KR20080110988A

KR20080110988A - 싱글-니들 생체내 일렉트로포레이션용 장치 및 방법

Info

Publication number: KR20080110988A
Application number: KR1020087019463A
Authority: KR
Inventors: 룬 크제켄; 이아코브 매티에센; 토룬 엘리사베스 트젤레; 조지 맥휴
Original assignee: 제네트로닉스, 인코포레이티드
Priority date: 2006-02-11
Filing date: 2007-02-09
Publication date: 2008-12-22
Also published as: CA3063263A1; EP1981581A4; CA2635437A1; WO2007095140A2; US20070287950A1; US10369359B2; US20230001190A1; CA3063263C; KR101385865B1; AU2007215263B2; WO2007095140A3; EP1981581A2; JP5059786B2; CN101370553B; AU2007215263A1; EP1981581B1; CA2635437C; CN101370553A; EA200870252A1; NO20083811L

Abstract

본 발명은 다양한 의약적 적용을 위해 생체내 조직으로 분자를 투여하는 장치 및 방법에 관한 것으로서,

상기 장치는 단일 피하 주사침 및 2개 이상의 공간이 이격된 긴 전극을 포함하며, 니들이 조직, 가령, 피부 또는 근육으로 삽입하는 경우 비균일한 전기장으로 조직을 펄스시킬 수 있어 상기 조직으로 니들이 삽입될 때 니들에 의해서 만들어지는 트랙에 근접하거나 또는 트랙을 따라 놓여 있는 세포를 가역적으로 포레이션할 수 있는 것을 특징으로 한다.

Description

싱글-니들 생체내 일렉트로포레이션용 장치 및 방법{DEVICE AND METHOD FOR SINGLE-NEEDLE IN VIVO ELECTROPORATION}

본 발명은 생체내 세포의 일렉트로포레이션에 관한 것으로서, 특히 환자의 조직 세포의 일렉트로포레이션에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 긴 싱글-니들 전극(elongate single-needle electrode)의 지정된 삽입 트랙 부위에서, 근처에서 및/또는 인접하게 위치하는 세포에 분자를 송달하기 위한 신규한 장치 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 조직의 표면으로부터 전극을 깊이 3 mm 내지 3 cm 조직에 삽입함으로써 만들어진 니들 트랙(needle track)의 주변을 따라서 세포로 물질을 일렉트로포레이션 송달하는 것에 관한 것으로서, 조직은 어떠한 조직이나 포함되며, 피부, 가로무늬근, 평활근, 점막 및 기관을 포함하며, 이에 한정되지 않는다.

하기의 설명은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 이러한 정보는 현재의 청구된 발명에 대한 종래 기술 또는 관련 기술이며, 참고로 특이적이거나 또는 함축된 공보는 종래 기술인 것으로 허용하지 않는다.

일렉트로포레이션은 조직에 삽입하기 위한 니들 전극으로 전형적으로 고안된 2개 이상의 전극의 배열로서 다양한 다수-전극 디자인을 사용하여 표면하 조직으로 분자를 송달하도록 적용되었다. 통상, 상기 배열은 배열의 니들 전극들 사이에 놓여 있는 치료 영역을 한정한다. 그러므로, 상기 치료 영역은 조직의 3차원 부피를 포함하며, 치료 영역내 세포는 3차원 부피내 또는 근처에 놓여 있는 세포에 세포막의 일시적 또는 가역적 포레이션 또는 때때로 비가역적 포레이션을 일으키기에 충분한 강도의 전기장에 노출된다.

조직내 세포를 일렉트로포레이션하기 위한 현재의 실시는 3차원 치료 영역을 통해 상대적으로 균일한 전기장을 부여하기위해 상당한 전압을 사용하는 것을 포함한다. 여기서 "상대적으로 균일한(relatively uniform)"이란 포레이션을 일으키기에 충분한 전기 펄스의 사용과 일치되는 전기력선이 3차원 치료 영역 부피를 통해 다소 균일하게 세포를 통해 부여되는 것을 의미한다. 마침내, 대량의 주입 부피 및 고전기장과 조합된 다수의 전극 니들은 조직으로 빠르게 송달되는 주입 환약(injection bolus)이 주입 부위로부터 빠르게 퍼져나가 전기장을 체험한 조직 부피와 주입된 약물이 충분히 오버랩되도록 해야 한다. 고전기장 및 다수의 전극 배열을 사용하는 것은 몇가지 단점을 가지고 있다. 예를들면, 다수의 니들과 고 전기장(전압)을 사용하면 통증을 더 줄 수 있으며 높은 주입 부피가 투여되는 경우 제어하는 것이 어려워서 약물이 폐기될 수 있다(대부분의 약물은 치료 영역의 외부면에 있는 경우 세포에 도달되지 않는다). 또한, 상기 다수의 니들 장치를 사용하는 것은 부담스러운 일이며, 환자의 관점에서 불안감을 일으킬 수 있다.

다수의 니들을 갖는 장치의 침해 측면과 비교하여, 상술된 바와 같은 전형적 인 일렉트로포레이션 기술은 치료 영역내 세포의 일렉트로포레이션에 가변성을 일으킨다. 상기는 주변 조직으로 주입된 환약의 치료 분자의 분산으로 일렉트로포레이션에 의한 치료 영역내 세포로 최종적으로 트랜스펙션(transfection)된 상기 치료 분자의 양을 조절하는데 실패할 수 있다는 일렉트로포레이션의 의약적 용도에 대한 단점이 있다. 그러므로, 일렉트로포레이션 분야에서 환자의 조직내 특이적이고 잘 한정된 송달 부위로 치료 분자의 "투여(dosing)"에 대한 제어를 좁히거나 또는 재한정하는 장치 및 방법에 대해서 필요성이 존재한다. 마찬가지로, 상기 분야에서 피부, 근육, 점막 및 기관을 포함하는 다양한 조직으로 치료 물질을 송달하는데 사용되는 전기장 펄스로부터 통증을 줄일 수 있고 침입성이 적게 일렉트로포레이션할 수 있는 방법 및 장치에 대한 필요성이 여전히 존재한다.

발명의 요약

제1 측면에서, 본 발명은 계내(in situ) 세포, 특히 피하(subcutaneously), 내피(intradermally), 피하(subdermally), 및/또는 근내(intramuscularly)[특히 골격근(skeletal muscle), 가로무늬근(striated muscle), 평활근(smooth muscle), 예를들면 심장, 근육]에 위치하는 세포의 일렉트로포레이션을 제공한다. 관련 실시양태에서, 본 발명은 조직으로 단일의 긴 니들 전극을 삽입함으로써 만들어진 트랙 근처 및/또는 트랙에 인접한 세포의 일렉트로포레이션을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 장치를 사용하여 일렉트로포레이션되는 세포는 새로운 디자인에 의해서 부여된 통상 원통형의 치료 영역을 포함하고 싱글-니들 전극에 의해서 조직으로 부여된 전기장을 펄스시킬 수 있도록 니들 트랙으로부터 0.0 내지 5 mm의 반경내에 위치한다.

제2 실시양태에서, 본 발명은 단일의 긴 전기적 비활성 샤프트와 조합되어 위치한 2개 이상의 대항하는 전극 리드(예를 들면, 1개 이상의 애노드 및 1개 이상의 캐소드)를 제공하는 다수의 구조적 배열을 제공하며, 샤프트 자체는 전극, 및 전극들 사이의 공간 0.05 mm 내지 1.5 mm를 채우는 전기적 비활성 물질, 예컨대 의약적으로 허용가능한 플라스틱 또는 폴리카르보네이트를 포함하거나, 또는 긴 마주보며 공간이 이격된 전극들을 포함할 수 있다.

실시양태에서, 싱글 니들 전극 또는 샤프트를 포함하는 전극을 침투하는 조직의 전극은 0.05 mm 내지 1.5 mm의 공간적으로 이격된 치수를 갖는다. 관련 실시양태에서, 전극 자체는 전체 니들 길이에서 니들 영역까지에서, 가령 샤프트 침투 팁(shaft penetration tip) 근처에 긴 샤프트를 따라 노출된 길이를 가질 수 있다. 또한, 전극은 0.005 내지 0.80 mm의 단면 치수를 가질 수 있다. 또다른 구조적 배열 실시양태에서, 싱글 니들 전극은 외부의 피하 니들의 길이의 적어도 일부를 따라 공간적으로 이격된 2개 이상의 긴 전극들을 포함하는 피하 니들을 포함할 수 있다. 예를들면, 피하 니들은 니들의 길이의 일부를 따라서 걸쳐진 2개 이상의 전극(예를들면, 애노드 및 캐소드)를 포함할 수 있다(도 1A 참조). 작업 실시양태에서, 각 전극은 반대 극들(예를들면, 하나의 전극은 애노드 전극이고, 다른 하나는 캐소드 전극임) 사이에서 전기장을 발생할 수 있는 전기 에너지 공급원에 연결된다. 다른 예에서, 다수의 전극들이 다수의 직쇄이고 평행한 전극들을 포함하는 도 3에 개시되거나 또는 주사침 주위에 나선으로 존재하는 다수의 전극을 포함하는 도 2 및 도 4에 도시된 피하 주사침의 외부에 형성될 수 있다. 부가의 실시양태에서, 싱글-니들 전극은 마이크로 전기역학 시스템(Micro electromechanical systems, MEMS) 기술에 대해서 부식 및 적층 단계를 포함하는 잘 이해되는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 상기 제조 방법에서, 마이크로매칭 방법(micromachining processes)은 물질의 층을 첨가 또는 스트립하여 적당한 어닐링, 절연, 및 전기 펄스 및 전기의 회로도의 실시를 위해서 사용된다. 도 13A, 13B, 13C, 13D 및 13E는 전극이 송달 니들 샤프트상에 에칭되는 실시양태의 사진이다. 특히, 금 전극 적층(layering)은 피하 니들 샤프트상에 적층되어진 비활성 물질(파릴렌)의 층상에 코팅되어진다. 긴 전극을 제조하는 추가의 방법은 압출 기술(extrusion technology)을 포함하며, 전극 리드가 가령 플라스틱, 폴리에스테르 유도체, 또는 폴리비닐클로라이드(PVC) 또는 절연 탄소 섬유와 같이 절연성을 갖는 전기적 비활성 조성물의 샤프트로 및/또는 샤프트를 따라서 형성된다. 도 14A 및 14B에 개시된 바와 같이, 긴 중공 니들은 전극 성분으로, 가령 예를들면 도 14B에 개시된 바와 같이 나선형 또는 중공 샤프트의 반대면을 따라 와이어가 압출될 수 있다. 또한, 니들 샤프트는 전극들이 접하지 않는 영역을 포함할 수 있다. 예를들면, 니들 샤프트의 한쪽 말단은 액체의 공급원에 연결하기위한 연결기, 가령 예를들면 주입기를 형성하는 허브(hub)에 연결된다. 샤프트의 영역 근처 또는 영역을 따른 절연은 환자에 의해서 인식가능한 전기 자극 지각을 부가적으로 적게 한다. 본원에 기술된 상기 전극 배치에 관련된 부가의 실시양태에서, 각 전극들은 개별적으로 가압될 수 있으며, 전극들의 조합은 동시에 또는 주어진 순서로 전극쌍(예를들면, 캐소드 및 애노드)에 가압될 수 있으며, 또한 단극(monopolar), 양극(bipolar), 지수적 붕괴(exponential decaying) 또는 상기의 펄스 트레인 결합(pulse train combination)을 포함하는 펄스의 형태를 사용할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

제3 실시양태에서, 본 발명은 상대적으로 낮은 전압 및/또는 낮은 전류의 사용을 제공하며, 처리 영역에서 세포의 가역적 포레이션을 일으키기에 충분한 전기 에너지를 제공할 뿐만 아니라 주위 조직으로 전기 펄스를 적용하는 동안 환자가 경험하는 통증의 수준을 낮출 수 있으며, 상기 적용은 명목 전기장 강도로 1 내지 100 V, 전형적으로는 2 내지 50 V, 더 바람직하게는 3 내지 25 V를 사용한다. 관련 측면에서, 본 발명의 장치 및 방법에 사용되는 전류는 통상 1-400 mAmps, 전형적으로 5-200 mAmps, 더 바람직하게는 20-100 mAmps를 사용한다. 관련 실시양태에서, 선택된 암페어수(amperage)는 전극의 전체 표면적에 따라 다르다. 예를 들면, 상기 장치는 각 전극의 전체 전극 표면적에 따라 10-40, 또는 25-100, 또는 50-150, 또는 125-200, 또는 175-250, 또는 225-300, 또는 250-300 또는 300-400 mAmps 범위를 사용한다. 표면적이 작아지면 계내 조직에서 전기장으로 일렉트로포레이션을 달성하기위해 필요한 암페어수가 적어진다. 펄스는 1-1000 밀리초로 적용될 수 있다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 다양한 농도(예컨대, 예를들면 0.05μg 내지 3 mg/ml), 바람직하게는 낮은 환약 부피(예컨대, 예를들면 통상 1 μl 내지 1 ml)에서 치료 분자의 송달을 위해서 제공한다. 싱글 니들 전극 샤프트와 조합된 송달 튜브를 포함하는 구조적 실시양태를 사용하는 관련 실시양태에서, 치료 분자의 부피를 조직으로 직접 주입하여(가령, 니들의 삽입 중에 주입물(injectate)을 송달하는 제어된 주입) 놀랍게도 주사침 트랙의 주변에 실제 수준으로 남아 있다. 치료 분자는 치료 약물, 예컨대 작은 분자, 유기 화합물 뿐만 아니라 단백질 및 생물학적 활성을 갖거나 또는 폴리펩티드가 일렉트로포레이션된 세포에서 발현되는 경우 숙주에서 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 것으로 이해된다. 세포에서 발현되는 폴리펩티드는 세포 대사 기작 및 면역 시스템 경로와 작용하는데 이용할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 조직을 펄스하는데 사용되는 전기 에너지는 유사한 조직의 일렉트로포레이션에 사용되는 전기장이 가압되기 이전과 달리 독특한 전기장을 제공한다. 특히, 종래의 전기장은 일렉트로포레이션 분야에 알려져 있는 것을 의도적으로 고유하게 부여되며, "균일한" 전기장은 가압된 전기 에너지는 충분한 강도를 가져서 전극들이 서로 떨어져 있는 거리를 제공하여 전극들을 널리 분리시키고, 상기 공간이 이격된 전극들 사이에 적절한 중심에 표적의 치료 영역을 놓음으로써 형성된 치료 영역을 통해 상대적으로 균일한 전압 강하 및 명목 전기장 강도를 부여하는 것을 의미한다. 조직내 펄스되는 경우 상기 전극 배열 디자인은 3차원 치료 영역에 인접하고 치료 영역을 둘러싼 위치에 세포 영역을 더 적게 하고 전기력선 주위에 전극에 의해서 경계를 주는 영역내 세포를 우선적으로 일렉트로포레이션하는 경향이 있다.

대조적으로, 본 발명은 니들 샤프트의 길이에 대해서 형성됨으로써 전극의 위치 "외부면"에서 일렉트로포레이션 필드를 중심에 놓인 전극에 충분히 가할 수 있는 가까운 영역내 놓여 있는 세포의 치료 영역을 형성할 수 있어 세포를 포레이션하기위한 충분한 강도의 원통형 또는 컬럼형 "비균일한(non-uniform)" 필드를 포함하는 전기장을 사용한다. 상기 치료 영역은 중심 니들 및 전극의 외부 및 주변에 있으며 비균일한 필드는 전극/니들로부터 외부 방향으로의 거리에 대해 분산된다. 통상, 싱글 니들 전극으로부터의 거리가 증가되는 경우 전기 에너지의 분산은 에너지 여기서 세포를 가역적으로 포레이션하기에 충분한 에너지가 지수율로 분산되는 다른 물리적 현상에서 발견되는 분산과 비슷하다. 그러나, 분산율이 적용가능하다면 상기 분산율은 본 발명의 장치의 기능에 부정적인 영향을 주지 않으며, 한정된 영역에서 세포로 물질을 송달하는 의도된 성과에 부정적인 영향을 주지 않는다. 그러므로 세포 포레이션을 일으키는데 필요한 전기 에너지는 전기장 공급원으로부터 거리로 분산되기 때문에, 일렉트로포레이션될 수 있는 니들 트랙 주위의 면적은 니들 트랙의 길이와 연관된 중심 코어 및 전극에 펄스 에너지를 부여할 때 가변성 반경의 원통형 치료 영역을 형성하는 주어진 반경으로 고유하게 한정된다. 추가의 관련 실시양태에서, 펄스에 사용되는 에너지가 더 많아지면, 전극과 직접 접촉하는 세포를 손상시킬 가능성이 더 커진다. 본 발명의 방법은 면역 시스템을 추가로 시뮬레이트하기위해 상기 손상을 일으킬 수 있는 역량을 사용한다. 그러므로, 치료 관리(treatment regimens)는 치료 부위 주변의 면역 반응 활성에 대한 자극을 제공하기위해서 더 적은 에너지보다는 오히려 더 큰 에너지를 부여하는데 사용될 수 있다.

또다른 실시양태에서, 상기 장치는 이에 한정되는 것은 아니지만 병원성 생물체 및 바이러스 및 암에 의해서 유래되는 질병을 포함하는 다양한 질병을 치료 및/또는 숙주내 면역 반응을 조절하기위해 또는 질환을 치료하기위해, 약물, 생물학적 활성을 갖는 천연 폴리펩티드 및 치료 영역내 세포내 계내에서 발현될 수 있는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 송달하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 특징 및 잇점은 하기의 도면, 상세한 설명 및 첨부된 청구의 범위에 의해서 명확할 것이다.

도 1은 니들내 통합된 긴 전극을 포함하는 피하 니들을 도시하는 도이다. 상기 니들은 상기 전체를 흐르는 루멘으로부터 액체 제제를 분배하는 포트 및 유체 운반 저장소로 연결하기위한 포트를 특징으로 한다.

도 2는 본 발명의 장치의 선택적 실시양태를 도시하며, 애노드 및 캐소드 전극들은 니들 주변에 나선형으로 형성된 평면을 통해 서로 평행하다.

도 3A는 또다른 실시양태를 나타내며, 송달 니들의 길이를 따라서 직쇄형으로 평행하게 전체에 걸쳐서 다수의 애노드 및 캐소드 전극을 송달 니들이 포함한다. 이에 도시된 바와 같이, 상기 도면은 전기 에너지 공급원에 전극을 연결하기위한 연결기의 예를 포함한다. 도 3B는 A-A 라인을 따라 본 발명의 하나의 전극 예의 단면도를 나타낸다. 하나의 배치에서 개시된 바와 같이, 전극은 섬유 분야에 공지된 다수의 기술에 의해서 송달 튜브 및 루멘의 외부면에 적층될 수 있다. 본 도면에서 적층된 전극상에 절연 물질(55)에 의해서 둘러싸인 루멘(54)을 갖는 이너 니들(inner needle, 53)이 도시되어 있다.

도 4는 송달 니들 주위에 나선형으로 배치된 전극을 포함하는 또다른 실시양태의 예이다. 나선형으로 배치된 전극은 다수의 애노드 쌍 및 캐소드 쌍을 포함할 수 있지만, 그러나 전형적으로 1개 또는 2개의 전극 쌍을 포함하며, 각 쌍은 애노드 및 캐소드를 포함한다.

도 5A-5C에서는 본 발명의 하나의 실시양태를 도시하며, 본 발명의 전극은 저장소, 전형적으로 주입기가 구비된 저장소, 및 니들이 환자 조직으로 삽입되는 경우 수축될 수 있는 샤프 커버(sharps cover)를 포함하는 실시양태를 추가로 포함한다. 또한 본 도면은 본 발명의 장치내 구체화될 수 있는 다른 특징을 나타내며, 가령 탄성 막(resilient membrane)은 확장되거나 또는 수축된 위치에 샤프 커버 및 주입기 플런저(syringe plunger)를 유지시키기위한 저장소 및 기작을 채우기위해서 니들에 의해서 피어싱될 수 있다. 더우기, 수축가능한 샤프 커버는 니들 가이드(needle guide)로서 작용하며 깊이 가이드(depth guide)로서 작용하도록 스탑(stop)으로 피팅할 수 있다. 비록 개시되지는 않았지만, 싱글 니들 전극은 주입기에 피팅될 수 있고, 자동 니들 송달/동시 유체 송달 일렉트로포레이션 장치에 부착되며, 이는 미국 특허 출원 제10/612,304호 및 PCT/GB2003/002887에 도시되어 있다. 상기 실시양태에서, 상기 장치는 하나의 니들과 하나의 주입기만을 가질 수 있다.

도 6은 전극/송달 니들이 조직으로 삽입되는 동안 또는 삽입 이후에 유체 물질이 투여되고, 전극을 가압하여 니들 트랙으로부터 외부 방향으로 조직에 전기장 을 부여한다. 전기장은 삽입된 니들의 부위로부터 조직으로 외부방향으로 분산된다.

도 7은 피하 조직의 상부면 및 전형적인 전기장을 나타내며, 본 발명의 장치는 니들 트랙 주위에 및 측면 치수 (a) 및 (b)를 갖는 조직에서 발생된다.

도 8A-8C는 본 발명과 반대되는 배열 니들들 사이의 상응하는 전기장 및 상대적으로 균일한 력선을 가는 종래의 배열을 나타내는 도면이며, 비균일한 력선 및 상대 전기장은 배열을 둘러싸며 이로부터 빠르게 소산된다. 예를 들면, 도 8A는 선형 배열로 3개의 대항 전극을 나타내며, 전극들 사이의 력선은 상대적으로 균일하다. 도 8B 및 8C에서는 원형 배열을 나타내며, 치료 영역은 전극에 중심에 있으며 상대적으로 균일한 력선 및 관련 전기장하에 있다(도 8B에서 반대 쌍들에서 개별적으로 펄스되며, 또는 도 8C에서 다른 배향의 대항 전극들의 쌍들에서 펄스됨).

도 9A-9D는 본 발명의 장치의 추가의 실시양태를 나타내며, 니들을 레스팅(resting)하기위한 가이드 및 조직 표면 근처에 치료 물질의 송달을 포함하는 방법에 사용하기위해 예각으로 치료될 조직의 침투를 위한 저장소를 포함한다. 상기 각은 조직 표면의 통상의 면적에 의해서 형성된 평면으로부터 3-25도 사이이다.

도 10은 송달 니들의 팁(tip) 근처에 노출된 전극들을 포함하는 송달 니들의 부분도를 나타낸다. 도 10A는 직쇄형 전극을 지지하는 니들을 나타내며, 도 10B는 나선형 전극을 지지하는 니들을 나타낸다. 각각의 포지티브 및 네가티브 애노드에 대한 리드는 니들의 내부 영역까지를 나타낸다. 또한, 상기는 긴 니들의 상부는 전극 리드 주위에 절연 및/또는 상한 니들 샤프트를 코팅하는 단계를 포함하는 것 을 나타내는 것으로 의도된다.

도 11A 및 11B는 조직내 일렉트로포레이션의 결과를 나타내며, 니들 트랙의 주위에 세포가 포레이션에 의해서 우선적으로 영향을 받는다. 도 11A에서, 인접한 조직의 슬라이스를 나타내는 일련의 사진이며, 도 11B는 니들 트랙을 따라 중심 슬라이스의 확대도를 나타낸다.

도 12는 본 발명에 따른 일렉트로포레이션 장치를 사용하여 형광 마커 단백질(fluorescent marker protein, GFP)을 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 핵산의 토끼의 고 근육으로 한번 주입한 결과를 나타낸다.

도 13A, 13B, 13C, 13D 및 13E는 프로토타입 피하 니들(prototype hypodermic needle)의 확대 사진이며, 금 긴 전극은 표준 주사침상에서 MEMS 기술을 사용하여 부식되며, 예를 들면 전극은 니들 샤프트 둘레의 1/4를 포함하도록 기본 주사침 샤프트상에 물질을 미세 적층(micro layering) 및 부식 및 재적층한다. 도 13A는 상기 니들의 길이 전체에 걸쳐서 하나의 긴 전극을 나타내는 니들의 하나의 도를 나타낸다. 도 13B에서, 상세한 사진은 2개의 금 전극의 말단 영역의 가시화를 허용하는 각으로부터 나타낸다. 도 13C는 니들 샤프트상에 부식된 전극의 말단 영역의 상세를 나타내는 투시도이다. 도 13D 및 도 13E는 MEM 크래프트 전극이 니들 샤프트 둘레의 1/16인 또다른 실시양태를 나타낸다.

도 14A, 14B 및 14C는 예를들면 압출된 피하 샤프트로 세워진 전극 리드로 압출된 플라스틱과 같은 전기적 비활성 물질을 샤프트내 포함하는 싱글-니들 디자인의 부가의 실시양태를 나타낸다. 도 14A는 니들 샤프트에 평행한 직쇄형 전극을 나타낸다. 도 14C는 샤프트의 전극이 니들 허브상에 위치한 전극 리드에 연결될 수 있는 하나의 실시양태를 나타내는 도 14A의 AA-AA 단면을 나타낸다.

도 15는 본 발명의 싱글 니들을 사용하는 일렉트로포레이션 펄스(■) 대 일렉트로포레이션하지 않은 것(▲)에 따라 제조된 토끼의 항-인간 IgG 항체의 수준을 나타내는 그래프이다.

도 16은 본 발명의 싱글 니들을 사용하는 일렉트로포레이션 펄스(■) 대 일렉트로포레이션하지 않은 것(▲)에 따라 제조된 토끼의 항-SEAP 항체의 수준을 나타내는 그래프이다.

도 17A 및 17B는 일렉트로포레이션하지 않음으로써 GFP를 코딩하는 플라스미드 DNA의 주입이후에 녹색 형광 단백질(GFP) 발현의 결과를 나타내는 사진이다. 천연 및 형광 광의 조합에서, 도 17A는 주입/니들 트랙 부위 주위에 인접한 조직 슬라이스를 나타낸다. 사진은 일렉트로포레이션되지 않아 발현되지 않은 것을 보여준다.

도 18A 및 18B는 천연 광 및 녹색 형광의 조합, 또는 형광 단독을 나타내는 사진이며, 일렉트로포레이션 이후에 GFP를 코딩하는 플라스미드 DNA의 주입은 23 게이지 니들 및 니들 샤프트 둘레의 1/16의 너비를 갖는 애노드 및 캐소드 전극들을 포함하는 싱글 니들 전극을 사용하여 실시된다. 본 실험에서, 상기 전극은 50 mA의 일정 전류로 펄스된다.

도 19A 및 19B는 천연 광 및 녹색 형광의 조합, 또는 형광 단독을 나타내는 사진이며, 일렉트로포레이션 이후에 GFP를 코딩하는 플라스미드 DNA의 주입은 23 게이지 니들 및 니들 샤프트 둘레의 1/16의 너비를 갖는 애노드 및 캐소드 전극들을 포함하는 싱글 니들 전극을 사용하여 실시된다. 본 실험에서, 상기 전극은 100 mA의 일정 전류로 펄스된다.

도 20A 및 20B는 천연 광 및 녹색 형광의 조합, 또는 형광 단독을 나타내는 사진이며, 일렉트로포레이션 이후에 GFP를 코딩하는 플라스미드 DNA의 주입은 23 게이지 니들 및 니들 샤프트 둘레의 1/4의 너비를 갖는 애노드 및 캐소드 전극들을 포함하는 싱글 니들 전극을 사용하여 실시된다. 본 실험에서, 상기 전극은 50 mA의 일정 전류로 펄스된다.

도 21A 및 21B는 천연 광 및 녹색 형광의 조합, 또는 형광 단독을 나타내는 사진이며, 일렉트로포레이션 이후에 GFP를 코딩하는 플라스미드 DNA의 주입은 23 게이지 니들 및 니들 샤프트 둘레의 1/4의 너비를 갖는 애노드 및 캐소드 전극들을 포함하는 싱글 니들 전극을 사용하여 실시된다. 본 실험에서, 상기 전극은 100 mA의 일정 전류로 펄스된다.

도 22A 및 22B는 천연 광 및 녹색 형광의 조합, 또는 형광 단독을 나타내는 사진이며, 일렉트로포레이션 이후에 GFP를 코딩하는 플라스미드 DNA의 주입은 23 게이지 니들 및 니들 샤프트 둘레의 1/4의 너비를 갖는 애노드 및 캐소드 전극들을 포함하는 싱글 니들 전극을 사용하여 실시된다. 본 실험에서, 상기 전극은 150 mA의 일정 전류로 펄스된다.

도 23A 및 23B는 천연 광 및 녹색 형광의 조합, 또는 형광 단독을 나타내는 사진이며, 일렉트로포레이션 이후에 GFP를 코딩하는 플라스미드 DNA의 주입은 유체 송달 실시 없이 1mm 이격된 전극들을 포함하는 싱글 니들 전극을 사용하여 실시된다. 본 실험에서, 상기 전극은 75 mA의 일정 전류로 펄스된다.

도 24A 및 24B는 천연 광 및 녹색 형광의 조합, 또는 형광 단독을 나타내는 사진이며, 일렉트로포레이션 이후에 GFP를 코딩하는 플라스미드 DNA의 주입은 유체 송달 실시 없이 1mm 이격된 전극들을 포함하는 싱글 니들 전극을 사용하여 실시된다. 본 실험에서, 상기 전극은 150 mA의 일정 전류로 펄스된다.

도 25A 및 25B는 천연 광 및 녹색 형광의 조합, 또는 형광 단독을 나타내는 사진이며, 일렉트로포레이션 이후에 GFP를 코딩하는 플라스미드 DNA의 주입은 유체 송달 실시 없이 1mm 이격된 전극들을 포함하는 싱글 니들 전극을 사용하여 실시된다. 본 실험에서, 상기 전극은 250 mA의 일정 전류로 펄스된다.

바람직한 실시양태의 상세한 설명

제1 실시양태에서, 본 발명은 유체 매질(예를들면, 송달 니들 샤프트)을 통해 송달되고, 계내 생물 조직 또는 기관으로 삽입할 수 있는 물질로 제조된 중공 샤프트(hollow shaft)를 포함하는 생체내 조직의 일렉트로포레이션용 장치를 포함하며, 상기 샤프트는 상기 샤프트의 외부면상에 적어도 일부 노출된 적어도 2개의 전극을 추가로 포함하며, 상기 전극은 서로 공간적으로 이격되어 있으며 상기 니들 샤프트를 따라 서로에 대해 평행하게 위치한다. 전극용 실시는 가변성 전극 구조 디자인을 사용할 수 있다. 예를들면, 애노드 및 캐소드 전극은 도 1 및 도 3에 기술된 바와 같은 송달 니들의 길이를 따라 서로 평행한 송달 니들과 조합하여 놓을 수 있거나, 또는 도 2 및 도 4에 기술된 바와 같이 니들 샤프트 주위에 나선형으로 서로 평행한 송달 니들과 조합하여 놓는다. 또한, 본 발명의 장치는 전기 에너지 공급원에 상기 전극들 각각을 연결하는 전기 도관을 포함하며, 상기 니들이 환자의 조직으로 삽입되는 경우 전극은 개별적으로 가압될 수 있으며 상기 니들 주위의 치료 영역내 세포에 전기장을 발생시켜서 상기 니들을 상기 조직으로 삽입함으로써 만들어진 트랙 근처 또는 트랙을 따라 세포가 가역적으로 포레이션되어 치료 분자를 상기 세포로 도입할 수 있다.

유체 송달 니들을 포함하는 상기 전극의 제조는 MEM 기술에서와 같이 통상 이해될 수 있는 마이크로매칭을 포함하는 공지된 방법에 의해서 실시될 수 있다. 예를들면, 표준 피하 니들(20 게이지, 21 게이지, 22 게이지, 23 게이지, 24 게이지, 25 게이지, 26 게이지, 27 게이지, 28 게이지 및 29 게이지와 같은 게이지 일 수 있음)이 전기적 비활성 물질로 코팅한 후 금과 같은 전기전도성 물질로 접착하여 니들의 표면에 목적하는 배향으로 전도성 물질을 부식시킬 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 비활성 물질, 예를들면 파릴렌(parylene)과 같이 표면에 균질하게 부착되는 성질을 갖는 폴리머의 접착을 위한 제조에서 피하 니들 샤프트를 세정한다. 상기 금속 샤프트 파릴렌의 스트립핑(stripping) 이후에, 가령 증착에 의해서 니들상에 접착된다. 상기는 전극 도전성 물질, 가령 금을 접착하기위해서 레이저를 사용하여 패턴된 후, 금을 선택적으로 제거하여 니들 샤프트상에 지정된 패턴에서 전극을 형성한다. 본 발명에서, MEM 기술의 사용으로 축소 규모로 3차원 니들을 조작 및 코팅 및 부식할 수 있다. 싱글 니들 전극을 제조함으로써 도 13A 내지 도 13E의 사진에 의해서 입증되었다. 제조는 또한 압출 기술에 의해서 실시될 수 있다. 도 14A-14C에서 도시된 바와 같이, 상기 측면에서 전극(202) 및 전극(203) (도 14A)은 직쇄형같이 폴리비닐클로린 등과 같은 전기적 비활성 물질을 갖는 미세 와이어 필라멘트(fine wire filaments)와 같이 압출된다. 니들(204)의 팁이 규격화될 수 있거나 또는 팁을 침투하기위해서 절단하여 다른 쪽에는 전극 리드(201a 및 201b)을 포함하는 허브(200) 및 유체 매질의 공급원에 부착하기위한 피팅(205)을 포함한다. 도 14B는 나선형 전극 및 전극 리드(210 및 211)을 갖는 압출 니들을 포함하는 구조적 실시양태의 예를 도시하였다.

제2 실시양태에서, 본 발명은 상기 세포를 포함하는 환자의 조직에 제공하는 단계를 포함하는 생체내 세포로 분자를 송달하는 방법을 포함하며, 상기 주사침들은 상기 분자를 포함하는 적어도 1개의 저장소 및 니들 샤프트를 따라 배치된 적어도 2개의 긴 전극(예를 들면, 캐소드 및 애노드)를 추가로 포함하며, 상기 저장소 및 분자는 니들 샤프트를 통해 흐르는 루멘(lumen)과 유체로 전달되며, 상기 분자를 상기 조직으로 주입하여 전기 에너지로 전극을 가압하여 전기 펄스를 제공하여 주입 부위 및 니들 트랙의 주변의 세포가 가역적으로 포레이트됨으로써 상기 분자를 섭취할 수 있도록 세포를 일렉트로포레이팅하는 단계를 포함한다.

제3 실시양태에서, 상기 장치는 협의적으로 정의된 위치에서 세포의 일렉트로포레이션을 제공하며, 특히 주사침에 의해서 만들어진 트랙을 따라 또는 트랙 근처의 세포의 일렉트로포레이션을 제공한다. 통상, 치료 부위안에서 고려된 세포는 약 5 mm, 전형적으로는 약 3 mm, 특히 약 2 mm, 가장 바람직하게는 약 1 mm의 니들 트랙 주위의 반경에 놓여있는 세포이다. 관련 실시양태에서, 상기 치료 부위내 세포의 일렉트로포레이션할 수 있는 전기장의 발생은 치료 부위가 전극으로부터 일정 거리를 벗어난 조직까지 확장하기위해서 펄스 에너지의 무역량으로 한정될 수 있는 중심 주사침으로부터 외부방향으로 약해지는 전기장이다.

추가의 관련 실시양태에서, 본 발명은 조직내 높게 배치된 세포 세트의 계내 일렉트로포레이션을 실시하기위한 단일의 긴 프로브(주사침 및 전극을 포함함)의 사용을 요구한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명의 장치는 다양한 전기 펄스 조건을 사용할 수 있다. 예를들면, 전극은 1-400 mAmps, 전형적으로 5-200 mAmps, 더 바람직하게는 20-100 mAmps 범위로 일정 전류의 적어도 하나의 펄스로 충전될 수 있다. 또다른 실시예에서, 전극은 1-100 볼트 범위로 전압 펄스로 충전될 수 있다. 또한, 전기 펄스는 단극 또는 양극 펄스일 수 있으며, 상기 펄스는 다양한 특성, 가령, 설정 전압 강하(set voltage drop), 가변 형상 펄스 트레인(variable shaped pulse trains) 또는 일정 전류를 사용하는 펄스를 갖는 1개, 2개 또는 다수의 펄스 시퀀스일 수 있다.

다른 실시양태에서, 상기 장치 및 방법은 약학적 약물, 단백질, 핵산(DNA 및 RNA를 포함함) 및 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 공지된 이의 합성 개질물을 환자의 조직, 특히 피하, 내피 및 피하 공간에 존재하는 세포 뿐만 아니라 포유류의 골격근 및 가로무늬근 부위, 및 기관(심장, 폐, 췌장, 비장, 간 및 소화관의 기관을 포함함)으로 송달 또는 트랜스펙팅(transfecting)하기위해서 제공된다. 선 택된 물질로 트랜스펙팅할 때, 세포는 약물, 또는 단백질 또는 핵산의 활성에 의해서 직접 영향을 줄 것이다. 핵산이 트랜스펙팅되는 경우, 전형적으로 핵산은 코딩된 단백질을 사용하여 치료 부위의 세포에서 발현될 수 있다. 또한, 물질은 사이토킨, 케모킨, 및 면역 관련 생활성 분자를 포함할 수 있으며, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, LIF, LT, TGF-β, IFN, TNF-α, BCGF, CD2 또는 ICAM으로 구성된 그룹으로부터 선택된 면역 조절 분자로서 활성 분자를 포함한다.

또다른 실시양태에서, 세포로 송달될 물질은 0.01 ml 내지 1 ml 사이의 부피로 액체 형태로 송달될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 0.9% 염화나트륨(NaCl)내 용해될 수 있다. 그러나 정확한 용매는 본 발명에서 중요하지 않다. 예를들면 다른 용매, 가령 수크로스는 골격근에서 핵산 섭취를 증가시킬 수 있다는 것은 잘 공지되어 있다. 관련 실시양태에서, 송달될 부피는 니들 길이에 대해서 조절될 수 있으며(니들 샤프트의 길이는 운송되는 물질의 부피를 측정할 것임), 니들을 통해 발현되고 조직 주변에 니들 트랙으로 충전될 상기 물질에 대해서 이용할 수 있는 공간의 부피를 측정하기위해서 니들 트랙을 만든다. 예를들면, 2 mm 길이의 니들은 피부 층 조직에 물질을 송달하기위해서 사용될 수 있으며 0.01 ml 내지 0.05 ml 범위의 부피로 주입하며, 5 mm 길이의 니들은 0.1 ml 내지 0.15 ml 범위의 부피를 송달하기위해서 사용될 수 있으며, 1.5 내지 2 cm 길이의 니들은 0.3 ml 내지 0.5 ml 범위의 부피를 송달하기위해서 사용될 수 있다.

다른 물질이 또한 다양한 유익한 이유로 목적하는 분자로 함께 트랜스펙팅 될 수 있다. 예를들면, 전기투과막(electropermeabilized membranes)을 밀봉하는 것으로 공지되어 있는 분자 P199 (lee, et al. PNAS., 4524-8, 10, 89 (1992))는 트랜스펙팅된 근섬유의 생존율을 증가시킴으로써 트랜스펙션 효율에 유익한 영향을 줄 수 있다.

도 6에 참고하여, 피하 니들을 운반하는 전극을 목적하는 침투 깊이로 환자 조직에 삽입한다. 부착된 주입기의 플런저(plunger)가 활성화되어 주입용의 선택된 물질을 포함하는 액체의 부피를 주입하고 상기 전극은 물질의 주입 직후, 또는 선택적으로 주입과 동시에 적어도 하나의 전기 에너지 펄스를 가압하여 치료 영역내 적어도 일부의 세포가 가역적으로 포레이션된다. 주입기 플런저가 살아있는 수단, 가령 손을 사용하여 활성화될지라도, 주입기는 도 9에 기술된 바와 같이 고정 장치(holding device)에 고정될 수 있거나 또는 자동 분배 장치, 가령 미국 특허 출원 제10/612,304호(2003년 7월 3일자 출원)에 기술된 장치에 고정될 수 있으며, 상기는 참고문으로 그의 전문이 본원에 통합된다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 체조직의 표면으로부터 다양한 깊이로 세포의 일렉트로포레이션에 적용될 수 있다. 예를들면, 하나의 실시양태에서 조직의 표면으로부터 대략 90도로 배향된 조직으로 물질을 주입함으로써 물질의 송달이 개시되는 근조직 구획내 존재하는 세포의 일렉트로포레이션 뿐만 아니라, 본 발명의 장치는 피부의 피하, 내피 또는 피하 공간내 세포를 일렉트로포레이션하기위해서 사용될 수 있다. 또한, 심장 및 혈관 조직과 같은 다른 기관내 림프절 또는 조직 층으로 물질을 일렉트로포레이션하기위해서 사용될 수 있다. 상기 위치에서 세포를 일 렉트로포레이션하기위해서, 상기 조직 층내 세포를 일렉트로포레이션하기위한 장치의 사용은 조직 표면에 대해 대략 90도에서 주입 및 일렉트로포레이션하기위한 조직 층(예컨대, 피부, 피하 등)의 외부 부분을 침투하기에 충분한 길이를 갖는 짧은 니들을 사용하는 것을 포함하거나, 또는 송달 니들은 상대적으로 가령 3-4 cm로 길며, 싱글 니들의 삽입으로 도 9A에 도시된 바와 같이 고정 장치를 사용하여 표면 조직에 대한 예각으로 만들어질 수 있다. 상기는 목적하는 층안에서 조직의 커다란 부분의 일렉트로포레이션이 될 것이다. 또한, 삽입 예각은 조직 표면으로부터 각이 3-25도 사이일 수 있다. 상기 조직 표면은 싱글 니들/전극의 삽입을 위한 부위를 포함하는 평면을 형성하는 평면 표면적을 형성하는 것이 기술되어 있다. 도 9A 내지 9D에 도시된 바와 같이, 주입기는 평면 가이드 트레이(100)상에 설정 각에서 주입기를 고정하도록 고안된 부착 수단에 연결될 수 있으며, 조직으로 지정된 목적하는 니들의 삽입 깊이에 기초하여 측정하여 상기 니들은 조직으로 설정 거리(X)에 놓인다. 노출된 니들을 갖는 가이드 트레이는 처방된 예각에서 니들이 조직으로 삽입될 수 있도록 조직 표면과 접촉시킨다. 니들이 삽입되고 주입기로부터 치료 물질이 방출된 이후에, 전극은 가압되어 주입된 물질을 피하, 내피 또는 피하 세포로 송달한다. 상술된 바와 같은 빗각에서 장치를 사용함으로써 다양한 유기 조직층을 일렉트로포레이션시키기위해 적용할 수 있다.

실시예

하기 실시예는 본 발명이 만들어지는 다양한 실시양태를 설명하기위해서 제공된다. 하기의 실시예는 본 발명에 따라 제조될 수 있는 많은 형태의 실시양태를 포함하는 것으로 이해된다.

실시예 I

본 발명의 다양한 측면으로 전환하여, 상기 장치는 예를들면 도 5에 개시된 바와 같이 분자 송달 저장소(20) 및 전극 니들(10) 성분을 포함할 수 있다. 부가의 실시양태는 샤프 커버(11), 저장소를 충전하는데 사용될 수 있는 저장소(20)를 포함하는 구조의 일부를 밀봉하는 탄성 막(12)(가령, 주사침의 피어싱에 의함) 및 개방/수축(도 5C) 또는 폐쇄/피복(도 5A 및 도 5B)의 반고정된 위치에서 샤프 커버(11)를 유지하기위한 구조를 갖춘 저장소(20)내 오목부(13) 및 오목부(14 및 14*)와 같은 기구(mechanism)를 포함한다. 추가의 실시양태는 반고정된 개방/수축 또는 폐쇄/구제 위치, 가령 예를들면 오목부(15) 및 오목부(16 및 16*)에서 플런저(9)를 유지하기위한 기구를 포함한다. 당분야의 통상의 지식을 가진 사람은 샤프 커버(11) 및 플런저(9)의 반고정 위치를 제공하기위해 사용되는 방법에 상관없이, 상기 위치는 살아있는 에너지, 가령 손에 의한 힘, 또는 기계적으로 전기적으로 구동된 액추에이터에 의해서 용이하게 변경될 수 있다. 상기 샤프 커버(11)의 말단 부분은 멸균된 커버(60)에 제거가능하게 부착되는 것을 포함할 수 있다. 전극 니들(10)은 추가적으로 팁(22)이 피어싱된 조직내 말단을 통해서 흐르는 루멘 및 저장소(20)에 연결되는 구멍(25)을 포함할 수 있다(도 1 참조). 주사침(10)은 18-29 게이지의 표준 피하 니들 게이지 크기를 가질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 송달 니들은 적어도 하나의 전극쌍, 가령 도 1의 전극 (21a 및 21b)을 포함한다. 상기 전극은 전극 리드(24a 및 24b)와 전기적으로 통신되는 적어도 하나의 애노드 및 하나의 캐소드 전극을 포함한다. 특정 본 발명의 생성물에 대해서 선택된 디자인에 따라, 상기 리드는 리드 말단(23)에서 종결될 수 있으며(예를들면 도 3 및 도 4 참조), 또는 전극으로부터 전기 에너지 공급원, 가령 펄스 발생기로 전체적으로 흐르는 리드 와이어를 갖춘 다른 수단에 의해서 연결된다. 니들 성분(10)은 추가로 피하 주입 저장소에 연결하기위하 연결기(26)를 포함하며(도 3 및 도 4), 또는 피하 주입 포트로 니들 성분(10)을 탈착가능하게 조이는 록킹 기구(locking mechanism)로 고정된 주입 저장소에 부착되는 연결기(26)를 추가로 포함한다.

부가의 실시양태에서, 저장소(20)는 특정 질환을 치료하기위한 지정된 물질로 제조될 수 있다. 선택적으로, 저장소는 플런저(9)를 수축함으로써 전극 니들(10)을 통해 저장소로 상기 물질을 드로잉함으로써 관심있는 물질을 채우거나 또는 바람직하게는 상기 저장소는 개방 위치로 플런지를 수축시킴으로써 플런지를 먼저 세정한 후, 멸균 바이알로부터 약물을 주입기로 방출하고 이를 다른 저장소로 도입하는 통상적인 실시 방법과 유사하게 탄성 실(12)을 통해 저장소로 이를 주입함으로써 물질을 저장소로 송달한다.

상기 전극 배열을 갖는 송달 니들(10)(가령 도 1-4에서 각각 전극 21a 및 21b, 전극 31a 및 31b, 전극 51a 및 51b 및 전극 52a 및 52b, 또는 전극 41 및 42)은 조직 표면에 대해서 대략 90도 또는 선택적으로 조직 표면에 대해 예각으로 조직으로 삽입되며, 상기 물질은 니들 트랙 및 국부 조직으로 주입된다. 상기 전극은 펄스 발생기를 사용하여 가압된 이후에 상기 물질을 주입하거나, 또는 상기 물 질의 주입과 동시에 가압될 수 있다. 도 6에 도시된 바와 같이, 전기 펄스가 가압되는 경우, 전극은 전기장(20)의 발생을 지지하여 상기 전기장내 세포의 가역적 포레이션을 일으키기에 충분한 에너지를 제공한다. 발생된 전기장은 니들 트랙(80)으로부터 거리에 의해서 지수적으로 감소된다는 점에서 균일하지 않다(도 7). 그러므로, 상기 포레이션을 제공하기에 충분한 전기장은 사용된 에너지에 따라 니들 트랙 길이에 대해서 한정된 3차원 부피를 형성할 수 있는 일렉트로포레이션된 전기장의 설정된 직경을 형성하는 대칭 측면 치수(a)×(b)를 갖는다(도 7에 개시됨). 통상, 포레이션이 충분한 전기장은 0-5 mm, 전형적으로 0-4 mm, 바람직하게는 0-3 mm, 가장 바람직하게는 0-2 mm의 전극 니들(10)로부터의 반경을 갖는다.

일렉트로포레이션 분야에 기술을 가지고 있는 사람에게 용이하게 이해될 수 있는 바와 같이, 종래의 일렉트로포레이션 장치와는 달리 본 발명의 싱글 니들 전극에 의해서 발생된 전기장은 비균일한 전기장이며, 전기장 강도는 니들 주변에서 더 크며, 전극으로부터 외부 방향으로 측정하여 감소된다. 본 전극 배열과 대조적으로, 도 8은 종래의 전극 배열을 나타내며, 균일한 전기장은 대량의 치료 부위를 통해서 사용된다. 본 발명은 "균일한" 전기장을 사용의 필요성을 제시하는 이전의 개념과는 크게 구별된다. 여기서, 본 발명은 비균일한 전기장을 사용하며, 송달 니들의 위치 근처, 예를들면 니들 트랙에 대량으로 세포의 가역적 포레이션을 제공한다. 상기는 공지된 치료 물질의 투여량을 수납하는 세포의 정확한 위치를 측정하기위해서 유익하다. 그러므로, 상기 실시양태를 통한 본 발명은 세포로 상기 물질을 더욱 불균일하게 분배하고 전극의 외부 배열과 종래의 균일한 전기장을 사용 하는 일렉트로포레이션 시스템을 허용하는 가변성 분포에 반대되는 국부 조직에 한정된다.

전극에 있어서, 상기는 금속, 바람직하게는 일렉트로포레이션된 조직의 세포에 금속 이온에 의한 독성을 부여하지 않는 금속을 포함할 수 있다. 상기 물질은 금, 텅스텐, 티타늄 니트라이드, 백금, 백금 이리듐, 및 이리듐 옥사이드를 포함한다. 전극 물질은 도 3B에 제시된 바와 같이 전극과 송달 튜브 사이에 절연 층이 있도록 송달 튜브(예컨대, 주사침)상에서 형성될 수 있다. 선택적으로, 상기 니들은 주입 튜브로부터 전극을 절연시키는데 요구되는 것을 제거한 비전도성인 물질을 포함할 수 있다. 상기 측면에서, 송달 튜브는 세라믹 또는 경질 생호환성 플라스틱을 포함하는 비전도성인 계내 조직으로 삽입하기에 적당한 물질(폴리비닐클로린 등을 포함함)로부터 제조될 수 있다.

부가적 실시양태에서, 송달 니들/전극 성분은 전극(90 또는 101)(도 10)이 도 9A, 및 도 1OA 및 10B에 도시된 바와 같은 니들 팁 근처에서만 일렉트로포레이션을 위해 노출된다. 상기 전극의 비노출된 부분(91 및 102)은 절연될 수 있으며 니들의 외부 또는 내부에 송달 니들을 따라서 움직인다. 특이적으로, 특정 조직에서 정의된 치료 부피의 위치를 잡는 것이 바람직하며(전극 배열에 의해서 조직에 부여되는 일렉트로포레이션 전기장의 치수에 의해서 정의됨), 도 10에 기술된 바와 같이 다른 조직, 전극의 일렉트로포레이션을 회피하는 것이 예를들면 조직 표면(가령 지방 세포 층)에 가깝게 놓인 다른 조직을 회피하면서 깊은 근육 조직을 일렉트로포레이션하는데 사용될 수 있거나 또는 도 9A에 제시된 바와 같이 피하 조직과 같은 표면 근처에 조직을 선택적으로 일렉트로포레이션하는데 사용될 수 있다. 상기 실시양태는 치료 부피의 위치 및 크기에 대해서 부가적 조절을 제공한다.

실시예 II

본 실시예에서, 본 발명의 싱글 피하 니들 전극을 조직으로 삽입함으로써 형성된 트랙을 따라서 위치한 세포에 가역적 포레이션에 의해서 분자를 송달하는 것에 대한 결과를 기술하고 있다.

도 11A 및 11B에 개시된 바와 같이, 토끼 사두근(rabbit quadriceps muscle)에 0.2 ml 및 1 mg/ml의 농도를 포함하는 환약내 베타-갈락토시다제를 코딩하는 DNA를 주입한다. 상기 전극은 250 mAmps의 2번의 펄스, 20 밀리초 기간을 사용하여 펄스된다. 일렉트로포레이션 이후에, 베타-갈라토시다제 유전자는 일렉트로포레이션에 의해 영향을 받은 세포에서 발현된다. 일렉트로포레이션 4일 후에, 토끼를 희생시키고, 싱글 니들/전극의 삽입시 부위를 통해 3 mm 두께의 슬라이스로 근육을 제조한다. 화학적 고정(chemical fixation) 이후에, 근육 슬라이스내 베타 갈락토시다제 발현 세포는 효소 반응에 의해서 가시화된다. 도 11A에서 화살표는 송달 튜브를 토끼 근육으로 삽입하는 방향을 나타낸다. 개시된 바와 같이, 니들 송달 전극의 조직으로 삽입함으로써 형성된 트랙을 따라 우선적으로 스테이닝(staining)이 실시된다.

실시예 III

본 실시예는 토끼 사두근으로 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 DNA를 송달하기위해서 본 발명의 실시양태에 따른 일렉트로포레이션용 장치를 사용하는 실험 을 기술하고 있으며, 결과는 도 12에 개시되어 있다.

여기서, 수마리의 뉴질랜드 백색 수컷 토끼 각각은 4-5 kg(Perry Scientific, San Diego, California)의 중량을 가지며, 각각은 갈색 GFP를 코딩하는 발현 벡터(gWizGFP, lot 12311, purchased from Aldevron, LLC, Fargo, ND; see also Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, CA)를 주입하며(Cheng, et al. (1996), Nature biotechnology, vol. 14:606-9), 상기는 변형된 사람의 사이토메칼로바이러스 직후 프로모터/인헨서(modified human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)의 제어하에 발현된다.

주입 이전에, 각 토끼는 먼저 아세프로마진(l mg/kg)으로 진정시킨 후 글리코피롤레이트(0.01 mg/kg)의 존재하에 케타민(35 mg/kg) 및 크실라진(5 mg/kg)의 혼합물을 근육내 주사함으로써 마취하고, 케타민/크실라진 처리의 결과로서 불규칙한 심장 박동을 방지하기위해서 이전에 피하에 주사되어야 한다. 그후 상기 토끼는 사두근으로 주입될 부위를 제모한다. 먼저 18 게이지 니들을 삽입함으로써 근육을 덮고 있는 피부에 구멍을 뚫은 후, 외과용 메스를 사용하여 약간 넓힌다. 니들의 외부면에 대해서 서로 마주보게 도입된 2개의 평행한 전극을 갖는 18 게이지 니들로부터 만들어지는 싱글 니들 일렉트로포레이션 장치(도 1에 도시됨)는 그후 근육 조직으로 천천히 삽입하고 대략 25 mm 의 최종 삽입 깊이로 매 수 밀리미터의 DNA를 주기적으로 주입한다. 전체 500 ul의 DNA-함유 용액(100 ug의 gWizGFP를 함유)을 각 주입 부위로 주입한다. 주입을 완료한 직후 및 니들/전극 장치가 최종 삽입 깊이로 삽입함으로써, 일렉트로포레이션이 실시된다.

특히, 5개의 250 mA 펄스, 각각의 20 밀리초(ms) 기간이 Elgen 1000 (Inovio AS, Oslo, Norway) 전류-클램프된 펄스를 사용하여 10 Hz 간격(예컨대, 100 ms)에서 일렉트로포레이션 니들 장치에 적용된다.

처치 4일 후에, 동물은 인간적으로 안락사시킨다. 벡터가 송달될 다리의 부분을 커버하는 피부는 조심스럽게 제거한 후에, 각 동물은 약 1시간동안 -20 ℃에 둔다. 그 후 처치된 근육은 외과용 메스를 사용하여 제거된 후 또다른 1-2 시간동안 -20 ℃에 둔다. 그후 동결된 근육 조직은 회전 미트 슬라이서(rotating meat slicer)를 사용하여 대략 3 mm 두께로 슬라이스한다. 플라스틱 트레이에 배치된 근육 슬라이스는 UV 광 및 GFP 필터 조합이 구비된 Leica MZ 12 해부 현미경을 사용하여 GFP 발현이 조사된다. 도 12는 상기 분석으로 수득된 결과의 대표적 사진이며, 본 발명에 따른 일렉트로포레이션 장치는 성공적으로 제제를 송달하는데 사용될 수 있으며, 예를들면 목적하는 단백질을 코딩하는 발현 벡터는 활성 형태로 세포로 발현된다.

실시예 IV

본 실시예에서, 본 발명의 전극 배치, SEAP를 코딩하는 플라스미드(pSEAP#3348, Aldevron) 및 IgG(pLNOH 2hg3 #11765, Aldevron)을 사용하여 도 15 및 도 16에 개시된 데이터는 시험 동물 조직의 세포(예컨대, 동물의 전경골근으로 근육내 주입)로 일렉트로포레이션되며, 발현은 "약한(weak)" 및 "강한(strong)" 항원(각각 SEAP 및 IgG)에 대항하는 면역 반응을 측정할 뿐만 아니라 토끼 근육에서 발현의 성공을 입증하기위해서 모니터한다. 상기 실험에서, SEAP 및 IgG 플라스미 드는 최종 농도 1 ug/ul로 투여된다.

사용된 동물은 3.5-4.5 kg의 뉴질랜드 백색 수컷 토끼이다. 일렉트로포레이션은 Elgen 1000(Inovio AS, Oslo, Norway Serial number 009)을 사용하여 실시되며, 추가적으로 전류-클램프된 펄스 발생기(프로토타입) 및 싱글 니들 프로토타입을 포함하며, 전극은 주입 트랙에 대해서 평행하며, 대략 1 mm 떨어져 있다. 전극은 각 펄스들 사이에 250 밀리초 간격으로 150 mA에서 5번 펄스되며 20밀리초 펄스 길이로 펄스된다(예컨대, 약 4 Hz의 주파수). 상기 전극은 약 1.0 cm 깊이까지 조직으로 확장된다.

각 실험은 2단계 송달 방법, 예를 들면 상이한 깊이에서 DNA를 분배하기위해 니들의 삽입 중에 주입에 의한 29 게이지 인슐린 주입기를 사용하여 플라스미드 용액(200 ul)의 주입, 이후에 주입기 니들의 제거 및 싱글 니들 전극의 삽입에 의한 단계를 포함한다.

하기 표 I에 개시된 바와 같이, 각각의 IgG 및 SEAP 실험은 2개 그룹의 시험 동물, 예를 들면 한세트는 일렉트로포레이션을 받은 동물이고 다른 세트는 일렉트로포레이션을 받지 않은 동물(대조군)을 이다.

그룹 번호	전류	처치
1	150-250 mA	100 ul x 2 SEAP 1 mg/ml, 100 ul x 2 좌경골근, IgG 1 mg/ml 100 ul x 2 우경골근
2	일렉트로포레이션하지 않음	100 ul x 2 SEAP lmg/ml, 100 ul x 2 좌경골근, IgG 1 mg/ml 100 ul x 2 우경골근

시료는 0일, 14일 및 21일에 취한다. 그후 토끼는 21일에 0.5 ml 히프노름(Hypnorm 0.1 ml/kg)을 피하 주사하고 귀 혈관에 1 ml/kg의 10% 펜토르바르비탈(Pentorbarbital)을 주입함으로써 희생된다.

도 15 및 도 16의 결과로부터 명백한 바와 같이, 싱글 니들 송달로부터 나타낸 항체 역가의 수준은 과량의 네가티브 대조군이다. 특히, 2개의 시험 항원(IgG 및 SEAP)은 다른 것에 대한 역가를 설명하며, IgG는 더 강한 항원 SEAP를 나타낼 것으로 기대된다(역가 스케일 참조). 2개의 항원은 일렉트로포레이션된 시료에서 항체 제조를 나타내며 실질적으로 일렉트로포레이션되지 않은 시료에서는 항체가 제조되지 않았다.

실시예 V

본 실험에서, 싱글 니들 전극으로 제조된 프로토타입 MEM은 다양한 펄스 에너지 및 녹색 형광 단백질 발현을 사용하여 토끼 조직에서 시험된다. 표 II에 개시된 바와 같이, 3개의 상이한 전극 실시양태가 시험되며, (1) 애노드 및 캐소드 전극이 각 니들의 둘레의 1/16에서 23 게이지 니들에 적용하고 MEM 기술에 의해서 니들의 전체 길이에 적용되는 싱글 니들 전극(도 13D-13E), (2) 전극은 각각의 니들 샤프트의 둘레 1/4인 싱글 니들 전극(도 13A-13C), 및 (3) 유체 매질 송달 튜브를 갖지 않으며 전극이 1 mm 떨어져 있는 싱글 니들 배열. 표 II에 개시된 바와 같이, 펄스의 다양한 조합이 실시된다.

본 실험에서 각 동물에 사용된 프로토콜은 언급된 농도에서 GFP 플라스미드를 주입하는 단계, 싱글 니들 전극의 실시를 사용하여 조직을 일렉트로포레이션하는 단계, 동물을 희생시키고 인접 조직에서 처리된 근육을 슬라이스하고 형광을 관찰하는 조직 제제를 실시하는 단계를 포함한다. 통상, 주입 트랙과 평행하게 슬라이스를 수축하기위해서 조직을 슬라이싱하는데 어려움에 의해서, 도면 사진에서 GFP 형광은 동그라미 또는 타원으로 표시한다. 상기 형광 패턴은 싱글 니들 개념이 기능적으로 입증되었으며, 조직내 니들 트랙 주위에 한정된 위치에서 매우 낮은 전압 및 상대 전류로 조직의 일렉트로포레이션을 제공한다.

전극 디자인	조직 부위	일정 전류	전압(평균 V)	펄스 수	pGFP DNA 농도/부피
샤프트 둘레 1/4 전극	사두근	0.0	0.0	0.0	0.2 mg/ml
샤프트 둘레 1/16 전극	사두근	50 mA	8	2	0.2 mg/ml
샤프트 둘레 1/16 전극	사두근	100 mA	18	2	0.2 mg/ml
샤프트 둘레 1/4 전극	사두근	50 mA	11	2	0.2 mg/ml
	사두근	100 mA	15	2	0.2 mg/ml
	사두근	150 mA	20	2	0.2 mg/ml
	사두근	250 mA	33	2	0.2 mg/ml
유체 송달 실시 없이 1mm 이격된 전극	경골근	75 mA	13	2	1.0 mg/ml
	경골근	150 mA	18	2	1.0 mg/ml
	경골근	250 mA	28	2	1.0 mg/ml
	사두근	150-200	20	2	1.0 mg/ml
	사두근	250-500	40	2	1.0 mg/ml
	사두근	600-1000 mA	50	2	1.0 mg/ml

도 17A 및 17B는 각각 천연 광 및 형광을 나타내며, GFP 발현, 이후 일렉트로포레이션되지 않은 GFP를 코딩하는 플라스미드 DNA를 주입한 사진을 나타낸다. 상기에서 기술한 바와 같이, 녹색 형광 단백질 발현은 나타나지 않는다. 그러므로 일렉트로포레이션되지 않은 것은 충분한 섭취 및 목적하는 유전자의 발현이 없는 것이 분명하다.

1/16 너비의 전극 모델을 사용하는 계내 일렉트로포레이션에 대해서, 일렉트로포레이션된 GFP에 대한 역량은 도 18A, 18B, 19A 및 19B에 개시되어 있다. 도 18A 및 18B는 일정 전류 50 mA로 일렉트로포레이션될 때 GFP 발현 결과를 나타내며, 도 19A 및 19B는 100 mA에서 일렉트로포레이션을 보여준다.

1/4 둘레 싱글 니들 전극을 사용하는 GFP 발현에 있어서, 결과는 도 2OA 및 20B, 21A 및 21B, 22A 및 22B에 제공하며, 일렉트로포레이션은 각각 50, 100 및 150 mA를 사용하여 실시된다.

GFP 발현은 또한 싱글 니들 전극이 전극과 조합된 유체 송달 튜브를 포함하지 않은 실시양태를 사용하여 시험된다. 도 23A 및 23B, 24A 및 24B, 및 25A 및 25B에 개시된 바와 같이, 본 발명의 장치의 실시양태는 일정 전류 각각 75, 150 및 250 mA에서 시험된다. 여기서, GFP 플라스미드의 양은 도 19-22에 개시된 실험 농도의 5배이다. 결과적으로 치료 영역은 더 용이하게 나타났다.

여기서 개시하고 청구하는 모든 조성물 및 방법은 본 상세한 설명으로 미루어 보아 과도한 실험없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시양태에 의해서 기재하는 반면에, 당업에 통상의 지식을 가진 자들에게는 본 발명의 정신 및 범주에서 멀어지지 않고 여기에 기재된 조성물 및 방법 및 방법의 단계 또는 순서에 변화를 줄 수 있을 것이다. 보다 특히 기재된 실시양태는 단지 실례를 들어 나타냈으며 이에 제한하지 않는다. 당업에 통상의 지식을 가진 자들에게 명백한 모든 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구 범위에 의해 규정한 본 발명의 정신 및 범주 내에 있는 것으로 간주한다.

상세한 설명에서 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 본 발명과 관련된 당업에 통상의 지식 수준을 나타낸다. 또 다른 이점 또는 우선권을 주장한 것을 포함해서 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 개개 공보가 특이적으로 및 개별적으로 참고문헌에 혼입한 것으로 나타나는 경우 동일한 내용에 참고문헌을 여기에 혼입한다.

여기에 예증으로 기재된 본 발명은 여기에 특이적으로 기재되지 않은 구성 요소(들)의 부재하에 실행될 수 있다. 따라서 예를 들어 "포함하는(comprising)", "본질적으로 구성하는(consisting essentially)" 및 "구성하는(consisting of)"이라는 용어 각각은 다른 두개의 용어와 대체할 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 설명을 위해 사용하였으며, 상기 용어 및 표현의 사용은 이에 제한하지는 않고, 전체 또는 이의 부분으로 기재되거나 나타낸 특성의 균등물을 제외하는 것을 암시하지는 않지만 다양한 변형이 청구하는 본 발명의 범주 내에서 가능하다. 따라서 본 발명이 바람직한 실시양태에 의해 특이적으로 개시되었는데도 불구하고, 여기에 기재된 선택적 특성, 변형 및 개념의 다양성은 당업에 통상의 지식을 가진 자들에게 알려져 있을 수 있으며, 상기 변형 및 다양성은 첨부된 청구범위에 의해 규정된 본 발명의 범주내에 있는 것으로 간주한다.

Claims

치료 물질을 조직 세포로 송달하기 위한 생체내 조직의 일렉트로포레이션(electroporation)용 장치로서,

(a) 긴 송달 튜브의 외부면에 접해 있는 2개 이상의 긴 전극들(elongate electrodes)을 포함하고 체조직(body tissue)을 침투할 수 있는 긴 송달 튜브(상기 전극들은 서로 공간적으로 이격되어 있고 전기적으로 분리되어 있으며 서로에 대해서 평행하게 위치함); 및

(b) 상기 각각의 전극을 전기 에너지 공급원에 연결할 수 있는 전기 도관을 포함하며,

(c) 상기 튜브가 환자의 조직으로 삽입되고 상기 에너지 공급원에 의한 가압으로, 상기 전극이 튜브를 둘러싼 치료 영역의 세포에 전기장을 발생시키고, 이는 튜브의 상기 조직에의 삽입에 의해 생긴 트랙 주위의 세포가 가역적으로 포레이션되도록 하여 상기 세포가 상기 치료 물질을 받아들이게 되는 것을 특징으로 하는 생체내 조직의 일렉트로포레이션용 장치.
제 1 항에 있어서,

확장가능하고 또는 수축가능한 저장소(reservoir)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체내 조직의 일렉트로포레이션용 장치.
제 2 항에 있어서,

상기 저장소는 주입기(syringe)를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체내 조직의 일렉트로포레이션용 장치.
제 3 항에 있어서,

상기 저장소는 0.0 내지 0.5 ml, 0.0 내지 1 ml, 0.0 내지 3 ml 및 0.0 내지 5 ml로 구성된 그룹으로부터 선택된 가변 부피 용량(variable volume capacity)을 갖는 것을 특징으로 하는 생체내 조직의 일렉트로포레이션용 장치.
제 1 항에 있어서,

상기 전기 에너지 공급원은 일렉트로포레이션 펄스 발생기인 것을 특징으로 하는 생체내 조직의 일렉트로포레이션용 장치.
제 6 항에 있어서,

상기 발생기는 전기 펄스를 발생시킬 수 있고 평균 전압은 1 내지 200 V 범위인 것을 특징으로 하는 생체내 조직의 일렉트로포레이션용 장치.
제 5 항에 있어서,

상기 발생기는 1 mAmp 내지 400 mAmp의 전류를 갖는 전기 펄스를 발생시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 생체내 조직의 일렉트로포레이션용 장치.
제 8 항에 있어서,

상기 전류는 10 내지 40, 25 내지 100, 50 내지 150, 125 내지 200, 175 내지 250, 225 내지 300, 250 내지 300, 및 300 내지 400으로 구성된 그룹으로부터 선택된 범위내에 있는 것을 특징으로 하는 생체내 조직의 일렉트로포레이션용 장치.
제 6 항에 있어서,

상기 발생기는 1 내지 10,000 Hz로 구성된 그룹으로부터 선택된 주파수를 갖는 전기 펄스를 발생시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 생체내 조직의 일렉트로포레이션용 장치.
제 6 항에 있어서,

상기 발생기는 0.1 us 내지 1000 ms로 구성된 그룹으로부터 선택된 시간 길이를 갖는 전기 펄스를 발생시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 생체내 조직의 일렉트로포레이션용 장치.
제 1 항에 있어서,

상기 튜브는 20 게이지, 21 게이지, 22 게이지, 23 게이지, 24 게이지, 25 게이지, 26 게이지, 27 게이지, 28 게이지 및 29 게이지로 구성된 그룹으로부터 선 택된 주사침 게이지의 크기로 제작된 피하 니들(hypodermic needle)인 것을 특징으로 하는 생체내 조직의 일렉트로포레이션용 장치.
제 1 항에 있어서,

상기 튜브는 각 전극으로부터 전기적으로 절연된 것을 특징으로 하는 생체내 조직의 일렉트로포레이션용 장치.
제 1 항에 있어서,

상기 조직은 피부(skin), 피하 조직(subcutaneous tissue), 내피 조직(intradermal tissue), 피하 조직(subdermal tissue), 골격근(skeletal muscle), 가로무늬근(striated muscle), 평활근(smooth muscle), 기관(organs), 심장(heart), 유방(breast), 폐(lung), 췌장(pancreas), 간(liver), 비장(spleen) 및 점막(mucosa)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 체조직 타입 또는 기관을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체내 조직의 일렉트로포레이션용 장치.
조직 세포내로 치료 물질을 송달하는 장치로서,

체조직을 침투할 수 있는 2개 이상의 평행한 긴 전극을 포함하며, 상기 전극은 각각 근접 부분(proximate end) 및 말단 부분(distal end)을 갖는 연장 샤프트(elongated shaft)를 포함하고, 상기 전극은 상호 근접 부분에서 1 mm 이하의 이격 거리로 영구적으로 고정되어 있으며, 상기 장치는 상기 전극의 길이 전체에 걸 쳐서 각 전극과 접촉하는 전기적 비활성 물질로 구성된 그룹으로부터 선택된 성분들을 추가로 포함하지만, 상기 전극의 길이 전체에 걸친 상기 전극들 사이에는 전기적 비활성 물질을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 장치.
치료 유용한 조성물을 생체내 세포에 일렉트로포레이팅(electroporating)하는 방법으로서,

(a) 튜브의 적어도 일부를 따라 위치하는 2개 이상의 긴 전극들을 포함하는 상기 조성물의 주입용 튜브를 준비하는 단계;

(b) 저장소와 조성물이 상기 튜브를 통해 흐르는 루멘(lumen)과 유체로 전달되는, 상기 조성물을 포함하는 저장소를 준비하는 단계;

(c) 환자의 생체내 조직으로 상기 튜브를 삽입함으로써 환자의 지정된 치료 부위에 채널(channel)을 형성하는 단계;

(d) 상기 루멘을 통해 상기 저장소로부터 상기 채널을 포함하는 치료 부위로 상기 조성물을 주입하는 단계;

(e) 상기 각각의 전극에 전기 에너지 공급원을 제공하여 상기 치료 부위의 세포에 가역적 포레이션을 일으키는 단계; 및

(f) 전기 에너지 공급원을 활성화시켜 전기 펄스를 제공하여 상기 세포가 상기 조성물을 섭취할 수 있도록 일렉트로포레이팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서,

상기 조성물은 약물, 핵산, 항원, 발현가능한 항원을 코딩하는 핵산, 발현가능한 면역 조절 분자를 코딩하는 핵산 중 1 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서,

상기 면역 조절 분자는 사이토킨(cytokine) 또는 케모킨(chemokine)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서,

상기 면역 조절 분자는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, LIF, LT, TGF-β, IFN, TNF-α, BCGF, CD2 또는 ICAM으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서,

상기 세포는 피하 세포(subcutaneous cell), 내피 세포, 피하 세포(subdermal cell), 골격근 세포, 가로무늬근 세포, 평활근 세포, 기관 세포, 유방 조직 세포, 췌장 세포, 비장 세포, 심장 세포, 간 세포 및 점막 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 살아 있는 환자의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서,

상기 전극은 금 및 티탄 중 1 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서,

상기 치료 부위는 환자의 대퇴부, 팔 또는 몸통(torso)에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서,

상기 조성물은 0.01 ㎕, 50 ㎕, 10O ㎕, 150 ㎕, 200 ㎕, 250 ㎕, 300 ㎕, 40O ㎕ 및 500 ㎕로 구성되는 그룹으로부터 선택된 전체 부피로 주입되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서,

상기 조성물은 2 ng/ml 내지 3 mg/ml로 구성된 그룹으로부터 선택된 전체 활성 성분 농도로 주입되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서,

상기 조성물은 상기 세포를 가역적으로 포레이트(porate)하기 위해서 상기 에너지 공급원을 활성화하기 이전 또는 활성화와 동시에 주입되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 24 항에 있어서,

주입 이후에 상기 조성물은 상기 튜브의 조직에의 삽입에 의해 형성된 채널내 및 채널 주위에 잔류하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서,

상기 조성물은 상기 치료 부위의 세포내로 일렉트로포레이트되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항에 있어서,

상기 치료 부위는 상기 니들에 의해서 만들어진 상기 조직내 트랙 주위의 조직/세포의 영역을 포함하며, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm 및 5 mm로 구성된 그룹으로부터 선택된 거리만큼 상기 트랙으로부터 방사상으로 확장되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 전기 에너지 공급원은 일렉트로포레이션 펄스 발생기인 것을 특징으로 하는 장치.
제 16 항에 있어서,

상기 발생기는 명목 전압(nominal voltage)이 1 V 내지 200 V 사이에 있도록 펄스되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서,

상기 발생기는 1 mAmp 내지 400 mAmp로 구성된 그룹으로부터 선택된 일정 전류로 펄스되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서,

상기 전류는 10 내지 40, 25 내지 100, 50 내지 150, 125 내지 200, 175 내지 250, 225 내지 300, 250 내지 300 및 300 내지 400으로 구성된 그룹으로부터 선택된 범위내에 있도록 구성된 그룹으로부터 일정 전류 범위가 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서,

상기 발생기는 1 Hz 내지 10,000 Hz 범위로부터 선택된 주파수에서 펄스되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서,

상기 발생기는 약 0.1 us 내지 1000 ms 사이의 시간 길이동안 펄스되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서,

상기 튜브는 20 게이지, 21 게이지, 22 게이지, 23 게이지, 24 게이지, 25 게이지, 26 게이지, 27 게이지, 28 게이지 및 29 게이지로 구성된 그룹으로부터 선택된 주사침의 게이지 크기로 제작된 것을 특징으로 하는 방법.