KR20090026295A - 폭스바이러스 및 폭스바이러스 조성물 제조 방법 - Google Patents

폭스바이러스 및 폭스바이러스 조성물 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폭스바이러스, 및 더욱 특히 세포외 외피보유 바이러스를 포함하는 조성물 및 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 폭스바이러스를 제조하는 방법 및 그에 의해 수득된 폭스바이러스에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 또한 약제 제조를 위한 상기 폭스바이러스 및 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
재조합 폭스바이러스, 세포외 외피보유 바이러스

Description

폭스바이러스 및 폭스바이러스 조성물 제조 방법{PROCESS FOR PRODUCING POXVIRUSES AND POXVIRUS COMPOSITIONS}
본 발명은 폭스바이러스, 및 더욱 특히 세포외 외피보유 바이러스를 포함하는 조성물 및 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 폭스바이러스를 제조하는 방법 및 그에 의해 수득된 폭스바이러스에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 또한 약제 제조를 위한 상기 폭스바이러스 및 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
새로운 위협 (조류 독감, 웨스트 나일 바이러스, 탄저병 등)의 발생 뿐만 아니라, 유전자 요법의 개발이 예방학적 또는 치료학적 목적을 위해 폭스바이러스를 제조하고 정제하는 것에 대한 필요성을 증가시켰다. 특히 이는 포유동물 바이러스 안카라 (MVA)의 경우에 그러하다. 초기에는 면역결핍 환자를 천연두에 대하여 백신화시키기 위해 사용되었던 상기와 같은 폭스바이러스는 또한 현재 유전자 요법용의 벡터로서도 사용된다. 예를 들면, MVA는 Muc1을 발현하는 종양에 대하여 환자를 백신화시키기 위해 MUC1 유전자에 대한 벡터로서 사용되고 있다 [Scholl et al., 2003, J Biomed Biotechnol., 2003, 3, 194-201]. HPV 항원을 코딩하는 유전자를 수반하는 MVA 또한 난소암종의 치료학적 치료법을 위한 벡터로서도 사용되고 있다.
폭스바이러스는 대체로 그의 독특한 형태, 그의 큰 DNA 게놈 및 그의 세포질 위치에서의 복제에 의해 구별되는 복합형 외피보유 바이러스 군이다. 코펜하겐 백시니아 바이러스 (VV) 균주 ([Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266 and 517-563]; [Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381-401]) 및 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA) 균주 [Antoine et al., 1998, Virol. 244, 365-396]를 비롯한, 폭스비리대(Poxviridae)의 몇몇 구성원의 게놈이 지도화되고 서열화되었다. VV는 약 200여개의 단백질 중 대략 100개가 바이러스 조립에 관여하는 것인, 약 200개의 단백질을 코딩하는 약 192 kb의 더블-스트랜드 DNA 게놈을 갖는다. MVA는 닭 배아 섬유모세포상에서 백시니아 바이러스의 500회 초과의 일련의 계대접종에 의해 생성된 고도로 약독화된 백시니아 바이러스 균주이다 [Mayr et al., 1975, Infection 3, 6-16]. MVA 바이러스는 수탁 번호 N602 I-721하에 콜렉시용 나시오날레 드 쿨투레 드 미크로오르가니스메(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes: CNCM)에 기탁되었다. MVA 게놈의 완전한 서열 결정 및 코펜하겐 VV 게놈과의 비교를 통해 바이러스 게놈에서 일어난 변경을 정확하게 동정할 수 있고, ORFs (오픈 리딩 프레임)를 단편화시키는 7개의 결실부 (I 내지 VII) 및 다수의 돌연변이를 정의할 수 있다 [Antoine et al., 1998, Virology 244, 365-396].
외피보유 바이러스의 세포내 흡수를 위한 천연 경로는 바이러스 표면에 노출된 바이러스 폴리펩티드와 세포 수용체의 결합, 및 바이러스 막 및 세포막 사이의 융합 기전에 의한 감염된 세포의 세포질 내로의 바이러스 게놈 방출을 포함하는 일련의 단계를 포함한다.
그러나, 폭스바이러스의 특정 경우에서는 세포내 성숙 바이러스 (IMV) 및 세포외 외피보유 바이러스 (EEV)로 명명되는, 형태학적으로 독특한 형태인 2개의 감염 바이러스의 존재로 인하여 정확한 전달 경로 분석이 복잡해졌다. IMV 형태는 다른 특수성들 중 바이러스 코어를 감싸고 있는 모노지질 외피를 특징으로 하고, 감염된 세포 용해 이후에 세포외로 방출될 수 있지만, 대개는 감염된 세포의 세포질에 위치한다. IMV 지질 외피 표면에 노출된 다수의 천연 폴리펩티드, 예를 들면, 각각 A27L 유전자 ([Rodriguez at al., 1985, J. Virol. 56, 482-488]; [Rodriguez et Estaban, 1987, J. Virol. 61, 3550-3554]) 및 A17L 유전자에 의해 코딩되는 p14 kDa 및 p21 kDa의 단백질 뿐만 아니라, L1R, A14L, D8L, A9L [Yeh et al., 2000, J. Virol. 74, 9701-9711], E10R [Senkevich et al., 2000, Virol. 5, 244-252] 및 H3L 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 동정되었다. IMV와 비교할 때, EEV 형태는 트랜스 골지망 시스터네로부터 획득한 추가의 외부 지질막 외피 (이중 지질층)를 갖는다. 이는 감염된 세포 밖으로 방출된 바이러스 형태에 일치하는 것이다. EEV 표면 막 외피는 IMV 표면에는 존재하지 않는 약 10개의 단백질, 예를 들면, 코딩된 B5R, A34R 및 헤마글루티닌 (HA) 유전자 생성물을 나타낸다. 상기 IMV 및 EEV 형태가 공존하는 것이 대부분의 백시니아 균주 (예를 들면, 코펜하겐 및 MVA 균주)에 대해서 뿐만 아니라, 다른 폭스바이러스, 예로서, 계두 바이러스 [Boulanger et al., 2000, J. Gen. Virol. 81, 675-687]에 대해 기재되어 있다.
IMVs는 환경하에서 대체로 안정적이기 때문에 이는 숙주에서 숙주로의 전파에 있어 주된 역할을 한다 [Hooper et al. Virology, 2003, 306, 181-185]. 이와 관련하여, IMV 입자는 유전자 요법용의 최상의 벡터가 되어 왔다. 이러한 이유에서 이용가능한 폭스바이러스 정제 방법은 오직 패키징 세포에 존재하는 바이러스 (즉, IMV)를 처리하는데 반해, 배양 배지내로 발산되는 EEV 입자는 버려진다. 보다 많은 다양한 폴리펩티드가 IMV 표면상보다는 재조합 EEV 그의 표면에 존재하기 때문에 표적화된 감염 특이성을 갖는 재조합 EEV의 용도는 이미 제안된 바 있다 (US20050208074; [Galmiche et al. J. Gen. Virol., 1997, 78, 3019-3027]). 그러나, 이러한 특이적인 용도에도 IMV 입자가 특히 바람직하다 (US20050208074, page 4, chapter 29).
놀랍게도, 본 출원인은 표적화된 감염 특이성을 갖지 않는 EEV가 IMV와 비교할 때 더 우수한 치료학적 및/또는 예방학적 효능을 갖고 있다는 것을 발견하게 되었다.
이와 관련하여, 본 발명은 폭스바이러스가 표적화된 감염 특이성을 갖지 않는 EEV인 폭스바이러스 및 바람직하게 재조합 폭스바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 표적화된 감염 특이성을 갖지 않는 재조합 EEV를 포함하는 조성물 및 바람직하게 약제학적 조성물에 관한 것이다.
전체 출원서 전반에 걸쳐 사용되는 바, "하나(a)" 및 "하나(an)"라는 용어는 문맥상 달리 명확하게 명시되지 않는 한, "적어도 하나," "적어도 제1의," "하나 이상의" 또는 "복수개의" 관련 성분 또는 단계를 의미한다는 의미로 사용된다. 예를 들어, "하나의 세포"라는 용어는 복수개 세포의 혼합물을 비롯한, 복수개의 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 경우 언제든지 "및/또는"이라는 용어는 "및," "또는," 및 "상기 용어와 관련된 요소들의 모든 또는 임의의 다른 조합"을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게 10% 이내, 및 더욱 바람직하게 5% 이내인 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "포함하는"이라는 용어는 생성물, 조성물 및 방법이 관련 성분들 또는 단계를 포함하되, 기타의 것들을 제외시키지는 않는다는 것을 의미하는 것으로 한다. 생성물, 조성물 및 방법을 정의하기 위하여 사용될 때 "본질적으로 ~으로 구성된"이라는 것은 임의의 본질적으로 중요한 기타 성분들 또는 단계들은 제외시킨다는 것을 의미하여야 한다. 따라서, 열거된 성분들로 본질적으로 구성된 조성물은 미량의 오염물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 제외시키지 않을 것이다. "~으로 구성된"이라는 것은 기타 성분들 또는 단계의 미량 원소들 이외의 것을 제외시킨다는 것을 의미하여야 한다.
폭스바이러스과는 코르도폭스바이러스 및 엔토모폭스바이러스 아과의 바이러스를 포함한다. 이들 중, 본 발명에 따른 폭스바이러스는 바람직하게 오르토폭스바이러스, 파라폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 카프리폭스바이러스, 레포리폭스바이러스, 수이폭스바이러스, 몰루사이폭스바이러스, 야타폭스바이러스를 포함하는 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명의 폭스바이러스는 오르토폭스바이러스이다.
오르토폭스바이러스는 바람직하게 백시니아 바이러스 및 더욱 바람직하게 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA), 특히 MVA 575 (ECACC VO0120707) 및 MVA-BN (ECACC V00083008)이다.
앞서 나타낸 바와 같이, IMV 입자는 단일층의 지질 외피에 의해 감싸여진 바이러스 게놈을 포함하는 바이러스 코어를 포함한다. "EEV"라는 용어는 그의 표면 세포 폴리펩티드 뿐만 아니라 바이러스 폴리펩티드에 노출된 추가의 이중층 지질 외피에 의해 감싸여진 IMV 입자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "표적화된 감염 특이성"이라는 용어는 관련된 비변형 폭스바이러스 입자와 비교할 때, 폭스바이러스 입자가 표적 세포에 대하여 새롭거나 증진된 친화성을 나타내도록 공학처리된 것인, 조정된 감염 특이성을 지칭한다. 그 결과, 표적화된 감염 특이성을 갖는 폭스바이러스 입자는 그의 관련된 비변형 폭스바이러스 입자와는 달리 상기 표적 세포를 감염시키는 성향을 보이는데, 이는 표적화된 감염 특이성을 갖는 폭스바이러스 입자가 (본 발명의 폭스바이러스 입자의 표면에서 보이는 리간드 부위에 의해 인식되는 항-리간드를 그의 표면에서 보이는) 그의 표적 세포를 (그의 표면에서 상기 항-리간드를 보이지 않는) 비표적 세포보다 더욱 효율적으로 또는 더욱 신속하게 감염시키는 반면, 표적화된 감염 특이성을 갖지 않는 관련된 폭스바이러스 입자는 비-표적 세포와 비교하여 더 낮거나 유사한 효율성으로 상기 표적 세포를 감염시킬 것이라는 것을 의미한다.
"재조합 바이러스"라는 용어는 그의 게놈내 삽입되어 있는 외인성 서열을 포함하는 바이러스를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, 외인성 서열이란 천연적으로는 모체 바이러스에 존재하지 않는 핵산을 지칭한다.
하나의 실시태양에서, 외인성 서열은 직접적인 또는 간접적인 세포독성 작용을 갖는 분자를 코딩한다. "직접적인 또는 간접적인" 세포독성이라는 것에 대하여 본 발명자들은 외인성 서열에 의해 코딩된 분자는 그 자체가 독성을 띨 수 있거나 (예를 들면, 리신(ricin), 종양 괴사 인자, 인터루킨-2, 인터페론-감마, 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제, 슈도모나스 외독소 A), 또는 독성 생성물을 형성하도록 대사될 수 있거나, 독성 생성물을 형성하도록 어떤 다른 것에 작용할 수 있다는 것을 의미한다. 리신 cDNA의 서열은 람(Lamb) 등 [Eur. J. Biochem., 1985, 148, 265-270] (본원에서 참고로 인용됨)에 의해 개시되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 외인성 서열은 자살 유전자이다. 자살 유전자는 상대적으로 비독성인 프로드럭에서 독성 약물으로 전환될 수 있는 단백질을 코딩한다. 예를 들면, 효소 시토신 데아미나제는 5-플루오로시토신 (5FC)을 5-플루오로우라실 (5FU)로 전환시키고 [Mullen et al (1922) PNAS 89, 33]; 헤르페스 심플렉스 효소 티미딘 키나제는 항바이러스제 간시클로비르 (GCV) 또는 아시클로비르를 사용한 치료법에 대해 세포를 감작시킨다 ([Moolten (1986) Cancer Res. 46, 5276]; [Ezzedine et al (1991) New Biol 3, 608]). 임의 유기체, 예를 들면, E. 콜라이(E. coli) 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 시토신 데아미나제가 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 더욱 바람직한 실시태양에서 본 유전자는 시토신 데아미나제 활성을 갖는 단백질, 및 더욱더 바람직하게 특허 출원 WO2005007857 및 WO9954481에 기재되어 있는 단백질을 코딩한다.
프로드럭/효소 조합물의 다른 예로는 베그쇼위(Bagshawe) 등 (WO88/07378)에 의해 개시되어 있는 것, 즉, 다양한 알킬화제 및 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.) CPG2 효소, 및 에페테토스(Epenetos) & 롤린슨-부스자(Rowlinson-Busza) (WO 91/11201)에 의해 개시되어 있는 것, 즉, 시안생성 프로드럭 (예를 들면, 아미그다린) 및 식물 유래의 베타-글루코시다제를 포함한다.
본 발명의 이러한 실시태양에 유용한 효소로는 인산염-함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리성 포스파타제; 황산염-함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴설파타제; 펩티드-함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예로서, 세라티아 프로테아제, 써몰리신, 서브틸리신, 카복시펩티다제 및 카텝신 (예로서, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 프로드럭을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카복시펩티다제; 당화된 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 당질-절단 효소, 예로서, 베타-갈락토시다제 및 뉴라미다제; 베타-람탐으로 유도화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 베타-락타마제; 및 약물의 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸기 또는 페닐아세틸기로 유도화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예로서, 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 별법으로, 본 발명의 프로드럭을 유리 활성 약물로 전환시키는데에는 당업계에서 애브자임(abzyme)으로도 알려져 있는, 효소 활성을 갖는 항체가 사용될 수 있다 [Massey R. et al., Nature, 1987, 328, 457-458].
유사하게, 프로드럭은 상기 열거된 프로드럭, 예를 들면, 인산염-함유 프로드럭, 티오인산염-함유 프로드럭, 황산염-함유 프로드럭, 펩티드-함유 프로드럭, D-아미노산-변형된 프로드럭, 당화된 프로드럭, 베타-람탐-함유 프로드럭, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 프로드럭 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 프로드럭, 5-플루오로시토신 및 전환 가능한 다른 5-플루오로우리딘 프로드럭을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용하기 위한 것으로 프로드럭 형태로 유도화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는 에토포시드, 테니포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 시스-백금 및 시스-백금 유사체, 블레오마이신, 에스페라마이신 (예를 들면, US4,675,187 참조), 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 관련 질소 머스타드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
추가의 실시태양에서, 외인성 유전자는 표적화된 RNA 또는 DNA를 절단할 수 있는 리보자임을 코딩한다. 절단되는 표적화된 RNA 또는 DNA는 세포의 기능에 필수적인 RNA 또는 DNA일 수 있으며, 그의 절단은 세포 사멸을 일으키거나, 절단되는 RNA 또는 DNA는 바람직하지 못한 단백질, 예를 들면, 종양유전자 생성물을 코딩하는 RNA 또는 DNA일 수 있고, 이러한 RNA 또는 DNA의 절단은 세포가 암이 되는 것을 막을 수 있다.
또다른 추가의 실시태양에서, 외인성 유전자는 안티센스 RNA를 코딩한다.
"안티센스 RNA"라는 것에 대하여 본 발명자들은 단백질을 코딩하는 mRNA 분자와 혼성화하고, 그로부터의 발현을 방해하거나, 세포내 또다른 RNA 분자, 예로서, 프리-mRNA 또는 tRNA 또는 rRNA에 혼성화하거나, 유전자에 혼성화하고 그로부터의 발현을 방해하는 RNA 분자를 의미한다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 외인성 서열은 표적 세포에서 결손 유전자의 기능을 대체한다. 인간을 비롯한 포유동물에는 결손 유전자에 의해 유발되는 수천개의 유전적 유전자 질환이 존재한다. 그러한 유전자 질환의 예로는 CFTR 유전자가 돌연변이된 것으로 알려져 있는 낭성 섬유증; 디스트로핀 유전자가 돌연변이된 것으로 알려져 있는 뒤시엔느 근위축증; HbA 유전자가 돌연변이된 것으로 알려져 있는 겸상 적혈구병을 포함한다. 다수의 암 유형이 결손 유전자, 특히, 원종양유전자, 및 돌연변인화된 종양-억제자 유전자에 의해 유발된다.
원종양유전자의 예는 ras, src, bcl 등이며; 종양-억제자 유전자의 예는 p53 및 Rb이다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 외인성 서열은 종양 관련 항원 (TAA)을 코딩한다. TAA는 동일한 조직 유형의 비-종양 세포에서보다는 종양 세포에서 더 높은 빈도로 또는 밀도로 검출되는 분자를 지칭한다. TAA의 예로는 CEA, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, GP-100, MUC-1, MUC-2, 점 돌연변이화된 ras 종양유전자, 일반 또는 점 돌연변이화된 p53, 과발현된 p53, CA-125, PSA, C-erb/B2, BRCA I, BRCA II, PSMA, 티로시나제, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, TAG72, KSA, HER-2/neu, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, 서바이빙 및 LRP를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 더욱 바람직한 실시태양에 따라, TAA는 MUC1이다.
재조합 폭스바이러스는 1 초과의 외인성 서열을 포함할 수 있고, 각각의 외인성 서열은 1 초과의 분자를 코딩할 수 있다. 예를 들면, 이는 동일한 재조합 폭스바이러스에서 TAA를 코딩하는 외인성 서열을, 사이토카인을 코딩하는 외인성 서열과 결합시키는데 유용할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 외인성 유전자는 항원을 코딩한다. 본원에서 사용되는 바, "항원"은 항체에 의해 결합될 수 있는 리간드를 지칭하며, 항원 그 자체가 면역원성일 필요는 없다.
바람직하게, 항원은 바이러스, 예를 들면, HIV-1, (예로서, gp 120 또는 gp 160), 펠린 면역결핍 바이러스, 인간 또는 동물 헤르페스 바이러스 중 임의의 것으로부터 유래된 것, 예로서, gD 또는 그의 유도체 또는 조기 단백질, 예로서, HSV1 또는 HSV2로부터의 ICP27, 사이토메갈로바이러스로부터 유래된 것 (예로서, gB 또는 그의 유도체), 수두 대상 포진 바이러스로부터 유래된 것 (예로서, gpI, II 또는 III), 또는 간염 바이러스, 예로서, B형 간염 바이러스로부터 유래된 것, 예를 들면, B형 간염 표면 항원 또는 그의 유도체, A형 간염 바이러스로부터 유래된 것, C형 간염 바이러스로부터 유래된 것 (바람직하게, 유전자형 1b 균주 ja로부터의 비구조 단백질) 및 E형 간염 바이러스로부터 유래된 것, 또는 다른 바이러스 병원체, 예로서, 호흡기 합포체 바이러스, 인간 유두종 바이러스 (바람직하게, HPV16 균주로부터의 E6 및 E7 단백질) 또는 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 것, 또는 세균 병원체, 예로서, 살모넬라(Salmonella), 네이세리아(Neisseria), 보렐리아(Borrelia) (예를 들면, OspA 또는 OspB 또는 그의 유도체), 또는 클라미디아(Chlamydia), 또는 보르데텔라(Bordetella)로부터 유래된 것, 예를 들면, P.69, PT 및 FHA, 또는 기생충, 예로서, 플라스모디움(Plasmodium) 또는 톡소플라스마(Toxoplasma)로부터 유래된 것이다.
본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서, 재조합 폭스바이러스는 TG4010 [Rochlitz et al. J Gene Med. 2003 Aug;5(8):690-9] 및 TG4001 [Liu et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Oct 5; 101 Suppl 2:14567-71]보다는 동일한 단백질을 코딩한다. 본 발명의 특히 바람직한 또다른 실시태양에서, 본 발명의 폭스바이러스는 TG4010의 서열 또는 TG4001 서열과 90% 초과로 상동성인 서열을 갖는다.
유리하게, 재조합 폭스바이러스는 추가로 외인성 서열의 발현에 필요한 요소를 포함한다. 발현에 필요한 요소는 뉴클레오시드 서열이 RNA로 전사될 수 있도록 하고, mRNA가 폴리펩티드로 번역될 수 있도록 하는 한 세트의 요소, 특히, 본 발명의 재조합 폭스바이러스에 의해 감염된 세포에서 효과적인 프로모터 서열 및/또는 조절 서열, 및 임의로 상기 폴리펩티드가 세포 표면에서 분비 또는 발현될 수 있도록 하는데 필요한 서열로 구성된다. 이러한 요소들은 유도성이거나 구성적일 수 있다. 물론, 프로모터는 선택된 재조합 폭스바이러스와 숙주 세포에 대하여 적합화된다. 일례로 백시니아 바이러스 프로모터 p7.5K pH5R, pK1L, p28, p11 또는 상기 프로모터들의 조합을 언급할 수 있다. 상기 프로모터 서열에 관한 다량의 정보는 문헌상에서 제공받을 수 있다.
필요한 요소로는 추가로 숙주 세포에서의 외인성 서열의 발현, 또는 그의 유지를 개선시키는 부가적인 요소를 포함할 수 있다. 특히, 인트론 서열 (WO 94/29471), 분비 신호 서열, 핵 위치 서열, IRES 유형 번역의 재개시를 위한 내부 부위, 전사 종결을 위한 폴리 A 서열을 언급할 수 있다.
이용가능한 폭스바이러스 제조 방법은 세포주 (예를 들면, HelaS3)에서, 수정란에서, 또는 닭 배아 섬유모세포에서의 바이러스 복제를 포함하였다. 바이러스 복제 후, 배양 배지를 버리고, 세포를 용해시키고, 세포로부터 방출된 폭스바이러스를 수크로스 쿠션 원심분리에 의해 정제한다 [Kotwal and Abraham; Poxvirus growth, Purification and tittering in Vaccinia Virus and Poxvirology, 2004, 101-108, Humana Press Inc., Totowa; NJ; USA). 이러한 방법을 사용할 경우, 정제된 조성물에는 어떤 EEVs도 존재하지 않는다.
그러나, 이용가능한 바이러스 제조 방법은 만족스럽지는 못하다. 우선, 이는 동물로부터 유래된 화합물, 예로서, 혈청 및 효소를 사용하는 것을 포함한다. 제조 방법에서 동물로부터 유래된 화합물을 사용하는 것은 몇가지 단점을 갖고 있다. 예를 들면, 이들 화합물의 화학 조성물은 로트간, 심지어 단일 제조자간에도 달라질 수 있다. 화합물은 또한 이들 오염된 보충물이 세포 배양 배지 제제에서 사용될 경우 배양되는 세포의 건강을 심각하게 손상시킬 수 있는 감염체 (예를 들면, 미코플라스마 및 바이러스)에 의해 오염될 수 있다. 더욱이, 배양 배지의 혈청 보충물을 사용하는 것은 혈청 또는 추출물 단백질의 비특이적인 공-정제로 인하여 배양 배지로부터 원하는 물질을 정제하는 것을 복잡하게 할 수 있고, 정제 비용을 증가시킬 수 있다. 가장 중요하게, 미정의 화합물을 사용하는 것은 상기 방법에 의해 수득된 약제학적 조성물이 의료 기관으로부터 승인받지 못하게 할 수 있다.
본 발명은 추가로
a) 패키징 세포의 배양물을 제조하는 단계,
b) 상기 세포 배양물을 감염시키는 단계,
c) 적절한 기간 동안 상기 감염된 세포를 배양하는 단계;
d) 배양 상등액 및/또는 패키징 세포로부터 제조된 폭스바이러스 입자를 회수하는 단계, 및
e) 임의로 회수한 폭스바이러스 입자를 정제하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 폭스바이러스 입자를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법에서 동물 생성물이 존재하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법은 또한 야생형, 및/또는 약독화된 폭스바이러스 제조에 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "약독화된 폭스바이러스"라는 용어는 의도하는 대상자에서 그의 병원성이 실질적으로 감소되도록 변형된 임의의 폭스바이러스를 지칭한다. 바람직하게, 폭스바이러스는 임상적 관점에서 볼 때 비병원성이 되는 지점까지, 즉, 대조군 대상자와 비교할 때 폭스바이러스에 노출된 대상자의 병적 수준이 통계학적으로 유의적 증가를 나타내지 않는 지점까지 약독화된다. 본 발명의 바람직한 실시태양에 따라, 약독화된 바이러스는 약독화된 백시니아 바이러스, 예로서, MVA이다.
"감염"이라는 용어는 바이러스 핵산이 복제되거나, 바이러스 단백질이 합성되거나, 새로운 바이러스 입자가 조립되는 것인, 바이러스 핵산을 세포로 전달하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "패키징 세포"라는 용어는 제조되는 폭스 바이러스에 의해 감염될 수 있는 세포를 지칭한다. 패키징 세포는 1차 세포, 재조합 세포 및/또는 세포주일 수 있다. 예를 들면, 재조합 바이러스 벡터에는 결핍되어 있는, 재조합 바이러스 제조에 필요한 요소를 함유하는 재조합 세포가 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 패키징 세포는 무한증식 조류 세포이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 패키징 세포는 DF1 세포 (US5,879,924)로, 이는 10일된 이스트 랜싱 라인(East Lansing Line: ELL-0) 난으로부터 유래된 자발적으로 무한증식하는 닭 세포주이다.
무한증식 조류 세포는 성장 인자 및 영양 세포층으로부터의 진행적 단절로 인해 이로써 미분화 줄기의 성장 특징 및 무한한 수명 특징을 유지하는 것인 배아 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, Ebx 닭 세포주 (WO2005007840)가 이러한 방법에 의해 수득되었다.
바람직한 실시태양에 따라, 오리 배아 영구 세포주 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, DEC 99 [Ivanov et al. Experimental Pathology And Parasitology, 4/2000 Bulgarian Academy of Sciences]로 명명되는 세포주는 140회에 걸친 연속적인 계대접종을 통해 배양되었고, 이는 조류에 대하여 발암성이 아니다. DEC 99 세포주는 연구에 사용될 수 있고, 생물공학의 필요성에 적용될 수 있는 표준 세포 배양 시스템이다. 더욱 바람직한 실시태양에 따라, 패키징 세포는 특허 출원 EP06360001.9에 개시된 방법에 의해 수득된 세포주이다.
또다른 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 패키징 세포는 닭 배아 섬유모세포 (CEF)이다. 바이러스 제조를 위한 제조 방법 및 CEF의 용도는 당업자에게 잘 알려져 있다.
CEF는 바람직하게 특정 병원체 부재 (SPF) 난으로부터 추출된다. SPF 난은 예를 들면, 찰스 리버 라보라토리즈(Charles River Laboratories) (미국 매사추세츠주 윌밍톤 소재)로부터 상업적으로 이용가능하다. 상기 난은 바람직하게 9일령이 넘은 것, 더욱 바람직하게 10일령 내지 14일령 사이의 것, 및 더욱더 바람직하게 12일령된 것이다.
배아 추출 이전에, 난을 소독되는 것이 바람직하다. 다수의 난 소독 전용 방법 및 제품이 선행 기술에서 이용가능하다. 포르몰 용액 (예를 들면, 2% 포르몰, 1분)에서 인큐베이션시킨 후 70% 에탄올에서 세정하는 것이 특히 바람직하다.
이어서, 배아 세포를 해리시키고 정제한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에 따라, 세포내 기질이 파괴될 수 있도록 세포를 효소 분해시킨다. 이러한 목적을 위해 세포내 기질을 분해시킬 수 있는 효소를 사용하는 것이 특히 유용하다. 그러한 효소는 트립신, 콜라게나제, 프로나제, 디스파제, 하이알루로니다제 및 뉴라미다제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 효소는 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서, 디스파제 및 트립신 (예를 들면, 기브코(Gibco)™로부터 선택된 TrypLE)이 함께 사용된다. 당업자는 세포를 효율적으로 분리할 수 있도록 하는 효소 농도, 인큐베이션 온도 및 기간을 결정할 수 있다.
바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 방법에는 동물 생성물 (패키징 세포 예외)이 존재하지 않는다. 이와 관련하여, CEF 제조에 사용되는 효소(들)는 바람직하게 재조합 기원이다. 본원에서 사용되는 바, "동물 생성물"은 살아있는 유기체중 동물에서 또는 살아있는 유기체중 동물에 의해 제조된 임의의 화합물 또는 화합물들의 수집물을 의미한다.
CEF 제조법은 추가로 오염물을 제거하기 위해 여과 단계 및/또는 원심분리 단계를 포함할 수 있다.
이러한 1차 CEF 세포는 직접 사용될 수 있거나, 1회의 추가적인 세포 계대접종 후 2차 CEF 세포로서 사용될 수 있다.
당업자는 특정 바이러스 제조를 위해 가장 적절한 세포를 선택할 수 있다. 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 방법은 MVA 제조를 위해 EP06360001.9에 따른 CEF 또는 세포를 사용하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 패키징 세포는 적절한 세포 배양 배지에서 배양된다. 본 발명에 따른 방법에서 1 초과의 배양 배지를 사용할 수 있다. 예를 들면, 패키징 세포를 제조하는 동안 (즉, 단계 a 동안) 1차 배양 배지가 사용될 수 있고, 감염 (즉, 단계 c 및/또는 단계 b 동안)을 위해 2차 세포 배양 배지가 사용될 수 있다.
바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 세포 배양 배지에는 동물 생성물이 존재하지 않는다.
동물 생성물이 존재하지 않는 다수의 배지가 이미 기술된 바 있고, 그중 일부는 상업적으로 이용가능하다. 예를 들면, 293 SFM II; 293-F 세포, SFM 어답티드(Adapted); 293-H 세포, SFM 어답티드; 293펙틴™ 형질감염 시약(293fectin™ Transfection Reagent); CD 293 AGT™; CD 293 배지; 프리스타일(FreeStyle)™ 293 발현 시스템; 프리스타일™ 293 배지; 프리스타일™ 293-F 세포, SFM 어답티드; PER.C6® 세포용 아데노바이러스 발현 배지 (AEM) 성장 배지; CD 293 AGT™; CD 293 배지; COS-7L 세포, SFM 어답티드; EPISERF® 배지; 옵티프로(OptiPro)™ SFM; VP-SFM; VP-SFM AGT™ (모두 인비트로젠(Invitrogene)으로부터 이용가능)가 본 발명에 따른 방법에서 세포 배양 배지로서 사용될 수 있다.
패키징 세포가 CEF인 경우, 단계 a를 위해서는 VP-SFM (인비트로젠) 및 단계 b 및 단계 c를 위해서는 기초 배지 이글(Basal Medium Eagle) (인비트로젠)이 특히 바람직하다.
패키징 세포가 CEF인 특정 실시태양에서, 세포 배양 배지는 0.5 내지 1.5 사이, 및 바람직하게 1.1 내지 1.3 사이, 및 더욱 바람직하게 약 1.2 배아/ℓ의 세포 배양 배지로 시딩된다. 이러한 실시태양에서, CEF는 감염 전 1일 내지 5일 사이, 더욱 바람직하게 1일 내지 2일 사이 및 더욱더 바람직하게 2일 동안 배양되는 것이 바람직하다.
제조되는 폭스바이러스가 MVA인 특정 실시태양에서, 바이러스는 바람직하게 0.001 내지 0.1 사이, 더욱 바람직하게 0.03 내지 0.07 사이, 및 더욱더 바람직하게 약 0.05를 포함하는 MOI로 세포 배양 용기에 도입된다.
본 발명의 바람직한 실시태양에 따라, 단계 c 동안, 패키징 세포는 37℃보다 낮은 온도, 바람직하게 30℃ 내지 36.5℃ 사이 또는 약 32℃ 내지 약 36℃ 사이, 더욱 바람직하게 33℃ 내지 35℃ 사이, 가장 바람직하게 34℃의 온도에서 배양된다.
본 발명의 바람직한 실시태양에 따라, 단계 c는 1일 내지 6일 사이, 더욱 바람직하게 2일 내지 4일, 및 가장 바람직하게 약 72시간 동안 지속된다.
감염 단계 후, 패키징 세포를 배양하는데 사용된 세포 배양 배지를 수집한다. 상기 세포 배양 배지는 감염된 패키징 세포에 의해 발산된 EEV 입자를 포함하였다. 바람직한 실시태양에 따라, 감염 단계 후, 세포 배양 배지 및 패키징 세포를 수집한다. 세포 배양 배지 및 패키징 세포를 따로따로 풀링하거나 수집할 수 있다.
패키징 세포에 존재하는 폭스바이러스를 회수하기 위해 본 발명에 따른 방법은 패키징 세포막을 파괴시킬 수 있는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 단계를 통해 폭스바이러스는 패키징 세포로부터 유리될 수 있다. 패키징 세포막의 파괴는 당업자에게 잘 알려져 있는 다양한 기법에 의해 유도될 수 있다. 이러한 기법으로는 초음파 처리, 동결/해동, 저장성 용해 및 미세유동화를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 실시태양에 따라, 패키징 세포막은 고속 균질기를 사용함으로써 파괴된다. 고속 균질기는 실버손 머신즈 인크(Silverson Machines Inc.) (미국 이스트 롱메도우 소재) 또는 이카-라보테크니크(Ika-Labotechnik) (독일 스타우펜 소재)로부터 상업적으로 이용가능하다. 본 발명의 특히 바람직한 실시태양에 따라, 상기 고속 균질기는 실버손(SILVERSON) L4R이다.
패키징 세포 및 세포 배양 배지가 풀링될 때, 동결/해동과 같은 이러한 기법은 EEV 입자를 파괴시킬 수 있기 때문에 [Ichihashi y. et al., 1996, virology, 217(2), 478-85] 패키징 세포막의 파괴는 동결/해동에 의해 유도되지 못한다.
바람직한 실시태양에 따라, 단계 d)는 추가로 세포 파편이 회수될 수 있도록 하는 정화 단계를 포함한다. 본 발명의 더욱 바람직한 실시태양에 따라, 상기 정화 단계는 심층 여과 단계이다.
심층 여과는 하나 이상의 상업적으로 이용가능한 제품: CUNO 인코포레이티드(CUNO Incorporated) AP 시리즈 심층 필터 (일례로 AP01을 포함한다), CUNO 인코포레이티드 CP 시리즈 심층 필터 (일례로 CP10, CP30, CP50, CP60, CP70, CP90을 포함한다), CUNO 인코포레이티드 HP 시리즈 심층 필터 (일례로 HP10, HP30, HP50, HP60, HP70, HP90을 포함한다), CUNO 인코포레이티드 칼리프.(Calif.) 시리즈 심층 필터 (일례로 CA10, CA30, CA50, CA60, CA70, CA90을 포함한다), CUNO 인코포레이티드 SP 시리즈 심층 필터 (일례로 SP10, SP30, SP50, SP60, SP70, SP90을 포함한다), CUNO 데리피드(Delipid) 및 데리피드 플러스(Delipid Plus) 필터, 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation) CE 시리즈 심층 필터 (일례로 CE15, CE20, CE25, CE30, CE35, CE40, CE45, CE50, CE70, CE75를 포함한다), 밀리포어 코포레이션 DE 시리즈 심층 필터 (일례로 DE25, DE30, DE35, DE40, DE45, DE50, DE55, DE560, DE65, DE70, DE75를 포함한다), 밀리포어 코포레이션 HC 필터 (일례로 A1 HC, B1HC, COHC를 포함한다), CUNO 폴리네트(Polynet) 필터 (일례로 폴리네트-PB를 포함한다), 밀리포어 클래리가드(Millipore Clarigard) 및 폴리가드(Polygard) 필터, CUNO 라이프 어슈어(CUNO Life Assure) 필터, 만셀 어소시에이츠(ManCel Associates) 심층 필터 (일례로 PR 12 UP, PR12, PR 5 UP를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 및 팔(PALL) 또는 자이츠쉔크 인코포레이티드(SeitzSchenk Incorporated) 필터를 사용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이용가능한 심층 여과 유니트의 정화능을 개선시키기 위해 2개 이상의 유니트를 커플링시켜 공극 크기를 감소시키는 것이 유용할 수 있다. 이러한 실시태양에서, 정화시키고자 하는 혼합물은 가장 큰 오염물이 잔류되는 제1 심층 여과 유니트를 통과한 후, 이어서 제2 심층 여과 유니트를 통과하게 된다. 본 발명의 더욱더 바람직한 실시태야에 따라, 공극 크기가 5 ㎛인 사토푸어(sartopure)ⓒ (사토리우스(sartorius))와 커플링된, 공극 크기가 8 ㎛인 사토푸어ⓒ가 심층 여과 단계에 사용된다.
바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 방법은 추가로 농축 단계를 포함한다. 더욱 바람직하게, 상기 농축 단계는 추가로 앞서 기술된 단계로부터 수득된 혼합물에 존재하는 단백질을 제거할 수 있다.
본 발명의 더욱 바람직한 실시태양에 따라, 상기 농축 단계는 미세여과 단계이다. 미세여과는 거대 분자를 농축시키고 정제하는, 압력에 의해 구동되는 막 공정이다. 더욱 특히, 용액은, 공극 크기가 보유물내 거대 입자 (바이러스)를 거절하고, 소분자 (예를 들면, 단백질)가 막을 통해 투과물내로 통과할 수 있도록 선택된 것인 반투과성 막을 통해 통과한다. 미세여과는 추출액의 부피를 감소시켜 준다.
본 발명의 바람직한 실시태양에 따라, 미세여과 단계에 이어 투석여과가 이루어진다. 이들 2가지 단계는 유리하게 동일한 여과 막을 사용함으로써 이루어질 수 있다. 투석여과는 미세여과의 개선안이며, 이는 보유물내 불순물의 농도를 감소시킬 수 있도록 용액을 사용하여 보유물을 희석시키는 것을 포함한다. 보유물을 희석시킴으로써 보유물로부터 더 많은 불순물을 세척할 수 있다. 투석여과는 배취 모드, 반-연속 모드, 또는 연속 모드로 수행될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 투석여과 단계는 유리하게 바이러스가 포함되어 있는 완충액을 교체하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 완충액으로 정제 방법에서 사용된 완충액을 교환하는 것이 유용할 수 있다.
바람직하게, 미세여과 및/또는 투석여과 단계에서 사용된 여과 막의 공극 크기는 0.01 내지 0.15 ㎛ 사이, 및 더욱 바람직하게 약 0.1 ㎛를 포함한다.
핵산은 세포 유래 입자, 예로서, 바이러스에 부착될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에 따른 방법은 임의로 용액내 존재하는 오염성 핵산을 제거하는 것으로 구성된 단계를 추가로 포함한다. 이러한 목적을 위해 뉴클레아제가 사용될 수 있다. 대표적인 뉴클레아제로는 벤조나제 또는 당업계에서 통상적으로 사용되는 임의의 다른 DNase 또는 RNase를 포함하며, 이중 벤조나제가 특히 바람직하다.
벤조나제는 핵산을 분해하나, 단백질을 분해하는 활성은 없다. 벤조나제는특정 뉴클레오시드 사이의 내부 포스포디에스터 결합을 가수분해시킴으로써 핵산을 신속하게 붕해시킨다. 완전하게 분해되었을 때 용액내 존재하는 모든 유리 핵산의 길이는 올리고뉴클레오시드 2 내지 4 염기로 축소된다.
벤조나제는 50 내지 400 U/ml 사이, 바람직하게 100 내지 300 U/ml 사이, 및 더욱 바람직하게 150 내지 250 U/ml 사이를 포함하는 최종 농도로 사용될 수 있다. 벤조나제 처리는 1 내지 4시간 사이 및 더욱더 바람직하게 1.5 내지 2.5시간 사이로 지속될 수 있다.
그러나, 앞서 기술된 심층 여과, 미세여과 및 투석여과가 사용되는 경우, 뉴클레아제의 사용 및 더욱 특히 벤조나제의 사용은 필요하지 않다. 이와 관련하여, 본 발명은 또한 뉴클레아제가 사용되지 않는, 더욱 특히, 벤조나제가 사용되지 않는 폭스바이러스 제조 방법에 관한 것이다.
이러한 단계에서, 앞서 기술된 방법에 의해 수득된 폭스바이러스는 충분하게 정제된다. 바이러스가 포함되어 있는 완충액을 교체하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 완충액으로 정제 방법에서 사용된 완충액을 교환하는 것이 유용할 수 있다. 완충액을 교체하는데 사용될 수 있는 다수의 방법들이 당업자에게 알려져 있다. 그중 접선 여과가 특히 바람직하다.
접선 여과는 여과 케이크 형성 뿐만 아니라, 빈번한 필터 차단을 막는 현탁액 와류를 형성하기 위해 여과하고자 하는 현탁액이 높은 속도로 여과 표면에 대해 평행인 방향을 따라 이동하는 것인 여과 기법이다.
현탁액이 높은 속도로 여과 표면에 대해 평행하게 유동하는 동안, 용질은 압력차에 기인하여 여과 표면 홀을 통과하고, 연속적으로 제거된다. 여과 표면은 예로서, 보유물 구획 (즉, 현탁액 농축 구획) 및 투과물 구획 (현탁된 입자가 없는 투명 여과액) 사이의 압력차에 대해 기계적인 내성을 지녀야 한다.
본 발명에 따른 방법에 포함된 다양한 단계는 독립된 작업실 및/또는 상이한 기간에 실행될 수 있다. 예를 들면, 패키징 세포의 감염 및 폭스바이러스의 정제는 상이한 작업실에서 수행될 수 있다. 게다가, 패키징 세포 및/또는 세포 배양 배지는 정제되기 이전에 필요한 기간 동안 저장될 수 있다 (예를 들면, -80℃에서).
본 발명은 또한 앞서 기술된 방법에 의해 수득된 조성물 및 본 발명의 폭스바이러스를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발명의 조성물은 상기 조성물내 포함되어 있는 폭스바이러스 중 1% 초과, 바람직하게 5% 초과, 더욱더 바람직하게 10% 초과, 및 가장 바람직하게는 적어도 20%가 EEV인 것을 포함한다.
바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 1 ml당 적어도 105, 바람직하게 적어도 106, 더욱 바람직하게 적어도 107, 더욱더 바람직하게 적어도 108 pfu의 역가를 갖는다.
또다른 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 단백질 1 ㎍당 적어도 103, 바람직하게 104 및 가장 바람직하게 적어도 3 105 pfu의 역가를 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득된 폭스바이러스를 포함하는 약제학적 조성물 및/또는 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바, "약제학적 조성물"은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 지칭한다.
그러한 담체는 바람직하게 등장성, 저장성 또는 약간 고장성이고, 상대적으로는 낮은 이온 강도를 가지며, 예로서는 수크로스 용액이 있다. 더욱이, 그러한 담체 임의의 용매, 또는 수성 또는 부분적으로 수성인 액체, 예로서, 비발열성 멸균수를 함유할 수 있다. 추가로, 약제학적 조성물의 pH는 생체내에서의 사용 요건을 충족시키도록 조정되고 완충처리된다. 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용가능한 희석제, 애주번트 또는 부형제 뿐만 아니라, 용해제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 주사 가능한 투여의 경우, 수성, 비수성 또는 등장성 용액의 제제가 바람직하다. 적절한 희석제를 이용하여 이용시 재구성될 수 있는 액체 또는 건조 (분말, 동결건조물 등) 형태로, 단일 용량 또는 다중 용량으로서 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 폭스바이러스 및 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 바이러스, 조성물 및/또는 약제학적 조성물 제조를 위한 본 발명에 따른 방법의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 약제 제조를 위한 본 발명에 따른 폭스바이러스, 조성물 및/또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 약제는 암의 치료학적 또는 예방학적 치료법을 위한 것이다.
고려시될 수 있는 적용들 중 유방암, 자궁암 (특히 유두종 바이러스에 의해 유도된 것), 전립선암, 폐암, 방광암, 간암, 결장암, 췌장암, 위암, 식도암, 후두암, 중추 신경계암 (특히 신경아교종) 및 혈액암 (림프종, 백혈병 등)을 언급할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 국소, 비경구 또는 소화 경로에 의한 투여용으로 통상적으로 제조될 수 있다. 고려시 되는 투여 경로는 많다. 예를 들면, 위내, 피하, 심장내, 근육내, 정맥내, 복강내, 종양내, 비내, 폐내 또는 기관내 경로를 언급할 수 있다. 후자의 3가지 실시태양의 경우, 에어로졸 또는 점적주입에 의한 투여가 유리하다. 단일 용량으로 또는 일정 시간 간격을 두고 한번 또는 여러번에 걸쳐 반복되는 용량으로 투여가 이루어질 수 있다. 적절한 투여 경로 및 투여량은 다양한 변수, 예를 들면, 개체, 치료하고자 하는 질환 또는 전달하고자 하는 관심의 대상이 되는 유전자(들)에 따라 달라질 수 있다.
첫번째 가능성에 따라, 약제는 생체내에 직접 투여될 수 있다 (예를 들면, 정맥 주사에 의해, 접근가능한 종양내로 또는 그의 주변에, 치료학적 또는 예방학적 백신화를 위해 피하로). 환자로부터 세포를 수집하고 (골수 줄기 세포, 말초 혈액 림프구, 근육 세포 등), 이를 선행 기술의 기법에 따라 시험관내에서 형질감염시키거나 감염시키고, 이를 환자에게 재투여하는 것으로 구성된 생체외 접근법도 채택할 수 있다.
더욱이, 적절하다면, 그리고 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않는다면 본 발명의 약제학적 조성물 또는 조성물내 함유되어 있는 다양한 성분들을 상이한 경로에 의해 동시에 또는 연속적으로 투여하는 것도 고려해 볼 수 있다.
본 발명의 유리한 실시태양에 따라, 치료학적 용도 또는 치료 방법은 수술 (종양의 부분적 또는 완전한 제거)에 의해, 방사선요법에 의해, 또는 화학요법에 의한 환자의 2차 치료법과 함께 병용된다. 이와 같이 특별 경우에는 본 발명에 따른 치료법이 상기의 2차 치료법 이전에, 동시에 또는 그 이후에 적용된다. 바람직하게, 이러한 치료법은 상기 2차 치료법 이후에 적용될 것이다.
또다른 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 약제는 감염 질환, 특히, B형 또는 C형 간염 바이러스, HIV, 헤르페스, 레트로바이러스 등에 의해 유도된, 바이러스 기원의 감염 질환의 치료학적 또는 예방학적 치료를 위한 것이다.
하기 실시예는 본 발명의 다양한 대상들들 설명하기 위한 것이며, 결과적으로 특징으로 제한되는 것은 아니다.
표 1: HPV 16 E6 및 E7, 및 C-Ha-ras 종양유전자를 발현하는 TC1 세포를 이식받은 C57BL/6 마우스의 생존율을 도시한다. HPV 항원을 코딩하는 IMV 및 EEV, HPV 항원을 코딩하는 IMV 또는 어떤 항원도 코딩하지 않는 IMV를 포함하는 조성물로 각기 다른 마우스 군을 처리한다.
표 2: HPV 16 E6 및 E7, 및 C-Ha-ras 종양유전자를 발현하는 TC1 세포를 이식한 후, 종양을 갖지 않는 C57BL/6 마우스의 백분율을 도시한다. HPV 항원을 코딩하는 IMV 및 EEV, HPV 항원을 코딩하는 IMV 또는 어떤 항원도 코딩하지 않는 IMV 를 포함하는 조성물로 각기 다른 마우스 군을 처리한다.
표 3: MUC1을 발현하는 TC1 세포를 이식받은 C57BL/6 마우스의 생존율을 도시한다. MUC1 및 IL2를 코딩하는 IMV 및 EEV, MUC1 및 IL2를 코딩하는 IMV 또는 어떤 항원도 코딩하지 않는 IMV를 포함하는 조성물로 각기 다른 마우스 군을 처리한다.
1. IMV 및 EEV를 포함하는 조성물의 제조
A. CEF의 제조
66개의 SPF 난을 2% 포르몰 용액에서 60초 동안 인큐베이션시켰다. 70% 에탄올로 세정한 후, 난을 깨어 배아를 추출하고 해부하였다. 이어서 수득한 조직을 디스파제 (Ul/ml) 및 트리플 셀렉트 (Ul/ml)에 의해 120분 동안 36.5℃에서 분해하였다.
혼합물을 여과하여 분해되지 않은 조직을 제거하고, 원심분리 (2300 rpm, 15분)에 의해 CEF를 수집하였다.
B. CEF 배양 및 감염.
CEF를 36.5℃에서 2일 동안 55 ℓ의 VP-SFM (인비트로젠) 중에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포 배양 배지를 버리고, 폭스바이러스 (0.05 MOI)를 55 ℓ의 기초 배지 이글 (인비트로젠) 중에 가하였다. 이어서, 감염된 패키징 세포를 3일 동안 인큐베이션시켰다.
C. 폭스바이러스 정제.
패키징 세포 및 세포 배양 배지를 수집하였다. 이어서 혼합물은 실버손ⓒ L4R 고속 균질기를 사용하여 15분 동안 균질화시켰다. 이어서, 수득된 혼합물을 1ℓ/분의 유속으로 사토푸어 5 ㎛와 커플링된 사토푸어 8 ㎛ (사토리우스) 상에서 심층 여과에 의해 정화시켰다.
혼합물은 추가로 0.1 ㎛ 프로스탁(Prostak) 미세여과 모듈 (참조번호: PSWAG021, 밀리포어)을 통해 18회에 걸쳐 농축시켰다.
폭스바이러스 조성물은 추가로 원하는 약제학적으로 허용가능한 담체에 대하여 동일 모듈상에서 투석여과시켰다.
2. EEV 및 IMV를 포함하는 조성물과, 오직 IMV만을 포함하는 조성물간의 치료학적 효능 비교.
A. HPV 항원을 발현하는 종양을 갖는 마우스의 치료학적 치료법
명칭 및 각 벡터 작제에 관한 간단한 설명
TG4001: HPV 단백질, E6 및 E7, (프로모터 p7.5의 제어하의 것) 및 IL2 (프로모터 pH5R의 제어하의 것)에 대한 코딩 서열을 수반하는 MVA 벡터. IMV 및 EEV를 포함하는 것 하나 (앞서 개시된 바와 같이 제조됨), 및 오직 IMV만을 포함하는 것 하나인, 두가지 로트를 시험하였다.
N33: HPV 단백질 E6 및 E7, 또는 IL2, 어느 것도 발현하지 않는 공 벡터 MVA를 음성 대조군으로서 사용하였다.
동물 모델
6 내지 8주령된 C57Bl/6 암컷 마우스를 본 연구 기간내내 사용하였다. 이들 마우스는 찰스 리버(Charles River) (프랑스 루앙 소재)로부터 입수하였다.
설명: 동물은 도착시 6주령된 것이었다. 실험 시작시에는 8주령 미만이었다.
환경: 시간당 최소 11회에 걸쳐 공기를 교체해 주는 단독 전용실에서 동물을 하우징하였다. 온도 및 상대 습도 범위는 각각 18℃ 내지 22℃ 이내, 및 40 내지 70%였다. 12시간의 명기와 12시간의 암기를 주기로 제공하기 위해 조명을 자동 조절하였다.
규칙적인 환경 제어를 통해 특정 병원체 부재 상태를 체크하였다.
섭식: 연구 전 기간에 걸쳐 동물은 멸균된 섭식 타입 D04 (UAR, 프랑스 UAR, 에피네수르 쉬흐 흐즈 소재)에 임의대로 접근할 수 있었다. 물은 병을 통해 임의대로 제공받았다.
순응 및 건강 절차: 모든 동물은 도착시 건강 상태에 대하여 임상 검사를 받았다. 본 연구에 대한 그들의 적합성을 확보하기 위해 실험 개시 1 내지 2주 사이 전에 특정 병원체 부재 (SPF) 동물 시설에서 순응시켰다.
종양 세포 특징 및 사용 조건:
TC1 세포주는 HPV-16 E6 및 E7, 및 c-Ha-ras 종양유전자로 공-형질전환된 C57Bl/6 마우스의 1차 폐 상피 세포로부터 유래되었다. 이들 세포는 글루타민 (2 mM), 우태아혈청 (10%), 비필수 아미노산 (0.1 mM), Na 피루베이트 (1 mM), β 머캅토-에탄올 (36 ㎛), 하이그로마이신 (0.2 mg/ml) 및 G418 (0.5 mg/ml)을 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 해동시킨 후, 세포를 2회에 걸쳐 증폭시키고, 세포를 주 사하기 2일 전에 최종의 계대접종을 실시하였다.
세포 주사
실험 1일째, TC1 세포를 2.0 E+05 세포/마우스의 용량으로 마우스 옆구리에 피하로 주사하였다.
바이러스 주사
세포 주사후 7일째, 5.0 E+05 pfu/50 ㎕/마우스의 시험된 로트 (TG4001 IMV/EEV 또는 IMV만), MVATGN33 (공 벡터)을 마우스에 주사하였다. 시험된 로트당 20마리의 마우스를 사용하였다.
같은 옆구리이지만, 세포 주사 지점으로부터 멀리 떨어져 있는 부위에 피하로 바이러스 주사를 실시하고, 7일 간격으로 3회에 걸쳐 수행하였다.
모니터링 변수:
캘리퍼를 사용하여 세포 주사후 90일 동안 종양 성장을 모니터하였다. 마우스의 종양 크기의 직경이 25 mm 보다 클 때, 또는 종양이 상기 보다는 작지만 마우스가 통증을 보일 때에는 윤리적인 이유에서 마우스를 안락사시켰다.
생존해 있는 마우스를 기록하였다.
결과
HPV 항원을 코딩하는 MVA 벡터로 처리된 군 모두가 공 MVA 벡터로 처리된 군보다 더 높은 생존율을 나타내었다. EEV 및 IMV를 포함하는 조성물로 처리된 마우스가 오직 IMV만을 포함하는 조성물에 의해 처리된 마우스보다 더 높은 생존율을 나타내었다. 더욱이, 주사후 77일이 경과한 후, 오직 IMV만을 포함하는 조성물에 의해 처리된 마우스에서는 단지 10%인 것과 비교하여 EEV 및 IMV를 포함하는 조성물에 의해 처리된 마우스 중 35%에서는 종양이 존재하지 않았다.
B. MUC1을 발현하는 종양을 갖는 마우스의 치료학적 치료법
명칭 및 각 벡터 작제에 관한 간단한 설명
TG4010: MUC1 단백질 (프로모터 p7.5의 제어하의 것) 및 IL2 (프로모터 pH5R의 제어하의 것)에 대한 코딩 서열을 수반하는 MVA 벡터. IMV 및 EEV를 포함하는 것 하나 (앞서 개시된 바와 같이 제조됨), 및 오직 IMV만을 포함하는 것 하나인, 두가지 로트를 시험하였다.
MUC1, 또는 IL2, 어느 것도 발현하지 않는 공 벡터 MVATGN33을 음성 대조군으로서 사용하였다.
마우스 모델 및 동물 실험 시스템
종, 균주 및 공급원: 6 내지 8주령된 C57Bl/6 암컷 마우스를 본 연구 기간내내 사용하였다. 이들 마우스는 찰스 리버(프랑스 루앙 소재)로부터 입수하였다.
설명: 동물은 도착시 6주령된 것이었다. 실험 시작시에는 8주령 미만이었다.
환경: 시간당 최소 11회에 걸쳐 공기를 교체해 주는 단독 전용실에서 동물을 하우징하였다. 온도 및 상대 습도 범위는 각각 18℃ 내지 22℃ 이내, 및 40 내지 70%였다. 12시간의 명기와 12시간의 암기를 주기로 제공하기 위해 조명을 자동 조절하였다.
동물은 43 X 27 X 15 cm의, 바닥 면적이 1161 ㎠인 우리당 10마리씩 소군으 로 하우징하였다.
섭식: 연구 전 기간에 걸쳐 동물은 멸균된 섭식 타입 RM (SDS, 프랑스 르 보르도 드 비니 소재)에 접근할 수 있었다.
물은 병을 통해 임의대로 제공받았다.
섭식 또는 물에는 어떤 오염물도 본 연구의 목적을 달성하는데 방해가 될 수 있는 수준으로는 존재하지 않았다.
순응 및 건강 절차: 모든 동물은 도착시 건강 상태에 대하여 임상 검사를 받았다. 본 연구에 대한 그들의 적합성을 확보하기 위해 실험 개시 1 내지 2주 사이 전에 특정 병원체 부재 (SPF) 동물 시설에서 순응시켰다.
종양 세포 특징 및 사용 조건:
RMA 종양주는 C57Bl/6 림프종으로부터 유래되었다. RMA-MUC1 세포는 MUC1 유전자 a를 함유하는 발현 플라스미드로 형질감염시킨 후에 수득하였다. 이들 세포를 글루타민 (2 mM), 우태아혈청 (10%), 비필수 아미노산 (0.1 mM), Na 피루베이트 (1 mM), β 머캅토-에탄올 (36 ㎛), 및 하이그로마이신 (0.2 mg/ml)을 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 해동시킨 후, 세포를 2회에 걸쳐 증폭시키고, 시험감염 전 당일날에 최종의 계대접종을 실시하였다.
면역화
TG4010 바이러스에 대해 1.0 104 또는 3.0 104 pfu/마우스로, 및 MVATGN33에 대해 3.0 104 pfu/마우스로 마우스를 면역화시켰다.
시험된 로트당 20마리의 마우스를 사용하였다.
옆구리에 피하로 바이러스 면역화를 실시하고, 14일 간격으로 3회에 걸쳐 수행하였다.
종양 시험감염
최종 면역화후 2주째에 1.0 E+06 RMA-MUC1 생육성 세포/50 ㎕/마우스를 사용하여 같은 옆구리이지만, 바이러스 주사 지점으로부터 멀리 떨어져 있는 부위에 피하로 마우스를 시험감염시켰다.
모니터링 변수:
캘리퍼를 사용하여 종양 시험감염후 6주 동안 종양 성장을 모니터하였다. 마우스의 종양 크기의 직경이 25 mm 보다 클 때, 또는 종양이 상기 보다는 작지만 마우스가 통증을 보일 때에는 윤리적인 이유에서 마우스를 안락사시켰다.
생존해 있는 마우스를 기록하였다.
용량당 20마리의 마우스를 사용하였다.
결과
MUC1 항원을 코딩하는 MVA 벡터로 처리된 군 모두가 공 MVA 벡터로 처리된 군보다 더 낮은 종양 성장을 나타내었고, 더 높은 생존율을 나타내었다. EEV 및 IMV를 포함하는 조성물로 처리된 마우스가 오직 IMV만을 포함하는 조성물에 의해 처리된 마우스보다 더 낮은 종양 성장을 나타내었다.

Claims (29)

  1. 표적화된 감염 특이성을 갖지 않는 EEV인 재조합 폭스바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 폭스바이러스가 오르토폭스바이러스, 파라폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 카프리폭스바이러스, 레포리폭스바이러스, 수이폭스바이러스, 몰루사이폭스바이러스, 야타폭스바이러스를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 재조합 폭스바이러스.
  3. 제2항에 있어서, 폭스바이러스가 오르토폭스바이러스인 재조합 폭스바이러스.
  4. 제3항에 있어서, 오르토폭스바이러스가 백시니아 바이러스인 재조합 폭스바이러스.
  5. 제3항에 있어서, 오르토폭스바이러스가 변형된 백시니아 바이러스 안카라인 재조합 폭스바이러스.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폭스바이러스가 직접적인 또는 간접적인 세포독성 작용을 갖는 분자를 코딩하는 외인성 서열을 포함하는 재조합 폭스바이러스.
  7. 제6항에 있어서, 외인성 서열이 자살 유전자인 재조합 폭스바이러스.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폭스바이러스가 종양 관련 항원 (TAA)을 코딩하는 외인성 서열을 포함하는 재조합 폭스바이러스.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폭스바이러스가 항원을 코딩하는 외인성 서열을 포함하는 재조합 폭스바이러스.
  10. 제9항에 있어서, 항원이 바이러스로부터 유래되는 것인 재조합 폭스바이러스.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 폭스바이러스가 외인성 서열의 발현에 필요한 요소들을 포함하는 것인 재조합 폭스바이러스.
  12. a) 패키징 세포의 배양물을 제조하는 단계,
    b) 상기 세포 배양물을 감염시키는 단계,
    c) 적절한 기간 동안 상기 감염된 세포를 배양하는 단계;
    d) 배양 상등액 및/또는 패키징 세포로부터 제조된 폭스바이러스 입자를 회 수하는 단계를 포함하는, 표적화된 감염 특이성을 갖지 않는 야생형 폭스바이러스, 약독화된 폭스바이러스 및/또는 재조합 폭스바이러스를 제조하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 동물 생성물이 존재하지 않는 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 패키징 세포가 CEF인 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)가 2일 내지 4일 동안 지속되는 것인 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d가 고속 균질기를 사용함으로써 패키징 세포를 파괴하는 것을 포함하는 것인 방법.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 파편이 회수될 수 있도록 하는, 단계 d로부터 수득된 혼합물을 정화시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 정화 단계가 심층 여과 단계인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 농축 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 농축 단계가 미세여과 단계인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 투석여과 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  22. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제, 및 더욱 특히 벤조나제가 사용되지 않는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폭스바이러스 또는 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 재조합 폭스바이러스를 포함하는 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 조성물내 포함되어 있는 폭스바이러스 중 1% 초과, 바람직하게 5% 초과, 더욱더 바람직하게 10% 초과, 및 가장 바람직하게 적어도 20%가 EEV인 조성물.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 1 ml당 적어도 105, 바람직하게 적어도 106, 더욱 바람직하게 적어도 107, 더욱더 바람직하게 적어도 108 pfu의 역가를 갖는 조성물.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 1 ㎍당 적어도 103, 바람직하게 104, 및 가장 바람직하게 적어도 3 105 pfu의 역가를 갖는 조성물.
  27. 약제 제조를 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폭스바이러스, 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  28. 제27항에 있어서, 암의 치료학적 또는 예방학적 치료법을 위한 용도.
  29. 제27항에 있어서, 감염 질환의 치료학적 또는 예방학적 치료법을 위한 용도.
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