KR101494776B1 - 미량 분석용 고감도 자극 반응성 표면증강 라만 산란 기판 제조 방법 및 그의 응용 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 일 실시예에 따르는 표면증강 라만 산란 기판은 티타늄층이 형성된 베이스 기판과, 상기 티타늄층 상에 형성되는 금속 박막층 및 상기 금속 박막층 상에 형성되고, 이방성(antisotropic)의 금속 나노 입자와 고분자가 결합된 결합층을 포함하고, 상기 결합층의 금속 나노입자들과 고분자들은 적어도 일부가 서로 이온 결합된다. 상기 금속 나노입자사이의 간격을 하한 용액 임계 온도의 특성을 가진 고분자들을 통하여 조절함으로써 더욱 강한 표면증강 라만 산란 신호를 낼 수 있다.
Description
본 발명은 표면증강 라만 산란(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS)에 기초한 고감도 미량분석용 바이오센싱 및 화학센싱을 위한 유무기 복합체 기판에 관한 것으로, 보다 상세하게는 이방성 모양을 가진 금속나노입자들 간의 거리를 자극반응성이 있는 고분자를 이용하여 조절함으로써 표면증강 라만산란신호의 증폭을 유도하는 유무기 복합체 기판 및 이의 제조방법, 그리고 이들의 응용에 관한 것이다.
환경문제는 최근 인류에게 가장 중요한 문제로 대두되고 있다. 인류는 생활수준의 향상과 많은 산업 활동을 통하여 많은 화학 물질을 만들어 냈으며, 많은 분야에 널리 사용되고 있다. 하지만 유독성 화학 물질들의 유출로 인해 치명적인 생태계의 파괴 등의 환경오염 문제가 심각해지면서 각종 중금속 및 유기인계 화합물과 같은 환경오염 물질의 조기 검출에 대한 필요성이 증대되고 있다. 또한, 9.11 테러 이후 국제 사회에서 테러에 의한 위협이 고조되면서 탄저 및 사린과 같은 단시간에 불특정 다수에게 큰 피해를 입히는 바이오 테러 작용제의 조기 검출에 대한 필요성이 증대되고 있다. 따라서, 실험실 수준에 국한되지 않은 현장에서의 신속한 검출 및 확산을 차단하는 것은 매우 중요한 과제이며, 이러한 각종 화학물질의 극미량 분석 기술의 개발은 환경, 의료, 식품, 군사 분야 등에서 매우 중요한 문제로 대두되고 있는 실정이다.
환경 오염물질 등의 화학물질 분석 기술은 특히 빠른 분석시간과 현장에서 직접 사용가능해야 하지만, 기존의 분석 기술은 샘플의 체취 후 현장에서의 분석이 불가능 하며 긴 반응 시간과 복잡한 전처리 과정을 필요로 하며, 비싼 장비 또는 대형의 분석장비를 필요로 하여, 분석시 노력과 실시간 분석이 되지 않고 재현성이 떨어지는 단점이 있었다.
이와 관련하여, 근래에는 극미량의 농도까지 화학물질(chemical)을 탐지하고 분석시간의 효율을 극대화 시킬 수 있는 표면 증강 라만산란(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS)이 각광받고 있다.
표면 증강 라만 산란신호를 극대화 시키기 위하여 다양한 형태의 나노 입자를 합성하거나[Jianping Xie, Jim Yang Lee, and Daniel I. C. Wang, 2007, Chem. Mater., 19, 2823-2830], 나노 입자 사이의 강한 자유 전자의 집단적 진동을 유도[Ping-Ji Huang, et al, 2009, Adv. funct. Mater., 19, 242-248], 자극 반응성 고분자를 사용하여 나노 입자 사이의 거리를 조절[Laura Rodriguez-Lorenzo, et al. 2009, J. AM. CHEM. SOC, 131, 4616-4618]에 대한 기술이 보고되었다.
따라서, 미량의 샘플만으로도 고감도의 바이오센싱 및 화학센싱을 할 수 있는 미량 분석용 표면증강 라만 산란 기판이 고려될 수 있다.
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본 발명의 목적은 보다 효율적으로 미량의 화학물질을 검출할 수 있는 표면증강 라만 산란 기판을 제작하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유무기 나노 복합체 기판을 이용하여 표면 증강 라만 산란에 의한 물질 분석 방법을 제공하기 위한 것이다.
이와 같은 본 발명의 해결 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따르는 표면증강 라만 산란 기판은 티타늄층이 형성된 베이스 기판과, 상기 티타늄층 상에 형성되는 금속 박막층 및 상기 금속 박막층 상에 형성되고, 이방성(antisotropic)의 금속 나노 입자와 고분자가 결합된 결합층을 포함하고, 상기 결합층의 금속 나노입자들과 고분자들은 적어도 일부가 서로 이온 결합된다.
본 발명과 관련한 일 예에 따르면, 상기 결합층의 고분자들은 각각, 제1 단량체와 제2 단량체가 자유 라디칼 중합반응에 의해 형성되는 공중합체를 포함하고, 상기 제1 단량체는 자극 반응성을 가지는 폴리(N-이소프로필 아크릴아마이드)[poly(N-isopropylacrylamide), 폴리(비닐카프로락탐)[poly(vinylcaprolatame)], 폴리(N,N-디에틸아크릴아마이드)[poly(N,N-diethylacrylamide)], 폴리(에틸렌 글라이콜)[poly(ethylene glycol)], 폴리(에틸렌 옥사이드)[poly(ethylene glycol)]로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 제2 단량체는 금속 나노 입자와 반대 전하를 띄는 폴리(알릴아민)[poly(allylamine)], 폴리라이신[polylysine], 키토산[chitosan], 폴리(아크릴릭에시드[poly(acrylic acid)]으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명과 관련한 일 예에 따르면, 상기 결합층의 금속 나노 입자는, 금, 은, 구리, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명과 관련한 일 예에 따르면, 상기 금속 나노 입자의 단면 형상은 막대, 삼각형, 사각형 또는 별 중의 어느 하나가 될 수 있다.
본 발명과 관련한 일 예에 따르면, 상기 금속 나노 입자에 내부표준신호로 사용되는 라만 염료가 결합되고, 상기 라만 염료는 로다민6G, 로다민 이소티오시아네이트(RBITC), 아데닌, 4-아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-플루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 6-머캅토 퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리미딘, 8-머캅토아데닌, 및 9-아미노-아크리딘 중 어느 하나가 될 수 있다.
또한 상기한 과제를 실현하기 위하여 본 발명의 다른 실시예는, 베이스 기판에 티타늄층과 금속 박막층을 형성하는 준비단계와, 자유 라디칼 중합반응에 의해 형성되는 공중합체를 상기 금속 박막층 상에 떨어뜨린 후 교반시키는 제1 교반단계 및 이방성(antisotropic)의 금속나노입자들을 상기 공중합체가 결합된 금속 박막층 상에 떨어뜨린 후 교반시키는 제2 교반단계를 포함하는 표면증강 라만 산란 기판의 제조 방법을 개시한다.
상기와 같이 구성되는 본 발명의 적어도 하나의 실시예에 관련된 표면증강 라만 산란 기판은 하한 용액 임계 온도 이상에서 더욱 강한 표면증강 라만 산란 신호를 낼 수 있다.
또한, 금속 나노입자사이의 간격을 조절함에 따라 자유 전자의 집단적 진동을 유도하는 핫스팟(hot spot)을 형성하여 보다 강한 표면 증강 라만 신호를 얻을 수 있으며, 표면증강 라만 산란 신호가 커질수록 더욱 미량의 샘플만으로도 고감도의 바이오센싱 및 화학센싱이 가능하다.
도 1은 본 발명은 표면증강 라만 산란에 기초한 미량분석용 고감도 바이오센싱 및 화학센싱을 위해 표면증강 라만 산란 신호 증폭효과가 높은 이방성 모양 (anisotropic shape)를 가진 금속나노입자들을 제조하고, 음전하를 가진 이 금속나노입자들의 전기적 성질을 이용하여 양전하를 가진 열적 반응성이 있는 고분자에 이온결합을 통해 결합시킨 유무기 하이브리드 (Inorganic-organic hybrid) 표면증강 라만 산란 기판 (SERS substrate)의 제조 방법에 대한, 본 발명의 모식도이다.
도 2는 폴리(NIPAM-co-AAm)의 중합반응의 화학적 설계를 보여준다. AAm은 중합반응의 효율을 올리기 위해 allylammonium chloride 상태로 바꾸어 주었다. 고분자 사슬 말단에 EDC 커플링 반응을 사용하여 maleimide로 치환해 주기 전에 사슬 끼리의 결합을 막기위해 t-boc을 이용하여 AAm의 아민기를 보호하였다. maleimide로 치환이 끝난 뒤 염산을 이용하여 아민을 보고하고 있는 t-boc을 제거하고 pH6.5-7의 인산염 버퍼에서 maleimide-thiol 커플링 반응을 통하여 폴리(NIPAM-co-AAm)와 금 기판 위의 자가조립된 1,6-hexadithol을 결합하였다.
도 3은 폴리(NIPAM-co-AAm)의 NMR 분석 스펙트럼이다. (a)와 (c)는 NIPAM과 AAm가 3:1의 반응비로 중합되었고, (b)와 (d)는 5:1의 반응비로 중합된 그림이다. 하한 용액 임계 온도의 차이를 확인 할 수 있다.
도 4 (a), (b), (c)는 별 형태 금나노입자의 크기 및 형태를 투과전자현미경을 통하여 확인한 그림이며, (d)는 UV-vis 흡광도, (e)는 표면증강 라만 산란 신호를 측정한 그림이다.
도 5 (a)는 음전하를 띄고있는 금나노입자 용액에 양전하를 띄고있는 고분자를 넣어 고분자와 금나노입자 사이의 정전기적 상호작용을 측정한 그림이다. (b)는 고분자가 마이크로어레이 위에 결합되어 정상적으로 금나노입자가 흡착되었을 때와 고분자가 없을 경우 나타나는 표면증강 라만 산란 신호를 측정한 그림이다. (c)는 하한 용액 임계 온도 아래에서 금나노입자 표면에 흡착된 라만염료에 대한 표면증강 라만 산란 신호를 측정한 그림이고, (b)는 하한 용액 임계 온도 이상에서 표면증강 라만 산란 신호를 측정한 그림이다.
도 6은 고분자의 분자량을 중합개시제의 양에따라 조절하여 표면증강 라만 산란 신호 및 주사전자 현미경을 통하여 기판에 흡착된 금 나노입자의 양을 비교한 그림이다. (a, c)는 0.1 mol%, 0.002 mol%의 중합개시제를 사용하여 표면증강 라만 산란 신호를 측정한 그래프이며, (b, d)는 주사전자 현미경을 이용하여 기판에 흡작된 금 나노입자의 양을 비교한 그림이다.
도 7 (a)는 하한 용액 임계 온도 아래에서의 RBITC와 MGITC의 표면증강 라만 산란 신호와 하한 용액 임계 온도 이상에서의 RBITC와 MGITC의 표면증강 라만 산란 신호를 나타낸 그림이다. (b)는 0.48ppm부터 4.8ppm까지 MGITC의 농도별로 표면증강 라만 산란 신호를 측정한 그림이다. (c)는 기준신호로 나타나는 RBITC에 대하여 MGITC가 농도별로 증가할 때의 표면증강 라만 산란 신호를 직선으로 나타낸 그림이다.
도 2는 폴리(NIPAM-co-AAm)의 중합반응의 화학적 설계를 보여준다. AAm은 중합반응의 효율을 올리기 위해 allylammonium chloride 상태로 바꾸어 주었다. 고분자 사슬 말단에 EDC 커플링 반응을 사용하여 maleimide로 치환해 주기 전에 사슬 끼리의 결합을 막기위해 t-boc을 이용하여 AAm의 아민기를 보호하였다. maleimide로 치환이 끝난 뒤 염산을 이용하여 아민을 보고하고 있는 t-boc을 제거하고 pH6.5-7의 인산염 버퍼에서 maleimide-thiol 커플링 반응을 통하여 폴리(NIPAM-co-AAm)와 금 기판 위의 자가조립된 1,6-hexadithol을 결합하였다.
도 3은 폴리(NIPAM-co-AAm)의 NMR 분석 스펙트럼이다. (a)와 (c)는 NIPAM과 AAm가 3:1의 반응비로 중합되었고, (b)와 (d)는 5:1의 반응비로 중합된 그림이다. 하한 용액 임계 온도의 차이를 확인 할 수 있다.
도 4 (a), (b), (c)는 별 형태 금나노입자의 크기 및 형태를 투과전자현미경을 통하여 확인한 그림이며, (d)는 UV-vis 흡광도, (e)는 표면증강 라만 산란 신호를 측정한 그림이다.
도 5 (a)는 음전하를 띄고있는 금나노입자 용액에 양전하를 띄고있는 고분자를 넣어 고분자와 금나노입자 사이의 정전기적 상호작용을 측정한 그림이다. (b)는 고분자가 마이크로어레이 위에 결합되어 정상적으로 금나노입자가 흡착되었을 때와 고분자가 없을 경우 나타나는 표면증강 라만 산란 신호를 측정한 그림이다. (c)는 하한 용액 임계 온도 아래에서 금나노입자 표면에 흡착된 라만염료에 대한 표면증강 라만 산란 신호를 측정한 그림이고, (b)는 하한 용액 임계 온도 이상에서 표면증강 라만 산란 신호를 측정한 그림이다.
도 6은 고분자의 분자량을 중합개시제의 양에따라 조절하여 표면증강 라만 산란 신호 및 주사전자 현미경을 통하여 기판에 흡착된 금 나노입자의 양을 비교한 그림이다. (a, c)는 0.1 mol%, 0.002 mol%의 중합개시제를 사용하여 표면증강 라만 산란 신호를 측정한 그래프이며, (b, d)는 주사전자 현미경을 이용하여 기판에 흡작된 금 나노입자의 양을 비교한 그림이다.
도 7 (a)는 하한 용액 임계 온도 아래에서의 RBITC와 MGITC의 표면증강 라만 산란 신호와 하한 용액 임계 온도 이상에서의 RBITC와 MGITC의 표면증강 라만 산란 신호를 나타낸 그림이다. (b)는 0.48ppm부터 4.8ppm까지 MGITC의 농도별로 표면증강 라만 산란 신호를 측정한 그림이다. (c)는 기준신호로 나타나는 RBITC에 대하여 MGITC가 농도별로 증가할 때의 표면증강 라만 산란 신호를 직선으로 나타낸 그림이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
고감도 미량분석용 바이오센싱 및 화학센싱 분야에서 라만 프로브로 이용할 수 있는 특정 구조에 대한 연구가 계속되고 있다. 금속 나노입자의 종류, 크기나 모양 등에 의해서 달라지기 때문에 이들을 조절하여 보다 강한 표면증강 라만 신호를 얻을 수 있다. 특히, 금속 나노입자를 구, 삼각형, 막대, 큐브, 별 모양 등의 다양한 형태로 만들기 위해 이온빔 리소그래피(Focused ion beam milling), 전자빔 리소그래피(e-beam lithography), 나노스피어 리소그래피(nanosphere lithography) 및 진공 증발(vacuum evaporation)등의 방법이 이용되고 있다. 또한 금속 나노입자사이에 화학적, 물리적인 방법을 통하여 응집을 조절하기 위한 연구가 진행되어 오고 있다. 금속 나노입자사이의 간격을 조절함에 따라 자유 전자의 집단적 진동을 유도하는 핫스팟(hot spot)을 형성하여 보다 강한 표면 증강 라만 신호를 얻을 수 있다. 이 기술들은 재현성이 높은 표면 증강 라만 신호를 가지는 라만 프로브를 만드는 데 이용된다.
자극 반응성 고분자는 고체와 액체의 중간물질로서 온도, pH, 전기, 응력, 압력, 이온강도 및 용매조성 등의 외부 자극에 의해 가역적 또는 비가역적으로 고분자 내부에서 구조적 변화를 일으킬 수 있다. 이중 하한 용액 임계 온도(Lower critical solution temperature)를 가지는 온도 반응성 고분자는 지난 10년 동안 꾸준히 연구되어 오고 있다. 폴리(N-이소프로필 아크릴아마이드) [poly(N-isopropylacrylamide)은 30~35℃ 정도의 체온 부근에서 하한 용액 임계 온도를 나타내 이 온도 이상에서는 고분자가 응집되어 침전되고, 이하의 온도에서는 응집이 풀어져 투명한 상태로 변한다. 폴리(N-이소프로필 아크릴아마이드)와 같은 자극 반응성 고분자는 센싱 뿐만 아니라 약물전달 및 조직공학 등 그 응용분야가 매우 다양하다.
이에 본 발명자들은 표면증강 라만 산란 신호 증폭효과가 높은 이방성 모양 (anisotropic shape)를 가진 금속나노입자들을 제조하고, 이 금속나노입자들의 음전하를 가진 전기적 성질을 이용하여 열적 반응성이 있는 양전하를 가진 고분자에 이온결합을 통해 결합시킨 새로운 유무기 하이브리드 (Inorganic-organic hybrid) 표면증강 라만 산란 기판 (SERS substrate)을 제조함으로써, 내부 표준 신호를 기준으로 분석 물질에 대한 신호 세기를 효과적으로 비교 및 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 따르는 표면증강 라만 산란 기판은 자극 반응성과 양전하를 띄고 있는 고분자에 이방성 모양으로 제조한 음전하를 띄고 있는 금속나노 입자가 결합된다.
일 예로, 본 발명의 일 실시예에 따르는 표면증강 라만 산란 기판은 티타늄층이 형성된 베이스 기판과, 상기 티타늄층 상에 형성되는 금속 박막층 및 상기 금속 박막층 상에 형성된 이방성(antisotropic)의 금속 나노 입자와 고분자가 결합된 결합층을 포함하고, 상기 결합층의 금속 나노입자들과 고분자들은 적어도 일부가 서로 이온 결합될 수 있다.
그리고, 표면증강 라만 산란 기판의 제조 방법은 베이스 기판에 티타늄층과 금속 박막층을 형성하는 준비단계와, 자유 라디칼 중합반응에 의해 형성되는 공중합체를 상기 금속 박막층 상에 떨어뜨린 후 교반시키는 제1 교반단계 및 이방성(antisotropic)의 금속나노입자들을 상기 공중합체가 결합된 금속 박막층 상에 떨어뜨린 후 교반시키는 제2 교반단계를 포함할 수 있다.
열적 반응성이 있는 고분자로는 폴리(N-이소프로필 아크릴아마이드)[poly(N-isopropylacrylamide), 폴리(비닐카프로락탐)[poly(vinylcaprolatame)], 폴리(N,N-디에틸아크릴아마이드)[poly(N,N-diethylacrylamide)], 폴리(에틸렌 글라이콜)[poly(ethylene glycol)], 폴리(에틸렌 옥사이드)[poly(ethylene glycol)] 등을 사용할 수 있고, 양전하를 띄고 있는 고분자로는 아마이드(amide)기를 포함하고 폴리(알릴아민)[poly(allylamine)], 폴리라이신[polylysine], 키토산[chitosan]등을 사용 할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 N-이소프로필 아크릴아마이드(NIPAM) 단량체와 알릴아민(allylamine) 단량체를 자유라디칼중합(free radical polymerization)을 이용하여 공중합체를 만들어 사용하였다.
특히, 상기 중합은 고분자 양 말단에 작용기를 도입할 수 있는 중합 개시제(initiator)를 사용하는 것이 효과적이다.
또한, 금속 나노입자의 표면 증강 라만 산란에 의한 내부 표준 신호(Internal standard signal)에 사용되는 라만 염료는 로다민6G, 로다민 이소티오시아네이트(RBITC), 아데닌, 4-아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-플루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 6-머캅토 퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리미딘, 8-머캅토아데닌, 및 9-아미노-아크리딘 등을 사용할 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 로다민 B 이소티오시아네이트(RBITC)를 사용하였다.
금속 나노입자는 금, 은, 구리, 및 이들의 혼합물 등으로부터 선택될 수 있는데, 본 발명의 일 실시예에서는 금 나노입자를 사용하였으며 상기 금나노입자의 형태는 구, 삼각형, 막대, 큐브, 별모양 등으로부터 선택될 수 있는데, 본발명의 일 실시예에서는 별 형태의 나노입자를 사용하였다.
상기 금속 나노입자는 20~50nm의 직경 크기를 가지는 것이 바람직하고, 상기 고분자의 하한 용액 임계 온도는 30~100 ℃에서 나타나는 것이 바람직하다.
본 발명은 다른 구체적인 예로써, 음전하를 띄는 별 모양의 이방성 금 나노입자를 제조하는 단계, 시드(seed) 금속 나노입자에 내부 표준 신호(Internal standard signal)로 사용되는 라만 염료를 결합시키는 단계, 자유라디칼중합(free radical polymerization)을 이용하여 공중합체를 중합하는 단계를 포함하는 표면증강 라만 산란 기판의 제조 방법을 제공한다.
이 때, 중합된 고분자 말단에 도입된 작용기를 통하여 금 기판과 결합할 수 있는 작용기로 개질시킬 수 있다. 그리고, 이온결합을 통하여 별 모양의 금 나노입자와 고분자를 결합시킬 수 있다. 또한, 공중합체를 중합하는 단계에서 상기 중합된 고분자의 단량체의 구성비를 조절할 수 있으며, 개시제의 양 조절을 통해 다양한 온도에서 하한 용액 임계 온도 특성을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 또 다른 구체예로서, 표면 증강 라만 산란 분석용 유무기 복합체 기판을 이용하여 수용액 상에서 분석물질을 검출하는 것을 특징으로 하는 표면 증강 라만 산란 분석방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서는 말라카이트그린(malachite green, MGITC)을 대상으로 분석을 수행하였다.
특히, 상기 분석방법은 상기 기판 내 존재하는 라만 염료에 의해 유도된 표면 증강 라만 산란에 의한 일정한 내부 표준 신호(Internal standard signal)를 기준으로 비교분석할 수 있어 효과적이다.
그리고, 상기 기판은 하한 용액 임계 온도 이하에서 넓은 표면적의 금나노입자를 통하여 malachite green isothiocyanate(MGITC)이 0.48~4.8ppm 의 농도로 존재하는 경우에 즉, 0.48ppm의 극미량의 경우에도 검출이 가능하므로, 더욱 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
실험 재료
본 발명의 실험재료로, 골드(III) 클로라이드 하이드레이트(Gold(III)chloride hydrate), 소듐 사이트레이트 트리베이직 디하이드레이트(Sodiumcitratetribasicdihydrate), 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설포닉에시드 헤미소듐 설트(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid hemisodium salt(HEPES)), 로다민 B 이소티오시아네이트(RBITC), 소듐하이드록사이드(SodiumHydroxide), N- 이소프로필아크릴아마이드 NIPAM(N-isopropylacrylamide), 알릴아민(Allyamine), 아조비스 사이아노 발레익 에시드(ACVA), 하이드로클로릭 에시드(Hydrochloric acid), t-뷰탄올(t-butanol), 디 터트 뷰틸 디카보네이트(t-boc), N-(2-아미노에틸)말레이미드 트리 플루오로아세테이트 설트(N-(2-aminoethyl)maleimide trifluoroacetate salt), 1,6-헥산디티올(1,6-hexanedithiol), 포스페이트 버퍼(phosphate buffer), 말라카이트그린 이소티오시아네이트(Malachite green isothiocyanate) 및 소듐 하이드록사이드 등이 사용될 수 있다.
그리고, 이하의 실시예들은 표면증강 라만 산란 기판의 제조 방법과 관련되는 실시예들로서 각 단계를 설명한 것이다. 이하의 단계들은 어느 하나의 단계가 다른 단계들에 우선적으로 수행될 수 있으며, 어느 하나의 단계가 생략될 수도 있다.
실시예
1-1 :
알릴암모늄
클로라이드의 합성
N-이소프로필아크릴아마이드와 알릴아민의 반응 활성을 증가시키기 위해 알릴 아민을 알릴암모늄 클로라이드로 합성하여 주었다. 4℃의 아이스 배스에서 염산 28.11ml에 알릴아민을 22.41ml 천천히 떨어뜨려 주었다. 떨어뜨린 뒤 80의 회전식 진공 증발기에 넣어 용액들을 제거하여 주었다.
실시예
1-2 : 폴리(N-
이소프로필아크릴아마이드
-
co
-
알릴아민
)의 공중합체 중합.
폴리(N-이소프로필아크릴아마이드-co-알릴아민) 공중합체는 N-이소프로필아크릴아미드와 알릴암모늄 클로라이드의 자유 라디칼 중합을 통하여 만들어질 수 있다.
N-이소프로필아크릴아미드 2.83 g(0.025 mol) 과 알릴암모늄 클로라이드 0.78 g(0.00625 mol) 그리고 디에틸 포스페이트 0.020 g(0.4 mol%) 를 t-뷰탄올 25ml에 녹여 혼합 용액 A를 만들었다. 용액 B는 개시제 아조비스 사이아노 발레릭 에시드(ACVA) 0.2 mol% 를 2.5ml t-뷰탄올에 녹여 만들었다. 용액 A는 250 ml 삼구 둥근바닥 플라스크에 넣고 질소 가스로 10분간 버블링 해 주었다. 삼구 둥근바닥 플라스크를 항온수조에 넣고 83℃로 가열하였다. 83℃로 가열된 플라스크에 용액 B를 유리 주사기를 이용해 빠르게 넣어주고, 24시간에서 36시간 반응시켜 주었다. 반응을 끝내고 냉각 시킨 뒤 에틸 아세테이트를 이용해 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드-co-알릴아민)을 침전시켜 여과한 뒤, 80℃에서 18시간동안 말려주었다.
실시예
1-3 : 디
터트
뷰틸
디카보네이트(t-boc)를
이용한 폴리(N-
이소프로필아크릴아마이드
-
co
-
알릴아민
)의
아민기
보호(
protection
)
공중합체 10 mmol을 10ml t-뷰탄올과 증류수의 1:1 혼합액에 녹여준 뒤, 소듐 하이드록사이드를 이용하여 pH8-9에 맞춰 주었다. 11 mmol의 디 터트 뷰틸 디카보네이트(t-boc)를 첨가하고 상온에서 16시간 반응시켜주었다. 회전식 진공 증발기에 넣어 용매를 제거하고 ITC를 이용하여 세척하여 주었다.
실시예
1-4 : N-(2-
아미노에틸
)
말레이미드
트리
플루오로아세테이트
설트(N-(2-aminoethyl)maleimide
trifluoroacetate
salt
)와 고분자의 결합
공중합체 10 mmol을 증류수 10ml에 녹여준 뒤, EDC 10 mmol과 NHS 10 mmol을 첨가하여 주었다. 1시간 동안 상온에서 반응시키고 N-(2-아미노에틸)말레이미드 트리 플루오로아세테이트 설트 10 mmol을 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시켜 주었다. 반응이 끝난 공중합체를 ITC를 이용하여 3회 세척하여 주었다.
실시예
1-5 : 폴리(N-
이소프로필아크릴아마이드
-
co
-
알릴아민
)의
아민기를
보호(
protection)하고있는
디
터트
뷰틸
디카보네이트(t-boc)의
제거(
deprotection
)
공중합체 10 mmol을 10 ml의 6M 염산에 넣어 1시간 동안 반응시켜 주었다. 반응이 끝난 뒤 이산화 탄소를 제거하고, 회전식 진공 증발기에 넣어 용매를 제거한 다음 ITC를 이용하여 3회 세척하여 주었다.
실시예
2 : 별 모양의
금나노입자
합성
4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설포닉에시드 헤미소듐 설트(HEPES) 0.952g을 40ml 증류수에 녹인 뒤 1M 소듐 하이드록사이드 용액을 이용하여 pH 7.4±0.1에 맞춰 주었다. 만들어진 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설포닉에시드 헤미소듐 설트 10 ml와 증류수 15 ml를 섞어 혼합액을 만들고, 10 mM 골드(III) 클로라이드 하이드레이트(Gold(III)chloride hydrate)를 첨가하여 주었다. 흔들지 않고 1시간동안 반응시키면 밝은 노란색에서 보라색 어두운 파란색으로 색이 변화한다.
실시예
3-1 : 금
마이크로어레이
기판의 제조
글래스 기판을 SPM(황산 : 과산화수소 = 4 :1)과 SC-1(암모니아수 : 과산화수소 : 증류수 = 1 : 1 : 5)를 이용하여 세척한 다음 티타늄을 글래스 기판 위에 스퍼터링(Sputtering)하였다. 감광액을 3000rpm에서 30초동안 스핀코팅(spin coating)하였다. 1분동안 365<λ<436파장의 빛을 50 mJ/cm의 세기로 조사하여 주었다. 금 박막을 기판위에 올리고 TMPS를 이용하여 30분동안 소수성 코팅을 해 주었다. 아세톤에서 초음파를 이용하여 감광액을 제거하고 아세톤과 증류수를 이용하여 세척하였다.
실시예
3-2 : 금
마이크로어레이
기판에서 1,6-
헥산디티올(1,6-hexandithiol)의
자가조립
1,6-헥산디티올 5 mM의 용액을 에탄올에 50ml 준비하였다. 금 마이크로 어레이 기판을 1,6-헥산디티올 용액에 넣고 20시간동안 반응시켜 주었다. 자가조립이 끝난 뒤 용액을 제거하고 에탄올로 3회 세척하여주었다.
실시예
4-1 : 금
마이크로어레이
기판과 공중합체의 결합
공중합체 0.1g을 pH7.4 포스페이트 버퍼(phosphate buffer)에 녹인 뒤 금 마이크로 어레이 기판의 각각의 스팟에 5 l 씩 떨어뜨리고 교반기(shaker)를 이용하여 4시간 동안 동적으로 결합하여 주었다. 결합이 끝난 기판은 증류수로 3회 세척하여 주었다.
실시예
4-2 : 공중합체와 별 모양의 금 나노입자의 이온 결합
0.6 w/v% 금 나노입자 용액을 공중합체가 결합된 금 마이크로어레이 기판의 스팟에 각각 5 μl씩 떨어뜨리고 교반기(shaker)를 이용하여 1시간 동안 동적으로 결합하여 주었다. 결합이 끝난 기판은 증류수로 3회 세척한 뒤 라만 스펙트럼을 측정 하였다.
실시예
5 : 자극 반응성 고분자의 하한 용액 임계 온도 조절
중합된 고분자의 하한 용액 임계 온도는 도 3에 나타냈다.
중합 개시제의 양, 모노머의 종류, 모노머의 양, 반응시간 등의 조절함에 의해 쉽게 하한 용액 임계 온도를 조절할 수 있다.
이에, 다양한 파라미터중 모노머의 중합 비율에 따라 나타나는 하한 용액 임계 온도의 특성을 조사하였다. 폴리(N-이소프로필 아크릴아마이드-co-알릴아민)의 성공적인 중합은 도3 (a), (b)의 HNMR 스펙트럼을 통하여 확인하였다. 폴리(N-이소프로필 아크릴아마이드)의 하한 용액 임계 온도의 약 30~35℃에서 나타나게 되지만, 폴리(N-이소프로필 아크릴아마이드-co-알릴아민)의 하한 용액 임계 온도는 약 40℃ 이상에서 나타난다. 알릴아민의 비율에 따라 다른 하한 용액 임계 온도가 나타남을 도3 (c), (d)를 통해 알 수 있었다.
실시예
6 :
금나노
입자 및 자극 반응성
SERS
기판의 라만 신호 측정
SERS 기판의 제조 중 별 모양의 금나노 입자의 라만 신호 측정은 도 4 (e)에 나타냈다.
RBITC 농도를 최적화시켜 HEPES 버퍼를 통해 제조된 별 모양의 금 나노입자의 라만 신호가 최대가 되도록하였다. 상기 별 모양의 금 나노입자의 라만 신호는 구, 삼각형, 막대, 큐브 형태등의 다른 모양의 금 나노입자보다 강한 라만 신호가 나타난다. RBITC가 금 나노입자에 결합되는 메커니즘은 RBITC의 -N=C=S작용기중 사이올과 희귀금속이 단단하고 쉽게 공유결합을 하는 원리이다.
자극 반응성 SERS 기판의 라만 신호 측정은 도 5 (c)에 나타냈다.
상기 자극 반응성 SERS 기판내에서 일어나는 다른 메커니즘은, 고분자에 결합된 금 나노입자들의 거리가 감소함에 따라 자유 전자의 집단적 진동을 유도하는 핫스팟(hot spot)을 형성하여 보다 강한 표면 증강 라만 신호를 얻을 수 있다. 금 나노입자들의 거리가 감소하는 원리는 열적 반응성을 가지는 고분자의 주변온도가 하한 용액 임계 온도 이상일 때 서로 고분자의 사슬이 서로 응집되는 것이다. 하한 용액 임계 온도 이하에서 낮은 표면 증강 라만 신호를 얻을 수 있었고, 하한 용액 임계 온도 이상에서 강한 표면 증강 라만 산란 신호가 나타남을 알 수 있었다.
실시예
7 :
말라카이트
그린 이소티오시아네이트 흔적 검출
0.48ppm ~ 4.8ppm 범위의 다양한 농도를 가진 말라카이트 그린 이소티오시아네이트의 용액을, 3:1의 부피비로 물과 에탄올의 혼합물에서 준비하였다. 준비된 기판을 MGITC용액에 10분 동안 넣어 두었다. 상기 기판을 증류수로 3회 철저히 세척하고 라만 스펙트럼 분석에 사용하였다.
라만 스펙트럼은 633nm파장의 He/Ne 레이저에 10초의 노출시간동안 측정하였다. 모든 샘플들은 라만 현미경의 동일 조건 하에서 분석하였다. 분석물의 검출 전, 기판의 다양한 스팟에서 균일한 SERS 신호가 확인되었다.
다양한 농도의 분석물의 용액에서 검출된 SERS 스펙트럼을 기판의 오리지널 스펙트럼과 비교하였다. 각 샘플을 5회 이상 측정하였고, SERS 스펙트럼 결과의 평균을 구하였다. MGITC용액의 농도의 증가로부터 발생하는 1621cm-1에서 라만 강도는 RBITC로부터 발생하는 1646cm-1에서의 라만 강도와 비례적으로 증가하는 것을 나타냈다.
에탄올과 물의 혼합물에서 MGITC는 쉽게 기판 내로 확산되고 SERS 신호를 생성하는 나노입자의 표면에 흡착된다. 나노입자의 표면에 흡착된 후 다양한 농도의 MGITC로부터 생성되는 라만 신호를 측정하여 나타냈다. 수용액 상태에서 MGITC의 0.48 ppm 농도까지 민감하게 검출되었다. RBITC피크는 내부 표준 신호로 사용하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, MGITC 피크 강도는 농도에 따라 증가하였고, 이를 통해 농도와 라만 강도 사이에 선형 관계(linear relation)가 존재함을 확인하였다.
RBITC의 라만 신호가 일정하게 유지되는 것은 용액 내에서 확산되지 않고 있는 안정성을 의미한다. RBITC의 일정한 영역은, 점차적으로 증가하는 MGITC의 일정 영역과 비교될 수 있고, 다양한 조건 아래 MGITC 스펙트럼에서 상이한 강도에 의해 야기되는 에러를 제거하기 위해 내부 표준 신호로서 사용되었다. 높은 재현성있는 정량적 결과를 얻기 위해 분석물 하나만 사용하는 대신 일정한 내부 신호에 대해 증가하는 SERS 신호의 비율이 중요함을 알 수 있었다.
이상 본 발명자에 의해서 이루어진 발명을 상기 실시 예에 따라 설명하였지만 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것은 아니고 그 요지를 이탈하지 않는 범위에서 여러 가지로 변경 가능한 것은 물론이다.
Claims (7)
- 티타늄층이 형성된 베이스 기판;
상기 티타늄층 상에 형성되는 금속 박막층; 및
상기 금속 박막층 상에 형성되고, 이방성(antisotropic)의 금속 나노 입자와 열적 반응성이 있는 고분자가 결합되는 결합층을 포함하고,
상기 고분자는 하한 용액 임계 온도를 가지며, 말단에 도입된 작용기에 의해 개질되어 적어도 일 단부가 상기 금속 박막층에 결합되고,
상기 금속 나노 입자들은 이온 결합에 의해 상기 고분자의 적어도 일부에 결합되는 것을 특징으로 하는 표면증강 라만 산란 기판. - 제1항에 있어서, 상기 이방성 금속 나노 입자 사이의 거리를 자극반응성이 있는 고분자를 이용하여 조절함으로써 표면-증강 라만 산란 신호의 증폭을 특징으로 하는 표면증강 라만 산란 기판.
- 제1항에 있어서,
상기 결합층의 고분자들은 각각,
제1 단량체와 제2 단량체가 자유 라디칼 중합반응에 의해 형성되는 공중합체를 포함하고,
상기 제1 단량체는 자극 반응성을 가지는 폴리(N-이소프로필 아크릴아마이드)[poly(N-isopropylacrylamide), 폴리(비닐카프로락탐)[poly(vinylcaprolatame)], 폴리(N,N-디에틸아크릴아마이드)[poly(N,N-diethylacrylamide)], 폴리(에틸렌 글라이콜)[poly(ethylene glycol)], 폴리(에틸렌 옥사이드)[poly(ethylene glycol)]로 구성된 군으로부터 선택되고,
상기 제2 단량체는 금속 나노 입자와 반대 전하를 띄는 폴리(알릴아민)[poly(allylamine)], 폴리라이신[polylysine], 키토산[chitosan], 폴리(아크릴릭에시드[poly(acrylic acid)]으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표면증강 라만 산란 기판. - 제3항에 있어서,
상기 결합층의 금속 나노 입자는,
금, 은, 구리, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표면증강 라만 산란 기판. - 제4항에 있어서,
상기 금속 나노 입자의 단면 형상은 막대, 삼각형, 사각형 또는 별 중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 표면증강 라만 산란 기판. - 제4항에 있어서,
상기 금속 나노 입자에 내부표준신호로 사용되고, 금속 나노 입자와 반대 전하를 가지는 라만 염료가 결합되고,
상기 라만 염료는 로다민6G, 로다민 이소티오시아네이트(RBITC), 아데닌, 4-아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-플루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 6-머캅토 퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리미딘, 8-머캅토아데닌, 및 9-아미노-아크리딘 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 표면증강 라만 산란 기판. - 베이스 기판에 티타늄층과 금속 박막층을 형성하는 준비단계;
자유 라디칼 중합반응에 의해 형성되는 공중합체를 상기 금속 박막층 상에 떨어뜨린 후 교반시켜 상기 공중합체의 말단 작용기를 이용하여 상기 공중합체를 상기 금속 박막층에 결합시키는 제1 교반단계; 및
이방성(antisotropic)의 금속 나노 입자들을 상기 공중합체가 결합된 금속 박막층 상에 떨어뜨린 후 교반시켜 상기 금속 나노 입자들을 상기 공중합체에 이온결합을 통해 결합시키는 제2 교반단계를 포함하고,
상기 공중합체는 열적 반응성이 있는 고분자를 포함하는 표면증강 라만 산란 기판의 제조 방법.
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