KR20080100645A - 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체 검출을 위한분자각인된 표면플라즈몬 공명 센서 칩, 그 제조방법 및그를 이용한 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체의검출방법 - Google Patents

곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체 검출을 위한분자각인된 표면플라즈몬 공명 센서 칩, 그 제조방법 및그를 이용한 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체의검출방법 Download PDF

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최성욱
전향숙
장현주
김현정
이나리
김재호
이재혁
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한국식품연구원
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Abstract

본 발명은 내분비장애를 나타내는 곰팡이 독소인 제랄레논 또는 그 유도체를 검출하기 위한 방법에 관한 것으로서, 본 발명에서는 고분자 전구체인 유기 단분자가 포함되어 있는 용액에 검출하고자 하는 분자인 제랄레논 또는 그 유도체를 첨가하여 혼합시키고, 이를 고체기질 상에서 고분자화 시킨 다음 제랄레논 또는 그 유도체를 제거하여 결합자리가 형성된 감지막 형태의 센서 칩을 제조하고, 분석시료에 함유된 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체가 결합자리에 결합되도록 한 후 표면 플라즈몬공명으로 검출하는 방법을 제공한다. 그에 따라 본 발명은 금속층이 형성된 지지체 상에 전기화학적 방법을 이용하여 간단히 제랄레논 또는 그 유도체를 용이하게 검출할 수 있는 감지막 형태의 고분자층을 갖는 센서 칩을 제작할 수 있을 뿐만 아니라 우수한 감도로 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체를 용이하게 검출할 수 있는 이점이 있다.

Description

곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체 검출을 위한 분자각인된 표면플라즈몬 공명 센서 칩, 그 제조방법 및 그를 이용한 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체의 검출방법{Surface plasmon resonance sensor chip using molecular imprinting technique for detecting the mycotoxins zearalenone and its derivatives, and method of the same, and detecting method of the mycotoxins zearalenone and its derivatives using the same}
도 1은 일반적인 표면 플라즈몬 공명 기술에 사용되는 센서칩을 개략적으로 나타낸 도면.
도 2는 본 발명에 따른 분자각인 된 센서칩을 개략적으로 나타낸 도면.
도 3은 도 2에 도시된 분자각인된 센서칩의 제조과정을 개략적으로 나타낸 도면.
도 4는 일반적으로 사용되는 표면플라즈몬 공명 분석기기의 설치상태를 개략적으로 나타낸 도면.
도 5a는 폴리피롤 고분자층을 형성한 후의 FTIR 측정결과를 나타낸 그래프이고, 도 5b는 폴리피롤 고분자층을 형성하기 전과 후의 SPR 측정결과를 나타낸 그래프.
도 6a와 도 6b는 본 발명에 따라 결합자리를 형성한 폴리피롤 고분자층에 3000 ppb의 제랄레논을 주입하기 전과 주입 후 60 분에 측정한 SPR 공명 곡선 변화를 나타낸 그래프.
도 7a와 도 7b는 결합자리를 형성하지 않고 제작한 폴리피롤 고분자층에 3000 ppb의 제랄레논을 주입하기 전과 주입 후 60 분에 측정한 SPR 공명 곡선 변화를 나타낸 그래프.
도 8은 본 발명에 따라 결합자리를 형성한 폴리피롤 감지막에 제랄레논 농도와 시간을 달리하여 측정한 공명각 변화를 나타낸 그래프.
도 9는 폴리피롤 감지막의 선택성을 확인하기 위하여 제랄레논 결합자리를 형성한 폴리피롤 고분자층에 제랄레논과 알파-제랄라놀을 첨가한 후 시간에 따른 공명각 변화를 나타낸 그래프.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
10 : 기판 11 : 지지체
12 : 금속층 20 : 고분자층
21 : 결합자리 22 : 모노머
23 : 템플릿 24 : 작업전극
25 : 상대전극 26: 기준전극
본 발명은 내분비장애를 나타내는 곰팡이 독소인 제랄레논 또는 그 유도체를 검출하기 위한 분자각인된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩, 그 제조방법 및 그를 이용한 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체의 검출방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 고분자 전구체인 유기 단분자가 포함되어 있는 용액에 검출하고자 하는 분자인 제랄레논 또는 그 유도체를 첨가하여 혼합시키고, 이를 고체기질 상에서 고분자화 시킨 다음 제랄레논 또는 그 유도체를 제거하여 결합자리가 형성된 감지막 형태의 센서 칩을 제조하고, 분석시료에 함유된 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체가 결합자리에 결합되도록 한 후 표면 플라즈몬공명으로 검출하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 식품관련 위해요소는 크게 급성과 만성 위해요인으로 구분되며 세계보건기구/세계식량농업기구(WHO/FAO)에서는 급성 위해요인으로는 미생물을, 만성 위해요인으로는 곰팡이독소를 가장 위험순위가 높은 요인으로 제시하고 있다. 곰팡이독소는 농산물의 생육기간 및 저장, 유통 중에 곰팡이에 의해 생성되는 독소로 열에 안정하며 조리 가공 후에도 분해되지 않아 곰팡이독소에 오염된 사료나 식품을 섭취한 동물이나 사람에게 여러 가지 건강상 장해를 야기한다.
특히 맥류를 포함한 곡류에 퓨사리움(Fusarium)속의 곰팡이가 기생하게 되면 붉은 곰팡이병이 발생한다. 이러한 붉은 곰팡이에 의한 중독증은 원래 붉은 곰팡이 병균인 퓨사리움 그라미니어룸(Fusarium graminearum)이 오염된 곡류를 섭취함으로 써 사람과 가축이 중독(scabby grain toxicosis)되는 것을 나타낸 것이었지만, 현재는 이 균에 의한 중독 사례뿐만이 아니라 다른 종의 퓨사리움(Fusarium)속 균이 곡류를 오염하여 생산한 대사물질이 동물에 대해서 특이한 독성을 나타내므로 이들을 총칭하는 퓨사리움 중독증(Fusarium toxicosis)의 뜻으로 바뀌었다.
이러한 퓨사리움 중독증을 유발하는 곰팡이 독소 가운데, 전 세계적으로 가장 빈번하게 발생되면서 내분비 장애를 야기시켜 문제가 되는 곰팡이 독소로 제랄레논(Zearalenone)과 그 유도체들이 있다. 제랄레논 유도체로는 알파-제랄레놀(α-zearalenol), 베타- 제랄레놀(β-zearalenol), 알파-제랄라놀(α-zearalanol), 베타-제랄라놀(β-zearalanol), 제랄라논(zearalanone) 등이 알려져 있다. 이들의 분자구조는 아래 표 1에 나타낸 바와 같다.
제랄레논 (zearalenone)
Figure 112007035453315-PAT00001
알파-제랄레놀 (α-zearalenol)
Figure 112007035453315-PAT00002
베타- 제랄레놀 (β-zearalenol)
Figure 112007035453315-PAT00003
알파-제랄라놀 (α-zearalanol)
Figure 112007035453315-PAT00004
베타-제랄라놀 (β-zearalanol)
Figure 112007035453315-PAT00005
제랄라논 (zearalanone)
Figure 112007035453315-PAT00006
제랄레논은 밀, 보리, 귀리, 옥수수 등에 잘 발생하며, 그 유도체들은 육류나 우유 등의 동물성 식품에서 검출된다. 제랄레논 또는 그 유도체들은 작물의 양적, 질적 저하와 가축의 생육저하 또는 개체수의 감소뿐만 아니라 급, 만성 질병 유발로 인한 의료비를 발생하는 등 대상에 따라 그 경제적 피해는 막대하다. 또한 자연계에서는 한 곰팡이독소에만 오염되어 있지 않으며, 제랄레논은 주로 데옥시니발레놀과 같은 트리코테신류 (trichothecenes) 곰팡이독소와 같이 오염되어 상승효과로 인해 피해가 더욱 커지게 된다.
세계 각국에서 제랄레논의 경우 200∼1000 ppb사이로 권고치나 최대허용량을 설정해 놓고 있다. 곰팡이독소에 대한 규제 장치는 수출국인 경우 자국의 이익을 고려하며, 수입국의 경우 자국민의 안전을 위하여 매우 엄격하게 설정하는 경향이어서 농산물의 수입국인 한국의 경우 검역소 등에서 이용할 수 있는 신속, 정확한 검출기의 마련이 절실하게 요구되고 있다. 이러한 곰팡이독소에 의한 경제적 피해를 정확하게 산출할 수는 없으나 미국의 경우, 몇 가지 곰팡이독소에 의한 농산물의 연간 평균 손실액이 $932 million (약 1조)에 이르는 것으로 추산하고 있다(US FDA 2003).
제랄레논 또는 그 유도체들은 TLC, ELISA, GC, HPLC 등 다양한 방법을 통해 분석되고 있다. TLC는 제랄레논 또는 그 유도체의 검출에 제일 먼저 적용된 분석법으로 제한된 예산에서 이용하기에 효율적인 방법이나 검출감도나 정량성 측면에서 제한점이 있다. 제랄레논 또는 그 유도체의 경우 형광검출기 또는 질량분석기(mass spectrometry)와 결합하여 독소의 정량에 사용되고 있으나 이 경우 장시간이 소요되고 고가의 장비와 숙련된 분석자가 요구되는 단점이 있다. 또한 제랄레논 또는 그 유도체들의 정량분석을 위해 불꽃이온화검출기 (FID), 전자포획검출기 (ECD), mass spectrometry검출기 등과 결합한 가스크로마토그래피 (GC)가 이용되고 있으나 이 방법 역시 장시간이 소요되고 고가의 장비와 숙련된 분석자가 요구되는 단점이 있다.
한편, 1971년 전반사(attenuated total reflectance)에 의한 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 현상이 발표된 이후 현재 SPR은 화학 또는 생체활성 물질 검출을 위한 가장 효과적인 광학기술로 알려져 왔다. 전류 또는 기계적 변화를 이용하는 검출시스템과 비교하였을 때, 용매의 흐름이나 전기적 잡음에 의해 방해되지 않기 때문에 안정된 신호를 얻을 수 있다는 장점을 가지고 있다. 생체활성 물질의 정성 또는 정량적 확인을 위해 가장 많이 이용되는 형광분석법은 형광물질을 검출물 상에 표지해야 되는 반면, SPR은 비표지 검출시스템으로 시료 전처리 공정을 간단히 할 수 있다. 또한 광학적 부분이 비교적 간단하기 때문에 소형화된 검출 시스템으로 적용하기에 적당하다. 이러한 SPR은 비표지 방법으로 신뢰성있는 안정된 신호를 얻을 수 있으며 소형화가 가능하여 현장에서 휴대하여 실시간 측정에 이용할 수 있다는 특징이 있다.
이러한 SPR 센서칩은 일반적으로 도 1에 도시된 바와 같이 유리, 플라스틱, 금속 등과 같은 소재의 지지체(11) 상에 금이나 은에서 선택되는 금속을 증착시켜 형성된 금속층(12)을 포함하는 기판(10)을 사용하고 있다. 이때 지지체(11) 상에 금속층(12)은 45∼50 nm 두께로 증착하여 사용하는 것이 일반적이며, 필요에 따라서는 지지체(11)와 금속층(12)간의 부착력을 높이기 위하여 니켈, 크롬 또는 티타늄을 증착한 후 금이나 은을 증착하고도 있다. 이렇게 제조된 기판(10)의 금속층(12) 상에는 분석하고자 하는 물질의 프로브(13)가 고정되며, 이렇게 제조된 센서 칩은 분석시 그 프로브에 분석하고자 하는 물질(14)을 고정시켜 SPR을 통해 분석하게 된다(Food and Agricultural Immunology (2002) 14, 313-321, J. Agric. Food Chem. (2003), 51, 5843-5848).
상기한 구조의 SPR용 칩은 프로브로써 단백질인 항체를 일반적으로 많이 사용하고 있다. 여기서 상기 항원-항체간의 특이적인 결합을 이용하는 면역화학적 분석법은 실험실 또는 현장에서 비교적 단시간 내에 측정 가능하므로 품질검사나 대량의 시료를 분석하는데 이용되고 있다. 그러나 도 1에 도시된 바와 같이 항체를 프로브로 이용하는 분석법은 고가이면서 항체의 활성을 유지하기 위하여 제작된 칩의 특별한 보관 방법이 필요하게 된다. 또한 항체를 고체기질에 고정화하고 활성을 유지시키는 복잡한 구조의 중간 연결층이 요구되는 단점이 있다.
프로브 물질로써 항체를 이용하지 않고 유기분자나 핵산을 이용한 프로브 제작에 많은 연구가 진행되었다. 유기분자 프로브는 중금속이나 저분자 수준의 물질을 검출할 수 있는 센서에 많이 이용되고 있으며, DNA 또는 RNA 프로브를 이용하여 DNA 또는 단백질을 검출하는데 사용하고 있다. 그러나 이들 프로브는 각각의 항원에 대해 제작이 어렵기 때문에 가격이 비싸며 기판 고정화를 위해 중간체를 필요로 하는 단점이 있다.
이러한 프로브 제작 연구의 일환으로 고분자를 이용하는 분자각인 방법이 알려지면서 1990년 이후 매우 활발히 연구가 이루어져 왔고, 당과 아미노산 유도체에 대하여 분자인식 고분자가 개발된 이후 지금까지 20여 종 이상의 화합물에 대한 분자인식 고분자가 보고되고 있다. 현재 알려진 분자각인 방법은 고분자 매트릭스를 형성할 수 있는 모노머(monomer)를 결합자리 형성용 템플릿(template)과 혼합한 다음 고분자화 시키고, 템플릿을 제거하여 화학적 기능과 템플릿의 3차원적 구조가 상호 보완적으로 구성된 결합자리를 형성하는 것이다. 분석시료를 고분자 상에 적하하면 분석하고자 하는 성분이 결합자리에 결합되어 검출이 가능해진다.
분자각인 될 수 있는 많은 고분자가 개발되고 연구되었지만, 고분자층이 감지막 형태로 제작되기 위해서는 고체 기질 상에 고정될 필요가 있다. 일반적으로 고분자를 고체기질상에 고정시키는 방법으로 회전도포(spin coating)방법이 많이 사용되고 있지만, 분자각인의 회전도포는 결합자리를 변형시킬 수 있기 때문에 감도를 저하시키는 요인으로 작용한다. 따라서 고분자층을 감지막 형태로 제작하기 위해서는 고체 기질 상에서 직접 고분자화하는 방법이 사용되어야 한다.
이에 본 발명자들은 기존의 알려진 분자각인법을 이용하여 퓨자리움 속 곰팡이 독소인 제랄레논 또는 그 유도체 검출용 센서칩을 제조함으로서, 기존의 항체를 이용한 검출 센서 칩에 비하여 센서칩의 제조가 용이하면서도 보관이 용이하며, 특히 분자각인법을 이용하면서도 고분자층을 감지막 형태로 고체 기질 상에 직접 형성하는 것이 가능하여 검출 감도를 높일 수 있도록 한 센서칩과 검출방법을 연구한 끝에 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 기판 상에 전기화학적 방법을 이용하여 감지막 형태의 분자각인된 고분자층을 도입함으로서 제랄레논 또는 그 유도체들을 포함하는 퓨자리움 속 곰팡이 독소를 용이하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라 높은 감도특성을 갖도록 한 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체 검출을 위한 분자각인된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한 본 발명은 상기 센서 칩을 보다 용이하게 제조할 수 있는 팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체 검출을 위한 분자각인된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩의 제조방법을 제공하는데 다른 목적이 있다.
또한 본 발명은 상기 센서 칩을 사용하여 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체를 검출하는 방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 금속층이 형성된 기판과; 상기 금속층상에 형성된 것으로 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리를 포함하는 고분자층;으로 이루어진 것임을 특징으로 하는 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체 검출을 위한 분자각인된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩을 제공한다.
또한 본 발명은 전기를 인가하면 고분자화되는 모노머와 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리 형성용 템플릿을 혼합하는 단계와; 금속층이 형성된 기판상에 상기 템플릿이 혼합된 모노머를 주입한 후 전기를 인가하여 고분자층을 형성시키는 단계와; 상기 고분자층에서 템플릿을 제거하여 제랄레논 또는 그 유도 체가 결합되는 결합자리를 형성하는 단계;를 포함함을 특징으로 하는 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체 검출을 위한 분자각인된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩의 제조방법을 제공한다.
아울러 본 발명은 금속층이 형성된 기판과, 상기 금속층상에 형성된 것으로 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리를 포함하는 고분자층으로 이루어진 분자각인된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩 상에 분석시료를 적하한 다음 플라즈몬 공명으로 제랄레논 또는 그 유도체를 검출하는 것임을 특징으로 하는 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체의 검출방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
이하, 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
도 2는 본 발명에 따른 분자각인 된 센서칩을 개략적으로 나타낸 도면이고, 도 3은 도 2에 도시된 분자각인된 센서칩의 제조과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
먼저 본 발명에 따른 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체를 검출하기 위한 센서 칩은 도 2에서 보는 바와 같이 금속층(12)이 형성된 기판(10)과, 상기 금속층(12)상에 형성된 것으로 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리(21)를 포함하는 고분자층(20)으로 이루어진다.
상기한 구조의 센서 칩은 도 3에 도시된 바와 같이 전기를 인가하면 고분자화되는 모노머(22)와 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리(21) 형성용 템 플릿(23)을 혼합하는 단계와, 금속층(12)이 형성된 기판(10)상에서 상기 템플릿(23)이 혼합된 모노머(22)에 전기를 인가하여 고분자층(20)을 형성시키는 단계와, 상기 고분자층(20)에서 템플릿(23)을 제거하여 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리(21)를 형성하는 단계를 거쳐 제조된다.
즉, 본 발명은 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체 검출을 위하여 분자각인 방법을 사용한 것과, 분자각인된 센서 칩을 제조과정에서 감지막 형태의 고분자층(20)을 형성하기 위하여 전기화학적 방법을 사용한 것에 가장 큰 특징이 있다. 이 경우 간단한 방법으로 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체를 높은 감도로 검출할 수 있게 된다. 또한 전기화학적인 방법을 사용함에 따라 고체 기질인 기판(10)상에 직접 고분자화가 가능하여 용이하게 센서 칩을 제조할 수 있다. 뿐만 아니라 감지막 형태의 고분자층(20)을 형성하는 과정에서 기존 회전도포(spin coating) 방법을 사용하는 감지막 형태의 고분자층(20)을 형성하는 것과 비교하여 보았을 때 결합자리(21)의 변형발생 가능성이 없어 우수한 감도로 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체의 검출이 가능하게 된다.
상기한 특성을 갖는 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체 검출을 위한 센서 칩의 제조를 위하여 본 발명에서는 먼저 전기를 인가하면 고분자화되는 모노머(22)와 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리(21) 형성용 템플릿(23)을 혼합하는 단계를 거치게 된다.
여기서, 전기를 인가하면 고분자화되는 모노머(22)는 다양한 화합물들이 알려져 있는데, 본 발명에서도 이런 공지된 화합물들에서 선택된 것을 적용하면 된 다. 전기를 인가하면 고분자화되는 모노머(22)는 가장 대표적인 것으로 피롤(pyrrol), 싸이오펜(thiophene), 아닐린(aniline)과 그 유도체들이 있으며, 이들은 800∼1000 mV에서 전기화학적으로 산화시키면 간단히 고분자화 된다. 예를 들어 하기 반응식 1에서 보는 바와 같이 피롤 모노머(22)에 전기를 인가하면 간단히 고분자화되게 된다.
Figure 112007035453315-PAT00007
상기한 모노머(22)와 혼합되는 템플릿(23)은 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리(21)를 형성하기 위한 것으로서, 제랄레논 또는 그 유도체에서 선택된 것을 템플릿(23)으로 사용하면 된다. 제랄레논 유도체로는 알파-제랄레놀(α-zearalenol), 베타- 제랄레놀(β-zearalenol), 알파-제랄라놀(α-zearalanol), 베타-제랄라놀(β-zearalanol) 또는 제랄라논(zearalanone)에서 선택된 것을 사용할 수 있다.
여기서, 모노머(22)와 템플릿(23)의 혼합비율은 반드시 한정할 필요는 없으나, 분석 효율성을 고려하여 모노머(22) 100중량부에 대하여 템플릿(23) 70∼120중량부 사용하는 것이 바람직하다.
전술한 모노머(22)와 템플릿(23)을 혼합하는 과정은 전해질과 유기용매 존재하에서 진행되는데, 전해질과 유기용매는 모노머(22)의 전기화학적 고분자화 분야 에서 일반적으로 사용되는 것에서 선택된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어 전해질은 테트라아세틸암모늄테트라플루오로보레이트(tetraethylammoniumtetrafluoroborate; TEABF4), 테트라에틸암모늄헥사플루오로포스페이트(tetraethylammoniumhexafluorophosphate; TEAPF6), 테트라부틸암모늄테트라플루오로보레이트(tetrabutylammoniumtetrafluoroborate; TBABF4) 또는 테트라부틸암모늄헥사플루오로포스페이트(tetrabutylammonium hexafluorophosphate; TBAPF6)에서 선택된 것을 사용할 수 있다. 아울러 유기용매는 아세토나이트릴(acetonitrile)을 포함하여, DMF(N,N-dimethyl-formamide), GBL(γ-butyrolactone), PC(propylene carbonate) 등에서 선택된 것을 사용할 수 있다.
템플릿(23)과 모노머(22)의 혼합이 완료되면, 금속층(12)이 형성된 기판(10)상에 상기 템플릿(23)이 혼합된 모노머(22)를 주입한 다음 전기를 인가하여 고분자층(20)을 형성시키는 단계를 거치게 된다.
여기서, 금속층(12)이 형성된 기판(10)은 당해분야에서 일반적으로 사용되는 유리, 수정, 플라스틱, 금속 등과 같은 지지체(11) 상에 금속층(12)을 형성한 것으로서, 금속층(12)은 일반적으로 적용되는 금이나 은에서 선택되는 금속을 증착시키면 용이하게 형성할 수 있다. 증착은 당해분야에서 일반적으로 사용되는 스퍼터링 방법을 포함하여 진공증착법 (VD, vapor deposition), 열 증착 또는 일렉트론 빔(electron-beam) 증착 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라서 다양한 방법이 접목될 수 있다. 지지체(11)상에 금속 증착시 형성된 금속층(12)의 두께가 45∼50 nm 정도 되도록 하면 된다. 아울러 주지된 바와 같이 지지체(11)와 금속층(12)간의 부착력을 높이기 위하여 지지체(11) 상에 니켈, 크롬 또는 티타늄을 증착한 후 금속층(12)을 형성시킬 수도 있다.
전기를 인가하는 방법은 다양한 방법이 모색될 수 있는데, 본 발명에서는 도면에 도시된 바와 같이 금속층(12)을 작업전극(24)으로 사용하고, 나머지 기준전극(26)과 상대전극(25)을 각각 설치하한 상태에서, 기판(10)상에 템플릿(23)이 혼합된 모노머(22)를 주입한 다음 전기를 인가하는 방법을 사용하였다. 전기를 인가하면 모노머(22)의 고분자화가 이루어지는데, 본 발명에서는 상대전극(25)으로 백금전극을, 기준전극(26)으로 Ag/AgCl 전극을 사용하였다.
고분자화가 이루어지면 아세토나이트릴과 에탄올을 사용하여 수 회 세척하면 템플릿(23)이 고정된 고분자층(20)이 형성되는데, 이후 상기 고분자층(20)에서 템플릿(23)을 제거하여 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리(21)를 형성하는 단계를 거치게 된다.
템플릿(23)의 제거를 위해서는 템플릿(23)이 용해되는 유기용매에 칩을 침적하여 방치하는 것으로 이루어진다. 고분자와 템플릿(23)은 강한 유기 결합으로 형성된 것이 아니기 때문에 템플릿(23)을 잘 용해시킬 수 있는 용매를 사용하여 결합자리(21)가 보전되면서 템플릿(23)을 효과적으로 제거할 수 있다. 템플릿(23)으로 사용된 제랄레논 또는 그 유도체를 용해시키기 위한 유기용매는 다양한 것이 적용될 수 있는데, 본 발명에서는 구입이 용이한 에탄올을 사용하였다. 템플릿(23)이 충분히 용해되어 제거될 수 있도록 하기 위하여 적어도 한시간 정도 방치하면 된 다.
템플릿(23)이 제거되면 에탄올을 이용하여 세척한 후 건조시키면 본 발명에 따른 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체 검출을 위한 분자각인된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩이 얻어진다. 따라서 본 발명은 결합자리(21)가 형성된 감지막 형태의 고분자층(20)을 금속층(12)상에 균일하게 형성시킬 수 있게 된다.
본 발명에 따라 제조된 센서 칩은 곰팡이 독소인 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리(21)를 갖는 감지막 형태의 고분자층(20)을 갖고 있어 곰팡이 독소인 제랄레논 또는 그 유도체를 용이하게 검출할 수 있다. 검출을 위해서는 분석시료를 센서칩의 고분자층(20)상에 적하하는 것으로 간단하게 이루어진다.
분석시료가 적하되면, 분석시료에 검출하고자 하는 곰팡이 독소인 제랄레논 또는 그 유도체가 함유되어 있는 경우 이들이 결합자리(21)에 결합되게 되며, 이를 공지된 표면플라즈몬공명 분석방법으로 분석하게 되면 분석시료에 곰팡이 독소인 제랄레논 또는 그 유도체들이 함유되어 있는지의 여부는 물론 정량적인 분석이 가능하게 된다.
여기서, 표면플라즈몬 공명(SPR)방법은 당해분야에서 일반적으로 사용되는 것으로서, 도 3에 도시된 바와 같이 당해분야에서 일반적으로 사용되는 SPR 분석기기를 사용하면 용이하게 분석이 가능하다. 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 회전할 수 있는 좀 더 구체적으로 회전할 수 있는 시료 회전판(30)에 프리즘(32)과 SPR 센서 칩(40)을 에멀젼오일로 부착하고 시료셀(31)과 같이 배치한다. 670 nm 다이오드 레이저를 광원(34)으로 이용하고 광원(34)과 프리즘(32) 사이에 입사각과 평행한 전기장을 만들기 위해 편광기(33)를 설치한다. 프리즘(32)을 통과한 빛은 검출기(35)를 이용하여 그 세기를 측정하고 검출부(36)를 통해 신호처리부(38)에서 신호를 처리한다. 시료 회전판 조절부(37)는 입사각을 변화시키기 위해 시료 회전판(30)의 회전각을 조절하고 이는 신호처리부(38)에 의해 통제된다.
이하 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하기로 하나, 하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것을 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 제랄레논 검출을 위한 표면플라즈몬 공명 센서 칩 제조
1.0 mM 피롤(pyrrol)과 0.1 mM 테트라부틸암모늄테트라플루오로보레이트(tetrabutylammoniumtetrafluoroborate)를 아세토나이트릴(acetonitrile)에 녹인 후 템플릿으로 1.0 mM 제랄레논을 첨가하고 2 시간 정도 교반한다.
유리판에 스퍼터링 방법으로 45 nm 두께의 금(Au)을 증착하고, 증착된 금을 작업전극으로 사용하고 나머지 기준전극, 상대전극을 각각 설치하였다. 여기에 위에서 교반하여 얻어진 혼합물을 2 ml를 주입한 후 900 mV 전압에서 0.005 C의 전하가 흐를 때 까지 피롤을 산화시켜 폴리피롤 고분자층을 형성하였다. 아세토나이트릴과 에탄올을 사용하여 수 회 세척 한 후 템플릿인 제랄레논을 제거하기 위하여 클로로포름속에 1시간 방치하고 에탄올을 이용하여 세척한 후 질소 건조시켜 센서 칩을 제조하였다.
<실험예 1> 센서칩에서의 고분자층 형성여부 확인
상기 실시예 1에서 제조한 센서칩은 FTIR 스펙트로미터와 도 4에 도시된 SPR측정기기를 사용하여 측정하였으며, FTIR 측정결과는 도 5a에 SPR 측정결과는 도 5b에 나타내었다.
도 5a는 금층에 형성된 폴리피롤을 ATR/FT-IR 분광법(Attenuated Total Reflectance Fourier Transform Infrared Spectrometry)으로 측정한 것으로서, 1713∼1617, 1191∼1095 그리고 926 cm-1 은 폴리피롤링 C-C의 스트레칭 진동 밴드(stretching vibration band), C-H의 같은 면 굽힘진동 밴드(in-plane bending vibration band) 그리고 C-H의 다른면 굽힘진동 밴드(out-plane bending vibration band)에 각각 해당한다.
도 5b는 제랄레논 감지막을 형성하기 전(실선)과 형성한 후(점선)의 SPR 측정결과를 나타낸 것으로서 1.365도의 공명각 이동이 발생한 것을 확인할 수 있었고, 이러한 공명각의 이동은 제랄레논 고분자의 굴절율이 1.45일 때 10 nm정도의 두께로 형성되었음을 확인할 수 있었다. 이러한 두께는 제랄레논 분자가 차지하는 부피를 고려하였을 때 최소 5층 이상 쌓일 수 있는 두께로써 항체를 이용한 단일층 센서 칩보다 많은 결합자리를 제공할 수 있으며 이로 인하여 더 좋은 감도 특성을 기대할 수 있다.
결국, 도 5의 결과를 통해 폴리피롤 고분자층이 형성되었음을 알 수 있다.
<실험예 2> 제작된 센서칩의 특성평가
제작된 센서칩의 감도특성을 SPR을 이용하여 공명각 이동을 통해 제랄레논의 검출여부와 농도에 따른 공명각이동 정도를 확인하였다.
이를 위하여 제랄레논 1 mM을 에탄올에 녹인 후 3000, 30, 0.3 ppb가 되도록 증류수로 희석하고, 각각의 농도에서 10 분 간격으로 100 분 동안 공명각 이동을 확인하였다. 또한 제랄레논 결합자리가 없는 순수한 폴리피롤 막을 같은 조건으로 제작하여 3000 ppb 농도에서 동일 시간 간격으로 측정하였다. 그 결과를 도 6, 7, 8에 각각 나타내었다.
도 6은 제작된 센서칩에 3000 ppb 농도의 제랄레논 주입 전 (실선)과 주입 60분 후 (점선)를 나타낸 것으로서 0.3 도의 공명각이 이동한 것을 확인 할 수 있었다. 도 7은 제랄레논 결합자리가 없는 순수한 폴리피롤 막을 이용한 것으로 3000 ppb 농도의 제랄레논 주입 전 (실선)과 주입 60분 후 (점선) 공명각 변화가 나타나지 않는 것을 확인 할 수 있었다.
도 8은 각각의 제랄레논 농도별 시간에 따른 상대적 공명각 이동을 나타낸 것이다. 도 8에서 보는 바와 같이 주입한 제랄레논 3000 ppb에서는 포화까지 50분 정도 소요되는 반면, 이 보다 낮은 농도의 30 ppb에서는 70분 이상 소요되는 것을 알 수 있다. 그러나 0.3 ppb와 결합자리가 없는 감지막의 공명각은 거의 이동되지 않았으며 0.3 ppb 이상의 농도에서 검출 한계가 있음을 알 수 있다.
<실험예 3> 센서칩의 선택성 평가
분자각인을 이용하여 형성된 감지막 형태의 고분자층은 3 차원적인 결합자리를 형성하기 때문에 선택도 또한 높은 것으로 잘 알려져 있다. 이를 확인하기 위하 여 제랄레논의 유사 유도체인 알파-제랄라놀을 상기 실시예 1에서 제조한 제랄레논으로 각인된 고분자층에 첨가하여 시간에 따른 SPR의 공명각 변화를 확인하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이 제랄레논을 템플릿으로 각인한 고분자층에 3000 ppb 농도의 알파-제랄라놀을 첨가하였을 때 공명각 변화가 거의 나타나지 않았다. 이는 제랄레논 템플릿을 사용하지 않은 순수한 폴리피폴 막을 사용하였을 때와 유사한 값으로 폴리피롤 막과의 결합만 존재한다는 것을 알 수 있다. 따라서 제랄레논을 템플릿으로 사용하여 제작한 감지막은 제랄레논과 선택적으로 결합하고 있으며 그 선택도 또한 우수한 것으로 판단된다.
이상의 실험결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명에 따른 센서칩은 랄레논 또는 그 유도체가 고체 기판상에 전기화학적으로 각인된 고분자층을 형성시킬 수 있으며, 결합자리가 없는 폴리피롤과 비교하였을 때 제랄레논 30 ppb 이하의 농도까지 SPR을 이용하여 검출할 수 있을 뿐만 아니라 제랄레논 유도체와 구분하여 특이적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.
이상에서 상술한 바와 같이 본 발명은 금속층이 형성된 지지체 상에 전기화학적 방법을 이용하여 간단히 제랄레논 또는 그 유도체를 용이하게 검출할 수 있는 센서 칩을 제작할 수 있으며, 특히 간단한 방법을 통해 센서칩의 제작이 가능하므로 대량 생산에 매우 적합하다는 이점이 있다. 뿐만 아니라 감지막 형태의 고분자 층을 형성하는 과정에서 기존 회전도포(spin coating) 방법을 사용하는 감지막 형태의 고분자층을 형성하는 것과 비교하여 보았을 때 결합자리의 변형발생 가능성이 없어 우수한 감도로 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체의 검출이 가능하게 되는 이점이 있다.

Claims (11)

  1. 금속층이 형성된 기판과; 상기 금속층상에 형성된 것으로 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리를 포함하는 고분자층;으로 이루어진 것임을 특징으로 하는 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체 검출을 위한 분자각인된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 고분자층은: 전기를 인가하면 고분자화되는 모노머와 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리 형성용 템플릿을 혼합하는 단계와; 금속층이 형성된 기판상에 상기 템플릿이 혼합된 모노머를 주입한 후 전기를 인가하여 고분자층을 형성시키는 단계와; 상기 고분자층에서 템플릿을 제거하여 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리를 형성하는 단계;를 거쳐 제조된 것임을 특징으로 하는 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체 검출을 위한 분자각인된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 전기를 인가하면 고분자화되는 모노머가: 피롤(pyrrol), 싸이오 펜(thiophene), 아닐린(aniline) 또는 이들 유도체에서 선택된 것;임을 특징으로 하는 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체 검출을 위한 분자각인된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩.
  4. 청구항 2 또는 3에 있어서,
    상기 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리 형성용 템플릿이: 제랄레논, 알파-제랄레놀 (α-zearalenol), 베타- 제랄레놀 (β-zearalenol), 알파-제랄라놀 (α-zearalanol, 베타-제랄라놀 (β-zearalanol) 또는 제랄라논(zearalanone)에서 선택된 것;임을 특징으로 하는 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체 검출을 위한 분자각인된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩.
  5. 전기를 인가하면 고분자화되는 모노머와 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리 형성용 템플릿을 혼합하는 단계와; 금속층이 형성된 기판상에 상기 템플릿이 혼합된 모노머를 주입한 후 전기를 인가하여 고분자층을 형성시키는 단계와; 상기 고분자층에서 템플릿을 제거하여 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리를 형성하는 단계;를 포함함을 특징으로 하는 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체 검출을 위한 분자각인된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩의 제조방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 전기를 인가하면 고분자화되는 모노머가: 피롤(pyrrol), 싸이오펜(thiophene), 아닐린(aniline) 및 이들 유도체에서 선택된 것;임을 특징으로 하는 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체 검출을 위한 분자각인된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩의 제조방법.
  7. 청구항 5 또는 6에 있어서,
    상기 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리 형성용 템플릿이: 제랄레논, 알파-제랄레놀 (α-zearalenol), 베타- 제랄레놀 (β-zearalenol), 알파-제랄라놀 (α-zearalanol), 베타-제랄라놀 (β-zearalanol) 또는 제랄라논(zearalanone)에서 선택된 것;임을 특징으로 하는 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체 검출을 위한 분자각인된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩의 제조방법.
  8. 금속층이 형성된 기판과, 상기 금속층상에 형성된 것으로 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리를 포함하는 고분자층으로 이루어진 분자각인된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩 상에 분석시료를 적하한 다음 플라즈몬 공명으로 제랄레논 또는 그 유도체를 검출하는 것임을 특징으로 하는 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체의 검출방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 고분자층은: 전기를 인가하면 고분자화되는 모노머와 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리 형성용 템플릿을 혼합하는 단계와; 금속층이 형성된 기판상에 상기 템플릿이 혼합된 모노머를 주입한 후 전기를 인가하여 고분자층을 형성시키는 단계와; 상기 고분자층에서 템플릿을 제거하여 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리를 형성하는 단계;를 거쳐 제조된 것임을 특징으로 하는 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체의 검출방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 전기를 인가하면 고분자화되는 모노머가: 피롤(pyrrol), 싸이오펜(thiophene), 아닐린(aniline) 및 이들 유도체에서 선택된 것;임을 특징으로 하는 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체의 검출방법.
  11. 청구항 9 또는 10에 있어서,
    상기 제랄레논 또는 그 유도체가 결합되는 결합자리 형성용 템플릿이: 제랄 레논, 알파-제랄레놀 (α-zearalenol), 베타- 제랄레놀 (β-zearalenol), 알파-제랄라놀 (α-zearalanol), 베타-제랄라놀 (β-zearalanol) 또는 제랄라논(zearalanone)에서 선택된 것;임을 특징으로 하는 곰팡이 독소 제랄레논 또는 그 유도체의 검출방법.
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