KR20090013829A - 안정적인 백신 제형 - Google Patents

Abstract

고체 상에 흡착된 단백질 및 하나 이상의 안정화제를 포함하는 수성 백신 조성물로서, 상기 하나 이상의 안정화제는 단백질 및 물 분해의 이온화 산물을 지닌 양자를 교환할 수 있는 이온화 가능기를 가지고, 그리고 상기 이온화 가능기는 양자화될 때 양전하를 띠고 양자화되지 않을 때 전하를 띠지 않는 제1기와 및 양자화될 때 전하를 띠지 않고 양자화되지 않을 때 음전하를 띠는 제2기를 가진다.

안정화제, 백신, 양전하, 음전하

Description

안정적인 백신 제형{STABLE VACCINE FORMULATION}

본 발명은 단백질을 함유하는 안정적인 백신 제형에 관한 것이다.

단백질의 천연 3차 구조의 손실은 일반적으로 생물학적 활성의 손실과 관련있다. 그러므로 활성 단백질(예를 들면, 백신, 치료용 단백질, 진단 단백질 등)을 천연 3차 구조가 유지되는 조건 하에 저장되는 것을 보증하는 것이 중요하다.

어떤 기간 동안의 단백질의 저장은 안정성 문제들을 갖는다. 3차 구조의 변이는 온도에 비례한다. 그러므로 단백질은 일반적으로 더 낮은 온도에서 더 안정적이다. 전형적으로, 단백질은 생물학적 활성을 보존하기 위해 냉동-건조(동결건조) 또는 냉동(-20℃ 가량)되어 저장되어야 한다. 만약 냉동-건조되거나 냉동되어 저장된다면, 단백질은 사용 전에 재구성되어야 한다. 단백질의 단기간 보관을 위해서는, 4℃의 냉장이 충분할 수 있다.

단백질은 천연적으로 발생하는 20가지 다른 아미노산의 서열들로 이루어진 거대분자이다. 이러한 아미노산들 중 7개(아스파르트산, 글루타민산, 히스티딘, 시스테인, 타이로신, 라이신 및 아르기닌)는 산-염기 평형에 관여할 수 있는 측쇄를 포함한다. 이것은 이들이 pH 및 용액에 존재하는 다른 종들에 따라 양자(proton)를 수용하거나 제공할 수 있다는 것을 의미한다. 세린 및 트레오닌 또한 주위 분자와 양자를 교환할 수도 있다. 그러나, 이러한 아미노산의 pK_a 값은 매우 높아(>13.9), 그들의 측쇄들은 실질적으로 항상 거의 완전히 양자화된 형태이다.

단백질 백신의 면역원성 활성은 주요 단백질 항원의 구조적 보전(integrity)에 (큰 정도로) 의존하고, 특히(항체들이 천연 접힘에 의해 함께 가져온 폴리펩타이드 사슬의 다른 영역에 결합을 요하는 곳인) 삼차원적 항원기(conformational epitopes)와 관련있다. 비가역적 삼차원적 변화 및 비가역적 응집은 백신의 불활성화를 이끈다. 각 단백질 분자의 상당한 영역이 여전히 용매수와 완전한 상호작용을 할 때 알루미나 입자와 같은 입자에 또는 다른(비미립자) 표면에 흡착된 단백질에 같은 고려사항이 적용된다. 이는 부분적으로 사실상 또는 논리상의 제한으로 인해 그리고 부분적으로 가격으로 인해, 저온 유통체계의 유지가 매우 어렵거나 불가능한 제3세계에서의 백신 배포에 특히 중요하다.

WO2007/003936(우선권 주장일 후 발표)는 다음과 같은 특징을 갖는 단백질 및 하나 이상의 안정화제를 포함하는 수성 시스템을 개시하고 있다

(i) 하나 이상의 안정화제는 단백질 및 물 분해(water dissociation)의 이온화 산물과 양자들을 교환할 수 있는 이온화 가능기를 갖는다;

(ii) 이온화 가능기는 양자화될 때 양전하를 띠고 양자화 되지 않을 때 전하를 띠지 않는 제1기와 양자화될 때 전하를 띠지 않고, 양자화되지 않을 때 음전하를 띠는 제2기를 포함하고; 그리고

(iii) 조성물의 pH는 pH에 대해 단백질의 최대 안정성의 50% 이상인 단백질 안정성의 범위 내이거나, 또는 조성물이 pH에 대해 최대 안정성을 갖는 pH의 ±0.5 pH 유닛의 범위 내이다.

본 발명의 요약

본 발명에 따르면, 백신 조성물은 단백질 및 적어도 (i) 및 (ii) 특성으로 상기에서 정의된 하나 이상의 안정화제를 포함하고, 상기 단백질은 고체에 흡착된 것이다.

안정화된 단백질은 미생물학적으로 살균 형태일 수 있고, 그리고 유리병, 주사기 또는 캡슐과 같은 봉합된 살균 용기에 편리하게 담기거나 보관될 수 있다.

적합한 pH에서 단백질을 갖는 것에 의해, 그 주위에 대해 양자 교환 평형 상태 값에서 또는 근처 값에서(대개 0.5 pH 유닛 내에서, 바람직하기는 0.4 pH 유닛 내에서 그리고 더 바람직하기는 0.2 pH 유닛 내에서) 저장 안정성이 최적이고, 그래서 단백질의 저장 안정성은 (주위의 온도(약 20℃)나 상승한 온도에서) 비-최적화 상태(대게 pH 7에서)에서 단백질의 저장 안정성과 비교하여 아마도 현저하게, 증가될 수 있다.

저장 안정성은 일반적으로 (13.99 pK_a를 갖는) H₃O⁺ 및 (-1.74 pK_a를 갖는) OH^-의 값들 보다 덜 극단적인 pK_a 값을 가진 단백질과 양자를 교환할 수 있는 하나 이상의 종을 포함하는 하나 이상의 첨가제의 사용에 의해 더욱 증진될 수 있다. 아래에서 더 자세히 상술한 바와 같이, 제1 및 제2 작용기를 지닌 하나 이상의 첨가제를 사용하는 것이 바람직하다. 이와 추가의 설명은 여기에 그 내용인 참조로서 병합된 WO2007/003936에서 발견될 수 있다.

첨가제는 첨가제의 전체 농도가 1 mM 내지 1 M, 바람직하기는 1 mM 내지 200 mM, 가장 바람직하기는 5 mM 내지 100 mM의 범위가 될 정도의 양으로 존재하는 것이 적절하다. 특정 실제 적용에서, 특히 의료적 적용에서, 종종 가능한한 낮은 농도의 첨가제의 사용이 바람직할 것이다.

본 발명의 기초가 되는 발견들은, 여기에서 설명되는 것처럼, 실제로 지지되어 왔던 이론적 기초를 갖는다. 실제로, 본 명세서는 임의의 단백질을 위한 안정화 시스템을 어떻게 이용가능한 정보를 토대로 결정할 수 있는지를 상술한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 이점은 또한 경험적 근거, 용액내 임의의 단백질에 대하여, 그리고 다른 첨가제의 존재에 따라 안정도와 pH사이의 관련이 있고, 단백질이 최적의 안정성을 갖는 pH가 있다는 이해에서 달성될 수 있다. 본 명세서의 정보를 기반으로, 당업자는 유용할 수 있는 첨가제를 쉽게 결정할 수 있고, 그래서 실제로 이들이 본 발명에 의해 정의된 기준을 충족하는지를 결정할 수 있다.

따라서 본 발명의 개선점은 활성의 현저한 손실없이 단백질이 주위 온도에서 연장된 시간동안 저장될 수 있을 정도의 수성 환경에서 단백질의 저장 안정성이 만들어져 증진을 가능하게 하는 것이고, 따라서 동결 또는 냉장을 필요로 하지 않게한다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 특정 바람직한 특색은 종속 청구항에서 정의한다.

본 발명은 단백질의 안정성, 특히 수성 환경에서, 예를 들면 수용액, 수성 겔 형태 및 유리수나 결합수가 있는 고체 상태(또는 다른 비-용액 상태)에서의 단백질의 안정성에 관한 것이고, 그리고 주위 온도(약 20℃) 및 그 이상에서의 안정성을 포함하는 단백질의 저장 안정성, 즉 시간 경과에 따른 안정성에 관한 것이라는 것이 이해될 것이다. 본 명세서에서 "단백질"이라는 용어는 단일 폴리펩타이드로 이루어지는 분자들 또는 분자 복합체, 두개 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 분자들 또는 분자 복합체, 및 보결분자단(prosthetic groups), 보인자(cofactor)들 등과 같은 하나 이상의 비-폴리펩타이드 모이어티와 함께 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 분자 또는 분자 복합체를 포함하는 것으로 사용된다.

본 발명은 단백질의 구조적 특성, 특히 2차, 3차 및 4차 구조의 보유, 그리고 단백질 기능적 특성, 특히 항원이나 수용체 결합 특성의 보유가 중요한 모든 시스템에 적용될 수 있다.

본 발명의 적용은 비가역적 형태적 변화 및 단백질의 비가역적 응집 및 결과적인 단백질 활성의 손실 가능성을 상당히 감소시킨다.

본 발명은 분리나 발현, 정제, 운송 및 보관을 포함한 생산물의 수명 동안 단백질의 안정화에 적용할 수 있다.

분자 크기의 면에서, 본 발명은 2차 또는 3차 구조의 최소한의 기본 모티브가 형성될 수 있는 2000 이상의 상대적 분자량을 갖는 폴리펩타이드에 적용할 수 있다. 본 발명의 적용을 제한하는 상대적 분자량의 상한은 없다.

2차 구조의 면에서, 본 발명은 알파 나선, 베타 시트 및 불규칙 코일의 임의의 비율을 포함하는 단백질에 적용할 수 있다.

3차 구조의 면에서, 본 발명은 구상 단백질과 피브릴상 단백질 둘 다에 적용할 수 있다. 본 발명은 그 3차 구조가 비-공유적 상호 작용에 의해서만 유지되는 단백질 뿐만 아니라 그 3차 구조가 비-공유적 상호 작용과 하나 이상의 이황화다리의 조합에 의해 유지되는 단백질에도 적용할 수 있다.

4차 구조의 면에서, 본 발명은 단량체 단백질 뿐만 아니라 두개, 세개, 네개 또는 그 이상의 서브 유닛으로 이루어진 단백질에도 적용된다. 본 발명은 또한 단백질 결합체에도 적용될 수 있다.

비-단백질 구조적 성분의 면에서, 본 발명은 비-펩타이드 성분을 전혀 포함하지 않는 단백질 뿐만 아니라 당단백질, 지단백질, 핵단백질, 금속단백질 및 전체 질량의 10% 이상을 단백질이 차지하는 복합체를 포함한 다른 단백질에 적용할 수 있다. 그들의 기능을 위해 보인자를 요하지 않는 단백질 뿐만 아니라 그들의 기능을 위해 조효소, 보결분자단 또는 활성화제를 요하는 단백질에도 적용할 수 있다.

본 발명은 소수성, 이온성 또는 리간드 교환 상호작용에 의한 백신 보조제와 같은 고체 기재에 부착된 단백질에 적용할 수 있다. 본 발명은 또한 수성 겔 형태에 용해된 단백질 및 자유수 또는 결합수가 여전히 존재하는 건조 또는 동결-건조에 의해 수용액으로부터 물이 부분적으로 또는 완전히 제거된 고체 상태의 단백질에 적용할 수 있다.

단백질은 천연 또는 재조합된, 글리코실화 또는 비-글리코실화, 자기 분해성 또는 비-자기분해성 일 수 있다. 본 발명은 주 항원이 폴리펩타이드 사슬로 이루어지는 경우의 재조합 단백질 백신 뿐만 아니라 감독된 바이러스나 전체 세포 백신에 특히 적용할 수 있다. 이러한 백신의 예는 다음을 포함한다:

B형 간염 백신

말라리아 백신

인유두종 백신

A형 뇌수막염 백신

C형 뇌수막염 백신

백일해 백신

소아마비 백신

본 발명에 사용된 단백질은 실질적으로 천연 상태로 유지될 수 있다. 본 명세서의 목적을 위해, "천연 단백질"이라는 용어는 보유된 3차 구조를 가지는 단백질을 설명하고, 어느정도 풀림 또는 변성을 거친 단백질과의 구별하기 위해 사용된다. 천연 단백질은 어느정도의 화학적 변형, 예를 들면 물리적 변형이 아닌 탈아미드화를 포함할 수 있다.

단백질은 알루미나와 같은 고체 표면에 흡착된다. 어떤 경우에서는, 표면에 단백질의 흡착 전에 안정화 제형에서 고체 표면(알루미나 입자와 같은)을 전-배양하는 것이 이롭다. 이것이 단백질의 더 높은 안정성을 야기할 수 잇다.

면역원성 단백질의 특정한 경우, 예를 들면, 백신으로 사용하기 위한, B형 간염과 같은 인단백질, 및 따라서 알루미나와 같은 흡착제/보조제와 함께 사용될 수 있는 것, 및 특히 리간드 교환이 발생할 수 있는 경우, 포스페이트는 바람직한 안정화제이다. 예를 들면, 제형이 포스페이트 음이온(> 20 mM)을 포함할 때, 포스페이트가 추가로 원하는 특성을 제공할 수 있는 것 같다. 포스페이트의 중요성에 대한 근거는 전체적으로 명확하지 않지만, 그러나 포스페이트 음이온이 알루미나로의 백신의 적절한 결합 역할을 한다고 믿어진다(예를 들면, Iyer S. et al.: 백신 22 (2004) 1475-1479 참조). 실시예에서 보고한 것과 같이, 포스페이트 음이온의 존재 중 새로운 안정화 기술을 기반으로한 제형에서 7주 동안 55℃에 저장된 B형 간염 백신의 항원 활성의 >95% 회복이 발견되었다. 추가적인 실험은, 백신이 알루미나 보조제에 강하게 흡착되어 남아있고, 백신/알루미나 입자의 침전율에 변화가 일어나지 않는다는 것을 확인하기 위해 수행되었다. 포스페이트의 사용은 약제학적 제형에서 pH 완충제로서 매우 일반적인 반면, 본 발명에서 이것의 적용은 제형의 pH가 5.2, 즉 포스페이트의 완충력이 무시할 정도인 상태이므로 일반적이지 않다.

단백질 분자를 안정화시키기 위해, 단백질 표면에서 양자 교환의 빈도와 에너지를 최소화시킬 필요가 있다. 다음의 양자 교환의 세가지 에너지-관련 관점이 현재 모델에서 고려된다:

(1) 단백질 안정성은 이것의 표면에서 양자 교환의 빈도를 최소화하여 증진시킬 수 있다.

(2) 모든 양자화할 수 있는 아미노산 측쇄의 자유 에너지가 양자화되지 않은 형태에서 보다 양자화된 형태에서 더 낮기 때문에, 단백질 안정성은 양자화된 형태에서 측쇄의 비율을 가능한한 높게 유지하여 증진시킬 수 있다.

(3) 단백질의 표면에서 아미노산 측쇄의 산-염기 동적 평형이 주변 분자와 양자의 연속적인 교환에 의해 유지되기 때문에, 그리고 그러한 양자 교환동안 방출된 에너지 양이 포함된 종들 사이의 pK_a 차이에 의존하기 때문에, "활동적인(energetic)" 양자 교환(특히 H₃O⁺ 및 OH^-를 포함하는 것들)을 "온화한(mild)" 양자 교환(덜 극단적인 pK_a 값을 갖는 화학적인 종들을 포함)으로 치환하는 것이 단백질 안정성에 유리하다. 이것은 H₃O⁺ 및 OH^-의 농도를 최소화하는 것, 그리고 덜 극단적인 pK_a 값을 갖는 양자를 교환할 수 있는 종들을 병합하는 것에 의해 달성될 수 있다.

양자 교환의 빈도

화합물의 pK_a는 산-염기 행동의 지표이다. 이 값은 온도에 따라 다양하고, 아미노산 측쇄의 pK_a 값은 유리 아미노산의 값과 같을 필요가 없음(비록 차이가 너무 크지 않아야 할지라도)이 주목되어야 한다. 단백질 아미노산의 측쇄의 pK_a 값은 주어진 pH에서 양자화된 형태 및 양자화되지 않은 형태의 상대적 비를 결정한다. 이는 WO2007/003936의 도1에 나타난다.

아미노산 측쇄와 주변 분자 사이의 양자 교환의 빈도(또는 비율)는 만약 아미노산의 pH = pK_a라면 최대일 것이다. 이 pH에서, 평형이 유지되어, 측쇄의 양자화된 형태 및 양자화 되지 않은 형태의 양은 동등하다. 이는 양자화/비-양자화 사이클의 최대 속도를 야기한다. 만약 pH가 아미노산의 pK_a에서 부터 멀어진다면, 양자화/비-양자화 사이클의 속도는 양자화된 형태(높은 pH에서)나 양자화되지 않은 형태(낮은 pH에서)의 낮은 비율에 의해 줄어든다. 예를 들면, 글루타민산의 경우에서, 최대의 양자 교환 빈도는 4.15 정도의 pH에서 발생할 것이고, 히스티딘의 경우는 6 정도의 pH에서 발생할 것이다. 7개 아미노산의 양자 교환의 상대 속도는 WO2007/003936의 도 2에서 pH의 함수로 도시된다. 상대 속도는 임의로 1로 선택된 아미노산 측쇄의 전체 비-차원적 농도와 함께, 아미노산 측쇄의 양자화된(HA) 및 양자화되지 않은 (A) 형태의 농도의 생산물로 표현된다. 양자 교환의 최고 속도에 해당하는 y-축의 값은 따라서 0.5 x 0.5 = 0.25이다.

단백질 안정성은 양자 교환의 전체적인 빈도를 최소화하여, 즉 단백질 표면에서 모든 양자 교환 발생의 합을 최소화하여 증진시킬 수 있다. 양자 교환 빈도의 전체적인 빈도의 실시예는 프로테아제 효소 파파인에 대해 WO2007/003936의 도 3에 도시된다. 이는 개별적인 아미노산의 양자 교환 빈도를 합하여 산출되었고, 반면 각각의 아미노산의 상대적 기여가 파파인 서열내 이것의 상대적 존재비에 의해 측정되었다. 파파인 안정성에 대한 최적의 pH는 5.8과 6.2 사이임이 실험으로 발견되었다. 이는 양자 교환 속도의 최소값과 대략 일치한다.

그러나, 양자 교환의 상대 빈도는 단백질 안정성/불안정성에 대한 기여 요소 중 하나일 뿐이고 다른 기여 요소의 관계에서 고려되어져야 한다(아래 참조). 이것은 양자 교환의 빈도가 최적 pH의 좋은 지표인 반면, 가장 높은 안정성이 양자 교환 빈도 프로파일의 최소값에서 정확하게 이루어질 필요는 없다.

측쇄의 자유(깁스)에너지의 최소화

모든 양자화될 수 있는 아미노산 측쇄의 깁스(Gibbs) 자유 에너지는 양자화되지 않은 형태에서 보다 양자화된 형태에서 더 낮다. 이는 자유 전자쌍(그곳에 양자가 결합된 것)이 양자의 부재와 비교하여 양자의 존재에서 에너지가 더 낮기 때문이다. 따라서 아미노산 측쇄 상에 양자의 결합은 전체 단백질의 전체적인 자유 에너지를 감소시킨다. 그러므로 단백질 안정성은 이것의 표면에 아미노산의 양자화를 최대화하여 증진시킬 수 있다.

pH의 함수로서 두개의 모델 단백질들(글루코스 산화효소 및 파파인)의 표면에서 전체적인 양자화의 백분율은 WO2007/003936의 도 4에 도시된다. 이는 두개의 단백질의 서열에서 모든 양자화될 수 있는 아미노산의 양자화된 형태의 비율을 합산하여 산출하였다. 반면 글루코스 산화효소는 낮은 등전점(pI = 대략 4.4)을 가진 단백질의 예인 반면, 파파인은 매우 높은 등전점(pI = 대략 8.7)을 가진 효소이다. 이것은 양자화 프로파일에 반영된다. 중성 pH (~7)에서 측쇄 양자화의 백분율은 글루코스 산화효소의 경우보다 파파인의 경우 상당히 더 높다. 그러므로 파파인의 경우보다 글루코스 산화효소의 경우 더 낮은 pH로 최적의 pH를 미는 경향이 더 높을 것이다.

효소 안정화를 위한 실제 최적 pH는 양자 교환 빈도를 기반으로 산출된 이론적인 최적 pH로부터 낮은 pH로 항상 적어도 약간은 (또는 상당하게) 이동한다는 것이 실험적으로 발견되었다. 양자화의 정도는 분명히, 양자 빈도를 토대로 산출된 이론적인 최적 pH로부터 더 낮은 최적 pH로 얼마나 이동하는지를 결정하는 중요한 매개변수이다. 양자화 정도가 단백질의 pI와 밀접하게 연결되기 때문에 이 효과는 다음과 같이 요약될 수 있다: 높은 pI를 갖는 단백질은 낮은 pH를 향해 그들의 실제 최적 pH를 이동하는 단지 적은 경향성 만을 가지는 반면, 낮은 pI를 갖는 단백질은 이 방향으로 최적 pH를 이동하는 더 큰 경향성을 가질 것이다.

양자 교환동안 방출된 에너지의 최소화

양자 교환동안 방출된 에너지의 양은 포함된 종들 간의 pK_a 차이에 의존한다. 그러므로 극단적인 pK_a의 화합물(특히 H₃O⁺ 및 OH^-를 포함한 것들)과 지속적인 상호작용의 영향을 최소화하고, 이들이 덜 극단적인 pK_a값을 갖는 화합물과 함께 상호작용하여 교체되는 것을 보증하는 것이 단백질의 안정성에 이롭다.

수용액에서 "극단적인 pK_a 값"을 가진 우점종은 H₃O⁺ 및 OH^-이다. 종의 pK_a 값이 극단적일수록, 이 종이 "고에너지" 형태 (즉, 강 산의 경우에는 양자화된 형태 또는 강 염기의 경우에는 양자화되지 않은 형태)로 발생할 가능성이 낮다. 단백질에서 그 종이 더 해로울수록 수용액에서 나타날 가능성이 낮고, 이것은 단백질을 보호하는 유용한 피드백 기전이라고 말할 수 있다. 이러한 피드백 기전은 또한 H₃O⁺ 및 OH^-에 적용된다. 그러나, 이들 두 종은 수용액에서 이들의 농도가, 순서대로 "고에너지" 종의 상대적 빈도를 증가시키는 극히 높은(~55.5 M)물에서 유래된다(양자화에 의하거나 비-양자화에 의한). 그러므로, H₃O⁺ 및 OH^-의 극단적인 pK_a를 감안할 때, 이러한 종들의 농도는 항상 매우 높을 것이다(예를 들면, 55.5 mM 농도로 존재하는 첨가제로부터 유래된 비슷한 pK_a의 다른 종의 농도보다 3배수 더 높은 조건).

주어진 pH의 25℃ 수용액에서 H₃O⁺ 및 OH^-의 농도는 WO2007/003936의 도 6에 도시된다. H₃O⁺ 및 OH^-의 전체 농도가 최소(200nM)인 pH이기 때문에, 단백질 안정화를 위한 최적 pH는 7이어야 한다는 것을 주장하는 몇몇 이론이 있을 것이다. 비교하자면, pH 6 또는 8에서 H₃O⁺ 및 OH^-의 전체 농도는 1.1 μM이고 pH 5 또는 9에서는 10.01 μM 등이다. 그럼에도 불구하고, 만약 H₃O⁺ 및 OH^-의 농도가 파괴적인 양자 교환의 가능성을 결정하는 유일한 매개변수였다면, 이는 사실일 수 밖에 없다. 가능성은 또한 상기한 바와 같이, 주어진 pH에서 단백질의 양자화 상태에 의존한다. 더욱이, 이것은 단백질의 전체적인 아미노산 조성물에 의존하고, 이는 단백질이 전체적으로 H₃O⁺ 공격이나 OH^-을 더 받기 쉬운지 여부를 결정한다. 따라서 최적 pH는 7로부터 꽤 멀 수 있다.

아미노산 측쇄 및 H₃O⁺ 또는 OH^- 사이의 양자 교환의 에너지 영향은 표 1에 나타내었다. 상기 영향은 충돌하는 종 사이의 pK_a 차이(pK_a 차이는 충돌동안 방출된 에너지에 비례함)로 표현된다.

표 1

아미노산	pK a	pK a - pK H3O+	pK OH- - pK a
아스파르트산	3.71	5.45	10.28
글루타민산	4.15	5.89	9.84
히스티딘	6.04	7.78	7.95
시스테인	8.14	9.88	5.85
타이로신	10.10	11.84	3.89
라이신	10.67	12.41	3.32
아르기닌	12.1	13.84	1.89

더 산성인 아미노산의 경우(아스파르트산, 글루타민산 및 히스티딘), 이는 더 많은 에너지를 방출하는 OH^-와의 상호작용인 반면, 더 알카리성인 아미노산의 경우, 이는 더 불안정한 H₃O⁺와의 상호작용이다.

낮은 에너지의 양자화된 형태로 가능한 많은 아미노산 측쇄를 유지하기 위한 단백질의 경향 때문에, 3개의 가장 알칼리성인 측쇄(타이로신, 라이신 및 아르기닌 - 모두 pK_a > 10 를 지님)는 사실상 최적 상태로 완전하게 양자화 될 것이고, 그러므로 양자 교환에서 그들의 개입은 최소일 것이라는 것이 예상될 수 있다. 이러한 예상은 실험 결과와 일치한다: 시험된 모델 단백질의 최적 pH는 4.8 - 8.0 사이의 범위이다. 심지어 pH 8.0에서 타이로신, 라이신 및 아르기닌은 거의 완전하게 양자화 된다. 그러므로 H₃O⁺ 또는 OH^-에 대한 단백질의 민감성과 이로인한 단백질 안정성에 대한 최적의 상태를 결정하는 것은 시스테인, 히스티딘, 글루타민산 및 아스파르트산의 상대 존재비(relative abundance)이다.

낮은 값으로 최적 pH를 미는 낮은 pI를 지닌 단백질의 경향성이 있을 것이다. 이는 낮은 pI 단백질이 특히 OH^- 공격에 민감한 가장 산성인 아미노산 (아스파르트산 및 글루타민산)의 더 높은 비율을 포함하기 때문이다(표 1 참조).

pH 조정은 단백질 안정성을 증진시키기 위해 이용될 수 있는 단 하나의 기준은 아니다. 안정성은 단백질의 아미노산 측쇄를 갖는 "온화한" 양자 교환에서 사용될 수 있어, 따라서 H₃O⁺또는 OH^-를 가지고 파괴적인 "활동적인" 양자 교환들의 가능성을 더 감소시킬 수 있는 화합물을 첨가하여 더욱 증진시킬 수 있다.

만약 두개의 산-염기 작용기가 포함된다면, 최상의 결과가 달성될 수 있다는 것을 실험에서 발견하였다. 바람직하게, 제1 작용기는 최적 pH 보다 적어도 한 유닛 더 높은 pK_a를 갖고, 최적 pH에서는 양전하를 띤다. 이는 기의 전하가 양자를 받아들이는 동안, 중성에서 양성으로 바뀌는 것을 의미한다(예를 들면 아미노기, 퓨린, TRIS등). 제2 작용기는 바람직하기는 최적 pH보다 적어도 한 유닛 더 낮은 pK_a를 갖고, 최적 pH에서는 음전하를 띤다. 이는 기의 전하가 양자를 수용하는 동안 음성에서 중성으로 바뀌는 것을 의미한다(예를 들면, 카르복실기).

소량의 완충제는 최적 pH를 유지하기 위해 첨가제와 함께 사용될 수 있지만, 이것이 필수적이지는 않는다. 첨가제의 병합은 단백질 안정성을 위한 최적 pH에 (첨가제의 특성과 양에 따라 약 0.5 pH 유닛 내에서) 약간 영향을 줄 수 있다.

제1기의 상대적 과량(즉, 최적의 pH에서 양으로 하전된)은 단백질 안정성에 유익하다는 것이 또한 발견되었다. 이는 아스파르트산 및 글루타민산의 음으로 하전된 측쇄와 이온 결합을 형성하여 추론적으로 설명될 수 있다; 최적 pH는 이들 측쇄가 대량으로 양자화되기 위해 4보다 훨씬 더 낮아야 한다. 그러한 이온 결합은 양자의 결합과 마찬가지로 이러한 측쇄의 자유 전자 쌍의 깁스 에너지를 더 낮출 수 있다.

알고리즘은 단백질의 알려진 아미노산 서열 및 이것의 등전점을 토대로 최적 pH를 바르게 예견할 수 있도록 유도되어왔다. 예견은 전체 아미노산 서열을 사용하여 달성될 수 있는 반면, 단백질의 표면에 접근 가능한 아미노산 측쇄를 고려하는 것 만이 추천된다. 단백질 구조에서 전체 아미노산 서열과 개별 아미노산의 접근성 둘다 Protein Data Bank 정보 데이타베이스(http://www.rcsb.org/pdb)를 사용하여 발견할 수 있었다. 아미노산 접근성 예측을 위해, DEEP VIEW 단백질 소프트웨어를 다운로드 할 필요가 있다(http://www.expasy.org/spdbv에서 이용 가능).

알고리즘은 다음과 같이 3단계로 이루어진다.

단계 1:(MS-엑셀로 쉽게 실행될 수 있다)

pH에 대한 양자 교환 빈도 함수(P) 및 플롯을 계산하라:

상기 식에서,

M은 단백질 유닛의 상대적 분자량이고,

N은 단백질 유닛에서 주어진 아미노산 측쇄의 수이고(1 = 아스파르트산, 2 = 글루타민산, 3 = 히스티딘 등)

[HA]는 주어진 pH에서 아미노산의 양자화된 형태의 비율이고,

0 < [HA] < 1.

[A]는 주어진 pH에서 아미노산의 양자화되지 않은 형태의 비율이다.

0 < [A] < 1.

만약 pH에 대해 표시한다면, 양자 교환 빈도 프로파일을 얻을 수 있다;

단계 2: 다음과 같이 pH 이동(여기에서 X로 표시)의 크기로 계산하라:

X = A x pI + B

상기식에서, 만약 전체 아미노산 조성물이 사용된다면 A = -1.192 및 B = 10.587 이고; 그리고

만약 오직 단백질 표면에 접근할 수 있는 아미노산 만이 사용된다면 A = -0.931 및 B = 8.430이다.

pH 간격 4-9에서 1 단계에서 얻은 함수의 최소값을 찾아라. Y값을 얻기 위해 최소값에 계산된 pH이동 값을 더하라:

Y = P_minimum + X

P 대 pH 그래프에서 Y 값에 해당하는 pH를 판독하라. 항상 P 대 pH 그래프에서 Y 값에 해당하는 두개의 pH 값이 있을 것이다(P_minimum 보다 아래에 하나 및 P_minimum 보다 위에 하나). 값이 P_minimum 아래로 판독되는 것이 중요하다(즉, 낮은 pH 값 쪽으로). 이것이 효소의 안정화를 위해 예상된 최적 pH이다. 매개변수 X, Y 및 P_minimum 사이의 관계는 WO2007/003936의 도 7에 개시된다.

3 단계: 일단 최적 pH가 선택되면, 하나 이상의 다음의 작용기를 함유한 하나 이상의 첨가제가 선택될 수 있다.

작용기 1:

제1 작용기는 단백질 안정성을 위해 최적 pH보다 더 높은 pK_a 값을 가지고(단계 1 및 2에서 예상된 것과 같이), 최적의 pH에서 양전하를 띤다. 이는 기의 전하가 양자를 수용하는 동안 중성에서 양성으로 바뀌는 것을 의미한다.

작용기의 pK_a는 단백질 안정성을 위해 최적 pH보다 더 높아야 한다. 바람직하기는, 최적 pH 보다 5 pH 유닛 큰 범위 내여야 한다. 더 바람직하기는, 최적 pH 보다 0.5 - 4 pH 유닛 큰 범위 내여야 한다. 가장 바람직하기는 효소를 위해 최적 pH 보다 1 - 3 pH 유닛 큰 범위 내여야 한다.

작용기 2:

제2 작용기는 단백질 안정성을 위해 최적 pH보다 하나 이상의 낮은 유닛에서 pK_a를 갖고(단계 1 및 2에서 예상된 것과 같이), 최적 pH에서 음전하를 띤다. 이것은 기의 전하가 양자를 수용하는 동안 음성에서 중성으로 바뀌는 것을 의미한다(예를 들면, 카르복실기).

작용기의 pK_a는 단백질 안정성을 위해 최적 pH보다 더 낮아야 한다. 바람직하기는, 최적 pH 보다 5 pH 유닛 낮은 범위 내여야 한다. 더 바람직하기는, 최적 pH 보다 0.5 - 4 pH 유닛 낮은 범위 내여야 한다. 가장 바람직하기는, 효소를 위해 최적 pH 보다 1 - 3 pH 유닛 낮은 범위 내여야 한다.

제형은 제1 작용기 만을 포함할 수 있다(즉, 양전하인 것). 바람직하기는, 제형은 제1 및 제2 작용기 모두를 포함한다.

두개의 작용기는 하나의 화합물(예를 들면, 아미노산) 내에 포함될 수 있다. 바람직하기는, 두개의 작용기는 하나 이상의 첨가제에 위치한다(예를 들면, 하나의 첨가제는 제1의, 음전하 기를 포함하고, 다른 첨가제는 제2의, 양전하 기를 포함한다). 제형에 첨가되는 작용기의 두가지 타입 각각의 수는 한정되지 않는다.

어떤 경우, 음전하 기의 양에 비하여 과량인 양전하 기를 포함하는 것이 유리할 수 있다.

첨가제의 완충력은 그들의 pK_a가 최적 pH로부터 오직 약 1 pH 유닛인 경우에서 충분할 수 있다. 만약 pK_a가 더 멀다면 완충력이 감소될 수 있다. 그 다음 최적 pH와 가까운 pK_a를 갖는 저농도의 완충제가 요구되는 pH를 유지하기 위해 사용될 수 있다.

안정화 첨가제로 유용하게 첨가될 수 있는 두개의 작용기 각각을 위한 기의 종류의 몇몇 예는 표 2에 나타내었다.

표 2

작용기 1	작용기 2
아미노산의 α-아미노기	아미노산의 α-카르복실기
아미노산의 측쇄 아미노기	아미노산의 측쇄 카르복실기
퓨린(및 퓨린 기저 화합물)	유기산의 카르복실기:
1차 아민	젖산
2차 아민	숙신산
3차 아민
TRIS와 같은 4차 아민	무기산

pK_a 값과 함께, 가능한 첨가제 성분의 특정 예의 목록은 표 3에 나타내었다.

표 3

아미노산	작용기 1의 pK a	작용기 2의 pK a
글리신	9.8	2.4
알라닌	9.9	2.4
발린	9.7	2.2.
류신	9.7	2.3
이소류신	9.8	2.3
세린	9.2	2.2
트레오닌	9.1	2.1
시스테인	10.8, 8.3	1.9
메티오닌	9.3	2.1
아스파르트산	9.9	2.0, 3.7
아스파라긴	8.8	2.1
글루타민산	9.5	2.1, 4.1
글루타민	9.1	2.2
알기닌	9.0	1.8
라이신	9.2	2.2
히스티딘	9.2, 6.0	1.8
페닐알라닌	9.2	2.2
티로신	9.1	2.2
트립토판	9.4	2.4
프롤린	10.6	2.0
오르니틴	8.69	1.7
시트룰린	9.69	2.4
및 상기 아미노산으로 이루어진 다양한 펩타이드
다른 카르복실산들
포름산		3.8
글리옥실산		3.2
옥살산		1.3, 4.2
아세트산		4.8
글리콜산		3.8
피루브산		2.4
말론산		2.8, 5.7
젖산		3.8
글리세르산		3.5
푸마르산		3.0, 4.4
숙신산		4.2, 5.6
말산		3.4, 5.1
α-타르타르산		3.0, 4.3
글루타르산		4.3, 5.4
아스코르브산		4.1
아디프산		4.4
갈산		4.4
아민들
트리메틸아민	9.8
1,2-프로판디아민	6.66, 9.8
1,3-프로판디아민	9.0, 10.3
1,2,3-트리아미노프로판	9.5, 7.9
펜틸아민	10.6
트리스(히드록시메틸)아미노메탄	8.1
벤질아민	9.3
페닐 에틸아민	9.8
티라민	9.7
트립타민	10.2
히드록시트립타민	9.8
이민들
에틸렌이민	8.01
다른 화합물들
퓨린	8.96
8-히드록시퓨린	8.26
암모늄 이온	9.25
퀴놀린	4.9
1-이소퀴놀아민	7.6
1-메틸이미다졸	7.0
알란토인	8.9
베로날	7.4
2-에틸벤즈이미다졸	6.2
브루신	8.3
우라실	9.5
2,4,6-트리메틸피리딘	7.5

상기 열거된 재료들은 오직 예시를 목적으로 나타내었다. 특정 단백질의 특이 양상이 고려되어져야 한다는 것을 당해 기술분야의 당업자는 물론 잘 이해할 수 있을 것이다. 예를 들면, 선택된 첨가제는 단백질 활성을 억제하지 않는다는 것을 보증하는 것이 중요하다. 또한 단백질의 열 안정성을 증진시키도록 사용된 화합물이 사용된 조건 하에서 그 자체는 안정하다는 것을 보증하는 것 또한 중요하다.

본 발명은 단백질 안정성에 잘 접근하는 다른 것과 결합할 수 있다. 예를 들면, 프로테아제 억제제는, 단백질이 샘플에 존재하는 프로테아제 활성에 의해 서서히 소화되지 않는다는 것을 보증하기 위해 제형에 병합될 수 있다.

사용될 수 있는 다른 첨가제는 폴리알콜, 예를 들면, 최소 0.5%의 농도인, 및 전형적으로 5% 이하(w/w)인 폴리알콜이다. 그러한 화합물의 예는 이노시톨, 락티톨, 만니톨, 자일리톨 및 트레할로스와 같은 사카라이드이다.

본 발명의 적용에 의해 안정화된 단백질 제형의 이온강도는 제형의 의도된 사용을 위한 요건을 충족시킬 수 있도록 조정될 수 있다(예를 들면, 치료용 등장성 제형). 중요하게는, 실험은 실온 거울에서의 단백질의 안정성이 원칙적으로는 더 높은 온도에서의 안정성을 반영하고, 활성 감소율이 증가된 온도(예를 들면, 6O℃)와 비교하여 실온에서 상당히 많이 느려진다는 것이 실험으로 반복적으로 입증되었다.

다음의 실시예는 본 발명을 설명한다.

실시예 - B형 간염 재조합 백신

B형 간염 백신의 인 비트로 항원 활성화는 AUSZYME 모노클론성 진단 키트(Abbott Laboratories; cat no. 1980-64)를 사용하여 측정되었다. 항원 활성은 전체 백신 및 원심분리한(13,000 RPM, 5 분) 상층액 둘 다에서 측정되었다. 각각의 샘플은 3번씩 측정되었다. 항원 활성은 다음과 같이 미처리 냉장 백신의 측정 값에 대한 백분율로 나타내었다:

상기 식에서:

R은 항원 활성의 복구율(%)이고,

N은 음성 대조 AUSZYME 측정의 값이고,

C1, C2 및 C3는 대조 샘플(즉, 미처리 냉장 백신)의 3번 반복된 AUSZYME 측 정의 값이고,

S1, S2 및 S3는 테스트 샘플의 3번 반복된 AUSZYME 측정의 값이다.

B형 간염 백신의 잔존 항원 활성은 2, 4 및 7 주 동안 55℃에서 배양한 후 테스트되었다. 히스티딘 및 포스페이트 음이온으로 이루어지고 최적 pH로 조정된 안정화 제형은 7주 후 원래의 항원 활성의 >95%를 보유하였다. 대조적으로, 원래의 백신 제형(18 mM 포스페이트 완충액, pH 6.9-7.1, 132 mM 소듐 클로라이드 함유)의 잔존 항원 활성은 이 시점에서 <10% 였다. 원심분리 후 안정화 제형의 상층액에서 측정된 항원 활성이 원래 샘플의 상층액에서 측정된 값과 비슷하므로 안정화 제형은 알루미나-항원 조합에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 포스페이트 음이온의 존재가 알루미나로 백신의 최적 결합을 보증한다고 믿어진다.

Claims (24)

1. 고체 상에 흡착된 단백질 및 하나 이상의 안정화제를 포함하는 수성 백신 조성물로서, 상기 하나 이상의 안정화제는 단백질 및 물 분해의 이온화 산물과 양자를 교환할 수 있는 이온화 가능기를 가지고, 그리고 상기 이온화 가능기는 양자화될 때 양전하를 띠고 양자화되지 않을 때 전하를 띠지 않는 제1기 및 양자화될 때 전하를 띠지 않고 양자화되지 않을 때 음전하를 띠는 제2기를 가지는 수성 백신 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 이온화 가능기를 가지는 하나의 안정화제를 포함하는 수성 백신 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 이온화 가능기를 각각 각지는 두개의 안정화제를 포함하는 수성 백신 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, pH와 관련하여 상기 조성물이 최대 안정성을 가지는 pH의 ±0.5 pH 유닛의 범위 내의 pH를 갖는 것인 수성 백신 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1기 및 제2기는 각각 조 성물의 pH보다 더 높거나 더 낮은 pK_a 값을 갖고, 이들 기 중 50%이상이 이온화된 것인 수성 백신 조성물.
6. 제4항에 있어서, 상기 기의 80%이상이 이온화되고, 그리고, 바람직하기는 상기 기가 실질적으로 완전히 이온화된 것인 수성 백신 조성물.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 각 pK_a 값은 조성물의 pH의 0.5 내지 4 pH 유닛 내에 있는 것인 수성 백신 조성물.
8. 제7항에 있어서, 각 pK_a 값은 조성물의 pH의 1 내지 3 pH 유닛 내에 있는 것인 수성 백신 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 4 내지 9인 수성 백신 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리알콜을 추가로 포함하는 수성 백신 조성물.
11. 제10항에 있어서, 폴리알콜 0.5%(w/w) 이상을 포함하는 것인 수성 백신 조성 물.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 안정화제 0.1% (w/w) 이상을 포함하는 것인 수성 백신 조성물.
13. 제12항에 있어서, 하나 이상의 안정화제 0.5% (w/w)이상을 포함하는 수성 백신 조성물.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 또는 각 안정화제 200mM 이하를 포함하는 수성 백신 조성물.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 또는 각 안정화제 100mM 이하를 포함하는 수성 백신 조성물.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 천연 상태인 수성 백신 조성물
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 안정성은 이것의 기능적 및/또는 구조적 특징의 보유에 의해 측정된 것인 수성 백신 조성물.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 면역원성인 수성 백신 조성물.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 수용액, 현탁액 또는 분산액인 수성 백신 조성물.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체는 알루미나와 같은 백신 보조제인 수성 백신 조성물.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 포스페이트를 추가로 포함하는 수성 백신 조성물.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 동물 몸에 실시되는 치료에 사용되는 것인 수성 백신 조성물.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 밀봉된 용기.
24. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 건조하여 얻어질 수 있고, 그리고 재구성될 수 있는 실질적으로 건조된 제형.