CN101258161A - csPCNA同种型修饰及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了通过鉴别一种或多种翻译后修饰检测csPCNA同种型的存在情况的方法和组合物。公开了通过翻译后修饰(包括甲酯化水平)鉴别csPCNA同种型的方法。

Description

csPCNA同种型修饰及其用途
相关申请的交叉参
本申请要求2005年6月7日提交的美国序号60/694,159的优先权。
发明领域
本文公开内容涉及恶性细胞的检测，包括癌症特异性蛋白修饰的用途。
发明背景
在细胞变成恶性细胞时发生的转化是了解得最少且最复杂的疾病过程之一。该过程涉及遗传突变和蛋白质组转化，其结果是使细胞逃脱正常控制；阻止不适宜的细胞分裂。癌细胞共有某些相同特性。大部分癌细胞在正常的细胞周期控制之外增殖，表现出形态变化，并表现出对细胞过程的各种生物化学破坏。
通常在开始出现细胞变化后肿瘤变得清晰可见时诊断出癌症。许多癌症在依据组织学检验活检样品的形态异常后被诊断出来，形态异常证明细胞增殖和遗传不正常。恶性肿瘤的有效治疗经常依赖于在疾病早期可靠地检测恶性细胞的存在情况的能力，使得有效治疗可在疾病对此治疗更敏感的阶段开始。因此，需要在恶性细胞还没有发展至被看作恶性肿瘤的组织学阶段，但可发展至恶性肿瘤状态时，能够可靠地检测潜在的恶性细胞。还需要快速的、侵入性最低的技术来可靠地检测或治疗恶性细胞或潜在的恶性细胞。
增殖细胞核抗原(PCNA)是一种29kDa的核蛋白，其在细胞周期的S期和G2期时于细胞中的表达使该蛋白成为良好的细胞增殖标记。还已经表明，在许多分子途径中的配偶体负责细胞的生命和死亡。其在S期细胞核中的周期性出现提示与DNA复制有关联。PCNA后来被鉴别为哺乳动物细胞中的DNA聚合酶辅助因子和体外SV40 DNA复制的必需因子。除了在哺乳动物细胞中用作DNA滑动钳蛋白和DNA聚合酶辅助因子以外，PCNA还与涉及转录、细胞周期关卡、染色质重塑、重组、凋亡和其它形式的DNA修复的众多其它蛋白相互作用。除了作用不同之外，PCNA的许多结合配偶体还通过其对每种新一代细胞的细胞功能的精确遗传的影响而连在一起。PCNA可用作协调染色体加工的主要分子。
还已知PCNA与诸如FEN-1、DNA连接酶和DNA甲基转移酶的其它因子相互作用。另外，还已经表明PCNA在多个DNA修复途径中是必需的参与者。与错配识别蛋白、Msh2和核苷酸切除修复内切核酸酶XPG之类的蛋白的相互作用使PCNA参与和DNA合成截然不同的过程。与多个配偶体的相互作用一般取决于能使PCNA以按顺序的和遗传有利的方式选择性相互作用的机制。
PCNA功能机制的线索起初通过研究哺乳动物细胞中存在的DNA合成体(synthesome)、多蛋白DNA复制复合物得以揭示。检验DNA合成体的合成活性的研究在恶性细胞中鉴别出的出错率高于非恶性细胞中鉴别出的出错率。这些结果提示，恶性细胞中DNA合成体的一个或多个组分的结构发生改变。DNA合成体的必需组分PCNA的2D-PAGE免疫印迹分析揭示出两种具有极大不同的等电点(pI)的截然不同的同种型。一种PCNA同种型显示出显著的碱性pI，在恶性和非恶性细胞中均存在。具有酸性pI的另一同种型专有地存在于恶性细胞中。因为该同种型仅存在于恶性细胞中，所以将其称为癌症特异性同种型或csPCNA，导致PCNA的改变的2D-PAGE迁移模式的翻译后改变仍未确定。
一些采用PCNA的标记研究提示，PCNA的迁移很可能不是缘于磷酸化、乙酰化、糖基化或唾液酸化等改变。业已披露了尝试鉴别针对PCNA的翻译后修饰的相左研究。例如，据报道，PCNA的磷酸化影响其结合DNA合成位点。另一个研究主张PCNA终归不是磷酸化的，而是乙酰化的。除了这些研究以外，酵母PCNA的分析表明，其是响应于DNA损伤的泛素化靶标以及没有损伤情况下的苏素化靶标。由于PCNA的多变性和相左的结构证据，所以难以鉴别哪种修饰(假使有的话)负责csPCNA同种型的出现和功能。
因此，期望鉴别出正确的csPCNA翻译后修饰，以开发诊断方法，另外基于csPCNA与其配偶体的相互作用开发治疗剂。恶性癌细胞表达一种称为癌症特异性PCNA(csPCNA)的PCNA同种型，而非恶性细胞表达一种称为非恶性细胞PCNA(nmPCNA)的同种型。癌症的诊断和治疗需要辨别两种同种型的有效组合物和方法。
发明概述
鉴别了csPCNA的新的翻译后修饰。鉴别了csPCNA的甲酯化。使用2D-PAGE/液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法分析csPCNA同种型，并鉴别存在于csPCNA上的甲酯化。甲酯化修饰位于特定的谷氨酸和天冬氨酸残基。
本文公开了利用双向电泳(2D-PAGE)和液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)对分离自乳癌细胞的单一酸性PCNA同种型的结构分析。甲酯位于csPCNA的16个特定谷氨酸和天冬氨酸残基。csPCNA的甲酯化代表了哺乳动物细胞中一种新型翻译后修饰，与解决PCNA的多种功能的其中一些相关。
一种检测生物样品中的癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的方法包括以下步骤：
在疑似含csPCNA同种型的样品中检测在csPCNA同种型的一个或多个氨基酸残基上含甲酯的翻译后修饰；并
通过比较csPCNA同种型和非恶性PCNA同种型上的甲酯水平确定csPCNA同种型的存在情况。
其中一些生物样品包括体液，例如血液、血浆、淋巴液、血清、胸膜液、脊髓液、唾液、痰、尿液、胃液、胰液、腹水、滑液、乳液和精液。
生物样品还包括组织样品，例如得自乳腺、前列腺、肺、结肠、上皮、结缔组织、子宫颈、食道、脑、胸腺、甲状腺、胰腺、睾丸、卵巢、肠、膀胱、胃、软组织瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、癌、腺癌、胎盘、纤维性组织、胚细胞组织及其提取物的组织。能够含csPCNA的任何生物样品都适于分析。
在一个方面，甲酯存在于csPCNA同种型的天冬氨酸上或谷氨酸上或其组合上。甲酯存在于csPCNA同种型上的16个天冬氨酸或谷氨酸残基的一个或多个上。甲酯存在于16个天冬氨酸或谷氨酸残基的一个或多个上，这16个残基对应于csPCNA同种型的氨基酸位置3、85、93、94、104、109、115、120、132、143、174、189、201、238、255和259。含16个天冬氨酸或谷氨酸修饰残基的csPCNA-衍生肽如下：
MFEmAR；
IEmDEEGS；
IEDEEmGS；
VSDYEmMK；
MPSGEmFAR；
LSQTSNVDmK；
CAGNEmDIITLR；
FSASGEmLGNGNIK；
AEDNADTLALVFEAPNQEmK；
AEmDNADTLALVFEAPNQEK；
AEDmNADTLALVFEAPNQEK；
AEDNADTLALVFEmAPNQEK；
LMDmLDVEQLGIPEQEYSCVVK；
ATPLSSTVTLSMSADVPLVVEmYK；和
LSQTSNVDKEEEAVTIEMNEmPVQLTFALR，
其中Em代表甲酯化谷氨酸残基，Dm代表甲酯化天冬氨酸残基。
在一个方面，使用质谱分析，例如通过液相色谱(LC)质谱(MS)分析，进行csPCNA同种型的检测。检测甲酯或甲酯化氨基酸残基的任何合适方法都可用。
与对应的未修饰肽相比，csPCNA-衍生肽的质谱分析产生14Da的质量位移(shift)。
一种诊断或预后恶性肿瘤的方法，该方法包括以下步骤：
通过鉴别区分csPCNA同种型和非恶性PCNA(nmPCNA)同种型的csPCNA同种型的翻译后修饰状态检测生物样品中的癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型；并
基于生物样品中的csPCNA的检测情况诊断恶性肿瘤。
检测csPCNA上的翻译后修饰，例如甲酯化，并使用csPCNA相对于nmPCNA上的甲酯化水平确定恶性肿瘤。
一种修饰的增殖细胞核抗原(PCNA)肽包含选自以下的氨基酸序列：
MFEmAR；
IEmDEEGS；
IEDEEmGS；
VSDYEmMK；
MPSGEmFAR；
LSQTSNVDmK；
CAGNEmDIITLR；
FSASGEmLGNGNIK；
AEDNADTLALVFEAPNQEmK；
AEmDNADTLALVFEAPNQEK；
AEDmNADTLALVFEAPNQEK；
AEDNADTLALVFEmAPNQEK；
LMDmLDVEQLGIPEQEYSCVVK；
ATPLSSTVTLSMSADVPLVVEmYK；和
LSQTSNVIDKEEEAVTIEMNEmPVQLTFALR，
其中Em代表甲酯化谷氨酸残基，Dm代表甲酯化天冬氨酸残基。
在一个方面，csPCNA或PCNA的修饰肽是翻译后修饰的。在另一方面，对csPCNA或PCNA的修饰肽进行蛋白酶消化步骤。在另一方面，csPCNA或PCNA的修饰肽是合成的。
在一个方面，检测生物样品中的癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的方法包括：测定csPCNA和nmPCNA的总体甲酯化水平，并基于该甲酯化水平确定生物样品具有csPCNA。
在考虑以下详述的实施方案时，本文公开内容的其它特征对本领域技术人员将变得显而易见，实施方案的详述例举了实施目前所认识到的公开内容主题的最佳方式。
附图简述
图1表明通过LC-MS/MS肽表征由2D-PAGE鉴别csPCNA。(A)显示了MDA MB 468细胞核提取物(2mg)的代表性考马斯蓝染色的20-PAGE凝胶。选择多个斑点，用于以胰蛋白酶蛋白水解，并通过LC-MS/MS鉴别。在凝胶的酸性一侧鉴别出csPCNA(黑色箭头)，pI约为4.6。依据2D分析软件的检测，2D-PAGE的三维表示检测出对应于csPCNA的两个斑点-一个适中丰度的斑点(黑色箭头)和一个低丰度的更酸性的斑点(白色箭头)。在分析中鉴别出来的非PCNA的蛋白斑点(i-v)列于表I。(B)显示了衍生于csPCNA的胰蛋白酶消化的肽的基峰色谱图。(C)图示了于43.3分钟洗脱的csPCNA肽的质谱。1038.7质荷比离子的串联质谱分析(D)鉴别出其为双电荷肽，对应于人PCNA的残基92-110。(E)是显示于43.74分钟洗脱的1045.4质荷比离子的质谱。单电荷离子的质量差异是双电荷离子差异的2倍，因此1045.4质荷比离子显现出+14Da质量位移。(F)表明，1045.4质荷比离子的串联质谱与D部分中的质谱几乎相同，只是所有y-离子都位移14Da。仅b18-离子的质量位移将额外的14Da定位在csPCNA的109位谷氨酸上。
图2显示了csPCNA的交错肽序列图谱的建立。(A)代表性基峰色谱图，显示了用胰蛋白酶(蓝色)、胰蛋白酶/CNBr(绿色)、GluC(红色)和AspN(黑色)切割csPCNA衍生的肽的洗脱。(B)通过LC-MS/MS鉴别的序列的csPCNA图谱。指示了甲酯的位置(Xm)。
图3表明，PCNA的C末端尾在多个位点被甲酯化。(A)衍生于csPCNA的C末端尾的3种不同肽的洗脱。用胰蛋白酶消化的csPCNA的基峰色谱图与肽IEDEEGS(778.5m/z)和甲酯化IEDEEGS肽(792.5)的选定离子色谱图相比。甲酯化肽具有增加的疏水性，之后在反相梯度中洗脱。(B)未修饰肽的串联质谱解析显示了具有序列IEDEEGS的单电荷肽的碎片。通常观察到水的中性丢失水(-18Da)和许多碎片离子。另外，在373.9质荷比观察到表现为由y4-离子中性丢失水和CO基团的碎片离子。(C)在以上色谱图中先洗脱的肽的792.3质荷比离子的串联质谱。可在质谱中鉴别出b3-6-离子，除y3和y5-离子没有位移之外，全部都位移14Da，提示修饰位于N-端的亮氨酸或谷氨酸中的任一个上。(D)在分离中第二洗脱的肽的792.3质荷比离子的串联质谱。b5和b6-离子含如上的14Da位移，但b3和b4离子不位移，与位于该肽5位谷氨酸上的甲酯相一致。
图4显示了PCNA的免疫印迹。
图5显示了PCNA的氨基酸序列(1-262个氨基酸)。
发明详述
增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白在癌细胞中被改变。PCNA是一种28kD的蛋白，其电泳迁移率等于36kDa蛋白的电泳迁移率。PCNA是DNA聚合酶δ介导高效DNA复制活性所需的辅助因子。由恶性细胞纯化的DNA合成体包含至少两种形式的PCNA。两种PCNA的总电荷明显不同。因此，恶性肿瘤或癌症特异性的酸性PCNA形式csPCNA和非恶性或正常的碱性PCNA形式nmPCNA可在双向聚丙烯酰胺凝胶上得以辨别。
酸性csPCNA在恶性细胞系中表达，例如HeLa(人宫颈癌)、Hs578T(乳癌)、HL-60(人原粒细胞白血病)、FM3A(小鼠乳癌)、PC 10(前列腺癌)、LNCaP(前列腺癌)、LN99(前列腺癌)、MD-MB468(人乳癌)、MCF-7(乳癌)、KGE 90(食道-结肠癌)、KYE 350(食道-结肠癌)、SW 48(食道-结肠癌)和T98(恶性神经胶质瘤)。酸性csPCNA还在得自人乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、脑肿瘤、人胃肠肿瘤或食道-结肠肿瘤、鼠乳腺肿瘤的恶性细胞中和人慢性原粒细胞白血病中表达。在非恶性细胞系(例如乳腺细胞系Hs578Bst和MCF-10A)中或在非恶性血清或组织(例如乳腺)的样品中未检测到酸性csPCNA。
LC-MS/MS肽表征方法用于测序存在于恶性细胞中的csPCNA同种型。鉴别出一种存在于csPCNA的众多残基上的新型翻译后修饰。此修饰-甲酯化存在于csPCNA中的16个不同的天冬氨酸和谷氨酸上。PCNA的未修饰氨基酸序列示于图5。依据串联质谱，这些甲酯最初在肽质谱中被鉴别为14Da位移，定位于谷氨酸残基或天冬氨酸残基。甲酯化肽的相对定量表明，恶性细胞中的csPCNA蛋白包括含一个或多个甲酯的几种分子，这些甲酯存在于整个蛋白中的多个残基处。特定残基的甲酯化有可能导致离散的蛋白构象变化，这些变化可促进和/或破坏蛋白/蛋白相互作用。
甲酯化对哺乳动物蛋白功能的影响了解得很贫乏。过去对哺乳动物蛋白甲酯化研究大部分集中于蛋白老化和酶蛋白异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)对异天冬氨酰残基的修复。但是，存在于csPCNA上的大部分甲酯被发现在谷氨酸残基上，而不是在天冬氨酸残基上，提示修饰经另路途径发生。
PCNA的甲酯化有可能改变其构象，有效隐藏和/或暴露特异性蛋白结合位点，并决定其功能。还进行了重组PCNA的LC-MS/MS序列分析，发现了甲酯化证据。因此，存在于PCNA上的甲酯化可稳定蛋白的特定构象状态，避免蛋白结构无序。另外，PCNA的静电势计算表明，PCNA三聚体的外表面具有高度的负电势以及谷氨酸和天冬氨酸残基丰度。这些残基的甲基化因此可改变此电势，并有效改变蛋白的表面拓扑学。
公开了由2D-PAGE解析的特定同种型csPCNA的LC-MS/MS肽表征。使用组合的蛋白水解法产生csPCNA的交错肽序列图谱，通过LC-MS/MS鉴别出100％的csPCNA蛋白序列。鉴别出一种存在于csPCNA上的新翻译后修饰。甲酯出现在csPCNA同种型的16个特定天冬氨酸和/或谷氨酸残基的至少一个上。这些修饰可改变PCNA三聚体的结构，并通过这样做促进可能与有序的蛋白/蛋白相互作用相关的构象改变。
生物样品可为体液样品，其可包括血液、血浆、淋巴液、血清、胸膜液、脊髓液、唾液、痰、尿液、精液、泪液、滑液或可测试csPCNA同种型存在情况的任何体液。或者，所述生物样品可为组织样品，其中组织样品的细胞可被怀疑是恶性的。例如，组织切片或细胞培养物可封装在玻璃或塑料载玻片上，并按照标准免疫细胞化学方法与抗体接触。组织提取物或细胞浓缩物或细胞提取物也是适宜的。
在另一个实施方案中，提供一种诊断恶性肿瘤的方法。所述方法包括以下步骤：检测生物样品中的csPCNA，所述生物样品得自人，或者具体地说是疑似具有恶性肿瘤病症的患者，其中检测csPCNA的步骤包括检测本文公开的含甲酯的翻译后修饰的水平。
在另一个实施方案中，提供一种有助于诊断恶性肿瘤的方法。所述方法包括与正常细胞中的PCNA相比检测组织样品的恶性细胞中的csPCNA上的翻译后修饰的步骤，其中组织样品的细胞疑似为恶性的，其中检测csPCNA的步骤包括检测csPCNA上的甲酯。要理解的是，恶性细胞不限于诸如乳腺、前列腺、血液、脑、胰腺、平滑肌或横纹肌、肝脏、脾脏、胸腺、肺、卵巢、皮肤、心脏、结缔组织、肾脏、膀胱、肠、胃、肾上腺、淋巴结或子宫颈的组织中的恶性细胞，或例如Hs578T、MCF-7、MDA-MB468、HeLa、HL60、FM3A、BT-474、MDA-MB-453、T98、LNCaP、LN 99、PC 10、SK-OV-3、MKN-7、KGE 90、KYE 350或SW 48的细胞系中的恶性细胞。
在另一个实施方案中，提供一种有助于预后恶性肿瘤发展的方法。该方法包括通过检测本文公开的翻译后修饰检测组织样品中的csPCNA，其中组织样品的细胞可被怀疑是恶性的，并将csPCNA水平与具体恶性肿瘤疾病的进展相关联。而且，csPCNA上的翻译后修饰的检测和分析可用于预后已发展出恶性肿瘤的患者的潜在存活结果。
要理解的是，可使用所述抗体诊断或预后的疾病包括但不限于恶性肿瘤，例如各种形式的成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、黑素瘤、结肠癌、肺癌、腺癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、成淋巴细胞瘤、白血病、骨肉瘤、乳癌、肝癌、肾瘤、肾上腺癌或前列腺癌、食道癌。如果恶性细胞表达csPCNA同种型，则本文公开的技术能够检测csPCNA同种型。
包含本文公开的翻译后修饰检测的检测技术还可检测乳腺组织某些侵入性和非侵入性肿瘤类型中的恶性肿瘤，这些肿瘤类型包括管囊肿、顶泌腺化生、硬化性腺病、管上皮细胞增生、非-非典型管内乳头瘤病、柱状细胞改变、放射状硬化病(放射状瘢痕)、乳头腺瘤、管内乳头瘤、纤维腺瘤、乳腺乳头瘤、非典型管上皮细胞增生、非典型小叶增生、原位管癌-再分类为核级1、2和3、原位小叶癌、原位多形性小叶癌、乳腺内脂瘤、乳腺错构瘤、粒细胞瘤、乳腺内脂肪坏死、假血管瘤样间质增生(PASH)、涉及乳腺的恶性黑素瘤、涉及乳腺的恶性淋巴瘤、叶状瘤-良性、临界和恶性亚型以及乳腺肉瘤。
在另一个实施方案中，本文公开的方法用于通过比较随时间变化的肿瘤中的csPCNA水平确定肿瘤的恶性程度、跟踪恶性肿瘤疾病的进展或患者对治疗的响应。通过测定血样的csPCNA同种型存在情况的方法，所述方法还可用于检测已脱离肿瘤并存在于患者血流中的恶性细胞。生物样品可得自人类患者或脊椎动物患者。
术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性或特异性。
可制备特异性识别翻译后修饰的nmPCNA或csPCNA的抗体。
术语“修饰的蛋白或肽”指在衍生于这些蛋白的csPCNA或nmPCNA蛋白或肽上存在一个或多个翻译后修饰。该术语还指合成的以及分离纯化的csPCNA和nmPCNA肽，它们包含一个或多个翻译后修饰。该术语还指蛋白酶消化的csPCNA和PCNA肽，以及通过任何已知方法片段化的csPCNA和PCNA的肽，它们含一个或多个翻译后修饰。
除非另有说明，否则本文使用的所有化学品都得自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)或Fisher Scientific(Hampton，NH)。质谱级水和乙腈得自Honeywell Burdick and Jackson(Morristown，NJ)。
使用任何标准技术分析由个体所获样品中存在的csPCNA和nmPCNA的翻译后修饰。例如，质谱分析是一种适宜的技术。质谱分析可与其它技术联用。
MDA MBA 468和MCF7乳癌细胞得自ATCC，并保持在含10％FCS(Bio Whittaker，Walkersville，MD)和抗生素-杀真菌剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)的DMEM(MediaTech，Hemdon，VA)中。细胞在100mm细胞培养皿上生长，直至60-70％汇合，淋洗，并用橡胶淀帚刮到冰冷的PBS中，之后使之沉淀。如在Malkas等，Biochemistry 1990，29，6362-6374中所述将细胞分级分离为核提取物。简而言之，使用DounceTM匀浆器匀化细胞，并沉淀核。随后用150mM KCl于4℃提取核蛋白2小时，通过超离心沉淀膜。将核提取物冷冻在-80℃，直至使用。
使用IEF Cell和17cm pH 4-7Ready Strip IPG胶条(Bio-Rad，Hercules，CA)进行等电聚焦。蛋白样品使用蛋白脱盐离心柱(Pierce，Rockford，IL)脱盐，并在speed-vac(ATR Biotech，Laurel，MD)中冻干。将冻干的样品重悬浮在再水合缓冲液(9M尿素、4％CHAPS、0.2％Bio-Lytes(Bio-Rad，Hercules，CA)、2mM三丁基膦、0.001％溴酚蓝)中，并于20℃被动再水合入IPG胶条中达12小时。按照生产商的说明(Bio-Rad，Hercules，CA)进行等电聚焦。在SDS-PAGE之前，通过在含20mg/ml DTT的缓冲液(6M尿素、0.375M tris、2％SDS、20％甘油，pH 8.8)中温育还原IPG胶条，并在含替代DTT的碘乙酰胺的相同缓冲液中烷基化。使用Protean XL装置(Bio-Rad，Hercules，CA)以恒定电流在12％聚丙烯酰胺凝胶(20cm×20cm)上进行约5小时的SDS-PAGE。凝胶在10％乙酸/50％甲醇的水溶液中固定，并用Gel CodeBlue(Pierce，Rockford，IL)过夜染色。使用GS710扫描图象光密度计(Bio-Rad，Hercules，CA)实现成像，并用Phoretix Evolution 2D软件(NonLinear Dynamics，Inc.，Durham，NC)进行凝胶分析。使用1mm打孔取样器(The Gel Company，San Francisco，CA)手工进行斑点拣选。
如先前所述并采用某些改进(Rosenfeld等，Anal Biochem 1992，203，173-179；van Montfort等，Biochim Biophys Acta 2002，1555，111-115)，用胰蛋白酶(Promega，Madison，WI)、溴化氰(CNBr)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、GluC或AspN(Roche，Indianapolis，IN)进行蛋白切割。简而言之，凝胶斑点在25mM碳酸氢铵(ABC)/50％乙腈中脱盐，接着用100％乙腈脱水，并在speed-vac(ATR Biotech，Laurel，MD)中干燥。然后将斑点在蛋白酶溶液的(20μg/ml的胰蛋白酶、GluC或AspN)25mM ABC中再水合。于4℃达10分钟后，去除过量的蛋白酶溶液，用新鲜的25mM ABC置换，并于37℃过夜温育。在25mMABC/50％乙腈(一次)和5％甲酸/50％乙腈(两次)存在下通过超声由凝胶提取肽。合并肽提取物，并在speed-vac中干燥。随后通过将干燥的肽提取物重悬浮在70％甲酸中，并加入CNBr至相对于所述肽约200M过量，进行胰蛋白酶消化物的CNBr切割(对选定样品)。于室温进行4小时的CNBr切割，并在speed-vac中干燥。所有样品都在临分析前重悬浮在1％甲酸中。
使用在内部用Magic C18Aq 5μ、
Figure A20068003092600161
(Michrom，Inc.，Auburn，CA)装填的MegraFrit(New Objective，Inc.，Woburn，MA)捕获柱和用Magic C18Aq 5μ、材料自装填并固定在由定制纳喷雾台原位保持的小型十字架上(Gatlin等，Anal Biochem 1998，263，93-101)的0.05mm×100mm拉尖的熔融硅柱(Polymicro Technologies，Phoenix，AZ)进行纳流HPLC。使用含0.1％甲酸的2-50％线性乙腈梯度分离肽。装置由Surveyor HPLC和LCQ Advantage离子阱质谱仪(ThermoElectron，Waltham，MA)或Ultimate HPLC(LC Packings)和LCQ DECA XP(ThermoElectron，Waltham，MA)组成。使用BioWorks 3.1(ThermoElectron，Waltham，MA)由原始数据产生峰表。使用Mascot(Matrix Science，Inc.，Boston，MA)进行Swissprot数据库检索(另参见Creasy&Cottrell，Proteomics 2002，2，1426-1434)。母离子和碎片质量容差分别设为3和0.8Da，最大未切割位点设为2。选择脲甲基半胱氨酸和氧化的甲硫氨酸作为第一遍哺乳动物数据库检索中的可变修饰。在选择胰蛋白酶作为酶的情况下进行随后的容错检索，并另外将谷氨酸和天冬氨酸甲酯看作可变修饰。
尽管以下的详述和实施例及其作为参考的具体实施方案中详细描述了与csPCNA同种型相关的检测翻译后修饰的方法及其用途，但对本领域一般技术人员显而易见的是，可对本发明实施各种变更和修改，而不偏离本发明的精神和范围。本文提及的所有参考文献都通过引用整体结到本文中。
实施例
提供以下实施例仅是为了解释目的，无意限制上文广义上已描述的公开内容。
实施例1：csPCNA同种型的双向2D-PAGE和肽表征
通过2D-PAGE解析分离自MDA MB 468乳癌细胞的核提取物级分(图1A)。由凝胶切下多个具有接近36kDa的表观分子量以及处于或接近4.5的pI(PCNA的表观SDS-PAGE MW和计算pI)的斑点，并用胰蛋白酶进行凝胶内消化。利用纳流液相色谱法(LC)和使用四极杆离子阱质谱仪的电喷射串联质谱法(LC-MS/MS)分析获得的肽。通过用Mascot检索引擎检索串联MS数据鉴别每个斑点包含的蛋白。使用该方法定位2D-PAGE凝胶上的csPCNA。该方法允许以有限的样品处理常规csPCNA鉴别和分析，因此使翻译后修饰的潜在损失最小。图1B显示了由2D-PAGE凝胶切下的csPCNA的凝胶内胰蛋白酶消化产生的肽的代表性基峰LC/MS色谱图。在该实验中，鉴别出25个覆盖全长PCNA序列的97％的肽。在该实验中鉴别出的代表性csPCNA肽示于图1C。该肽于43.3分钟被洗脱，并显示出1038.7的质荷比(2+)(图1C)。肽的碰撞诱导解离(CID)(Roepstorff，P.和Fohlman，J.，BiomedMass Spectrom 1984，11，601)揭示了人PCNA的氨基酸92-110的序列AEDNADTLALVFEAPNQEK(图1D)。
实施例2：csPCNA的甲酯化
该实施例表明，csPCNA同种型在一个或多个氨基酸位置表现出甲酯化。LC-MS/MS数据鉴别出多个表现出14Da的母肽质量位移的肽。令人感兴趣的是，鉴别出的质量位移提示存在翻译后修饰-甲酯化。哺乳动物细胞中的甲基化一般被认为是不可逆的翻译后修饰。主要在赖氨酸残基的胺基和蛋白N末端上存在的甲基化已在诸如p53和组蛋白H3和H4的蛋白上被鉴别出来。但是，检查CID谱的+14Da位移肽将甲基定位在天冬氨酸和谷氨酸残基，与甲酯化一致。图1E表明在该实验中甲酯化肽(1045.4质荷比[2+])于43.8分钟被洗脱。该肽紧邻(25秒后)未修饰的1038.7质荷比(2+)肽被洗脱(图1C)，在MS谱中仍可见。1045.4质荷比离子的碎片(图1F)揭示了非常类似于1038.7质荷比肽的模式(图1D)。这些碎片谱的主要差异在于，与1038.7质荷比肽的y系列离子相比，在1045.4质荷比肽的几乎所有y系列离子中都有+14质量位移。检查1045.4CID谱的高MW区(图1F)鉴别出两个具有1943.3和1800.2的质荷比值的b-离子。1943.3离子对应于b18-离子，表明C-末端失去未修饰的赖氨酸。该离子与在1038.7质荷比肽的碎片质谱(图1D)中观察到的b18-离子(1928.4)也相差14Da，这进一步提示赖氨酸未被修饰，14-Da质量位移在该肽的另一个残基上。另一方面，图1F中的b17-离子(1800.2)紧密匹配图1D中的b17-离子(1799.4)，表明失去谷氨酸(129Da)加甲基(14Da)，或失去1045.4质荷比肽的b17和b18-离子之间的143Da。刚好在图1D和1F中的b18-离子左侧的小峰分别具有1911.1和1925.4的质荷比值，与b18-离子中性丢失H2O或NH3相一致。这些观察结果与位移的y-离子质量一起将甲酯定位于全长csPCNA蛋白109位的谷氨酸残基。
除了csPCNA以外，分析凝胶中其它蛋白的甲酯化存在情况。5个代表性蛋白斑点示于图1A，这些印迹的身份及其甲酯化状态示于表1。令人感兴趣的是，发现所分析的5种蛋白中的一种(Stathmin)被甲酯化以及N-末端乙酰化。csPCNA的甲酯化不是样品处理(例如用乙酸和甲醇进行凝胶固定)的结果，因为仅对一小部分蛋白观测到甲酯化，并一致地对特定csPCNA残基观测到甲酯化，而不是在凝胶中存在的所有蛋白中存在。
实施例3.csPCNA甲酯化的鉴别
除了图1中鉴别的AEDNADTLALVFEAPNQEK肽以外，多个其它csPCNA肽一致地表现出14Da质量位移。为成功地鉴别所有甲酯化位点以及鉴别csPCNA同种型上存在的任何其它潜在翻译后修饰，使用不同试剂产生如在csPCNA同种型的序列图谱中所示的交错肽。图2A显示了LC-MS/MS实验中来源于用单独的胰蛋白酶、胰蛋白酶继之以溴化氰(CNBr)切割、单独的AspN、单独的GluC分别消化的csPCNA的代表性基峰色谱图。这些基峰描图显示出使用这些技术产生的肽洗脱谱的差异。用单独的胰蛋白酶以及胰蛋白酶和CNBr消化提供序列覆盖，AspN和GluC实验提供额外的证实数据。从C末端向甲硫氨酸残基方向切割的CNBr切割降低了较大胰蛋白酶消化肽的大小，使这些序列适于使用离子阱的LC-MS/MS分析。此组合消化可用于表征33个残基的胰蛋白酶消化肽DLINEACWDISSSGVNLQSMDSSHVSLVQLTLR(PCNA残基21-53)。用AspN和GluC消化产生证实数据，但其不产生完整序列覆盖。这有可能归因于多种因素。例如，与胰蛋白酶相比，GluC和AspN在PCNA中具有较少的切割位点，因此产生更难以分析的较大肽。另外，这些蛋白酶识别蛋白中的天冬氨酸和谷氨酸残基，本研究发现这些残基被甲酯化。因此，甲酯化可潜在地影响蛋白酶切割产生的较大肽，最终导致不佳的序列覆盖。这种蛋白酶切割的损失可用作检测甲酯化的诊断工具。产生的具有质子化C-末端残基的肽如胰蛋白酶消化肽一样通常产生高质量的CID谱。使用这些不同方法由多个测序实验产生的组合数据一致地在MDA MB 468和MCF7乳癌细胞的csPCNA上鉴别出16个甲酯化的谷氨酸残基和天冬氨酸残基(参见表III)。产生的csPCNA序列图谱连同通过LC-MS/MS鉴别的任何修饰示于图2B。除了甲酯化以外，观察到几种其它修饰。在所有实验中于csPCNA和其它蛋白上都一致地观测到氧化的甲硫氨酸和脲甲基半胱氨酸。另外，在胰蛋白酶/CNBr消化物中观测到多个“甲酰化”丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。但是，这些修饰可能是由样品处理产生的化学修饰，不是“天然的”翻译后修饰。
实施例3A：PCNA和csPCNA上的其它翻译后修饰的鉴别
除了鉴别csPCNA上的甲酯以外，还分析完整的csPCNA分子的其它已知翻译后修饰的存在情况。与先前对其它形式的PCNA的报道相反，在csPCNA上未鉴别出泛素化、苏素化、磷酸化或乙酰化。泛素化和苏素化会导致PCNA在2D-PAGE凝胶上出现显著质量位移，用csPCNA同种型没有观测到此现象。另外，在csPCNA的任一个LC-MS/MS实验中都没有鉴别出对应于泛素化或苏素化的肽，没有csPCNA肽表现出与泛素化或苏素化缀合一致的质量位移，这强有力地表明，在此分析的凝胶斑点中的csPCNA既没有泛素化，也没有苏素化。而且，尽管先前已报道了磷酸化的PCNA，但在这些分析中没有发现支持csPCNA的任何残基磷酸化的数据。在这些分析中观测到的csPCNA肽没有一个显示出+80Da质量位移和/或H3PO4的中性丢失(98Da)，这与表明PCNA是乙酰化的而不是磷酸化的报道相一致。另外，为确定磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、乙酰化赖氨酸以及聚(ADP)核糖的存在情况，对凝胶进行免疫印迹分析，但未能在PCNA上检测到这些翻译后修饰。
乳癌细胞中的csPCNA同种型不是磷酸化的、乙酰化的、泛素化的或苏素化的，而是甲酯化的。与乙酰化和磷酸化类似，甲酯化可改变其在2D-PAGE上的迁移。但是，与能将分子迁移至更酸性pI的乙酰化和磷酸化不同，甲酯化会使蛋白在更碱性的pI解析。因此，可以假定，在图1A中可见的低丰度酸性同种型(白色箭头)可为与csPCNA同种型相比含较少或不含甲酯的同种型。
与正常或非恶性形式的PCNA(nmPCNA或简单PCNA)相比，csPCNA同种型含少量的甲酯化。非恶性或碱性PCNA同种型可能包含较高水平的甲酯化。此结论部分地基于以下事实：甲酯化修饰酸性残基，会将蛋白迁移至更碱性的pI(由于失去酸性电荷)，csPCNA同种型非常接近其理论pI 4.5。但是，乙酰化、磷酸化和ADP-核糖基化会将蛋白迁移至4.5以下的更酸性pI(由于加入酸性电荷)。因此，这些修饰不可能引起所述pI迁移。检测PCNA和csPCNA上的甲酯化程度区分恶性肿瘤与非恶性肿瘤(区分csPCNA与nmPCNA)。使用本文公开的方法，确定和比较csPCNA和nmPCNA的甲酯化水平，用于诊断恶性肿瘤。例如，表II提供了多种csPCNA衍生肽的甲酯化状态以及异质群体中的修饰百分率。表II可用作在恶性肿瘤诊断中确定不同甲酯化水平的对比表。
实施例4.甲酯化的csPCNA肽的半定量
进一步研究了相对于同种型的pI鉴别csPCNA上的甲酯。PCNA具有约4.5的理论pI，使用周围蛋白的pI在2D-PAGE凝胶校准后测定的csPCNA的pI稍高，约为4.6。相反，如果在图2中鉴别出的全部16个酸性残基100％都是甲酯化的，则蛋白的pI应有可能迁移至比0.1pH单位更显著的碱性(例如5.66)。可能有额外的残基被修饰，以产生碱性或nmPCNA同种型。nmPCNA同种型还可以在与csPCNA不同的和/或额外的残基上被甲酯化。本文公开的方法能使本领域一般技术人员确定csPCNA和nmPCNA的甲酯化水平。检测甲酯化肽的相对丰度，并与未修饰肽相比较。这通过检测和比较每个未修饰肽及其甲酯化对应物的峰面积完成。
峰面积的比较揭示了如表II所示的在此LC-MS/MS实验中鉴别出的各个甲酯的相对丰度。在比较峰面积时，每种肽仅显示出部分甲酯化(＜25％)。因此，csPCNA同种型可能由具有相同pI的PCNA的异质群体组成。换句话说，单个csPCNA分子可能具有一个或几个甲酯，但没有16个。但是，一个或几个甲酯可遍及蛋白的16个不同残基上存在。csPCNA的这种异质性表现为csPCNA的C-末端肽上存在甲酯化。未修饰肽IEDEEGS(778质荷比)在28.9分钟被洗脱(图3A)，该肽的CID谱与含未修饰的酸性残基的肽相一致(图3B)。令人感兴趣的是，在该肽的甲酯化物质(792质荷比)的选定离子色谱图中，鉴别出保留时间增加2-3分钟的两个峰。这可能归因于增加的疏水特征和甲酯化赋予的电荷的丢失。因此，这两个峰的解析指示了这些肽的结构的差异。检查CID谱鉴别出所述肽是甲酯化的，但在不同残基上(图3C和D)。因为没有观测到在两个残基上都具有甲酯的肽，所以这些肽的出现最有可能是由csPCNA的异质群体的分析产生。
观测到的修饰物质的异质性和低百分率有可能是甲酯修饰自身的易变性的结果。某些报道指出，蛋白甲酯化修饰在中性和碱性溶液中是短暂的。因此，蛋白甲酯和存在于csPCNA上的那些甲酯一样，可自发水解，剩下未修饰的残基和甲醇。另外，SDS-PAGE的碱性和氧化条件也可导致PCNA失去甲酯，将高度甲酯化形式的PCNA-碱性PCNA同种型解析至其碱性pI的尝试似乎表现出向更酸性pI的自发回归(图4)。
高水平的甲酯可能引起PCNA向碱性pI聚焦，如在图4中的免疫印迹所示(约pH 8.8-9.0)。但是，此同种型的聚焦可能是不均一的(有条纹)，可能以较低密度存在。此同种型解析处的碱性pH可能对保持蛋白上的所有甲酯化没有帮助。在该凝胶上观察到的不能于特定pI聚焦(图4)可能归因于一种或多种甲酯由于聚焦于碱性pH而伴发的缺失。甲酯出现自发水解，释放甲醇和未修饰的氨基酸侧链。通过此“碱性水解”再生酸性侧链可能引起PCNA的pI由碱性pI迁移至更酸性的pI，这由PCNA向凝胶的更酸性一侧(pH 7)累积得以证实。
甲酯化的鉴别和分析可在使甲酯丢失最小化的条件下进行。例如，业已描述了一种方法(O′Connor等，Anal Biochem 1985，148，79-86)，该方法描述了使用能够保护蛋白甲酯的条件的酸性2D-PAGE。但是，存在的许多识别PCNA的蛋白酶在中性至碱性pH有活性，并且相当大量的甲酯化有可能会在消化过程中丢失。
在完整细胞或提取物中，负责甲酯化的一种或多种酶可能有活性，可修饰由于自发水解而失去甲酯的残基。PCNA与负责甲酯化的酶的分离以及在支持水解的条件(例如7.0以上的pH)中温育可导致失去一个或多个甲酯。例如，可通过在样品处理和分析过程中保持稍微酸性的条件使甲酯的这种丢失最小化。
表I.多种蛋白的甲酯化状态的分析
印迹a 蛋白   Swissprot登录号   分子量(Mr) pI   鉴别出的肽   甲酯化肽b   序列覆盖c
i   埃兹蛋白(Ezrin)   P15311   69,225   5.95   16   0   32％
ii   驿蛋白(Stathmin)   P16949   17,161   5.77   16   7   62％
iii   钙网蛋白前体   P27797   48,112   4.29   7   0   33％
iv   无机焦磷酸酶   Q15181   32,639   5.54   20   0   75％
  v   翻译控制肿瘤蛋白   P13693   19583   4.84   8   0   70％
a：在图1A中标识蛋白斑点位置。
b：清楚显示出在天冬氨酸残基或谷氨酸残基上的+14质量位移的肽。
c：通过将鉴别出的氨基酸残基数除以蛋白中的总残基数计算序列覆盖。
表II：多种csPCNA衍生肽的甲酯化状态
肽序列a   观测的质荷比   电荷态   理论质量 峰面积   甲酯(％)b   得分c
  MoFEmAR   343.37   2   682.31   5.9×106   3.6   19
  IEmDEEGS   792.30   1   791.32   2.8×107   7.3   27
  IEDEEmGS   792.47   1   791.32   2.7×107   7.0   25
  VSDYEmMoK   451.9   2   900.39   8.1×106   11.4   46
  MoPSGEmFAR   463.20   2   923.42   1.4×107   2.5   50
  LSQTSNVDmK   503.96   2   1004.51   1.5×106   21.1   40
  CcaAGNEmDIITLR   639.44   2   1274.63   1.7×107   8.8   66
  FSASGEmLGNGNIK   655.11   2   1306.65   76×107   2.7   99
  AEDNADTLALVFEAPNQEmK   1045.93   2   2088.00   5.0×107   3.5   97
  AEmDNADTLALVFEAPNQEK   1046.01   2   2088.00   2.0×107   3.9   89
  AEDmNADTLALVFEAPNQEK   1045.31   2   2088.00   4.1×107   12.7   102
  AEDNADTLALVFEmAPNQEK   1045.69   2   2088.00   3.4×107   4.5   94
  LMoDmLDVEQLGIPEQEYSCoaVVK   1249.50   2   2494.20   9.5×107   10.3   78
  ATPLSSTVTLSMoSADVPLVVEmYK   1220.83   2   2437.27   1.35×107   8.3   95
  LSQTSNVDKEEEAVTIEMoNEmPVQLTFALR   1108.28   3   3320.64   3.43×109d   8.7   50
a：所示的肽修饰为氧化的甲硫氨酸(Mo)、脲甲基半胱氨酸(Cca)、甲酯化谷氨酸(Em)和甲酯化天冬氨酸(Dm)。
b：通过将甲酯化肽的峰面积除以甲酯化肽和未修饰肽的组合峰面积计算甲酯百分率。
c：MaScots得分报告为-10log(P)，其中P是匹配为随机事件的概率。
d：相比于LCQ Advantage使用LCQ DECA XP产生的数据。
表III：csPCNA上甲酯的氨基酸位置
  甲酯   残基   位置(1-261氨基酸)
  1   谷氨酸   3
  2   谷氨酸   85
  3   谷氨酸   93
  4   天冬氨酸   94
  5   谷氨酸   104
  6   谷氨酸   109
  7   谷氨酸   115
  8   天冬氨酸   120
  9   谷氨酸   132
  10   谷氨酸   143
  11   谷氨酸   174
  12   天冬氨酸   189
  13   谷氨酸   201
  14   天冬氨酸   238
  15   谷氨酸   255
  16   谷氨酸   259
。

Claims (22)

1.一种检测生物样品中的癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型的方法，所述方法包括：
在疑似含csPCNA同种型的样品中检测在csPCNA同种型的一个或多个氨基酸残基上含甲酯的翻译后修饰；并
通过比较csPCNA同种型和非恶性PCNA同种型上的甲酯水平确定csPCNA同种型的存在情况。
2.权利要求1的方法，其中所述生物样品是体液。
3.权利要求1的方法，其中所述体液选自血液、血浆、淋巴液、血清、胸膜液、脊髓液、唾液、痰、尿液、胃液、胰液、腹水、滑液、乳液和精液。
4.权利要求1的方法，其中所述生物样品是组织样品。
5.权利要求1的方法，其中所述组织选自乳腺、前列腺、肺、结肠、上皮、结缔组织、子宫颈、食道、脑、胸腺、甲状腺、胰腺、睾丸、卵巢、肠、膀胱、胃、软组织瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、癌、腺癌、胎盘、纤维性组织、胚细胞组织及其提取物。
6.权利要求1的方法，其中所述甲酯存在于天冬氨酸上。
7.权利要求1的方法，其中所述甲酯存在于谷氨酸上。
8.权利要求1的方法，其中所述甲酯存在于csPCNA同种型上的16个天冬氨酸残基或谷氨酸残基的一个或多个上。
9.权利要求8的方法，其中所述甲酯存在于16个天冬氨酸残基或谷氨酸残基的一个或多个上，所述16个天冬氨酸残基或谷氨酸残基对应于csPCNA同种型的氨基酸位置3、85、93、94、104、109、115、120、132、143、174、189、201、238、255和259。
10.权利要求8的方法，其中所述甲酯存在于16个天冬氨酸残基或谷氨酸残基的一个或多个上，所述16个天冬氨酸残基或谷氨酸残基对应于具有修饰的氨基酸残基的肽，所述肽选自：
MFEmAR；
IEmDEEGS；
IEDEEmGS；
VSDYEmMK；
MPSGEmFAR；
LSQTSNVDmK；
CAGNEmDIITLR；
FSASGEmLGNGNIK；
AEDNADTLALVFEAPNQEmK；
AEmDNADTLALVFEAPNQEK；
AEDmNADTLALVFEAPNQEK；
AEDNADTLALVFEmAPNQEK；
LMDmLDVEQLGIPEQEYSCVVK；
ATPLSSTVTLSMSADVPLVVEmYK；和
LSQTSNVDKEEEAVTIEMNEmPVQLTFALR，
其中Em代表甲酯化谷氨酸残基，Dm代表甲酯化天冬氨酸残基。
11.权利要求1的方法，其中所述csPCNA同种型的检测使用质谱分析进行。
12.权利要求11的方法，其中所述质谱分析是液相色谱(LC)质谱(MS)分析。
13.权利要求11的方法，其中与对应的未修饰肽相比，csPCNA衍生肽的质谱分析产生14Da的质量位移。
14.一种诊断或预后恶性肿瘤的方法，所述方法包括：
通过鉴别区分csPCNA同种型和非恶性PCNA(nmPCNA)同种型的csPCNA同种型的翻译后修饰状态检测癌症特异性增殖细胞核抗原(csPCNA)同种型；并
基于生物样品中的csPCNA的检测情况诊断恶性肿瘤。
15.权利要求14的方法，其中所述翻译后修饰是甲酯化。
16.权利要求15的方法，其中所述甲酯化存在于csPCNA同种型上的16个天冬氨酸残基或谷氨酸残基的一个或多个上。
17.权利要求14的方法，其中所述翻译后修饰包括测定csPCNA同种型和nmPCNA同种型的甲酯化水平。
18.权利要求16的方法，其中所述甲酯存在于16个天冬氨酸残基或谷氨酸残基的一个或多个上，所述16个天冬氨酸残基或谷氨酸残基对应于csPCNA同种型的氨基酸位置3、85、93、94、104、109、115、120、132、143、174、189、201、238、255和259。
19.一种修饰的增殖细胞核抗原(PCNA)肽，所述肽包含选自以下的氨基酸序列：
MFEmAR；
IEmDEEGS；
IEDEEmGS；
VSDYEmMK；
MPSGEmFAR；
LSQTSNVDmK；
CAGNEmDIITLR；
FSASGEmLGNGNIK；
AEDNADTLALVFEAPNQEmK；
AEmDNADTLALVFEAPNQEK；
AEDmNADTLALVFEAPNQEK；
AEDNADTLALVFEmAPNQEK；
LMDmLDVEQLGIPEQEYSCVVK；
ATPLSSTVTLSMSADVPLVVEmYK；和
LSQTSNVDKEEEAVTIEMNEmPVQLTFALR，
其中Em代表甲酯化谷氨酸残基，Dm代表甲酯化天冬氨酸残基。
20.权利要求19的修饰的肽，其中所述肽被翻译后修饰。
21.权利要求19的修饰的肽，其中所述肽经受蛋白酶消化步骤。
22.权利要求19的修饰的肽，其中所述肽是合成的。
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