KR20090026060A - 다기능성 고분자막 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 표면상에 중합체 막이 코팅되어 있고 항-바이오파울링 특성을 나타내며 공유결합을 형성할 수 있는 반응기를 포함하는 고상 기질의 제조방법에 관한 것이다: (a) (ⅰ) 상기 고상 기질의 표면에 결합되는 표면-앵커링 부위를 포함하는 중합체의 제1단량체, (ⅱ) 항-바이오파울링 특성을 나타내는 중합체가 결합된 제2단량체, 및 (ⅲ) 공유결합을 형성할 수 있는 반응기를 포함하는 제3단량체를 반응시켜 표면-앵커 부위, 단백질-저항성 부위 및 반응성 부위를 포함하는 중합체를 생성하는 단계; 및 (b) 상기 중합체를 상기 고상 기질의 표면에 코팅하는 단계.

기질, 바이오칩, 바이오센서, 자가-조립 단일막

Description

다기능성 고분자막 및 그의 용도{Multi―Functional Polymeric Layers and Its Uses}

본 발명은 고상 기질의 제조방법, 고상 기질, 바이오칩 또는 바이오센서 및 고상 기질을 코팅하는 데 이용되는 신규한 중합체에 관한 것이다.

생물학적 활성 물질(예컨대, 바이오틴, DNAs, 당류, 펩타이드 및 단백질)¹ 및 세포를 고상의 기질 상²에 패턴을 생성시키는 것은 큰 관심의 대상이 되고 있는데, 그 이유는 이와 같은 패턴이 바이오센서³ 또는 고속 스크리닝용 분석 시스템에 이용되어 우수한 응용성을 갖고 있기 때문이다⁴. 특히, 프로테옴의 연구 또는 질환의 진단에 현재 이용되고 있는 SiO₂-계 기질 상의 단백질 마이크로어레이를 구축하는 것은 관심이 크게 집중되는 분야이다⁵. 일반적으로, 두 개의 작용기성(functionality)가 단백질 어레이의 성공적인 구축에 요구된다: ⅰ) 프로브 단 백질을 고정화 하는 생활성 표면; 및 ⅱ) 낮은 시그널-대-노이즈 비율(S/N 비율)를 야기하는 원치 않는 단백질의 비특이적 흡착을 최소화 하는 생물학적 비활성 (항바이오파울링) 표면⁶. 이러한 목적을 달성하기 위한 종래의 전략은, 한쪽 말단에 표면 반응성 그룹(즉, 트리메톡시 또는 트리클로로 실란) 및 다른쪽 말단에 작용기(즉, 아민, 알코올, 올리고에틸렌 글라이콜)를 포함하는 모노밸런트 화합물에 의해 형성되는 자가-조립 단일막[self-assembled monolayers(SAMs)]에 의존한다⁷. 그러나, 금 표면 상에 SAMs가 직접적으로 형성⁸되는 것과는 다르게, 모노밸런트 실리콘 화합물을 이용하여 SiO₂ 기질 상에 SAMS를 형성시키는 것은, 종종 표면 상에 응집체(중합체화돈 실록산)를 생성할 뿐만 아니라 많은 결점을 초래하며, 이는 분석 결과의 나쁜 재현성을 초래한다⁹. 따라서, 비특이적 흡착을 억제하면서 SiO₂ 기질 상에서 생물학적 물질을 특이적으로 고정화할 수 있는 새로운 플랫폼을 개발하는 것이 매우 중요하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 바이오센서 및 바이오칩의 기반 기술인 기질 표면 코팅을 개선하려는 시도를 하였다. 특히, 비특이적 흡착을 억제면서도 기질 표면에 생체 분자를 효율적으로 고정화하여, 시그널-대-노이즈(signal-to-noise)를 크게 개선하여, 우수한 분석능 및 재현성을 갖는 바이오센서 및 바이오칩을 제공하고자 노력하였다. 그 결과, 표면-앵커링, 항-바이오파울링 및 반응성 부위를 각각 갖는 3종의 단량체를 이용하여 중합체를 제조하고 이를 고상 기질에 코팅하고, 생체 분자를 고정화 하여 우수한 특성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 표면상에 중합체 막이 코팅되어 있고 항-바이오파울링 특성을 나타내며 공유결합을 형성할 수 있는 반응기를 포함하는 고상 기질의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 표면-앵커링, 항-바이오파울링 및 반응성 부위를 포함하는 이중 기능성 고상 기질을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 바이오칩 또는 바이오센서를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 고상 기질을 코팅하는 데 이용되는 신규한 중합체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 표면상에 중합체 막이 코팅되어 있고 항-바이오파울링 특성을 나타내며 공유결합을 형성할 수 있는 반응기를 포함하는 고상 기질의 제조방법을 제공한다:

(a) (ⅰ) 상기 고상 기질의 표면에 결합되는 표면-앵커링 부위를 포함하는 중합체의 제1단량체, (ⅱ) 항-바이오파울링 특성을 나타내는 중합체가 결합된 제2단량체, 및 (ⅲ) 공유결합을 형성할 수 있는 반응기를 포함하는 제3단량체를 반응시켜 표면-앵커 부위, 단백질-저항성 부위 및 반응성 부위를 포함하는 중합체를 생성하는 단계; 및

(b) 상기 중합체를 상기 고상 기질의 표면에 코팅하는 단계.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단량체의 중합반응에 의해 형성된 중합체가 코팅되어 있고, 표면-앵커링, 항-바이오파울링 및 반응성 부위를 포함하는 이중 기능성 고상 기질을 제공한다: (ⅰ) 상기 고상 기질의 표면에 결합되는 표면-앵커링 부위를 포함하는 제1단량체, (ⅱ) 항-바이오파울링 특성을 나타내는 중합체가 결합된 제2단량체, 및 (ⅲ) 공유결합을 형성할 수 있는 반응기를 포함하는 제3단량체.

본 발명자들은 바이오센서 및 바이오칩의 기반 기술인 기질 표면 코팅을 개 선하려는 시도를 하였다. 특히, 비특이적 흡착을 억제면서도 기질 표면에 생체 분자를 효율적으로 고정화하여, 시그널-대-노이즈(signal-to-noise)를 크게 개선하여, 우수한 분석능 및 재현성을 갖는 바이오센서 및 바이오칩을 제공하고자 노력하였다. 그 결과, 표면-앵커링, 항-바이오파울링 및 반응성 부위를 각각 갖는 3종의 단량체를 이용하여 중합체를 제조하고 이를 고상 기질에 코팅하고, 생체 분자를 고정화 하여 우수한 특성을 확인하였다.

바이오센서 또는 바이오칩에 이용되는 고상 기질의 표면에는 생체 분자(단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드 또는 당) 또는 화학물질(chemicals)을 부착하여 분석에 이용된다. 본 발명은 이러한 고상 기질의 표면에 생체분자 등을 부착하는 기술에 관한 것으로서, 중합체를 기질 표면에 코팅하여 실시된다.

본 발명의 중합체는 3가지 단량체를 이용하여 제조된다. 그리고 3종의 단량체는 각각 (ⅰ) 표면-앵커링 부위, (ⅱ) 항-바이오파울링 부위 및 (ⅲ) 반응성 부위를 포함하며, 이를 통하여 이중 기능성, 즉 항-바이오파울링 및 생체분자의 부착을 달성한다.

3가지 단량체 중에서, 제1단량체는 고상 기질의 표면에 결합되는 표면-앵커링 부위를 포함한다.

제1단량체로 이용 가능한 것은, 중합체의 다양한 단량체들이 이용될 수 있으며, 예를 들어, 아크릴산, 아크릴로니트릴, 알릴아민, 메타크릴산, 알킬 아크릴레이트, 알킬 메타크릴레이트, 부타디엔, 카보메틸실란, (카보네이트)우레탄, 폴리디메틸실록산의 아크릴레이트, 폴리디메틸 실록산의 메타크릴레이트, 에틸렌, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, (에테르) 우레탄, 우레탄, 비닐 클로라이드, 비닐 알코올, 말레산 무수물, 셀룰로오스 클로라이드, 비닐 알코올, 셀룰로오스 니트레이트, 카복시 메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 프로필렌, 에스테르, 카보네이트, 에테르, 부텐, 말레산, 플루오로폴리머 모노머 단위, 불포화 폴리머 모노머, 이소프렌, 멜라민, 설폰, 생물학적 폴리머 모노머 단위, 단백질, 젤라틴, 단백질, 젤라틴, 엘라스틴, 부틸 메타크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 폴리프로필렌 글리콜 디글라이시달 에테르, 폴리프로필렌 글리콜 디글라이시딜 에테르, N-아크릴옥시석니너마이드, 글라이시딜 메타크릴레이트, 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 아크로레인, 글리세롤 모노메타클리레이트, 헤파린 메타크릴레이트, 메타크릴로일에틸 포스포릴콜린, 부틸 아크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 모노메타크릴레이트, 이소부틸 메타크릴레이트, 사이클로헥실 메타크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 2-에틸헥실 메타크릴레이트, 에틸 메타크릴레이트, 메틸 아크릴레이트, 헥사데실 메타크릴레이트, 옥타데실 메타크릴레이트, 스틸렌, 메틸 스틸렌, 비닐 톨루엔, 터트-부틸 아크릴레이트, n-비닐 피롤리돈, 글리코라이드, 락타이드, 부티로락톤, 카프로락톤, 하이드록시알카노에이트, 3-하이드록시부티레이트, 4-하이드록시부티레이트, 3-하이드록시발러레이트 및 3-하이드록시헥사노에이트를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 본 발명의 제1단량체는 아클릴계 또는 메타크릴계 단량체이며, 예를 들어, 메타크릴산, 아크릴산, 알킬메타크릴레이트(예컨대, 메틸메타크릴 레이트, 에틸메타크릴레이트, 부틸메타크릴레이트, 이소부틸 메타크릴레이트, 헥사데실 메타크릴레이트, 옥타데실 메타크릴레이트 및 사이클로헥실 메타크릴레이트), 알킬아크릴레이트(예컨대, 메틸아크릴레이트, 에틸 아크릴레이트 및 터트-부틸 아크릴레이트), 아릴 아크릴레이트(예컨대, 벤질 아크릴레이트), 아릴 메타크릴레이트(예컨대, 벤질 메타크릴레이트), 2-에틸헥실메타크릴레이트, 라우릴메타크릴레이트, 하이드록실에틸메타크릴레이트, PEG 아크렐레이트, PEG 메타크릴레이트, 하이드록시프로필 메타크릴레이트, 하이드록시프로필메타크릴아미드, 3-트리메틸실릴프로필 메타크릴레이트, 3-트리메톡시실릴프로필 메타크릴레이트, 아크릴로니트릴, 폴리디메틸실록산의 아크릴레이트, 폴리디메틸 실록산의 메타크릴레이트, 글라이시딜 메타크릴레이트, 글리세롤 모노메타클리레이트, 헤파린 메타크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 모노메타크릴레이트, 2-하이드록시에틸 아크릴레이트 및 2-에틸헥실 메타크릴레이트를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 제1단량체는 표면-앵커링 부위로서, 치환 또는 비치환된 실란기, 치환 또는 비치환된 알킬기 또는 치환 또는 비치환된 아릴기를 포함한다.

제1단량체에 있는 치환 또는 비치환된 실란기는 고상 기질(예컨대, Si/SiO₂ 웨이퍼)의 하이드록실기와 공유결합을 형성하여 고상 기질에 중합체 막을 앵커링시킨다.

제1단량체에는 비치환된 실란기, 즉 SiH₄가 있을 수 있으며 이는 고상 기질 표면에 앵커링 된다. 바람직하게는, 제1단량체에는 치환된 실란기가 있으며, 이 치환된 실란기를 통하여 중합체가 고상 기질 표면에 앵커링 된다.

제1단량체에서 표면-앵커링 부위가 치환된 실란기인 경우에는, 바람직하게는 알콕시기로 치환된 실란기(즉, 알콕시실릴기), 보다 바람직하게는 C₁-C₆ 알콕시기로 치환된 실란기이다. 본 명세서 용어 알콕시는 -O알킬기를 의미한다. 용어 알콕시실릴은 알콕시 치환된 실릴기를 의미하며, 바람직하게는 트리메톡시실릴 및 트리에톡실릴, 보다 바람직하게는 트리메톡시실릴이다.

제1단량체에는 하이드록시기로 치환된 실란기(즉, 하이드록시실릴기)가 있을 수 있다. 용어 하이드록시실릴은 하이드록시-치환된 실릴기를 의미하며, 바람직하게는 트리하이드록시 실릴기이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제1단량체는 치환 또는 비치환된 알킬기를 포함할 수 있다. 이러한 알킬기는 제1단량체에 소수성을 부여하여 중합체가 고상 기질(예컨대, 소수성 표면을 갖는 폴리스틸렌 기질)에 소수성 상호 작용 및/또는 다이폴(dipole) 상호작용을 통해서 앵커링 되도록 한다.

바람직하게는, 제1단량체에 있는 알킬기는 C_{6 -30} 알킬기, 보다 바람직하게는 C_{8 -30} 알킬기이다. 용어 알킬은 지정된 탄소수를 갖는 직쇄 또는 분쇄 포화 탄화수소기를 의미한다. 알킬기가 치환되는 경우, 바람직하게는 F, Cl 또는 Br, 보다 바람직하게는 F로 치환된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제1단량체는 치환 또는 비치환된 아릴 기를 포함할 수 있다. 이러한 아릴기는 p-p 상호작용을 통하여 중합체가 고상 기질(예컨대, 소수성 표면을 갖는 폴리스틸렌 기질)에 앵커링 되도록 한다. 용어, 아릴은 전체적으로 또는 부분적으로 불포화된 치환 또는 비치환된 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄소 고리를 의미하며, 바람직하게는 모노아릴 또는 비아릴이다. 모노아릴은 탄소수 5-6을 갖는 것이 바람직하며, 비아릴은 탄소수 9-10을 갖는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 상기 아릴은 치환 또는 비치환된 페닐이다. 모노아릴, 예컨대, 페닐이 치환되는 경우에는, 다양한 위치에서 다양한 치환체에 의해 치환이 이루어질 수 있으나, 바람직하게는, 할로, 히드록시, 니트로, 시아노, C₁-C₄ 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 가지쇄 알킬, C₁-C₄ 직쇄 또는 가지쇄 알콕시, 알킬 치환 설파닐, 페녹시, C₃-C₆ 사이클로헤테로알킬 또는 치환 또는 비치환 아미노기에 의해 치환될 수 있다.

본 발명에서 이용되는 제2단량체의 기본적인 구조는 제1단량체와 동일하다. 바람직하게는 제2단량체는 메타크릴레이트계 또는 아크릴레이트계 단량체이다. 메타크릴레이트계 또는 아크릴레이트계 단량체에 대한 설명은 제1단량체에 대한 설명을 인용한다.

제2단량체에는 항-바이오파울링 특성을 나타내는 중합체가 결합되어 있다. 바람직하게는, 항-바이오파울링 특성을 나타내는 중합체는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드[예컨대, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 또는 이들의 공중합체(예컨대, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌 옥사 이드 공중합체)], 폴리페닐렌 옥사이드, PEG와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체, 폴리(메톡시에틸 메타크릴에이트), 폴리(메타크릴로일 포스파티딜콜린), 과불화된 폴리에테르, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈이고, 보다 바람직하게는 PEG, 폴리알킬렌 옥사이드 또는 PEG와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체이며, 가장 바람직하게는 PEG이다.

본 발명에서 이용되는 제3단량체의 기본적인 구조는 제1단량체와 동일하다. 바람직하게는, 제2단량체는 메타크릴레이트계 또는 아크릴레이트계 단량체이다. 메타크릴레이트계 또는 아크릴레이트계 단량체에 대한 설명은 제1단량체에 대한 설명을 인용한다.

제3단량체에는 반응기가 결합되어 있다. 이 반응기는 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA), 당 또는 화학물질과 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 것이다. 따라서, 제3단량체에 있는 반응기는 다양한 반응기를 포함한다. 예를 들어, 제3단량체에 있는 반응기는, 알데하이드; 에폭시; 할로알킬; 1차아민; 티올; 말레이미드; 에스테르(바람직하게는 N-하이드록시석시너마이드 에스테르 작용기); 그리고 카르복실기(하이드록시-석시너마이드 에스테르 형성에 의해 활성화됨)와 히드록실기(사이아노겐 브로마이드로 활성화됨)와 같은 활성화되는 반응기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 제3단량체는 반응기로서 카르복실기를 포함한다.

제3단량체가 반응기로서 카르복실기를 포함하는 경우, 바람직하게는, 이 카르복실기는 석시너마이드, 석시너미딜 에스테르, 설포-석시너미딜 에스테르, 2,3,5,6-테트라플루오로페놀 에스테르, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페놀 에스테르, 알데하이드, 산무수화물, 아자이드, 아졸리드, 카보이마이드, 에폭사이드, 에스테르, 글리시딜 에테르, 할라이드, 이미다졸 또는 이미데이트에 의해 활성화 되어 있다. 가장 바람직하게는, 반응기로서의 카르복실기는 석시너마이드 또는 석시너미딜 에스테르에 의해 활성화 되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고상 기질에 코팅되는 중합체는 다음 화학식 1로 나타낸다:

상기 화학식에서, R₁은 실릴알킬기, (알콕시실릴)알킬기, (하이드록시실릴)알킬기, 치환 또는 비치환된 알킬기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기, 또는 치환 또는 비치환된 알카릴기이고; R₂는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리페닐렌 옥사이드, PEG와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체, 폴리(메톡시에틸 메타크릴에이트), 폴리(메타크릴로일 포스파티딜콜린), 과불화된 폴리에테르, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈이며; R₃는 알데하이드, 에폭시, 할로알킬, 1차아민, 티올, 말레이미드, 에스테르, 카르복실기 또는 히드록 실기이며; R₄, R₅ 및 R₆는 서로 독립적으로, H 또는 C₁-C₅ 알킬기이며; X, Y 및 Z는 서로 독립적으로 산소, 황 또는 질소 원자이고; l, m 및 n은 서로 독립적으로 1-10,000의 정수이다.

상기 화학식 1에서 R₁의 정의에 사용되는 용어 실릴알킬은 알킬기로 치환된 실릴기로 치환된 알킬기를 의미한다. 예를 들어, 실릴알킬은 실릴메틸, 실릴에틸, 실릴프로필 및 실릴부틸을 포함한다. 용어 (알콕시실릴)알킬은 알콕시-치환된 실릴알킬기를 의미한다. 예를 들어, (알콕시실릴)알킬은 트리메톡시실릴에틸, 트리메톡시실릴프로필, 트리메톡실릴부틸, 트리메톡실릴펜틸, 트리에톡시실릴에틸, 트리에톡시실릴프로필, 트리에톡실릴부틸, 트리메톡실릴펜틸, 메틸디메톡시실릴에틸, 메틸디메톡시실릴프로필, 디메틸메톡시실릴에틸 및 디메틸메톡시실릴프로필을 포함한다. 용어 (하이드록시실릴)알킬은 하이드록실-치환된 실릴알킬을 의미하며, 예컨대, 트리하이드록시실릴에틸, 트리하이드록시실릴프로필, 트리하이드록시실릴부틸 및 트리하이드록시실릴펜틸을 포함한다.

용어 “아랄킬”은 하나 또는 그 이상의 알킬기에 의한 구조에 결합된 아릴기를 의미하며, 예컨대 벤질기 및 페닐프로필기이다. 용어, “알카릴”은 하나 또는 그 이상의 아릴기로 이루어진 구조에 결합된 알킬기를 의미한다.

바람직하게는, 화학식 1에서 R₁은 (알콕시실릴)알킬기, 치환 또는 비치환된 C_{6 -30} 알킬기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기, 또는 치환 또는 비치환된 알카릴기이고, 보다 바람직하게는 (C_{1 -6} 알콕시실릴)C_{1 -10} 알킬기, 치환 또는 비치환된 C_{6 -30} 알킬기, 치환 또는 비치환된 페닐기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기로서 C_{1 -5} 알킬기에 페닐기에 결합된 것, 또는 치환 또는 비치환된 알카릴기로서 페닐기에 C_{1 -5} 알킬기가 결합된 것이며, 가장 바람직하게는 (C_{1 -3} 알콕시실릴)C_{1 -5} 알킬기, 치환 또는 비치환된 C_{8 -20} 알킬기, 치환 또는 비치환된 페닐기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기로서 C_{1 -5} 알킬기에 페닐기에 결합된 것, 또는 치환 또는 비치환된 알카릴기로서 페닐기에 C_{1 -5} 알킬기가 결합된 것이다.

상술한 3가지 단량체에 의해 제조된 중합체를 고상 기질 표면에 코팅하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 중합체의 용액에 고상 기질을 적합한 시간 동안 함침시켜 코팅할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고상 기질 상에 코팅되는 중합체는 고상 기질 상에 자가-조립 단일막(self assembled monolayer) 형태로 존재한다.

고상 기질 상에 형성된 자가-조립 단일막은, 0.8-2 nm, 바람직하게는 0.9-1.3 nm의 두께를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (c) 상기 고상 기질에 코팅된 중합체 막의 제3단량체로부터 유래된 반응기에 화학물질, 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA), 펩타이드 핵산(PNA) 또는 당을 결합시키는 단계를 추가적으로 포함한다.

고상 기질에 코팅된 중합체 막의 제3단량체로부터 유래된 반응기에 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA), 당 또는 화학물질을 공유결합시킨다.

예컨대, 반응기가 활성화된 카르복실기인 경우에는 단백질 등의 아민기를 통하여 공유결합시킬 수 있다. 반응기가 아민기인 경우에는 단백질 등의 카르복실기를 통하여 공유결합시킬 수 있다.

또한, 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드 및 당은 간접적으로 반응기에 결합시킬 수 있다. 예를 들어, 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드 또는 당에 친화성을 갖는 물질을 우선 반응기에 결합시킨 다음, 단백질(예컨대, 스트렙타비딘 또는 아비딘) 등을 친화성 물질(바이오틴)에 결합(바람직하게는, 비공유결합)시켜 간접적으로 반응기에 결합시킬 수 있다.

생체분자 등을 자기조립막을 통하여 고상 기질에 고정화 하는 경우, 생체분자는 다음과 같은 방법에 의해 고정화 될 수 있다: 접촉 핀 프린팅, 잉크 젯 프린팅과 에어로졸 프린팅과 같은 비접촉 프린팅, 모세관 프린팅, 마이크로접촉 프린팅, 패드 프린팅, 스크린 프린팅, 실크 스크리닝, 마이크로파이펫팅 또는 스프레이잉.

본 발명에서 이용될 수 있는 고상 기질은 표면 특성에 무관하게 어떠한 것도 이용 가능하다. 예를 들어, 고상 기질은, 금속(예컨대, 금, 금과 구리의 합금, 알루미눔), 금속 옥사이드, 유리, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO₂ 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스 및 콜로이드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

제1단량체에 있는 표면-앵커링 부위가 치환 또는 비치환된 실란기인 경우에는, 유리, 금속 옥사이드, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체 및 Si/SiO₂ 웨이퍼 기질을 이용하는 것이 바람직하다. 제1단량체에 있는 표면-앵커링 부위가 치환 또는 비치환된 알킬기 또는 치환 또는 비치환된 아릴기인 경우에는, 카본, 탄소나노튜브 및 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드) 기질을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 고상 기질 상에 중합체성 자가-조립 단일막을 안정되게 코팅할 수 있고, 항-바이오파울링 특성에 의해 원하는 생체분자 이외에 다른 분자들이 흡착되는 것을 억제하여 시그널-대-노이즈를 크게 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 중합체에 있는 반응기를 통하여 원하는 생체분자를 안정되면서도 패턴화된 형태로 고상 기질에 고정화할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 고상 기질을 포함하는 바이오칩 또는 바이오센서를 제공한다.

본 발명의 바이오칩 또는 바이오센서에서, 자기조립단일막 중합체의 반응기를 통하여 생체분자가 고상 기질에 고정화 된다.

본 발명의 바이오칩은 바람직하게는, DNA 마이크로어레이 또는 단백질 칩이 다. 본 발명의 바이오칩에 적용될 수 있는 일반적인 설명은, 미국 특허 제5,143,854, 5,242,974, 5,252,743, 5,324,633, 5,384,261, 5,405,783, 5,412,087, 5,424,186, 5,451,683, 5,482,867, 5,491,074, 5,527,681, 5,550,215, 5,571,639, 5,578,832, 5,593,839, 5,599,695, 5,624,711, 5,631,734, 5,795,716, 5,831,070, 5,837,832, 5,856,101, 5,858,659, 5,889,165, 5,936,324, 5,959,098, 5,968,740, 5,974,164, 5,981,185, 5,981,956, 6,025,601, 6,033,860, 6,040,193, 6,090,555, 6,136,269, 6,147,205, 6,262,216, 6,269,846, 6,310,189 및 6,428,752호게 상세하게 기재되어 있다.

본 발명의 바이오센서에 적용될 수 있는 일반적인 내용은, Myska, J. Mol . Recognit, 12:279-284(1999); J. Dubendorfer et al. Journal of Biomedical Optics, 2(4):391-400(1997); 및 O'Brien et al. Biosensors & Bioelectronics, 14:145-154(1999)에 기재되어 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 중합체를 제공한다:

화학식 1

상기 화학식에서, R₁은 실릴알킬기, (알콕시실릴)알킬기, (하이드록시실릴)알킬기, 치환 또는 비치환된 알킬기 또는 치환 또는 비치환된 아릴기이고; R₂는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리페닐렌 옥사이드, PEG와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체, 폴리(메톡시에틸 메타크릴에이트), 폴리(메타크릴로일 포스파티딜콜린), 과불화된 폴리에테르, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈이며; R₃는 알데하이드, 에폭시, 할로알킬, 1차아민, 티올, 말레이미드, 에스테르, 카르복실기 또는 히드록실기이며; R₄, R₅ 및 R₆는 서로 독립적으로, H 또는 C₁-C₅ 알킬기이며; X, Y 및 Z는 서로 독립적으로 산소, 황 또는 질소 원자이고; l, m 및 n은 서로 독립적으로 1-10,000의 정수이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 3가지 기능성, 표면-앵커링, 항-바이오파울링 및 반응성 부위를 갖는 중합체를 이용한다.

(b) 본 발명에 따르면 고상 기질 상에 중합체성 자가-조립 단일막을 안정되게 코팅할 수 있다.

(c) 본 발명은 우수한 항-바이오파울링 특성을 가지고 있어, 시그널-대-노이즈를 크게 향상시킬 수 있다.

(d) 본 발명에 따르면 이용되는 중합체의 반응기를 통하여 원하는 생체분자를 안정되면서도 패턴화된 형태로 고상 기질에 고정할 수 있다.

(e) 본 발명에 따르면, 사용되는 3가지 단량체의 양을 조절함으로써, 생체분자의 결합을 위한 반응기성(bioreactive functionality) 및 항-바이오파울링 작용기성(antibiofouling functionality)를 조절할 수 있다.

(f) 본 발명에 따르면, 기질의 종류에 무관하게 SAM을 고체 기질 표면 상에 형성시킬 수 있으며, 특히 폴리머 기질 표면에 SAM을 우수한 효율로 형성시킬 수 있다.

(g) 본 발명에 따르면 시그널-대-노이즈가 크게 향상된 바이오센서 또는 바이오칩을 제공할 수 있다.

위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 3가지 기능성, 표면-앵커링, 항-바이오파울링 및 반응성 부위를 갖는 중합체를 이용한다. 본 발명에 따르면 고상 기질 상에 중합체성 자가-조립 단일막을 안정되게 코팅할 수 있으며, 우수한 항-바이오파울링 특성을 가지고 있어, 시그널-대-노이즈를 크게 향상시킬 수 있다. 본 발명에 따르면 이용되는 중합체의 반응기를 통하여 원하는 생체분자를 안정되면서도 패턴화된 형태로 고상 기질에 고정할 수 있고, 사용되는 3가지 단량체의 양을 조절함으로써, 생체분자의 결합을 위한 반응기성(bioreactive functionality) 및 항-바이오파울링 작용기성(antibiofouling functionality)를 조절할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 기질의 종류에 무관하게 SAM을 고체 기질 표면 상에 형성시킬 수 있으며, 특히 폴리머 기질 표면에 SAM을 우수한 효율로 형성시킬 수 있다. 본 발명에 따르면 시그널-대-노이즈가 크게 향상된 바이오센서 또는 바이오칩을 제공할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 방법

실험 물질

N-아크릴옥시석시나마이드(NAS 99%)를 ACROS Organics (Noisy-le-Grand, 프랑스)로부터 구입하였다. 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트(평균 Mn = ca. 475), 도데실 메타크릴레이트, Zonyl^TM TM 플루오로모노머(평균 Mn = ca. 534), 벤질 메타크릴레이트, 메타크릴산 및 2,2'-아조비스이소부티로니트릴(AIBN)을 Aldrich Chemical Co.(Milwaukee, WI)로부터 구입하였다. (+)-바이오티닐-3,6,9-트리옥사운데칸디아민(바이오틴-NH₂) 및 플루오레신-결합 스트렙토마이신을 Pierce (Rockford, IL)로부터 구입하였 다. 모든 유기 용매는 추가적인 정제 없이 구입한 그대로 사용하였다. Si/SiO₂ 웨이퍼, 폴리(디메틸실록산) (PDMS) 및 유리 슬라이드와 같은 실험에서 이용된 모든 기질은 세정제로 세정한 다음, 탈이온수 및 메탄올로 수회 세척하였다. 폴리머 필름을 형성하기 전에, 모든 기질을 O₂ 플라즈마로 1분 동안 처리하여 표면을 세정하고 -OH 그룹을 형성시켰다.

측정

¹H NMR (300 MHz) 스펙트럼을 JEOL JNM-LA300WB FT-NMR (Tokyo, Japan)로 기록하였다. Waters 1515 시리즈 등용매 펌프, 0.4 mL/min의 유속으로 100 ㎕ 주입 루프를 가지는 Rheodyne 모델 7725 주입기를 이용하여, 유기상 젤 투과 크로마토그래피(GPC)를 실시하였다. 단일막 필름의 두께는 Gaertner L116A ellipsometer (Gaertner Scientific Corporation, IL)를 이용하여 70^o 입사각으로 측정하였다. 모든 필름에 대하여 1.46의 굴절률을 이용하였고, 3-상 모델을 이용하여 두께를 계산하였다. 비데오 카메라 및 모니터가 장착된 phoenix300, 접촉각 & 표면 장력 분석기(Surface electro optics, Kyonggi, Korea)를 이용하여 접촉을 측정하였다. X-선 광전자 스펙트로스코피(XPS) 스펙트럼은, 모노크로마틴화된 Al K X-선 소스가 있는 Kratos AXIS Ultra Imaging X-선 광전자 스펙트로미터를 이용하여 얻었다.

폴리(TMSMA-r-PEGMA-r-NAS)의 합성

중합반응 전, 니트 PEGMA를 억제제 제거 컬럼(Aldrich Chemical Co.)에 통과시켰다. PEGMA (1.425 g, 3 mmol, 1 equiv) 및 TMSMA (0.744 g, 3 mmol, 1 equiv), NAS (0.507 g, 3 mmol, 1 equiv), 및 AIBN (16.5 mg, 0.1 mmol, 0.01 equiv) 바이알에 넣고, 테트라하이드로퓨란 (무수, 억제제 결여, 99.9%, 10 mL)에 녹였다. Ar 가스 스트림을 이용하여 20분 동안 상기 혼합물로부터 탈가스화 시킨 다음, 테프론-라이닝 스크루-캡으로 바이알을 봉입 하였다. 중합 반응은 70℃에서 24시간 동안 실시하였다. 진공 하에서 용매를 증발시킨 다음, 중합체를 접착성 액체 상태로 얻었다. 생반응성 그룹의 상이한 몰 비(NAS: 33%, 20%, 및 10%)를 갖는 공중합체가 제조 되었다. 3가지 모노머의 초기 피딩 비율은, 폴리 1, 폴리 2 및 폴리 3에 대하여 각각 1:1:1, 2:2:1 및 4:5:1 이었다. 최종 공중합체에 들어가 있는 3가지 중합체의 실질적인 비율을 계산하기 위하여, ¹H NMR 스펙트럼에서 δ = 4.13 (CO₂-CH ₂ at PEGMA)에서의 피크의 통합수치, δ = 3.92 (CO2-CH ₂ at TMSMA)에서의 피크의 통합수치를 δ = 2.82 (CO-CH ₂-CH ₂-CO at NAS)에서 피크의 통합수치와 비교하였다. 폴리 1의 ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 4.13 (br, 2H, CO₂-CH ₂ of PEGMA), 3.92 (br, 2H, CO₂-CH ₂ of TMSMA), 3.66 (s, 30H), 3.63-3.55 (s, 9H; m, 2H), 3.40 (s, 3H), 2.82 (br, 4H, CO-CH ₂CH2-CO of NAS) 2.0-1.71 (br, 6H), 1.04 (br, 2H), 0.87 (br, 4H), 0.66 (br, 2H). 폴리 1 (Mn = 15784 with Mw/Mn = 1.58), 폴리 2 (Mn = 17245 with Mw/Mn = 1.71), 폴리 3 (Mn = 16571 with Mw/Mn = 1.67).

양극성( amphipathic ) 중합체의 합성

앵커링 위치에 도데실 메타크릴레이트를 이용하여 폴리-4를 합성하였다. 도데실 메타크릴레이트 (4 mmol, 1.016 g, 2 equiv), PEGMA (4 mmol, 1.9 g, 2 equiv) 및 메타크릴산 (2 mmol, 0.172 g, 1 equiv)을 THF (무수, 99.9%, 억제제-결여)에 용해하였다. 혼합물을 N₂로 15분 동안 버블링하여 탈기체화 하였다. 0.1 mmol AIBN (16.4 mg, 0.05 equiv)을 라디칼 개시제로 첨가한 다음, 바이알을 테프론-라이닝 스크루-캡으로 봉입 하였다. 중합 반응은 70℃에서 24시간 동안 실시하였다. 최종 산물은 4℃에서 보관하였다. 플루오로모노머 및 벤질 메타크릴레이트를 이용하여 앵커리지 위치에서 도데실 메타크릴레이트를 치환 하여 폴리 5 및 폴리 6을 제조하였다. 폴리-4 (Mn = 19581 with Mw/Mn = 1.88), 폴리-5 (Mn = 21831 with Mw/Mn = 1.97), 폴리-6 (Mn = 16255 with Mw/Mn = 1.91). ¹H NMR (300.40 MHz, CDCL₃): poly-4 δ = 4.05 (br, 2H, CO2-CH2 of PEGMA), 3.82 (br, 2H, CO₂-CH₂ of dodecylMA), 3.66 (s, 30H), 3.40 (s, 3H), 2.0-1.71 (br, 10H), 1.5-1.1 (br, 20H), 0.87 (br, 3H); poly-6 δ = 7.30 (s, 5H), 4.93 (br, 2H, CO₂-CH₂ of benzylMA), 4.05 (br, 2H, CO₂-CH₂ of PEGMA), 3.66 (s, 30H), 3.40 (s, 3H), 2.0-1.71 (br, 10H), 0.87 (br, 3H), 0.72 (br, 4H).

양극성( amphipathic ) 중합체를 이용한 폴리스틸렌계 플라스틱 표면의 변형

THF를 진공 펌프를 이용하여 증발시켰다. 증발 후, 점성 액상의 중합체를 얻었다. 폴리 4-6 중합체는 물에 잘 용해되는데, 그 이유는 다수의 PEG기가 존재하기 때문이다. 폴리스틸렌 기질을 양극성 중합체(20 mg/mL)의 수용액에 주위온도에서 함침시키고, 순수한 물로 세척하여 폴리스틸렌계 기질 상에 양극성 중합체의 pSAMs를 형성시켰다.

중합체 코팅된 플라스틱 표면의 항- 바이오파울링 효과

플라스틱 표면 상에 단백질의 비특이적 결합은 소수성 상호작용에 의해 주로 발생한다. 중합체(폴리-4, 폴리-6) 코팅의 단백질-저항성을 평가하기 위하여, 중합체 코팅된 플라스틱 표면을 우혈청 알부민(BSA) 용액(0.25 mg/mL in PBS, pH 7.4)에 2시간 동안 함침시켰다. 플라스틱 표면 상에 단백질의 비특이적 흡착 정도는 고해상 N (1s) XPS 스펙트럼으로 분석하였다.

EDC / NHS 를 이용한 중합체 코팅 표면의 활성화

생체분자의 특이적 고정화를 위하여, 중합체 코팅 플라스틱 표면을 활성화 시켰다. 폴리 4-6의 카르복실산 그룹을 EDC/NHS를 이용하여 NHS 에스테르기로 전환 시켰다. 증류수 내의 EDC (0.4 M) 및 NHS (0.1 M)의 1:1 혼합물을 20분 동안 적용시켜 중합체 코팅된 플라스틱 표면 COOH 그룹을 활성화 시켰다.

생물학적 리간드의 마이크로접촉 프린팅( Microcontact printing : μ CP )

잉킹 후, 아민-말단 바이오틴 리간드(바이오틴-NH₂, 10mM in 에탄올)를, PSAMS 상에 PDMS 스탬프를 접촉시켜 60초 동안 프린팅 하였다. 이어, 시료를 보레이트 완충액(pH 9.0)에 즉시 2시간 동안 함침시켰다. 바이오틴의 패턴 생성 후, 시료를 인산완충염수(PBS, pH 7.4) 내의 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(TRITC)-결합 스트렙타비딘 용액(0.1 mg/mL)에 실온에서 함침시켰다. 60분 후, 시료를 제거하고 PBS 및 증류수로 수회 세척하였다. 폴리 1-3의 경우, 40, 100, 200(1.4 NA) 오일 오브젝티브 및 TRITC-최적화 필터 세트(Omega Optical Inc, Brattleboro, VT, U.S.A.)가 장착된 Leica DMRBE 현미경(Leica Microsystems AG, Wetzlar, Germany)을 이용하여 스트렙타비딘의 패턴(λ_ex = 488 nm, λ_em = 520 nm)을 가시화 하였다. MetaMorph 이미징 소프트웨어(Universal Imaging Co, Downingtown, PA, U.S.A.)에 의해 작동되는 CoolSNAPfx CCD 카메라를 이용하여 이미지를 얻었다. 폴리 4-6의 경우, 200x, 400x 오브젝티브 및 TRITC-최적화 필터 세트(Omega Optical Inc, Brattleboro, VT, U.S.A.)가 장착된 Leica DMRBE 현미경(Leica Microsystems AG, Wetzlar, Germany)을 이용하여 스트렙타비딘의 패턴(λ_ex = 547 nm, λ_em = 572 nm)을 가시화 하였다.

양친성 중합체에 의한 변형 플라스틱 표면의 ELISA 응용

96 웰 플랫-저부 분석 플레이트를 이용하여 양친성 중합체의 표면 코팅을 실시하였다. 물 내의 양친성 중합체 100 ㎕ (20 mg/mL)를 각각의 웰에 첨가하고 1시간 동안 주위 온도에서 방치 하였다. 이어, 탈이온수 150 ㎕로 웰을 4회 세척하였으며, 각각의 세척 사이에 30초 동안 담그는 과정을 실시하였다. 반응성 부위의 -COOH 기를 활성화시키기 위하여, 100 ㎕ EDC (400 mM) 및 NHS (100 mM)를 각각의 웰에 첨가하고 27℃ 2시간 동안 방치한 다음, 4회 세척하였다. 아민-말단 바이오틴 리간드(바이오틴-NH₂, 10 mg/mL in 에탄올) 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 1시간 동안 27℃에서 반응시키고 150 ㎕ 에탄올로 3회 세척하였으며, 각각의 세척 사이에 30초 동안 담그는 과정을 실시하였다. 보레이트 완충액 (pH 9.0) 150 ㎕를 각각의 웰에 즉시 첨가한 다음 27℃에서 2시간 동안 방치 하였다. 보레이트 완충액을 제거한 다음, PBS 내의 스트렙타비딘 100 ㎕(10 ㎍/mL)을 각각의 웰에 첨가하고 27℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 150 ㎕ PBS로 3회 세척하였다. 100 ㎕ 바이오틴-결합 마우스 항-토끼 IgG 단일클론 항체를 다른 농도로 각각의 웰에 첨가하고 27℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 Immuno™ Washers (Nunc A/S, Roskilde, Denmark)를 이용하여 150 ㎕ PBST (0.1% Tween 20)로 3회 세척하였다. HRP 결합 항-마우스 IgG 항체(1 ㎍/mL) 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 27℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 3회 세척하였다. 최종적으로, 기질 용액(TMB) 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가한 다음, 30분 후 1 M HCl 100 ㎕를 첨가하여 효소 반응을 정지시 켰다. ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 리더를 이용하여 450 nm에서의 흡광 값으로부터 세기를 계산하였다.

중합체 코팅된 표면 상에 단백질 A에 의한 항체 고정화

양친성 중합체의 수용액(20 mg/mL)에 기질을 주위 온도에서 함침시킨 다음 물로 세척하여 양친성 중합체 코팅된 플라스틱 표면을 준비하였다. 중합체 코팅된 플라스틱 표면을 EDC/NHS 시약으로 활성화 시켰다. 증류수 내의 EDC (400 mM)와 NHS (100 mM)의 1:1 혼합물을 20분 동안 적용시켜 중합체 코팅된 플라스틱 표면의 -COOH 기를 활성화 시켰다. 이어, μCP를 실시하여 단백질 A를 고정화 하였다. PDMS 스탬프를 중합체 코팅 플라스틱 표면에 1시간 동안 접촉시켜 단백질 A (100 ㎍/ml in PBS)를 프린팅 하였다. 이어, 시료를 즉시 보레이트 완충액(pH 9.0)에서 2시간 동안 함침 시켰다. 단백질 A의 패턴을 생성시킨 다음, 시료를 실온에서 1시간 동안 항-BSA 용액(10 ㎍/ml in PBS)에 첨가하였다. PBS로 세척한 다음, 시료 코팅된 플라스틱 표면에 FITC-표지 BSA (50 ㎍/ml in PBS)를 최종적으로 첨가하였다. 1시간 후, 시료를 PBS로 여러 번 세척하였다. 200x, 400x 오브젝티브 및 TRITC-최적화 필터 세트(Omega Optical Inc, Brattleboro, VT, U.S.A.)가 장착된 Leica DMRBE 현미경(Leica Microsystems AG, Wetzlar, Germany)을 이용하여 BSA의 패턴(λ_ex = 494 nm, λ_em = 521 nm)을 가시화 하였다.

실험 결과

실험에 이용된 트리플 작용기성 공중합체의 화학적 구조는 하기 반응식 1에 기재되어 있다:

폴리(TMSMA-r-PEGMA-r-NAS)로 명명된 공중합체는 라디칼 중합반응에 의해 3가지 단량체로부터 합성되었다: 표면-앵커 부위로서의 (트리메톡시 실릴)프로필 메타크릴레이트(TMSMA); 단백질-저항성 부위로서의 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트(PEGMA); 및 생반응성 부위로서의 N-아크릴로일석시나마이드(NAS). 생반응성 및 항바이오파울링 작용기성의 표면 밀도는, 중합 합성 반응에서 각각의 단량체의 초기 피딩 비율을 간단하게 변화시켜 조절할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 반응식 1에 기재된 바와 같이 3가지 상이한 NAS 농도를 가지고 일련의 랜덤 공중합들을 합성하였다: 폴리 1 = 1: 1: 1, 폴리 2= 2: 2: 1 및 폴리 3 = 4: 5: 1.

¹H NMR 스펙트럼에서의 통합수치(도 2)에 기초하여 얻은 각각의 공중합체에 서의 실질적 NAS 양은 폴리 1, 폴리 2 및 폴리 3에 대하여 각각 35%, 21% 및 12%로 분석되었다. 공중합체의 조성은 초기 피딩 비율과 잘 일치되었다. 합성된 3가지 공중합체의 분자량은 15,000-17,000이며, 약 1.6의 다분산성을 나타내었으며, 이는 단분산성 폴리스틸렌 표준물질에 대한 상대적인 값으로서 젤 투과 크로마토그래피(GPC)로 측정된 것이다.

상기 공중합체의 용액 (10 mg/mL in 메틸렌 클로라이드)에 Si/SiO₂ 웨이퍼를 주위 온도에서 1시간 동안 함침시키고 용매로 세척하여, 중합체성 자가-조립 단일막(polymeric self-assembled monolayers : pSAMs)를 제조하였다. 이어, pSAMs를 110℃에서 5분 동안 큐어링 하여 탈수시킴으로써 공중합체의 실란기와 산소 플라즈마 처리 후에 형성된 기질의 하이드록실기 사이에 공유결합을 추가적으로 형성시켰다¹⁰.

Si/SiO₂ 표면 상에 형성된 자가-조립 구조 및 생체분자의 특이적 고정화는 도 1에 나타나 있다. 폴리 1-3에 의해 형성된 pSAMs의 두께 및 소수성을 각각 엘립소메트리(ellipsometry) 및 접촉각 측정으로 분석하였다(표 1).

엘립소메트리 및 접촉각과 표면 장력 분석기로 측정된 Si/SiO₂ 웨이퍼 상에 구축된 자가-조립 중합체성 단일막의 두께 및 정적 수 접촉각

분석 항목	폴리 1	폴리 2	폴리 3
두께(Å)	9.9 ± 0.1	10.4 ± 0.1	10.7 ± 0.1
정적 CA(˚)	35.6 ± 0.4	35.3 ± 0.3	33.7 ± 0.5

NAS 부위가 없는 공중합체의 pSAMs에 대하여 종래에 발표¹⁰된 것과 유사하게, 공중합체의 단일 초박막이 표면 전체에 걸쳐 생성되었으며, 두께는 약 1 nm 정도 이었고, 이는 엘립소메트리로 측정되었다. 이와 같은 결과는, 박막이 중합체성 단일막(중합체성 다층막이 아님)으로 존재한다는 것을 의미한다.

pSAMs의 젖음성(wettability)을 주위 온도에서 정적 수 접촉각 측정으로 분석하였다. 공중합체에서의 친수성 PEG가 증가할수록 접촉각이 감소하였다. 중합체 막의 존재를 X-선 광전자 스펙트로스코피로 추가적으로 확인하였다(도 3 및 표 2).

Si/SiO₂ 웨이퍼 상의 폴리 1의 PSAMs의 XPS로 측정된 원소 조성

기질	원소 조성(%)
	C1s	N1s	O1s	Si2p
폴리 1의 PSAM	22.7	1.21	33.38	42.71

이중 기능성 표면(생반응성/생불활성)으로서의 pSAMs의 작동성을 조사하기 위하여, 소프트 리소그래픽 기술, 마이크로접촉 프린팅(μCP)¹²을 이용하여 생체분자의 마이크로패턴을 제조하였다(도 4). 우선, 50 x 50 ㎛ 원형 패턴을 가지는 포지티브 PDMS 스탬프를 이용하여 폴리 1의 pSAMs 상에 아민-말단 바이오틴 잉크(바이오틴-NH₂, 10 mM in 에탄올)를 접촉-프린팅 하였다. 단백질의 아민기는 pSAMs의 반응성 NAS에 쉽게 반응하기 때문에, 스탬프를 제거한 이후의 바이오틴-패턴화 pSAMs를 보레이트 완충액(pH 8.5)에 1시간 동안 함침시켜 표면 상의 비반응성 NAS를 가수분해 시킨 다음, 이어 TRITC-표지 스트렙타비딘 용액 (0.1 mg/mL PBS 완충액, pH 7.4)과 반응시켰다. 도 4는 TRITC-표지 스트렙타비딘의 패턴에 대한 형광 이미지이다. 기대한 대로, 스트렙타비딘은 바이오틴-작용기성 부위에만 결합하였으며, 이 결과는 스트렙타비딘과 바이오틴 사이의 특이적 상호작용을 보여주는 것이다. 흥미롭게도, 바이오틴 없이 단지 가수분해된 중합체 막이 존재하는 부위에서는 스트렙타비딘의 비특이적 흡착이 검출되지 않았으며, 이는 시그널-대-노이즈의 높은 콘트라스트를 초래한다.

보다 작은 PDMS 스탬프(원형 패턴을 가지는 25 ㎛ x 25 ㎛)를 사용한 경우, 비슷한 결과를 얻을 수 있었다. PEG의 백프린팅¹³ 또는 우혈청 알부민(BSA)의 프리코팅¹⁴이, 표면 상에 단백질의 비특이적 흡착을 최소화 하기 위하여 필요로 하지만, 본 발명의 중합체 시스템은 공중합체에 이미 PEG 그룹이 있기 때문에 이러한 추가적인 공정이 필요 없다.

pSAMs의 가수분해 형태의 단백질-저항성을 조사하기 위하여¹⁵, BSA를 모델 혈장 단백질로 이용하여 단백질 흡착 정도를 평가하였다. Si/SiO₂ 웨이퍼 상의 pSAMs의 가수분해 형태를 BSA 용액 (0.1 mg/mL in PBS 완충액, pH 7.4)에 1시간 처리한 다음, 세척하고 공기-건조시켰다. 표 3은 BSA 흡착 전/후에 엘립소메트리로 측정된 폴리 1-3의 pSAMs의 두께에 대한 데이터이다.

우혈청 알부민 흡착 전 및 후의 Si/SiO₂ 웨이퍼 상의 pSAM의 대조군(비변형) 및 가수분해물의 두께

항목	대조군	폴리 1	폴리 2	폴리 3
두께(Å) (전)	얻을 수 없음 (not available)	10.6 ± 0.6	11.5 ± 0.6	11.9 ± 0.6
두께(Å) (후)	44.7 ± 0.1	11.5 ± 0.1	11.6 ± 0.1	11.6 ± 0.1

BSA 흡착 후의 pSAMs의 두께는 초기 두께와 거의 동일하였다. 그러나, 대조군으로서의 실리콘 웨이퍼의 두께는 상당하게 증가하였다. X-선 광전자 스펙트로스포프에 의해 측정된 pSAMs 및 대조군(비변형 Si/SiO₂ 웨이퍼) 상의 고해상능 질소(1s)에 대한 분석 결과에 따르면, 대조군과 비교하여 pSAMs는 dir 3%의 BSQ 흡착 (97% 저항성)을 나타내었다. 이 결과는, NSA-가수분해된 pSAMs가 비특이적 단백질 흡착에 대하여 높은 저항성을 나타낸다는 것을 명확하게 보여주는 것이다. 상술한 모든 데이터에 따르면, 특이적으로 그리고 비특이적 흡착이 거의 없이 목적의 생체분자는 폴리(TMSMA-r-PEGMA-r-NAS)의 pSAMs 상에 고정화 될 수 있다는 것을 알 수 있다.

표면에 고정화된 생체분자들 사이의 스페이싱이 타겟 분자와의 상호작용에 영향을 미치기 때문에, 바이오칩의 최적화를 위하여 표면 상에 생반응성기의 밀도를 조절하는 것은 매우 중요하다¹⁶. 따라서, 생반응성기 (NAS)의 상이한 몰 비율을 가지는 일련의 폴리(TMSMA-r-PEGMA-r-NAS) 공중합체[폴리 1(35%), 폴리 2(21%) 및 폴리 3(12%)]를 이용하여 스페이싱 효과를 조사하였다. 도 5는, 상술한 마이크로접촉 프린팅의 방법과 동일하게 제조된 pSAM 상의 TRITC-표지 스트렙타비딘의 패턴에 대한 형광 현미경 사진이다. 스트렙타비딘은 각각의 pSAM에 효과적으로 고정화되어 표면 상의 생반응성기의 밀도에 따라 상이한 형광 세기를 가지면서 높은 시그널-대-노이즈 비율을 가지는 마이크로패턴을 제공하였다. 보다 명확한 비교를 위하여, 각각의 pSAM의 사진에 있는 원형 부위의 상대적 시그널 세기에 대한 데이터를 얻었고, 이는 표 4에 정리되어 있다.

항목	폴리 1	폴리 2	폴리 3
평균 형광 세기	231.77 ± 15.04	156.67 ± 45.82	99.01 ± 57

35%의 NAS 함량을 가지는 폴리 1은 232± 15 a.u의 형광세기를 나타내었고, 폴리 2 및 폴리 3는 각각 157 ± 46 및 99 ± 57로서 보다 낮은 세기를 나타내었다. 중합체의 pSAMs 상에 NAS 함량이 증가 할수록, 고정화된 스트렙타비딘이 점진적으로 증가하였다. 이 결과는, 각각의 단량체의 초기 피딩 비율을 변화시켜 생반응성 부위의 간단한 밀도 조절을 할 수 있는 본 발명 공중합체 시스템의 또 다른 장점을 보여주는 것이며, 이는 바이오칩의 최적화에서 유용하다.

한편, 합성된 본 발명의 양극성 중합체의 화학구조는 다음과 같다:

양극성 중합체의 화학 구조

각각의 중합체는 2:2:2의 몰 피딩 비율로 하여 해당되는 3가지 단량체로부터 라디칼 중합반응으로 합성하였다. 폴리-4에서는 도데실, 폴리-5에서는 플루오로알킬 및 폴리-6에서는 벤질이 플라스틱 표면에 대한 앵커링 그룹으로 선택되었으며, 폴리-4는 소수성 상호작용, 폴리-6는 소수성 상호작용과 다이폴 상호작용, 그리고 폴리-6은 π-π 스태킹 상호작용에 의해 폴리스틸렌 플라스틱 표면에 앵커링 된다. 모든 3가지 중합체는 물에 대하여 용해도가 우수하였고, 이는 PEG 그룹에 의한 것으로 판단된다.

플라스틱 표면의 젖음성(wettability)을 측정하기 위하여 실온에서 정적 물 접촉각 분석기로 폴리-4 및 폴리-6이 코팅된 플라스틱 표면을 분석하였다(표 5).

분석 항목	대조군	폴리 4	폴리 6
정적 CA(˚)	130 ± 7	74 ± 1	79 ± 2

양친성 중합체로 1시간 동안 코팅함으로써 폴리-4 및 폴리-6의 물 접촉각은 130±7°로부터 74±1° 및 79±2°로 상당히 감소하였다. 접촉각의 상당한 감소는, 공중합체 내의 친수성 PEG가 증감함에 따라 플라스틱 표면이 보다 친수성으로 변화되었음을 나타내는 것이다.

중합체 코팅된 플라스틱 표면이 기능성 표면으로 이용될 수 있는지를 평가하기 위하여, 마이크로-접촉 프린팅 방식으로 생분자의 마이크로패턴을 제조하였다. 도 7은 TRITC-표지 스트렙타비딘의 패턴에 대한 형광현미경 이미지이다. 결과적으로, 스트렙타비딘은 각각의 중합체 코팅 플라스틱 표면에 효율적으로 고정화 되어 높는 시그널-to-노이즈 비율로 마이크로패턴을 형성하였으며, 이 경우 각각의 중합체의 앵커링 위치(폴리-4 도데실기, 폴리-6 벤질기)에 따라 다른 형광세기를 나타내었다.

폴리-4 및 폴리-6을 보다 정확히 비교하기 위하여, 각각의 중합체 코팅된 플라스틱 표면의 이미지에서 원 부위의 상대적 시그널 세기를 측정하였다(표 6).

중합체	폴리 4	폴리 6
형광 세기	149.9 ± 24.4	179.7 ± 34.3

도데실기를 갖는 폴리-4의 경우 149.9 ± 24.4 a.u.의 형광세기를 나타내었고, 폴리-6은 179.7 ± 34.4 a.u.의 형광세기를 나타내었다. 폴리-4는 앵커링 위치로서 알킬 체인을 가지고 있어 소수성 상호작용과 반데르발스 상호작용을 통하여 플라스틱 표면에 결합된다. 한편, 폴리-6은 벤질기의 방향족 고리를 가지고 있어, 소수성 상호작용과 반데르발스 상호작용뿐만 아니라 π-π 스태킹 상호작용을 통하여 플라스틱 표면에 강하게 결합한다. 바이오틴이 없고 가수분해된 중합체 표면만 있는 부위에서 백그라운드 시그널이 거의 관찰되지 않았으며, 이는 높은 시그널-to-노이즈 비율을 초래한다. 종래기술에 따르면, PEG의 백프린팅 또는 우혈청 알부민(BSA)의 프리코팅 단계는, 표면 상에 단백질의 비특이적 흡착을 최소화시키기 위하여 필수적으로 실시한다. 그러나, 본 발명의 중합체 표면은 이러한 단계를 필요로 하지 않는다.

폴리 4-6에 대하여 항바이오파울링을 분석하였다. 폴리 4-6이 코팅된 폴리스틸렌 기질을 BSA 용액 (0.25 mg/mL in PBS, pH 7.4)에 2시간 함침시켰다. pSAMs 상에 비특이적 단백질 흡착의 정도를 고해상능 N(1s) XPS 스펙트럼으로부터 얻었다(도 6). 도 6에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 중합체가 코팅된 폴리스틸렌 기질에 대하여 대조군과 비교하여 약 1%의 BSA 흡착 정도(즉, 99% 저항성)를 나타내었다.

이어, 본 발명의 중합체를 이용하여 96-웰 플레이트를 표면 처리하고, ELISA를 실시하였다(도 8a). 본 발명의 중합체가 코팅된 스트렙타비딘 플레이트와 구입한 시중의 스트렙타비딘 플레이트를 비교하였다. 구입한 스트렙타비딘 플레이트의 경우에는 블록킹 완충액인 밀크 단백질 용액 100 ㎕를 2시간 동안 처리하였다. 그러나, 본 발명의 중합체가 코팅된 스트렙타비딘 플레이트는 이러한 과정이 필요 없었으며, 이는 PEG기가 단백질의 비특이적 결합을 차단시키기 때문이다. 도 8b는 바이오틴-IgG의 농도에 따른 흡광 곡선을 나타낸다. 중합체 코팅된 스트렙타비딘 플레이트는 동일 농도에서 종래의 스트렙타비딘 플레이트보다 보다 강한 세기를 나타내었다. 이러한 결과는, 본 발명의 중합체가 코팅된 스트렙타비딘 플레이트가 동일 농도에서 종래의 플레이트보다 바이오틴-IgG를 잘 캡처링 한다는 것을 보여 주는 것이다. 본 발명의 중합체 시스템의 경우 블록킹 완충액을 처리하지 않았음에도 불구하고, 바이오틴-IgG의 0 ng/ml 농도에서 대조군과 유사한 세기를 나타내었으며, 이는 PEG 부분에 의한 것이다.

중합체 코팅된 플라스틱 표면 상의 단백질 A를 이용하여 항체의 고정화를 실시하였다. 단백질 A는 많은 면역분석에서 항체를 고정화 하는 데 이용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 부위에 특이적으로 결합하여 항체의 배향성을 제공한다. 단백질 A-매개 항체 고정화는 항체의 변형을 요구하지 않는다. 따라서, 종래의 공유결합 또는 물리적 흡착과 같은 항체 고정화 방법와 비교하여 본 발명은 매우 우수한 항체 검출 방법을 제공한다. 도 9a는 중합체 코팅된 플라스틱 표면 상의 단백질 A를 이용하여 항-BSA 항체의 고정화에 대한 모식도이고, 도 9b는 FITC-표지 BSA의 형광현미경 이미지이다. 예상한 바와 같이, FITC-표지 BSA는 항-BSA 기능화 부위에만 침적되었고, 이는 이들 사이의 특이적 상호작용을 나타낸다. 항-BSA 항체 없이 단지 가수분해된 중합체층만이 존재하는 부위에서는, BSA의 비특이적 흡착이 관찰되지 않았다는 것은 매우 주목할 만한 결과이며, 이에 의해 높은 시그널-to-노이즈 비율이 초래된다. 각각의 중합체 코팅된 플라스틱 표면의 이미지에서 원형 이미지의 상대적 시그널 세기를 측정하였다. 도데실기를 갖는 폴리-4는 98.7 ± 15 a.u.의 형광세기를 나타내었고, 폴리-6은 42.6 ± 6.9 a.u.의 형광세기를 나타내었다. 따라서 본 발명의 중합체 시스템은 플라스틱 표면에 단백질 A를 이용한 항체 고정화의 배양성에 매우 유리하며, 이는 단백질 칩 개발에 이용될 수 있다.

결론적으로, 본 발명은 신규한 PEG 공중합체를 이용하여 중합체성 자가-조립 단일막(pSAMs)을 형성시킴으로써, SiO₂-계 및 플라스틱 기질 상에 이중 기능성 표면(생반응성 및 생불활성)을 쉽게 제조할 수 있다는 것을 보여준다. 생체분자는 높은 특이성으로 pSAMs상에 효과적으로 고정화될 뿐만 아니라, 최소화된 비특이적 흡착을 나타낸다. 또한, 중합체 합성에서 초기 피딩 비율을 간단하게 조절함으로써, 생반응성 및 항바이오파울링 작용기성의 밀도를 조절할 수 있다. 종합적으로, 본 발명의 이중 기능성 pSAMs 플랫폼은 바이오센서 및 바이오칩 분야에서 우수한 응용성을 갖는다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조 문헌

(1) Leonard, E. F.; Turitto, V. T.; Vroman, L. Blood in Contact with Natural and Artificial Surfaces; New York Academy of Sciences: New York, 1987; Vol. 516.

(1) (a) Niemeyer, C. M.; Blohm, D. Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 2865. (b) Pirrung, M. C. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 1276. (c) Templin, M. F.; Stoll, D.; Schrenk, M.; Traub, P. C.; Vohringer, C. F.; Joos, T. O. Trends Biotechnol. 2002, 20, 160. (d) Zhu, H.; Snyder, M. Curr. Opin. Chem. Biol. 2001, 5, 40. (e) Mitchell, P. Nat. Biotechnol. 2002, 20, 225.

(2) (a) Khademhosseini, A.; Yeh, J.; Eng, G.; Karp, J.; Kaji, H.; Borenstein, J.; Farokhzad, D. C.; Langer, R. Lab Chip. 2005, 12, 1380. (b) Peterbauer, T.; Heitz, J.; Olbrich, M.; Hering, S. Lab Chip., 2006, 6, 857.

(3) (a) Mann, M.; Wilm, M. S. Anal. Chem., 1994, 66, 4390. (b) Yates, J. R.; Speicher, S.; Griffin, P. R.; Hunkapiller, T. Anal. Biochem., 1993, 214, 397. (c) MacBeath, G.; Schreiber, S. L. Science, 2000, 289, 1760. (d) Schweitzer, B.; Roberts, S.; Grimwade, B.; Shao, W.; Velleca, M.; Kingsmore, S. F. Nat. Biotechnol. 2002, 20, 359.

(4) (a) Houseman, B. T.; Huh, J. H.; Kron, S. J.; Mrksich, M. Nat. Biotechnol. 2002, 20, 270. (b) Funeriu, D. P.; Eppinger, J.; Denizot, L.; Miyake, M.; Miyake, J. Nat Biotechnol. 2005, 23, 622. (c) Kingsmore, S. F. Nat. Rev. Drug Discov. 2006, 5, 310.

(5) (a) Sieber, S. A.; Cravatt, B. F. Chem. Commun. 2006, 14, 2311. (b) Zhu, H.; Hu, S.; Jona, G.; Zhu, X.; Kreiswirth, N.; Willey, B. M.; Mazzulli, T.; Liu, G.; Song, Q.; Chen, P.; Cameron, M.; Tyler, A.; Wang, J. Wen,J.; Chen, W.; Compton, S.; Snyder, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 2006, 103, 4011. (c) Chen, C. S.; Zhu, H. Biotechniques. 2006, 40, 423.

(6) (a) Sauer, U.; Preininger, C.; Krumpel, G.; Stelzer, N.; Kern, W. Sens Actuators B Chem. 2005, 107, 178. (b) Schweitzer, B.; Kingsmore, S. F. Curr. Opin. Biotechnol. 2002, 13, 14. (c) Sun, J.; Zhang, H.; Tian, R.; Ma, D.; Bao, X.; Su, D. S.; Hanfa, Z. Chem. Commun. 2006, 12, 1322.

(7) (a) Lorenz, C. D. Chandross, M. Grest, G. S. Stevens, M. J. Webb, E. B. Langmuir 2005, 21, 11744. (b) Killampalli, A. S. Ma, P. F.; Engstrom, J. R. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6300.

(8) (a) Sun, F.; Castner, D. G.; Mao, G.; Wang, W.; Mckeown, P.; Grainger, D. W. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 1856. (b) Xia, N.; HuD, Y.; Grainger, W.; Castner, D. G. Langmuir, 2002, 18, 3255. (c) Bearinger, J. P.; Terrettaz, S.; Michel, R.; Tirelli, N.; Vogel, H.; Textor, M.; Hubbell, J. A. Nat. Mater. 2003, 2, 259.

(9) (a) Srinivasan, U.; Houston, N. R.; Howe, T. R.; Maboudian, R. J Microelectromech. Syst. 1998, 7, 252. (b) Cave, N. G.; Kinlock, A. J. Polymer, 1992, 33, 162. (c) Dishner, M. H.; Feher, F. J.; Hemminger, J. C. J. Am. Chem. Soc. 1996, 7, 1971.

(10) (a) Jon, S.; Seong, J.; Khademhosseini, A.; Tran, T. T.; Laibinis, P. E.; Langer, R. Langmuir, 2003, 19, 9989. (b) Park, S.; Chi, Y. S.; Choi, I. S.; Seong, J.; Jon, S. J. Nanosci. Nanotechnol. 2006, 6, 1.

(11) Lee, B. S.; Park, S.; Lee, K.-B.; Jon, S.; Choi, I. S. XXX submitted.

(12) (a) Duffy, D. C.; Mcdonald, J. C.; Schueller, O. J. A.; Whitesides, G. M. Anal. Chem. 1998, 70, 2974. (b) Kane, R. S.; Takayama, S.; Ostuni, E.; Ingber, D. E.; Whitesides, G. M. Biomaterials 1999, 20, 2363; K.B. Lee, D.J. Kim, Z. Lee and I.S. Choi, Langmuir 2004, 20, 2531. (c) Park, T. J.; Lee, K. B.; Lee, S. J.; Lee, Z.; Lee, S. Y.; Choi, I. S. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 10512.

(13) Whitesides, G. M.; Ostuni, E.; Takayama, S.; Jiang, X.; Ingber, D. E. Annu. Rev. Biomed. Eng. 2001, 3, 335. (b) Zhu, X. Y.; Jun, Y.; Starrup, D. R.; Major, R. C.; Danielson, S.; Boiadjiev, V.; Gladfelter, W. L.; Bunker, B. C.; Guo, A. Langmuir 2001, 17, 7798.

(14) (a) Sethuraman, A.; Han, M.; Kane, R. S.; Belfort, G. Langmuir 2004, 20, 7779. (b) Kim, N.; Lee, S.; Kim, K. Chem. Commun. 2003, 6, 724.

(15) (a) Rundqvist, J.; Hoh, J. H.; Haviland, D. B. Langmuir 2005, 21, 2981. (b) Wirth, M.J.; Fairbank, R. W.; Fatunmbi, H. O. Science 1997, 275, 44. (b) Zhou, C.; Khlestkin, V. K.; Braeken, D. Keersmaecker, D.; Laurevn, W.; Engelborghs, Y.; Borghs, G. Langmuir 2005, 21, 5988.

(16) (a) Eppinger, J.; Funeriu, D. P.; Miyake, M.; Denizot, L.; Miyake, J. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 3806. (b) Kodadek, T. Chem. Biol. 2001, 8, 105. (c) Zhu, H.; Bilgin, M.; Bangham, R.; Hall, D.; Casamayor, A.; Bertone, P.; Lan, N.; Jansen, R.; Bidlingmaier, S.; Houfek, T. Mitchell, T.; Miller, P.; Dean, R. A.; Gerstein, M.; Snyder, M. Science 2001, 293, 2101.

도 1은 항바이오파울링 특성을 갖는 본 발명의 자가-조립 중합체 단일막(PSAM) 상에 생체분자를 특이적으로 고정화 하는 것을 보여주는 도면이다.

도 2는 본 발명의 폴리 1, 폴리 2 및 폴리 3에 대한 ¹H NMR 스펙트럼이다.

도 3은 Si/SiO₂ 웨이퍼 상에 형성된 폴리 1의 PSAM에 대한 고해상능 C(1s) X-선 광전자 스펙트럼이다.

도 4는 (a) 50 x 50 ㎛ 및 (b) 25 x 25 ㎛ 원형 패턴화 스탬프를 이용하여 폴리 1의 PSAMs 상에 바이오틴-EO-아민의 마이크로접촉 프린팅을 하여 제조된 TRITC-표지 스트렙타비딘 패턴에 대한 형광 현미경 사진이다.

도 5는 50 x 50 ㎛ 원형 패턴화 스탬프를 이용하여 제조된 폴리 1-3의 PSAMs 상에 형성된 TRITC-표지 스트렙타비딘 패턴에 대한 형광 현미경 사진이다

도 6은 폴리스틸렌 기질 상에 형성된 폴리 4-6의 PSAM에 대한 고해상능 N(1s) X-선 광전자 스펙트럼이다.

도 7은 50 x 50 ㎛ 원형 패턴화 스탬프를 이용하여 중합체 코팅된 플라스틱 표면 상에 바이오틴-아민의 마이크로접촉 프린팅에 의해 형성된 TRITC-표지 스트렙타비딘 패턴에 대한 형광 현미경 이미지이다.

도 8a는 바이오틴-결합 마우스 항-토끼 IgG를 검출하기 위하여 이용되는 본 발명의 중합체에 의하여 스트렙타비딘 코팅된 96 웰 플레이트에 대한 모식도이다.

도 8b는 흡착 캡처링된 바이오틴화 마우스 IgG의 EILSA 검출 결과이다. 고 정화된 바이오틴화 마우스 IgG를 HRP 결합 항-마우스 IgG로 검출 하였다.

도 9a는 중합체 코팅된 플라스틱 표면 상에 단백질 A를 이용한 항-BSA 항체의 배향에 대한 모식도이다.

도 9b는 50 x 50 ㎛ 원형 패턴화 스탬프를 이용하여 중합체 코팅된 플라스틱 표면 상에 단백질 A의 마이크로접촉 프린팅 및 항-BSA 항체의 첨가에 의해 형성된 FITC-표지 BSA 패턴에 대한 형광 현미경 이미지이다.

Claims (22)

1. 다음의 단계를 포함하는 표면상에 중합체 막이 코팅되어 있고 항-바이오파울링 특성을 나타내며 공유결합을 형성할 수 있는 반응기를 포함하는 고상 기질의 제조방법:

   (a) (ⅰ) 상기 고상 기질의 표면에 결합되는 표면-앵커링 부위를 포함하는 중합체의 제1단량체, (ⅱ) 항-바이오파울링 특성을 나타내는 중합체가 결합된 제2단량체, 및 (ⅲ) 공유결합을 형성할 수 있는 반응기를 포함하는 제3단량체를 반응시켜 표면-앵커 부위, 단백질-저항성 부위 및 반응성 부위를 포함하는 중합체를 생성하는 단계; 및

   (b) 상기 중합체를 상기 고상 기질의 표면에 코팅하는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 제1단량체는 메타크릴레이트계 또는 아크릴레이트계 단량체이고, 제1단량체에 있는 표면-앵커링 부위는 치환 또는 비치환된 실란기, 치환 또는 비치환된 알킬기 또는 치환 또는 비치환된 아릴기인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 치환된 실란기는 알콕시기로 치환된 실란기인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 2 항에 있어서, 상기 알킬기는 C_{6 -30} 알킬기인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 2 항에 있어서, 상기 치환된 알킬기는 F, Cl 또는 Br로 치환된 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 제2단량체는 메타크릴레이트계 또는 아크릴레이트계 단량체이고, 제2단량체에 있는 항-바이오파울링 특성을 나타내는 중합체는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 제3단량체는 메타크릴레이트계 또는 아크릴레이트계 단량체이고, 제3단량체에 있는 반응기는 카르복실기인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 카르복실기는 석시너마이드, 석시너미딜 에스테르, 설포-석시너미딜 에스테르, 2,3,5,6-테트라플루오로페놀 에스테르, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페놀 에스테르, 알데하이드, 산무수화물, 아자이드, 아졸리드, 카보이마이드, 에폭사이드, 에스테르, 글리시딜 에테르, 할라이드, 이미다졸 또는 이미데이트에 의해 활성화 되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 중합체는 다음 화학식 1로 나타내는 것을 특징으로 하는 방법:

   화학식 1

   

   상기 화학식에서, R₁은 실릴알킬기, (알콕시실릴)알킬기, (하이드록시실릴)알킬기, 치환 또는 비치환된 알킬기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기, 또는 치환 또는 비치환된 알카릴기이고; R₂는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리페닐렌 옥사이드, PEG와 폴리알킬렌 옥사이드 의 공중합체, 폴리(메톡시에틸 메타크릴에이트), 폴리(메타크릴로일 포스파티딜콜린), 과불화된 폴리에테르, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈이며; R₃는 알데하이드, 에폭시, 할로알킬, 1차아민, 티올, 말레이미드, 에스테르, 카르복실기 또는 히드록실기이며; R₄, R₅ 및 R₆는 서로 독립적으로, H 또는 C₁-C₅ 알킬기이며; X, Y 및 Z는 서로 독립적으로 산소, 황 또는 질소 원자이고; l, m 및 n은 서로 독립적으로 1-10,000의 정수이다.
10. 제 10 항에 있어서, 상기 중합체는 고상 기질 상에 자가-조립 단일막(self assembled monolayer) 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c) 상기 고상 기질에 코팅된 중합체 막의 제3단량체로부터 유래된 반응기에 화학물질, 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드 또는 당을 공유결합시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 다음의 단량체의 중합반응에 의해 형성된 중합체가 코팅되어 있고, 표면-앵 커링, 항-바이오파울링 및 반응성 부위를 포함하는 이중 기능성 고상 기질: (ⅰ) 상기 고상 기질의 표면에 결합되는 표면-앵커링 부위를 포함하는 제1단량체, (ⅱ) 항-바이오파울링 특성을 나타내는 중합체가 결합된 제2단량체, 및 (ⅲ) 공유결합을 형성할 수 있는 반응기를 포함하는 제3단량체.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 제1단량체는 메타크릴레이트계 또는 아크릴레이트계 단량체이고, 제1단량체에 있는 표면-앵커링 부위는 치환 또는 비치환된 실란기, 치환 또는 비치환된 알킬기 또는 치환 또는 비치환된 아릴기인 것을 특징으로 하는 고상 기질.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 알킬기는 C_{6 -30} 알킬기인 것을 특징으로 하는 고상 기질.
15. 제 13 항에 있어서, 상기 치환된 알킬기는 F, Cl 또는 Br로 치환된 것을 특징으로 하는 고상 기질.
16. 제 12 항에 있어서, 상기 제2단량체는 메타크릴레이트계 또는 아크릴레이트계 단량체이고, 제2단량체에 있는 항-바이오파울링 특성을 나타내는 중합체는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈인 것을 특징으로 하는 고상 기질.
17. 제 12 항에 있어서, 상기 제3단량체는 메타크릴레이트계 또는 아크릴레이트계 단량체이고, 제3단량체에 있는 반응기는 카르복실기인 것을 특징으로 하는 고상 기질.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 카르복실기는 석시너마이드, 석시너미딜 에스테르, 설포-석시니미딜 에스테르, 2,3,5,6-테트라플루오로페놀 에스테르, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페놀 에스테르, 알데하이드, 산무수화물, 아자이드, 아졸리드, 카보이마이드, 에폭사이드, 에스테르, 글리시딜 에테르, 할라이드, 이미다졸 또는 이미데이트에 의해 활성화 되어 있는 것을 특징으로 하는 고상 기질.
19. 제 12 항에 있어서, 상기 반응성 부위는 화학물질, 단백질, 펩타이드, 뉴클 레오타이드 또는 당이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 고상 기질.
20. 제 12 항에 있어서, 상기 중합체는 다음 화학식 1로 나타내는 것을 특징으로 하는 고상 기질:

    화학식 1

    

    상기 화학식에서, R₁은 실릴알킬기, (알콕시실릴)알킬기, (하이드록시실릴)알킬기, 치환 또는 비치환된 알킬기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기, 또는 치환 또는 비치환된 알카릴기이고; R₂는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리페닐렌 옥사이드, PEG와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체, 폴리(메톡시에틸 메타크릴에이트), 폴리(메타크릴로일 포스파티딜콜린), 과불화된 폴리에테르, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈이며; R₃는 알데하이드, 에폭시, 할로알킬, 1차아민, 티올, 말레이미드, 에스테르, 카르복실기 또는 히드록실기이며; R₄, R₅ 및 R₆는 서로 독립적으로, H 또는 C₁-C₅ 알킬기이며; X, Y 및 Z는 서로 독립적으로 산소, 황 또는 질소 원자이고; l, m 및 n은 서로 독립적으로 1-10,000의 정수이다.
21. 상기 제 12 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항의 고상 기질을 포함하는 바이오칩 또는 바이오센서.
22. 다음 화학식 1로 표시되는 중합체:

    화학식 1

    

    상기 화학식에서, R₁은 실릴알킬기, (알콕시실릴)알킬기, (하이드록시실릴)알킬기, 치환 또는 비치환된 알킬기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기, 또는 치환 또는 비치환된 알카릴기이고; R₂는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리페닐렌 옥사이드, PEG와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체, 폴리(메톡시에틸 메타크릴에이트), 폴리(메타크릴로일 포스파티딜콜 린), 과불화된 폴리에테르, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈이며; R₃는 알데하이드, 에폭시, 할로알킬, 1차아민, 티올, 말레이미드, 에스테르, 카르복실기 또는 히드록실기이며; R₄, R₅ 및 R₆는 서로 독립적으로, H 또는 C₁-C₅ 알킬기이며; X, Y 및 Z는 서로 독립적으로 산소, 황 또는 질소 원자이고; l, m 및 n은 서로 독립적으로 1-10,000의 정수이다.

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