되었다. 이러한 것으로는, 혈소판 인자4(Gupta et al., 1995; Maione et al., 1990), 인터페론-α, 인터루킨-12 및/또는 인터페론 감마(Voest et al., 1995)에 의해 유도되는 인퍼테론-유발성 단백질10(Angiolillo et al., 1995; Strieter et al., 1995), gro-β(Cao et al., 1995), 및 프로락틴의 16 kDa의 N-말단 단편(Clapp et al., 1993)이 있다.
눈에서의 혈관신생은 노화성 황반 변성(AMD) 및 당뇨병성 망막증 등의 몇가 지 안 질환의 근간이 된다. AMD는 미국, 캐나다, 잉글랜드, 웨일즈, 스코틀랜드 및 호주에서 65세 이상의 노년층의 법적 비가역성 실명에 가장 공통적인 원인이다. 환자가 처음 눈의 중심 시력(central vision)을 상실하게 되는 평균 연령은 약 65세이지만, 일부 환자들은 40대 또는 50대에 질병의 징후가 나타난다. 환자의 약 10% 내지 15%에서는 삼출(습성)형 질환이 나타난다. 삼출형 AMD는 혈관형성 및 병인성 혈관신생을 특징으로 한다. 질환은 양측성이며, 환자의 실명 장애가 발병할 누적 발생 가능성은 연간 약 10% 내지 15%에 이른다.
당뇨병성 망막증은 1형 또는 2형 당뇨병 중 어느 하나로 진단받은 환자의 약 40 내지 45%에서 발생하는 당뇨병 합병증이다. 당뇨병성 망막증은 통상 양쪽 눈에 영향을 주며, 4단계로 진행된다. 제1 단계인 경증 비증식성 망막증(mild nonproliferative retinopathy)은 눈의 미세동맥류가 특징이다. 망막의 모세관과 소혈관에서 소규모의 부종(swelling)이 이루어진다. 제2 단계인 중간 수준의 비증식성 망막증에서는, 망막에 제공되는 혈관이 차단되기 시작한다. 중증 비증식성 망막증인 제3 단계에서는, 혈관 폐색이 망막으로의 혈액 공급 감소로 이어져, 망막은 망막에 혈액 공급을 제공하기 위해 눈에 새로운 혈관을 만드는(혈관형성) 신호를 보내게 된다. 제4 단계이고 가장 진전된 단계인 증식성 망막증에서는, 혈관 신생이 이루어지지만 신생 혈관은 비정상적이고, 허약하며, 망막과 눈에 채워진 유리질 젤 표면을 따라 생장한다. 이들 얇은 혈관이 파열되거나 혈액이 누출되면, 심 각한 시력 상실 또는 실명으로 이어질 수 있다.
혈관형성 저해자
특이적으로 내피 세포 증식을 저해하는 혈관형성 저해자의 예로는 안지오스타틴 단백질(O'Reilly et al., 1994)이 있다. 안지오스타틴 단백질은 약 38 kDa의 특이적인 내피 세포 증식 저해자이다. 안지오스타틴 단백질은 플라스미노겐의 5종의 크링글(kringle) 중 3종 이상을 포함하는, 플라스미노겐의 내부 절편이다. 안지오스타틴 단백질은 특정 종양 모델에서 종양 무게를 감소시키고 전이를 저해시키는 것으로 확인되었다(O'Reilly et al., 1994). 다른 혈관형성 저해자로는 콜라겐의 카르복시 말단 또는 XVIII인, 엔도스타틴 단백질이 있다(O'Reilly et al., 1997).
혈관형성 관련 장애를 치료 또는 예방하기 위해, 단독으로 사용가능하거나 또는 공지된 혈관형성 물질과 함께 사용할 수 있는 추가적인 항-혈관형성 물질을 발굴 및 개발할 필요가 있다.
발명의 개요
본 발명자들은 놀랍게도 줄기 세포 및 이의 자손 세포를 사용하여 혈관형성 관련 장애를 치료 또는 예방할 수 있다는 것을 발견하였다.
일측면으로, 본 발명은 줄기 세포 또는 이의 자손 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 혈관형성 관련 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
바람직한 예에서, 줄기 세포는 골수로부터 수득된다.
바람직하기로는, 줄기 세포는 간엽 전구 세포(mesenchymal precursor cell: MPC)이다. 바람직하기로는, 간엽 전구 세포는 TNAP+, STRO-1+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, CD45+, CD146+, 3G5+ 또는 이의 조합이다. 다른 예로, STRO-1+ 세포들 중 적어도 일부는 STRO-1bri이다.
다른 예로, 간엽 전구 세포는 배양 증폭(culture expanded)되지 않은 것이며, TNAP+이다.
바람직한 예로, 자손 세포는 간엽 전구 세포를 시험관내 배양하여 수득된다.
다른 예로, 세포들 중 적어도 일부는 유전자가 변형된 것이다.
다른 예로, 혈관형성 관련 질병은 혈관형성 의존성 암 또는 양성 종양이며, 세포는 항암제 전달에 이용된다.
또한, 개체에게 혈관형성 관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제 제조에 있어 줄기 세포 또는 이의 자손 세포의 용도를 제공한다.
본 발명의 일측면의 바람직한 특성 및 특징은 본 발명의 여러가지 다른 측면에 적용가능함은 자명한 일이다.
본 명세서 전반에서, 용어 "포함한다" 또는 "포함한" 또는 포함하는" 등의 변형 형태는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함하는 것을 내포하며, 다른 요소, 정수, 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 배제하는 것이 아닌 것으로 이해될 것이다.
발명의 상세한 설명
일반적인 기술
구체적으로 언급하지 않은 한, 본원에 사용된 모든 기술적 용어와 과학적 용어들은 당해 기술 분야(예, 줄기 세포 생물학, 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학, 및 생화학)의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가지는 것으로 이해되어야 한다.
달리 언급되어 있지 않은 한, 본 발명에서 사용되는 재조합 단백질, 세포 배양 및 면역학적 기술들은 당업자들에게 잘 알려져 있는 표준적인 과정이다. 이러한 기술들은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (including all updates until present) 등의 문헌에 개시 및 설명되어 있으며, 이들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
혈관형성 관련 질병 및 이의 치료 또는 예방
본원에서, 용어 "혈관형성"은 새로운 혈관 조직의 생장 및/또는 발생이 포함된 조직 혈관화(vascularization) 과정으로 정의되며, 또한 신-혈관 형성이라고도 한다. 과정은 3가지 방법들 중 한가지로 진행될 수 있다: 기존 혈관으로부터 혈관이 뻗어날 수 있으며, 전구 세포로부터 혈관이 새로 생겨날 수 있으며(혈관신생, vasculogenesis), 및/또는 기존의 소형 혈관의 직경이 커질 수 있다.
본원에서, "혈관형성 관련 질환"은 과도한 및/또는 비정상적인 신규-혈관 형성이 특징인 모든 상태를 의미한다.
어떠한 혈관형성 관련 질병도 본 발명의 방법으로 치료 또는 예방할 수 있다. 혈관형성 관련 질환으로는, 혈관형성 의존성 암, 예컨대 고형 종양, 백혈병과 같은 혈액성 종양 및 종양 전이; 양성 종양, 예컨대 혈관종(hemangiomas), 청신경종(acoustic neuromas), 신경섬유종, 트라코마스(trachomas) 및 화종성 육아종; 류마티스 관절염; 건선; 안구 혈관형성 질환, 예컨대 당뇨병성 망막증, 조산아의 망막증, 건식 노인성 황반 변성 및 습식 노인성 황반 변성을 포함한 황반 변성, 각막 이식 거부 반응, 신혈관 녹내장(neovascular glaucoma), 후수정체 섬유증식증(retrolental fibroplasia), 피부 조홍(rubeosis); 오슬러-베버 증후군(Osler-Webber Syndrome); 심근 혈관형성 실명(myocardial angiogenesis blindness); 경화반내 신생혈관증식(plaque neovascularization); 말초혈관 확장증(telangiectasia); 혈우병성 관절증(hemophiliac joint); 맥관섬유종; 및 상처 과립화(wound granulation)를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 방법은 고양이 찰상병(Rochele minalia quintosa) 및 궤양(Helicobacter pylorii) 등의 병리학적 결과로 귀결되는 혈관형성이 나타나는 질병의 치료 또는 예방에 이용할 수 있다.
본원에서 "안구 혈관형성 질환"은 과도한 및/또는 비정상적인 신규-혈관형성이 특징인 모든 눈 증상이다.
본 발명의 방법은 혈관형성 관련 질환을 치료 또는 예방하기 위해 다른 치료법과 병용할 수 있다. 상기 다른 치료법의 특성은 특정 혈관형성 관련 질환에 따라 달라질 것이다. 예컨대, 본 발명의 방법으로 황반 변성을 치료 및 예방하기 위해, 항산화제 및/또는 철 보충제, US 6,942,655에 기재된 방법을 이용한 마쿠젠(macugen)(Pegaptanib) 투여 및/또는 레이저 치료와 병용할 수 있다. 암의 경우 본 발명의 방법을 이용한 치료는 수술, 방사선 치료 및/또는 화학치료와 병용할 수 있다.
본원에서, 용어 "개체"(또한 "환자"라함)는 온혈동물, 바람직하기로는 인간을 포함한 포유류를 포함한다. 바람직한 예로, 개체는 영장류이다. 보다 더 바람직한 예로, 개체는 인간이다.
본원에서, 용어 "치료하는", "치료한다" 또는 "치료"는 혈관형성 관련 질환의 한가지 이상의 증상을 감퇴 또는 없애는데 충분한 치료학적 유효량의 본 발명에 따른 세포의 투여를 포함한다.
본원에서, 용어 "예방하는", "예방한다" 또는 "예방"은 혈관형성 관련 질환의 한가지 이상의 증상의 진전을 중지 또는 방해하는데 충분한 치료학적 유효량의 본 발명에 따른 세포의 투여를 포함한다.
줄기 세포 및 이의 자손 세포
본원에서, 용어 "줄기 세포"는 표현형 및 유전자형이 동일한 딸 세포로 생장할 수 있으며 적어도 한가지 이상의 최종 세포 타입(예, 최종적으로 분화된 세포)로 생장할 수 있는, 자가-복제성 세포(self-renewing cell)를 의미한다. 용어 "줄기 세포"는 전능성(totipotential), 다잠재성(pluripotential) 및 다능성(multipotential) 세포 뿐 아니라 이들의 분화로부터 유래된 선조 세포 및/또는 전구 세포를 포함한다.
본원에서, 용어 "전능성 세포(totipotent cell)" 또는 "전능성 세포(totipotential cell)"는 완전한 배아(예, 배반포)를 형성할 수 있는 세포이다.
본원에서, 용어 "다잠재성 세포(pluripotent cell)" 또는 "다잠재성 세포(pluripotential cell)"는 완전한 분화 다재다능성, 즉 포유류 신체의 약 260종의 세포 타입들 중 임의의 타입으로 생장할 수 있는 능력을 가진 세포를 의미한다. 다잠재성 세포는 자기-복제 가능하며 조직내에서 휴지 또는 정지한 상태로 유지될 수 있다.
"다능성 세포(multipotential cell)" 또는 "다능성 세포(multipotent cell)"는 여러가지 성숙형 세포 타입들 중 어느 하나로 생장할 수 있는 세포를 의미한다. 본원에서, 이러한 표현은 간엽 전구 세포(MPC) 및 이들 세포의 다능성 자손 등의, 성체 또는 배아성 줄기 세포 및 선조 세포를 포함한다.
본원에서, 용어 "선조 세포"는 특정 타입의 세포로 분화가 예정되었거나 또는 특정 타입의 조직을 형성하도록 예정된 세포를 의미한다.
간엽 전구 세포(MPC)는 골수, 혈액, 치수 세포(dental pulp cell), 지방 조직, 피부, 비장, 췌장, 뇌, 신장 간, 심장 신장, 모낭, 장, 폐, 림프절, 흉선, 뼈, 인대, 힘줄, 골격근, 진피 및 골막에서 발견되는 세포이며, 이는 중배엽, 내배엽 및 외배엽 등의 여러가지 생식세포(germ line)로 분화할 수 있다. 따라서, MPC는 비제한적으로 지방 조직, 골 조직, 연골 조직, 탄성 조직, 근육 조직 및 섬유성 연결 조직 등의 수많은 세포 타입으로 분화가능하다. 이들 세포가 들어서게 되는 특정 계통-예정(lineage-commitment) 및 분화 경로는, 기계적 영향 및/또는 성장 인자, 사이토카인 및/또는 숙주 조직에 의해 확립된 국소 미세환경 조건 등의 내인성 생활성 인자로 인한 다양한 영향에 따라 결정된다. 간엽 전구 세포는, 따라서 분열되어, 줄기 세포이거나 또는 비가역적으로 분화되어 표현형을 나타내는 세포가 되는 전구 세포인, 딸 세포가 되는, 비조혈성 선조 세포이다.
바람직한 예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 세포는 개체로부터 수득한 샘플에서 농화된다. 용어 '농화된다', '농화' 또는 이의 변형어는 본원에서 무처리한 개체군과 비교하여 특정 세포 타입들의 수적 비율 또는 한가지 특정 세포 타입의 비율이 증가된, 세포 집단을 지칭한다.
바람직한 예에서, 본 발명에 사용되는 세포는 TNAP+, STRO-1+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, CD45+, CD146+, 3G5+ 또는 이의 조합이다. 바람직하게는, STRO-1+ 세포는 STRO-1bright이다. 바람직하기로는, STRO-1bright 세포는 부가적으로 VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+ 및/또는 CD146+ 중 한가지 이상이다.
일 예로, 간엽 전구 세포는 WO 2004/85630에 기재된 바와 같이 혈관주위 간엽 전구 세포(perivascular mesenchymal precursor cell)이다.
세포를 해당 마커에 대해 "양성"이라고 할 때, 이는 세포 표면에 존재하는 마커의 정도에 따라 마커의 낮은(lo 또는 dim) 또는 높은(bright, bri) 발현체 중 어느 하나일 수 있으며, 상기 용어는 세포의 색 분류 과정에 사용된 형광이나 다른 색상의 세기와 관련있다. lo(또는 dim 또는 dull) 및 bri의 구별은 특정 세포 집단을 분류할때 사용되는 마커 측면에서 이해될 것이다. 해당 마커에 대해 세포를 "음성"이라고 언급할 때는, 상기 마커가 상기 세포에서 전혀 발현되지 않는다는 것을 의미하는 것은 아니다. 이는 상기 마커가 세포에서 비교적 매우 낮은 수준으로 발현되며, 마커를 검출가능하게 표지하였을때 매우 낮은 시그널을 형성함을 의미한다.
본원에서, "bright"는 검출가능하게 표지하였을 때 비교적 강한 신호를 형성하는 세포 표면상의 마커를 의미한다. 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니나, "bright" 세포는 샘플에서 다른 세포 보다 표적 마커 단백질(예, STRO-1에 의해 인식된 항원)을 더 많이 발현하는 것으로 제안된다. 예컨대, STRO-1bri 세포는 FACS 분석으로 결정된 바에 따라, FITC-접합된 STRO-1 항체로 표지하였을 때, 비-bright 세포(STRO-ldull/neg) 보다 형광 신호를 더 강하게 형성한다. 바람직하게는, "bright" 세포는 출발 샘플에 함유된 가장 밝게 표지된 골수 단핵구 세포를 약 0.1% 이상으로 포함한다. 다른 예에서, "bright" 세포는 출발 샘플에 함유된 가장 밝게 표지된 골수 단핵구 세포의 약 0.1%, 약 0.5% 이상, 약 1% 이상, 약 1.5% 이상 또는 약 2% 이상을 포함한다. 바람직한 예에서, STRO-1bright 세포는 2 log 높은 STRO-1 표면 발현을 보인다. 이는 "백그라운드" 즉 STRO-1-인 세포에 대해 상대적으로 계산된다. 비교하면, STRO-1dim 및/또는 STRO-1intermediate 세포는 2 log 이하, 전형적으로 "백그라운드" 보다 약 1 log 이하의 STRO-1 표면 발현을 보인다.
본원에서 용어 "TNAP"는 조직 비-특이적 알칼라인 포스파타제의 모든 이소형(isoform)을 망라하는 것으로 의도된다. 예컨대, 상기 용어는 간 이소형(LAP), 골 이소형(BAP) 및 신장 이소형(KAP)를 포함한다. 바람직한 예로, TNA는 BAP이다. 특히 바람직하기로는, 본원에 사용되는 TNAP는 부다페스트 조약 규정하에 2005년 12월 19일자로 ATCC에 기탁번호 PTA-7282로 기탁된 하이브리도마 세포주에서 생산되는 STRO-3 항체에 결합할 수 있는 분자를 일컫는다.
아울러 바람직한 예로 세포는 클론원성(clonogenic) CFU-F로 생장할 수 있다.
바람직하기로는, 상당 비율의 다능성 세포는 적어도 2 이상의 상이한 생식세포로 분화될 수 있다. 다능성 세포가 예정될 수 있는 계통에 대한 비제한적인 예로는, 골 전구세포; 담관 상피 세포 및 간 세포로 될 수 있는 다능성 간 세포 선조체; 희소돌기아교 세포(oligodendrocyte) 및 성상 세포(astrocyte)로 진행되는 아교 세포 전구 세포를 만들 수 있는 신경 한정 세포; 신경으로 진행되는 신경 전구세포; 심근육 및 심근 세포에 대한 전구세포, 글루코스-반응성 인슐린 분비성 췌장 β 세포주가 있다. 그외 계통으로는, 상아질모세포(odontoblast), 상아질-생산 세포 및 연골세포, 및 하기 세포의 전구 세포를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다: 망막색소 상피 세포, 섬유모세포, 각질 세포와 같은 피부 세포, 수지상 세포(dendritic cell), 모낭 세포, 신관(renal duct) 상피 세포, 평활근 및 골격근 세포, 고환 선조체, 혈관내피 세포, 힘줄, 인대, 연골, 지방 세포, 섬유모세포, 골수 기질(marrow stroma), 심장 근육, 평활근, 골격근, 혈관주위 세포(pericyte), 혈관, 상피, 아교, 신경, 성상 세포 및 희소돌기아교 세포.
일 예로, 줄기 세포 및 이의 자손 세포는 혈관주위 세포로 분화될 수 있다.
다른 예로, "다능성 세포"는 배양시 조혈 세포로 생장될 수 없다.
본 발명의 방법에 사용가능한 줄기 세포는 성체 조직, 배아 또는 태아로부터 유래될 수 있다. 용어 "성체"는 광의적으로는 출생 이후의 개체를 포함한다. 바람직한 예로, 용어 "개체"는 사춘기가 지난 개체를 의미한다. 또한, 본원에서 용어 "성체"는 여성으로부터 취한 재대혈(cord blood)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 줄기 세포의 시험관내 배양으로부터 만들어지는 자손 세포(또한, 증폭된 세포(expanded cell)라고도 함)의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 증폭된 세포는 배양 조건(배양 배지내 자극성 인자의 수 및/또는 타입을 포함함), 계대 횟수 등에 따라 매우 다양한 표현형을 가질 수 있다. 특정 예에서, 자손 세포는 모 개체로부터 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10번 계대 배양한 후 수득된다. 그러나, 자손 세포는 모 개체로부터 임의 횟수의 계배 배양하여 수득할 수도 있다.
자손 세포는 임의의 적정 배지에서 배양함으로써 수득할 수도 있다. 용어 "배지"는 본원에서 세포 배양에서 사용되는 것으로, 세포를 둘러싼 환경 성분들을 포함한다. 배지는 고체, 액체, 가스 또는 상 및 물질의 혼합일 수 있다. 배지는 액체 생장 배지 뿐 아니라 세포 생장을 지지하지 않는 액체 배지도 포함한다. 또한, 배지는 아가, 아가로스, 젤라틴 및 콜라겐 기질 등의 젤라틴성 배지를 포함한다. 또한 용어 "배지"는 세포와 접촉되지 않더라도, 세포 배양에서의 사용이 의도된 물질도 지칭한다. 즉, 박테리아 배양용으로 제조된 영양분이 풍부한 액체(nutrient rich liquid)도 배지이다. 이와 유사하게, 물이나 다른 액체와 혼합하였을 때 세포 배양에 적합하게 되는 가루 혼합물도 "분말 배지"로 지칭할 수 있다.
예로, 본 발명의 방법에 이용가능한 자손 세포는 STRO-3 항체로 표지된 자기 비드를 이용하여 골수로부터 TNAP+ 세포를 분리하고, 이를 기존과 같이 20% 소태아 혈청, 2mM L-글루타민 및 100 μM L-아스코르베이트-2-포스페이트가 보충된 α-MEM에 접종하여, 수득한다(배양 조건에 대한 보다 구체적인 사항은 Gronthos et al. (1995) 참조).
일 예로, 그러한 증폭된 세포(최소 5회 계대 배양한)는 TNAP-, CC9+, HLA 클래스 I+, HLA 클래스 II-, CD14-, CD19-, CD3-, CD11a-c-, CD31-, CD86- 및/또는 CD80-일 수 있다. 그러나, 전술한 조건과 다른 배양 조건하에서, 여러가지 마커의 발현은 바뀔 수 있다. 또한, 이러한 표현형의 세포는 증폭된 세포 집단에서 우세적인 수 있지만, 이러한 표현형(들)을 가지지 않는 세포의 비율이 소수임을 의미하진 않는다(예로, 증폭된 세포에서 적은 비율은 CC9-일 수 있음). 바람직한 일 예에서, 본 발명의 증폭된 세포는 여전히 여러가지 세포 타입으로 분화할 수 있는 능력을 가진다.
일 예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 증폭된 세포 집단은 세포의 25% 이상이, 더 바람직하기로는 50% 이상이 CC9+인 세포를 포함한다.
다른 예로, 본 발명의 방법에 사용되는 증폭된 세포 집단은 세포의 40% 이상이, 더 바람직하기로는 45% 이상이 STRO-1+인 세포를 포함한다.
다른 예로, 자손 세포는 LFA-3, THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 3G5, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD29, CD18, CD61, 인테그린 β, 6-19, 트롬보모듈린, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, 렙틴-R, (STRO-2 = Leptin-R), RANKL, STRO-1bright 및 CD146로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커 또는 이들 마커의 조합를 발현할 수 있다.
일 예로, 자손 세포는 WO 2006/032092에서 정의된 다능성 증폭된 MPC 자손(MEMP)이다. 자손이 유래될 수 있는 MPC의 농화된 집단을 제조하는 방법은 WO 01/04268 및 WO 2004/085630에 기재되어 있다. 시험관내에서, MPC는 절대적으로 순수한 조제물로서 존재하기는 어려우며, 조직 특이적 예정된 세포(tissue specific committed cells, TSCCs)인 다른 세포와 일반적으로 같이 존재할 것이다. WO 01/04268에는, 골수 유래 세포를 약 0.1% 내지 90%의 순도로 수득하는 것이 기재되어 있다. 자손이 유래되는 MPC를 포함하는 집단은 직접 조직 소스로부터 수확하거나, 또는 생체외에서 이미 증폭된 집단일 수도 있다.
예컨대, 자손은 이들이 존재하는 집단의 총 세포에 약 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 95% 이상을 차지하는, 수확된, 미증폭된 실질적으로 정제된 MPC 집단으로부터 수득될 수 있다. 상기 수준은 예컨대 TNAP, STRO-1bright, 3G5+, VCAM-1, THY-1, CD146 및 STRO-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 마커에 양성인 세포를 선별함으로써, 달성될 수 있다.
MPC 출발 집단은 WO 01/04268 또는 WO 2004/085630에 기재된 임의의 하나 이상의 조직 타입, 즉 골수, 치수세포(dental pulp), 지방 조직 및 피부, 또는 보다 광의적으로는 지방 조직, 치아, 치수, 피부, 간, 신장, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 비장, 림프절, 흉선, 췌장, 뼈, 인대, 골수, 힘줄 및 골격근으로부터 유래될 수 있다.
MEMP는 마커 STRO-1bri에 대해 양성이고 마커 알카라인 포스파타제(ALP)에 대해 음성이라는 점에서 막 회수한 MPC과 구분할 수 있다. 반면, 막 분리한 MPC는 STRO-1bri와 ALP에 모두 양성이다. 본 발명의 바람직한 예에서, 투여되는 세포들 중 적어도 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상은 표현형 STRO-1bri, ALP-를 가진다. 더 바람직한 예로, MEMP는 마커 Ki67, CD44 및/또는 CD49c/CD29, VLA-3, α3β1 중 1종 이상에 대해 양성이다. 또다른 바람직한 예로, MEMP는 TERT 활성을 나타내지 않으며/않거나, 마커 CD18에 음성이다.
일 예로, 세포는 혈관형성 관련 질환자로부터 취하여 표준 기법으로 시험관내에서 배양한 후, 환자에게 자기 이식(autologous transplant) 또는 동종 이식(allogeneic transplant)으로서 투여된다. 다른 예로, 1종 이상의 확립된 인간 세포주의 세포가 이용된다. 본 발명의 다른 유용한 예로, 인간을 제외한 동물(환자가 인간이 아니고 다른 종인 경우)의 세포가 이용된다.
본 발명은 인간을 제외한 연장류의 세포, 유제류, 개과 동물, 고양이과 동물, 토끼목, 설치류, 조류 및 어류의 세포 등의 인간을 제외한 모든 동물 종 유래의 세포를 이용하여 실시될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 영장류의 세포는 침팬지, 비비, 시노몰구스 원숭이 및 임의의 그외 신세계 또는 구세계 원숭이의 세포를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명에서 수행될 수 있는 유제류 세포로는 소, 돼지, 양, 염소, 말, 버팔로 및 비손의 세포가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명에서 실시될 수 있는 설치류 세포로는 마우스, 랫, 기니아 피그, 햄스터 및 저빌쥐가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명에서 실시될 수 있는 토끼목 동물의 예로는 토끼, 잭 토끼(jack rabbit), 산토끼(hare), 흰꼬리 토끼, 눈신 토끼(snowshoe rabbit) 및 새앙토끼가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 닭(Gallus gallus)은 본 발명에서 실시될 수 있는 조류의 일 예이다.
본 발명의 방법에 사용가능한 세포는 사용하기 전에 보관될 수 있다. 진행 세포 특히 포유류 세포의 보존 및 저장 방법 및 프로토콜은 당업계에 잘 알려져 있다(비교, 예, Pollard, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.). 간엽 줄기/선조 세포 등의 분리된 줄기 세포 또는 이의 자손의 생물학적 활성을 유지시키는 임의 방법을 본 발명에서 활용할 수 있다. 바람직한 일 예로, 세포는 동결-보존을 이용하여 유지 및 저장된다.
세포 분류 기술
본 발명의 방법에 이용가능한 세포는 다양한 기술을 이용하여 수득될 수 있다. 예로, 세포-항체 복합체 또는 항체에 부착된 표지물과 관련있는 특성을 참조하여 세포를 물리적으로 분리하는 다수의 세포 분류 기술이 사용될 수 있다. 상기 표지물은 자기 입자나 형광 분자일 수 있다. 항체는 교차 연결되어, 밀도로 분리가능한 다중 세포들의 응집물을 형성할 수 있다. 또는, 항체는 원하는 세포가 부착된 정지상 기질에 부착될 수 있다.
바람직한 예에서, TNAP+, STRO-1+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, 3G5+, CD45+, CD146+에 결합하는 항체(또는 그외 결합성 물질)를 이용하여 세포를 분리한다. 더 바람직하기로는, TNAP+ 또는 STRO-1+에 결합하는 항체(또는 그외 결합성 물질)를 이용하여 세포를 분리한다.
결합되지 않은 세포들로부터 항체-결합된 세포를 분리하는 다양한 방법들이 알려져 있다. 예로, 세포에 결합된 항체 (또는 항-이소형 항체)를 표지한 다음, 표지물의 존재를 검출하는 기계적 세포 분류기에 의해 세포를 분리할 수 있다. 형광-활성화된 세포 분류기가 당업계에 잘 알려져 있다. 일 예로, 항-TNAP 항체 및/또는 STRO-1 항체는 고형 지지체에 부착된다. 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 중공 섬유막 폴리머 및 플라스틱 페트리 디쉬 등의 다양한 고형 지지체들이 당업자들에게 알려져 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 항체에 의해 결합되는 세포는 간단하게 고체 지지체를 세포 현탁물로부터 물리적으로 분리함으로써, 세포 현탁물로부터 취할 수 있다.
초상자성 미세입자도 세포 분리에 사용될 수 있다. 예로, 미세입자를 항-TNAP 항체 및/또는 항-STRO-1 항체로 코팅할 수 있다. 그런 후, 항체-텍이 달린, 초상자성 미세입자를 목적 세포가 함유된 용액과 함께 배양할 수 있다. 미세입자는 원하는 줄기 세포의 표면에 결합하며, 이들 세포는 자기장에서 수집할 수 있다.
다른 예로, 세포 샘플은 예컨대 고상-연결된 항-TNAP 단일클론 항체 및/또는 항-STRO-1 단일클론 항체에 대한 물리적 접촉이 허용된다. 고상 연결은 예로 플라스틱 니트로셀룰로스 또는 다른 표면에 항체 흡착을 포함할 수 있다. 또한, 항체는 중공 섬유막의 대구경(세포 통과(flow-through)가 가능할 만큼 충분히 큼)의 벽에 흡착될 수 있다. 또한, 항체는 파마시아의 세파로즈 6 MB 마크로비드 등의 비드나 표면에 공유결합으로 연결될 수 있다. 고상-연결된 항체와 줄기 세포-함유성 현탁물의 실제 인큐베이션 조건과 기간은 사용되는 시스템에 특이적인 수종의 인자에 따라 결정된다. 그러나, 적절한 조건의 선택은 당업자들에게 자명한 것이다.
그 후, 줄기 세포가 결합될 충분한 시간을 준 후, 생리 완충액으로 결합되지 않은 세포를 용리 또는 씻어 제거한다. 결합되지 않은 세포는 회수한 다음, 다른 목적으로 사용하거나 또는 원하는 분리가 달성되었는지를 확실하게 하기 위해 적합한 테스트를 행한 다음, 폐기할 수 있다. 결합된 세포는 주로 고상 및 항체의 성질에 따라 적절한 임의 방법에 의해 고상으로부터 분리한다. 예로, 결합된 세포는 활발한 교반에 의해 플라스틱 페트리 디쉬로부터 용리시킬 수 있다. 또는, 결합된 세포는 고상 및 항체 간에 효소-반응성 "스페이서" 서열을 절단하거나 효소를 이용한 "닉킹(nicking)"에 의해 용리시킬 수 있다. 아가로스 비드에 결합된 스페이서는 예컨데 파마시아로부터 상업적으로 구입가능하다.
용리시킨 농화된 세포 분획은 원심분리에 의해 완충액으로 세정할 수 있으며, 상기 농화된 분획은 통상적인 기술에 따라 이후 사용을 위해 살아있는 상태로 동결보존하거나, 증폭 배양하거나, 및/또는 환자에게 도입할 수 있다.
조성물 및 이의 투여
전형적으로, 세포는 한가지 이상의 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약리학적 조성물로 투여된다. "약리학적으로 허용가능한"이라는 표현은, 신뢰성 있는 의학적 판단 범위내에 속하며 과도한 독성 자극, 알레르기 반응인 그외 문제나 합병증 없이 인간 및 동물의 조직에 접촉하는 형태로 사용하기에 적합하며, 합리적인 유익성/위험성 비율을 보이는, 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투약 형태를 지칭한다. 본원에서 "약리학적으로 허용가능한 담체"라는 표현은 약리학적으로 허용가능한 물질, 조성물, 또는 액체나 고체 필러, 희석제, 부형제 또는 용매 캡슐화 물질(solvent encapsulating material) 등의 비히클을 의미한다.
약리학적으로 허용가능한 담체는 염수, 수계 완충 용액, 용매 및/또는 분산 매질을 포함한다. 이러한 담체의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 용액은 바람직하기로는 멸균성이고 용이하게 주사가능할 정도의 유동성을 가진다. 바람직하기로는, 용액은 제조 및 보관 조건하에서 안정적이며, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등의 사용하여 박테리아 및 진균 등의 미생물 오염 가능성으로부터 보호된다.
약리학적으로 허용가능한 담체로서 제공할 수 있는 물질 및 용액에 대한 일부 예로는, (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 슈크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말화된 트래거갠스; (5) 말트; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약용 왁스; (9) 오일류, 예컨대 피넛 오일, 면실유, 사플라워 오일(safflower oil), 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 콩유; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충성 물질, 예컨대 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드; (15) 알긴산; (16) 발열성 물질이 제거된 물(pyrogen-free water); (17) 등장성 염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충화된 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리안하이드라이드; 및 (22) 그외 약리학적 제형에 사용되는 무독성의 상용성 물질.
본 발명의 방법에 사용가능한 약리학적 조성물은 폴리머성 담체나 세포외 기질을 포함할 수 있다.
다양한 생물학적 또는 합성된 고체 매트릭스 물질(예, 고체 지지 매트릭스, 생물학적 점착제 또는 드레싱제, 및 생물학적/의학적 스캐폴드)은 본 발명에 사용하기 적합하다. 매트릭스 물질은 바람직하기로는 생체내 적용에 사용하기에 의학적으로 허용가능하다. 이러한 의학적으로 허용가능한 및/또는 생물학적으로 또는 생리적으로 허용가능한, 또는 상용가능한 물질에 대한 비제한적인 예로는 예컨대 돼지 유래의 (및 그외 SIS 소스) 소장 점막하(small intestine submucosa, SIS)와 같은, 흡수가능한 고체 매트릭스 물질 및/또는 흡수불가한 고체 매트릭스 물질; 가교된 또는 가교되지 않은 알기네이트, 하이드로콜로이드, 폼(foam), 콜라겐 젤, 콜라겐 스폰지, 폴리글리콜산(PGA) 메쉬, 폴리글랙틴(PGL) 메쉬, 플리스(fleece), 폼 드레싱, 생체점착제(예, 피브린 글루 및 피브린 젤) 및 1층 이상의 탈상피화한 죽은 피부 등가물을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
피브린 글루는 다양한 임상적인 상황에서 사용되는 외과 봉합제의 한 부류이다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 많은 밀봉제들이 본 발명의 방법에 사용하기 위한 조성물에 이용가능하다. 그러나, 본 발명의 바람직한 예는 본원에 언급된 세포와 함께 사용되는 피브린 글루의 용도에 관한 것이다.
본원에서, 용어 "피브린 글루"는 칼륨 이온의 존재시 피브린 폴리머의 가교에 의해 형성된 불용성의 매트릭스를 지칭한다. 피브린 글루는, 피브린 매트릭스를 형성하는 유체나 생물 조직으로부터 유래된, 피브리노겐이나 이의 유도체 또는 대사산물, 피브린(수용성 단량체 또는 폴리머) 및/또는 이의 복합체로부터 만들 수 있다. 또한, 피브린 글루는, 재조합 DNA 기술에 의해 생산된, 피브리노겐, 이의 유도체, 이의 대사산물, 또는 피브린으로부터 만들 수 있다.
또한, 피브린 글루는 피브리노겐와 피브린 글루 형성 촉매(예, 트롬빈 및/또는 팩터 XIII)와의 상호작용에 의해 만들어질 수 있다. 당업자에게 자명할 바와 같이, 피브리노겐은 촉매(예, 트롬빈)의 존재시 단백질이 절단되어 피브린 단량체로 변환된다. 피브린 단량체는 이후 가교되어 피브린 글루 매트릭스를 형성할 수 있는 폴리머를 형성할 수 있다. 피브린 폴리머의 가교는 팩터 XIII과 같은 촉매의 존재에 의해 강화될 수 있다. 피브린 글루 형성의 촉매는 혈장, 동결침전물 또는 피브리노겐이나 트롬빈을 포함하고 있는 그외 혈장 분획으로부터 유래될 수 있다. 또는, 촉매는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다.
응괴 형성율은 피브리노겐과 혼합된 트롬빈의 농도에 의해 좌우된다. 효소 의존적인 반응으로, 온도가 높을수록(최대 37 ℃), 응괴 형성율은 빨라진다. 응괴의 장력 강도는 사용되는 피브리노겐의 농도에 의존적이다.
피브리노겐 글루의 용도 및 이의 제조 및 사용 방법은 미국 특허 5,643,192에 기재되어 있다. 미국특허 5,643,192에는 단일 공여체로부터 피브리노겐과 트롬빈 성분의 추출과 단지 피브린 글루로서 사용하기 위한 이들 성분들의 조합이 기재되어 있다. 미국 특허 5,651,982에는 피브린 글루의 다른 제조 방법 및 이용 방법이 기재되어 있다. 미국 특허 5,651,982에서는 동물에서 국소 봉합제로 사용하기 위한 피브린 글루와 리포좀을 제시한다.
몇가지 공개문헌들에 치료제의 전달을 위한 피브린 글루의 사용이 개시되어 있다. 예로, 미국 특허 4,983,393에는 아가로스, 아가, 염수 용액, 글리코사미노글리칸, 콜라겐, 피브린 및 효소를 포함하는 질내 삽입물로서 이용하기 위한 조성물이 개시되어 있다. 또한, 미국 특허 3,089,815에는 피브리노겐 및 트롬빈으로 구성된 주사용 약리학적 조제물이 개시되어 있으며, 미국 특허 6,468,527에는 체내 특정 부위에 다양한 생물학제 및 비-생물학제의 전달을 용이하게 하는 피브린 글루가 개시되어 있다. 이러한 처치는 본 발명의 방법에 이용될 수 있다.
적합한 폴리머성 담체로는 합성 폴리머나 천연 폴리머로 형성된 다공성 메쉬나 스폰지 뿐만 아니라 폴리머 용액을 포함한다. 매트릭스의 한가지 형태는 폴리머성 메쉬 또는 스폰지이며, 다른 형태는 폴리머성 하이드로겔이다. 사용될 수 있는 천연 폴리머로는 콜라겐, 알부민 및 피브린 등의 단백질을 포함하며, 알기네이트 등의 다당류 및 히알루론산 폴리머를 포함한다. 합성 폴리머로는 생분해성 및 비-생분해성 폴리머 둘다를 포함한다. 생분해성 폴리머의 예로는 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 및 폴리락트산-글리콜산(PLGA) 등의 하이드록시산의 폴리머, 폴리오르쏘에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리포스파젠 및 이들의 조합이 있다. 비-생분해성 폴리머로는 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 에틸렌 비닐 아세테이트 및 폴리비닐 알코올이 있다.
가단성의 이온성 또는 공유결합에 의해 가교된 하이드로겔을 형성할 수 있는 폴리머를 이용하여 세포를 캡슐에 넣는다. 하이드로겔은 공유결합, 이온결합 또는 수소결합을 콩해 유기 폴리머(천연 또는 합성)가 가교되어 물 분자를 포착하여 젤이되는 3차 구조의 오픈-격자 구조를 형성할때 만들어지는 물질이다. 하이드로겔을 형성하는데 사용가능한 물질의 예로는, 이온에 의해 가교된, 알기네이트 등의 다당류, 폴리포스파진 및 폴리아크릴레이트, 또는 Pluronics™ 또는 Tetronics™ 등의 블록 공중합체, 온도 또는 pH에 의해 각각 가교된 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 글리콜 블록 공중합체가 있다. 다른 물질로는 피브린 등의 단백질, 폴리비닐피롤리돈, 히알루론산 및 콜라겐 등의 폴리머가 있다.
일반적으로, 이들 폴리머는 하전된 측기를 가진, 물, 완충화된 염 용액 또는 알코올 수용액 등의 수용액이나, 또는 이들의 일가 이온 염에 어느 정도 용해가능하다. 양이온과 반응가능한 산성 측기를 가진 폴리머의 예로는 폴리(포스파젠), 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 아크릴산과 메타크릴산의 공중합체, 폴리(비닐 아세테이트) 및 설폰화된 폴리머, 예컨대 설폰화된 폴리스티렌이 있다. 아크릴산 또는 메타크릴산과 비닐 에테르 모노머 또는 폴리머의 반응에 의해 형성되는 산성 측기를 가진 공중합체도 이용될 수 있다. 산성기의 예로는 카르복시산기, 설폰산기, 할로겐화된(바람직하기로는 불소화된) 알코올기, 페놀성 OH 기 및 산성 OH 기이다. 음이온과 반응가능한 염기성 측기를 가진 폴리머의 예로는 폴리(비닐 아민), 폴리(비닐 피리딘), 폴리(비닐 이미다졸) 및 일부 이미노 치환된 폴리포스파젠이 있다. 또한, 폴리머의 암모늄 또는 4급 염이 벡본 질소나 펜단트 이미노기로부터 형성될 수 있다. 염기성 측기의 예로는 아미노기와 이미노기가 있다.
추가로, 본 발명의 방법에 이용되는 조성물은 1종 이상의 치료제를 포함할 수 있다. 예로, 조성물은 염증이나 통증 치료를 돕기 위해 진통제, 기타 항-혈관형성 화합물 또는 조성물과 함께 처리되는 부위의 감염을 예방하기 위한 항-감염제를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, 사용가능한 치료제의 비제한적인 예로는 하기 치료제 카테고리들을 포함한다: 진통제, 예컨대 비스테로이드계 항-염증제, 아편 작용제(opiate agonist) 및 살리실레이트; 항-감염제, 예컨대 항기생충제, 항혐기성제, 항생제, 아미노글리코사이드 항생제, 항진균성 항생제, 세팔로스포린 항생제, 마크롤라이드 항생제, 다양한 β-락탐 항생제들, 페니실린 항생제, 퀴놀론 항생제, 설폰아미드 항생제, 테트라사이클린 항생제, 항-미코박테리아제, 항-튜베르큘로시스 항-미코막테리아제, 항-원생동물제, 항-말라리아성 항-원생동물제, 항-바이러스제, 항-레트로바이러스제, 옴벌레 살충제, 항-염증제, 코르티코스테로이드 항-염증제, 항소양제/국소 마취제, 국소 항-감염제, 항-진균성 국소 항-감염제, 항-바이러스성 국소 항-감염제; 전해질 및 신장 물질, 예컨대 산성화제, 염기성화제, 이뇨제, 탄산 탈수효소 억제성 이뇨제(carbonic anhydrase inhibitor diuretics), 루프 이뇨제(loop diuretic), 삼투성 이뇨제, 칼륨 보존성 이뇨제(potassium-sparing diuretic), 티아자이드 이뇨제, 전해질 보충제 및 요산배설제(uricosuric agent); 효소, 예컨대 췌장 효소 및 트롬빈 분해 효소(thrombolytic enzyme); 위장 효소, 예컨대 지사제, 위장 항-염증제, 제산성 항-궤양제, 위산-펌프 저해제 항-궤양제, 위막 항-궤양제, H2-차단제 항-궤양제, 콜레리톨라이틱 물질(cholelitholytic agent), 소화제, 구토제, 변비제 및 대변 연화제, 및 운동 촉진제(prokinetic agent); 일반 마취제, 예컨대 흡입 마취제, 할로겐화된 흡입 마취제, 정맥내 마취제, 바르비투레이트 정맥내 마취제, 벤조디아제핀 정맥내 마취제 및 아편 작용제 정맥재 마취제; 호르몬과 호르몬 변형제, 예컨대 낙태제, 부신제(adrenal agent), 코르티코스테로이드 부신제, 안드로겐, 항-안드로겐, 면역생물학제, 예컨대 면역글로불린, 면역제제, 톡소이드 및 백신; 국소 마취제, 예컨대 아미드 국소 마취제 및 에스테르 국소 마취제; 근골격제(musculoskeletal agent), 예컨대, 항-통풍 항-염증제, 코르티코스테로이드 항-염증제, 금 화합물 항-염증제, 면역억제성 항-염증제, 비스테로이드성 항-염증제(NSAID), 살리실레이트 항-염증제, 미네랄류; 및 비타민, 예컨대 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 및 비타민 K.
단독 조성물로 또는 병용 요법으로서, 본 발명과 함께 사용할 수 있는 그외 항-혈관형성성 인자의 예로는, 혈소판 인자 4; 프로타민 설페이트; 황화(Sulphated) 키틴 유도체(퀸크랩 껍질로부터 제조); 황화 다당류 펩티도글리칸 복합체(SP-PG)(이 화합물의 기능은 에스트로겐과 같은 스테로이드 및 타목시펜 사이트레이트의 존재에 의해 강화될 수 있음); 스타우로스포린(Staurosporine); 매트릭스 대사의 모듈레이터, 예컨대 프롤린 유사체, 시스하이드록시프롤린, d,L-3,4-데하이드로프롤린, 티아프롤린, α,α-디피리딜, 아미노프로피오니트릴 퓨마레이트; 4-프로필-5-(4-피리디닐)-2(3H)-옥사졸론; 메토트렉세이트; 미톡잔트론; 헤파린; 인터페론; 2 마크로글로불린-혈청; ChIMP-3; 키모스타틴; 사이클로덱스트린 테트라데카설페이트; 에포네마이신; 캄프토테신; 푸마길린(Fumagillin); 골드 소듐 티오말레이트(Gold Sodium Thiomalate); 항-콜라게나제-혈청; α2-항플라스민(antiplasmin); 비산트렌(Bisantrene)(National Cancer Institute); 로벤자릿 디소듐(Lobenzarit disodium)(N-(2)-카르복시페닐-4-클로로안트로닐산 디소듐); 탈리도미드(Thalidomide); 안고스타트 스테로이드(Angostatic steroid); AGM-1470; 카르복시아미노이미다졸; 및 BB94와 같은 메탈로프로테나제 저해제가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
특정 예로, 치료제는 성장 인자 또는 세포 분화 및/또는 증식에 작용하는 그외 분자일 수 있다. 최종 분화 상태를 유도하는 성장 인자는 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 최종 분화 상태를 유도하는 것으로 입증된 임의의 그러한 인자로부터 선택될 수 있다. 본원에 기재된 방법에 이용하기 위한 성장 인자는 특정 예로 천연적으로 형성되는 성장 인자의 다변체 또는 단편일 수 있다.
본 발명의 방법에 이용가능한 조성물은 세포 배양 성분들, 예컨대 아미노산, 금속류, 코엔자임 인자를 포함하는 배양 배지 뿐 아니라 낮은 비율의 다른 세포, 예컨대 줄기 세포의 이후 분화에 의해 생길 수 있는 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용가능한 조성물은 예컨대 배양 배지로부터 대상 세포를 침전시키고, 이를 원하는 용액이나 물질에 재현탁하여 준비할 수 있다. 세포는 예컨대 원심분리, 여과, 초여과 등에 의해 배양 배지로부터 침전 및/또는 거를 수 있다.
당업자는 조성물내 세포 및 최적 담체(들)의 함량 및 본 발명의 방법으로 투여할 세포 및 최적 담체(들)의 함량을 쉽게 결정할 수 있다. 일 예로, 임의의 첨가제(활성 세포(들) 이외에도)가 포스페이트 완충화된 염수에 0.001 - 50% (중량)으로 존재되며, 활성 성분은 약 0.0001 - 약 5 wt %, 바람직하기로는 약 0.0001 - 약 1 wt %, 더 바람직하기로는 약 0.0001 - 약 0.05 wt % 또는 약 0.001 - 약 20 wt %, 바람직하기로는 약 0.01 - 약 10 wt %, 및 더 더욱 바람직하기로는 약 0.05 - 약 5 wt %와 같이 수 마이크로그램 내지 밀리그램 수준으로 존재된다. 물론, 동물이나 인간에 투여할 임의 조성물 및 임의의 특정 투여 방법에 있어, 적합한 동물 모델, 예컨대 마우스와 같은 설치류에서의 치사량(LD) 및 LD50을 결정함에 의한 것과 같은 독성; 및 적합한 반응을 도출하는, 조성물(들)의 투여량, 이에 포함된 성분의 농도 및 조성물(들)의 투여 시기를 결정하는 것이 바람직하다. 이러한 결정은 당업자의 지식, 본 발명에 언급된 사항 및 문헌으로부터 과도한 실험없이 이루어진다. 그리고, 연속 투여 시간도 과도한 실험없이 확인할 수 있다.
조성물내 세포 농도는 적어도 약 5 x 105 cells/mL, 적어도 약 1 x 106 cells/mL, 적어도 약 5 x 106 cells/mL, 적어도 약 107cells/mL, 적어도 약 2 x 107cells/mL, 적어도 약 3 x 107cells/mL, 또는 적어도 약 5 x 107cells/mL일 수 있다.
본 발명의 방법에 이용가능한 조성물은 특히 카테터 적용 등의 국소 주사, 전신 주사, 국소 주사, 정맥내 주사, 자궁내 주사 또는 비경구 투여를 통해 투여될 수있다. 본원에 기재된 치료 조성물(예, 약리학적 조성물)을 투여할 때, 단위 투약 주사형(용액, 현탁, 에멀젼)으로 일반적으로 제형화될 것이다.
유전자 변형된 세포의 제조
일 예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 세포는 유전자 변형된다. 바람직하기로는, 세포는 유전자 변형되어 이종의 단백질을 생산한다. 전형적으로, 세포는 세포에서 이종의 단백질이 분비되도록 유전자가 변형될 것이다. 그러나, 일 예로, 세포는 dsRNA (전형적으로 RNA 침묵화), 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 촉매성 뉴클레익산(리보자임 또는 DNAzyme 등)과 같은 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 기능성 비-단백질을 발현하도록 변형될 수 있다.
유전자 변형된 세포는 변형된 세포의 생장을 뒷받침하는데 충분한 양으로 하나 이상의 사이토카인의 존재하에 배양될 수 있다. 이렇게 수득한 유전자 변형된 세포는 즉시 사용되거나(예, 이식), 시험관내에서 배양 및 증폭시키거나, 또는 나중에 사용하기 위해 보관할 수 있다. 변형된 세포는 당업계에 잘 알려진 방법, 예컨대 액체 질소에 동결에 의해 보관될 수 있다.
본원에서 유전자 변형은 외인성 또는 외래 폴리뉴클레오타이드의 본 발명에 기재된 세포에 도입, 또는 세포내 내인성 유전자의 변형을 포함하는 모든 유전자 변형 방법을 망라한다. 유전자 변형은 형질전이(숙주 또는 공여체로부터 수여체로 숙주 DNA를 시험관내 또는 생체내 바이러스 매개 전달), 형질감염(분리된 바이러스 DNA 게놈을 세포에 형질전환), 리포좀 매개 전달, 전기천공, 칼슘 포스페이트 형질감염 또는 공침전 등을 포함하나, 이들러 한정되지 않는다. 형질전이 방법은 세포와 생산자 세포의 직접 공배양(Bregni et al., 1992) 또는 적절한 성장 인자 및 폴리양이온과 함께 또는 첨가없이 배양하는 것을 포함한다.
본 발명의 이용가능한 예로, 세포는 일반적으로 혈관형성을 파괴 또는 저해하는 유전자를 포함하도록 유전자 변형된다. 유전자는 리신 등의 세포독성 물질을 코딩할 수 있다. 다른 예로, 유전자는 면역 거부 반응을 도출하는 세포 표면 분자를 코딩한다. 예로, 세포는 α1,3 갈락토실 트랜스퍼라제를 생산하도록 유전자 변형될 수 있다. 이러한 유전자는 주된 이종항원(xenoantigen)인 α1,3 갈락토실 에피토프를 합성하며, 이의 발현은 수행된 순환성 항체에 의해 및/또는 T 세포 매개 면역 반응에 의한 형질전환 내피 세포의 초급성 면역 거부를 초래한다.
외인성 폴리뉴클레오티드는 바람직하기로는 벡터 형태로 세포에 도입된다. 벡터는 바람직하기로는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 포함한다. 벡터와 같은 구조체에 사용되는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예로, 적합한 발현 벡터를 구축하는 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (3rd Ed., 2000); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1999)에 상세하기 기재되어 있다.
벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-조합 바이러스(adeno-associated viruse) 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 등의 바이러스 벡터; 코스미드; 플라스미드 벡터; 합성 벡터; 및 당업계에서 전형적으로 이용되는 그외 재조합 비히클을 포함할 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결될 수 있는, 프로모터 및 클로닝 사이트 둘다가 있는 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 벡터는 시험관내 또는 생체내에서 RNA를 전사할 수 있으며, Stratagene (La Jolla, Calif.) 및 Promega Biotech (Madison, Wis.) 등의 공급처로부터 상업적으로 이용가능하다. 구체적인 예로는 Stratagene 사의 pSG, pSV2CAT, pXtl; Pharmacia 사의 pMSG, pSVL, pBPV 및 pSVK3가 있다.
바람직한 벡터는 레트로바이러스 벡터를 포함한다(Coffin et al., "Retroviruses", Chapter 9 pp; 437-473, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997 참조). 본 발명에 이용가능한 벡터는 당업계에 잘 알려진 과정에 의해 재조합으로 생산할 수 있다. 예컨대, WO94/29438, WO97/21824 및 WO97/21825는 레트로바이러스 패킹 플라스미드 및 패킹 세포주의 구축을 설명하고 있다. 예시적인 벡터로는 pCMV6b 및 pCMV6c(Chiron Corp.)와 같은 pCMV 포유류 발현 벡터, pSFFV-Neo, 및 pBluescript-Sk+가 있다. 이용가능한 레트로바이러스 벡터의 비제한적인 예는 쥐과, 조류, 영장류 레트로바이러스로부터 유래된 것이다. 통상적인 레트로바이러스 벡터는 Moloney 쥐과 백혈병 바이러스(MoML V-벡터)를 기본으로한 벡터를 포함한다. 다른 MoMLV 유래 벡터로는 Lmily, LINGFER, MINGFR 및 MINT가 있다. 다른 벡터로는 Gibbon ape 백혈병 바이러스(GALV) 및 Moloney 쥐과의 품종 바이러스(MOMSV), 및 SFFV(spleen focus forming virus)가 있다. 쥐과의 줄기세포 바이러스(MESV) 유래 바이러스로는 MESV-MiLy가 있다. 또한, 레트로바이러스 벡터로는 렌티바이러스를 기본으로하는 벡터가 있으며, 비제한적인 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1 및 HIV-2)을 기본으로하는 벡터가 있다.
레트로바이러스 벡터 구조체 생산에 있어서, 바이러스 gag, pol 및 env 서열을 바이러스에서 제거하여, 외래 DNA 서열 삽입을 위한 공간을 형성할 수 있다. 외래 DNA에 의해 코딩된 유전자는 일반적으로 LTR(long terminal repeat)에서 강력한 바이러스 프로모터의 통제하에 발현된다. 적절한 조절 서열의 선택은 사용되는 숙주 세포에 따라 다르며, 선택은 당업자의 기술 범위내에 속한다. LTR 프로모터 외에도 다수의 프로모터가 공지되어 있다. 비제한적인 예로는 파지 람다 PL 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터(immediate early promoter); MMSV(Moloney Murine Sarcoma Virus), RSV(Rous Sacroma Virus) 또는 SFFV(Spleen Focus Forming Virus)의 U3 영역 프로모터; Granzyme A 프로모터; 및 Granzyme B 프로모터가 있다. 부가적으로, 유도가능한 또는 복수의 통제 요소가 사용될 수 있다. 적합한 프로모터의 선택은 당업자에게 명백할 것이다.
이러한 구조체는 gag, pol 및 env 기능이 세포주 팩킹에 의해 트랜스로 제공되는 경우에, 효율적으로 바이러스 입자로 팩킹될 수 있다. 따라서, 벡터 구조체를 팩킹 세포에 도입하였을 때, 세포에서 생산된 gag-pol 및 env 단백질은 벡터 RNA와 조합되어, 배양 배지로 분비되는 감염성 바이론(infectious viron)을 생산한다. 따라서, 제조된 바이러스는 표적 세포에 감염되어 DNA에 삽입할 수 있지만, 필수 팩킹 서열이 없어 감염성 바이러스 입자를 형성할 수 없다. 현재 이용되는 대부분의 팩킹 세포주는 각각 필수 코딩 서열들중 하나를 포함하고 있는 개별 플라스미드로 형질전환되며, 따라서, 복제 가능 바이러스의 제조 전에 여러번의 재조합 반응이 필수적으로 이루어진다. 대안적으로, 팩킹 세포주는 프로바이러스(provirus)를 가진다. 상기 프로바이러스는 무력화(crippled)되어, 감염성 바이러스 조합에 필요한 모든 단백질을 생산할 수 있지만, 그것의 RNA는 바이러스로 팩킹될 수 없다. 재조합 바이러스로부터 생산된 RNA가 대신 팩킹된다. 따라서, 팩킹 세포로부터 방출되는 바이러스 스톡(stock)은 오직 재조합 바이러스만을 포함한다. 레트로바이러스 팩킹 세포주의 비제한적인 예로는 PA12, PA317, PE501, PG13, PSI.CRIP, RDI 14, GP7C-tTA-G10, ProPak-A(PPA-6) 및 PT67가 있다.
그외 적합한 벡터로 아데노바이러스 벡터(WO 95/27071) 및 아데노-조합 바이러스 벡터를 포함한다. 이러한 벡터는 Stem Cell Biology and Gene Therapy, eds. Quesenberry et al., John Wiley & Sons, 1998 및 미국 특허 제 5,693,531호 및 제 5,691,176호에 개시된 바와 같이, 당업계에 잘 알려져 있다. 아데노바이러스 유래 벡터는 비-분열 세포에 감염할 수 없어 특정 조건하에서는 유용하게 사용할 수 있다. 레트로바이러스 DNA와는 달리, 아데노바이러스 DNA는 표적 세포의 게놈으로 삽입되어 들어가지 않는다. 또한, 외래 DNA를 수송하는 능력은 레트로바이러스 벡터 보다 아데노바이러스 벡터가 더 낫다. 아데노-조합 바이러스 벡터는 또 하나의 유용한 전달 시스템이다. 이러한 바이러스의 DNA는 비-분열 세포에 삽입될 수 있으며, 다수의 폴리뉴클레오티드는 아데노-조합 바이러스 벡터를 이용하여 여러가지 세포 타입에 성공적으로 도입된다.
일부 예들에서, 구조체 또는 벡터는 2 이상의 이종의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다. 바람직하기로는, 상기 부가적인 핵산 서열은 선택 마커, 구조 유전자, 치료 유전자 또는 사이토카인/케모카인 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
선택 마커는 성공적인 유전자 변형을 모니터링하기 위한 목적으로, 그리고 DNA가 삽입된 세포를 선택하기 위한 목적으로, 구조체 또는 벡터에 포함될 수 있다. 비제한적인 예로는 약물 내성 마커, 예컨대 G148 또는 히그로마이신을 포함한다. 추가적인 음성 선택을 사용할 수 있으며, 예컨대 마커는 HSV-tk 유전자이다. 이 유전자는 세포가 어사이클로비르(acyclovir) 및 간사이클로비르(gancyclovir)와 같은 물질에 민감하게 만들 것이다. NeoR(네오마이신/G148 내성) 유전자가 통상적으로 사용되지만, 표적 세포에 기존재하지 않는 유전자 서열의, 임의의 기존 마커 유전자를 사용할 수 있다. 다른, 비제한적인 예로는 저-친화성 NGFR(low-affinity Nerve Growth Factor), EFGP(enhanced fluorescent green protein), DHFR(dihydrofolate reductase gene), 세균 hisD 유전자, 쥐과의 CD24(HSA), 쥐과의 CD8a(lyt), 퓨로마이신이나 플레오마이신에 내성을 부여하는 세균성 유전자, 및 β-갈락토시다제가 있다.
추가적인 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 동일한 벡터상에서 세포에 도입될 수 있거나, 또는 제2 벡터상에서 숙주 세포에 도입될 수 있다. 바람직한 예에서, 선별 마커는 폴리뉴클레오티드와 동일한 벡터상에 포함될 것이다.
또한, 본 발명은 내인성 유전자의 발현이 상향 조절되어 천연형 세포 보다 코딩된 단백질의 생산이 증가되도록, 내인성 유전자의 프로모터 영역을 유전자 변형하는 것을 포함한다.
항암제 전달
용어 "항암제"는 본원에서 암세포의 기능을 저해 또는 예방하거나/하며 암세포의 파괴를 야기하는 모든 물질을 의미한다. 예로, 항암제는 세포독성 물질이다. 항암제는 줄기 세포나 이의 자손 세포에 접합될 수 있다. 예로, 줄기 세포나 이의 자손 세포는 항암제를 코딩하는 트랜스유전자를 포함한다.
본원에서 용어 "세포독성 물질"은 세포의 기능을 저해 또는 예방하거나/하며 세포의 파괴를 야기하는 모든 물질을 의미한다. 이 용어는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편 등의 독소 및 화학치료제를 포함한다. 세포독성 물질은 항체 등의 세포 표적화 모이어티에 접합될 수 있다. 바람직한 예로, 세포독성 물질은 유전자 변형된 세포의 트랜스유전자로부터 생산된다.
바람직한 예로, 항암제는 줄기 세포나 이의 자손 세포를 죽이진 않는다. 이러한 물질의 예로는 IL-2, 인터페론-감마, 항-VEGF 단일클론 항체 및 암세포에 의해 코딩되는 중요한 유전자를 타겟으로 하는 리보자임 및 dsRNA 등의 생물학적으로 활성인 핵산이 있다. 또한, 항암제는 활성 항암제를 분비하도록 생체내에서 처리(예, 절단 등)되는 프로-독소 형태일 수 있다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 원하는 생물학적 활성, 예컨대 암세포 결합을 나타내는, 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중특이 항체(예, 이중특이 항체) 및 항체 단편을 망라한다. 항체는 쥐과, 인과, 인간화된, 키메라 또는 다른 종으로부터 유래될 수 있다.
"항체 단편"은 전장 항체의 일부분, 일반적으로 항원 결합부 또는 이의 가변부를 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 이중 특이 항체(diabody); 선형 항체; Fab 발현 라이브러리에서 제조되는 단편, 항-이디오타입(anti-Id) 항체, CDR(complementary determining region), 및 면역특이적으로 암세포 항원에 결합하는 전술한 임의의 것의 에피토프-결합 단편, 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로부터 만들어진 다중특이 항체가 있다.
세포독성 물질로 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 단백질 독소 및 이의 단편으로는 디프테리아 A 체인, 디프테리아 독소의 비결합성 활성 단편, 콜레라 독소, 보툴리누스 독소, 엑소톡신A 체인, α-사르신(saecin), 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질(dianthin protein), 미국자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 저해제, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 비누풀(sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌(gelonin), 사포린(saporin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭톡신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 및 트리코테센(tricothecene)을 포함한다.
종양 관련 항원 또는 항체-세포독성 접합체에 의해 표적될 수 있는 세포 표면 리셉터의 예로는, BMPR1B(골 형태형성 단백질 수용체-타입 1B), E16, STEAP1(six transmembrane epithelial antigen of prostate), 0772P(CA125, MUC16), MPF(MSLN, SMR, megakaryocyte potentiating factor, mesothelin), Napi3b(NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 캐리어 패밀리 34(소듐 포스페이트), member 2, 타입 II 소듐-의존적인 포스페이트 트랜스포터 3b), Sema 5b(FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaphorin 5b Hlog, sema domain, 7개의 트롬보스포딘 리피트(타입 I 및 타입 1-유사), 트랜스멤브레인 도메인(TM) 및 짧은 세포질 도메인, (semaphorin) 5B, PSCA hlg(2700050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자), ETBR(엔도텔린 타입 B 수용체), MSG783(RNF124, 가정 단백질 FLJ20315), STEAP2(IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 관련 유전자 1, 전립선암 관련 단백질 1, six transmembrane epithelial antigen of prostate 2, six transmembrane prostate protein), TrpM4(BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 4), CRIPTO(CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 테라토카시노마-유래 성장 인자(teratocarcinoma-derived growth factor)), CD21(CR2 (Complement receptor 2) 또는 C3DR(C3d/Epstein Barr virus receptor) 또는 Hs.73792), CD79b(CD79B, CD79p, IGb(immunoglobulin-associated beta), B29, FcRH2(IFGP4, IRTA4, SPAP1A(SH2 domain containing phosphatase anchor protein 1a), SPAP1B, SPAP1C), HER2, NCA, MDP, IL20Ra, EphB2R, ASLG659, PSCA, GEDA, BAFF-R(B cell-activating factor receptor, BLyS receptor 3), CD22(B-세포 수용체 CD22-β 이소형), CD79a, CXCR5 (Burkitt's lymphoma receptor 1), HLA-DOB (펩타이드에 결합하여 이를 CD4+ T 림프구에 제시하는 MHC 클래스 II 분자의 β 서브유닛(Ia 항원)), P2X5(퓨린성 수용체(Purinergic receptor) P2X 리간드-게이트 이온 채널 5), CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2), LY64(림프구 항원 64(RP105)), FCRH1(Fc 수용체-유사 단백질 1), IRTA2(Immunoglobulin superfamily receptor translocation associated 2), 및 TENB2가 있으나, 이들로 한정되진 않는다.
도 1. 레이저 광응고된 눈(laser photocoagulated eye)의 CFP 및 FA
각 시점을 대표하는 눈 사진은 레이저 병변(1a 화살표), 7 일(1b), 14 일(1c) 및 28 일(1d)에 조합된 플루오로세인 누출을 나타낸다.
도 2. 각 시점에서의 레이저 병변의 평균 중증도 수치
농도계 방법을 이용하여, CNV 범위를 계산하고 통계 분석하였다. 평균 중증도 수치는 레이저 처리 7일 후(*) 보다 14일 후(p<0.01)에 유의하게 높았다. 그러나, 14일과 29일 사이에는 평균 수치가 증가하였지만 차이는 유의하지 않았다(p>0.05). 이러한 결과는 이 모델을 이용한 랫의 다른 품종에 특징적이었다.
도 3. 각 병변 수치 값의 빈도
각 상처 수치의 빈도 분포는 레이저 광응고 모델을 이용하여 다른 설치류 품종에서 대조군 수치로서 전형적인 것으로 확인되었다. 초기에는 0 내지 약한 누출 수준이고, 레이저 처리 후 14 내지 28일 사이에는 최대가 되는 특징을 보였다. 0 = 0/누출 없음, 1 = 약한 누출, 2 = 중간 수준의 누출, 및 3 = 높은 수준의 누출
도 4. 망막 조직의 H&E 염색한 조직 단편들
정상 망막 단편(a)에서는 모두 손상되는 않은 층이 있다(GC, 신경절 세포; IPL, 내부 망상층; INL, 내부 핵층; OPL, 외부 망상층; ONL 외부 핵층; RPE, 망막 색소 상피 및 CB, 맥락막상(choroidal bed)). 눈을 20 배율로 검경하였을 때, 레이저 조사 후 7일(b)에, 브로크막의 파괴를 관찰할 수 있었다(막대). 이후 40 배율(c)에서는 혈관 누출을 의미하는, 망막층내 적혈구 세포의 존재가 확인되었다. 그러나, 28일까지 혈액세포의 존재는 20X(d) 및 40X(e) 배율 둘다에서 명백하게 나타났다.
도 5. 레이저 병변의 형광 현미경 관찰
RPE는 노란색을 띄고, 층의 파편들을 병변 부위 전체에서 볼 수 있었다. 대식세포는 확인되지 않았는데, 이는 CD68 항체를 이용한 면역조직화학으로 검증하였다.
도 6. 처리한 눈에 대한 CFP 및 FA
레이저를 조사하지 않은 눈(a 및 b)을 비교에 이용하였다. CFP (c, e 및 g) 및 FA (d, f 및 h)를 이용하여 병변(화살)의 출현을 7 일(c 및 d), 14 일(e 및 f) 및 28 일(g 및 h)에 눈에서 평가하였다..
도 7. 평균 누출 수치
7일째에, 대조군과 실험군 간에 유의한 차이는 계산되지 않았다. 7일과 비교하여, CNV 발병으로 인한 플루오레세인 누출은 14일 또는 28일에 유의하게 증가하지 않았으며, 이는 상응하는 시기의 대조군 수치 보다 유의하게 낮았다.
도 8. 각 상처 수치의 빈도수
각 상처 수치의 분포 빈도는 레이저 광응고 모델을 이용하여 다른 설치류 품종에서 대조군 수치로 전형적인 것으로 확인되었다. 초기에는 0 내지 약한 누출 수준이고, 레이저 처리 후 14 내지 28일 사이에는 최대가 되는 특징을 보였다. 0 = 0/누출 없음, 1 = 약한 누출, 2 = 중간 수준의 누출, 및 3 = 높은 수준의 누출
도 9. 눈 조직 단편들
다수의 대식세포가 눈에 존재하였으며, 이는 안내염 신호이다(화살, 10x a, 20x b). 병에 걸리지 않은 눈에서, 망막은 정상이었고, 병변 부위에는 혈관 구조 발달이 빈약하였다(c).
도 10. 플루오레세인 누출을 이용한 레이저 광응고의 백분율 비교
Profreeze- 및 세포-주사한 눈에서 주사 후 여러가지 시기별 플루오레세인 누출을 이용한 레이저 광응고 백분율을 나타내는 그래프
도 11. H&E 염색한 파라핀 포매 눈 단편의 광 현미경 관찰
Profreeze (A) 및 HMPC (B) 주사한 H&E 염색한 파라핀 포매시킨 눈 단편의 광 현미경 검사. 화살은 맥락막 신혈관막의 두께를 표시함
도 12. 맥락막 신혈관막의 두께 비교
Profreeze- 및 세포-주사한 눈에서 맥락막 신혈관막 10개의 평균 두께를 나타낸 그래프
이하, 본 발명은 하기 비제한적인 실시예들과 첨부된 도를 참조하여 설명된다.
실시예 1: 맥락막 혈관신생(CNV) 유도
재료 및 방법
동물 준비 및 마취
실험동안에 총 15마리의 누드 랫을 사용하였고, 실험은 시기능 연구에서의 동물 사용에 관한 ARVO(Associate for Research in Vision and Ophthalmology) 규정에 따라 수행하였다. 랫은 모두 케이지내 분리된 멸균 시설에서, 22 ℃의 일정한 온도와 12:12 시간의 주/야 주기(08:00 시간에 조명을 켬)로 사육하였고, 사료와 물은 자유롭게 이용가능하게 하였다. 랫에 자일라진(6 mg/kg, Bayer AG, Germany)과 케타민(50 mg/kg, Lambert Company, USA)을 근육내 주사하여 마취시켰다. 레이저 광응고(photocoagulation), 유리체내(intravitreal) 주사 및 사진 촬영전 적어도 10분 전에, 2.5% 페닐에프린(Chauvin Pharmaceuticals Ltd, Romford, Essex) 및 1% Mydriacyl (Alcon, Belgium)으로 동공을 확장시켰다. 실험하는 전 과정은 무균 기법으로 수행하였다.
크립톤 레이저 조사
콘택트 렌즈로 제공되는 소형 커버슬립(hand-held coverslip)이 장착된 Zeiss 슬릿트 램프를 통해, 각 동물의 좌안에 크립톤 레이저 광선(647.1nm, coherent Radiation System, CA, USA)을 조사하였다. 각 눈의 시신경 주변 후극부에 총 6-11번의 레이저 화상을 직경 100 ㎛, 지속 기간 0.1초 및 강도 150 mW로 적용하였다.
색조 안저 촬영(Color Fundus Photography: CFP)
동물 준비 및 마취에 언급한 바와 같이, 촬영하기 전에 동물을 마취시켰다. 사진 촬영하기 적어도 10분 전에, 2.5% 페닐에프린(Chauvin Pharmaceuticals Ltd, Romford, Essex) 및 1% Mydriacyl (Alcon, Belgium)을 사용하여 동공을 확장시켰다. 랫의 안저 촬영은 소형 동물 안저 카메라(Kowa Genesis Tokyo, Japan)로 Kodak Elite 200 ASA 슬라이드 필름을 사용하여 수행하였다.
플루오레세인 혈관 조영술(FA)
10% 소듐 플루오레세인 0.1 ml을 복막내 주사하여 모든 랫에 대해 플루오레세인 혈관 조영술을 수행하였다. 망막의 혈관 구조를 플루오레세인 혈관 조영용 배리어 필터를 추가한 CFP와 동일한 카메라(Kowa Genesis Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하였다. 소듐 플루오레세인 투여 후 바로 Kodak Tmax 400 ASA 모노크롬 전문가용 필름을 이용하여 0.5 내지 1 분 간격으로 단회 촬영을 실시하였다.
맥락막 혈관신생증의 형성 및 크기(Choroidal Neovascularization: CNV)
이러한 모델을 이용하여 눈에서의 CNV 형성 및 크기를 CFP 및 FA로 모니터링하였다. 마취시킨 동물에 10% 소듐 플루오레세인 0.3 내지 0.4 ml을 복막내 주사하고, 혈광 안저 조영술로 눈을 촬영하였다. 플루오레세인 누출 정도는 밀도법으 로 계산하였다(Marano and Rakoczy, 2005). 간략하게는, Quantity One® basic densitometry software (Bio-Rad, CA, USA)에 입력하기 위해, LS-4000 ED 필름 스캐너(Nikon Corp., Tokyo, Japan)를 이용하여 컴퓨터로 형광 혈관사진(fluorescein angiogram)을 스캐닝하였다. 각 병변에 대한 상대적인 형광(rf)을 계산하고, 이어 각 수치를 rf 차이를 나타나는데 사용되는 중증도 템플레이트 - rf : 0 - 20, 누출 무; 21 - 70, 누출 정도 낮음; 71 - 120, 누출 정도 중간; 및 > 121, 누출 정도 높음 -로 비교하여 중증도 수치로 변환하였다. 각 시기별 평균 중증도 수치를 post hoc Fishers LSD 분석으로 ANOVA에 의해 비교하였다. 차이는 p < 0.05에서 유의한 것으로 간주하였다. 또한, 각 병변의 빈도치를 측정하여 표로 작성하고, 그래프로 나타내었다.
조직학적 연구
소듐 펜토바르비탈(Nembutal)을 과량으로 사용하여 주사한 지 7일 후에 랫 5마리를 안락사시키고, 나머지 10마리는 실험을 종료한 28일째에 안락사시켰다. 7일에 안락사시킨 동물들 중 2마리에서 적출한, 레이저 조사한 눈을, OCT 매질에 포매하고, 형광 현미경 관찰 및 대식세포 검출용 CD68 항체를 이용한 면역조직화학을 위해 액체 질소에서 동결시켰다. 절편을 UV 광 하에서 검경하고, 올림푸스 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)과 올림푸스 DP70 비디오 카메라를 이용하여 20X 배율에서 2초 노출 시간으로 이미지를 캡쳐하였다. 7일 및 28일에 안락사시킨 나머지 동물의 눈 샘플을 탈핵하고, 10% 중성 완충 염수나 4% 파라포름알데하이드에서 4시간 동안 고정시켰다. 단계적인 알코올 이용한 통상적인 처리를 실시한 후, 눈을 파라핀에 포매하고, 5 ㎛로 단편화한고, 이를 실란처리한 슬라이드에 높고, 조직병리학적 조사를 위해 헤마톡실린 및 에오신(H & E)로 염색하였다.
결과
컬러 안저 조영술을 이용하여 레이저 병변의 존재를 확인하였다(도 1a). 형광 혈관 촬영을 이어 실시하여, 각 병변에서의 플루오레세인의 누출 정도를 기록하였고, 이를 CNV 진행 단계를 나타내는 것으로 사용하였다. 레이저 광응고한 후 7일째의 초기 임상 결과에서는, 병변 대부분에서의 누출 정도가 0 내지 낮은 수준으로 나타났다(도 1b). 이후, 14일에는 급격한 누출 수준 증가(도 1c)가 관찰되었으며, 28일까지 이러한 누출 수준은 7 - 14일과 비교하여 약간에 불과하였지만 다시 증가한 것 같았다(도 1d).
다음으로 레이저 광응고한지 7, 14 및 28일째에 각 병변에 대한 중증도 수치를 계산하여, 각 시기의 평균 중증도 수치를 산출하였다(도 2). 7일째에, 평균 누출 수치는 0 내지 낮은 수준(0.86 ± 0.07)이었는데, 이는 이 시기에 누출에 최소임을 나타낸다. 이러한 사실은, 다른 설치류 종에 레이저 광응고한 후, 처음 3 내지 4일에는 CNV로 인한 플루오레세인 누출이 발생되지 않음을 시사한다. 14일째에, 평균 누출 수치는 CNV 발병이 진행됨에 따라 평균 누출 수치는 7일 수준보다 현저하게 증가되었다(1.8 ± 0.1, p < 0.01). 레이저 광응고한 지 28일째에, 병소의 평균 중증도 수치는 다시 증가하였지만, 14일 수치와 비교하여 유의하진 않았는 데(1.96 ± 0.1; p > 0.01), 이는 CNV로 인한 누출이 대략 이 시기임을 의미한다.
2차 분석을 수행하여, 각 시기에서 각 상처 수치의 빈도를 조사하였다(표 1 및 도 3). 7일에, 병변들의 87% 이상에서 0 내지 낮은 수준의 누출(0: 29.3%, 낮은 수준: 58.6%)이 나타났으며, 나머지에서는 중간 내지 높은 누출 수준이 나타났다. 14일까지, 0 내지 중간 수치를 보이는 각 상처 수치의 빈도가 전체 병변의 32.4%로 감소되는 급격한 이동이 있었다(각각 7% 및 25.4%). 대부분의 병변(47.9%)은 중간 범위였고, 높은 수준의 누출을 보이는 병변의 수는 7일째의 1%에서 19.7%로 증가하여, 중간 내지 높은 수치를 보이는 병변은 전체의 67.6%였다. 28일까지, 병변이 높은 수치로 진행되는 속도는 느려졌다. 0로 매겨진 병변의 수는 2.8%로 떨어졌는데, 이는 이러한 모델에서 전형적인 양상이며, 적은 비율의 레이저 병변에서는 브로크 막(Bruch's membrane)이 파괴되지 않아, 따라서 결코 CNV로 진행되지 않을 것으로 예상된다. 대부분의 수치(70%)는 중간 내지 높은 순위에 있었는데(각각 42.2% 및 28.2%), 이 역시 이러한 모델에 전형적인 현상이다.
표 1. 각 시기별 각 상해 수치의 빈도수
중증도 수치(측정한 전체 병소에 대한 %)
그룹 0 1 2 3
7일(n=99) 14일(n=71) 28일(n=71) 29.3%(29) 7%(5) 2.8%(2) 58.6%(58) 25.4%(18) 26.8%(19) 11.1%(11) 47.9%(34) 42.2%(30) 1%(1) 19.7%(14) 28.2%(20)
0 = 누출 없음
1 = 누출 정도 낮음
2 = 누출 정도 중간
3 = 누출 정도 높음
눈의 조직 단편은 정상적인 레이저 조사하지 않은 망막 외양(도 4a)에 병변과 브로크막 파괴가 나타나는 레이저 광응고한 망막 외양(도 4b, 막대 표시)을 보이는데, 이는 이 모델의 효과 확인에 필수적이다. 단편을 조사하는 동안에, 병변 부위내에서 적혈구 세포의 존재가 식별되었으며(도 4c, 화살표), 이는 초기 CNV 발생을 의미한다. 28일까지, 적혈구 세포의 존재는 상당한 비율로 증가된 것으로 나타났다(도 4d 및 e, 화살표). 이러한 관찰 결과는 각 누출 수치의 빈도 분포 및 계산된 중증도 수치와 일치된다.
CD68 항원(대식세포)의 검출을 UV 광 현미경하에서 가시화하기 위한 FITC 테깅된 이차 항체를 이용하여 냉동시킨 단편을 대상으로 수행하였다. 검출되지 않은 단편의 가시화(도 5)를 통해, 나머지 RPF 층의 단편(노란색으로 나타냄)들을 병변 부위 전체에서 볼 수 있는(화살 표시) 망막 조직에서 나타나는 자가형광 레벨을 나타내었다(도 5). 탈색 및 면역-검출을 수행한 후, 대식세포의 생존 신호는 검출되지 않았다(데이타 미기재)
고찰
본원에 기재된 바와 같은 크립톤 레이저 광응고에 의한 맥락막 혈관신생 유도는 눈의 혈관신생을 치료하는 물질의 능력을 테스트하기 위한 적합한 모델이 될 수 있는 것으로 확인되었다.
실시예 2: CNV 발병에 있어 인간 세포의 효능
재료 및 방법
실시예 1과 같이 동물을 준비하여 마취시키고, 크립톤 레이저 조사를 수행하였다. 또한, CNV 평가를 실시예 1과 같이 수행하였다.
세포의 준비
로얄 아델라이드 병원의 윤리 위원회에서 승인한 절차에 따라, 건강한 정상 성인 지원자(20-35세)로부터 골수(BM)를 채취하였다. 간략하게는, BM 40 ml을 후장골능(posterior iliac crest)에서 리튬-헤파린 항응고제-함유 튜브로 흡입 추출하였다. 기존에 개시된 바(Zannettino et al., 1998)에 따라 Lymphoprep(Nycomed Pharma, Oslo, Norway)와 같이 밀도 농도구배 분리에 의해 BMMNC를 준비하였다. 30분간 4℃에서 400 x g로 원심분리한 후, 담황막층을 트랜스퍼 파이펫으로 제거하고, 5% 소태아 혈청(FCS, CSL Limited, Victoria, Australia)이 포함된 HBSS(Hank's balanced salt solution; Life Technologies, Gaithersburg, MD)로 구성된 "HHF"에서 3번 헹구었다.
다음으로, TNAP+ 세포를 기존에 공지된 바와 같이 자기 활성화된 세포 분류에 의해 분리하였다(Gronthos et al., 2003; Gronthos et al., 1995). 간략하게는, HHF 중에 10%(v/v) 정상적인 토끼 혈청으로 이루어진 블록킹 완충액에서 약 1-3 x 108 BMMNC를 20분간 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 세포를, 얼음 위에서 한시 간 동안, 블록킹 완충액 중에서, STRO-3 mAb 용액 10 ㎍/ml 200 ㎕과 함께 인큐베이션하였다. 이후, 세포는 400 x g에서 원심분리에 의해 HHF로 2번 헹구었다. 염소 항-마우스 γ-바이오틴(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, UK)의 HHF 완충액 중의 1/50 희석액을 첨가하여, 세포를 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 상기와 같이 MACS 완충액(1% BSA, 5 mM EDTA 및 0.01% 소듐 아자이드가 첨가된 Ca2+ - 및 Mn2+ - 무첨가 PBS)으로 2번 헹구고, 최종 부피 0.9 ml MACS 완충액에 재현탁하였다.
스트렙타미딘 마이크로비드(Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach, Germany) 100 ㎕을 세포 현탁액에 첨가하여, 15분간 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 이 세포 현탁액을 2회 헹구고, 0.5 ml의 MACS 완충액에 재현탁한 다음, 미니 MACS 컬럼(MS Columns, Miltenyi Biotec)에 주입하고, 0.5 ml MACS 완충액으로 3번 헹구어, STRO-3 mAb(ATCC(American Type Culture Collection)에 2005년 12월 19일자로 기탁번호 PTA-7282로 기탁됨, 계류중인 WO 2006/108229 참조)에 결합하지 않은 세포를 회수하였다. 1 ml MACS 완충액을 더 첨가한 후, 컬럼에서 자기를 제거하고, 양압에 의해 TNAP-양성 세포를 분리하였다. 각 분획에서 일부 세포는 스트렙타비딘-FITC로 염색될 수 있으며, 유세포 측정으로 순도를 측정할 수 있다.
일차 배양물은, 종래에 언급된 바(Gronthos et al., 1995)와 같이, 20% 소태아 혈청(FCS), 2 mM L-글루타민 및 100 μM L-아스코르베이트-2-포스페이트가 첨가 된 α-MEM에 파종하여, MACS 분리된 TNAP+ 세포로부터 확립하였다.
본원에 언급된 바와 같이 준비한 세포는 또한 인간 간엽 전구 세포(HMPC)라 한다.
유리체내 주사
눈 가장자리에서 1 mm 뒤쪽 부위에 30-게이지의 주사기를 유리체에 삽입하여, 유리체내 주사를 수행하였다. 삽입과 주입을 수행하였고, 수술용 현미경으로 직접 확인하였다. 수정체나 망막이 다치지 않도록 조심하였다. 레이저 광응고하고, 그날 세포 2 ㎕ (5.625 x 104 cells/㎕)를 랫의 왼쪽 눈에 주사하고, 유리체강 위쪽과 주변부에 이것이 위치되게 하였다.
조직학적 연구
소듐 펜토바르비탈(Nembutal)을 과량 주사하여 실험 종료한 28일째에 랫을 안락사시켰다. 이들 동물에서 적출한 눈을 탈핵하고 10% 중성 완충 염수나 4% 파라포름알데하이드에서 4시간 동안 고정시켰다. 단계적인 알코올 이용한 통상적인 처리를 실시한 후, 눈을 파라핀에 포매하고, 5 ㎛로 단편화한고, 이를 실란처리한 슬라이드에 높고, 조직병리학적 조사를 위해 헤마톡실린 및 에오신(H & E)로 염색하였다.
결과
CFP를 이용하여 동물의 처리한 눈에서의 레이저 병변이 있는지를 확인하였고, 이후 CFP직후에 FA를 수행하여 각 병변에서의 플루오레세인 누출 수준을 기록 하였다(도 6). 세포를 주사하였지만 레이저 광응고하지 않은 대조군 눈은, 안저(도 6a) 및 혈관 구조(도 6b)가 정상인 것으로 나타났다. 처리한 눈에서는, 레이저 병변이 주사 후 7일째에 명확하게 가시화되었고(도 6c, 화살표), FA에서는 대부분의 병변에서 0 내지 약한 수준의 누출이 우세적인 것으로 나타났다(도 6d, 화살표). 이후, 14일에도 CFP로 병변을 여전히 명확하게 볼 수 있었다(도 6e, 화살표). 그러나, FA를 이용한 초기 관찰을 통해(도 6f), 실시예 1의 14일 대조군 눈에서 관찰된 바와 같이 누출이 상당히 증가되지 않은 것으로 시사되었다. 이는 또한, 병변을 명확하게 볼 수 있는 상태이고(도 6g, 화살표), 상당한 수준으로 누출이 증가된 것으로 보이진 않는(도 6h), 주사 후 28일째에 확인되었다.
중증도 수치는 세포 주사 후 7, 14 및 28일째에 각 병변에 대해 계산하여, 각 시간별 평균 중증도 수치를 산출하였다(도 7). 7일에, 평균 누출 수치는 0 내지 낮은 수준(0.88 ± 0.14)이었는데, 이는 이 시기에 누출에 최소임을 의미한다. 이러한 결과는 실시예 1로부터 동시에 측정한 대조군 동물 (0.86 ± 0.07)과 유의한 차이가 없었다(p > 0.05). 14일에, 평균 누출 수치는 7일의 수준에서 크게 증가하지 않았으며(0.93 ± 0.16, p > 0.05), 14일 대조군의 상처 수치(1.8 ± 0.1, p < 0.01) 보다 현저하게 낮았다. 이와 유사하게, 주사후 28일에, 병변의 평균 중증도 수치는 증가하였지만 7일 수치에 비해 유의하지 않았으며(1.18 ± 0.17; p > 0.01), 대조군의 비교 수치(1.96 ± 0.1, p < 0.01) 보다 상당히 낮았다
실시예 1과 유사하게, 각 시기별 각 상처 수치의 빈도를 조사하였다(표 2 및 도 8). 7일에, 병변의 73% 이상에서 0 내지 낮은 수준의 누출이 있었으며, 나머지 에서는 중간 수준의 누출이 있었다. 14일까지의 빈도 분포에서 인지가능한 변화는 없었으며, 병변들 중 39.9%는 여전히 누출 0를 보였다. 약한 수준의 누출을 보이는 병변의 일부 감소(35.3% -> 28.6%), 중간 수준의 누출을 보이는 병변의 소폭 증가(26.5% -> 32.1%)가 있었으며, 높은 수준의 누출이 있는 병변은 없었다. 28일까지, 몇개의 병변은 심각한 수준으로 진행되었고(8.7%), 많은 비율이 누출 0을 여전히 나타내었다(32.4%). 이러한 데이타는, 14 및 28일에 누출 수치 0인 것의 비율이 7% 및 2.8%로 각각 하락하였고, 누출 수치 0인 갯수가 각각 19.7% 및 28.2%로 하락한, 대조군과는 대조적이다.
표 2. 각 시기별 각 상해 수치의 빈도수
중증도 수치(측정한 전체 병변에 대한 %)
그룹 0 1 2 3
7일(n=34) 14일(n=28) 28일(n=34) 38.2%(13) 39.3%(11) 32.48%(11) 35.3%(12) 28.6%(8) 26.5%(9) 26.5%(9) 32.1%(9) 32.4%(11) 0%(0) 0%(0) 8.7%(3)
0 = 누출 없음
1 = 누출 정도 낮음
2 = 누출 정도 중간
3 = 누출 정도 높음
도 9에 나타낸 눈의 조직 단편에는, 대식세포가 다수 존재하였고(도 9a 및 b, 화살표), 어떠한 식별가능한 망막 조직은 없었다. 눈 단편에 대식세포 수개 있었지만(도 9b), 감염 신호는 검출할 수 없었으며, 외관상 망막 조직은 정상이었다. 또한, 발생중인 혈관을 병변 부위내에서 검출할 수 있었다.
고찰
15마리의 누드 랫의 왼쪽 눈의 망막에 레이저 광응고를 유도하여 6-10곳의 병변을 만들었다. 다음날, 레이저 조사한 눈에 세포(5.625 x 104 cells/㎕) 2 ㎕를 주사하고, 3번의 시기(주사 후 7, 14 및 28일)에 눈 검사, CFP 및 FA를 실시하였다.
초기 임상 결과는, 병변내 CNV 발병으로 인한 누출이 시간 흐름에 따라 증가하는 것으로 보이지 않는 것으로 나타났다. 이후 평균 플루오레세인 누출의 현저한 증가가 없는 케이스로 밝혀진, FA를 이용한 병소에 대한 밀도법으로, 7일에서 28일까지 계산하였다. 또한, 조직 단편 검경시 화상 부위에서 혈관은 검출할 수 없었는데 이는 혈관형성 저해를 의미한다.
실시예 3: 레이저-유발성 설치류 CNV 모델에서의 줄기 세포 치료의 최적화
재료 및 방법
동물
본 연구를 위해 웨스턴 오스트레일리아의 동물 리소스 센터로부터 8-10주령의 암컷 CBH-rnu/Arc 랫 20마리를 구입하였다. 동형접합체 CBH-rnu/ARc 랫은 털이 거의 또는 전혀 없으며, 흉선이 없으며, 누드 돌연변이 마우스와 유사한 발육 부전을 가지고 있다. 이의 세포 매개성 면역은 크게 위축되었거나 없으며, T 림프구의 기능이 현저하게 감소되어 있으며, 클로스트리듐 필리포르미(Clostridium piliformi) 감염에 매우 감수성이 높다.
CBH-rnu/Arc 랫은 필터가 상단에 설치된 케이지에서 22 ℃의 일정한 온도로 12:12시간 주야 주기(8:00에 조명 켬)로 사육하였다. 사료와 음료에 자유롭게 접근가능하게 하였다. 랫의 신체 상태(예, 체중, 움직임 등)를 실험하는 동안에 모니터링하였다.
절차
모든 절차는 웨스턴 오스트레일리아 대학의 동물 윤리 및 실험 위원회와 ARVO(Associate for Research in Vision and Ophthalmology)의 가이드라인에 따라 수행하였다.
마취 및 동공 확대
모든 임상 촬영, 유리체내 주사 및 레이저 광응고를, 케타민(50 mg/kg, Lambert Company, USA)과 자일라신(6 mg/kg, Bayer AG, Germany) 혼합물을 근육내 주사하는 일반적인 마취를 수행한 랫을 대상으로 수행하였다. 2.5% 페닐에프린(Chauvin Pharmaceutical Ltd., Romford, Essex)과 1% 미드리아실(Alcon, Belgium) 눈 점안제로 동공을 확장시켰다.
세포 준비
실시예 2에 기재된 바와 같이 HMPC를 준비하였다.
레이저 광응고
콘택트 렌즈로 제공되는 소형 커버슬립(hand-held coverslip)이 장착된 Zeiss 슬릿트 램프를 통해, 각 CBH-rnu/Arc 랫의 좌안에 크립톤 레이저 광 선(647.1nm, coherent Radiation System, CA, USA)을 조사하였다. 시신경 주변 주요 망막 혈관들 사이에 8-13번의 레이저 광응고를 각 눈에 직경 100 ㎛, 노출 시간 0.1초 및 강도 150 mW의 설정으로 수행하였다. 기포 형성은 브로크막의 성공적인 파괴를 나타내는 표시로 이용하였다.
임상 촬영
시야각을 넓히기 위해 압축 렌즈(Volk Superfield, Volk Optical, Mentor, OH)가 개지된 휴대용 소형 동물 안저 카메라(Genesis; Kowa, Tokyo, Japan)를 이용하여 색조 안저 촬영을 수행하였다. 플루오레세인 혈관 촬영은 공초점 주사 레이저 편광계(confocal scanning laser ophthalmoscopy, Heidelberg Retinal Angiograph; Heidelberg Engineering, Carlsbad, CA)를 이용하여, 10% 소듐 플루오레세인 용액 100 ml을 랫에 복막내 주사한 후 수행하였다.
유리체내 주사
결막을 자르고, 30게이지 바늘을 이용하여 노출된 공막에 제1 구멍을 만들었다. 5　㎕ 해밀톤 주사기가 붙어있는 32 게이지 바늘을 공막의 상기 구멍을 통해 유리체강내에 넣었다. 미세-전달시스템으로 조절되는 바늘의 전진은 수술용 현미경하에서 직접 관찰하고, 바늘 끝이 유리체강에 도착하면 물질을 전달하게 하였다. 바늘을 빼기 전 약 1분간 바늘은 유리체강에 삽입한 채로 약 1분간 둔 후 빼고, 항생제 연고(0.5% chloramphenicol drop, Chauvin Pharmaceutical Ltd.)를 가하여 감염을 예방하였다. 주사한 눈은 매일 관찰하고, 주사 후 처음 3일간은 클로람페니 콜 점안제를 적가하였다.
조직학적 평가
주사 후 30일째에 랫을 치사시키고, 장기를 회수하여, 부앙 고정제(Bouin's Fixative, 눈 및 시신경)나 완충화된 3.7% 포름알데하이드로 고정하였다. 장기를 포스페이트 완충화된 염수(PBS, pH 7.2-7.4)로 3번 헹구고, 농도 단계적인 에탄올 용액으로 탈수한 다음, 파라핀 왁스에 포매하였다. 선택한 조직을 단편화하고, 조직 검경을 위해 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 맥락막 혈관신생막 두께를 측정(morphometric measurement)하기 위해, ProfreezeTM- (Lonza, Basel, Switerland, which comprises CDM NAO Freezing Medium, 7.5% DMSO and 50% Alpha MEM) 및 세포 - 주사한 눈에서 병소 10곳을 무작위 선정하였다. 이 방추형 흉터를 통과하는 수직 경선 최대값(maximum vertical meridian)을 두께로 정하여 측정하였다.
실험 설계
CBH-rnu/Arc 랫 20마리를 신체 검사하고, 마취시켰다. 동공 확대 후, 각 랫의 좌안에 레이저 광응고를 수행하였다. 레이저 광응고 후 거품 형성을 브로크막 파괴 표시로 이용하였다. 각 눈에 총 8 내지 13번의 레이저 광응고를 수행하였고, 레이저 광응고 인가 후 즉시 컬러 안저 조영술로 촬영하였다(-1일).
레이저 광응고한(0일) 다음날, 레이저 광응고시킨 눈 10개에 3 ㎕ Profreeze를 유리체내에 주사하고, 나머지 10개의 레이저 광응고시킨 CBH-rnu/Arc 랫 눈에는 3 ㎕ HMPC를 유리체내에 주사하였다. 항생제 연고를 주사한 눈에 도포하였다. 이후 3일 간 랫을 매일 조사하고, 주사 후 처음 3일 동안 매일 항생제 연고를 발라주었다.
주사 후 7일, 14일 및 28일에, 처리한 눈에 대해 임상 촬영(컬러 안저 촬영 및 플루오레세인 혈관촬영)을 실시하였다. 주사 후 30일째에 이산화탄소 질식에 의해 CBH-rnu/Arc 랫을 치사시키고, 안구와 장기를 회수하였다. 안구 모두를 보잉 고정제에 고정하고, 장기는 완충화된 3.7% 포름알데하이드에 침지하였다. 이후, 조직 샘플을 단계적인 에탄올 용액으로 탈수하고 파라핀 왁스에 포매하였다. 선택한 조직을 잘라 H & E로 염색하였다.
결과 및 고찰
실험에 이용된 CBH-rnu/Arc 랫의 신체 상태
CBH-rnu/Arc 랫은 실험하기 전과 실험하는 동안에 건강한 상태였으며, 건강한 체중 범위내였다. 동물들을 실험하는 동안에 여러가지 과정을 거치게 하였지만, 마취에서 완전히 회복되었을 때 잘 먹었으며 정상적으로 움직였다. 일부는 근육내 주사 부위에 약간의 타박상이 있었지만, 운동, 식이 및 행동에 영향을 주지 않았다.
실험에 사용된 20마리의 랫의 눈은 실험 개시 시점에 정상이었다. 각 랫의 좌 및 우측 눈의 크기는 동일하였다. 이들의 동공은 쉽게 확대되었고, 결막, 각막, 홍채 및 수정체는 모두 정상이었다. 실험 개시 시점에 모두 투명한 유리체의 정상적인 안저와 망막 혈관 구조를 보였고, 출혈이 없었다.
레이저 광응고 직후, 유리체는 투명하였고, 레이저 광응고된 스팟은 명확하고 선명하게 드러났다. 몇개의 눈에서는 망막 혈관에 대한 레이저 광응고의 우발적인 인가로 인한 출혈이 때때로 관찰되었다.
CBH-rnu/Arc 랫의 눈에 대한 Profreeze 및 세포의 독성 효과 분석
Profreeze 및 세포를 각 랫의 광응고시킨 눈의 수정체에 주사하였다. 주사 직 후 눈은 모두 정상이었다.
주사 후 7, 14 및 28일에 컬러 안저 촬영 및 슬리트 램프 촬영 결과, 랫 #10, #24 및 #25를 제외하고는, Profreeze 및 cell의 존재는 눈에 어떠한 부정적인 영향을 보이지 않는 것으로 나타났으며, 각막은 정상이었고, 안구 전방과 유리체 모두 투명하였다. 랫 #10 및 랫 #24는 주사한 지 7일째에 흐려졌으며, 이로 인해 이 시기에 촬영하기 어려웠다. 그러나 유리체는 14일 및 28일에 다시 투명하게 보였다. 랫 #25는 7일째에 전부 포도막염(anterior uveitis)에 걸렸으며, 이후에 부분적인 백내장이 관찰되었다. 부분적인 백내장은 대부분 주사하는 동안에 수정체에 돌발적인 상해에 의해 야기된 것으로 보인다. 마취성 백내장으로 인해 일부 눈에서는 촬영할 수 없었다.
Profreeze 및 세포가 유리체내 전달 후 어떠한 국소 또는 전신 독성 효과가 있는지를 평가하기 위해,주사하고 30일 후에 조직과 장기를 회수하였다. 부검 보고서를 기초로, Profreeze 주사한 랫과 세포 주사한 랫 둘다에서 대략 동일한 횟수로 세포 조직과 장기에서 병리학적 변화를 검사하였으나, 주사한 세포는 어떠한 부 정적인 효과도 미치지 않는 것으로 시사되었다.
Profreeze 및 세포의 효능 분석
레이저 유발한 랫 CNV 모델에서 새롭게 형성된 멤브레인을 플루오레세인 혈관촬영을 이용한 플루오레세인 누출을 평가함으로써 정량하였다. 각 시기별 플루오레세인 누출이 나타난 레이저 광응고 비율을 Profreeze 주사한 랫과 세포 주사한 랫에서 평가하였다.
레이저 유발한 CNV 모델에서 랫이 CNV로 발병할 성공율을 계산하기 위해, 레이저 광응고한 지 7일째에 플루오레세인 평가에 이용할 수 있는 플루오레세인 혈관 조영도가 있는 눈 샘플만 사용하였다. 이런 이유로, 랫 #24, #16, #19 및 #25는 평가에서 제외시켰다. 총 167회의 레이저 광응고 수행시, 122 또는 73.1%에서 7일째에 플루오레세인 누출이 나타났다(표 3). 이 비율은 다른 그룹에서 기존에 보고한 범위내에 속한다(Yanagi et al., 2002; El Bradey et al., 2004; Zou et al., 2006)).
표 3: 주사후 다양한 시기에 레이저 광응고 전달 및 플루오레세인 누출을 보이는 레이저 광응고 수의 요약 #NA: 마취성 백내장으로 인해 이용불가. NA: 이용불가.
동물 ID 처리 전달한 레이저 스팟 수 주사 후 일정 시간이 지난 후 플루레세인 누출을 보이는 레이저 스팟의 수
7일 14일 28일
1 HMPC 8 7 7 1
2 HMPC 11 10 8 3
3 HMPC 12 8 9 6
4 HMPC 11 9 10 5
5 HMPC 12 10 5 3
6 HMPC 13 9 5 0
7 HMPC 9 5 6 3
8 HMPC 11 6 #NA 2
10 HMPC 10 6 NA NA
24 HMPC 9 NA 8 8
12 Profreeze 9 8 8 8
13 Profreeze 11 9 9 9
14 Profreeze 12 10 9 8
16 Profreeze 10 NA 7 8
17 Profreeze 11 6 10 10
18 Profreeze 8 6 6 3
19 Profreeze 12 NA 9 6
20 Profreeze 10 7 6 #NA
23 Profreeze 9 6 6 7
25 Profreeze 9 NA NA 1
시간에 따라 플루오레세인 누출이 있는 광응고의 백분율 변화 계산에서, 플루오레세인 조영도의 완전한 세트가 있는 눈 샘플만 포함시켰다. Profreeze 주사한 그룹에서, 랫 #16, #19, #20 및 #23이 제외되었고, 세포 주사한 그룹에서는 랫 #8, #10 및 #24가 평가에서 제외되었다.
Profreeze 주사한 그룹의 경우, 레이저 광응고에서 78%는 레이저 광응고후 7일째 플루오레세인 누출이 있었으며, 14일에는 80%로 증가하였다가 레이저 광응고후 28일째에는 75%로 다시 떨어졌다(도 10). 이와는 반대로, HMPC 주사한 그룹의 경우, 광응고에서 76.3%에서 플루오레세인 누출이 있었지만, 14일에 65.8%로 떨어졌고, 다시 레이저 광응고후 28일에 30.3%로 더 떨어졌다(도 10). 이로써, 세포의 존재가 이 모델에서 혈관신생 저해에 효과적이라는 것이 확인되었다.
H & E 염색한 눈 단편에 대한 광 현미경 분석에서, 병소(레이저 병변)는 Profreeze 주사한 눈과 HMPC 주사한 눈 모두에 존재하였다. 이러한 병변은 외측 망상층 및 외측 핵 층의 절삭이었다. 염색된 세포와 작은 혈관이 외측 핵 층에서 발견되었다. 망막 색소 상피 층의 병변 비대도 관찰되었고, 일부 병변에서는 소형 혈관의 수 증가가 있었다. 신혈관막의 존재는, 레이저 병변에 방추형의 망막하 섬유혈관 흉터로 나타나며 단층화 또는 다층화된 망막 색소 상피 세포를 가져, 명확해졌으며, 광응고한 눈에서 인접한 정상 조직과 구별할 수 있었다(도 11).
Profreeze(n=6) 및 세포(n=7)를 주사한 눈 샘플에서 무작위로 선정한 10개의 맥락막 신혈관막의 최대 두께를 비교하였다. 맥락막 신혈관막의 평균 두께는 Profreeze 주사한 그룹은 35.1 ± 10.2 ㎛이었고, 세포를 주사한 그룹은 16.3 ± 4.7 ㎛이었다(도 12). 이러한 평균 두께 차이는 통계적으로 유의하였다(p<0.001, Student's T-test).
레이저 유발성 CMV 모델에서 맥락막 신혈관막의 두께는 화합물 또는 분자의 항-혈관신행 활성 효능을 평가하기 위한 파라미터 중 하나로 사용되고 있어(Lai et al., 2002; Berglin et al., 2003; Krzystolik et al., 2002; Ciulla et al., 2003), HMPC 주사한 눈의 맥락막 신혈관막의 두께 감소는 HMPC가 레이저-유발성 맥락막 혈관신생을 억제하는 효과를 가짐을 시사한다.
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참고문헌
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Claims (14)

  1. 줄기 세포 또는 이의 자손 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 혈관형성 관련 질병(angiogenesis-related disease)을 치료 또는 예방하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 혈관형성 관련 질병이 혈관형성 의존성 암(angiogenesis-dependent cancer), 양성 종양, 류마티스 관절염, 건선, 안구 혈관형성 질환, 오슬러-베버 증후군(Osler-Webber Syndrome), 심근 혈관형성 실명(myocardial angiogenesis blindness), 경화반내 신생혈관증식(plaque neovascularization), 말초혈관 확장증(telangiectasia), 혈우병성 관절증(hemophiliac joint), 맥관섬유종(angiofibroma), 상처 과립화(wound granulation), 장 유착, 죽상동맥경화증, 경피증, 비대성 반흔(hypertrophic scar), 고양이 찰상병(Rochele minalia quintosa) 및 궤양(Helicobacter pylori ulcer)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 혈관형성 관련 질병이 안구 혈관형성 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 안구 혈관형성 질환이 당뇨병성 망막증, 조산아의 망 막증, 황반 변성, 각막 이식 거부 반응, 신혈관 녹내장(neovascular glaucoma), 후수정체 섬유증식증(retrolental fibroplasia) 및 피부 조홍(rubeosis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 안구 혈관형성 질환이 황반 변성 또는 당뇨병성 망막증인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 황반 변성이 건조형 노인성 황반 변성(dry age-related macular degeneration) 또는 습식형 노인성 황반 변성(wet age-related macular degeneration)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 상기 줄기 세포가 골수로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 상기 줄기세포가 간엽 전구 세포(MPC)인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 간엽 전구 세포가 TNAP+, STRO-1+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, CD45+, CD146+, 3G5+ 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 STRO-1+ 세포 중 적어도 일부는 STRO-1bri인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 있어서, 상기 자손 세포가 시험관내에서 간엽 전구 세포를 배양하여 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한항에 있어서, 상기 세포 중 적어도 일부는 유전자 변형된 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한항에 있어서, 상기 혈관형성 관련 질병이 혈관형성 의존성 암이나 양성 종양이고, 세포를 이용하여 항암제를 전달하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 개체의 혈관형성 관련 질병의 치료 또는 예방을 위한 약제 제조에 있어 줄기 세포나 이의 자손 세포의 용도.
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