KR20090020244A

KR20090020244A - 콕싸키바이러스 Ａ2４에 대한 항바이러스 활성을 가지는ｓｉＲＮＡ 및 이를 포함한 급성 출혈성 결막염 치료용조성물

Info

Publication number: KR20090020244A
Application number: KR1020070084841A
Authority: KR
Inventors: 이희란; 김유겸; 지영미; 차흥원; 전은정; 안정현; 서일선; 남영란; 강병학
Original assignee: 울산대학교 산학협력단
Priority date: 2007-08-23
Filing date: 2007-08-23
Publication date: 2009-02-26
Also published as: KR100941452B1

Abstract

본 발명은 콕싸키바이러스 A24에 대한 항바이러스 활성을 가지는 작은 간섭 RNA(small-interfering RNA, siRNA) 및 이를 포함한 급성 출혈성 결막염의 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 콕싸키바이러스 A24 유전체의 2C cre(cis-acting replication element)에 위치하는 siRNA, 이를 포함하는 항바이러스용 조성물 및 급성 출혈성 결막염의 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 siRNA는 표준형 콕싸키바이러스 A24 뿐 만 아니라 환자의 검체로부터 분리한 다양한 야생형 바이러스에 의한 세포독성을 현저히 저해하고 바이러스 복제를 억제함으로써 매우 우수한 항바이러스 활성을 나타내므로 항바이러스 제제, 특히 급성 출혈성 결막염의 치료제로서 매우 유용하다.

콕싸키바이러스 A24, 작은 간섭 RNA(siRNA), 항바이러스성, 급성 출혈성 결막염

Description

콕싸키바이러스 Ａ2４에 대한 항바이러스 활성을 가지는 ｓｉＲＮＡ 및 이를 포함한 급성 출혈성 결막염 치료용 조성물{siRNA having antiviral activity against coxsackievirus A24 and composition for treating Acute hemorrhagic conjunctivitis comprising the same }

본 발명은 콕싸키바이러스 A24에 대한 항바이러스 활성을 가지는 siRNA 및 이를 포함한 급성 출혈성 결막염의 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 콕싸키바이러스 A24 유전체의 2C cre(cis-acting replication element)에 위치하는 siRNA, 이를 포함하는 항바이러스용 조성물 및 급성 출혈성 결막염의 치료용 조성물에 관한 것이다.

콕싸키바이러스(Coxsakievirus, CV)는 피코나바이러스(Picornavirus)과에 속하는 인간 장내바이러스(human enterovirus)로서 중심에 단일 가닥 RNA가 있고 외피(envelope)가 없는 정이십면체 바이러스이다. 마우스 병변의 차이에 따라 콕싸키바이러스는 크게 A 형(A type)과 B 형(B type)으로 구분되며 중화시험에 의한 항 원성의 차이에 따라 A군은 다시 1-22 및 24형으로, B군은 1-6형으로 분류된다.

급성 출혈성 결막염(Acute hemorrhagic conjunctivitis, AHC)은 인간 장내바이러스 중 엔테로바이러스 70(Enterovirus 70) 및 콕싸키바이러스 A24가 주요 원인균으로 알려져 있다. 1969년 처음 가나에서 확인되었고 발생시기가 아폴로의 달 착륙 시기와 일치해서 일명 아폴로눈병이라고 불리운다. 8~48시간의 짧은 잠복기와 경과기간이 5~7일이 특징이다. 자각증상은 갑작스런 동통, 이물감, 눈부심, 다량의 눈물흘림이며 타각증상으로는 결막충혈, 눈꺼풀종창을 볼 수 있고 결막 부종도 나타난다. 환자의 25%에서는 열, 무력감, 전신근육통을 보이며 드물게는 하지가 마비되기도 한다. 급성 출혈성 결막염의 예방 백신이나 제제는 현재까지 개발된 바 없으며, 점안액 투여 등 대증적 안과 치료로 증상을 완화시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.

한편, RNA 간섭 (RNA interference, 이하 「RNAi」라 칭한다)은 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중사슬 RNA (이하, 「dsRNA」라 칭한다)를 세포 등에 도입하는 것에 의하여 표적유전자 mRNA의 분해를 유도하고 표적유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상이다. 이와 같이 RNAi는 표적유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 유전자치료 (gene therapy)의 방법으로서 상당한 관심을 모으고 있다.

최근, 긴 이중사슬 RNA 대신 21-25 뉴클레오티드의 짧은 dsRNA (이하, siRNA이라 함)를 포유동물 세포에 도입함으로써 포유동물 세포에서도 RNAi를 유도할 수 있음이 보고 되었다 (Elbashir, S. M. et al., Nature 411, 494-498, 2001; Caplen, N. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9742-9747, 2001). 또한, 화학적으로 합성된 siRNA와 shRNA (short hairpin RNA)를 발현하는 벡터들이 시험관 내 (in vitro) 및 생체 내 (in vivo)에서 RNAi를 유도할 수 있다는 것이 입증되었다 (Bernstein, E. et al., Rna, 7:1509-1521, 2001; Hasuwa, H. et al., FEBS Lett, 532:227-230, 2002). 더욱이, 최근 연구에서는 RNAi가 효과적인 항바이러스 제제의 개발을 위한 신규한 기반 기술로서 제시되었다 (Dave, R. S. et al., Rev Med Virol, 13:373-385, 2003; tevenson, M., Nat Rev Immunol, 3:851-858, 2003). 이러한 연구에서는 siRNA가 다양한 실험 조건에서 간염 바이러스 (hepatitis virus), 폴리오바이러스 (poliovirus) 또는 인플루엔자 바이러스 (influenza virus)와 같은 다양한 바이러스들의 복제를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다. 또한, 콕사키바이러스 B3 (coxsackievirus B3; CVB3)를 표적으로 하는 siRNA가 심근세포 등 각종 허용 (permissive) 세포에서 극적인 항바이러스 효과를 나타냄도 확인되었다(Ahn J. et al., J Virol, 79:2151-2159, 2005; Merl, S. et al., Circulation, 111:1583-1592, 2005; Schubert, S. et al., J Mol Biol, 346:457-465, 2005; Yuan).

이에 본 발명자들은 콕싸키바이러스 A24 유래 급성 출혈성 결막염의 치료제 개발을 위하여 연구하던 중 콕싸키바이러스 A24 유전체 내 2C CRE(cis-acting replication element) 영역에 대한 siRNA를 제조(CVA24CRE)하여 항바이러스성을 검증한 결과 상기 siRNA가 표준형 콕싸키바이러스 A24 뿐만 아니라 환자 검체로부터 분리한 다양한 야생형 바이러스 균주에 대해서도 현저한 항바이러스 활성을 가지고 있으며 바이러스 특이 단백 및 자손 바이러스의 생산을 저해하는 활성을 가지고 있으므로 급성 출혈성 결막염의 치료제로서 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 콕싸키바이러스 A24 유전체에 대한 siRNA 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콕싸키바이러스 A24 유전체에 대한 siRNA를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 siRNA를 포함하는 콕싸이바이러스에 대한 항바이러스 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 siRNA를 포함하는 급성 출혈성 결막염의 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 콕싸키바이러스 A24에 의한 세포독성을 현저히 저해하고 바이러스 복제를 억제함으로써 매우 우수한 항바이러스 활성을 가진 신규한 siRNA를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 siRNA의 항바이러스 활성을 표준형 바이러스 및 야생형 바이러스(환자의 검체로부터 분리된 것임)를 대상으로 조사한 결과(실시예 <2-3> 및 <2-4> 참조), 매우 현저하게 상기 바이러스에 대한 세포독성을 억제함을 확인할 수 있었다(도 2, 도 3 및 표 1 참조).

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명의 siRNA가 바이러스 특이 단백의 생산을 저해하고(도 3 참조), 자손 바이러스의 생산을 저해함을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

나아가, 본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명의 표준형 바이러스 및 야생형 바이러스에서 본 발명의 siRNA의 표적 부위에 대한 게놈 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 변이형 및 빈번한 돌연변이형이 출현하는 CVA24 바이러스 게놈 부위 중 유전정보가 매우 보존적인 부위를 표적하므로써 그 효과가 극대화될 수 있는 특성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다(도 5 참조).

또한, 본 발명의 siRNA가 공격하는 게놈 부위의 RNA 이차구조를 분석한 결 과, 커다란 루프가 내제되어 있어 이 부분의 자유 에너지(free energy)가 상당히 높을 것으로 예상되었으며, 이러한 표적부위는 본 발명의 CVA24CRE siRNA에 의한 접근이 용이할 것으로 추정되었고 결과적으로 항바이러스 활성이 극대화될 수 있음을 예상할 수 있었다(도 6 참조).

본 발명에서 용어, "siRNA"는 표적 유전자의 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNA 간섭 (RNAi: RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 이중사슬 RNA를 의미한다.

본 발명에 따른 siRNA 말단 구조는 표적유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활 (blunt) 말단 혹은 점착 (cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA (예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA 분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 siRNA는 19개의 염기를 갖는 이중가닥 RNA로서, 콕싸키바이러스 A24 유전체의 2C cre (cis-acting replication element)에 위치하며(도 1 참조), 하기와 같은 염기서열을 갖는다.

5'-AGAGCAAACACCGUAUUGA-3'(서열번호 1)

본 발명의 siRNA는 이의 활성을 저하시키지 않는 변화를 갖는, 즉 기능적 등가물인, 하나 이상의 치환, 삽입, 결실 및 이들의 조합을 갖는 변형체를 포함한다. 이러한 변형체는 상기한 siRNA 서열(서열번호 1)과 70% 이상의 상동성을 나타낼 수 있으며, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타낸다. 이러한 상동성은 당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Align 또는 BLAST 알고리즘 (Altschul, S. F. J. Mol. Biol. 219, 555-565, 1991; Henikoff, S. and Henikoff, J. G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919, 1992)을 이용하여 폴리뉴클레오타이드의 서열을 표적 폴리뉴클레오타이드의 상응하는 부분과 비교하여 용이하게 결정할 수 있다.

siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당 업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법(Sui G et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520, 2002), 시험관 내(in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법(Brummelkamp TR et al., Science 296:550-553, 2002), 시험관 내(in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중-가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법(Paul CP et al., Nature Biotechnology 20:505-508, 2002), siRNA 발현 플 라스미드나 바이러스성 벡터의 세포내 전달을 통한 발현법 (Lee NS et al., Nature Biotechnology 20:500-505, 2002) 및 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법(Castanotto D et al., RNA 8:1454-1460, 2002) 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. siRNA를 제조하는 방법의 결정은 실험의 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.

또한 본 발명에 따른 siRNA를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 예를 들어 염색체, 에피솜 및 유도된 바이러스와 같은 수많은 발현 시스템이 사용될 수 있다. 보다 구체적으로 사용할 수 있는 재조합 벡터로는 세균성 플라즈미드, 트랜스포숀, 효모 에피솜, 삽입 인자, 효모 염색체 인자, 바큘로바이러스와 같은 바이러스, SV40과 같은 유두종바이러스, 백신 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병 바이러스, 레트로바이러스로부터 유래한 것이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 재조합 벡터는 또한 코스미드 또는 파지미드 유도체일 수 있다.

siRNA 서열은 예를 들어 문헌(Molecular cloning: A laboratory manual, Sambrook 등, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)에 기재된 바와 같이 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 익히 공지되어 있는 방법들에 의해 재조합 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 재조합 벡터는 본 발명의 siRNA 발현의 조절을 제어하는 염기서열을 포 함할 수 있고, 이들 서열은 사용된 숙주 세포에 따라서 선택된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포에 재조합 벡터의 도입은 인산칼슘를 이용한 형질감염(Graham, F.L. 등, Virology, 52:456(1973)), DEAE 덱스트란에 의한 형질감염, 미세주사에 의한 형질감염(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 양이온성 지질에 의한 형질감염(Wong, T.K. 등, Gene, 10:87(1980)), 전기천공법(Neumann E. 등, EMBO J., 1:841(1982)), 형질도입 또는 트랜스펙션과 같이 문헌(Basic methods in molecular biology, Davis 등, 1986 및 Molecular cloning: A laboratory manual, Davis 등, 1986)에 기재된 바와 같이 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 익히 공지되어 있는 방법들에 따라 제조될 수 있다.

숙주 세포는 예를 들어 스트렙토코커스(streptococci), 스타필로코커스( staphylococci), 대장균(E. coli) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 세균 세포, 효모 세포 및 아스페르질러스(Aspergillus), 스트렙토마이세스( Streptomyces)의 세포와 같은 진균류의 세포, 드로소필리아(Drosophilia) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9 세포와 같은 곤충 세포 및 치료 대상이 되는 포유 동물의 세포 또는 식물 세포가 될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 상기 siRNA을 함유하는 항바이러스 조성물을 제공한다. 바 람직하게는 본 발명에 따른 상기 항바이러스 조성물은 콕싸키바이러스 A24에 의해 유발되는 급성 출혈성 결막염 또는 급성 이완성 마비(acute flaccid paralysis)(Coxsackie virus A24 infection presenting as acute flaccid paralysis. Chaves SS et al, Lancet 357:605, 2001) 치료용 조성물로서 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 siRNA와 약학적으로 허용되는 담체를 균일 또는 균질하게 혼합하여 제조된다. 수성 담체로는 물, 식염수 및 약학적으로 허용되는 완충액이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니며, 또 바람직한 비-수성 담체로는 광유 및 중성 오일과 이들의 혼합물이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 조성물은 상술한 담체 외에도 부형제 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 그 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트를 들 수 있다. 이외에 본 발명의 조성물은 활성성분의 안정화, 삼투압조절 및 pH 조절 등의 목적으로 적절한 첨가제를 함유할 수도 있다. 상기 첨가제에는 안정화제, 삼투압조절제, pH 조절제, 습윤제, 유화제, 분산제, 방부제 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물의 제형은 예를 들어 고형상, 현탁상 또는 액상일 수 있으 나 바람직하게는 주사투여가 가능한 현탁상 또는 액상 제제 또는 투여 전에 적당한 용매에 녹여 사용하는 주사용 분말 제제이다. 이들 제제는 본 발명이 속한 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여경로로는 핵산을 시험관 내 및 생체 내의 세포로 도입시키는 종래 알려진 방법에 의해 투여될 수 있으며, 통상적인 방법으로는 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 전기천공 및 미세주입법, 바이러스법, 및 양이온성 리포좀을 사용하는 방법 등이 있다(Graham, F. L. et al., Virol. 52, 456, 1973; McCutchan, J. H. et al., J. Natl. Cancer Inst. 41, 351, 1968; Chu, G. et al., Nucl. Acids Res. 15, 1311, 1987; Fraley, R. et al., J. Biol. Chem. 255, 10431, 1980; Capecchi, M. R. et al., Cell, 22, 479, 1980; 및 Felgner, P. L. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 7413, 1987). 바람직하게는 양이온성 리포좀을 사용하며, 상업적으로 구입하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물의 투여경로로는 경구, 국소, 피하, 경피, 진피하, 근육내, 복막내, 방광내, 관절내, 동맥내, 정맥내, 피내, 두개내, 병소내, 안내, 폐내, 척수강내 및 전립선내 투여가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 조성물은 비 흡입, 폐 흡입, 피부에의 압인을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

사람의 경우, 활성 화합물의 통상적인 1일 투여량은 1 내지 10 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 1 내지 5 ㎎/㎏ 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투 여할 수 있다. 그러나 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 투여 시간, 환자의 연령, 성별 및 체중, 배설 속도, 질환의 중증도, 반응 감응성 등의 여러 요인들에 의해 다양하게 변할 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 siRNA는 표준형 콕싸키바이러스 A24 뿐 만 아니라 환자의 검체로부터 분리한 다양한 야생형 바이러스에 의한 세포독성을 현저히 저해하고 바이러스 복제를 억제함으로써 매우 우수한 항바이러스 활성을 나타내므로 항바이러스 제제, 특히 급성 출혈성 결막염의 치료제로서 매우 유용하다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에 만 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

siRNA의 합성

서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 이중 가닥 siRNA(이하 CVA24CRE siRNA라 함)를 DHARMACON사(미국, www.dharmacon.com)에 의뢰하여 합성하였다(도 1).

<실시예 2>

본 발명에 따른 siRNA의 항바이러스 활성

본 발명에 따른 CVA24CRE siRNA의 콕싸키바이러스 A24 바이러스 균주에 대한 항바이러스 활성을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

<2-1> 세포 배양

HeLa 세포를 미국세포주은행(ATCC)에서 구입하여, 10% 우태아혈청, L-글루타민(2mM), 페니실린(100IU/㎖) 및 스트렙토마이신(50㎍/㎖)을 함유하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배양 배지에서 37℃의 5% CO₂ 배양기를 이용하여 배양하였다.

<2-2> 바이러스의 적정

표준형 콕싸키바이러스 A24 바이러스 균주인 CVA24 및 야생형 바이러스 균주(WT1, WT2, WT3, WT4, WT5 및 WT6)를 문헌(Ahn, J. et al., Intervirology, 46: 245-251, 2003)에 기재된 방법에 따라 플라크 분석법(plaque assay) 또는 TCID₅₀ 시험법으로 적정하였다. 상기 표준형 콕싸키바이러스 A24 바이러스 균주인 CVA24는 미국세포주은행 (ATCC; VR-583)에서 구입하였고, 야생형 바이러스 균주 WT3은 화학연구소에서 입수하였으며, 나머지 WT 바이러스들은 보건원에서 입수하였다.

<2-3> 표준형 바이러스 감염에 의한 세포독성 저해효과

표준형 바이러스 감염에 대한 본 발명의 siRNA의 세포독성 저해효과는 HeLa세포주를 이용하여 확인하였다. 즉, 상기 HeLa 세포주에 본 발명의 siRNA 전처리하고 표준형 바이러스를 감염시킨 다음 위상차 현미경을 이용하여 HeLa 세포주의 변화를 관찰함으로써 세포 독성정도를 확인하였다. 보다 구체적인 방법은 다음과 같다.

상기 <2-1>에서 배양된 세포 3×10⁴개/웰 및 무혈청 Opti-MEM 배지 (인비트로젠, 미국) 80㎕를 96-웰 배양판의 각 웰에 가한 후, 100 nM의 CVA24CRE siRNA 및 올리고펙타민 시약(oliofectamine, 인비트로젠, 미국) 20㎕을 가하였다. 4시간 후, <2-1>의 세포 배양용 배지 50㎕를 첨가하고 세포를 8시간 동안 더 배양한 다음, 세포 당 1 MOI의 <2-2>에서 준비된 표준형 바이러스를 처리하여 6시간 동안 감염시켰다(실험군). 또한, siRNA로 전 처리하지 않은 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 바이러스를 감염시킨 세포(비교군) 및 siRNA 전 처리 및 바이러스 감염을 수행하지 않은 세포(대조군)를 준비하였다. 세포를 위상차 현미경을 사용하여 200× 의 배율로 관찰하였다.

실험 결과, 본 발명의 CVA24CRE siRNA가 처리되지 않은 비교군 세포는 바이러스 감염 후 수 시간이 지나면 본래의 형태를 잃어버리고 동그란 모양을 하면서 서서히 배양판으로부터 분리되기 시작하였다. 반면, 본 발명의 siRNA로 전처리된 실험군의 경우에는 세포의 형태가 정상정인 상태로 그대로 유지되는 것으로 나타났다(도 2).

<2-4> 야생형 바이러스 감염에 의한 세포독성 저해효과

야생형형 바이러스 감염에 대한 본 발명의 siRNA의 세포독성 저해효과를 상기 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 실험을 수행하되, HeLa 세포에 본 발명의 CVA24CRE siRNA를 전처리한 후 다양한 야생형의 CVA24로 감염시킨 실험군의 항바이러스 활성을 조사하였다. 야생형 CVA24로는 WT1, WT2, WT3, WT4, WT5 및 WT6를 사용하였다. 이들은 모두 아폴로눈병으로 병원을 찾은 환자 검체에서 추출한 것으로 모두 CVA24로 확인된 바이러스들이다. 상기 야생형 바이러스들은 표준형과 유사하게 생산되었고 역가도 확인하였다 (표 1).

실험에 사용된 야생형 바이러스

타입	균주	명칭	바이러스 역가	비고
Reference	CXA24-CG	A24r	no virus available	전체 서열 입수가능
표준형 (Variant)	CVA24-DN-19	CVA24	1.4× 10⁶ PFU/ml	ATCC(VR-583), 부분 서열
야생형 (Clinical isolates)	W1-2002-8199	WT1	1× 10⁷ PFU/ml	보건원(#8199)
	W2-2003-7920	WT2	1× 10⁷ PFU/ml	보건원(#7920)
	W3-2003-HG	WT3	1× 10⁷ PFU/ml	화학연구소(#HG)
	W4-2006-268	WT4	2× 10⁷ PFU/ml	보건원(#268)
	W5-2006-271	WT5	4× 10⁷PFU/ml	보건원(#271)
	W6-2006-272	WT6	1× 10⁷ PFU/ml	보건원(#272)

실험 결과, 본 발명의 CVA24CRE siRNA는 야생형 바이러스에 대해서도 동일한 항바이러스 활성을 나타냈다 (표 2).

다양한 야생형 CVA24에 대한 siRNA의 세포독성 저해효과

	CVA24	WT1	WT2	WT3	WT4	WT5	WT6
세포독성 저해효과	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++

+++: 완전방어 (CVA24 즉 표준형과 같은 정도의 저해효과)

<2-5> 바이러스 특이 단백 생산 저해효과

CVA24CRE siRNA의 항바이러스 활성에 의한 바이러스 특이 단백질의 생산량 저해 정도를 알아보기 위하여, VP1 바이러스 단백질의 생산정도를 VP1 항체 (Chemicon, Temecula, CA)를 이용한 면역세포화학법으로 분석하였다. 면역세포화학법은 장내바이러스 특이 VP1에 대한 항체와 FITC가 표지(labeling)된 이차항체 (BD Bioscience, Temecula, CA)를 이용하여 바이러스 감염의 유무에 차이가 있는 세포에서 나타나는 세포내 변화를 형광현미경으로 관찰할 수 있도록 하는 방법이다. 면역세포화학법를 수행하기 위해 배양된 세포를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 사용하여 고정시킨 후 0.5% Triton X-100에서 5분 처리, 1% 블럭킹 용액(blocking solution)에서 1시간 처리 후 일차항체로 4℃에서 12시간 이상 처리하였다. 이후 이차항체로 1시간 처리 후 광학 현미경(LM, Leica) 및 형광현미경 (FM, Leica) 하에서 ×200의 배율로 FITC 발광정도 (FM에서 초록색으로 확인)를 관찰하였다.

실험 결과, CVA24CRE siRNA를 전처리하지 않은 HeLa 세포 즉 비교군 경우 CVA24 감염에 의해 VP1 단백질 (FM에서 초록색으로 염색)이 다량 생산되었음을 확인할 수 있었다. 반면, CVA24CRE siRNA를 전처리한 HeLa 세포의 경우에는 VP1 단백질의 생산이 현저하게 감소되었음을 확인할 수 있었다(도 3).

<2-6> 자손 바이러스 생산능 저해효과

CVA24CRE siRNA의 항바이러스 활성에 의한 자손 바이러스의 생산량 변화를 알아보기 위하여, 표준 바이러스 균주 CVA24를 사용하고, 바이러스를 1시간 동안 감염시킨 것을 제외하고는 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 HeLa 세포를 배양하였다. 그 후, 웰을 여러 번 세척하여 바이러스를 제거한 다음, 새 배지를 첨가하여 6 또는 10시간 더 배양하고, 배지 및 세포를 회수하였다. 자손 바이러스의 생산량을 공지된 방법(Ahn, J. et al., Intervirology, 46: 245-251, 2003)에 따라 측정하였다.

실험 결과, 본 발명의 CVA24CRE siRNA가 CVB24 바이러스의 복제를 방해하여 바이러스의 증폭을 현저히 억제함을 알 수 있다(도 4).

<2-7> 콕싸키바이러스 A24 바이러스의 CRE 영역의 염기서열 분석 및 RNA 이차구조 예측

바이러스 염기서열 분석은 공지된 방법에 따라(Lee HS, et al, J Gen Virol, 88:2003-2012, 2007) 표준형 콕싸키바이러스 A24 바이러스 균주인 CVA24 및 야생형 바이러스 균주(WT1, WT2, WT3, WT4, WT5 및 WT6)로 부터 총 RNA를 수득한 후 RT-PCR을 수행하고 수득한 PCR 산물을 분석함으로써 수행하였다.

실험 결과, CVA24CRE siRNA가 표준형 바이러스를 비롯하여 유전자 염기서열이 매우 다양한 것으로 예측되는 야생형 변이형들에서도 확연한 세포독성 저해능 즉 항바이러스 활성이 유도될 수 있는 것은 CVA24CRE가 CVA24의 증식에 필수적인 게놈 부위 즉 유전정보가 100% 잘 보존되어있는 부위를 공격하기 때문임을 게놈 염기서열 분석 결과로 부터 확인할 수 있었다(도 5).

나아가, 본 발명의 CVA24CRE siRNA가 공격하는 게놈 부위의 RNA 이차구조를 Mfold web server (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/ mfold-simple. html)를 이용하여 분석하였다

그 결과, CVA24CRE siRNA의 표적부위에 커다란 루프가 내제되어 있어 이 부분의 자유 에너지(free energy)가 상당히 높을 것으로 예상되었다. 따라서 이러한 표적부위는 CVA24CRE RNAi에 의한 접근이 용이할 것으로 기대되었으며 결과적으로 항바이러스 활성이 극대화될 수 있음을 예상할 수 있었다(도 6).

도 1은 콕싸키바이러스 A24 유전체의 전체 구조 및 본 발명에 다른 CVA24CRE siRNA의 상보적 위치를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 CVA24CRE siRNA를 전처리한 후 표준형 콕싸키바이러스 A24 균주로 감염시킨 세포(실험군), CVA24CRE siRNA 전처리 없이 바이러스만 감염시킨 세포(비교군) 및 CVA24CRE siRNA 및 바이러스를 모두 처리하지 않은 세포(대조군)의 세포독성도를 위상차 현미경을 이용하여 관찰한 결과이다.

도 3은 본 발명에 따른 CVA24CRE siRNA를 전처리한 후 표준형 콕싸키바이러스 A24 균주로 감염시킨 세포(실험군) 및 CVA24CRE siRNA 전처리 없이 바이러스만 감염시킨 세포(비교군)에서 VP1 바이러스 단백질의 생성 정도를 광학 현미경(LM) 및 형광 현미경(FM)을 이용하여 관찰한 사진이다.

도 4는 본 발명에 따른 CVA24CRE siRNA를 전처리한 후 표준형 콕싸키바이러스 A24 균주로 감염시킨 세포(실험군) 및 CVA24CRE siRNA 전처리 없이 바이러스만 감염시킨 세포(비교군)에서 자손 바이러스의 생성 정도를 비교한 그래프이다.

도 5는 콕싸키바이러스 A24의 표준형 바이러스 및 야생형 바이러스에서 본 발명에 따른 CVA24CRE siRNA의 표적 부위에 대한 게놈 염기서열을 분석한 결과이다.

도 6은 본 발명에 따른 CVA24CRE siRNA가 공격하는 게놈 부위의 RNA 이차구조를 분석한 결과이다.

<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> siRNA having antiviral activity against coxsackievirus A24 and composition for treating Acute hemorrhagic conjunctivitis comprising the same <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 1 agagcaaaca ccguauuga 19

Claims

서열번호 1로 표시되는 siRNA(small interfering RNA).
제1항의 siRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 콕싸키바이러스 A24(coxsackievirus A24)에 대한 항바이러스 조성물.
제1항의 siRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 급성 출혈성 결막염의 치료용 약학적 조성물.
제1항의 siRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 급성 이완성 마비의 치료용 약학적 조성물.