KR20090023055A - 인산 단백질의 분획·분리 방법 및 키트 - Google Patents

인산 단백질의 분획·분리 방법 및 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR20090023055A
KR20090023055A KR1020080057308A KR20080057308A KR20090023055A KR 20090023055 A KR20090023055 A KR 20090023055A KR 1020080057308 A KR1020080057308 A KR 1020080057308A KR 20080057308 A KR20080057308 A KR 20080057308A KR 20090023055 A KR20090023055 A KR 20090023055A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
phosphate
ions
salts
group
Prior art date
Application number
KR1020080057308A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101579946B1 (ko
Inventor
김동수
나형진
장재호
김혜경
박모열
Original Assignee
(주)디씨디
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)디씨디 filed Critical (주)디씨디
Publication of KR20090023055A publication Critical patent/KR20090023055A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101579946B1 publication Critical patent/KR101579946B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C07K1/32—Extraction; Separation; Purification by precipitation as complexes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 발명은 인산 단백질의 분획·분리 방법 및 키트를 개시한다.
구체적으로 본 발명은, 인산 단백질의 분획·분리에 있어서, 인산 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 칼슘 이온, 바륨 이온, 코발트 이온 및 몰리브덴 이온과 이들 결합체를 침전시킬 수 있는 침전제로서 설페이트(sulfate)의 염, 시트레이트(citrate)의 염, 비카보네이트(bicarbonate)의 염 및 카보네이트(carbonate)를 사용함을 특징으로 한다.
인산 단백질, 분리, 분획, 키트

Description

인산 단백질의 분획·분리 방법 및 키트 {Method and Kit for Isolating and Fractioning Phosphoproteins}
본 발명은 인산 단백질의 분획·분리 방법 및 키트에 관한 것이다.
생체 유전 정보의 기능 조절 및 질병과 같은 비정상적인 신체의 기능 변화에 는 단백질의 발현 변화뿐만이 아니라, 단백질의 정상적인 또는 비정상적인 분자 변형(post-translational modification)이 관여하는 것으로 알려져 있다.
따라서 단백질의 인산화에 관여하는 효소의 기능을 제어함으로써 궁극적으로 관련 질병을 치료할 수 있는 신약을 개발하고자 하는 노력이 있어 왔으며, 대표적인 것이 암 치료제인 글리벡이다.
단백질의 인산화가 관련된 질병에 대한 신약의 디자인·개발을 위해서는 인산화된 단백질을 세포 또는 생체 조직으로부터 연구에 필요한 만큼의 충분한 양으로 분획·분리할 수 있어야 한다.
본 발명은 세포 또는 생체 조직으로부터 인산 단백질을 분획·분리할 수 있 는 방법을 제공한다.
본 발명의 목적은 인산 단백질을 효율적으로 분획할 수 있는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 인산 단백질을 효율적으로 분리할 수 있는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 인산 단백질을 효율적으로 분획할 수 있는 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 인산 단백질을 효율적으로 분리할 수 있는 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 기타의 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시된다.
일 측면에 있어서, 본 발명은 인산 단백질의 분획 방법에 관한 것이다.
본 발명의 인산 단백질의 분획 방법은 (a) 세포 또는 조직에 용해 용액(lysis solution)를 첨가하여 세포 또는 조직을 용해(lysis)시켜 세포 또는 조직의 파쇄액(용해액)을 얻는 단계, (b) 이 세포 또는 조직의 파쇄액에 칼슘 이온, 바륨 이온, 코발트 이온 및 몰리브덴 이온으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 금 속 이온을 넣어 그 금속 이온과 상기 세포 또는 조직의 파쇄물 중의 인산 단백질을 결합시키는 단계, (c) 상기 결합체를, 설페이트(sulfate)의 염, 시트레이트(citrate)의 염, 비카보네이트(bicarbonate)의 염, 및 카보네이트(carbonate)의 염으로 구성된 군에서 선택된 침전제로 침전시키는 단계, 및 (d) 그 침전물을 분리하는 단계를 포함하여 구성된다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 인산 단백질의 분리 방법에 관한 것으로, 본 발명의 인산 단백질의 분리 방법은 (a) 세포 또는 조직에 용해 용액(lysis solution)를 첨가하여 세포 또는 조직을 용해(lysis)시켜 세포 또는 조직의 파쇄액을 얻는 단계, (b) 이 세포 또는 조직의 파쇄액에 칼슘 이온, 바륨 이온, 코발트 이온 및 몰리브덴 이온으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 금속 이온을 넣어 그 금속 이온과 상기 세포 또는 조직의 파쇄액 중의 인산 단백질을 결합시키는 단계, (c) 상기 결합체를, 설페이트(sulfate)의 염, 시트레이트(citrate)의 염, 비카보네이트(bicarbonate)의 염, 및 카보네이트(carbonate)의 염으로 구성된 군에서 선택된 침전제로 침전시키는 단계, (d) 그 침전물을 분리하는 단계 및 (e) 그 침전된 금속 이온과 인산 단백질의 결합체로부터 금속 이온을 제거하는 단계를 포함하여 구성된다.
본 발명의 인산 단백질의 분획·분리 방법은 인산 단백질에 결합하는 칼슘 이온, 바륨 이온, 코발트 이온 및 몰리브덴 이온을 사용한다는 점과 이 결합체를 침전시킬 있는 염 화합물 즉 설페이트(sulfate)의 염, 시트레이트(citrate)의 염, 비카보네이트(bicarbonate)의 염, 및/또는 카보네이트(carbonate)의 염을 사용한다 는 점을 특징으로 한다.
상기 열거된 금속 이온을 세포 또는 조직의 파쇄액 중의 인산 단백질과 결합시키고 이 결합체에 상기 열거된 염 화합물을 사용하여 침전시킴으로서, 인산 단백질의 분획·분리가 용이하고 가능하게 된다.
상기에서, 세포 또는 조직은 인산 단백질을 포함하는 모든 유형의 세포 또는 조직으로서, 특히 세포는 박테리아 등의 원핵 세포, 및 효모, 동물, 식물, 사람 등에서 분리된 진핵 세포를 포함하는 의미이며, 조직은 동물, 식물 등으로부터 분리된 조직, 사람으로부터 분리된 조직을 포함하는 의미이다. 바람직하게는 사람 또는 포유동물로부터 분리된 세포 또는 조직이다.
또 상기에서 용해 용액은 그 구체적인 구성 성분을 불문하고 단백질 분획·분리의 용도에 적합하게 세포 또는 조직을 용해시킬 수 있는 것이라면 어떠한 것이든 사용될 수 있다. 당업자는 그의 통상의 능력 범위내에서 이러한 용해 용액을 제조하여 사용하거나 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있다.
그러한 용해 용액는 라이소자임(lysozyme), 계면 활성제(예, NP-40(nonyl phenoxylpolyethoxylethanol), TritonX-100(polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether), CHAPS(3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-1-propanesulfonate) 등), 단백질 변성제(DTT(Dithiothreitol), TBP(Tributyl phosphate), 우레아(Urea), 씨오우레아(Thiourea) 등) 등을 포함할 수 있으고, 본 발명이 인산 단백질의 분획·분리를 위한 것이란 점에서, 단백질 분해 효소 저해제(benzamidine, AEBSF(4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride), Aprotinin, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), Bestatin, Leupeptin, PMSF(phenylmethanesulphonylfluoride) 등) 및/또는 포스파타아제 저해제( Na3VO4, NaF 등) 등을 포함할 수 있으며, 필요에 따라 버퍼로서 제조될 경우에는 완충 작용을 갖게하는 약염기/약산, pH 조절 인자 등 버퍼에 통상 포함되는 성분((HEPES(4-2-hydroxyethyl-1-piperazineethanesulfonic acid), TES(2-{[tris(hydroxymethyl)methyl]amino}ethanesulfonic acid), MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid), Tris-HCl, ampholyte, PBS, NaCl 등)을 포함할 수 있다.
또 상기에서 세포 또는 조직의 용해는 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예컨대 초음파 처리, 균질기의 사용, 유리 마쇄기의 사용, 삼투압의 이용, 효소(lysozyme)의 이용, 계면 활성제(예, NP-40, TritonX-100, CHAPS, SDS 등)의 이용, 반복적인 동결과 해동, 또는 이들을 조합한 방법 등이 그러한 방법이다.
세포 또는 조직의 파쇄 후에는 인산 단백질의 분리 효율을 높이기 위해서 원심 분리 등의 방법을 통하여 불용성 물질을 제거하고 그 결과 얻어지는 상등액을 이용하는 것이 바람직하다.
또 상기에서 세포 또는 조직을 파쇄한 후에, 상기 (b) 단계의 공정을 바로 적용할 수도 있으나, 인산 단백질의 분획·분리 효율을 높이기 위해서 단백질의 변성을 유도할 필요가 있다.
단백질이 인산화되었을 때 인산기는 그것이 가지는 음전하 때문에 양전하를 띤 아미노산과 상호작용을 일으켜 단백질의 3차원 구조 또는 4차원 구조를 변화시 킴으로써, 인산기가 단백질의 외부로 노출되지 않는 경우가 대부분이다. 따라서 단백질이 3차원 구조 또는 4차원 구조를 이루는 공유(S-S 결합) 및/또는 비공유 결합을 파괴시켜 단백질이 변성을 유도함으로써 인산기를 외부로 노출시키면 인산 단백질의 분획·분리 효율이 높아 질 수 있다.
일반적으로 단백질의 변성은 불용성 또는 가용성(solubilization)의 방향으로 진행된다. 예컨대 에탄올을 포함한 알콜, 산, 다수의 염류, 반추동물의 위액에 있는 레닌(응유 효소)은 단백질을 응고시켜 불용성의 단백질로 만드는 변성제이다. 반면, S-S 공유결합을 파괴하는 DTT, TBP, Tris(carboxyethy)phosphine 등이나 비공유결합을 파괴하는 우레아, 씨오우레아, 그리고 Triton X-100, CHAPS, NP-40 등의 계면활성제 등의 경우는 가용성의 단백질을 만드는 변성제이다.
본 발명에 적합한 단백질 변성제는 단백질을 가용성으로 만드는 상기 예시한 바의 변성제들이다. 당업자는 그의 통상의 능력 범위 내에서 상기 예시된 것 이외에도 공지된 단백질 변성제 중에서 본 발명에 적합한 단백질 변성제를 선택할 수 있다.
세포 또는 조직의 파쇄액을 얻고 필요에 따라 단백질을 변성시킨 후에는, 칼슘 이온, 바륨 이온, 코발트 이온 및/또는 몰리브덴 이온을 첨가하여 세포 또는 조직의 파쇄액 중의 인산 단백질과 결합시키게 된다.
본 발명자들은 아래의 실시예에서는 게시되어 있지 않지만, 예비 실험을 통하여 상기 금속 이온을 포함한 여러 금속 이온에 대해서 아래의 <실시예 1>과 동일한 방법으로 표준 인산 단백질 즉 베타카제인(β-casein), 알파카제인(α-casein), 오발부민(ovalbumin) 및 펩신(pepsin)에 대한 결합 여부를 스크리닝한 바 있다.
그 결과 여러 금속 이온 중에서 상기 열거된 네 가지 금속 이온만이 인산 단백질에 대한 결합 능력을 나타내었고, 특히 칼슘 이온과 바륨 이온의 결합 능력이 가장 높았다. 따라서 아래의 실시예에서 칼슘 이온과 바륨 이온만을 사용하였다 하더라도 본 발명의 범위가 이들 금속 이온으로 한정·해석되어서는 아니 된다.
상기 열거된 금속 이온을 인산 단백질과 결합시키기 전에, 바람직하게는 상기 열거된 금속 이온이 인산 단백질과 효율적으로 결합하기 위해서, 소디움 아세테이트(sodium acetate) 등의 아세테이트의 염, 아세트산, 염화나트륨(NaCl) 등 해리되어 음이온을 띨 수 있는 화합물이나 염을 세포 또는 조직의 파쇄액에 첨가하는 것이 바람직하다.
양전하를 띠고 있는 금속 이온은 일반적으로 이온결합에 의해서 음전하를 가지는 여러 단백질과 비특이적인 결합 능력을 가지고 있다. 따라서 상기 열거된 칼슘 이온, 바륨 이온, 코발트 이온 및/또는 몰리브덴 이온과 결합할 수 있는 화합물, 즉 음이온을 띨 수 있는 화합물을 경쟁적 저해자(competitive inhibitor)로 사용함으로써 상기 열거된 칼슘 이온, 바륨 이온, 코발트 이온 및/또는 몰리브덴 이온이 단백질과 비특이적인 결합을 하는 것을 방지할 수 있다.
상기 열거된 칼슘 이온, 바륨 이온, 코발트 이온 및/또는 몰리브덴 이온이 단백질과 비특이적인 결합을 하는 것을 방지하게 되면, 결과적으로 상기 금속 이온들이 인산 단백질과 더 효율적으로 결합할 수 있을 것이며, 결국 인산 단백질의 분획·분리 효율을 높일 수 있을 것이다.
바람직한 측면에서 본다면, 아세테이트의 염이나 아세트산을 사용하는 경우이다. 단백질은 카르복실 그룹에 의해서 음전하를 띠는 경우가 많을 것이고 양전하를 띠는 금속 이온은 이러한 카르복실 그룹과 결합할 것이어서, 카르복실 그룹을 가지는 아세테이트나 아세트산이 경쟁적 저해자로서 더 효과적일 것이기 때문이다.
칼슘 이온, 바륨 이온, 코발트 이온 및/또는 몰리브덴 이온을 세포 또는 조직의 파쇄액 중의 인산 단백질과 결합시킨 후에는 이 결합체에 설페이트의 염, 시트레이트의 염, 비카보네이트의 염 및/또는 카보네이트의 염을 사용하여 금속 이온-인산 단백질의 결합체를 침전시킬 수 있다.
아래의 실시예에서 개시되어 있지 않지만, 본 발명자들은 여러 염 화합물을 사용하여 아래의 <실시예 1>과 동일한 방식으로 금속 이온-인산 단백질 결합체를 침전시킬 수 있는가를 스크리닝 하였는데, 그 결과 상기 열거된 화합물만이 금속 이온-인산 단백질 결합체를 침전시킬 수 있는 능력을 가지고 있었으며, 특히 하기 실시예에서 사용된 비카보네이트의 염이 가장 뛰어난 결합 능력을 가지고 있었다.
바람직한 측면에 있어서, 침전제로서 소듐(sodium)과 암모늄(ammoniium)이 설페이트, 시트레이트, 비카보네이트 및 카보네이트와 결합된 염을 사용하는 경우이며, 가장 바람직한 측면에 있어서는 소듐 비카보네이트와 암모늄 비카보네이트를 사용하는 경우이다.
상기 침전제를 사용하여 금속 이온-인산 단백질의 결합체를 침전시킨 후에는 원심 분리 방법 등 당업계에 알려진 공지의 방법을 사용하여 그 침전물을 분리할 수 있다.
침전물의 분리 후에는 금속 이온-인산 단백질의 결합체에 EDTA 또는 EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid)를 처리하거나 pH 4.0 이하의 조건을 만들어 줌으로써 금속 이온-인산 단백질의 결합체로부터 금속 이온을 제거해 낼 수 있다. 여기서도 본 발명자들은 예비 실험에서 여러 화합물을 사용하고 또 여러 조건을 만들어줬지만 상기 화합물만이 그리고 상기 조건에서만이 금속 이온-인산 단백질의 결합체에서 금속 이온을 제거할 수 있었다.
금속 이온이 제거된 인산 단백질은 증류수, 에탄올, 클로로포름, 아세톤, 메탄올, 이들의 혼합 용매 등 적당한 용매를 사용하여 분별 침전시킴으로써 인산 단백질을 순수하게 분리해낼 수 있게 된다.
본 발명의 인산 단백질의 분획·분리 방법은 표준 인산 단백질에 대해서는 비 인산 단백질에 비해 87% 이상의 순도로 인산 단백질을 분획·분리하는 효율을 가지고 있었으며, 전체 인산 단백질에 대해서는 93% 이상의 분획·분리 효율을 가지고 있었다.
본 발명의 인산 단백질의 분획·분리 방법은 미량으로 존재하여 검출이 용이하지 않은 인산 단백질을 고농축 상태로 분획·분리하는 것을 가능하게 한다. 아래의 실시예에서, 효모 추출물의 대부분의 인산 단백질들이 인산 단백질 분획에서 염색되어 확인되었으며, 이중 일부는 질량 분석기의 분석에서도 인산 단백질로 확인되었다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 인산 단백질의 분획 키트에 관한 것이다. 본 발명의 인산 단백질의 분획 키트는 (a) 세포 또는 조직의 용해 용액, (b) 세포 또는 조직의 파쇄액 중의 인산 단백질과 결합할 수 있는 칼슘 이온, 바륨 이온, 코발트 이온 및 몰리브덴 이온으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 금속 이온, (c) 상기 금속 이온과 인산 단백질의 결합체를 침전시킬 수 있는 설페이트(sulfate)의 염, 시트레이트(citrate)의 염, 비카보네이트(bicarbonate)의 염, 및 카보네이트(carbonate)의 염으로 구성된 군에서 선택된 침전제 및 (d) 그 침전물을 분리하기 위한 수단을 포함하여 구성된다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 인산 단백질의 분리 키트에 관한 것으로, 본 발명의 인산 단백질의 분리 키트는 (a) 세포 또는 조직의 용해 용액, (b) 세포 또는 조직의 파쇄액 중의 인산 단백질과 결합할 수 있는 칼슘 이온, 바륨 이온, 코발트 이온 및 몰리브덴 이온으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 금속 이온, (c) 상기 금속 이온과 인산 단백질의 결합체를 침전시킬 수 있는 설페이트(sulfate)의 염, 시트레이트(citrate)의 염, 비카보네이트(bicarbonate)의 염, 및 카보네이트(carbonate)의 염으로 구성된 군에서 선택된 침전제, (d) 그 침전물을 분리하기 위한 수단, 및 (e) 그 침전된 금속 이온과 인산 단백질의 결합체로부터 금속 이온을 제거할 수 있는 수단을 포함하여 구성된다.
본 발명의 인산 단백질의 분획·분리 키트에 있어서, 각 구성요소의 의미, 각 구성 요소의 기능 및 각 구성요소 사이의 작용과 관련하여서는 본 발명의 인산 단백질의 분획·분리 방법과 관련하여 전술한 바의 설명이 그대로 유효하다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 인산 단백질 발현량의 변화와 관련된 질병의 진단 키트에 관한 것이다.
많은 질병들에서 단백질 키나제(단백질 인산화 효소)의 활성이나 발현 정도가 변함으로써 인산 단백질의 발현량이 변화(증가 또는 감소)하는 것으로 알려져 있다. 예컨대 대표적으로 DNA가 손상되었을 때 인산화되어 활성화 되는 종양 억제 유전자(Tumor suppressor gene)인 p53은 p21 유전자의 발현을 유도하는데, p21 단백질은 세포분열 주기 중 S-단계(S-phase)를 유도하는 싸이클린 의존성 키나제(cyclin dependent kinase; CDK) 에 결합하여 그 CDK 활성을 저해함으로써 Rb (Retinoblastoma)의 인산화를 막아 암 발생을 억제 시키는 것으로 알려져 있다.( E.D. Israels at al, The Oncologist, Vol. 5, 6, pp. 510-513, 2000; David Lane. Nature , 414, 1 , 2001).
또한 PKB(protein kinase B)는 난소 암, 췌장암 등 여러 종류의 암에서 과발현되는 것으로 알려져 있으며,(Cheng, J. Q. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 89, pp. 9267-9271, 1992; Cheng, J. Q. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 93, pp. 3636-3641, 1996), PKCK-2'는 항암제에 의한 암세포 사멸 과정을 억제하는데 관여하는 것으로 알려져 있다(Kim, K . H et al. , EMBO JOURNAL, 24, pp. : 3532-3542, 2005).
또한 EGF(Epidermal Growth Factor) 수용체 티로신 키나제는 폐암, 유방암 등 상피조직에 생기는 암의 발생과 관련된 것으로 알려져 있으며(Morin, M. Oncogene, 19, pp 6574-6583, 2000), ROCK(Rho-associated, coiled-coil-containing protein kinase)는 고혈압, 발기 부전, 녹내장, 염증, 동맥경화증, 면역 억제, 혈관 재협착, 천식, 심장 비대 등의 여러 질병들과 관련된 것으로 알려져 있다(Ishizaki, T. et al. , EMBOJ., 15, pp. 1885-1893, 1996; Chitaley, et al., Curr. Hypertens. Rep. 2001 Apr., 3 (2), pp.139-144; Uehata, M. et al., Nature, 389, pp. 990-994, 1997, Chitaley, K. et al. , Nature Medicine, 7, pp. 119-122, 2001; Uchida, S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 269 (2), pp. 633-40, 2000; Bito, H. et al., Neuron, 26, pp. 431-441, 2000; Takamura, M. et al., Hepatology, 33, pp. 577-581, 2001; Genda, T. et al., Hepatology, 30, pp. 1027-1036, 1999; Rao, et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 42, pp. 1029-37, 2001; Ishizuka, T. et al., J. Immunol., 167, pp. 2298-2304, 2001; (Smim okawa, et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 11, pp. 2351-2358, 2000; Lou, Z. et al., J.Immunol., 167, pp. 5749-5757, 2001; Seaholtz, et al., Circ. Res., 84, pp. 1186-1193, 1999; Yoshii, et al., Am.J. Respir. Cell Mol. Biol., 20, pp. 1190-1200, 1999; Kuwahara, K. et al. , FEBS Lett., 452, pp. 314-318, 1999).
따라서 인산 단백질의 발현량 변화와 관련된 질병에 있어서는 정상 세포/조직의 인산 단백질 발현량과 병리적 증상을 가진 기관의 세포/조직의 인산 단백질의 발현량을 정성적·정량적으로 비교함으로써 질병의 유무를 진단할 수 있다.
실제 하기 실시예에서도 페암 세포주, 페암 조직, 신장암 조직 및 난소암 조직에서 정상 세포/조직에 비해 뚜렷하게 인산 단백질의 발현량이 높은 것으로 확인이 되었다.
본 발명의 인산 단백질 발현량의 변화와 관련된 인산 단백질의 진단 키트는 (a) 세포 또는 조직의 용해 용액, (b) 세포 또는 조직의 파쇄액 중의 인산 단백질과 결합할 수 있는 칼슘 이온, 바륨 이온, 코발트 이온 및 몰리브덴 이온으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 금속 이온, (c) 상기 금속 이온과 인산 단백질의 결합체를 침전시킬 수 있는 설페이트(sulfate)의 염, 시트레이트(citrate)의 염, 비카보네이트(bicarbonate)의 염, 및 카보네이트(carbonate)의 염으로 구성된 군에서 선택된 침전제, (d) 그 침전물을 분리하기 위한 수단, (e) 그 침전된 금속 이온과 인산 단백질의 결합체로부터 금속 이온을 제거할 수 있는 수단, 및 (f) 인산 단백질을 정성적·정량적으로 확인할 수 있는 수단을 포함하여 구성된다.
상기 본 발명의 진단 키트에서 (a) 내지 (e)의 구성요소에 대해서는 전술한 바의 설명이 그대로 유효하다.
상기 본 발명의 진단 키트에서 (f)의 구성 요소의 바람직한 예로서는 인산 단백질을 특이적으로 염색할 수 있는 시약이다. 이러한 시약은 당업자가 제조하여 사용하거나 시중에 유통되는 것을 구입하여 사용될 수 있다. 시중에 유통되는 것으로서는 예컨대 하기 실시예에 사용된 ProQ Diamond Phosphoprotein Gel Stain(Invitrogen) 그리고 GelCode Phosphoprotein detection kit (Pierce) 등을 들 수 있다.
본 발명의 진단 키트는 인산 단백질의 정성적·정량적 확인으로부터 질병 유무를 교시하는 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 그럴 경우 일반인의 경우도 의학적 전문가의 도움 없이 본 발명의 진단 키트를 사용하여 직접 질병 유무를 판단할 수 있게 된다.
본 발명의 진단 키트는 통상은 사람에게 적용될 것이나 포유동물에도 적용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 인산 단백질을 효율적으로 분획·분리할 수 있는 방법 및 키트를 제공할 수 있다. 또한 본 발명은 인산 단백질 발현량의 증가와 관련된 질병의 진단 키트를 제공할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 표준 인산 단백질의 분획
금속 이온은 칼슘 이온 또는 바륨 이온을 사용하고, 침전제로서는 암모늄비카보네이트(ammonium bicarbonate) 또는 소듐비카보네이트(sodium bicarbonate)을 사용하였다.
표준 인산 단백질은 베타카제인(β-casein), 알파카제인(α-casein), 오발부민(ovalbumin), 펩신(pepsin)을 사용하였고, 인산 단백질의 대조군으로는 비 인산 단백질로 알려져 있는 소 혈장 알부민(BSA)을 사용하였다. 상기 표준 인산 단백질 및 BSA는 각각 0.025mg/ml의 농도로 요소용액(8M urea, 50mM Tris-HCl pH 7.5) 1ml에 녹였다. 이 용액에 1M의 소듐 아세테이트 용액 10ul 또는 20ul를 첨가해 최종 농도가 10mM 또는 20mM이 되게 하였다. 이 단백질 용액에 1M의 칼슘이온(1M CaCl2) 또는 1M 바륨이온 (1M BaCl2)를 40ul 또는 80ul를 첨가해 각각의 농도가 40mM이 되게 한 후 20분 동안 교반하여 잘 혼합하였다. 이어 암모늄비카보네이트(ammonium bicarbonate) 또는 소듐비카보네이트(sodium bicarbonate)를 첨가하여 인산 단백질과 금속 이온의 결합체의 침전을 유도하였다. 즉 암모늄비카보네이트 또는 소듐비카보네이트는 1M 용액을 20ul 또는 40ul씩 첨가해 최종농도가 20mM 또는 40mM되게 한 후 20분 교반하여 혼합하면서 침전을 유도하였다. 침전된 침전물은 12,000xg에서 원심분리하여 상등액과 침전물로 분리하고, 침전물을 취하였다. 침전물에서 금속이온과 침전제를 제거하기 위하여 침전물에 0.25M EDTA를 첨가하고 교반하여 침전물이 반투명의 용액상태로 전환될 때까지 반응시켰다. 이 용액에 에탄올을 550ul, 클로로포름을 150ul첨가하고 5분간 추가적으로 교반하였다. 여기에 증류수를 500ul 첨가하고 5분간 교반한 뒤 12,000Xg에서 5분간 원심분리하였다. 이때 중간층에 형성된 단백질 침전물을 회수하고 에탄올 1ml로 두번 세척한 후 공기 중에서 건조시켜 침전물에서 인산단백질만의 분획을 얻었다.
다음 상기 상등액과 분리된 인산단백질 분획을 전기영동(SDS-PAGE)용 완충용액(Sigma)에 녹여 SDS-PAGE 키트(Hoeffer)에 로딩하여 120V에서 90분 동안 전개하고 전기영동 단백질의 염색시약인 CBB(Sigma) 또는 인산단백질에 특이적인 염색시약인 ProQ Diamond(Invitrogen)로 염색 시약 제공회사의 매뉴얼에 따라 염색하여 <도 1>에 나타내었다. 그리고 염색 후의 형광검출에 의한 단백질 검출은 형광검출장비인 Diversity( SYNGENE)로 Cy3파장 범위에서 4초간 검출하여 이미지화 하였다.
<도 1>를 참조하여 보면, 인산 단백질 분획에서 상기 실험에 사용된 표준 인산 단백질을 확인할 수 있다.
<실시예 2> 인산 단백질 분획능력 시험
인산 단백질의 분획능력에 관해, 분획의 인산 단백질 특이성, 선택성, 수율에 관한 성능을 시험하기 위해 표준 인산 단백질을 대상으로 인산 단백질 분획을 수행하였다. 여기서도 상기 <실시예 1>과 같이 금속 이온은 바륨 이온을 사용하고, 침전제로는 암모늄비카보네이트 또는 소듐비카보네이트를 사용하였으며, 비특이적인 결합의 예방 또는 제거의 목적으로 소듐아세테이트(sodium acetate)를 사용하였다. 대체적인 실험 방법은 상기 <실시예 1>과 거의 유사하다.
구체적으로는 다음과 같다.
표준 인산 단백질은 베타카제인(β-casein), 알파카제인(α-casein),오발부민(ovalbumin), 펩신(pepsin)을 사용하였다. 인산 단백질의 대조군으로는 비 인산 단백질로 알려져 있는 소 혈장 알부민(BSA)을 사용하였다. 표준 인산 단백질 및 BSA는 각각 0.025mg/ml의 농도로 요소 용액(8M urea, 50mM Tris-HCl pH 7.5) 1ml에 녹였다. 이 용액에 1M의 소듐아세테이트 용액 10ul 또는 20ul를 첨가해 최종 농도가 10mM 또는 20mM이 되게 하였다. 이 단백질 용액에 1M의 바륨이온 (1M BaCl2) 40ul를 첨가해 농도가 40mM이 되게 한 후 20분 동안 교반하여 잘 혼합하였다. 이어 침전제인 암모늄비카보네이트 또는 소듐비카보네이트는 1M 용액을 20ul 첨가해 최종농도가 20mM되게 한후 20분 교반하여 혼합하면서 침전을 유도하였다. 침전된 침전물은 12,000xg에서 원심분리하여 상등액과 침전물로 분리하고, 침전물에 대해서 는 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 처리하여 그 침전물로부터 금속이온과 침전제를 제거하여 인산단백질만의 분획을 얻었다. 다음 상등액과 인산단백질 분획을 전기영동(SDS-PAGE)용 완충용액(Sigma)에 녹여 SDS-PAGE 키트(Hoeffer)에 로딩하여 120V에서 90분 동안 전개하고 전기영동 단백질의 염색 시약인 CBB(Sigma)로 염색하여 <도 2>에 나타내었다. 염색 후의 형광검출에 의한 단백질 검출은 상기 <실시예 1>과 동일한 장비를 사용하여 동일한 방식으로 이미지화 하였다.
그리고 분획 5를 증류수로 연속희석(serial dilution)하여 전기영동하고 그 결과물을 분획 6과 함께 <도 3>에 나타내었으며, 분획 6을 증류수로 연속희석(serial dilution)하여 전기영동하고 그 결과물을 분획 5와 함께 <도 4>에 나타내었다.
<도 2>에서는, 침전물 즉 인산 단백질 분획에서 상기 실험에 사용된 표준인산 단백질을 확인할 수 있으며, <도 3>에서는 분획 6에서 잔존하는 BSA의 양이 대략 분획 5의 BSA 양의 약 1/16 정도임을 확인할 수 있으며, <도 4>에서는 분획 6에 존재하는 단백질이 분획 5에 잔존하는 인산 단백질에 비해 약 8 배지 32배 많음을 알 수 있다.
<실시예 3> 효모 추출물에서 인산 단백질의 분획
초저온 냉동고(-80℃) 에 보관되어 있던 효모(Saccharomyces cerevisiae)세포 600mg을 이차원전기영동용 단백질 추출용액(7M urea , 2M Thiourea, 4%(w/v) 3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS), 1%(w/v) dithiothreitol(DTT), 2%(v/v) pharmalyte, 1mM benzamidine) 1ml에 용해시키고 초 음파 분쇄기(HD2200, BANDELIN SONOPULSE)를 이용하여 30초씩 4회 반복하여 세포를 분쇄하였다. 분쇄된 효모 추출물은 12,000xg에서 30분간 원심분리하고 불용성 물질을 제거한 후 인산 단백질 분획에 이용하였다. 추출된 단백질 용액은 요소용액(8M urea, 50mM Tris-HCl pH 7.5) 1ml에 녹여 최종 단백질 농도가 0.5mg/ml이 되도록 하였다. 여기에 1M 바륨 이온(1M BaCl2) 80ul를 첨가하여 농도가 80mM이 되게 한 후 교반기에서 잘 혼합하면서 20분 동안 반응시켰다. 이어서 1M 암모늄 비카보네이트 60ul 또는 80ul를 첨가해 최종농도가 약 60mM 또는 80mM이 되게 하고 20분간 추가적으로 교반하여 혼합해서 인산단백질의 침전을 유도하였다. 침전된 침전물은 12,000xg에서 원심분리하여 상등액과 침전물을 분리하고 침전물에 대해서는 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 처리하여 그 침전물로부터 금속이온과 침전제를 제거하여 인산단백질 분획만을 얻었다. 다음 상등액과 인산단백질 분획을 전기영동(SDS-PAGE)용 완충용액(Sigma)에 녹여 SDS-PAGE 키트(Hoeffer)에 로딩하여 120V에서 90분 동안 전개하고 전기영동 단백질의 염색시약인 CBB(Sigma)와 인산단백질에 특이적인 염색 시약인 ProQ Diamond(Invitrogen)로 염색하였다. 염색 후의 형광검출에 의한 단백질 검출은 상기 <실시예 1>과 동일한 장비를 사용하여 동일한 방식으로 이미지화 하였다.
결과를 <도 5>에 나타내었다. <도 5>를 참조하여 보면 인산 단백질이 적절히 분획되었음을 알 수 있다.
한편, 분획 전 총 단백질(상기에서 분쇄된 효모추출물을 12,000xg에서 30분 간 원심분리하고 불용성 물질을 제거한 후 효모 단백질의 총 추출물)과 분획 후의 인산단백질에 대해서 이차원 전기영동을 실시하였다.
먼저 상기 분획 전 총 단백질과 분획 후의 인산단백질을 이차원전기영동용 단백질 추출용액(7M urea , 2M Thiourea, 4%(w/v) 3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS), 1%(w/v) dithiothreitol(DTT), 2%(v/v) pharmalyte, 1mM benzamidine) 120ul에 용해시켰다. 일차 Isoelectric focusing(IEF)를 위하여 IPG strips은 7M urea, 2M thiourea, 2% 3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS), 1% dithiothreitol(DTT), 1% pharmalyte로 구성된 재수화(reswelling) 용액으로 상온에서 12-16시간 정도 재수화되었다. Strip은 IPG 방식의 (주) 제노마인(대한민국, 포항)에서 제작한 8.5cm strip(pH4~10)을 사용하였다. Strip 당 시료는 각각 300ug씩을 정량하여 사용하였으며, Amersham Biosciences 사의 Multiphore II system을 이용하여 제조회사의 사용 메뉴얼을 준수하여 20℃에서 IEF를 수행하였다. IEF 조건은 150V에서 3,500V까지의 도달시간을 3시간 되게 하였으며, 3,500V에서 12시간 지속되도록 하여 최종적으로 96kVh 가 되도록 설정하였다.
이차적으로 SDS-PAGE를 수행하기 전에 IPG Strips을 1% DTT를 함유한 평형용 용액(equilibration buffer,50mM Tris-Cl, pH6.8, 6M urea, 2% SDS, 30% glycerol)으로 10분간 incubation 하였으며, 곧바로 2.5% iodoacetamide를 함유한 또다른 평형용 용액으로 10분간 더 incubation 하였다. 평형이 완료된 strips을 SDS-PAGE gels(20x24cm, 10-16% 젤 농도구배) 위에 배열시키고, Hoefer DALT 2D system(Amersham Biosciences)을 이용하여 20℃에서 최종적으로 1.7kVh가 되게 전개하였다.
전기영동으로 전개된 젤은 전기영동 단백질의 염색 시약인 CBB 및 인산단백질에 특이적인 염색 시약인 ProQ Diamond(Invitrogen)로 염색을 실시하였으며, 방법은 염색 시약 제공회사의 매뉴얼에 따랐다. 염색 후의 형광검출에 의한 단백질 검출은 상기 <실시예 1>과 동일한 장비를 사용하여 동일한 방식으로 이미지화 하였다.
결과를 <도 6>에 나타내었다.
<도 6>을 참조하여 보면 인산 단백질이 적절히 분획되었음을 알 수 있다.
<실시예 4> 폐암 세포주에서 인산단백질의 분획
초저온 냉동고(-80℃) 에 보관되어 있던 폐암 세포주(h460) 300mg을 이차원전기영동용 단백질 추출용액(7M urea , 2M Thiourea, 4%(w/v) 3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS), 1%(w/v) dithiothreitol(DTT), 2%(v/v) pharmalyte, 1mM benzamidine) 1ml에 용해시키고 초음파 분쇄기(HD2200, BANDELIN SONOPULSE)를 이용하여 30초씩 3회 반복하여 세포를 분쇄하였다. 분쇄된 폐암 세포주 추출물은 12,000xg에서 30분간 원심분리하고 불용성 물질을 제거한 후 인산단백질 분획에 이용하였다. 추출된 단백질 용액은 8M 요소(urea)용액으로 희석하여 최종 단백질 농도가 1mg/ml이 되도록 하여 3ml의 용액이 되도록 하였다. 여기에 1M Tris-HCl pH7.5 를 첨가하여 최종농도가 50mM이 되게 하고 여기에, 1M BaCl2 240ul를 첨가하고 교반기에서 잘 혼합하면서 20분 동안 반응 시켰다. 이어서 1M 암모늄 비카보네이트를 360ul 첨가하고 20분간 추가적으로 교반하여 혼합해서 인산단백질의 침전을 유도하였다. 침전된 침전물은 12,000xg에서 원심분리하여 상등액을 제거하고 침전물만을 취하였다. 그 침전물에 대해서는 상기 <실시예 1>과 동일한 방식으로 그 침전물로부터 금속이온과 침전제를 제거하고 인산단백질 분획을 얻었다.
분획 전 총 단백질과 분획 후의 인산단백질에 대해서 상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 2차원 전기영동을 실시하고 이미지화하여 <도 7>에 나타내었다.
<도 7>을 참조하여 보면 인산단백질이 적절히 분획되었음을 알 수 있다.
<실시예 5> 폐암 조직에서 인산 단백질의 분획
초저온 냉동고(-80℃) 에 보관되어 있던 각각의 폐암 조직 400mg을 이차원전기영동용 단백질 추출용액(7M urea , 2M Thiourea, 4%(w/v) 3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS), 1%(w/v) dithiothreitol(DTT), 2%(v/v) pharmalyte, 1mM benzamidine) 0.5ml에 용해시키고 전기모터를 이용한 분쇄기로 조직을 파쇄시킨 후, 초음파 분쇄기(HD2200, BANDELIN SONOPULSE)를 이용하여 30초씩 3회 반복하여 세포를 분쇄하였다. 분쇄된 폐암 조직 추출물은 12,000xg에서 30분간 원심분리하고 불용성 물질을 제거한 후 인산단백질 분획에 이용하였다. 추출된 단백질 용액은 8M 요소(urea)용액으로 희석하여 최종 단백질 농도가 0.7mg/ml이 되도록 하여 3ml의 용액이 되도록 하였다. 여기에 1M Tris-HCl pH7.5 를 첨가하여 최종농도가 50mM이되게 하고 여기에, 1M BaCl2 240ul를 첨가하고 교반기에서 잘 혼합하면서 20분 동안 반응 시켰다. 이어서 1M 암모늄 비카보네이트를 360ul 첨가하고 20분간 추가적으로 교반하여 혼합해서 인산단백질의 침전을 유도하였다. 침전된 침전물은 12,000xg에서 원심분리하여 상등액을 제거하고 침전물만을 취하였다. 그 침전물에 대해서는 상기 <실시예 1>과 동일한 방식으로 그 침전물로부터 금속이온과 침전제를 제거하고 인산단백질 분획을 얻었다.
분획 전 총 단백질과 분획 후의 인산단백질에 대해서 상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 2차원 전기영동을 실시하고 이미지화하여 <도 8>에 나타내었다.
<도 8>을 참조하여 보면 정상 폐암 조직에서보다 폐암 조직에서 많은 단백질이, 큰 정도로 인산화 되어 있음을 볼 수 있고 이를 통하여 정상조직과 암조직에서 차별적으로 인산화가 이루어지는 것을 확인할 수 있다.
<실시예 6> 신장암 조직에서 인산 단백질의 분획
초저온 냉동고(-80℃) 에 보관되어 있던 정상 신장 조직과 신장암 조직 각각 400mg으로부터 <실시예 5>와 동일한 방법으로 인산단백질 분획, 2차원전기영동을 실시화고 이미지화하여 <도 9>에 나타내었다.
<도 9>를 참조하여 보면, <도 8>의 결과와 비슷하게 정상 신장 조직에서보다 신장암 조직에서 많은 단백질들이 인산화되었음을 알 수 있다.
<실시예 7> 난소암 조직에서 인산 단백질의 분획
초저온 냉동고(-80℃) 에 보관되어 있던 정상 난소조직과 난소암 조직 각각 400mg으로부터 <실시예 5>와 동일한 방법으로 인산단백질 분획, 2차원전기영동을 실시화고 이미지화하여 <도 10>에 나타내었다.
<도 10>을 참조하여 보면, <도 8>의 결과와 비슷하게 정상 신장 조직에서보다 신장암 조직에서 많은 단백질들이 인산화되었음을 알 수 있다.
<실시예 8> 폐암 인산 단백질 분획의 탈인산화
분리된 인산단백질을 단백질의 인산기를 가수분해하여 탈인산시키는 λPPase처리에 의해 탈인산시키고 인산 단백질 특이적 염색을 시킨 결과를 해석함으로 분획이 인산단백질 분획임을 확인 하기 위해 다음과 같은 실험을 진행하였다.
<실시예 5>에서 2차원 전기영동에 사용했던 폐암 인산 단백질 용액10㎕를 0.1% SDS 용액으로 10배 희석하였다. λPPase의 반응에 최적의 조건을 만들기 위해, 10 x 반응 용액을 1/10 부피로 첨가해 최종 50mM Tris-HCl pH7.5, 0.1mM EDTA, 5mM DTT, 0.01% BRIJ 35이 되게 하였다. 여기에 λPPase를 20unit가하고 최종적으로 MnCl2를 0.1mM되게 처리해 반응을 시작하였다. 반응은 30℃에서 밤샘처리하고 그 결과물을 1차원 SDS PAGE를 수행한 후 <실시예1>에서와 같이 ProQ 염색을 진행하였다. 그 결과 이미지를 <도 11>에 나타내었다.
<도 11>의 결과는 <실시예 5>에서 얻어진 것이 인산 단백질 분획임을 분명히 보여준다.
<실시예 9> 효모 유래 인산단백질 스팟에 대한 단백질 동정 및 인산단백질의 확인
<실시예 9-1> 효모 유래 인산단백질 스팟에 대한 단백질 동정
<실시예 3>의 단백질 spot 3405(<도 6> 참조)에 대해 Shevchenko 등의 방법(Anal. chem. 1996, 68:850-858)에 따라 다음과 같이 modified porcine trypsin을 이용하여 작은 단편으로 효소적으로 분해되었다.　
먼저 단백질 spot 3405의 젤을 오려내었다. 오려낸 젤 조각으로부터 SDS, 유기용매, 염색 시약 등의 불순물을 제거하기 위하여 50% acetonitrile로 세척하였다. 그 다음 단백질을 분해하기 위해 젤 조각에 단백질 분해 용액(8-10ng/㎕의 trypsin, trypsin digestion buffer: ACN 5%, NH4HCO3 5%, DW 90%) 5㎕/spot)를 가하고 8-10 시간 동안 37℃에서 재수화시켜 단백질을 분해시킨 후, 0.5% trifluoroacetic acid 5㎕를 첨가하여 단백질 분해 반응을 종결시켰다. Trypsin에 의해 잘려진 단백질 단편들을 수용액 상태로 회수하고, C18ZipTips(Millipore, USA)을 이용하여 1-5㎕ 부피로 탈염 및 농축시켰다. 이 농축액을 동량의 매트리스 용액(50% aqueous acetonitrile에 포화된 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)과 혼합하고 질량 분석에 사용하였다.질량분석기는 Ettan MALDI-TOF(Amersham Biosciences)를 사용하였다. Target plate 상에 적하되어 있는 단백질 단편들은 337nm의 N2 laser 조사에 의해 기화된 다음, 20Kv injection pulse에 의해 가속되었다. 300 laser shots의 누적 peaks에 의해 각각의 단백질 spot에 대한 mass spectrum을 구하였다. Mass spectrum의 분석을 위해서 trypsin의 자가분해에 의해 생성된 펩타이드의 ion peak m/z(842.510, 2211.1046)를 표준 peaks로 이용하였다. 분석이 완료된 mass spectrum으로부터 단백질 동정을 위하여 Rockefeller 대학에서 개발한 ProFound 검색엔진(http://129.85.19.192/profound_bin/ WebProFound.exe)을 이용하였다.
그 결과 <도 12>에 도시된 바와 같이 Gene Bank Accesion No. NP-010199.1인 단백질로 확인되었다.
<실시예 9-2> 효모 유래 단백질의 인산단백질 확인
상기 <실시예 9-1>의 얻어진 단백질 단편 즉 인산펩티드를 농축하였다. 인산펩티트 농축은 1.5ml 또는 0.5ml micro centrifuge tube에서 진행하였으며, 인산펩티드 농축시약 Phos-PepTM(제노마인. 한국)을 사용하여 수행하였다. 인산단백질의 펩티드 혼합물 10ul에 Phos-PepTM의 주소재 용액(A용액) 5ul를 첨가하고 수초 정도 교반기로 혼합 후 5분동안 상온에 방치했다. Phos-PepTM의 부소재 용액(B 용액) 5ul를 이어서 첨가하고 수초동안 교반기로 혼합 후 상온에서 20~30분 동안 방치했다. 이때 흰색 침전물이 현탁액 상태로 형성되며, 20~30분 경과하는 동안 이 침전물은 투명한 크리스탈 형태로 변환되어 반응용기의 내벽면에 침착이 되거나 침전의 형태로 존재하게 된다. 침전물은 250mM의 ammonium acetate 50~100ul를 첨가해 수초간 교반 해서 침전물을 세척한 후 세척액을 피펫을 이용해 제거했다.
이렇게 농축된 인산펩티드 침점물은 1% 인산용액 10ul로 용해하여 수용액 상태로 회수되었고, C18ZipTips(Millipore)을 이용하여 1-5㎕ 부피로 탈염 및 농축되었다. 이 농축액은 동량의 50% aqueous acetonitrile에 포화된 α-cyano-4- hydroxycinnamic acid와 혼합되었고, 질량분석을 위하여target plate 위에 적하되었다. 질량분석기는 Ettan MALDI-TOF (Amersham Biosciences)를 사용하였다. Target plate 상에 적하되어 있는 단백질 단편들은 337nm의 N2 laser 조사에 의해 기화된 다음, 20Kv injection pulse에 의해 가속되었다. 펩티드 mass분석은 positive reflectron mode로 진행했으며, 300 laser shots의 누적 peaks에 의해 각각의 단백질 spot에 대한 mass spectrum을 구하였다. Mass spectrum의 분석을 위해서 trypsin의 자가분해에 의해 생성된 펩타이드의ion peak m/z(842.510, 2211.1046)를 표준 peaks로 이용하였다.
Phosphoserine 또는 Phosphothreonine이 포함된 인산펩티드의 확인은 MALDI-TOF의 low energy source에 의한 fragmentation mode인 PSD(post source decay) mode에서 인산 펩티드의 인산기가 β-elimination 반응으로 유리되어 positive mode에서 98Da 또는 80Da의 분자량이 탈인산된 펩티드가 형성되는지의 여부를 mass측정의 결과로부터 해석했다. Phosphotyrosine이 포함된 인산펩티드의 확인은　β-elimination으로 유리되지 않는 특성으로 인산 펩티드를 MALDI-TOF PSD mode에서 chemical assisted fragmentation방법으로 sequencing하여, 아미노산의 분자량을 해석함으로써 확인 하였다(<도 13의 (가)> 참조).
한편 단백질 spot 5802(<도 6> 참조)에 대해서도 상기 동일한 방법을 실험하여 인산 단백질 여부를 확인하였다(<도 13의 (나)> 참조).
도 1은 금속 이온과 침전제를 이용하여 각 농도에서 비 인산 단백질인 BSA에 대해서 표준 인산 단백질을 분획·분리한 결과를 보여주는 사진이다. 도 1에서 Ca : CaCl2 , Ba: BaCl2, AB: ammonium bicarbonate, SB: sodium bicarbonate, SA: sodium acetate, sup: supernatant를 표시한 것이며, 이들과 인접해서 표시한 숫자는 이들의 최종농도(mM)를 표시한 것이다.
도 2 내지 4는 바륨 이온과 침전제를 이용하여 비인산단백질 및 인산단백질의 혼합물에서 인산단백질을 분획해 내는 성능을 시험한 결과를 보여주는 사진이다. 도 2 내지 4에서 Ba: BaCl2, AB: ammonium bicarbonate, SB: sodium bicarbonate, SA: sodium acetate, sup: supernatant를 표시한 것이며, 이들과 인접해서 표시한 숫자는 이들의 최종농도(mM)를 표시한 것이다.
도 5 및 6은 효모 추출물로부터 인산 단백질을 분획·분리한 결과를 보여주는 사진이다. 도 5는 여러 가지 조건에서 분획·분리된 인산 단백질(8~14 레인)과 이에 상응하는 비 인산 단백질을 포함한 분획을 각각 전기영동하고, CBB염색과 인산단백질 염색을 한 결과를 보여주는 사진이다. 도 6은 분획 전 효모 추출물과, 인산 단백질 분획 후 단백질을 각각 이차원전기영동으로 전개하고 분획 후 인산 단백질들이 염색에 의해 염색된 결과를 보여주는 사진이다. 도 5에서 Ba: BaCl2, AB: ammonium bicarbonate, sup: supernatant를 표시한 것이며, 이들과 인접해서 표시한 숫자는 이들의 최종농도(mM)를 표시한 것이며, original slon은 효모 세포를 단 백질 추출용액으로 용해시킨 것을 의미한다.
도 7은 폐암 세포주 추출물로부터 인산 단백질을 분획 전후의 단백질을 이차원전기영동으로 분리전개 하였을 때의 결과를 보여주는 사진이다.
도 8은 사람 폐의 정상 조직과 폐암 조직에서 인산 단백질을 분획하고 분리한 것을 2차원 전기영동으로 전개한 결과를 보여주는 사진이다.
도 9는 사람 신장의 정상 조직과 신장암 조직에서 인산 단백질을 분획하고 분리한 것을 2차원 전기영동으로 전개한 결과를 보여주는 사진이다.
도 10은 사람 난소의 정상 조직과 난소암 조직에서 인산 단백질을 분획하고 분리한 것을 2차원 전기영동으로 전개한 결과를 보여주는 사진이다.
도 11은 분획된 인산 단백질에 탈인산효소를 처리해 탈인산화시킨 결과 인산단백질에 특이적인 염색 시약(ProQ)에 염색이 되지 않는 것을 보임으로서, 본 발명에 따라 분획된 단백질이 인산 단백질임을 재확인한 결과이다.
도 12 및 도 13은 효모로부터 분획·분리 되어 인산 단백질 염색이 된 단백질 spot에 대한 단백질 동정 및 질량분석기에 의한 인산단백질 확인의 결과이다.

Claims (30)

  1. (a) 세포 또는 조직에 용해 용액(lysis solution)를 첨가하여 세포 또는 조직을 용해(lysis)시켜 세포 또는 조직의 파쇄액을 얻는 단계,
    (b) 이 세포 또는 조직의 파쇄액에 칼슘 이온, 바륨 이온, 코발트 이온 및 몰리브덴 이온으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 금속 이온을 넣어 그 금속 이온과 상기 세포 또는 조직의 파쇄액 중의 인산 단백질을 결합시키는 단계,
    (c) 상기 결합체를, 설페이트(sulfate)의 염, 시트레이트(citrate)의 염, 비카보네이트(bicarbonate)의 염, 및 카보네이트(carbonate)의 염으로 구성된 군에서 선택된 침전제로 침전시키는 단계, 및
    (d) 그 침전물을 분리하는 단계를 포함하여 구성되는 인산 단백질의 분획 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 용해 용액은 라이소자임, 계면 활성제, 단백질 변성제, 단백질 분해 효소 저해제 및 포스파타아제 저해제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 인산 단백질의 분획 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계 후에 세포 또는 조직의 파쇄액을 원심 분리시켜 불용성 물질을 제거하고 상등액을 얻는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 인산 단백질의 분획 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    세포 또는 조직의 파쇄액에 단백질이 가용성을 띠도록 하는 단백질 변성제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 인산 단백질의 분획 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 단백질 변성제는 DTT, TBP, Tris(carboxyethy)phosphine, 우레아, 씨오우레아, NP-40, TritonX-100 및 CHAPS로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 인산 단백질의 분획 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계 전·후에 해리되어 음이온을 띨 수 있는 화합물이나 염을 세포 또는 조직의 파쇄액에 첨가하는 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 인산 단백 질의 분획 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 해리되어 음이온을 띨 수 있는 화합물이나 염은 아세테이트의 염, 아세트산 및 염화나트륨으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인산 단백질의 분획 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 침전제로서 소듐설페이트, 소듐시트레이트, 소듐비카보네이트, 소듐카보네이트, 암모늄설페이트, 암모늄시트레이트, 암모늄비카보네이트 및 암모늄카보네이트로 구성된 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 인산 단백질의 분획 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 (d) 단계 후에, EDTA 또는 EGTA를 첨가하거나, pH 4.0 이하의 조건을 만들어 줌으로써 금속 이온-인산 단백질의 결합체로부터 금속 이온을 제거하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 인산 단백질의 분획 방법.
  10. (a) 세포 또는 조직의 용해 용액,
    (b) 세포 또는 조직의 파쇄액 중의 인산 단백질과 결합할 수 있는 칼슘 이온, 바륨 이온, 코발트 이온 및 몰리브덴 이온으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 금속 이온,
    (c) 상기 금속 이온과 인산 단백질의 결합체를 침전시킬 수 있는 설페이트(sulfate)의 염, 시트레이트(citrate)의 염, 비카보네이트(bicarbonate)의 염, 및 카보네이트(carbonate)의 염으로 구성된 군에서 선택된 침전제, 및
    (d) 그 침전물을 분리하기 위한 수단을 포함하여 구성되는 인산 단백질 분획 키트.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 용해 용액은 라이소자임, 계면 활성제, 단백질 변성제, 단백질 분해 효소 저해제 및 포스파타아제 저해제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 인산 단백질의 분획 키트.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 키트는 세포 또는 조직의 파쇄액 중의 불용성 물질을 제거할 수 있도록 세포 또는 조직의 파쇄액을 원심 분리시키기 위한 수단을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인산 단백질의 분획 키트.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 키트는 단백질을 가용성을 띠도록 변성시킬 수 있는 단백질 변성제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인산 단백질의 분획 키트.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 단백질 변성제는 DTT, TBP, Tris(carboxyethy)phosphine, 우레아, 씨오우레아, NP-40, TritonX-100 및 CHAPS로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 인산 단백질의 분획 키트.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 키트는 해리되어 음이온을 띨 수 있는 화합물이나 염을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인산 단백질의 분획 키트.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 해리되어 음이온을 띨 수 있는 화합물이나 염은 아세테이트의 염, 아세트산 및 염화나트륨으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인산 단백질의 분획 키트.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 침전제는 소듐설페이트, 소듐시트레이트, 소듐비카보네이트, 소듐카보네이트, 암모늄설페이트, 암모늄시트레이트, 암모늄비카보네이트 및 암모늄카보네이트로 구성된 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 인산 단백질의 분획 키트.
  18. 제10항에 있어서,
    상기 키트는 금속 이온-인산 단백질 결합체로부터 금속 이온을 분리하도록 하기 위한 EDTA, EGTA 및 pH 4.0 이하의 조건을 만들기 위한 수단으로 구성된 군에서 선택되는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인산 단백질의 분획 키트.
  19. (a) 세포 또는 조직에 용해 용액(lysis solution)를 첨가하여 세포 또는 조직을 용해(lysis)시켜 세포 또는 조직의 파쇄액을 얻는 단계,
    (b) 이 세포 또는 조직의 파쇄액에 칼슘 이온, 바륨 이온, 코발트 이온 및 몰리브덴 이온으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 금속 이온을 넣어 그 금속 이온과 상기 세포 또는 조직의 파쇄액 중의 인산 단백질을 결합시키는 단계,
    (c) 상기 결합체를, 설페이트(sulfate)의 염, 시트레이트(citrate)의 염, 비카보네이트(bicarbonate)의 염, 및 카보네이트(carbonate)의 염으로 구성된 군에서 선택된 침전제로 침전시키는 단계,
    (d) 그 침전물을 분리하는 단계, 및
    (e) 그 침전된 금속 이온과 인산 단백질의 결합체로부터 금속 이온을 제거하는 단계를 포함하여 구성되는 인산 단백질의 분리 방법.
  20. (a) 세포 또는 조직의 용해 용액,
    (b) 세포 또는 조직의 파쇄액 중의 인산 단백질과 결합할 수 있는 칼슘 이온, 바륨 이온, 코발트 이온 및 몰리브덴 이온으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 금속 이온,
    (c) 상기 금속 이온과 인산 단백질의 결합체를 침전시킬 수 있는 설페이트(sulfate)의 염, 시트레이트(citrate)의 염, 비카보네이트(bicarbonate)의 염, 및 카보네이트(carbonate)의 염으로 구성된 군에서 선택된 침전제,
    (d) 그 침전물을 분리하기 위한 수단, 및
    (e) 그 침전된 금속 이온과 인산 단백질의 결합체로부터 금속 이온을 제거할 수 있는 수단을 포함하여 구성되는 인산 단백질의 분리 키트.
  21. (a) 세포 또는 조직의 용해 용액,
    (b) 세포 또는 조직의 파쇄액 중의 인산 단백질과 결합할 수 있는 칼슘 이온, 바륨 이온, 코발트 이온 및 몰리브덴 이온으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 금속 이온,
    (c) 상기 금속 이온과 인산 단백질의 결합체를 침전시킬 수 있는 설페이트(sulfate)의 염, 시트레이트(citrate)의 염, 비카보네이트(bicarbonate)의 염, 및 카보네이트(carbonate)의 염으로 구성된 군에서 선택된 침전제,
    (d) 그 침전물을 분리하기 위한 수단,
    (e) 그 침전된 금속 이온과 인산 단백질의 결합체로부터 금속 이온을 제거할 수 있는 수단, 및
    (f) 인산 단백질을 정성적 또는 정량적으로 확인할 수 있는 수단을 포함하여 구성되는 인산 단백질 발현량의 변화와 관련된 질병의 진단 키트.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 용해 용액는 라이소자임, 계면 활성제, 단백질 변성제, 단백질 분해 효소 저해제 및 포스파타아제 저해제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 인산 단백질 발현량의 변화와 관련된 질병의 진단 키트.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 키트는 세포 또는 조직의 파쇄액 중의 불용성 물질을 제거할 수 있도록 세포 또는 조직의 파쇄액을 원심 분리시키기 위한 수단을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인산 단백질 발현량의 변화와 관련된 질병의 진단 키트.
  24. 제21항에 있어서,
    상기 키트는 단백질을 가용성을 띠도록 변성시킬 수 있는 단백질 변성제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인산 단백질 발현량의 변화와 관련된 질병의 진단 키트.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 단백질 변성제는 DTT, TBP, Tris(carboxyethy)phosphine, 우레아, 씨오우레아, NP-40, TritonX-100 및 CHAPS로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 인산 단백질 발현량의 변화와 관련된 질병의 진단 키트.
  26. 제21항에 있어서,
    상기 키트는 해리되어 음이온을 띨 수 있는 화합물이나 염을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인산 단백질 발현량의 변화와 관련된 질병의 진단 키트.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 해리되어 음이온을 띨 수 있는 화합물이나 염은 아세테이트의 염, 아세트산 및 염화나트륨으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인산 단백질 발현량의 변화와 관련된 질병의 진단 키트.
  28. 제21항에 있어서,
    상기 침전제는 소듐설페이트, 소듐시트레이트, 소듐비카보네이트, 소듐카보네이트, 암모늄설페이트, 암모늄시트레이트, 암모늄비카보네이트 및 암모늄카보네이트로 구성된 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 인산 단백질 발현량의 변화와 관련된 질병의 진단 키트.
  29. 제21항에 있어서,
    상기 키트는 금속 이온-인산 단백질 결합체로부터 금속 이온을 분리하도록 하기 위한 EDTA, EGTA 및 pH 4.0 이하의 조건을 만들기 위한 수단으로 구성된 군에서 선택되는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인산 단백질 발현량의 변화와 관련된 질병의 진단 키트.
  30. 제21항에 있어서,
    인산 단백질을 정성적 또는 정량적으로 확인할 수 있는 수단은 인산 단백질을 특이적으로 염색할 수 있는 시약인 것을 특징으로 하는 인산 단백질 발현량의 변화와 관련된 질병의 진단 키트.
KR1020080057308A 2007-08-31 2008-06-18 인산 단백질의 분획·분리 방법 및 키트 KR101579946B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070088003 2007-08-31
KR20070088003 2007-08-31

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090023055A true KR20090023055A (ko) 2009-03-04
KR101579946B1 KR101579946B1 (ko) 2015-12-28

Family

ID=40387476

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020080057308A KR101579946B1 (ko) 2007-08-31 2008-06-18 인산 단백질의 분획·분리 방법 및 키트

Country Status (3)

Country Link
US (1) US8003340B2 (ko)
KR (1) KR101579946B1 (ko)
WO (1) WO2009028791A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170000264A (ko) 2015-06-23 2017-01-02 부산대학교 산학협력단 에탄올을 이용한 고구마 과발현 스포라민 단백질 대량 분리 및 고효율 저발현 단백질 검출 방법

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8907059B2 (en) 2008-11-14 2014-12-09 Bio-Rad Laboratories, Inc. Phosphopeptide enrichment of compositions by fractionation on ceramic hydroxyapatite
US20240254528A1 (en) * 2021-05-28 2024-08-01 Corn Products Development, Inc. Aqueous biological systems with reduced phosphate levels and methods of reducing phosphate levels
CN114657125B (zh) * 2022-04-29 2023-08-08 中国科学院海洋研究所 鲨鱼单个核细胞的分离方法、鲨鱼稀释液及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004168739A (ja) * 2002-11-22 2004-06-17 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 骨形成を促進する水溶性タンパク質−リン酸カルシウム複合体およびその製造方法
WO2005111062A1 (de) * 2004-05-14 2005-11-24 Merck Patent Gmbh Verfahren und kit zur isolierung phosphorylierter peptide
JP2005539243A (ja) * 2002-05-03 2005-12-22 モレキュラー プローブス， インコーポレイテッド リン酸化分子の検出および分離のための組成物および方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ522071A (en) * 2002-10-18 2005-07-29 Patrick Joseph Silcock Hydrolysed casein phosphoprotein preparations for bioactive metal ion delivery and teeth remineralisation

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005539243A (ja) * 2002-05-03 2005-12-22 モレキュラー プローブス， インコーポレイテッド リン酸化分子の検出および分離のための組成物および方法
JP2004168739A (ja) * 2002-11-22 2004-06-17 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 骨形成を促進する水溶性タンパク質−リン酸カルシウム複合体およびその製造方法
WO2005111062A1 (de) * 2004-05-14 2005-11-24 Merck Patent Gmbh Verfahren und kit zur isolierung phosphorylierter peptide

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Molecular and Cellular Proteomics, Vol. 6, p.2032-2042, 2007 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170000264A (ko) 2015-06-23 2017-01-02 부산대학교 산학협력단 에탄올을 이용한 고구마 과발현 스포라민 단백질 대량 분리 및 고효율 저발현 단백질 검출 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR101579946B1 (ko) 2015-12-28
US8003340B2 (en) 2011-08-23
WO2009028791A1 (en) 2009-03-05
US20100233784A1 (en) 2010-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pieper et al. Characterization of the human urinary proteome: a method for high‐resolution display of urinary proteins on two‐dimensional electrophoresis gels with a yield of nearly 1400 distinct protein spots
Utleg et al. Proteomic analysis of human prostasomes
Aboulaich et al. Vectorial proteomics reveal targeting, phosphorylation and specific fragmentation of polymerase I and transcript release factor (PTRF) at the surface of caveolae in human adipocytes
Zheng et al. Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer
D'Amato et al. In-depth exploration of Hevea brasiliensis latex proteome and “hidden allergens” via combinatorial peptide ligand libraries
Hwa et al. Identification of proteins differentially expressed in the conventional renal cell carcinoma by proteomic analysis
Kyama et al. ProteinChip technology is a useful method in the pathogenesis and diagnosis of endometriosis: a preliminary study
KR101579946B1 (ko) 인산 단백질의 분획·분리 방법 및 키트
Forde et al. A rapid method to capture and screen for transcription factors by SELDI mass spectrometry
EP0970377B1 (en) Diagnosis of epithelial cell abnormalities
KR100916651B1 (ko) 단백질 타이로신 탈인산화 효소의 양적 감시에 의한 질환의 진단 방법
CN101258161A (zh) csPCNA同种型修饰及其用途
Álvarez-Chaver et al. Identification of hydrophobic proteins as biomarker candidates for colorectal cancer
Jang et al. Caspase-7 mediated cleavage of proteasome subunits during apoptosis
JP5239319B2 (ja) タンパク質のｃ末端ペプチドを選択的に回収する方法及びそれを用いたタンパク質のｃ末端ペプチドのアミノ酸配列決定法
CN112213164A (zh) 一种总蛋白提取试剂盒及提取方法
US6773894B1 (en) Isolation and extraction of subcellularly compartmentalized protein
JP6118523B2 (ja) エチレングリコール及び界面活性剤を含む溶液を用いた細胞分画法
JP6742235B2 (ja) 質量分析を用いたタンパク質の検出方法
EP2370452B1 (en) Process for extracting proteins from ffpe biological tissue samples
Suder et al. General strategies for proteomic sample preparation
US20100144044A1 (en) Identification of phosphorylation sites in polypeptides by employment of uranyl photocleavage
Minami et al. Purification and characterization of C-terminal truncated forms of histone H2A in monocytic THP-1 cells
Czaplewska et al. Basic Proteomics Protocols
Chen et al. Purification and proteomics analysis of pancreatic zymogen granule membranes

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
N231 Notification of change of applicant
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181217

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200116

Year of fee payment: 5