KR20090016719A - 재조합 바이러스 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 재조합 바이러스 백신에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 재조합 바이러스 벡터 및 상기 재조합 바이러스 벡터에 의해 생체내에서 증진된 면역 반응을 향상시킬 수 있는 특정 화합물을 포함하는 조합 생성물을 제공한다.
재조합 바이러스 백신, 면역 반응, 폭스바이러스.

Description

재조합 바이러스 백신 {Recombinant Viral Vaccine}
본 발명은 신규 재조합 바이러스 백신을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 재조합 바이러스 벡터 및 상기 재조합 바이러스 벡터에 의해 생체내에서 증진된 면역 반응을 향상시킬 수 있는 특정 화합물을 포함하는 조합 생성물을 제공한다.
면역 반응을 유도할 수 있어서 이에 따라 감염에 대해 동물을 보호하는 항원을 동물계에 도입하는 것을 포함하는 전통적인 백신화 기술은 여러해 동안 공지되어 왔다. 이러한 기술은 생 백신 및 불활성화된 백신 둘 다의 개발을 포함하였다. 생 백신은 전형적으로 병원성 형태의 감염성 물질에 대해 지시되는 면역 반응을 개시할 수 있는 비병원성 형태의 약화된 감염성 물질이다. 최근 몇해 동안, 대상 외래 항원이 벡터로부터 코딩되어 발현되는 것인 재조합 백신, 특히 재조합 생 백신의 개발에 있어서 진전이 있어 왔다. 이들 중에서, 재조합 바이러스계 벡터가 매우 유망한 것으로 나타났으며 신규 백신의 개발에 있어서 중요한 역할을 수행한다. 외래 병원체 또는 종양 조직으로부터 단백질을 발현시키며 생체내에서 이들 항원에 대해 특정한 면역학적 반응을 유도하는 능력에 대해 다수의 바이러스들이 연구되어 왔다. 일반적으로, 이들 유전자계 백신은 강력한 체액성 및 세포성 면역 반응을 자극할 수 있으며 바이러스 벡터는 항원-코딩 유전자의 전달 및 항원 제시의 촉진 및 증진 둘 다에 있어서 효과적인 전략이 될 수 있다. 백신 운반자로서 이용되기 위해서는, 이상적인 바이러스 벡터는 안전해야 하며, 면역계에 대해 필요한 병원체-특이적 항원을 효과적으로 제시할 수 있어야 한다. 또한, 관련된 특이적 면역 반응을 증진시키기 위해서는 재투여가 가능하도록 고유한 면역원성을 낮게 나타내야 한다. 추가로, 벡터계는 대규모 기반으로 생산될 수 있도록 하는 기준을 충족시켜야 한다. 따라서 최근까지 여러 바이러스 백신 벡터들이 출시되었으나, 이들은 모두 제안된 용도에 따라 상대적인 이점 및 한계를 가지며, 지금까지 이들 중 어느 것도 이상적인 백신 운반자인 것으로 입증되지 못하였다.
재조합 폭스바이러스 벡터는 바이러스 백신 벡터의 예이다. 상기 벡터는 체액성 및 세포성 면역 반응 둘 다의 유도자로서 사용되어 왔으며, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 둘 다 유도하므로, 특히 암 또는 항바이러스 면역요법에서 전달계로서 선택된다 (문헌 [Arlen et al., 2005, Semin Oncol., 32, 549-555] 또는 [Essajee and Kaufman, 2004, Expert Opin Biol Ther., 4, 575-588] 참조). 폭스바이러스 백신화는 다른 백신화 요법에 비해 이점이 있지만 (예를 들어 문헌 [Souza et al, 2005, Braz J Med Biol Res, 38, 509-522] 참조), 그럼에도 불구하고 이 바이러스 벡터에 맞게 개질되어 상기 백신에 의해 유도된 면역 반응을 증가시키는 역할을 하는 애쥬번트 화합물을 개발하는 것이 요망되는 실정이다.
최근 몇년 동안에는 면역계의 특정 주요 측면을 자극함으로써 작용하는 신규 약물 화합물을 발견하기 위해 많은 노력이 있어 왔으며 상당한 성공을 거두었다. 면역 반응 변경자 (IRM) 또는 애쥬번트라고 언급되는 이들 화합물은 톨형(Toll-like) 수용체 (TLR)를 통한 기본적인 면역계 기전에 의해 작용해서 각종의 중요한 사이토카인 생합성 (예, 인터페론, 인터루킨, 종양 괴사 인자 등)을 유도하는 것으로 보인다. 이러한 화합물은 여러 단핵구/대식세포-유래의 사이토카인의 급속한 방출을 자극하는 것으로 나타났으며, 또한 B 세포를 자극해서 IRM 화합물의 항바이러스 및 항종양 활성에서 중요한 역할을 하는 항체를 분비할 수 있다. IRM에 의해 유도된 주된 면역자극 반응의 한가지는 인터페론 IFN-알파 생산의 유도이며, 이는 나타낸 급성 항바이러스 및 항종양 활성에서 매우 중요한 것으로 여겨진다. 게다가, 예를 들어, 종양 괴사 인자 (TNF), IL-1 및 IL-6과 같은 다른 사이토카인의 상향조절은 또한 잠재적으로 유익한 활성을 가지며 이들 화합물의 항바이러스 및 항종양 특성에 기여하는 것으로 여겨진다. 면역 반응 변경자 (IRM)는 바이러스 질환 (예, 인간 파필로마 바이러스, 간염, 헤르페스), 신생물 (예, 기저 세포 암종, 편평세포 암종, 광선각화증, 흑색종), 및 TH2-매개 질환 (예, 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염)를 비롯하여 폭넓은 다양한 질환 및 증상을 치료하는데 유용한 것으로 개시되어 왔다.
이러한 면역 반응 변경자 (IRM)의 예로는 CpG 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, US 6,194,388; US 2006094683; WO 2004039829 참조), 리포폴리사카라이드, 폴리이노스산:폴리시티딜산(polyinosic:polycytidylic acid) 복합체 [Kadowaki, et al., 2001, J. Immunol. 166, 2291-2295], 및 수지상 세포 및/또는 단핵구/대식세포로부터 사이토카인 생산을 유도하는 것으로 알려진 폴리펩티드 및 단백질을 들 수 있다. 이러한 면역 반응 변경자 (IRM)의 다른 예로는 유기 소분자, 예를 들면 이미다조퀴놀린아민, 이미다조피리딘 아민, 6,7-융합 시클로알킬이미다조피리딘 아 민, 이미다조나프티리딘 아민, 옥사졸로퀴놀린 아민, 티아졸로퀴놀린 아민 및 1,2-가교 이미다조퀴놀린 아민 (예를 들어 US 4,689,338; US 5,389,640; US 6,110,929; 및 US 6,331,539 참조)이 있다.
특히, 이미다조퀴놀린아민은 시험관내 및 생체내에서 인터페론-알파 (IFN), 종양 괴사 인자-알파 (TNF), 인터루킨 IL-1 베타, IL-6, IL-1 알파, IL-1 수용체 길항제, IL-10, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 과립구 CSF (G-CSF), 및 대식세포 염증성 단백질-1 알파의 유도자로서 강한 효능이 입증되었으며 [Gibson et al., 1995, J Interferon Cytokine Res., 15, 537-545; Tomai et al., 1995, Antiviral Res. , 28, 253-264; Testerman et al., 1995, J Leukoc Biol., 58, 365-372], 항바이러스, 항증식 및 항종양 활성을 포함하는 다양한 생물학적 기능을 유발하는 것으로 나타났다 (검토를 위해서는 문헌 [Syed, 2001, Expert Opin Pharmacother., 2, 877-882] 또는 [Li et al, 2005, J Drugs Dermatol., 4, 708-717]을 참조한다). 보다 특히, 특허 출원 WO 93/20847의 발명자들은 이미다조퀴놀린아민이 특정 항원, 예를 들면 생 바이러스 및 박테리아 면역원, 종양-유래, 원생동물, 생물체-유래, 진균 및 박테리아 면역원, 톡소이드, 독소, 폴리사카라이드, 단백질, 당단백질, 펩티드 등에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있었음을 밝혀냈다 (이들 항원이 상기 화합물 목록과 공동 투여되는 경우). 이미다조퀴놀린아민 화합물의 항바이러스 활성은 다양한 바이러스, 특히 폭스바이러스 [Bikowski, 2004, Cutis., 73, 202-206; US 20050048072]에 대해 추가로 입증되었으며, 상기 화합물의 임상적 효능은 생식기 혹 [Scheinfeld and Lehman, 2006, Dermatol Online J., 12, 5], 음부 헤르페스 [Miller et al, 2002, Int Immunopharmacol., 2, 443-451] 및 전염성 연속종 [Stulberg and Galbraith Hutchinson, 2003, Am. Fam. Physician, 67, 1233-1240]에 대하여 입증되었다.
플라스미드 DNA 벡터가 생체내에서 동물 세포를 직접 형질감염시킬 수 있었다는 1990년대 초기의 관찰 후, 상당한 연구 노력이 기울여져 항원성 펩티드를 코딩하는 DNA를 동물에 직접 도입함으로써 면역 반응을 유도하는 DNA 플라스미드를 사용하는 것으로 기초로 하는 백신화 기술이 개발되었다. 본 발명에서는 DNA 백신화로서 널리 언급되는 이러한 기술을 이용해서 다수의 질환 모델에서 보호적 면역 반응을 유도하였다. 보다 최근에는, 이미다조퀴놀린아민이 DNA 백신화 (WO 02/24225), 특히 암 면역요법 [WO 2006/042254; Smorlesi et al, 2005, Gene Therapy, 12, 1324-1332]에서 애쥬번트로서 제안되었다. DNA 백신에 대한 검토를 위해서는, 문헌 [Reyes-Sandoval and Ertl, 2001 (Current Molecular Medicine, 1, 217-243)]을 참조한다.
본 발명은 생체내에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열, 특히 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 재조합 바이러스 백신에 대한 개선에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로 하나 이상의 항원을 발현시키는 하나 이상의 재조합 바이러스 벡터 및 하나 이상의 애쥬번트를 함유하는 재조합 바이러스 백신에 관한 것이며, 상기 애쥬번트는 상기 항원에 대해 부여된 면역성을 애쥬번트가 없는 동일한 재조합 바이러스 백신에 비해 현저하게 증가시킬 수 있으며 이러한 유형의 백신에 대해 완전히 적합하다. 추가로 본 발명은 이와 관련된 백신화 방법에 관한 것이다.
놀랍게도 본 출원인은 특정 이미다조퀴놀린아민 화합물이 강한 항바이러스 효능을 제공하면서, 재조합 바이러스 벡터에 의해 코딩된 항원에 대하여 재조합 바이러스 백신, 보다 특히는 재조합 폭스바이러스 벡터 기재의 백신에 의해 증진된 면역 반응을 향상시킬 수 있다는 사실을 밝혀냈으며, 이는 예상치 못한 것이었다.
따라서 본 발명의 주제물질은 (i) 생체내에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열, 특히 항원을 코딩하는 이종 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 하나 이상의 재조합 바이러스 벡터 및 (ii) 하나 이상의 1H-이미다조 [4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 함유하는 재조합 바이러스 백신이다.
본 발명의 한 실시양태에 따라, 상기 1H-이미다조 [4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체는 상기 재조합 바이러스 백신이 투여되는 환자에서 상기 항원에 대한 면역 반응을 강화한다.
전체 출원서 전반에 걸쳐 사용되는 바, "하나(a)" 및 "하나(an)"라는 용어는 문맥상 달리 명확하게 명시되지 않는 한, "적어도 하나," "적어도 제1의," "하나 이상의" 또는 "복수개의" 관련 화합물 또는 단계를 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들어, "하나의 세포"라는 용어는 복수개 세포의 혼합물을 비롯한, 복수개의 세포를 포함한다. 보다 특히, "하나 이상의" 또는 "한가지 이상의"는 구성원이 하나 또는 하나 초과임을 의미하며, 하나, 둘 또는 셋이 특히 바람직하다.
본원에서 사용되는 경우 언제든지 "및/또는"이라는 용어는 "및," "또는," 및 "상기 용어와 관련된 요소들의 모든 또는 임의의 다른 조합"을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 주어진 값 또는 범위의 20％ 이내, 바람직하게 10％ 이내, 및 더욱 바람직하게 5％ 이내인 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "포함하는," "함유하는"이라는 용어는 생성물, 조성물 및 방법을 정의하는데 사용되는 경우, 이들 생성물, 조성물 및 방법이 관련 화합물 또는 단계를 포함하되, 기타의 것들을 제외시키지는 않는다는 것을 의미하기 위한 것이다.
용어 "환자"는 척추동물, 특히 포유동물 종의 구성원을 지칭하며, 사육 동물, 스포츠 동물, 인간을 비롯한 영장류를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 용어 "환자"는 어떤 식으로든지 특별한 질환 상태로 한정되지 않으며, 대상 질환이 이미 발병한 환자 및 질환에 걸리지 않은 환자를 둘 다 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 예방 및/또는 치료를 포함한다. 따라서, 본 발명의 재조합 바이러스 백신은 치료 용도로 한정되지 않으며, 예방 용도로 사용될 수 있다.
더 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 재조합 바이러스 벡터는 폭스바이러스 벡터이다 (예를 들어, 문헌 [Cox et al. in "Viruses in Human Gene Therapy" Ed J. M. Hos, Carolina Academic Press] 참조). 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 벡터는 백시니아 바이러스로 이루어진 군에서 선택되며, 적합한 백시니아 바이러스로는 코펜하겐(Copenhagen) 종 [Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266 and 517-563; Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381-401], 와이어 쓰(Wyeth) 종 및 이들로부터 유도된 고도로 약화된 바이러스, 예를 들면 MVA (검토를 위해서는 문헌 [Mayr, A., et al., 1975, Infection 3, 6-14] 참조) 및 그의 유도체 (예를 들면, MVA 백시니아 종 575 (ECACC V00120707 - US 6,913,752), NYVAC (WO 92/15672 참조 - Tartaglia et al., 1992, Virology, 188, 217-232)를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 이는 또한 폭스바이러스과(poxviridae)의 임의의 다른 구성원, 구체적으로 조류폭스(fowlpox) (예, TROVAC, 문헌 [Paoletti et al, 1995, Dev Biol Stand., 84, 159-163] 참조); 카나리폭스(canarypox) (예, ALVAC, WO 95/27780, 문헌 [Paoletti et al, 1995, Dev Biol Stand., 84, 159-163]); 피죤폭스(pigeonpox); 스와인폭스(swinepox) 등으로부터 얻어질 수도 있다. 예를 들어, 당업자는 이러한 이종 뉴클레오티드 서열, 특히 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현시킬 수 있는 폭스바이러스를 기재로 한 발현 벡터의 제조를 기술하는 WO 92 15672 (본원에 참고로 도입됨)를 참조할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원"은 면역 반응의 표적일 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. 항원은 예를 들어 환자에 의해 증진된 세포-매개 및/또는 체액성 면역 반응의 표적일 수 있다. 용어 "항원"은 예를 들어 바이러스 항원, 종양-특이적 또는 -관련 항원, 박테리아 항원, 기생충 항원, 알러겐(allergen) 등을 포함한다:
- 바이러스 항원은 예를 들어 간염 바이러스 A, B, C, D 및 E, HIV, 헤르페스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 수두대상포진(varicella zoster), 파필로마 바이러스, 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라-인플 루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 콕사키(coxsakie) 바이러스, 피코나(picorna) 바이러스, 로타바이러스, 호흡기세포융합(respiratory syncytial) 바이러스, 폭스 바이러스, 리노바이러스, 풍진(rubella) 바이러스, 파포바이러스, 볼거리(mump) 바이러스, 홍역 바이러스로부터의 항원을 포함하며; 공지된 바이러스 항원의 일부 비-제한적 예로는 이하의 것들을 들 수 있다: HIV-1 유래의 항원, 예를 들면 tat, nef, gp120 or gp160, gp40, p24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev 또는 이들의 부분 및/또는 조합물; 인간 헤르페스 바이러스 유래의 항원, 예를 들면 gH, gL gM gB gC gK gE 또는 gD 또는 이들의 부분 및/또는 조합물 또는 즉시 초기 (Immediate Early) 단백질, 예를 들면 ICP27, ICP47, ICP4, ICP36 (HSV1 또는 HSV2 유래); 사이토메갈로바이러스, 특히 인간 사이토메갈로바이러스 유래의 항원, 예를 들면 gB 또는 그의 유도체; 엡스타인 바 바이러스 유래의 항원, 예를 들면 gp350 또는 그의 유도체; 수두대상포진 바이러스 유래의 항원, 예를 들면 gpl, 11, 111 및 IE63; 간염 바이러스 유래의 항원, 예를 들면 B형 간염, C형 간염 또는 E형 간염 바이러스 항원 (예, HCV의 env 단백질 E1 또는 E2, 코어 단백질, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, p7, 또는 이들의 부분 및/또는 조합물); 인간 파필로마 바이러스 유래의 항원 (예를 들어 HPV6,11,16,18, 예를 들어 L1, L2, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, 또는 이들의 부분 및/또는 조합물); 다른 바이러스 병원체 유래의 항원, 예를 들면 호흡기세포융합 바이러스 (예를 들어, F 및 G 단백질 또는 이들의 유도체), 파라인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 플라비바이러스 (예, 황열병(Yellow Fever) 바이러스, 뎅기(Dengue) 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러 스, 일본 뇌염 바이러스) 또는 인플루엔자 바이러스 세포 (예, HA, NP, NA, 또는 M 단백질, 또는 이들의 부분 및/또는 조합물);
- 종양 특이적 또는 -관련 항원은 유방암, 결장암, 직장암, 두부 및 경부 암, 신장암, 악성 흑색종, 후두암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암 유래의 항원을 포함한다. 암 항원은 종양-특이적 면역 반응을 분명하게 강력히 자극할 수 있는 항원이다. 이들 항원의 일부는 종상 세포에 의해 코딩되지만 반드시 발현되는 것은 아니다. 상기 항원은 정상 세포에서는 일반적으로 침묵상태인 (즉, 발현되지 않는) 것, 특정 분화 단계에서만 발현되는 것 및 배아 및 태아 항원과 같이 일시적으로 발현되는 것을 특징으로 할 수 있다. 다른 암 항원은 돌연변이체 세포 유전자, 예를 들면 종양유전자(oncogene) (예, 활성화된 ras 종양유전자), 억제자 유전자 (예, 돌연변이체 p53)에 의해 코딩되며, 융합 단백질은 내부 결실 또는 염색체 전좌(translocation)로부터 발생한다. 또 다른 암 항원은 바이러스 유전자, 예를 들면 RNA 및 DNA 종양 바이러스 상에 운반되는 것에 의해 코딩될 수 있다. 종양-특이적 또는 -관련 항원의 일부 비-제한적 예로는 MART-1/Melan-A, gp100, 디펩티딜 펩티다제 IV (DPPIV), 아데노신 데아미나제-결합 단백질 (ADAbp), 시클로필린 b, 결장직장 관련 항원 (CRC)-C017-1A/GA733, 암배아 항원 (CEA) 및 그의 면역원성 에피토프 CAP-1 및 CAP-2, etv6, aml1, 전립선 특이적 항원 (PSA) 및 그의 면역원성 에피토프 PSA-1, PSA-2, 및 PSA-3, 전립선 특이적 멤브레인 항원 (PSMA), T-세포 수용체/CD3-제타 쇄, MAGE-군(family)의 종양 항원 (예, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), GAGE-군의 종양 항원 (예, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, 티로시나제, p53, MUC 군 (예, MUC-1), HER2/neu, p21ras, RCAS1, 알파-페토단백질, E-카드헤린, 알파-카테닌, 베타-카테닌, 및 감마-카테닌, p120ctn, gp100.sup.Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, 선종성 결장폴립증(adenomatous polyposis coli) 단백질 (APC), 포드린(fodrin), 코넥신(Connexin) 37, Ig-이디오타입(idiotype), p15, gp75, GM2 및 GD2 강글리오시드(ganglioside), 바이러스 생성물, 예를 들면 인간 파필로마 바이러스 단백질, Smad 군의 종양 항원, lmp-1, P1A, EBV-코딩 핵 항원 (EBNA)-1, 뇌 글리코겐 포스포릴라제, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 및 CT-7, 및 c-erbB-2를 들 수 있다;
- 박테리아 항원은 예를 들어 TB 및 나병을 유발하는 미코박테리아(Mycobacteria), 폐렴구균(pneumocci), 호기성 그람 음성 바실러스, 미코플라스마, 스태필로코커스 감염, 스트렙토코커스 감염, 살모넬라(salmonellae), 클라미디아(chlamydiae), 네이세리아(neisseriae) 유래의 항원을 들 수 있다;
- 다른 항원으로는 예를 들어 말라리아, 리슈만편모충증(leishmaniasis), 파동편모충증(trypanosomiasis), 톡소포자충증(toxoplasmosis), 주혈흡충증(schistosomiasis), 사상충증(filariasis) 유래의 항원을 들 수 있다;
- 알러겐은 민감한 대상체에서 알러지성 또는 천식성 반응을 유도할 수 있는 물질을 지칭한다. 알러겐 종류는 매우 많으며, 화분, 곤충 독, 동물 비듬 먼지, 진균 포자 및 약물 (예, 페니실린)을 들 수 있다. 천연, 동물 및 식물 알러겐의 예로는 하기 속(genus)으로 특정된 단백질을 들 수 있지만 이에 한정되지는 않는다: 개과 동물(Canine)(Canis familiaris); 먼지진드기(Dermatophagoides)(예, Dermatophagoides farinae); 펠리스(Felis)(Felis domesticus); 암브로시아(Ambrosia)(Ambrosia artemiisfolia); 롤리움(Lolium)(예, Lolium perenne 또는 Lolium multiflorum); 삼나무(Cryptomeria)(Cryptomeria japonica); 알터나리아(Alternaria)(Alternaria alternata); 오리나무(Alder); 알누스(Alnus)(Alnus gultinoasa); 베툴라(Betula)(Betula verrucosa); 쿠에르쿠스(Quercus)(Quercus alba); 올레아(Olea)(Olea europa); 쑥속 식물(Artemisia)(Artemisia vulgaris); 플란타고(Plantago)(예, Plantago lanceolata); 파리에타리아(Parietaria)(예, Parietaria officinalis 또는 Parietaria judaica); 블라텔라(Blattella)(예, Blattella germanica); 아피스(Apis) (예, Apis multiflorum); 쿠프레수스(Cupressus)(예, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica 및 Cupressus macrocarpa); 주니페루스(Juniperus)(예, Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis 및 Juniperus ashei); 투야(Thuya)(예, Thuya orientalis); 카마에시파리스(Chamaecyparis)(예, Chamaecyparis obtusa); 바퀴(Periplaneta)(예, Periplaneta americana); 아그로피론(Agropyron)(예, Agropyron repens); 세칼(Secale)(예, Secale cereale); 트리티쿰(Triticum)(예, Triticum aestivum); 닥틸리스(Dactylis)(예, Dactylis glomerata); 페스투 카(Festuca)(예, Festuca elatior); 포아(Poa)(예, Poa pratensis 또는 Poa compressa); 아베나(Avena)(예, Avena sativa); 홀쿠스(Holcus)(예, Holcus lanatus); 안톡산툼(Anthoxanthum)(예, Anthoxanthum odoratum); 아르헤나테룸(Arrhenatherum)(예, Arrhenatherum elatius); 아그로스티스(Agrostis)(예, Agrostis alba); 플레움(Phleum)(예, Phleum pratense); 팔라리스(Phalaris)(예, Phalaris arundinacea); 파스팔룸(Paspalum)(예, Paspalum notatum); 소르굼(Sorghum)(예, Sorghum halepensis); 및 브로무스(Bromus)(예, Bromus inermis).
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이종 뉴클레오티드 서열은 하기 항원 HBV-PreS1 PreS2 및 표면 env 단백질, 코어 및 폴HIV-gp120 gp40,gp160, p24, gag, pol, env, vif, vpr, vpu, tat, rev, nef; HPV-E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, L1, L2 (예를 들어 WO 90/10459, WO 98/04705, WO 99/03885 참조); HCV env 단백질 E1 또는 E2, 코어 단백질, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, p7; Muc-1의 전부 또는 일부를 한가지 이상 코딩한다 (예를 들어 US 5,861,381; US6,054,438; WO98/04727; WO98/37095 참조).
항원을 코딩하는 핵산은 진핵 세포 내에서 항원 핵산의 발현을 지시하는 유전자 발현 서열에 에 작동가능하게 연결된다. 유전자 발현 서열은 임의의 조절 뉴클레오티드 서열, 예를 들면 프로모터 서열 또는 프로모터-인핸서 조합물이며, 이는 작동가능하게 연결되는 항원 핵산의 전사 및 번역을 효과적으로 촉진한다. 유전자 발현 서열은 예를 들어 포유동물 또는 바이러스 프로모터, 예를 들면 구성적 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 구성적 포유동물 프로모터로는 하기 유전자들에 대한 프로모터를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다: 히포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, b-액틴 프로모터 및 다른 구성적 프로모터. 진핵 세포에서 구성적으로 기능하는 예시적인 바이러스 프로모터로는 예를 들어 사이토메갈로바이러스 (CMV), 시미안 바이러스 (예, SV40), 파필로마 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 로우스(Rous) 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스 유래의 프로모터, 몰로니(Moloney) 백혈병 바이러스 및 다른 레트로바이러스의 긴 말단 반복부 (LTR), 및 헤르페스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터를 들 수 있다. 다른 구성적 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 유전자 발현 서열로서 유용한 프로모터는 또한 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터는 유도제의 존재하에 발현된다. 예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터는 특정 금속 이온의 존재하에 전사 및 번역을 촉진하도록 유도된다. 다른 유도성 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 유전자 발현 서열은 필요에 따라 각각 전사 및 번역의 개시와 관련된 5' 비-전사 및 5' 비-번역 서열, 예를 들면 TATA 박스(box), 캡핑(capping) 서열, CAAT 서열 등을 포함한다. 특히, 이러한 5' 비-전사 서열은 작동가능하게 연결된 항원 핵산의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 유전자 발현 서열은 인핸서 서열 또는 상류 활성자 서열을 필요에 따라 임의로 포함한다. 폭스바이러스 벡터에 사용하기에 바람직한 프로모터 (하기 참조)로는 백시니아 프로모터 7.5K, H5R, TK, p28, p11 및 K1L, 초기 및 후기 폭스바이러스 프로모터 사이의 키메라 프로모터, 및 문헌 [Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23, 1094-1097), Hammond et al. (1997, J. Virological Methods 66, 135-138) and Kumar and Boyle (1990, Virology 179, 151-158)]에 기재된 것들과 같은 합성 프로모터를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
다른 특별한 실시양태에 따라, 상기 본 발명의 이종 뉴클레오티드 서열은 HPV의 E6 초기 코딩 영역, HPV의 E7 초기 코딩 영역 및 이들의 유도체 또는 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 HPV 항원(들)의 전부 또는 일부를 코딩한다.
본 발명에 따른 재조합 바이러스 벡터에 의해 코딩된 HPV 항원은 HPV E6 폴리펩티드, HPV E7 폴리펩티드, 또는 HPV E6 폴리펩티드 및 HPV E7 폴리펩티드의 둘 다로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명은 p53에 대한 결합이 변경되거나 적어도 유의적으로 감소한 임의의 HPV E6 폴리펩티드의 용도 및/또는 Rb에 대한 결합이 변경되거나 적어도 유의적으로 감소한 임의의 HPV E7 폴리펩티드의 용도를 포함한다 ([Munger et al., 1989, EMBO J. 8, 4099-4105]; [Crook et al., 1991, Cell 67, 547-556]; [Heck et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4442-4446]; [Phelps et al., 1992, J. Virol. 66, 2148-2427]). 본 발명의 목적에 적합한 비-종양원성 HPV-16 E6 변이체에는 대략적으로 118번 위치에서부터 대략적으로 122번 위치 (+1은 본래의 HPV-16 E6 폴리펩티드의 첫번째 메티오닌 잔기를 나타낸다)에 위치하는 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되어 있으며, 잔기 118 내지 122 (CPEEK)가 완전히 결실되어 있는 것이 특히 바람직하다. 본 발명의 목적에 적합한 비-종양원성 HPV-16 E7 변이체에는 대략적으로 21번 위치에서부터 대략적으로 26번 위치 (+1은 본래의 HPV-16 E7 폴리펩티드의 첫번째 메티오닌 잔기를 나타낸다)에 위치하는 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되어 있으며, 잔기 21 내지 26 (DLYCYE)이 완전히 결실되어 있는 것이 특히 바람직하다. 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 사용되는 하나 이상의 HPV-16 초기 폴리펩티드(들)는 MHC I형 및/또는 MHC II형 제시를 개선시키기 위하여 및/또는 항-HPV 면역성을 자극시키기 위하여 추가로 변형된다. HPV E6 및 E7 폴리펩티드는 핵 단백질이며, 막 제시가 그의 치료학적 효능을 개선시킬 수 있다고 앞서 밝혀진 바 있다 (예를 들어, WO99/03885 참조). 따라서, 세포 막에 부착될 수 있도록 HPV 초기 폴리펩티드(들) 중 적어도 하나를 변형시키는 것이 현명할 수 있다. 막-부착은 HPV 초기 폴리펩티드에 막-부착 서열을 혼입시킴으로써, 그리고, 본래의 폴리펩티드에 분비 서열 (즉, 신호 펩티드)이 결실되어 있다면 쉽게 이루어질 수 있다. 막-부착 및 분비 서열은 당업계에 알려져 있다. 간략하면, 분비 서열은 막 제시 또는 분비 폴리펩티드의 N-말단에 존재하고, 소포체 (ER)내로의 그의 통과를 개시한다. 이는 일반적으로 15 내지 35개의 본질적으로 소수성인 아미노산을 포함하는데, 이는 이어서 특이적인 ER-위치의 엔도펩티다제에 의해 제거됨으로써 성숙한 폴리펩티드를 제공한다. 막-부착 서열은 일반적으로 실제로 고도로 소수성이며, 세포 막에서 폴리펩티드를 부착시키는 역할을 한다 (예를 들어, [Branden and Tooze, 1991, in Introduction to Protein Structure p. 202-214, NY Garland] 참조).
본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 막-부착 및 분비 서열을 선택하는 것은 방대하다. 이는 그를 포함하는 임의의 막-부착된 및/또는 분비된 폴리펩티드 (예를 들면, 세포 또는 바이러스 폴리펩티드), 예로서, 광견병 당단백질, HIV 바이러 스 외피 당단백질 또는 홍역 바이러스 F 단백질로부터 수득될 수 있거나, 합성일 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 각각의 초기 HPV-16 폴리펩티드에 삽입되는 막-부착 및/또는 분비 서열은 공통된 또는 상이한 기점을 가질 수 있다. 분비 서열의 바람직한 삽입 부위는 번역 개시 코돈 하류의 N-말단이고, 막-부착 서열의 바람직한 삽입 부위는 예를 들면, 종결 코돈 상류에 인접하는 C-말단이다.
본 발명에서 사용되는 HPV E6 폴리펩티드는 홍역 F 단백질의 분비 및 막-부착 신호의 삽입에 의해 바람직하게 변형된다. 임의로 또는 조합하여, 본 발명에서 사용되는 HPV E7 폴리펩티드는 광견병 당단백질의 분비 및 막-부착 신호의 삽입에 의해 바람직하게 변형된다.
재조합 바이러스 벡터의 치료 효능은 면역강화제(immunopotentiator) 폴리펩티드(들)을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 사용함으로써 향상될 수도 있다. 예를 들어, HPV 초기 폴리펩티드(들)을 폴리펩티드, 예를 들면 칼레티쿨린(calreticulin)[Cheng et al., 2001, J. Clin. Invest. 108, 669-678], 미코박테리움 투베르쿨로시스 열 충격 단백질 70 (HSP70)[Chen et al., 2000, Cancer Res. 60, 1035-1042], 유비퀴틴 [Rodriguez et al., 1997, J. Virol. 71, 8497-8503] 또는 박테리아 독소, 예를 들면 슈도모나스 애루기노사 내독소 A (ETA(dIII))의 전좌 도메인 [Hung et al., 2001 Cancer Res. 61, 3698-3703]에 연결하는 것이 유리할 수 있다.
다른 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 재조합 바이러스 벡터는 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 초기 폴리펩티드(들), 보다 구체적으로는 HPV- 16 및/또는 HPV-18 초기 E6 및/또는 E7 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다.
다른 특별한 실시양태에 따라, 상기 본 발명의 이종 뉴클레오티드 서열은 MUC 1 항원 또는 그의 유도체의 전부 또는 일부를 코딩한다.
필요하다면, 본 발명에 사용되는 핵산 분자는 특정 숙주 세포 또는 생물체, 예를 들어 인간숙주 세포 또는 생물체에서 항원 (예, HPV 초기 폴리펩티드(들))의 높은 수준의 발현을 제공하도록 최적화될 수 있다. 전형적으로, 코돈 최적화는 포유동물 숙주 세포에서 가끔 사용되는 코돈에 상응하는 하나 이상의 "천연" (예, HPV) 코돈을 보다 흔하게 사용되며 동일한 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 코돈으로 대체함으로써 수행된다. 이는 통상의 돌연변이유발 또는 화학적 합성 기술 (예를 들어, 합성 핵산을 형성함)에 의해 달성할 수 있다. 부분적으로 대체하는 경우에도 발현 증가를 달성할 수 있기 때문에, 가끔 사용되는 코돈에 상응하는 모든 천연 코돈을 대체할 필요는 없다. 게다가, 제한 부위(들)의 도입을 수용하기 위해서는 최적화된 코돈 용법을 정확하게 고수하는 것에서 일부 벗어날 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 폭스바이러스 벡터, 보다 구체적으로는 고도로 약화된 백시니아 바이러스 종이 바람직하다. MVA 게놈의 완전한 서열의 결정 및 코펜하겐 백시니아 바이러스 게놈과의 비교에 의해 MVA 게놈에서 발생한 7개의 결실 (I 내지 VII)을 정확하게 확인할 수 있었으며 [Antoine et al., 1998, Virology 244, 365-396], 이중 임의의 결실을 이용해서 항원 (예, HPV 초기 폴리펩티드 또는 MUC1)-코딩 핵산을 삽입할 수 있다.
발현에 필요한 핵산 및 관련 조절 요소를 폭스바이러스 게놈에 삽입하는 기 본적인 기술은 당업자가 이용가능한 다수의 문헌들 [Paul et al., 2002, Cancer gene Ther. 9, 470-477; Piccini et al., 1987, Methods of Enzymology 153, 545-563; US 4,769,330; US 4,772,848; US 4,603,112; US 5,100,587 및 US 5,179,993]에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 기술은 바이러스 게놈과 삽입 핵산을 운반하는 플라스미드 둘 다에 존재하는 중복 서열들 (즉, 목적하는 삽입 부위) 사이의 상동성 재조합을 통해 진행한다.
재조합 폭스바이러스가 생존성 및 감염성인 상태로 있도록 하기 위해, 본 발명의 항원을 코딩하는 핵산은 바람직하게는 폭스바이러스 게놈의 비필수 유전자좌에 삽입된다. 비필수 영역은 불활성화 또는 결실되더라도 바이러스 성장, 복제 또는 감염을 유의하게 손상시지키 않는 비-코딩성 유전자간 영역 또는 임의의 유전자이다. 당업자라면, 바이러스 입자의 생성 동안 결함이 있는 기능이 트랜스로 제공된다면, 예를 들어 폭스바이러스 게놈에서 결실된 것에 상응하는 보완성 서열을 운반하는 헬퍼(helper) 세포주를 사용함으로써 필수 바이러스 유전자좌 내의 삽입을 고려할 수도 있다.
코펜하겐 백시니아 바이러스를 사용하는 경우, 항원-코딩 핵산은 바람직하게는 티미딘 키나제 유전자 (tk) 내에 삽입된다 [Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 3411-3415; Weir et al., 1983, J. Virol. 46, 530-537]. 그러나, 예를 들어 헤마글루티닌 유전자 내 [Guo et al., 1989, J. Virol. 63, 4189-4198], K1L 유전자좌 내, u 유전자 내 [Zhou et al., 1990, J. Gen. Virol. 71, 2185-2190] 또는 백시니아 바이러스 게놈의 좌측 말단에서의 다른 삽입 부위가 또 한 적절하며, 여기서 다양한 자발적 또는 조작된 결실이 문헌 [Altenburger et al., 1989, Archives Virol. 105, 15-27; Moss et al. 1981, J. Virol. 40, 387-395; Panicali et al., 1981, J. Virol. 37, 1000-1010; Perkus et al, 1989, J. Virol. 63, 3829-3836; Perkus et al, 1990, Virol. 179, 276-286; Perkus et al, 1991, Virol. 180, 406-410]에 보고되었다.
MVA를 이용하는 경우, 항원-코딩 핵산은 확인된 결실 I 내지 VII 중 어느 하나 뿐만 아니라 D4R 유전자좌에 삽입될 수 있지만, 결실 II 또는 III 내의 삽입이 바람직하다 [Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032-1040].
조류폭스 바이러스를 이용하는 경우, 티미딘 키나제 유전자 내의 삽입이 고려될 수 있지만, 항원-코딩 핵산은 바람직하게는 ORF 7과 9 사이에 위치하는 유전자간 영역에 도입된다 (예를 들어 EP 314 569 및 US 5,180,675 참조).
바람직하게는, 본 발명에 사용되는 항원-코딩 핵산은 숙주 세포 또는 생물체에서의 발현에 적합한 형태로 존재하며, 이는 항원을 코딩하는 핵산 서열 (예, E6 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 및/또는 E7 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열)이 숙주 세포 또는 생물체에서의 발현에 필요한 하나 이상의 조절 서열의 조절하에 배치됨을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조절 서열"은 주어진 숙주 세포에서 핵산 또는 그의 한가지 유도체 (즉, mRNA)의 복제, 중복, 전사, 스플라이싱, 번역, 안정성 및/또는 숙주 세포로의 운반을 비롯한 핵산의 발현을 허용하거나, 발현에 기여하거나 또는 발현을 조절하는 임의의 서열을 지칭한다. 당업자라 면 조절 서열의 선택이 숙주 세포, 벡터 및 목적 발현 수준과 같은 인자들에 의존할 수 있음을 이해할 것이다.
프로모터는 특히 중요하며, 본 발명은 다수 유형의 숙주 세포에서 핵산의 발현을 지시하는 구성적 프로모터 및 특정 숙주 세포에서만 또는 특정 반응 또는 외생성 인자 (예, 온도, 영양 첨가, 호르몬 또는 다른 리간드)에 반응해서만 발현을 지시하는 구성적 프로모터의 사용을 포함한다. 적합한 프로모터는 문헌에 폭넓게 기술되어 있으며, 당업자라면 보다 구체적으로 바이러스 프로모터, 예를 들면 RSV, SV40, CMV 및 MLP 프로모터를 인용할 수 있다. 폭스바이러스 벡터에 사용하기에 바람직한 프로모터로는 백시니아 프로모터 7.5K, H5R, TK, p28, p11 및 K1L, 초기 및 후기 폭스바이러스 프로모터 사이의 키메라 프로모터, 및 문헌 [Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23, 1094-1097), Hammond et al. (1997, J. Virological Methods 66, 135-138) and Kumar and Boyle (1990, Virology 179, 151-158)]에 기재된 것들과 같은 합성 프로모터를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
당업자라면 본 발명의 핵산 분자의 발현을 조절하는 조절 요소들이 전사의 적절한 개시, 조절 및/또는 종결 (예, 폴리A 전사 종결 서열), mRNA 운반 (예, 핵 국소화 신호 서열), 프로세싱 (예, 스플라이싱 신호), 및 안정성 (예, 인트론 및 비-코딩 5' 및 3' 서열), 번역 (예, 펩티드 신호, 프로펩티드, 3부분으로 이루어진 리더 서열, 리보좀 결합 부위, 샤인-달가노(Shine-Dalgano) 서열 등)을 위한 부가 요소들을 숙주 세포 또는 생물체에 추가로 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
또는, 본 발명에 사용되는 재조합 바이러스 벡터는 하나 이상의 사이토카인 을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 사이토카인으로는 IL-2, IL-7, IL-15, IL-18, IL-21 및 IFNg를 들 수 있지만 이에 한정되지 않으며, IL-2가 특히 바람직하다. 본 발명의 재조합 바이러스 백신이 사이토카인-발현 핵산을 포함하는 경우, 상기 핵산은 하나 이상의 HPV 초기 폴리펩티드(들)을 코딩하는 재조합 바이러스 벡터에 의해 또는 동일 또는 상이한 기점이 있을 수 있는 독립적인 재조합 벡터에 의해 운반될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 7.5K 프로모터 하에 배치된 HPV E6 폴리펩티드, 7.5K 프로모터 하에 배치된 HPV E7 폴리펩티드를 코딩하는 MVA 벡터 및 H5R 프로모터의 조절 하에 배치된 인간 IL-2 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 백신의 사용에 관한 것이다. 바람직하게는, HPV E6 폴리펩티드, HPV E7 폴리펩티드 및 인간 IL-2를 코딩하는 핵산은 MVA 게놈의 결실 III에 삽입된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시양태는 7.5K 프로모터 하에 배치된 MUC 1 폴리펩티드를 코딩하는 MVA 벡터 및 H5R 프로모터의 조절 하에 배치된 인간 IL-2 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 백신의 용도에 관한 것이다.
상기 기술된 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 감염성 바이러스 입자는 통상의 공정에 의해 제조할 수 있다. 예시적인 공정은
a. 바이러스 벡터를 적합한 세포주에 도입하는 단계,
b. 상기 감염성 바이러스 입자가 생성되도록 하는 적합한 조건하에 상기 세포주를 배양하는 단계,
c. 생성된 감염성 바이러스 입자를 상기 세포주의 배양물로부터 회수하는 단 계, 및
d. 임의로 상기 회수된 감염성 바이러스 입자를 정제하는 단계
를 포함한다.
폭스바이러스 벡터를 증식시키는데 적절한 세포는 조류 세포, 가장 바람직하게는 수정란으로부터 얻어진 병아리 배아로부터 제조된 1차 병아리 배아 섬유아세포 (CEF)이다.
감염성 바이러스 입자는 배양 상등액 또는 용해 후 세포로부터 (예를 들어, 화학적 수단, 동결/해동, 삽투압 충격, 기계적 충격, 초음파처리 등에 의해) 회수될 수 있다. 바이러스 입자는 플라크 정제를 연속 회로 수행하여 단리할 수 있으며, 이어서 당업계의 기술 (크로마토그래피 방법, 염화세슘 또는 수크로스 농도구배 상의 초원심분리)을 이용해서 정제할 수 있다.
다른 실시양태에 따라, 본 발명의 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민-유도체는 하기 화학식 I 내지 V 중 하나에 의해 정의된 화합물 또는 이들의 유사체, 용매화물 또는 염이다:
Figure 112008087429530-PCT00001
상기 식 중,
R 11 은 선형 또는 분지형 알킬, 히드록시알킬, 아실옥시알킬, 벤질, (페닐)에틸 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 고리 상에서 서로 독립적으로 C1-4 알킬 잔기, C1-4 알콕시 잔기 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 잔기에 의해 임의로 치환되며, 단, 상기 벤젠 고리가 2개의 상기 잔기에 의해 치환되는 경우, 상기 잔기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고;
R 21 은 수소, C1-8 알킬 잔기, 벤질, (페닐)에틸 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 고리 상에서 서로 독립적으로 C1-4 알킬 잔기, C1-4 알콕시 잔기 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 잔기에 의해 임의로 치환되며, 단, 벤젠 고리가 2개의 상기 잔기에 의해 치환되는 경우, 잔기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고;
R 1 은 각각 서로 독립적으로 수소, C1-4 알콕시 잔기, 할로겐 및 C1-4 알킬 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고, n은 0 내지 2의 정수이며, 단, n이 2인 경우, 상기 R 1 기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고;
Figure 112008087429530-PCT00002
상기 식 중,
R 12 는 선형 또는 분지형 C2-10 알케닐 및 치환된 선형 또는 분지형 C2-10 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 치환기는 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기 및 C3-6 시클로알킬 잔기; 및 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기에 의해 치환된 C3-6 시클로알킬 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R 22 는 수소, 선형 또는 분지형 C1-8 알킬 잔기, 벤질, (페닐)에틸 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 고리 상에서 서로 독립적으로 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기, 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 잔기에 의해 임의로 치환되며, 단, 벤젠 고리가 2개의 상기 잔기에 의해 치환되는 경우, 잔기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고;
R 2 는 각각 서로 독립적으로 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 할로겐, 및 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고, n은 0 내지 2의 정수이고, 단, n이 2인 경우, 상기 R 2 기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고;
Figure 112008087429530-PCT00003
상기 식 중,
R 23 은 수소, 선형 또는 분지형 C1-8 알킬 잔기, 벤질, (페닐)에틸 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 고리상에서 서로 독립적으로 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기, 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 잔기에 의해 임의로 치환되며, 단, 벤젠 고리가 2개의 상기 잔기에 의해 치환되는 경우, 잔기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고;
R 3 은 각각 서로 독립적으로 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 할로겐, 및 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고, n은 0 내지 2의 정수이며, 단, n이 2인 경우, 상기 R 3 기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고;
Figure 112008087429530-PCT00004
상기 식 중,
R 14 는 -CHR34R44이고, 여기서 R44는 수소 또는 탄소-탄소 결합이며, 단, R44가 수소인 경우, R34는 C1-4 알콕시 잔기, C1-4 히드록시알콕시 잔기, C2-10 1-알키닐 잔기, 테트라히드로피라닐, 알콕시 잔기는 1개 내지 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기는 1개 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 알콕시알킬, 2-, 3-, 또는 4-피리딜이며, 단, R44가 탄소-탄소 결합인 경우, R44 및 R34는 함께 테트라히드로푸라닐 기를 형성하며, 이는 서로 독립적으로 히드록시 및 C1-4 히드록시알킬 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
R 24 는 수소, C1-4 알킬, 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 페닐은 서로 독립적으로 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기, 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 잔기에 의해 임의로 치환되고;
R 4 는 수소, 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 할로겐, 및 선형 또는 분지 형 C1-4 알킬 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Figure 112008087429530-PCT00005
상기 식 중,
R 15 는 수소; 선형 또는 분지형 C1-10 알킬 잔기 및 치환된 선형 또는 분지형 C1-10 알킬 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 치환기는 C3-6 시클로알킬, 및 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기에 의해 치환된 C3-6 시클로알킬; 선형 또는 분지형 C2-10 알케닐 및 치환된 선형 또는 분지형 C2-10 알케닐 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 치환기는 C3-6 시클로알킬, 및 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기에 의해 치환된 C3-6 시클로알킬; C1-6 히드록시알킬; 알콕시 잔기가 1개 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기가 1개 내지 약 6개의 탄소 원자를 함유하는 알콕시알킬; 아실옥시 잔기가 2개 내지 약 4개의 탄소 원자의 알카노일옥시 또는 벤조일옥시이고 알킬 잔기가 1개 내지 약 6개의 탄소 원자를 함유하는 아실옥시알킬; 벤질; (페닐)에틸; 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 고리 상에서 서로 독립적으로 C1-4 알킬 잔기, C1-4 알콕 시 잔기, 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 잔기에 의해 임의로 치환되며, 단, 상기 벤젠 고리가 2개의 상기 잔기에 의해 치환되는 경우, 잔기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고;
R 25 는
Figure 112008087429530-PCT00006
이고,
상기 식 중,
R 35 는 C1-4 알콕시 잔기, 알콕시 잔기는 1개 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기는 1개 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하는 알콕시알킬; C1-4 할로알킬 잔기; 알킬기가 1개 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하는 알킬아미도; 아미노; C1-4 알킬 또는 C1-4 히드록시알킬로 치환된 아미노; 아지도; C1-4 알킬티오로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R 55 및 R 45 는 서로 독립적으로 수소, C1-4 알킬 잔기, 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 페닐은 서로 독립적으로 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기, 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 잔기에 의해 임의로 치환되고;
R 5 는 수소, 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 할로겐, 및 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 함유 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에 따라, C1-4 알킬 잔기는 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 2-메틸프로필 및 부틸이다. 바람직한 실시양태에 따라, C1-4 알킬 잔기는 메틸, 에틸 및 2메틸-프로필로 이루어진 군에서 선택된다.
특정 실시양태에 따라, 알콕시 잔기는 메톡시, 에톡시 및 에톡시메틸로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직한 실시양태에 따라, n은 0 또는 1이다.
바람직한 실시양태에 따라, R1-R5 기는 수소이다.
바람직한 실시양태에 따라, R11-R15 기는 2-메틸프로필 및 2-히드록시-2-메틸프로필로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직한 실시양태에 따라, R21-R25 기는 수소, C1-6 알킬 잔기, 알콕시 잔기가 1개 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기가 1개 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하는 알콕시알킬로 이루어진 군에서 선택된다. 가장 바람직한 R21-R25 기는 수소, 메틸, 또는 에톡시메틸로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직한 한 실시양태에 따라, 본 발명의 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민-유도체는 하기 화학식 VI에서 정의된 화합물 또는 그의 유사체, 용매화물 또는 염이다:
Figure 112008087429530-PCT00007
상기 식 중,
R t 는 수소, 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 할로겐, 및 선형 또는 분지형 C1-4 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R u 는 2-메틸프로필 또는 2-히드록시-2-메틸프로필이고;
R v 는 수소, C1-6 알킬, 또는 알콕시 잔기가 1개 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기가 1개 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하는 알콕시알킬이다.
바람직한 실시양태에 따라, 화학식 VI에서, Rt는 수소이고, Ru는 2-메틸프로필 또는 2히드록시-2-메틸프로필이고, Rv는 수소, 메틸 또는 에톡시메틸이다.
다른 바람직한 실시양태에 따라, 본 발명의 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민-유도체는 하기 군에서 선택된 화합물이다:
1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (Rt가 수소이고, Ru가 2-메틸프로필이고, Rv가 수소인 화학식 VI의 화합물);
1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2-메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (Rt 가 수소이고, Ru가 2-히드록시-2-메틸프로필이며, Rv가 메틸인 화학식 VI의 화합물);
1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (Rt가 수소이고, Ru가 2-히드록시-2-메틸프로필이며, Rv가 수소인 화학식 VI의 화합물);
1-(2-히드록시-2-메틸프로필-2-에톡시메틸-1-H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (Rt가 수소이고, Ru가 2-히드록시-2-메틸프로필이며, Rv가 에톡시메틸인 화학식 VI의 화합물); 또는 그의 유사체, 용매화물 또는 염.
당업자들은 상기 언급된 화합물 및 그의 제조 방법을 기재하는 예를 들어 US 4.689.338, US 4.929.624, EP 0385630 또는 WO 94/17043 (본원에 참고로 포함됨)을 참조할 수 있다.
보다 구체적으로, 1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (용어 이미퀴모드 또는 알다라로도 알려짐)이 광범위하게 개시되어 있으며 (문헌 [Buck, 1998, Infect. Dis. Obstet. Gynecol., 6, 49-51]; [Dockrell and Kinghorn, 2001, J. Antimicrob. Chemother., 48, 751-755] 또는 [Garland, 2003, Curr. Opin. Infect. Dis., 16, 85-89] 참조), 1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2-메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 및 1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5,-c]퀴놀린-4-아민은 US 2004/0076633에 개시되어 있고, 1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2-에톡시메틸-1-H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (용어 레시퀴모드로도 알려져 있음)은 문헌 [Dockrell and Kinghorn, 2001, J. Antimicrob. Chemother. 48, 751-755] 또 는 [Jones, Curr. Opin. Investig. Drugs., 2003, 4,214-218]에 개시되어 있다.
달리 나타내지 않는다면, 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민-유도체에 대한 언급은 임의의 이성질체 (예를 들어, 부분입체이성질체 또는 거울상이성질체), 염, 용매화물 및 다형체 등을 비롯한 임의의 제약상 허용되는 형태의 화합물을 포함할 수 있다. 특히, 화합물이 광학 활성인 경우, 화합물에 대한 언급은 각 화합물의 거울상이성질체, 및 거울상이성질체의 라세미 혼합물을 포함할 수 있다.
한 바람직한 실시양태에 따르면, 재조합 바이러스 백신 및 보다 특히 재조합 바이러스 벡터는 그 자체로 면역 반응을 유발하는 면역자극 모티프 또는 백본, 특히 면역자극 모티프 또는 백본을 갖는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 CpG, polyG, polyT, TG, 메틸화된 CpG, CpI 및 T 풍부 모티프 또는 포스포로티오에이트 백본을 포함하지 않는다 (US 2003/0139364, US 6,207,646 또는 WO 01/22972 (이의 내용은 본원에 참고로 포함됨) 참조).
한 실시양태에 따르면, 최종 재조합 바이러스 백신에서의 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체 농도는 약 0.0001％ 내지 약 10％ (달리 나타내지 않는다면, 본원에서 제공되는 모든 백분율은 총 제제에 대한 중량/중량임), 약 0.01％ 내지 약 2％, 보다 특히 약 0.06 내지 약 1％, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 0.6％일 것이다.
또 다른 실시양태에 따르면, 재조합 바이러스 벡터의 적절한 투여량은 여러 파라미터, 특히 투여 방식; 사용되는 조성물; 숙주 유기체의 연령, 건강 및 체중; 증상의 특성 및 정도; 동시 치료의 종류; 치료의 주기; 및/또는 예방 또는 요법에 대한 필요의 함수로서 변경할 수 있다. 치료를 위한 적절한 투여량을 결정하는데 필요한 추가적인 계산의 정밀화는 통상적으로 관련된 상황에 비추어 담당자에 의해 이루어진다. 일반적인 지침에 대하여, MVA-함유 조성물에 대한 적합한 투여량은 약 104 내지 1010 pfu (플라크 형성 단위), 바람직하게는 약 105 내지 108 pfu로 변하는 반면, 아데노바이러스-함유 조성물은 약 105 내지 1013 iu (감염 단위), 바람직하게는 약 107 내지 1012 iu로 변한다. 벡터 플라스미드를 기초로 하는 조성물은 10 μg 내지 20 mg, 유리하게는 100 μg 내지 2 mg의 용량으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 5×105 pfu 내지 5×1O7 pfu의 MVA 백신 벡터를 포함하는 용량으로 투여한다.
투여 요법은 적어도 일부 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체 및 사용되는 재조합 바이러스 벡터의 특성, 담체의 특성, 투여되는 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체 및 재조합 바이러스 벡터의 양, 대상체의 면역계의 상태 (예를 들어, 저해, 억제, 자극), 및 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체 및/또는 재조합 바이러스 벡터 화합물의 투여 방법을 비제한적으로 비롯한 당업계에 알려진 여러 인자에 따를 수 있다. 따라서, 모든 가능한 용도에 대한 재조합 바이러스 백신의 효능을 증가시키는데 유효한 투여 요법을 일반적으로 설명하는 것은 실제적이지 않다. 그러나, 당업자들은 상기 인자를 충분히 고려하여 적절한 투여 요법을 용이하게 결정할 수 있다. 비록 몇몇 실시양태에서 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 및/또는 재조 합 바이러스 벡터 화합물을 후술하는 범위 밖의 주기로 투여할 수 있지만, 본 발명의 몇몇 실시양태에서 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체 및/또는 재조합 바이러스 벡터 화합물을 예를 들어 1일 1회 내지 약 1회 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체 및/또는 재조합 바이러스 벡터 화합물을 1주일 당 약 1회 내지 1일 당 약 1회로 투여할 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체 및 재조합 바이러스 벡터를 1주 1회 투여한다. 바람직하게는, 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체 및/또는 재조합 바이러스 벡터 화합물을 1주의 간격으로 1 내지 10회 투여한다. 바람직하게는, 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체 및 재조합 바이러스 벡터, 또는 그를 함유하는 임의의 조성물을 1주 간격으로 3회 피하 경로로 투여한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 환자에서 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열, 특히 항원을 코딩하는 이종 뉴클레오티드 서열을 생체내 발현하는 재조합 바이러스 벡터 및 (ii) 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 순서대로 또는 동시에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자에서 암의 발생을 예방하고/거나 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열, 특히 항원을 코딩하는 이종 뉴클레오티드 서열을 생체내 발현하는 재조합 바이러스 벡터 및 (ii) 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 순서대로 또는 동시에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자에서 감염성 질환의 발생을 예방하고/거나 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열, 특히 항원을 코딩하는 이종 뉴클레오티드 서열을 생체내 발현하는 재조합 바이러스 벡터 및 (ii) 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 순서대로 또는 동시에 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 감염성 질환은 바이러스 유발성 질환, 예컨대 예를 들어 HIV, HCV, HBV 및 HPV 등에 의해 유발된 질환이다.
추가의 실시양태에서, 재조합 바이러스 벡터에 의해 코딩된 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 재조합 바이러스 백신의 제조에서의 이미다조[4,5-c]퀴놀린4-아민의 용도가 제공되며, 상기 재조합 바이러스 벡터는 상기 유도체와 순서대로 또는 동시에 투여된다.
"순서대로 투여되는"은 본 재조합 바이러스 백신의 재조합 바이러스 벡터 [화합물 (i)] 및 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체 [화합물 (ii)]가 서로 독립적으로 투여되는 것, 예를 들어 상기 화합물 중 하나가 제1 투여되고, 이후 제2 화합물을 별도로 제2 투여하는 것을 의미한다. 본 발명에 따르면, 제1 투여는 제2 투여 이전에, 동시에 또는 이후에, 및 역으로 수행될 수 있다. 치료 조성물 투여 및 제2 투여는 상이하거나 또는 동일한 전달 경로 (예를 들어, 전신 전달 및 표적화 전달, 또는 표적화 전달)에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각각은 동일한 표적 조직으로, 가장 바람직하게는 비경구 경로로 수행되어야 한다.
바람직한 실시양태에서, 재조합 바이러스 벡터 및 이미다조[4,5-c]퀴놀린- 4-아민 유도체를 실질적으로 동시에 투여한다. 보다 바람직하게는, 두 화합물을 동시-투여한다.
또 다른 실시양태에서, 재조합 바이러스 벡터의 투여 이전에 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 투여한다. 상기 특정 실시양태에서, "이전에"는 약 5분 내지 약 2주, 보다 특히 약 1시간 내지 약 1주, 보다 특히 약 6시간 내지 약 48시간을 의미한다.
본 발명의 재조합 바이러스 백신은 제약상 허용되는 용액으로서 환자에게 투여하며, 이는 전형적으로 제약상 허용되는 농도의 염, 완충제, 보존제, 상용성 담체, 애쥬번트 (예를 들어, 명반, BCG, 면역 반응 조절제) 및 임의의 기타 치료 성분을 함유할 수 있다.
용어 제약상 허용되는 담체는 인간 또는 다른 척추 동물에의 투여에 적합한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제, 희석제, 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 용어 담체는 유기 또는 무기 성분, 천연 또는 합성 물질을 의미하며, 활성 성분과 합하여 적용을 용이하게 한다. 또한, 제약 조성물의 성분은 각각에 대하여 원하는 제약 효능을 실질적으로 손상시키는 상호 작용이 없는 방식으로 본 발명의 화합물과 혼합할 수 있다.
재조합 바이러스 백신은 약물 투여를 위한 임의의 통상적인 경로에 의해 투여할 수 있다. 여러 투여 경로가 이용가능하다. 선택된 특정 방식은 물론 특정 재조합 바이러스 백신 성분, 치료되는 특정 상태 및 치료 효능에 요구되는 투여량에 따를 것이다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 임상적으로 원하지 않는 부작용을 유발하지 않고 유효 수준의 면역 반응을 생성하는 임의의 방식을 의미하는 의학적으로 허용되는 임의의 투여 방식을 사용하여 실시할 수 있다. 바람직한 투여 방식을 본원에서 논의한다. 치료에서 사용하기 위하여, 임의의 형태, 예를 들어 크림, 용액 하에 원하는 표면, 예를 들어 점막, 전신에 작용제를 전달하는 임의의 방식으로 유효량의 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 대상체에 투여할 수 있다.
재조합 바이러스 백신 또는 그의 개별적인 화합물 (i) 및 (ii)는 본 발명에 따라 전신, 국소 및 편재 투여를 비롯한 여러 투여 방식에 의해 사용할 수 있다. 주사는 임의의 방식, 예를 들어 피하, 피부내, 근육내, 정맥내, 복강내, 종양내, 혈관내, 동맥내 주사에 의해, 또는 간으로 향하는 동맥으로의 직접 주사 (예를 들어, 간 동맥 주입) 또는 간으로 향하는 정맥으로의 직접 주사 (예를 들어, 간문맥으로의 주사)에 의해 수행할 수 있다. 통상적인 주사기 및 바늘로, 또는 당업계에서 이용가능한 임의의 다른 적절한 설비로 주사할 수 있다. 별법으로, 활성 화합물 또는 그를 함유하는 임의의 조성물을 점막 경로, 예컨대 경구/소화관, 비내, 기관내, 폐내, 질내, 또는 직장내 경로를 통해 투여할 수 있다. 또한, 경피 수단 (예를 들어, 패치 및 크림 등)을 사용하여 국소 투여를 수행할 수 있다. 본 발명의 문맥상, 근육내 및 피하 투여가 바람직한 경로를 나타낸다.
경구 투여에 대하여, 활성 화합물을 당업계에 잘 알려진 제약상 허용되는 담체와 합하여 재조합 바이러스 백신을 쉽게 제제화할 수 있다. 이러한 담체는 치료되는 대상체에 의한 경구 섭취를 위해 본 발명의 화합물을 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽, 슬러리, 현탁제 등으로 제제화할 수 있다. 경구 사용을 위한 제약 제제는 고체 부형제로서 얻을 수 있으며, 임의로 얻어진 혼합물을 연마하고, 입제 혼합물을 가공하고, 바람직하게는 이후 적합한 보조제를 첨가하여, 정제 또는 당의정 코어를 얻을 수 있다. 적합한 부형제는 특히 충전제, 예컨대 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 비롯한 당; 셀룰로스 제제, 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트래거캔스, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)이다. 원하는 경우, 붕해제, 예컨대 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 아가 또는 알긴산, 또는 그의 염, 예컨대 나트륨 알기네이트를 첨가할 수 있다. 임의로, 경구 제제는 내부 산 상태를 중화시키기 위한 염수 또는 완충액 중에서 제제화되거나, 또는 임의의 담체 없이 투여될 수도 있다. 경구 사용될 수 있는 재조합 바이러스 백신에는 젤라틴으로 제조된 푸쉬-핏 (push-fit) 캡슐, 및 또한 젤라틴 및 가소제, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질 밀봉 캡슐이 포함된다. 푸쉬-핏 캡슐은 충전제, 예컨대 락토스, 결합제, 예컨대 전분, 및/또는 윤활제, 예컨대 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트, 및 임의로 안정화제와의 혼합 상태로 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물을 적합한 액체, 예컨대 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해시키거나 또는 현탁시킬 수 있다. 추가적으로, 안정화제를 첨가할 수 있다. 경구 투여용으로 제형화된 마이크로구체 또한 사용할 수 있다. 이러한 마이크로구체는 당업계에 잘 정의되어 있다. 경구 투여용의 모든 제형은 상기 투여에 적합한 투여량 내에 있어야 한다.
전신 전달하는 것이 바람직한 경우, 재조합 바이러스 백신은 주사, 예를 들 어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 첨가된 보존제와 함께 단위 투여 형태, 예를 들어 앰플 또는 다중-용량 용기에 존재할 수 있다. 재조합 바이러스 백신은 오일성 또는 수성 비히클 중의 현탁제, 용액제 또는 에멀션제와 같은 형태를 취할 수 있으며, 제제 첨가제, 예컨대 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 비경구 투여용 재조합 바이러스 백신에는 수용성 형태 중의 활성 성분의 수용액제가 포함된다. 추가적으로, 활성 화합물 (i) 및/또는 (ii)의 현탁제를 적절한 오일상 주사 현탁제로서 제조할 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클에는 지방 오일, 예컨대 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포좀이 포함된다. 수성 주사 현탁제는 현탁제의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁제는 고도로 농축된 용액을 제조하도록 하기 위해 적합한 안정화제 또는 화합물의 용해도를 증가시키는 작용제 또한 함유할 수 있다.
별법으로, 활성 화합물 (i) 및/또는 (ii)는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 발열원이 없는 멸균수와의 구성을 위한 분말 형태일 수 있다. 또한, 재조합 바이러스 백신은, 예를 들어 통상적인 좌약 베이스, 예컨대 코코아 버터 또는 다른 글리세리드를 함유하는 좌약제 또는 체류 관장제로서 제제화될 수 있다. 추가적으로 재조합 바이러스 백신은 데포 제제로서 제제화될 수도 있다. 이러한 지속 작용 제제는 적합한 중합체 또는 소수성 물질 (예를 들어, 허용되는 오일 중 에멀션), 또는 이온 교환 수지, 또는 난용성 유도체, 예를 들어 난용성 염과 함께 제제화될 수 있다. 또한, 재조합 바이러스 백신은 적합한 고체 또는 겔 상 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 담체 또는 부형제의 예에는 탄산칼슘, 인산칼슘, 여러 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴 및 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리폴이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
적합한 액체 또는 고체 재조합 바이러스 백신 형태는 예를 들어 흡입용 수용액 또는 염수 용액이거나, 마이크로캡슐화되거나, 엔코클리에이트화 (encochleate) 되거나, 미세 금 입자로 코팅되거나, 리포좀내에 포함되거나, 연무형화되거나, 에어로졸이거나, 피부로의 이식을 위한 펠렛이거나, 또는 피부에 스크래칭되는 날카로운 형태로 건조된다. 또한, 제약 조성물에는 입제, 산제, 정제, 코팅된 정제, (마이크로) 캡슐제, 좌약제, 시럽, 에멀션제, 현탁제, 크림, 드롭스 또는 활성 화합물의 연장된 방출을 갖는 제제가 포함되며, 이러한 제제 부형제 및 첨가제 및/또는 보조제, 예컨대 붕해제, 결합제, 코팅제, 팽윤제, 윤활제, 착향제, 감미제 또는 가용화제가 상기 기재된 것과 같이 통상적으로 사용된다.
1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체는 자체로서 또는 제약상 허용되는 염 형태로서 투여할 수 있다. 의약에서 사용되는 경우, 염은 제약상 허용가능하여야 하되, 비-제약상 허용되는 염을 통상적으로 사용하여 그의 제약상 허용되는 염을 제조할 수 있다. 이러한 염에는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, p-톨루엔 술폰산, 타르타르산, 시트르산, 메탄 술폰산, 포름산, 말론산, 숙신산, 나프탈렌-2-술폰산 및 벤젠 술폰산으로부터 제조된 것들이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 이러한 염은 알칼리 금속 또는 알칼 리 토금속 염, 예컨대 카르복실산기의 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염으로서 제조될 수 있다.
적합한 완충제에는 아세트산 및 염 (1-2％ w/v); 시트르산 및 염 (1-3％ w/v); 붕산 및 염 (0.5-2.5％ w/v); 및 인산 및 염 (0.8-2％ w/v)이 포함된다. 적합한 보존제에는 벤즈알코늄 클로라이드 (0.003-0.03％ w/v); 클로로부탄올 (0.3-0.9％ w/v); 파라벤 (0.01-0.25％ w/v) 및 티메로살 (0.004-0.02％ w/v)이 포함된다.
통상적으로, 재조합 바이러스 백신은 단위 투여 형태로 존재할 수 있으며, 약학 업계에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 모든 방법은 화합물 (i) 및 (ii)를 하나 이상의 부 성분을 구성하는 담체와 회합하도록 하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 화합물을 액체 담체, 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 균질하게 잘 회합하도록 하고, 이후 필요한 경우 생성물을 조형하여 조성물을 제조한다. 액체 투여 단위는 바이알 또는 앰플이다. 고체 투여 단위는 정제, 캡슐제 및 좌약제이다. 환자의 치료를 위하여, 화합물의 활성, 투여 방법, 면역화의 목적 (즉, 예방적 또는 치료적), 장애의 성질 및 중증도, 환자의 연령 및 체중에 따라서, 상이한 용량이 필요할 수 있다. 주어진 용량의 투여는 개개 투여 단위 형태 또는 달리 여러 유사한 투여 단위의 단일 투여에 의해 수행될 수 있다. 별개의 주 또는 달의 특정 간격에서의 용량의 다중 투여는 항원-특이적 반응의 촉진에 유용하다.
다른 전달 시스템은 시간-방출 (time-release), 지연 방출 또는 지속 방출 전달 시스템을 포함할 수 있다. 이러한 시스템은 제조합 바이러스 백신의 화합물의 반복된 투여를 피하여, 대상체 및 의사에 대한 편의를 증가시킬 수 있다. 여러 형태의 방출 전달 시스템이 이용가능하며 당업자들에게 알려져 있다. 이들에는 중합체 베이스 시스템, 예컨대 폴리(락티드-글리콜리드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리히드록시부티르산 및 폴리안히드라이드가 포함된다. 약물을 함유하는 상기 중합체의 마이크로캡슐은 예를 들어 US 5,075,109에 기재되어 있다. 또한, 전달 시스템은 비-중합체 시스템, 즉 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 및 지방산, 또는 중성 지방, 예컨대 모노-, 디- 및 트리-글리세리드; 히드로겔 방출 시스템; 실라스틱 (sylastic) 시스템; 펩티드계 시스템; 왁스 코팅; 통상적인 결합체 및 부형제를 사용하는 압축 정제; 및 부분 융합된 이식물 등을 포함한다. 특정 예에는 (a) 침식 시스템 (여기서, 본 발명의 작용제는 US 4,452,775, 4,675,189 및 5,736,152에 기재된 것과 같이 매트릭스 내의 형태로서 함유됨) 및 (b) 확산 시스템 (여기서, 활성 성분은 US 3,854,480, 5,133,974 및 5,407,686에 기재된 것과 같이 중합체로부터의 제어된 속도로 퍼짐)이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 추가적으로, 펌프-기재 하드웨어 전달 시스템을 사용할 수 있으며, 이들 중 일부는 이식에 적합하다.
재조합 바이러스 벡터 [화합물 (i)] 및 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체 [화합물 (ii)]의 투여 형태는 본 발명에 따른 상기 재조합 바이러스 백신과 동일하거나 또는 상이할 수 있다 (예를 들어, 용액으로서 투여되는 화합물 (i) 및 크림으로서 투여되는 화합물 (ii)).
다른 측면에서, 본 발명은 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트에는 (i) 하나 이상의 본 발명의 재조합 바이러스 벡터 및 (ii) 하나 이상의 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 함유하는 용기, 및 화합물의 투여 타이밍에 대한 설명서가 포함된다. 용기는 (i) 하나 이상의 재조합 바이러스 백신 및 (ii) 하나 이상의 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 함께 수용하는 단일 용기일 수 있거나, 또는 개개 투여량의 화합물 (i) 및 (ii)를 수용하는 다중 용기 또는 챔버, 예컨대 블리스터 팩일 수 있다. 또한, 키트는 재조합 바이러스 백신의 투여 타이밍에 대한 설명서를 갖는다. 상기 설명서는 대상체가 재조합 바이러스 백신을 적절한 시간에서 취하도록 할 것이다. 예를 들어, 재조합 바이러스 백신의 전달을 위한 적절한 시간은 증상이 발생하는 시간과 같을 수 있다. 별법으로, 재조합 바이러스 백신의 투여를 위한 적절한 시간은 일반적인 일정, 예컨대 매달 또는 매년 중에 있을 수 있다. 화합물 (i) 및 (ii)는 상승적 면역 반응을 생성하기 위해 시간상 충분히 근접하여 투여되는 한 동시에 또는 별도로 투여될 수 있다.
바람직한 경우, 본 발명의 방법 또는 용도는 하나 이상의 통상적인 치료 기법 (예를 들어, 방사선, 화학요법 및/또는 수술)과 함께 수행할 수 있다. 다중 치료 방법의 사용은 환자에게 보다 폭넓은 개입을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 수술 개입 이전 또는 이후일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 방사선치료 (예를 들어, 감마 방사선) 이전 또는 이후일 수 있다. 당업자들은 사용할 수 있는 적절한 방사 치료 프로토콜 및 파라미터를 용이하게 수립할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Perez and Brady, 1992, Principles and Practice of Radiation Oncology, 2nd Ed. JB Lippincott Co] 침조; 당업자들에게 명백할 적절한 변형 및 변경을 사용함). 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법 또는 용도는 하나 이상의 약물 (예를 들어, HPV 감염, HPV-관련 병리학적 상태의 치료 또는 예방에서 통상 사용되는 약물)로의 화학요법과 관련되어 있다.
추가적으로, 본 발명은 화학요법제로의 화학요법 치료를 겪는 암 환자의 치료를 개선시키기 위한 방법에 관한 것이며, 이는 상기 개시된 것과 같은 재조합 바이러스 백신과 함께 상기 환자의 동시-치료를 포함한다.
추가적으로, 본 발명은 세포독성 약물 또는 방사선치료의 세포독성 효과를
Figure 112008087429530-PCT00008
개선시키는 방법에 관한 것이며, 이는 상기 개시된 것과 같은 재조합 바이러스 백신과 함께 상기 치료가 필요한 환자의 동시-치료를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법 또는 사용은 프라임 부스트 (prime boost) 치료 기법에 따라 수행되며, 이는 하나 이상의 프라이머 조성물 및 하나 이상의 부스터 조성물의 순차 투여를 포함한다. 전형적으로, 프라이밍 및 부스팅 조성물은 상이한 비히클을 사용하며, 이는 하나 이상의 항원 도메인을 공통적으로 포함하거나 또는 코딩한다. 먼저 프라이밍 조성물을 숙주 기관에 투여하고, 후속적으로 1일 내지 12개월의 기간 이후 부스팅 조성물을 동일한 숙주 기관에 투여한다. 본 발명의 방법은 프라이밍 조성물의 1회 내지 10회 순차 투여, 이어서 부스팅 조성물의 1회 내지 10회 순차 투여를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 주사 간격은 대략 1주 내지 6개월이다. 추가적으로, 프라이밍 및 부스팅 조성물은 동일하거나 또는 상이한 투여 경로로 동일하거나 또는 다른 부위에 투여할 수 있다. 예를 들어, HPV 초기 폴리펩티드에 기초한 조성물은 점막 경로로 투여할 수 있는 반면, 재조합 바이러스 백신은 바람직하게는 예를 들어 MVA 벡터에 대하여 피하 주사한다.
동물 또는 인간 유기체에의 투여시 항-HPV 면역 반응을 유발 또는 자극하는 능력은 당업계에 표준인 여러 분석법을 사용하여 실험관내 또는 생체내 평가할 수 있다. 면역 반응의 개시 및 활성화 평가에 이용가능한 기법의 일반적인 기재에 대해서는 예를 들어 문헌 [Coligan et al. (1992 and 1994, Current Protocols in Immunology; ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health)]을 참조한다. 세포 면역의 측정은 CD4+ 및 CD8+ T-세포로부터 유래된 세포를 비롯한 활성화된 이펙터 세포에 의해 분비되는 사이토카인 프로파일의 측정 (예를 들어, ELIspot에 의한 IL-10 또는 IFN 감마-생성 세포의 정량화), 면역 이펙터 세포의 활성화 상태의 측정 (예를 들어 전통적인 [3H] 티미딘 흡수에 의한 T 세포 증식 분석), 감작된 대상체에서의 항원-특이적 T 림프구에 대한 분석 (예를 들어, 세포 독성 분석에서의 펩티드-특이적 세포 용해)에 의해 수행될 수 있다. 호르몬 반응을 자극하는 능력은 항체 결합 및/또는 결합에서의 경쟁에 의해 측정할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press] 참조). 또한, 본 발명의 방법은 적절한 종양-유발 작용제가 투여된 동물 모델 (예를 들어, HPV-E6 및 E7-발현 TC1 세포)에서 추가로 입증되어, 항-HPV 면역 반응의 유발 또는 증진을 반영하 는 항-종양 활성을 측정할 수 있다.
본 발명과 관련하여 특별히 치료할 수 있는 질환 상태는 예를 들어 경추 암 또는 상기 악성 종양 형성의 전구 병변이며, 이는 경추 상피내 종양 형성 (CIN) 또는 상피내병변 (SIL)으로 불린다. 또한, 본 발명의 재조합 바이러스 백신은 DNA 진단에 의해 확인된 환자에서의 자궁 경부의 무증상의 감염, 또는 경추 암, CIN 또는 SIL의 수술 치료 이후 남아있는 것으로 추정되는 무증상의 감염, 또는 역학적 이론에 따라 존재하는 것으로 가정되는 무증상의 감염의 치료에 유용하다. 또한, 치료되는 질환 상태에는 생식기 사마귀, 및 보통 사마귀 및 발바닥 사마귀가 포함된다. 또한, 이들 모든 상태는 다수의 다른 HPV 형태에 의해 유발되며, 본 발명의 작용제, 화합물 및 방법이 이들 바이러스에 대하여 이를 유용하게 지배할 수도 있다. 이들 병변 모두는 거의 대부분 진단되지 않는 무증상의 감염으로부터 유래될 수 있다. 또한, 본 발명은 이들 무증상의 감염 모두에 대하여 유용하게 표적화될 수 있다.
본 발명은 예시적 방식으로 기재되어 있으며, 사용되는 용어는 제한하려고 하기보다는 단어 표현의 본질에 있도록 하려는 것으로 이해된다. 명백하게, 상기 교시에 비추어 본 발명의 여러 변형 및 변경이 가능하다. 이에 따라, 첨부된 특허청구범위 범주 내에서, 본 발명은 본원에서 구체적으로 기재된 것과는 상이한 방식으로 실시될 수 있다고 이해된다.
상기 인용된 특허 문헌, 공보 및 데이터베이스 항목 모두는 각각의 상기 개별 특허, 공보 또는 항목이 구체적이며 개별적으로 참고 문헌으로 포함된다고 나타 내는 것과 동일한 정도로 그의 전문이 본원에 구체적으로 포함된다.
도 1a/b/c/d: MVATG8042의 피하 주사와 이미퀴모드의 국부 투여 간 조합의 치료 효과. 도 1b: 실험 1: 그룹당 15마리의 마우스에, 2.105 TCI 피하, 5.106 pfu로 3회 피하 주사; 도 1c: 실험 2: 그룹당 15마리의 마우스에, 2.105 TCI 피하, 5.106 또는 5.105 pfu로 3회 피하 주사; 도 1d: 실험 3: 그룹당 15마리의 마우스에, 2.105 TCI 피하, 5.106 pfu로 3회 피하 주사.
도 2a/2b: E7/E6 특이 IFNγ 분비 림프구의 빈도 측정. 도 2b: E6/E7 특이 INF감마/Elispot Th1 반응.
도 3: IL-4 ELISPOT 검정법. E7 특이 IL-4/Elispot Th2 반응.
도 4a/4b: R9F-특이 CD8+ T 세포의 유동세포계수 분석. Tet_R9F+ E7 특이 CD8+ T 세포의 빈도 측정.
도 5a/5b: E7-특이 체액성 면역 반응. Th1/Th2 이소타입 IgG 전환의 측정.
도 6: MVA-특이 중화 항체 역가 (NAT50).
도 7: RenCa-Muc1 종양 모델에서 알다라 + MVATG9931 조합물의 치료 효과.
도 8: 짧은 에피토프 또는 긴 에피토프에 대한 MUC1-특이 Th1 유형 T 세포 반응 상 이미퀴모드의 효과.
도 9: IL-4 elispot 검정법: MUC-1 특이 Th2 유형 T 세포 반응 상 이미퀴모드의 효과.
도 10: MUC1 특이 체액성 면역 반응 (이소타입 전환): MUC1 특이 체액성 반응 상 이미퀴모드의 효과.
A - HPV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터.
1. 재료 및 방법
1.1. 시험 품목
명칭 및 각 재조합 벡터 작제 (MVA에 기반)에 관한 간단한 설명
바이러스 명칭 배취 농도 (pfu/ml) E6tm/E7tm 프로모터 hIL-2 프로모터
MVAN33 4,5.109 pfu/ml - -
MVATG8042 3,1.109 pfu/ml P7.5 PH5R
저장 조건:
바이러스를 주사 당일까지 -80℃에서 유지시켰다. 바이러스 현탁액은 희석 및 투여 직전에 신속하게 해동시켰다.
바이러스를 완충액 트리스/HCl 10 mM, 수크로스 5％ (w/v), 10 mM NaGlu, 50 mM NaCl, pH 8.0에 희석시켜, 100 ㎕ 부피의 필요 용량을 수득하였다.
1.2. 동물 모델
종/균주/공급원:
SPF의 건강한 암컷 C57Bl/6 마우스를 찰스 리버(Charles River) (프랑스 레 옹생 소재)로부터 입수하였다.
동물은 도착시에 6주령이었다. 실험 시작시에는 7주령이 되었다.
시간당 최소 11회에 걸쳐 공기를 교체해 주도록 조절되는 단일 전용실에 동물을 수용시켰다. 온도 및 상대 습도 범위는 각각 20℃ 내지 24℃, 및 40 내지 70％였다. 조명을 자동으로 조절하여 12시간의 명기와 12시간의 암기를 주기로 제공하였다. 감시 동물의 규칙적인 통제에 의해 특정 병원체 부재 상태를 체크하였다.
전 연구 기간에 걸쳐 동물은 멸균된 섭식 유형 RM1 (생 그라띠엥 소재의 다이어텍스 프랑스(Dietex France))에 임의대로 접근하였다. 멸균수는 병을 통해 임의대로 제공받았다.
모든 동물은 실험 개시 전에 1주일 동안 순응시켰다.
1.3. 세포 설명
C57Bl6 마우스의 폐로부터 수득한 TC1 종양 세포를 2개의 레트로바이러스: HPV16으로부터 E6 및 E7을 발현하는 LXSN16E6E7, 및 ras 유전자를 발현하는 pVEJB로 형질도입시켰다. 0.5 mg/ml G418 및 0.2 mg/ml 하이그로마이신을 함유하는 DMEM에서 세포를 배양하였다. 트립신 처리하여 부착성 세포를 제거하고, 3회에 걸쳐 세척한 후, 2.105 TC1 생존 세포를 사용하여 피하로 종양을 접종하였다.
1.4. 알다라™ (3M 파머수티컬즈(3M Pharmaceuticals))
알다라™는 이미퀴모드에 대한 상표명이다. 5％ 크림은 그램당 이소스테아르산, 세틸 알콜, 스테아릴 알콜, 백색 바셀린, 폴리소르베이트 60, 소르비탄 모노스테아레이트, 글리세린, 크산탄 검, 정제수, 벤질 알콜, 메틸파라벤 및 프로필파 라벤으로 이루어진 회백색 수중유 배니싱 크림 기재의 이미퀴모드 50 mg을 함유한다.
1.5. 프로토콜
면역화 스케줄:
면역치료 실험을 위해, D1일째에 우측 옆구리를 통해 15마리의 C57Bl6 암컷 마우스에 2.105 TC1 세포를 피하 접종하였다. D8, D15 및 D22일째에 5.106 pfu 또는 5.105 pfu의 백시니아 바이러스를 사용하여 3회에 걸쳐 마우스를 3개의 원위 부위에서 피하로 처리하였다. 각각의 면역화 직전에 이미퀴모드 (알다라 5％ 크림; 3M 파머수티칼즈)를 마우스의 면도한 피부 (대략 1 ㎠)의 주사 부위에 국부 적용하였다. 각각의 마우스는 면역화마다 마우스당 대략 0.8 mg 또는 1.6 mg의 활성 이미퀴모드를 적용받았다. 캘리퍼를 사용하여 80일 동안 주당 2회에 걸쳐 종양 성장을 모니터링하였다. 마우스의 종양 크기가 직경 25 mm보다 클 때, 또는 종양이 상기보다는 작지만 마우스가 통증을 보일 때에는 윤리적인 이유에서 마우스를 안락사시켰다.
면역원성 연구를 위해, D1, D8 및 D15일째에 3마리의 종양 부재 C57Bl6 암컷 마우스를 5.107 pfu 또는 5.106 pfu의 백시니아 바이러스를 사용하여 3개의 원위 부위에서 피하로 백신화하였다. 상기 용량은 HPV 특이 항원에 대한 세포 면역성에 관한 검출을 최적화하기 위하여 사용되었다. 각각의 면역화 직전에 이미퀴모드를 마우스의 면도한 피부 (대략 1 ㎠)의 주사 부위에 국부 적용하였다. 각각의 마우 스는 면역화마다 마우스당 대략 0.8 mg 또는 1.6 mg의 활성 이미퀴모드를 적용받았다. 면역학적 분석을 위해 D22일째에 비장 및 혈청을 제거하였다.
모니터링의 매개변수:
* Elispot에 의한 IFN감마 (Th1) 또는 IL-4 (Th2) 분비 세포의 개수/빈도 측정
셀 스트레이너(Cell Strainer) (BD 팰콘(BD Falcon))를 사용하여 신선한 비장 세포를 준비하였다. 모든 펩티드는 네오시스템(Neosystem)에 의해 면역등급 수준 (10 mg)으로 합성하였다. 각 펩티드를 DMSO에 10 mg/ml로 용해시키고 4℃에서 저장하였다. 맵테크(Mabtech) AB 마우스 IFN감마 ELISPOTPLUS 키트 또는 마우스 IL-4 ELISPOTPLUS 키트 (프랑스 소재의 맵테크)를 제조사의 설명서에 따라 사용하여 Elispot을 수행하였다. 96-웰 니트로셀룰로스 플레이트를 탄산나트륨 완충액 중 3 ㎍/ml의 모노클로날 래트 항-마우스 IFN감마 항체 (클론(Clone) R4-6A2; 파밍겐(Pharmingen), 카탈로그 nr551216, 로트 M072862; 100 ㎕/웰)로 코팅하였다. 플레이트를 밤새도록 4℃에서 또는 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 DMEM 10％ FCS로 3회에 걸쳐 세척하고, 2시간 동안 37℃에서 100 ㎕ DMEM 10％ FCS/웰로 포화시켰다. 비장 림프구를 106개 세포/100 ㎕의 농도로 플레이팅하였다. 인터루킨 2를 6 U/50 ㎕/웰 (R&D 시스템즈(R&D Systems)) (10 ng/ml)의 농도로 모든 웰에 첨가하였다. 콘카나발린 A를 양성 대조군으로 사용하였다 (5 ㎍/ml). HPV 특이 펩티드는 5 ㎍/ml의 농도로 사용하였다. 플레이트를 37℃, 5％ CO2에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 1X로 1회 및 PBS-트윈 0.05％로 5회에 걸쳐 플레이트를 세척하였다. 비오틴화된 항-마우스 IFN감마 (클론 XMG 1.2, 파밍겐)를 0.3 ㎍/100 ㎕/웰의 농도로 첨가하고, 천천히 교반하면서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBS-트윈 0.05％로 5회에 걸쳐 플레이트를 세척하였다. PBS-트윈 0.05％-FCS 1％ 중에 1/5000으로 희석시킨 엑스트라비딘(Extravidin) AKP (미주리주 세인트루이스 소재의 시그마(Sigma))를 또한 웰에 첨가하였다 (100 ㎕/웰). 플레이트를 실온에서 45분 동안 인큐베이션한 후, PBS-트윈 0.05％로 5회에 걸쳐 세척하였다. 바이오래드 키트(Biorad Kit)를 사용하여 IFN감마 분비에 관해 나타내었다. 100 ㎕의 기질 (NBT+BCIP)을 웰마다 첨가하고, 플레이트를 ½시간 동안 실온에 방치해 두었다. 플레이트를 물로 세척하고, 실온에서 밤새도록 건조시켰다. 해부 현미경을 사용하여 스폿을 계수하였다. Elispot 판독기인 바이오리더(Bioreader) 4000 Pro-X (프랑스 세를라보 소재의 바이오시스-게엠베하(BIOSYS-Gmbh))를 사용하여 스폿을 계수하였다.
시험한 펩티드 목록:
SCVYCKKEL (E6; Db): S9L 펩티드
RCIICQRPL (E6; Db): R9L 펩티드
SEYRHYQYS (E6; Kb): S9S 펩티드
ECVYCKQQL (E6; Db): E9L 펩티드
TDLHCYEQL (E7; Kb): T9L 펩티드
RAHYNIVTF (E7; Db): R9F 펩티드
비관련 펩티드 (MUC1 특이)
D38L (E7; Db)은 38개 아미노산 길이의 E7-특이 펩티드이다. 재조합 정제 E7 단백질을 또한 상이한 ELISPOT 검정법에서 사용하였다.
* R9F 사량체 특이 CD8+ T 세포의 빈도 측정
신선한 비장 세포를 수거하고, BD 특이 시브 (셀 스트레이너)를 사용하여 준비시켰다. 비장 림프구를 24 웰 플레이트에서 R9F 펩티드 (5 ㎍/ml)를 사용하여 5일 동안 자극시키거나, 특이적 표지화에 직접 사용하였다. 4℃에서 30분 동안 1.106 세포를 1 ㎕의 APC-커플링된 마우스 CD8 특이 항체 (BD 파밍겐 553035; 클론 53-6.7; 로트 n°32567) 및 10 ㎕의 R9F 특이 H-2Db 사량체 (벡크만 쿨터(Beckman Coulter) T20071; H-2Db/PE; 펩티드 RAHYNIVTF; 로트 C507117; C602110)로 염색하였다. 세포를 세척한 후, PBS/0.5％ PFA 중에 희석시켰다.
* E7 항원에 대한 Th1/Th2 관련 IgG 이소타입 전환의 측정
* 96-웰 플레이트를 밤새도록 4℃에서 3 ㎍/ml의 E7 정제 단백질로 코팅하였다 (P#2101 보고서 PC00001; 157페이지; 2002년 10월). 단백질을 코팅 완충액 (200 mM NaHCO3, 8O mM Na2CO3, pH 9.5)에 희석시켰고, 웰당 100 ㎕를 첨가하였다.
* 웰을 5회에 걸쳐 플레이트 세척액 (PBS, 0.1％ 트윈 20, 10 mM EDTA)으로 세척하고 1시간 동안 실온에서 300 ㎕ PBS + 3％ BSA로 포화시켰다.
* 웰을 5회에 걸쳐 세척하고 마우스 혈청의 ½ 연속 희석액 (PBS + 1％ BSA 중에 1/25에서 1/1600까지)과 함께 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
* 플레이트를 5회에 걸쳐 세척하였다. PBS + 1％ BSA 중에 1/1000으로 희석시킨 과산화효소-접합된 래트 항-마우스 IgG2a (BD 파밍겐 553391) 또는 래트 항-마우스 IgG1 (BD 파밍겐 559626)을 첨가하고 (100 ㎕/웰) 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
* 웰을 5회에 걸쳐 세척하고 100 ㎕ 기질 용액 (0.05 M 시트르산, 0.05 M 아세트산나트륨, 1％ 테트라메틸벤지딘, 0.015％ H2O2)/웰을 사용하여 나타내었다.
TMB 용액 (10 ml) = 140 ㎕ TMB + 2 ㎕ H2O2 + 5 ml Na 아세테이트 (0.1 M) + 5 ml 시트레이트 (0.1 M)
* 100 ㎕의 0.8 M H2SO4/웰을 첨가함으로써 반응을 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였다 (제네시스 시스템(Genesys system)).
* 백신화에 의해 유도된 MVA-중화 항체의 분석
세포: BHK-21 (햄스터 섬유모세포, Ref ATCC: CCL-10)
MVA-GFP (MVATGl5938): 리포터 녹색 형광 단백질을 p11K7.5 프로모터의 제어하에 MVA 결실부 III에 삽입하였다.
단계 1: 혈청의 중화:
- 모든 혈청은 사용 전에 30분 동안 56℃에서 가열함으로써 보체를 제거하였다.
- 양성 대조군: 폭스바이러스 (WR 균주) (Ref. Ac WR IMVQC34)로 면역화시킨 토끼로부터의 혈청.
단계 2: 혈청중화 분석법 (항-MVA 항체 역가를 중화하는 SOP 측정)
- 혈장을 배지 중에 연속 희석시키고 (50x에서 3200x까지의 희석 범위) MVA-GFP (5x103 pfu/웰)와 함께 96-웰 마이크로플레이트에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다 (중화 단계). 그 후, BHK-21 세포 (105개 세포/웰)를 시딩하고 추가 16-18시간 동안 37℃, 5％ CO2에서 인큐베이션하였다.
- 다음날, 96-웰 마이크로플레이트를 250 ㎕의 PBS로 세척하고 100 ㎕의 PBS를 각각의 웰에 첨가한 후, 형광 마이크로플레이트 판독기 (빅터™(VICTOR™) 퍼킨엘머®(PerkinElmer®))를 사용하여 형광 강도를 판독하였다. 중화 항체 역가는 바이러스 활성이 50％ 억제되는 역가이다. 중화 항체 역가 (NAT50)를 스피어맨-카버(Spearman-Karber) 방법을 사용하여 계산하였다.
2. 결과
3개의 독립적인 치료 실험을 재료 및 방법 섹션에 기재된 모델에 따라 수행하였다.
모든 실험에서, 백신화 부위에 대한 알다라™ 크림 (5％)의 국부 적용은 MVATG8042의 치료 효능을 유의하게 증가시킨다는 것이 일관적으로 관찰되었다 (도 1a, b, c 및 d 참조). 상기 세팅에서, 5.106 pfu의 MVATG8042에 의한 백신화는 각 실험 종결시까지 평균 45％ 종양 부재 마우스를 유도한 반면, MVATG8042를 각각 0.8 mg 또는 1.6 mg 이미퀴모드와 조합하여 사용한 경우에는 75％ 및 95％ 종양 부재 동물이 관찰되었다.
한 실험 시리즈 (도 1c 참조)에서는, 알다라™의 첨가에 의해서, 로그값이 1 낮은 용량의 바이러스 (5.105 pfu)로도 동일한 치료 효능에 도달하게 되는 것이 또한 관찰되었다.
상이한 그룹 간의 생체내 생존 실험에서의 통계적 차이는 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선의 로그 순위 응용 프로그램 (스태트소프트 인크.(Statsoft Inc.)의 스태티스티카(Statistica) 5.1 소프트웨어)을 사용하여 평가하였다. p≤0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주한다.
상기와 병행하여, E6 및 E7 HPV 항원에 대한 세포성 반응 및 체액성 반응 둘 다의 유도를 평가하기 위한 2개의 독립적인 연구를 수행하였다. 마우스를 프로토콜 섹션에 기재되어 있는 바와 같이 백신화시켰다. 두 실험에서, ELISPOT 검정법을 사용하여 E6 또는 E7-특이 IFN감마 분비 세포의 수를 계수하였다. 이들 결과는 알다라™의 국부 적용이 MVATG8042 단독으로 얻어진 것과 비교해서 MHC I형 제한 CD8+ T 세포의 수를 유의하게 증가시킨다는 것을 나타내었다 (도 2a 및 b). 알다라™ + MVATG8042 그룹에는 보다 광범위한 에피토프에 대한 낮은 반응이 존재하였다 (펩티드 S9S 및 T9L). 상기와 병행하여, 별도의 실험에서 E7-특이 IL-4 분비 세포의 수는 MVA 단독 그룹에서보다 MVATG8042 + 알다라™에서 낮았다 (도 3). 종합하면, 이들 데이터는 MVATG8042 + 알다라™의 조합물이 E6 및 E7 항원에 대한 Th1-기 반 세포성 면역 반응을 증진시킨다는 것을 나타낸다.
E7-특이 면역우세 에피토프 R9F에 의한 시험관내 자극 전후에 유동세포계수법에 의해서 CD8+/R9F 사량체+ 비장 림프구의 빈도를 추가로 분석하였다 (도 4a). 이들 결과는, R9F 면역우세 에피토프의 인식은 CD8+ 특이 T 세포에 의해 뚜렷이 매개된다는 것을 나타낸다. R9F-Db-제한 CD8+ 군집의 빈도는 비장에서는 낮고, 이들 군집은 펩티드에 의한 시험관내 자극 후에는 보다 잘 검출된다. 도 4b에 나타낸 실험에서, 알다라™에 의한 전처리는 R9F-Db-특이 CD8+ T 세포의 수를 유의하게 증진시켰다.
끝으로, ELISA에 의해 E7 항원에 대한 체액성 반응의 측정을 또한 수행하였다. 알다라™ + MVATG8042 조합물에 의해 유도되는 반응의 유형을 보다 잘 특성화하기 위해, IgG 이소타입 전환을 분석하였다. E7-특이 IgG1 및 IgG2a를 검출하였다. 데이터 (도 5)는 알다라™의 국부 적용이 조합 치료의 효능에 있어서 의미를 가질 수 있는 전형적인 Th1 프로파일 (IgG1보다 높은 IgG2a 역가, 도 5a)을 유도한다는 것을 나타낸다. 이들 결과를 제2 실험에서 확인하였다 (도 5b).
끝으로, MVA-특이 중화 항체의 수준을 측정하여 MVATG8042와 조합한 알다라의 영향을 분석하였다 (도 6). 결과는 조합한 MVATG8042 및 알다라™가 유사하게 주사된 MVA 단독과 비교할 때 얻어진 MVA-특이 중화 항체의 역가를 감소시킨다는 것을 나타낸다. 이는 특이 항원에 의한 중화에 대해 보호할 수 있는 알다라™ 크 림의 국부 적용에 의해 생성된 환경으로 설명될 수 있다.
B - 종양 항원 MUC1을 발현하는 재조합 바이러스 벡터
2.1. 시험 품목
각 재조합 벡터 작제물 (MVA 기반)의 명칭 및 그에 관한 간단한 설명
바이러스 명칭 배취 번호 배취 농도 (pfu/ml) 코딩된 유전자
MVAN33 P925PB 2.4.109 pfu/ml -
MVATG9931 P920W1 1.5.109 pfu/ml MUC1; hIL-2
저장 조건:
바이러스를 몰레큘라 이뮤놀로지 디파트먼트(Molecular Immunology Department)로부터 받은 후, 주입 당일까지 -80℃에서 유지시켰다. 바이러스 현탁액은 희석 및 투여 직전에 급속 해동시켰다.
사용하기 전의 희석 조건:
바이러스를 TG0008 완충액 (트리스/HCl 10 mM, 사카로스 5％ (w/v), 10 mM NaGlu, 50 mM NaCl, pH 8.0) 중에서 희석시켜 100 ㎕ 부피의 필요한 용량을 얻었다.
2.2 동물 모델
종/균주/공급원:
SPF의 건강한 암컷 B6D2 및 C57Bl/6 마우스를 찰스 리버(Charles River) (프랑스 레 온신에 소재)로부터 입수하였다.
동물은 도착시 6주령된 것이었다. 실험 시작시에는 7주령이 되었다. 시간당 최소 11회에 걸쳐 공기를 교체해 주도록 에어-컨디셔닝되는 단독 전용실에 동물 을 수용시켰다. 온도 및 상대 습도 범위는 각각 20℃ 내지 24℃ 이내, 및 40 내지 70％였다. 12시간의 명기와 12시간의 암기의 주기를 제공하도록 조명을 자동 조절시켰다. 연구 전 기간에 걸쳐 동물이 멸균된 사료 타입 RM1 (다이어트엑스(Dietex), 프랑스 쌩 그라띠엔)을 자유급이하도록 하였다. 멸균수는 병을 통해 자유급이되었다.
2.3. 세포 설명
RenCa-MUC1 종양 세포 : RenCa는 실험용 뮤린 신장암 모델이다. 전통적인 Ca2+ 포스페이트 형질감염 방법을 사용하여 RenCa 세포를 pHMG-ETAtm (MUC-1) 및 pY3 (하이그로마이신 B 내성)로 형질감염시켰다. 10％ 불활성 우태혈청, L-글루타민 (2 mM), 젠타마이신 (0.04 g/l) 및 하이그로마이신 (600 ㎍/ml, 로슈 디아그노스틱(Roche Diagnostic))이 보충된 DMEM (둘베코(Dulbecco) 변형된) 중에서의 클론 희석 후에 클론을 선별하였다. H23 모노클로날 항체를 이용하여 유동세포계수 분석법 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)의 FACScan 사용)으로 MUC-1 발현을 분석하였다. 부착성 세포를 PBS/EDTA 처리에 의해 제거하고 3회 세척 후에, 3.105 RenCa-MUC1 (클론 4) 생육성 세포를 사용하여 피하로 종양에 접종하였다.
2.4. 프로토콜
면역화 스케줄:
면역치료학적 실험을 위해, D1일째에 15마리의 B6D2 암컷 마우스에 피하로 우측 옆구리에 3.105 RenCa-MUC1 세포를 접종하였다. D4, 11 및 18일째에 5.107 pfu의 폭스바이러스 (MVA 균주)로 마우스를 멀리 떨어져 있는 3 부위에 피하로 3회 처리하였다. 마우스의 면도한 피부 (대략 10 ㎠)에 주입 부위에서의 각각의 면역화 직전에 이미퀴모드를 국부 적용하였다. 각각의 마우스에 1회 면역화마다 마우스 당 활성 이미퀴모드 대략 1 mg을 투여하였다. 캘리퍼를 사용하여 80일 동안 주당 2회에 걸쳐 종양 성장을 모니터링하였다. 마우스의 종양 크기가 직경 25 mm 보다 클 때, 또는 종양이 상기보다 작아도 마우스가 통증을 보일 때에는 윤리적인 이유에서 마우스를 안락사시켰다.
면역원성 연구를 위해, D1, 8 및 15일째에 3마리의 C57B16 암컷 마우스를 5.107 pfu의 폭스바이러스 (MVA 균주)로 멀리 떨어져 있는 3 부위에 피하로 백신화하였다. MUC1 특이 항원에 대한 세포 면역의 검출을 최적화하기 위하여 상기 용량을 사용하였다. 마우스의 면도한 피부 (대략 10 ㎠)에 주입 부위에서의 각각의 면역화 직전에 이미퀴모드를 국부 적용하였다. 각각의 마우스에 1회 면역화마다 마우스 당 활성 이미퀴모드 대략 1 mg을 투여하였다. 면역학적 분석을 위해 D22일째에 비장 및 혈청을 제거하였다.
모니터링의 파라미터:
* Elispot에 의한 IFNγ 분비 세포의 갯수/빈도 측정
림포라이트(Lympholite) 정제 완충액을 사용하여 신선한 비장 세포를 준비하였다. 모든 펩티드를 네오시스템(Neosystem)에 의해 면역등급 수준 (10 mg)으로 합성하였다. 각 펩티드를 DMSO에 10 mg/ml로 용해시키고 4℃에서 저장하였다. 96-웰 니트로셀룰로스 플레이트를 탄산나트륨 완충액 중 3 ㎍/ml의 모노클로날 래트 항-마우스 IFNγ 항체 (클론(Clone) R4-6A2; 파밍겐(Pharmingen), 카탈로그 nr551216, 로트 M072862; 100 ㎕/웰)로 코팅하였다. 플레이트를 밤새 4℃에서 또는 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 DMEM 10％ FCS로 3회 세척하고, 2시간 동안 37℃에서 100 ㎕ DMEM 10％ FCS/웰로 포화시켰다. 비장림프구를 106개 세포/100 ㎕의 농도로 플레이팅시켰다. 인터루킨 2를 6 U/50 ㎕/웰 (R&D 시스템즈, 10 ng/ml)의 농도로 모든 웰에 첨가하였다. 콘카나발린(Concanavalin) A를 양성 대조군으로 사용하였다 (5 ㎍/ml). MUC1 특이 펩티드는 5 ㎍/ml의 농도로 사용하였다. 플레이트를 37℃, 5％ CO2에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다. PBS 1X로 1회, 또한 PBS-트윈 0.05％로 5회에 걸쳐 플레이트를 세척하였다. 비오틴화된 항-마우스 IFNγ (클론 XMG1.2, 파밍겐)를 0.3 ㎍/100 ㎕/웰의 농도로 첨가하고, 천천히 교반시키면서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. PBS-트윈 0.05％로 5회에 걸쳐 플레이트를 세척하였다. PBS-트윈 0.05％-FCS 1％ 중에 1/5000으로 희석된 엑스트라비딘(Extravidin) AKP (미주리주 세인트루이스에 소재하는 시그마(Sigma)) 또한 웰에 첨가하였다 (100 ㎕/웰). 플레이트를 실온에서 45분 동안 인큐베이션시킨 후, PBS-트윈 0.05％로 5회에 걸쳐 세척하였다. 바이로래드 키트(Biorad Kit)를 사용하여 IFNγ 분비를 나타냈다. 100 ㎕의 기질 (NBT+BCIP)을 웰마다 첨가하고, 플레이트를 ½시간 동안 실온에 방치해 두었다. 물로 플레이트를 세척하고, 실온에서 밤새 방치하여 건조시켰다. 해부 현미경을 사용하여 스폿 을 계수하였다.
* Elispot에 의한 IL-4 분비 세포의 갯수/빈도 측정
림포라이트 정제 완충액을 사용하여 신선한 비장 세포를 준비하였다. 모든 펩티드를 네오시스템에 의해 면역등급 수준 (10 mg)으로 합성하였다. 각 펩티드를 DMSO에 10 mg/ml로 용해시키고 4℃에서 저장하였다. 96-웰 니트로셀룰로스 플레이트를 탄산나트륨 완충액 중 3 ㎍/ml의 모노클로날 항-마우스 IL-4 항체 (파밍겐, 카탈로그 nr551878, 로트 27401; 100 ㎕/웰)로 코팅하였다. 플레이트를 밤새 4℃에서 또는 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 DMEM 10％ FCS로 3회 세척하고, 2시간 동안 37℃에서 100 ㎕ DMEM 10％ FCS/웰로 포화시켰다. 비장림프구를 106개 세포/100 ㎕의 농도로 플레이팅시켰다. 인터루킨 2를 6 U/50 ㎕/웰 (R&D 시스템즈, 10 ng/ml)의 농도로 모든 웰에 첨가하였다. 콘카나발린 A를 양성 대조군으로 사용하였다 (5 ㎍/ml). MUC1 특이 펩티드는 5 ㎍/ml의 농도로 사용하였다. 플레이트를 37℃, 5％ CO2에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다. PBS 1X로 1회, 또한 PBS-트윈 0.05％로 5회에 걸쳐 플레이트를 세척하였다. 비오틴화된 항-마우스 IL-4 (파밍겐)를 0.2 ㎍/100 ㎕/웰의 농도로 첨가하고, 천천히 교반시키면서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. PBS-트윈 0.05％로 5회에 걸쳐 플레이트를 세척하였다. PBS-트윈 0.05％-FCS 1％ 중에 1/5000으로 희석된 엑스트라비딘 AKP (미주리주 세인트루이스에 소재하는 시그마) 또한 웰에 첨가하였다 (100 ㎕/웰). 플레이트를 실온에서 45분 동안 인큐베이션시킨 후, PBS-트윈 0.05％로 5회 에 걸쳐 세척하였다. 바이로래드 키트를 사용하여 IFNγ 분비를 나타냈다. 100 ㎕의 기질 (NBT+BCIP)을 웰마다 첨가하고, 플레이트를 ½시간 동안 실온에 방치해 두었다. 물로 플레이트를 세척하고, 실온에서 밤새 방치하여 건조시켰다. 해부 현미경을 사용하여 스폿을 계수하였다.
시험한 펩티드 목록:
F9L FLSFHISNL (H-2Kb; Heukamp, 2001)
A9A APGSTAPPA (H-2Db)
T24P TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP
G23D GQDVTLAPATEPASGSAATWGQD
V23S VTGSGHASSTPGGEKETSATQRS
비관련 펩티드/R9F RAHYNIVTF (E7; Db)
* MUC1 항원에 대한 Th1/Th2 관련 IgG 이소형 스위치의 측정
* 96-웰 플레이트를 3 ㎍/ml의 T24P MUC1 특이 펩티드로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 펩티드를 코팅 완충액 (200 mM NaHCO3, 80 mM Na2CO3, pH 9.5)으로 희석시켜 웰마다 100 ㎕를 첨가하였다.
* 웰을 플레이트 세척액 (PBS, 0.1％ 트윈 20, 10 mM EDTA)으로 5회에 걸쳐 세척하고, 300 ㎕의 PBS + 3％ BSA로 실온에서 1시간 동안 포화시켰다.
* 웰을 5회에 걸쳐 세척하고 2시간 동안 실온에서 마우스 혈청의 ½ 연속 희석액 (PBS + 1％ BSA 중 1/25 내지 1/1600)과 함께 인큐베이션시켰다.
* 플레이트를 5회에 걸쳐 세척하였다. PBS + 1％ BSA 중에 1/1000으로 희석된 퍼옥시다제-콘쥬게이션 래트 항-마우스 IgG2a (BD 파밍겐 553391) 또는 래트 항-마우스 IgG1 (BD 파밍겐 559626)을 첨가하고 (100 ㎕/웰) 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다.
* 웰을 5회에 걸쳐 세척하고 웰 당 100 ㎕의 기질 용액 (0.05 M 시트르산, 0.05 M 아세트산나트륨, 1％ 테트라메틸벤지딘, 0.015％ H2O2)으로 나타냈다.
TMB 용액 (10 ml) = 140 ㎕ TMB + 2 ㎕ H2O2 + 5 ml 아세트산나트륨 (0.1 M) + 5 ml 시트레이트 (0.1 M)
* 웰 당 100 ㎕의 0.8 M H2SO4를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 흡광도를 450 nm (제네시스 시스템(Genesys system))에서 측정하였다.
3 - 결과
프로토콜 섹션에 기술되어 있는 바와 같이 RenCa-MUC1 피하 모델에서 치료학적 실험을 실시하였다. 본 발명자들은 알다라(Aldara)™ 크림 5％의 국부 투여에 의한 전처리가 실험 종료시 종양을 갖지 않는 마우스의 5％ 내지 35％까지 MVATG9931의 치료학적 효능을 현저히 증가시킨다는 것을 관찰하였다. 이 실험에서, 어떤 마우스도 알다라™를 단독으로 국부 적용 처리하지 않았다. 그러나, 상이한 암 모델 (OVA 발현 종양)에 대해 공개된 정보에 따르면, 종양에서 멀리 떨어진 부위에서의 알다라™의 국부 적용은 치료학적 효과가 없는 것으로 개시되어 있다 (Craft et al., 2005). 상이한 군들 사이의 생체내 생존 실험에서 통계학적 차 이는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선의 로그 랭크 애플리케이션(Log Rank application) (스타트소프트 인크.(Statsoft Inc.)의 Statistica 5.1 소프트웨어)을 사용하여 평가하였다. P≤O.05를 통계학적으로 유의한 것으로 간주한다.
도 7은 renCa-Muc1 종양 모델에서의 알다라 + MVATG9931 조합의 치료학적 효과를 나타낸다.
MUC1 항원에 대한 세포성 및 체액성 반응의 유도를 관찰하기 위해 면역원성 연구 또한 동시에 실시하였다. 프로토콜 섹션에 기술되어 있는 바와 같이 마우스를 백신화시켰다.
제1 실험 세트에서, ELISPOT 검정법을 사용하여 MUC1-특이 IFNγ 분비 세포의 갯수를 계수하였다. MUC1 H-2Db, H-2Kb 및 장쇄 제한 펩티드를 사용하여 면역화 이후의 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 모니터링하였다. 본 발명자들은 알다라의 국부 투여에 의한 전처리가 MVATG9931 단독으로 얻어지는 MHC I형 및 II형 제한 CD4 및 CD8 T 세포의 갯수를 현저히 증가시키지 않는다는 것을 관찰하였다 (도 8).
또다른 실험 세트에서, ELISPOT 검정법을 사용하여 MUC1-특이 IL-4 분비 세포의 갯수를 계수하였다. MUC1 제한 펩티드를 사용하여 면역화 이후의 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 모니터링하였다. 본 발명자들은 알다라의 국부 투여에 의한 전처리가 MVATG9931 단독으로 얻어지는 TH2-기반 T 세포 반응의 갯수를 현저히 감소시킨다는 것을 관찰하였다 (도 9).
최종적으로 MUC1 항원에 대한 체액성 반응의 측정 또한 ELISA로 실시하였다. 알다라™ + MVATG9931의 조합에 의해 유도되는 반응의 유형을 더욱 잘 규명하기 위하여, IgG 이소형 스위치를 분석하였다. MUC1-특이 IgG1 및 IgG2a가 검출되었다 (도 10). 본 발명자들은 알다라™의 국부 투여에 의한 전처리가, 처리의 효능과 관련시킬 수 있는 전형적인 Th1 유형 반응 (IgG1보다 더 높은 IgG2a 역가)을 유도한다는 것을 관찰하였다.
C - 결론 및 논의
상기 실험들은 알다라™의 국부 적용이 항원에 대한 MVA-기반 백신의 치료학적 효능을 증진 (면역 반응을 증진)시킬 수 있음을 최초로 입증하였다.

Claims (4)

  1. (i) 생체내에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열, 특히 항원을 코딩하는 이종 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 하나 이상의 재조합 바이러스 벡터, 및 (ii) 하나 이상의 1H-이미다조 [4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 함유하는 재조합 바이러스 백신.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 폭스바이러스인 재조합 바이러스 백신.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 1H-이미다조 [4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체가 하기 화학식 I 내지 V 중 하나에 의해 정의된 화합물 또는 그의 유사체, 용매화물 또는 염인 재조합 바이러스 백신.
    <화학식 I>
    Figure 112008087429530-PCT00009
    상기 식 중,
    R 11 은 선형 또는 분지형 알킬, 히드록시알킬, 아실옥시알킬, 벤질, (페닐)에 틸 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 고리 상에서 서로 독립적으로 C1-4 알킬 잔기, C1-4 알콕시 잔기 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 잔기에 의해 임의로 치환되며, 단, 상기 벤젠 고리가 2개의 상기 잔기에 의해 치환되는 경우, 상기 잔기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고;
    R 21 은 수소, C1-8 알킬 잔기, 벤질, (페닐)에틸 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 고리 상에서 서로 독립적으로 C1-4 알킬 잔기, C1-4 알콕시 잔기 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 잔기에 의해 임의로 치환되며, 단, 벤젠 고리가 2개의 상기 잔기에 의해 치환되는 경우, 잔기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고;
    R 1 은 각각 서로 독립적으로 수소, C1-4 알콕시 잔기, 할로겐 및 C1-4 알킬 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고, n은 0 내지 2의 정수이며, 단, n이 2인 경우, 상기 R 1 기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고;
    <화학식 II>
    Figure 112008087429530-PCT00010
    상기 식 중,
    R 12 는 선형 또는 분지형 C2-10 알케닐 및 치환된 선형 또는 분지형 C2-10 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 치환기는 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기 및 C3-6 시클로알킬 잔기; 및 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기에 의해 치환된 C3-6 시클로알킬 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R 22 는 수소, 선형 또는 분지형 C1-8 알킬 잔기, 벤질, (페닐)에틸 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 고리 상에서 서로 독립적으로 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기, 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 잔기에 의해 임의로 치환되며, 단, 벤젠 고리가 2개의 상기 잔기에 의해 치환되는 경우, 잔기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고;
    R 2 는 각각 서로 독립적으로 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 할로겐, 및 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고, n은 0 내지 2의 정수이고, 단, n이 2인 경우, 상기 R 2 기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고;
    <화학식 III>
    Figure 112008087429530-PCT00011
    상기 식 중,
    R 23 은 수소, 선형 또는 분지형 C1-8 알킬 잔기, 벤질, (페닐)에틸 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 고리상에서 서로 독립적으로 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기, 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 잔기에 의해 임의로 치환되며, 단, 벤젠 고리가 2개의 상기 잔기에 의해 치환되는 경우, 잔기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고;
    R 3 은 각각 서로 독립적으로 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 할로겐, 및 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고, n은 0 내지 2의 정수이며, 단, n이 2인 경우, 상기 R 3 기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고;
    <화학식 IV>
    Figure 112008087429530-PCT00012
    상기 식 중,
    R 14 는 -CHR34R44이고, 여기서 R44는 수소 또는 탄소-탄소 결합이며, 단, R44가 수소인 경우, R34는 C1-4 알콕시 잔기, C1-4 히드록시알콕시 잔기, C2-10 1-알키닐 잔 기, 테트라히드로피라닐, 알콕시 잔기는 1개 내지 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기는 1개 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 알콕시알킬, 2-, 3-, 또는 4-피리딜이며, 단, R44가 탄소-탄소 결합인 경우, R44 및 R34는 함께 테트라히드로푸라닐 기를 형성하며, 이는 서로 독립적으로 히드록시 및 C1-4 히드록시알킬 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
    R 24 는 수소, C1-4 알킬, 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 페닐은 서로 독립적으로 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기, 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 잔기에 의해 임의로 치환되고;
    R 4 는 수소, 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 할로겐, 및 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    <화학식 V>
    Figure 112008087429530-PCT00013
    상기 식 중,
    R 15 는 수소; 선형 또는 분지형 C1-10 알킬 잔기 및 치환된 선형 또는 분지형 C1-10 알킬 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 치환기는 C3-6 시클로알킬, 및 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기에 의해 치환된 C3-6 시클로알킬; 선형 또는 분지형 C2-10 알케닐 및 치환된 선형 또는 분지형 C2-10 알케닐 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 치환기는 C3-6 시클로알킬, 및 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기에 의해 치환된 C3-6 시클로알킬; C1-6 히드록시알킬; 알콕시 잔기가 1개 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기가 1개 내지 약 6개의 탄소 원자를 함유하는 알콕시알킬; 아실옥시 잔기가 2개 내지 약 4개의 탄소 원자의 알카노일옥시 또는 벤조일옥시이고 알킬 잔기가 1개 내지 약 6개의 탄소 원자를 함유하는 아실옥시알킬; 벤질; (페닐)에틸; 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 고리 상에서 서로 독립적으로 C1-4 알킬 잔기, C1-4 알콕시 잔기, 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 잔기에 의해 임의로 치환되며, 단, 상기 벤젠 고리가 2개의 상기 잔기에 의해 치환되는 경우, 잔기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고;
    R 25 는
    Figure 112008087429530-PCT00014
    이고,
    상기 식 중,
    R 35 는 C1-4 알콕시 잔기, 알콕시 잔기는 1개 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유 하고 알킬 잔기는 1개 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하는 알콕시알킬; C1-4 할로알킬 잔기; 알킬기가 1개 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하는 알킬아미도; 아미노; C1-4 알킬 또는 C1-4 히드록시알킬로 치환된 아미노; 아지도; C1-4 알킬티오로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R 55 및 R 45 는 서로 독립적으로 수소, C1-4 알킬 잔기, 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 페닐은 서로 독립적으로 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 잔기, 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 잔기에 의해 임의로 치환되고;
    R 5 는 수소, 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 할로겐, 및 선형 또는 분지형 C1-4 알킬 함유 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 1H-이미다조 [4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체가 하기 화학식 VI에 의해 정의된 화합물 또는 그의 유사체, 용매화물 또는 염인 재조합 바이러스 백신.
    <화학식 VI>
    Figure 112008087429530-PCT00015
    상기 식 중,
    R t 는 수소, 선형 또는 분지형 C1-4 알콕시 잔기, 할로겐, 및 선형 또는 분지형 C1-4 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R u 는 2-메틸프로필 또는 2-히드록시-2-메틸프로필이고;
    R v 는 수소, C1-6 알킬, 또는 알콕시 잔기가 1개 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기가 1개 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하는 알콕시알킬이다.
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