KR20090014856A - 카스파제-7 절단에서 유래하는 세포사멸과 관련된폴리뉴클레오티드 서열, 세포사멸의 억제, 유도 인자 및이의 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 카스파제-7 절단에서 유래하는 세포사멸과 관련된 폴리뉴클레오티드 서열, 세포사멸의 억제, 유도 인자 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것으로 (a) 서열번호1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열, (b) (a)의 DNA에 대하여 전장에 걸쳐 70％ 이상의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열, 혹은 (c) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드 서열에 스트린젼트한 조건하에 하이브리다이제이션하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 (d) (a), (b) 또는 (c) 서열과 상보적인 서열 또는 RNA 서열과, 이를 이용한 세포사멸의 억제, 유도 인자 및 이의 스크리닝 방법을 제공한다.

세포사멸, 카스파제-7

Description

카스파제-7 절단에서 유래하는 세포사멸과 관련된 폴리뉴클레오티드 서열, 세포사멸의 억제, 유도 인자 및 이의 스크리닝 방법{Polynucleotides Sequence Associated with Apoptosis Induced from Cleavage of Caspase-7, Inhibitor or Inducer of the Apoptosis, and The Screening Method thereof}

본 발명은 세포사멸에 관여하는 신규 뉴클레오티드 서열 및 이와 관련한 세포사멸 억제 또는 유도인자 및 이들의 스크리닝 방법 등에 관한 것으로, 보다 상세하게는 카스파제-7의 절단에 의해 야기되는 세포사멸에 관여하는 폴리뉴클레오티드 서열, 세포사멸 억제 또는 유도인자의 스크리닝 방법, 세포사멸 억제 또는 유도인자에 관한 것이다.

인간게놈의 분석은 기능을 알 수 없는 많은 유전자를 밝혀냈다. 이들 유전자의 역할을 밝혀내기 위해서 대규모 발현시스템과 RNA 간섭 (RNAi) 라이브러리가 개발되어져 왔다. 예를 들면, 대규모 유전자 과잉발현 스크린에 의하면 신규 세포사멸 유도인자 (Albayrak and Grimm, 2003; Koenig-Hoffman et al., 2005; Mannherz et al., 2006), 및 RNAi 라이브러리를 이용한 유전자 발현감소(knockdown)를 이용 하여 신규 종양 억압인자, 세포주기 조절인자 (Kittler et al., 2004) 및 세포사멸 유도인자 (MacKeigan et al., 2005)를 밝혀내었다 (Kolfschoten et al., 2005; Westbrook et al., 2005).

그러나, 대규모 유전자 발현 연구를 위해서는 대규모 방식으로 수행되는 세포 표현형의 심사가 필요하다. 표현형의 분석속도를 높이기 위하여 자동화된 형광현미경을 이용하는 하부세포 영상기반 스크린기술이 개발되었다. 이들은 형광신호의 강도와 위치를 결정하고, 이는 많은 수의 샘플에서 세포에 대한 영향을 측정할 수 있게 한다 (Gasparri et al., 2004; Lovborg et al.,2004).

이에 본 발명자들은 신규한 세포사멸 (apoptosis)의 조절자를 동정하기 위하여 938개의 가정적 cDNA들을 일시적으로 과발현하고, 자동화된 형광현미경을 사용하여 세포사멸을 측정하는 방법으로 세포사멸에 관여하는 신규한 폴리뉴클레오티디를 선별하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 세포사멸에 관여하는 신규한 폴리뉴클레오티드 서열, 세포사멸 억제 또는 유도인자의 스크리닝 방법, 세포사멸 억제 또는 유도인자 등을 제공함에 있다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 세포사멸에 관여하며, 이하의 서열군에 의해 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 또는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.

(a) 서열번호1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열,

(b) (a)의 DNA에 대하여 전장에 걸쳐 70％ 이상의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열, 혹은

(c) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드 서열에 스트린전트한 조건하에 하이브리다이제이션하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및

(d) (a), (b) 또는 (c) 서열과 상보적인 서열 또는 RNA 서열

본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 서열, 또는/및 상기 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 폴리펩티드를 포함하는 세포사멸 유도제를 제공한다.

상기 본 발명에 따른 세포사멸 유도제는 암, 자기면역 질환, 바이러스 감염증, 내분비 질환, 장기과형성, 혈관형성 수술후 재협착, 암절제 수술후의 재발, 이식 장기 거절, 면역 부전, 신경변성 질환, 허혈성 심질환, 방사선 장해, 자외선 장 해, 중독성 질환, 영양 장해, 염증성 질환, 허혈성 신경장애, 당뇨병성 신경장애, 혈관계 질환, 호흡기계 질환 및 연골 질환으로부터 구성되는 군에서 선택되는 질환의 치료를 위한 것을 포함한다.

본 발명은 상기 본 발명의 어느 하나의 유전자를 발현하고 있는 세포를 후보약제의 존재하에 배양하고, 필요한 경우 후보약제의 부존재하에 동일하게 배양을 한 경우와 비교하여 세포의 사멸을 억제 또는 촉진하는 후보약제를 발견하는 단계를 포함하는 세포사멸 억제 또는 유도인자의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 스크리닝 방법에 의해 발견된 세포사멸 억제 또는 유도인자를 제공한다.

본 발명은 상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합벡터를 제공한다.

본 발명은 상기 본 발명의 벡터로 형질전환된 숙주세포를 포함한다.

본 발명은 상기 본 발명에 의한 형질전환 세포를 포함하는 인간을 제외한 동물을 제공한다.

본 발명은 상기한 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포사멸 억제제를 포함한다.

본 발명에 의하면 카스파제-7의 절단에 의해 야기되는 세포사멸에 관여하는 폴리뉴클레오티드 서열, 세포사멸 억제 또는 유도인자의 스크리닝 방법, 세포사멸 억제 또는 유도인자를 제공하고, 이에 의해 야기되는 질병에 효과적인 치료제를 제 공할 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 대해 이용되는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1에 나타나는 염기서열 (FLJ13855라 명명)과 동일 혹은 실질적으로 동일한 염기서열을 포함한다. 서열 번호 1에 나타나는 염기서열과 「실질적으로 동일한 염기 서열」로서는, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열과 약 70%이상, 바람직하게는 약 80%이상, 한층 더 바람직하게는 약 90%이상, 특히 바람직하게는 약 95%이상, 가장 바람직하게는 약 98%이상의 상동성을 가지는 염기 서열 등을 들 수 있다.

서열 번호 1에 나타난 염기 서열과 실질적으로 동일한 염기 서열은 카스파제-7의 절단을 야기하는 것에 의해 세포사멸을 유도하는 세포사멸 인자를 발현하는 능력을 가지는 것이다. 그러한 능력은 성질적으로(예, 생리학적으로, 또는 약리학적으로) 동질인 것을 나타내지만, 발현에 의해 얻어지는 세포사멸 활성의 정도 또는 단백질의 분자량 등의 양적 요소에는 다소의 차이, 예를 들면, 활성에 대해서는, 약 0.01~100배, 바람직하게는 약 0.1~10배, 보다 바람직하게는 0.5~2배의 범위내의 오차를 허용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들면, 서열 번호 1에 나타나는 염기 배열을 함유 하는 DNA, 혹은 실질적으로 동일한 염기 서열을 가지는 DNA와 스트린전트한 조건하에서 하이브리다이즈 하는 염기 서열을 포함한다. 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열과 스트린전트한 조건하에서 하이브리다이즈 할 수 있 는 DNA로서는, 예를 들면, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열의 상보적인 서열과 약 50%이상, 바람직하게는 약 60%이상, 한층 더 바람직하게는 약 70%이상, 특히 바람직하게는 약 80%이상, 가장 바람직하게는 약 90%이상의 상동성을 가지는 염기 서열을 함유 하는 DNA 등이 이용된다. 하이브리다이제이션은 자체 공지의 방법 혹은 거기에 준하는 방법, 예를 들면, 모리큘라클로닝(Molecular Cloning) 제2판(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)에 기재된 방법 등에 따라서 행할 수 있다. 또, 시판되는 라이브러리를 사용하는 경우, 하이브리다이제이션은 첨부된 사용 설명서에 기재된 방법에 따라 행할 수 있다. 하이브리다이제이션은 바람직하게는 스트린전트한 조건에 따라 행할 수 있다. 스트린전트한 조건이란, 예를 들면, 나트륨 농도가 약 19~40 mM, 바람직하게는 약 19~20 mM으로, 온도가 약 50~70℃, 바람직하게는 약 60~65℃의 조건을 나타낸다. 특히, 나트륨 농도가 약 19 mM로 온도가 약 65℃의 경우가 바람직하다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 들 중 어느 하나를 함유하는 DNA 발현 벡터는, 예를 들면, 목적으로 하는 DNA 단편을 얻고, 당해 DNA 단편을 적당한 발현 벡터 내의 프로모터 하류에 연결하여 제조할 수 있다. 발현 벡터로서는, 대장균 유래의 핵외 유전자(예, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13)；고초균 유래의 핵외 유전자(예, pUB110, pTP5, pC194)；효모 유래 핵외 유전자(예, pSH19, pSH15)；λ살균 바이러스 등의 bacteriophage；RNA 종양 바이러스, 배큐로바이러스 등의 동물 바이러스；pA1－11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo 등이 이용될 수 있다.

프로모터로서는 유전자의 발현에 이용되는 숙주세포에 사용가능하다고 알려 져 있는 적절한 프로모터이면 어떠한 것이라도 좋다. 예를 들면, 숙주 세포가 동물세포인 경우, SRα프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV(사이트메가로위르스) 프로모터, HSV-TK프로모터 등이 이용될 수 있다. 그 중에서도, CMV 프로모터, SRα프로모터 등이 바람직하다. 숙주 세포가 에스케리치아 속균인 경우, trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL프로모터, lpp 프로모터, T7프로모터 등이 이용될 수 있다. 숙주 세포가 바실러스 속균인 경우, SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등이 이용될 수 있다. 숙주세포가 효모인 경우, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등이 이용될 수 있다. 숙주 세포가 곤충 세포인 경우, P10 프로모터가 이용될 수 있다.

발현 벡터는 상기 외에 필요에 따라 인핸서, 스프라이싱 시그날, 폴리 A부가 시그널, 선택 마커, SV40 복제 오리진(SV40ori) 등을 함유 하고 있는 것을 이용할 수 있다. 선택 마커로는, 예를 들면, 디하이드로엽산환원효소 (dhfr) 유전자, 암피실린 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 들 중 어느 하나를 함유하는 형질 전환체는 공지의 방법에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하는 것에 의해 제조할 수 있다. 숙주 세포로는, 예를 들면, 에스케리치아 속균, 바실러스 속균, 효모, 곤충 세포, 곤충, 동물세포 등이 이용될 수 있다.

형질 전환은 숙주 세포의 종류에 따라 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다. 에스케리치아 속균은, 예를 들면, Proceedings of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69권, 2110(1972)나 진(Gene), 17권, 107(1982) 등에 기재된 방법에 따라 형질 전환할 수 있다. 바실러스 속균은, 예를 들면, Molecular ＆ General Genetics, 168권, 111(1979) 등에 기재된 방법에 따라 형질 전환할 수 있다. 효모는, 예를 들면, Methods in Enzymology, 194권, 182－187(1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75권, 1929(1978) 등에 기재된 방법에 따라 형질 전환할 수 있다. 곤충 세포 및 곤충은, 예를 들면, Bio/Technology, 6, 47-55(1988) 등에 기재된 방법에 따라 형질 전환할 수 있다. 동물세포는, 예를 들면, Virology, 52권, 456(1973)에 기재된 방법에 따라 형질 전환할 수 있다.

형질 전환체의 배양은 숙주 세포의 종류에 따라 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들면, 숙주세포가 에스케리치아 속균 또는 바실러스 속균인 형질 전환체를 배양하는 경우, 배양에 사용되는 배양배지로서는 액체 배양배지가 바람직하다. 또, 배양배지는 형질 전환체의 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기물 등을 함유 하는 것이 바람직하다. 여기서, 탄소원으로는, 예를 들면, 글루코오스, 덱스트린, 가용성 전분, 자당 등；질소원으로는, 예를 들면, 암모늄 염류, 질산염류, 펩톤, 콩깻묵 등의 무기 또는 유기물질이；무기물로는, 예를 들면, 염화 칼슘, 염화 마그네슘 등이다. 또, 배양배지에는, 효모 엑기스, 비타민류, 생장 촉진 인자 등을 첨가할 수도 있다. 배양배지의 pH는 바람직하게는 약 5~8이다.

숙주세포가 에스케리치아 속균인 형질 전환체를 배양하는 경우의 배양배지로는, 예를 들면, 글루코오스, 카자미노산을 포함한 M9배양배지[밀러(Miller), Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431－433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]가 바람직하다. 숙주 세포가 에스케리치아 속균인 형질 전환체의 배양은 통상 약 15~43℃로, 약 3~24시간 행해진다. 이때, 환기나 교반을 실시해도 된다. 숙주세포가 바실러스 속균인 형질 전환체의 배양은 통상 약 30~40℃로, 약 6~24시간 행해진다. 이때, 환기나 교반을 실시해도 된다. 숙주 세포가 효모인 형질 전환체를 배양하는 경우의 배양배지로는, 예를 들면, 버크홀더(Burkholder) 최소 배양지 [Bostian, K. L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77권, 4505(1980)] 등을 들 수 있다. 배양배지의 pH는 바람직하게는 약 5~8이다. 배양은 통상 약 20℃~35℃로, 약 24~72시간 행해진다. 필요에 따라서, 환기나 교반을 실시해도 무방하다. 숙주 세포가 곤충 세포 또는 곤충인 형질 전환체를 배양하는 경우의 배양배지로는, 예를 들면 Grace's Insect Medium (Grace, T.C.C., 네이쳐(Nature), 195, 788(1962))에 비동화한 10% 소혈청 등의 첨가물을 적당히 더한 것 등이 이용될 수 있다. 배양배지의 pH는 바람직하게는 약 6.2~6.4이다. 배양은 통상 약 27℃로 약 3~5일간 행해진다. 필요에 따라서 환기나 교반을 실시해도 무방하다. 숙주세포가 동물세포인 형질 전환체를 배양하는 경우의 배양배지로는, 예를 들면, 약 5~20%의 소태아혈청을 포함한 MEM 배양배지 [Science, 122권, 501(1952)], DMEM 배양배지[Virology, 8권, 396(1959)], RPMI 1640 배양배지[The Journal of the American Medical Association) 199권, 519(1967)], 199 배양배지[Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73권, 1(1950)]등이 이용될 수 있다. 배양배지의 pH는 바람직하게는 약 6~8이다. 배양은 통상 약 30℃~40℃로, 약 15~60시간 행해진다. 필요에 따라서 환기나 교반을 실시해도 무방하 다.

상기 형질 전환체를 배양해 얻을 수 있는 배양물로부터 본 발명의 세포사멸 유도인자를 자체 공지의 방법에 따라 분리 정제 할 수가 있다. 예를 들면, 본 발명의 유도인자를 배양균체 혹은 세포로부터 추출하는 경우, 배양물로부터 공지의 방법으로 모은 균체 혹은 세포를 적당한 완충액에 현탁시켜, 초음파, 리소자임 및/또는 동결 융해 등에 의해 균체 혹은 세포를 파괴한 후, 원심분리나 여과에 의해 가용성 단백질의 결정 추출액을 얻는 방법 등이 적당히 이용될 수 있다. 이때 완충액은 요소나 염산 구아니딘 등의 단백질 변성제나, 트리톤 X－100 등의 계면활성제를 포함하고 있어도 무방하다.

이와 같이 하여 얻을 수 있는 본 발명에 따른 세포사멸 유도인자의 단리정제는 자체 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다. 이러한 방법으로서는 염석이나 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법；투석법, 한외여과법, 겔 여과법, 및 SDS－폴리아크릴 아마이드겔 전기 영동법 등의 주로 분자량의 차이를 이용하는 방법；이온 교환 크로마토그래피 등의 하전의 차이를 이용하는 방법； 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법；역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차이를 이용하는 방법；등전점 전기 영동법 등의 등전점의 차이를 이용하는 방법 등이 이용된다. 이러한 방법은 적당히 조합할 수도 있다.

상기 본 발명에 따라 얻어질 수 있는 세포사멸 유도인자가 유리체인 경우에는 자체 공지의 방법 혹은 거기에 준하는 방법에 따라 당해 유리체를 염으로 변환할 수 있고, 염의 형태를 얻을 수 있는 경우에는, 자체 공지의 방법 혹은 거기에 준하는 방법에 의해 당해 염을 유리체 또는 다른 염으로 변환할 수 있다.

상기 본 발명에 따라 얻을 수 있는 세포사멸 유도인자의 존재는 특이 항체를 이용한 효소면역검정법이나 웨스턴블롯팅 등에 의해 확인할 수 있다.

본 발명에 따라 얻어지는 세포사멸 유도인자 또는 그 염에 대한 항체는 폴리클로날 항체, 단일 클론 항체의 어느 것이어도 무방하다. 이들 항체는 본 발명에 의해 얻어지는 세포사멸인자를 항원으로 이용해 자체 공지의 항체 또는 항혈청의 제조법에 따라 제조할 수 있다. 항원으로서 이용되는 본 발명의 세포사멸 유도인자로는 상기 본 발명의 세포사멸 유도인자 또는 그 일부 펩티드 또는 그 염이면 어느 것을 이용해도 무방하다.

상기 본 발명의 세포사멸 유도인자를 코드하는 염기 서열과 상보적인 염기 서열 또는 그 일부를 함유하는 폴리뉴클레오티드(이하, 안티센스 폴리뉴클레오티드)로는 세포사멸 유도인자를 코드하는 염기 서열과 완전하게 상보적인 염기 서열 혹은 실질적으로 상보적인 염기 서열 또는 그 일부를 가지고, 세포사멸 유도인자를 코드 하는 RNA로부터 당해 단백질의 번역을 억제하는 작용을 가지는 것이면 좋다. 실질적으로 상보적인 염기 서열로는 세포사멸 유도인자 또는 그 부분 펩티드를 코드 하는 염기 서열과 당해 단백질을 발현하는 세포의 생리학적 조건하에서 하이브리다이즈 할 수 있는 염기 서열, 보다 구체적으로는, 이들 유도인자 또는 그 부분 펩티드를 코드하는 염기 서열의 상보사슬과의 사이에 오버랩 하는 부분에 관해서 약 70%이상, 바람직하게는 약 80%이상, 보다 바람직하게는 약 90%이상, 가장 바람직하게는 약 95%이상의 상동성을 가지는 염기 서열 등을 들 수 있다.

본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드는 클론화하거나 혹은 결정된 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 염기 서열 정보에 근거해 설계하고 합성할 수 있다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 세포사멸 유도인자를 코드하는 유전자의 복제 또는 발현을 저해할 수 있다. 즉, 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드는 세포사멸 유도인자를 코드하는 유전자로부터 전사되는 RNA와 하이브리다이즈할 수 있어 mRNA의 합성(프로세싱) 또는 기능(단백질에의 번역)을 저해할 수 있다.

본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드의 표적 영역은 안티센스 폴리뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 것으로써, 결과적으로 세포사멸 유도인자의 번역이 저해되는 것이면 그 길이에 특히 제한은 없고, 이러한 유도인자를 코드 하는 RNA의 전배열이어도 부분 배열이어도 좋고, 짧은 것으로는 약 15 bp 정도, 긴 것으로 mRNA 또는 초기 전사 산물의 전배열을 들 수 있다. 합성의 용이함이나 항원성의 문제를 고려하면, 약 15~ 약 30 bp로 구성되는 올리고 뉴클레오티드가 바람직하지만 여기에 한정되지 않는다. 구체적으로는, 예를 들면, 세포사멸 유도인자를 코드 하는 유전자의 5＇말단 헤어핀 루프, 5＇말단 6bp 리피트, 5＇말단 비번역 영역, 폴리펩티드 번역 개시 코돈, 단백질 코드 영역, ORF 번역 개시 코돈, 3＇말단 비번역 영역, 3＇말단 팰린드롬 영역, 및 3＇말단 헤어핀 루프가 표적 영역과 같이 당해 유전자 내부의 어떤 영역도 표적으로서 선택할 수 있다. 예를 들면, 당해 유전자의 인트론 부분을 표적 영역으로 하는 일도 또 바람직하다.

더욱이 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드는 세포사멸 유도인자를 코드하는 mRNA 혹은 초기 전사 산물과 하이브리다이즈하여 단백질로의 번역을 저해할 뿐 만 아니라, 세포사멸 유도인자를 코드하는 유전자와 결합하여 트리플렉스를 형성하여 RNA의 전사를 저해 할 수 있는 것이어도 무방하다.

상기 안티센스 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA, 혹은 수식된 핵산(RNA, DNA) 일 수 있다. 수식된 핵산의 구체적인 예로서는 핵산의 유황 유도체나 티오 인산염 유도체, 그리고 폴리 뉴클레오티드 아미드나 올리고 뉴클레오티드 아미드의 분해에 저항성을 가지는 것을 들 수 있지만, 여기에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 세포사멸 유도인자를 코드하는 mRNA 혹은 유전자 초기 전사 산물을 코드 영역의 내부(초기 전사 산물의 경우는 인트론 부분을 포함한다)에서 특이적으로 절단 할 수 있는 리보자임도 또, 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드에 포함 될 수 있다. 또, 세포사멸 유도인자를 코드하는 mRNA 혹은 유전자 초기 전사 산물의 코드 영역내의 부분 배열(초기 전사 산물의 경우는 인트론 부분을 포함한다)에 상보적인 siRNA도 또한, 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있다. SiRNA를 세포내에 도입하면 그 RNA에 상보적인 mRNA가 분해되는 이른바 RNA 간섭(RNAi)으로 불리는 현상은 이전부터 선충, 곤충, 식물 등으로 알려져 있었지만, 최근, 이 현상이 포유동물 세포에서도 일어나는 것이 확인된 것으로부터［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］리보자임의 대체 기술로서 주목받고 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임은 본 발명의 단백질을 코드하는 cDNA 배열 혹은 게놈 DNA 서열 정보에 근거해 mRNA 혹은 초기 전사 산물의 표적 영역을 결정하고, 시판되는 DNA/RNA 자동 합성기를 이용하여, 이것에 상보적인 서열을 합성하는 것으로써 제조할 수 있다. siRNA는 센스 스트랜드 및 안티센스 스트랜드를 DNA/RNA 자동 합성기로 각각 합성하고, 적당한 어닐링 완충액 중에서, 예를 들면, 약 90~ 약 95℃로 약 1분 정도 변성시킨 후, 약 30~ 약 70℃로 약 1~ 약 8시간 어닐링시키는 것에 의해 제조할 수 있다. 또, 상보적인 올리고 뉴클레오티드 스트랜드를 교대로 오버랩 하도록 합성하여, 이것들을 어닐링시킨 후 리가제로 라이게이션하는 것에 의해 보다 긴 2 스트랜드의 폴리뉴클레오티드를 제조할 수도 있다.

본 발명에 따른 세포사멸 유도인자 또는 활성화 펩티드는 카스파제-7을 절단함으로써 세포사멸 (apoptosis)의 유도를 야기한다. 따라서, 1) 본 발명에 따른 세포사멸 유도인자 또는 활성화 펩티드, 2) 세포사멸 유도인자 또는 본 발명의 활성화 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 3) 세포사멸 유도인자를 코드 하는 염기 서열 또는 그 일부를 함유 하는 폴리뉴클레오티드, 4) 본 발명의 항체, 5) 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드, 6) 본 발명의 저해 펩티드는 세포사멸의 억제와 관련하는 질환의 예방·치료제로서 사용될 수 있다.

상기와 같이, 본 발명에 따른 세포사멸 유도인자는 카스파제-7을 절단하여 세포사멸을 유도하는 기능을 가지므로, 생체내에서 세포사멸 유도인자 또는 그것을 코드하는 핵산(예, 유전자, mRNA등 )에 이상이 있거나 이것을 결손하고 있는 경우, 혹은 그 발현량이 이상하게 감소하고 있는 경우, 또, 다른 어떠한 요인으로 세포사멸 유도가 과도하게 억제되고 있는 경우, 예를 들면, 암, 자기면역 질환, 바이러스 감염증, 내분비 질환, 혈액 질환, 장기과형성 등의 여러 가지의 질병을 발병한다. 따라서, 세포사멸 유도인자의 감소 혹은 다른 요인에 의해 불필요한 세포나 이상 세포의 사멸에 의한 제거를 기대할 수 없는 환자가 있는 경우에, a) 세포사멸 유도 인자 혹은 활성화 펩티드 또는 그 염을 당해 환자에게 투여해 그 양을 보충하거나 b) (i) 세포사멸 유도인자 또는 활성화 펩티드를 코드하는 DNA를 당해 환자에게 투여해 표적 세포내에서 발현시키는 것에 의해, 혹은 (ii) 단분리된 표적 세포에 세포사멸 유도인자 또는 활성화 펩티드를 코드하는 DNA를 도입해 발현시킨 후에, 당해 세포를 당해 환자에게 이식하는 것 등에 의해, 환자의 체내에 있어서의 세포사멸 유도인자의 양을 증가시키고, 이상 세포나 불필요해진 세포에서 카스파제-7의 절단으로부터 유래되는 세포사멸을 유도할 수 있다.

본 발명에 따른 세포사멸 유도인자 혹은 활성화 펩티드 또는 그 염을 상기 예방·치료제로서 사용하는 경우는 공지된 수단에 따라 제재화할 수가 있다. 한편, 세포사멸 유도인자 또는 본 발명의 활성화 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 상기 예방·치료제로서 사용하는 경우는 당해 폴리뉴클레오티드를 단독 혹은 RNA 종양 바이러스 벡터, 아데노바이러스벡터, 아데노바이러스 관련 바이러스 벡터 등의 적당한 벡터에 삽입한 후, 공지 수단에 따라 제재화할 수 있다. 예를 들면, a) 세포사멸 유도인자 혹은 본 발명의 활성화 펩티드 또는 그 염, 혹은 b) 세포사멸 유도인자 또는 본 발명의 활성화 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 필요에 따라서 정제, 캅셀제, 마이크로 캅셀제 등으로 하여 경구적으로, 혹은 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다.

정제, 캅셀제 등에 혼화 할 수 있는 첨가제로는, 예를 들면, 젤라틴, 옥수수 전분, 트라간트, 검아라빅과 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 옥수수 전분, 젤라틴, 알긴산 등과 같은 팽화제, 스테아린산마그네슘과 같은 윤활제, 자당, 유당 또는 사카린과 같은 감미제, 페퍼민트, 아카모노유 또는 체리와 같은 향미제 등이 이용될 수 있다. 조제 단위 형태가 캅셀인 경우에는 상기 타입의 재료에 한층 더 유지와 같은 액상 담체를 함유할 수 있다. 주사용 수성액으로는, 예를 들면, 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 포함한 등장용액(예를 들면, D－솔비톨, D－만니톨, 염화 나트륨 등) 등이 이용되어 적당한 용해 보조제, 예를 들면, 알코올(예, 에탄올), 폴리 알코올(예, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제(예, 폴리솔베이트 80 TM, HCO－50)등과 병용해도 무방하다. 유성액으로서는, 예를 들면, 참기름, 콩기름 등이 이용되어 용해 보조제인 안식향산벤질, 벤질 알코올등과 병용해도 무방하다.

상기 본 발명에 따른 예방·치료제는, 예를 들면, 완충제(예를 들면, 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액), 무통화제(예를 들면, 염화 벤자르코니움, 염산 프로카인 등), 안정제(예를 들면, 사람 혈청알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제(예를 들면, 벤질 알코올, 페놀 등), 산화 방지제 등과 배합하여도 무방하다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전된다.

이와 같이 하여 얻을 수 있는 제재는 안전하고 저독성이므로, 예를 들면, 사람이나 다른 온혈동물(예를 들면, 래트, 마우스, 햄스터, 토끼, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 고양이, 개, 원숭이, 침팬지, 새 등)에 대해서 투여할 수 있다. 세포사멸 유도인자 또는 본 발명의 활성화 펩티드의 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 의해 차이는 있지만, 경구투여의 경우, 일반적으로 예를 들면, 60 kg 성인에 있어서는, 하루에 대해 약 0.1 mg~100 mg, 바람직하게는 약 1.0~50 mg, 보다 바람직하게는 약 1.0~20 mg이다. 비경구적으로 투여하는 경우는, 그 1회 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 따라서 다르지만, 예를 들면, 주사제의 형태에서는 통상 예를 들면, 60 kg 성인에 있어서는 하루에 대해 약 0.01~30 mg정도, 바람직하게는 약 0.1~20 mg정도, 보다 바람직하게는 약 0.1~10 mg정도를 투여하는 것이 형편상 좋다. 다른 동물의 경우도, 60 kg 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

세포사멸 유도인자 또는 본 발명의 활성화 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 의해 차이는 있지만, 경구투여의 경우, 일반적으로 예를 들면, 60 kg 성인에 있어서는, 하루에 대해 약 0.1 mg~100 mg, 바람직하게는 약 1.0~50 mg, 보다 바람직하게는 약 1.0~20 mg이다. 비경구적으로 투여하는 경우는 그 1회 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 따라서 다르지만, 예를 들면, 주사제의 형태에서는 통상 예를 들면, 60 kg 성인에 있어서는 하루에 대해 약 0.01~30 mg정도, 바람직하게는 약 0.1~20 mg정도, 보다 바람직하게는 약 0.1~10 mg정도를 투여하는 것이 형편상 좋다. 다른 동물의 경우도, 60 kg 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 세포사멸 유도인자와 특이적으로 결합하여 카스파제-7의 절단을 방지하여 세포사멸을 저해할 수 있다. 한편, 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드는 세포사멸 유도인자의 발현을 저해하여, 마찬가지로 세포사멸 유도 촉진 작용을 절감시킬 수가 있다.

본 발명의 항체를 상기의 세포사멸 저해제 등으로 사용하는 경우, 물 혹은 적당한 완충액(예, 인산 완충액, PBS, 트리스 염산 완충액 등) 중에 적당한 농도가 되도록 용해하는 것으로써 조제할 수 있다. 또, 필요에 따라서, 통상 사용되는 보존제, 안정제, 환원제, 등 장화제 등을 배합시켜도 무방하다. 한편, 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드를 상기의 세포사멸 저해제 또는 억제제로서 사용하는 경우는 당해 폴리뉴클레오티드를 단독 혹은 RNA 종양 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 등의 적당한 벡터에 삽입한 후, 상기의 형질 전환법(예, 리포솜법, 일렉트로포레이션법 등)을 이용해 세포에 도입할 수 있다.

본 발명의 항체의 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 의해 차이는 있지만, 경구투여의 경우, 일반적으로 예를 들면, 60 kg 성인에 있어서는 하루에 대해 약 0.1 mg~100 mg, 바람직하게는 약 1.0~50 mg, 보다 바람직하게는 약 1.0~20 mg이다. 비경구적으로 투여하는 경우는 그 1회 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 따라서 다르지만, 예를 들면, 주사제의 형태에서는 통상 예를 들면, 60 kg 성인에 있어서는, 하루에 대해 약 0.01~30 mg정도, 바람직하게는 약 0.1~20 mg정도, 보다 바람직하게는 약 0.1~10 mg정도를 투여하는 것이 형편상 좋다. 다른 동물의 경우도, 60 kg 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드의 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 의해 차이는 있지만, 경구투여의 경우, 일반적으로 예를 들면, 60 kg 성인에 있어서는 하루에 대해 약 0.1 mg~100 mg, 바람직하게는 약 1.0~50 mg, 보다 바람직하게는 약 1.0~20 mg이다. 비경구적으로 투여하는 경우는 그 1회 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 따라서 다르지만, 예를 들 면, 주사제의 형태에서는 통상 예를 들면, 60 kg 성인에 있어서는 하루에 대해 약 0.01~30 mg정도, 바람직하게는 약 0.1~20 mg정도, 보다 바람직하게는 약 0.1~10 mg정도를 투여하는 것이 형편상 좋다. 다른 동물의 경우도, 60 kg 당으로 환산한 양을 투여할 수가 있다.

본 발명은 또 세포사멸 유도인자 혹은 활성화 펩티드 또는 그 염을 이용하는 세포사멸 유도인자 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 당해 스크리닝 방법의 예로는 본 발명의 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드를 프로브로서 이용하는 것으로, 혹은 본 발명의 항체를 이용하는 것으로, 세포사멸 유도인자의 발현량을 변화시키는 물질을 스크리닝할 수 있다. 즉, 본 발명은, 예를 들면, (i) 비사람 포유동물의 a) 혈액, b) 특정의 장기, c) 장기로부터 단리한 조직 혹은 세포, 또는 (ii) 형질 전환체 등에 포함되는 세포사멸인자의 mRNA량 또는 단백질량을 측정하는 것에 의한, 세포사멸 유도인자의 발현량을 변화시키는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

예를 들면, 세포사멸 유도인자의 mRNA량 또는 단백질량의 측정은 구체적으로는 이하와 같이 실시할 수 있다.

정상 혹은 질환 모델 비사람 포유동물 (예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등)에 대해서, 약제(예를 들면, TNF－α, IL－1, Fas, 항암제 등) 혹은 물리화학적 스트레스(예를 들면, UV, 활성 산소, 허혈 등) 등을 주어 일정시간 경과한 후에, 혈액, 혹은 특정의 장기(예를 들면, 뇌, 간장, 신장 등), 또는 장기로부터 단리한 조직, 혹은 세포를 얻는다.

얻을 수 있는 세포에 포함되는 mRNA는, 예를 들면, 통상의 방법에 의해 세포 등으로부터 mRNA를 추출하고, 예를 들면, RT－PCR등의 수법을 이용하는 것으로 정량 할 수 있거나 혹은 자체 공지의 노던블롯의 해석에 의해 정량 할 수도 있다. 한편, 세포사멸 유도인자의 함량은 통상의 방법에 의해 세포 등으로부터 단백질을 추출하여, 예를 들면, 웨스턴블롯 해석에 의해 정량할 수 있다.

상기의 스크리닝법에 의해, 세포사멸 유도인자의 발현량을 증가시키는 물질을 세포사멸 유도 촉진 물질, 세포사멸 유도인자의 발현량을 감소시키는 물질을 세포사멸 유도인자의 활성화 저해 물질로서 선택할 수 있다.

이하에 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 그것들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 세포사멸 유도인자의 발현 및 기능 확인 Ⅰ

cDNA 발현 플라스미드

Korean UniGene Information database (KUGI; http://kugi.kribb.re.kr)에 있는 7,385개의 전장 유전자 중에 4,782가 포유동물 발현벡터에 존재한다(Kim et al., 2004; Oh et al., 2004). 본 발명자들은 스크린에서 이들 가정적 cDNA 클론을 사용하였다. C-말단 GFP 또는 myc 태그된 형태의 FLJI3855 (서열번호 1), C10orf61 (서열번호 2), 및 MGC26717(서열번호 3)를 생성하기 위해 이들의 암호화 부위를 PCR 증폭하였다. FLJ13855에 대하여는 전방향 프라이머로 5’-CGCTCGAGATGTCCATTTATAAG-3'(서열번호 4)과 역방향 프라이머로 5’-CGGGATCCAACCCTCAGGCTCCC-3'(서열번호 5)을 사용하였다. C10orf61에 대하여는 전방 향 프라이머로 5’-GCGAATTCATGGATTCTAATGGA-3'(서열번호 6)과 역방향 프라이머로 5’-GCGGTACCCATAGTCTCTAGGTT-3'(서열번호 7)을 사용하였다. MGC26717에 대하여는 전방향 프라이머로 5’-GCCTCGAGATGTCGGGACTCAGC-3'(서열번호 8)과 역방향 프라이머로 5’-GCGGATCCAACTTGGTCCCCAGT-3'(서열번호 9)을 사용하였다. PCR증폭된 C10orf61을 pEGFP/N3 (인비트로겐, 미국)과 pcDNA3.1/myc-His(-)(인비트로겐, 미국)의 EcoRⅠ과 KpnⅠ 자리에 서브클로닝하였다. MGC26717과 FLJ13855의 PCR 산물을 pEGFP/N3과 pcDNA3.1/myc-His(-)의 XhoⅠ과 BamHⅠ 자리에 서브클로닝하였다. 서브클로닝 후 만든 모든 플라스미드의 DNA 서열을 확인하였다. C10orf61-myc의 발현은 항myc항체로 웨스턴블롯한 결과 검출되지 않았다. 하지만 항GFP항체를 이용하여 C10orf61-GFP를 쉽게 검출하였다.

세포배양 및 트랜스펙션

HeLa 세포를 5% CO₂를 함유하는 가습세포배양기에서 37℃로 유지하고, 10% 소태아혈청(FBS)과 항체(JBI, 한국)로 보충된 DMEM에서 배양하였다. 트랜스펙션을 하기 위해 96웰플레이트에 웰당 7.5×10³ HeLa 세포를 파종하였고, 6웰플레이트에 웰당 1.4×10⁵ HeLa 세포를 파종하였다. 16~18시간 (이때 세포들은 약 70% 합류상태에 달하였다)후에 리포펙타민 Plus^TM (인비트로겐)을 이용하여 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션은 96웰플레이트에 대해 웰당 100ng의 cDNA와 6웰플레이트에 대해 웰당 1μg의 cDNA로 수행하였다.

렌티바이러스 벡터의 구축

김연수 박사 (인제대학, 한국) 실험실에서 재조합 렌티바이러스 벡터를 구축하였다. Myc로 태그시킨 C10orf61, MGC26717 및 FLJ13855를 IRES 시스템에 의해 hCMV 프로모터와 EGFP-제오신 융합단백질을 함유하는 렌티바이러스 벡터(LentiH1.2)의 다클로닝 부위에 개별적으로 삽입하고, 재조합 벡터는 VectorCore A사(한국)에 의해 생산하였다. 3개의 플라스미드, VSV-G 벡터를 발현하는 전달벡터, gag-pol 발현벡터를 리포펙타민 PlusTM을 이용하여 1:1:1 몰비로 293T 세포에 코트랜스펙션하였다. 바이러스 벡터입자를 함유하는 배양상청액을 트랜스펙션 후 48시간 수거하고, 0.45㎛ 멤브레인필터 (Nalge Nunc International, 미국)로 정화하고, 즉시 -70℃에서 저장하였다.

이들의 역가는 더 이상의 농축없이 대략 3-5 × 10⁷ 형질도입단위였다. 형질도입을 위해 12웰플레이트의 웰당 대략 1× 10⁵ HeLa 세포를 파종하였다. 16~18 시간 후에 폴리브레인(인비트로겐)을 이용하여 300㎕의 렌티바이러스 (1~1.7× 10⁷ 형질도입 단위)로 형질도입을 수행하였다.

핵분획의 아세포 이미지

트랜스펙션 후 28~30시간에 5μM Hoechst 33342(Molecular Probes, USA)로 세포들을 염색하고, 핵 모폴로지를 자동화 In Cell Analyzer 1000 형광현미경 (GE, Cardiff, 영국)을 이용하여 분석하였다. 웰당 3 필드의 형광이미지를 얻어 총핵 (대략 각 트랜스펙션 당 500세포)수를 대략 object intensity 모듈 (GE)을 이용하 여 자동으로 계수하고, 사멸핵의 수를 수작업으로 계수하였다.

DNA 분획 ELISA

6웰 플레이트에 배양된 HeLa 세포들을 위에서 언급된 바와 같이 cDNA로 트랜스펙션하고, 획득하여 Cell Death Detection ELISA 시스템(Roche, 미국)을 이용하여 DNA 분획량을 측정하였다. 대략 1× 10⁴ 세포들로부터 얻은 세포질 분획 (20,000× g)을 항히스톤 항체로 코팅한 마이크로타이터 플레이트에 인큐베이션하고, 퍼옥시다제와 결합시킨 두 번째 항DNA항체가 뒤를 이었다. DNA 분획 퍼센트를 벡터가 도입된 대조세포와 비교하였다 (Oh et al., 2004).

웨스턴 블롯팅

세포들을 1% SDS, 100mM Tris/pH8.0에 용해하고, 즉시 100℃로 가열하였다. 단백질을 9% 또는 12% Tris/Tricine 젤의 어느 하나에 용해하고, 나이트로셀룰로오스 막(Bio-Rad, 미국)에 옮기고, 1차 항체와 반응시켰다. 항카스파제7을 BD(미국)에서, 항RARP를 Cell Signaling(미국)에서 구입하였다. 항GFP를 Zymed(미국)에서 구입하고, 항액틴을 Sigma(미국)에서 구입하였다. 항myc와 2차항체, 항래빗 IgG-HRP와 항마우스 IgG-HRP를 Santa Cruz Biotechnology(미국)으로부터 구입하였다. 항원들은 ECL 용액(Pierce, 미국)을 이용하여 가시화하였다.

세포생존율측정

12웰 플레이트에 파종된 대략 1× 10⁵ HeLa 세포를 앞서 언급한 C10orf61, MGC26717 또는 FLJ13855를 암호화하는 렌티바이러스를 이용하여 형질도입하였다. 형질도입후 48시간 후 세포들을 수거하고, 새로운 배지에 재부유시키고, 트리판블루 염색을 이용하여 혈구계에서 생존세포수를 계수하였다. 후속하여 6× 10⁴개의 세포를 60mm 접시에 플레이팅하여 4일간 배양하였다. 세포들을 10% 포름알데히드로 고정하고, 1% 크리스탈바이올렛으로 염색하였다. 접시를 건조한 후 이미지를 평대 스캐너로 캡쳐하였다.

단백질 도메인과 호몰로지의 확인

단백질 도메인과 호몰로지를 EMBL데이타베이스 (http://smart.embl-heidelberg.de)에서 SMART 툴을 이용하여 확인하였다.

실험 결과

신규한 세포사멸 유도인자의 유전자를 동정하기 위해, 938 가정적 cDNA 클론을 HeLa 세포에서 일시적으로 발현하였다. 후자의 세포들은 쉽게 배양되고, 높은 효율로 트랜스펙션이 가능하여 이용하였다. 더욱이 세포사멸은 신뢰성과 선택성을 가지고 검출될 수 있다. 트랜스펙션 후 28-30시간후에 자동화된 형광현미경을 이용하여 Hoechst 33342로 염색된 핵의 이미지를 캡쳐하고 분석하여 세포사멸을 측정하였다.

27개 유전자 모두 a가 사멸핵 (도 1A)의 수의 3배보다 큰 자극을 야기하였다. DNA 서열분석에 의하면 7개의 유전자들은 전장이고, 이들 서열들은 주석을 단 서열들과 완전히 일치하였으나 반면 나머지 20개 유전자들은 대개 C 말단이 삭제된 부분 클론들이었다. 본 발명자들은 세포사멸에서 가장 높은 증가율을 보인 전장 유전자로 확인된 3개의 서열 FLJ13855 (서열 번호 1), C10orf61, 및 MGC26717을 선택하였다 (표 1). 이들 3유전자를 가지고 트랜스펙션된 HeLa 세포의 대표적인 Hoechst 염색된 핵의 이미지들을 도 1B에 나타내었다.

<표 1> 가정적 proapoptotic 활성을 가진 유전자

승인번호	부호	유전자명	세포사멸핵에서 배율
NM_015631.2	C10orf61	염색체 10 오픈리딩프레임 61	4.7
NM_173824.2	MGC26717	가정적 단백질 MGC26717	3.9
NM_023079.2	FLJ13855	가정적 단백질 FLJ13855	3.7

이 스크린으로부터 얻은 결과를 확인하기 위해 본 발명자들은 생존성 측정을 수행하였다. 도 2A에서 볼 수 있듯이, 세포생존은 이들 3유전자들에 의한 트랜스펙션으로 현저하게 감소되었다. DNA 분획 ELISAs를 이용하여 본 발명자들은 세포생존율의 감소가 세포사멸에서 유래된 것을 확인하였다 (도 2B). DNA 분획들은 C10orf61, MGC26717, 및 FLJ13855로 트랜스펙션된 세포들에서 거의 2~2.5배 증가하였고, 이는 양성대조구로서 BAX 플라스미드에 의해 야기된 세포사멸에서의 3배 증가에 필적하는 효과이다.

금번 발견을 실체화하기 위해, 본 발명자들은 웨스턴블롯을 도입하여 실행 카스파제인 카스파제-7의 수준을 결정하였다 (도 2C). 세포사멸 유전자 후보군에 의한 트랜스펙션은 카스파제-7의 절단을 유도하였고, 실행 카스파제의 하류 타겟인 폴리-(ADP-리보오스)-폴리머라제 (PARP)에 대한 항체로 웨스턴블롯을 수행한 결과 PARP의 절단이 또한 야기되었다 (도 2D).

도입된 유전자가 정말 발현되었는지 여부를 확인하기 위해 본 발명자들은 FLJ13855의 GFP 태그된 형태를 생성하여 이 구조물로 트랜스펙션된 세포핵을 Hoechst로 염색하였다 (도 3A). 세포사멸핵은 GFP 발현 세포들에서만 계수되었고, 이러한 결과는 FLJ13855 발현 HeLa 세포들이 대략 세포사멸핵이 5배 증가되었다는 것을 나타낸다. 양성대조구인 Bax-GFP는 89.3% 세포사멸을 유도하였고, 반면 세포사멸과 무관한 단백질인 Sec61β는 벡터대조구의 그것과 유사한 수준의 세포사멸을 일으켰다. 이러한 결과는 FLJ13855에 의해 야기된 세포사멸이 그 유전자에 특이적이라는 것을 보여준다.

C10orf61와 FLJ13855 모두에 대하여, 본 발명자들은 항카스파제-7을 이용한 웨스턴 블롯을 수행하여 세포사멸을 검출하였고(도 3C), 항GFP로 블로팅하여 이들 발현을 확인하였다. 약간의 프로카스파제-7의 절단은 트랜스펙션된 GFP 벡터 대조구에서 주목되었고, 이들 세포에서 낮은 세포사멸 수준과 일치하였다. 절단된 카스파제-7의 수준은 C10orf61-GFP 및 FLJ13855-GFP로 트랜스펙션된 세포들에서 증가하였고, 이는 C10orf61 및 FLJ13855의 과잉발현에 기인한 세포사멸을 야기하는 것으로 확인시켜주었다.

이 세포사멸이 사용된 트랜스펙션 시약에 의한 대량의 유전자의 과잉발현으로부터 야기된 가능성을 배제하기 위해 본 발명자들은 C 말단이 myc으로 태그된 형태의 C10orf61, MGC26717, 및 FLJ13855를 만들어, 이들을 렌티바이러스벡터에 서브클로닝하였다. 형질도입된 세포에서 GFP 발현수준은 이들 바이러스가 HeLa 세포들을 효율적으로 감염시키는 것을 보여주었다. 도입된 세포들이 세포사멸을 일으켰는지 여부를 시험하지 않았지만, 본 발명자들은 많은 수의 살아있는 세포들이 현저히 감소되었다는 것을 알아냈다 (도 3D).

C10orf61, MGC26717, 및 FLJ13855의 기능을 알아보기 위해, 본 발명자들은 호몰로그와 유사한 단백질 도메인에 대해 조사하였다. MGC26717의 아미노산 서열은 알려진 단백질 또는 도메인과 명백한 유사성이 없었다. C10orf61는 최근 명명된 Tectonic3의 스플라이싱 변이체인 Tectonic3 아이소폼 b에 대응한다. 포유동물의 Tectonic은 2개의 호몰로그, Tect2와 Tect3을 가지고, 이들의 Tectonic에 대한 상동성은 각각 49%와 58%였다 (Reiter et al., 2006). Tectonic은 헤지호그시그날링의 활성화와 저해 모두에 필수적이나 (Reiter et al., 2006), 관여하는 기작은 정해져야 한다. 헤지호그시그날은 세포주기의 양성 및 음성 조절자로서 행동한다 (Hutchin et al., 2005; Shkumatava and Neumann, 2005). C10orf61에 의해 유도된 세포사멸이 헤지호그시그날링에 의해 매개되는 세포주기 조절과 관련되는지 여부는 더 연구되어야 한다.

상기 단백질 도메인 조사에서 FLJ13855의 N 말단이 유비퀴틴을 컨쥬게이션한 효소 E2 활성(UBC) 도메인을 가진다는 것이 밝혀졌다. 유비퀴틴을 컨쥬게이션한 효소는 유비퀴틴을 타겟 단백질에 공유결합과정에 촉매역할을 담당한다. 주된 pro- 및 항세포사멸 분자들의 폴리유비퀴틴 컨쥬게이션은 유비퀴틴이 세포사멸 세포사의 필수조절자임을 보여준다 (Yang and Xu, 2003). 따라서, FLJ13855는 항세포사멸 단백질의 분해를 촉진하여 세포사멸을 유도하는 것으로 생각할 수 있다.

<실시예 2> 세포사멸 유도인자의 발현 및 기능 확인 Ⅱ

상기 본 발명 실시예 1에 의한 폴리펩티드(FLJ13855, C10orf61, 및 MGC26717)와 기능적으로 동등한 폴리펩티드는 당업자라면, 예를 들면, 폴리펩티드 중의 아미노산 배열에 변이를 도입하는 방법을 이용해 조제할 수 있다. 변이의 도입 방법으로서는 예를 들면, 부위 특이적 변이 유발법(Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wily & Sons Section 8.1-8. 5) 등을 들 수 있다. 또, 이러한 폴리펩티드는 자연계에 있어서의 아미노산의 변이에 의해 생기는 경우도 있다. 본 발명에서는 이와 같이 본 실시예 1에 의해 얻어진 폴리펩티드들과 동등한 기능을 가지는 한, 실시예 1에 의해 얻어지는 최종 아미노산 서열에 대해 1 혹은 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가 등에 의해 얻어질 수 있는 다른 폴리펩티드도 포함된다. 폴리펩티드에 있어서의 아미노산의 변이수나 변이 부위는 그 기능이 보관 유지되는 한 특히 제한되지 않는다. 변이수는 전형적으로는, 전아미노산의 10%이내이며, 바람직하게는 전아미노산의 5%이내이며, 한층 더 바람직하게는 전아미노산의 1%이내이다. 치환되는 아미노산은 폴리펩티드의 기능ㆍ보관ㆍ유지의 관점으로부터, 치환전의 아미노산과 닮은 성질을 가지는 아미노산인 것이 바람직하다. 예를 들면, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp는 모두 비극성 아미노산으로 분류되기 때문에, 서로 닮은 성질을 가진다고 생각된다. 또, 비하전성으로서는 Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln를 들 수 있다. 또, 산성 아미노산으로서는 Asp 및 Glu를 들 수 있다. 또, 알칼리성 아미노산으로서는 Lys, Arg, His를 들 수 있다.

또, 본 발명의 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드는 당업자에게 주 지의 하이브리다이제이션 기술 혹은 유전자 증폭 기술을 이용해 단리 하는 일도 가능하다. 즉, 당업자이면 하이브리다이제이션 기술 (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wily & Sons Section 6.3-6. 4)을 이용해 본 실시예 1에서 얻어지는 폴리펩티드를 코드 하는 염기 서열 또는 그 일부를 기초로 이것과 상동성의 높은 폴리뉴클레오티드를 단리하고, 이 폴리뉴클레오티드로부터 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 얻는 것은 통상적인 기술에 해당한다. 본 발명에서는 본 발명의 폴리펩티드와 동등의 기능을 가지는 한 이들 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 하이브리다이즈 하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드 되는 폴리펩티드도 포함된다.

기능적으로 동등한 폴리펩티드를 코드 하는 폴리뉴클레오티드를 단리하기 위한 하이브리다이제이션의 스트린전트한 조건은 이미 앞서 언급한 바 있다. 일반적으로 하이브리다이제이션의 조건이 어려워질수록 프로브 배열과 높은 상동성을 가지는 DNA의 단리를 기대 할 수 있다. 이러한 하이브리다이제이션 기술을 이용해 단리된 폴리펩티드는 실시예 1에서 얻어진 본 발명의 폴리펩티드와 비교하여 통상, 그 아미노산 서열 또는 해당 폴리펩티드를 코드 하는 염기 서열에 대해 높은 상동성을 가진다. 높은 상동성이란, 적어도 70%이상, 바람직하게는 80%이상, 더 바람직하게는 90%이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상의 서열의 동일성을 가리킨다. 상동성의 특정은 BLAST2 검색 알고리즘(Altschul, S.F. et al, 1997 Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. )을 이용해 결정할 수 있 다.

상술한 조건에 따라 본 발명자들이 각각 70%, 80%, 90%, 95% 및 98%의 상동성을 가지도록 서열번호 1의 염기서열 중 비극성 아미노산 중 Ala을 Val으로, Leu을 Ile으로, Pro을 Met으로 변환시킬 수 있도록 코돈의 일부를 수정하였으며, Phe의 일부는 Trp으로 변형하기 위해 해당 코돈의 일부를 수정하였다. 그 결과 얻어진 유전자를 실시예 1에서와 동일한 방법에 의해 폴리펩티드로 발현시키고, 이 때 각각 얻어진 폴리펩티드를 FLJ13855-1~5로 각각 명명 하였다.

이들 FLJ13855-1~5를 이용하여 실시예 1에서와 동일한 방법에 따라 카스파제-7의 절단과 세포사멸에 대한 기능을 확인한 결과 FLJ13855와 동등한 세포사멸활성을 가지는 것으로 확인하였다.

도 1은 본 발명에 따른 세포사멸 유도성 (proapoptotic) 표현형을 가진 신규 유전자에 대한 스크린 결과이다.

A. 96웰플레이트에 파종된 HeLa 세포가 938 가정적 유전자로 트랜스펙션되었다. 28~30시간동안의 인큐베이션 후에, 세포들은 Hoechst 33342로 염색되었고, 세포사멸은 In Cell Analyzer 1000을 이용하여 측정하였다. 벡터로 트랜스펙션된 세포에서 세포사멸의 비율은 1에서 정해졌다.

B. pCNS 벡터(대조구), C10orf61, MGC26717, 및 FLJ13855로 트랜스펙션된 Hoechst로 염색된 HeLa 세포의 핵 이미지를 In Cell Analyzer 1000을 이용하여 캡쳐하였다. 웰당 3개 필드에서 얻은 이들 대표적인 이미지들을 나타낸다.

도 2는 본 발명에 따라 선발된 후보유전자의 세포사멸 활성실험 결과이다.

A. 세포생존율을 pCNS 벡터(대조구), C10orf61, MGC26717, 및 FLJ13855로 HeLa 세포를 트랜스펙션한 후 36시간에 측정하였다. NT는 트랜스펙션되지 않은 HeLa 세포를 의미한다. 살아있는 세포를 가시화하기 위해 세포를 고정하고, 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 별표는 세포로 파종되지 않은 웰을 나타낸다.

B. HeLa 세포를 pCNS 벡터(대조구), C10orf61, MGC26717, 및 FLJ13855 플라스미드, 또는 양성 대조구로 Bax 플라스미드로 트랜스펙션하고, DNA 분획 ELISA를 이용하여 세포사멸을 측정하였다. 그 결과 3개 독립적인 실험의 평균 및 표준편차를 보여준다.

C. B에 기술된 플라스미드로 트랜스펙션된 HeLa 세포로부터 얻은 용해액을 12% Tris/Tricine 폴리아크릴아마이드젤로 분리하였으며, 웨스턴블롯을 이용하여 프로카스파제-7과 활성화된 빠른 이동성을 가진 카스파제-7을 검출하였다. 부하 대조구로서 비특이적인 교차반응 밴드 (NS)를 이용하였다. 결과는 적어도 3개의 독립적인 대표적인 실험들이다.

D. B에 기술된 플라스미드로 트랜스펙션된 HeLa 세포로부터 얻은 용해액을 9% Tris/Tricine 폴리아크릴아마이드젤로 분리하였으며, 웨스턴블롯을 이용하여 PARP와 절단된 PARP를 검출하였다. 부하 대조구로 액틴을 이용하였다. 결과는 적어도 3개의 독립적인 대표적인 실험들이다.

도 3은 본 발명에 따라 선발된 후보유전자의 발현실험결과이다.

A. HeLa 세포를 일시적으로 GFP 벡터(GFP), GFP로 태그된 FLJ13855(FLJ-GFP), GFP로 태그된 Sec61β(Sec61-GFP), 또는 GFP로 태그된 Bax(Bax-GFP)로 트랜스펙션하였다. 핵을 Hoechst 33342로 염색하고, GFP와 Hoechst 이미지를 자동화된 형광현미경을 이용하여 캡쳐하였다. 3개 웰로부터 얻어진 대표적인 이미지를 나타내었다.

B. 세포사멸핵의 백불율을 구조물당 3개웰에서 세포사멸 핵을 가진 GFP 발현 세포수로부터 계산하였다.

C. HeLa 세포를 트랜스펙션하지 않거나 GFP, C10orf61-GFP, 또는 FLJ13855-GFP로 트랜스펙션하였다. *는 C10orf61-GFP의 발현을 나타내고, **는 FLJ13855-GFP의 발현을 나타낸다. 웨스턴블롯을 이용하여 프로카스파제-7과 활성화된 빨리 이동하는 카스파제-7을 검출하였다. 부하 대조구로 액틴을 이용하였다.

D. 좌측 패널: 대조구 렌티바이러스 (대조구), C10orf61, MGC26717, 또는 FLJ13855로 트랜스덕션된 HeLa 세포를 계수하고, 같은 수의 세포를 60mm 접시에 플레이팅하였다. 4일 후 크리스탈바이올렛을 이용하여 생존세포를 검출하였다.

우측패널: 형질도입후 2일후 얻은 세포용해액을 9% 폴리아크릴아마이드 Tris/Tricine 젤상에서 분리하고, 항myc로 블롯하였다. 블롯의 짧고 긴 노출을 나타낸다. *는 MGC26717-myc의 발현을 나타내고, **는 FLJ13855-myc의 발현을 나타낸다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Polynucleotides Sequence Associated with Apoptosis Induced from Cleavage of Caspase-7, Inhibitor or Inducer of the Apoptosis, and The Screening Method thereof <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3101 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 acactctggc ccggttctcg gtggtgcggg agcgggcggg agcagcggcc gctctggtcg 60 gcggacgtgc tgccgagtag tcccggaagc gaagcagcga tggcggagag tccgactgag 120 gaggcggcaa cggcgggcgc cggggcggcg ggccccgggg cgagcagcgt tgctggtgtt 180 gttggcgtta gcggcagcgg cggcgggttc gggccgcctt tcctgccgga tgtgtgggcg 240 gcggcggcgg cagcgggcgg ggccgggggc ccggggagcg gcctggctcc gctgcccggg 300 ctcccgccct cagccgctgc ccacggggcc gcgctgctta gccactggga ccccacgctc 360 agctccgact gggacggcga gcgcaccgcg ccgcagtgtc tactccggat caagcgggat 420 atcatgtcca tttataagga gcctcctcca ggaatgttcg ttgtacctga tactgttgac 480 atgactaaga ttcatgcatt gatcacaggc ccatttgaca ctccttatga agggggtttc 540 ttcctgttcg tgtttcggtg tccgcccgac tatcccatcc acccacctcg 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Claims (9)

1. 세포사멸에 관여하며, 이하의 서열군에 의해 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 또는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열：

   (a) 서열번호1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열,

   (b) (a)의 DNA에 대하여 전장에 걸쳐 70％ 이상의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열, 혹은

   (c) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드 서열에 스트린전트한 조건하에 하이브리다이제이션하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및

   (d) (a), (b) 또는 (c) 서열과 상보적인 서열 또는 RNA 서열
2. 제 1항에 의한 폴리뉴클레오티드 서열, 또는/및 상기 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 폴리펩티드를 포함하는 세포사멸 유도제.
3. 제 2항에 있어서, 세포사멸 유도제는 암, 자기면역 질환, 바이러스 감염증, 내분비 질환, 장기과형성, 혈관형성 수술후 재협착, 암절제 수술후의 재발, 이식 장기 거절, 면역 부전, 신경 변성 질환, 허혈성 심질환, 방사선 장해, 자외선 장해, 중독성 질환, 영양 장해, 염증성 질환, 허혈성 신경장애, 당뇨병성 신경장애, 혈관계 질환, 호흡기계 질환 및 연골 질환으로부터 구성되는 군에서 선택되는 질환의 치료를 위한 것인 세포사멸 유도제.
4. 제 1항에 기재된 어느 하나의 유전자를 발현하고 있는 세포를 후보약제의 존재하에 배양하고, 후보약제의 부존재하에 동일하게 배양을 한 경우와 비교하여 세포의 사멸을 억제 또는 촉진하는 후보약제를 발견하는 단계를 포함하는 세포사멸 억제 또는 유도인자의 스크리닝 방법.
5. 제 4항에 의한 방법에 의해 발견된 세포사멸 억제 또는 유도인자.
6. 청구항 1 기재의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합벡터
7. 청구항 6 기재의 벡터로 형질전환된 숙주세포
8. 청구항 7 기재의 세포를 포함하는 인간을 제외한 동물
9. 청구항 1 기재의 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포사멸 억제제

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