KR101956262B1 - 자극 반응성을 가진 그래핀 옥사이드에 기초한 고분자 브러시-금속나노입자 클러스터 유무기 복합체, 제조방법, 및 표면 증강 라만 산란에 기초한 바이오센싱 및 바이오이미징 나노 프로브로의 응용 - Google Patents

자극 반응성을 가진 그래핀 옥사이드에 기초한 고분자 브러시-금속나노입자 클러스터 유무기 복합체, 제조방법, 및 표면 증강 라만 산란에 기초한 바이오센싱 및 바이오이미징 나노 프로브로의 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자극 반응성을 가진 그래핀 옥사이드에 기초한 고분자 브러시-금속나노로드 클러스터 유무기 복합체 및 이를 이용한 표면증강라만 산란에 기초한 바이오센싱 기술에 관한 것이다. 본 발명에 따른 SERS 기반 바이오센싱 및/또는 바이오이미지 측정용 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터는, 온도 반응성 고분자인 NIPAA의 상 전이에 의해, 그래핀 옥사이드와 금속 나노로드를 서로 가깝게 재배열시키고, 그래핀 옥사이드 표면에 존재하는 금속 나노로드의 밀도를 증가시켜, 라만 신호를 보다 향상시킬 수 있었다. 또한, 상기 클러스터에 기반한 샌드위치형 면역복합체는, 역시 상기와 마찬가지로 온도 반응성을 나타내며, 라만 신호의 강도와 검출 대상 분자의 농도간 선형 비례 관계를 보여주어 검출 민감도가 매우 우수함을 알 수 있었다. 따라서 본 발명은 스마트 바이오센싱 및 바이오이미징 분야의 핵심 기술로 이용될 수 있을 것이다.

Description

자극 반응성을 가진 그래핀 옥사이드에 기초한 고분자 브러시-금속나노입자 클러스터 유무기 복합체, 제조방법, 및 표면 증강 라만 산란에 기초한 바이오센싱 및 바이오이미징 나노 프로브로의 응용 {Stimuli-responsive Graphene Oxide-based Polymer Brush and Metallic Nanoparticle Clusters as Inorganic-organic Composite Nanoprobes for Surface Enhanced Raman Scattering-based Biosensing and/or Bioimaging, and the Method Thereof}
본 발명은 자극 반응성을 가진 그래핀 옥사이드에 기초한 고분자 브러시-금속 나노로드 클러스터 유무기 복합체 및 이를 이용한 표면 증강 라만 산란에 기초한 바이오센싱 기술에 관한 것이다.
자극-반응성 나노구조체는 입체 상태의 상 전이에 의해 물리적 또는 화학적 자극에 반응한다. 이러한 나노구조체의 변화는, 바이오 엑추에이터, 화학적 센서, 생물 친화적 어세이, 조직 공학, 및 약물 전달 등과 같은 다양한 응용 분야로의 적용을 가능하게 한다. 자극 반응성 폴리머가 플라스몬 나노구조 표면에 결합하게 되면, 플라스몬 나노구조의 3차원 형태로부터 전자기적 특성이 나타나며, 이는 국부 유전 환경을 조작하여 플라즈몬 나노구조의 민감도를 향상시킨다. 결과적으로, 플라즈몬 반응을 조절할 수 있게 되고, 가역적인 성격의 잘-조절된 플라즈몬 시스템은, 자극-반응성 나노구조체 및 플라즈몬 나노구조체의 개발로 이어질 수 있다.
최근, 그래핀 옥사이드와 고분자간 직접적인 혼합 또는 조합은 수많은 연구들을 통해 보고되고 있다. 다만, 고분자를 이용한 그래핀의 직접 기능기화 등에 대한 연구는 개발 초기 단계에 있는바, 밀도, 모양, 로딩된 형태가 효과적으로 제어되는 안정한 그래핀 콜로이드를 제공하기 위한 기술은 여전히 해결하여야 할 과제 중 하나이다. 그래핀 옥사이드 표면에 구조체를 로딩하기 위한 부착 전략은 크게 (1) 비-공유 결합에 의한 부착 및 (2) 공유 결합에 의한 부착으로 분류될 수 있다. 첫번째 방법은 정전기력, 수소결합, 반데르 발스 상호작용, 방향족 분자의 양이온-π, 및 π-π 스테킹과 같은 비공유 상호작용을 이용하는 것으로서, 수행하기 쉽고, 그래핀의 물리적, 전기적 특성에 미치는 영향을 최소화시킬 수는 장점이 있다. 반면, 그래핀 및 이들의 유도체의 기능기화를 위한 공유 결합 방법은, 분자의 기능기와 산소를 포함하는 작용기간 반응에 의존하며, 이러한 결합 전략은 ex-situ 부착으로도 일컫는 "grafting to" 기술, in-situ 부착으로 일컫는 "grafting from"으로 분류된다. 상기 "grafting to" 기술은 그래핀에 도입된 기능기에 미리 제조된 중합체 사슬을 화학적으로 부착시킨다. 예를 들어, "grafting to" 기술은 에스터화를 통해 그래핀을 poly (vinyl alcohol)로 개질시키고, 이러한 그래핀의 개질은 극성 유기 용매에 대한 보다 우수한 용해도와 안정성을 제공한다. 유사하게, 우수한 용해도와 함께 보다 나은 전기적 전도도를 제공하는 니트렌 화학에 의해, 그래핀 상에 다른 형태의 기능기 모이어티 또는 중합체를 고정화시키는 기술이 개시된 바 있다. 반면, "grafting from" 기술은, 그래핀의 표면에 개시재를 부착시킨 다음, 테더링된 폴리머 사슬을 생성하기 위한 표면-개시된 폴리머화 과정을 포함한다. 그래핀 유래 그래프트 폴리머는 외부 자극에 반응하게 하는 훌륭한 방법이며, 이전의 보고에 따르면, 이러한 그래프트화는 그래핀의 용해도, 안정성 및 그 밖의 특성을 향상시킬 수 있다.
전술한 공유 결합에 의한 부착을 위하여, 자유 라디칼 중합, 원자 이동 라디칼 중합 (ATRP), 양이온 그래프트 및 음이온 그래프트 등의 다양한 폴리머화 기술이 사용될 수 있다. 이들 중에서, ATRP는 단순하고, 라디컬 폴리머화의 장점인 1) 신속한 개시 공정과 2) 성장 또는 비성장 중인 라디컬간 동적 균형을 제공하기 때문에 널리 이용되고 있다. 또한, 블록 공중합체는 리빙 라디컬 반응으로 인해 ATRP에 의해 합성될수 있고, 말단 알킬 할라이드는 고전적인 유기 합성 경로를 사용하여 여러 종류의 기능기로 변형될 수 있다. 예를 들면, ATRP 개시제 분자는 먼저 그래파이트 산화물에 부착되고, GO의 표면에 poly[2-(dimethylamino) ethyl methacrylate] (PDMAEMA) 사슬을 성장시키기 위하여, in situ ATRP 중합을 수행함으로써 용해도를 향상시킬 수 있다. 또 다른 연구에서는 하이드록시 기를 이용하여 그래핀 옥사이드에 ATRP 개시제를 부착시키고, 메틸 메타크릴레이트, 부틸아크릴레이트, 및 스티렌 중합체를 그래핀 옥사이드상에 테더링시키기 위한 표면 개시 중합을 수행하였다.
최근, 미량 성분 분석 및 검출을 위한 강력한 수단인 표면 증감 라만 산란 (SERS)은 SERS 효과를 조절하는 주요 원리에 대한 부족한 지식에도 불구하고, 점점 더 많은 주목을 받고 있는 실정이다. 그러나, 두 가지의 기본 메커니즘, 즉, 화학적 메커니즘 (CM) 및 전자기 메커니즘 (EM)이 높은 SERS 신호에 관여한다는 점은 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 CM은 제1층의 전하-이동 공명에 의해, 신규한 금속 나노구조체에 흡착된 분석물의 반응에 따라 유발된다. 반면, EM의 증강은 라만 염료의 전이 모멘트가 상기 금속 나노구조체 상에 처리된 레이져에 의해 생성된 표면 플라즈몬 전자기장과 결합함으로써 발생한다. 한편, p(NIPAAm-co-AA)와 같은 열에 민감한 폴리머는 액체 상태에서 하한 임계 용액 온도 (LCST) 이하에서 상전이가 일어나기 때문에, 임계온도는 나노구조체간 간격을 조절할 수 있는 폴리머의 구성 변화를 개시한다. 하한 임계 용액 온도 이하에서 p(NIPAAm-co-AA)는 수용성인 반면, 하한 임계 용액 온도 이상에서는 비수용성이다. 즉, 하한 임계 용액 온도 이하에서 팽창되며, 그 이상에서는 수축한다. 이러한 중합체의 수축과 팽창은 금속 나노 구조체간 간격을 조절하며, 이에 따라 SERS 신호 강도를 조절할 수 있을 것이다.
이러한 기술적 배경 하에서, 자극-반응성 폴리머를 기반으로 하는 바이오센싱 또는 바이오이미징 기술에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나 (한국 공개특허 10-2011-0099711호), 아직은 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 NGO (Nanoscale graphene oxide)의 표면을 poly(NIPAAm-co-AAc) 랜덤 공중합체 또는 poly(NIPAM-b-AAc) 블럭 공중합체로 개질함으로써, SERS 기반 바이오센싱 및/또는 바이오이미지 측정용 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터를 제조하였다. 특히, poly(NIPAM-b-AAc) 블록 공중합체를 이용한 표면 개질은 "Grafting from" 또는 "Grafting to" 기술을 적용하였으며, 전자의 경우 그래핀 옥사이드 표면에 결합되는 공중합체의 밀도를 용이하게 조절할 수 있고, 후자의 경우 그래핀 옥사이드 표면에 결합되는 공중합체의 사슬 길이를 용이하게 조절할 수 있다는 장점이 있다. 한편, 상기와 같이 제조된 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터는, 온도 반응성 고분자인 NIPAA의 상 전이에 의해, 그래핀 옥사이드와 금속 나노로드를 서로 가깝게 재배열시키고, 그래핀 옥사이드 표면에 존재하는 금속 나노로드의 밀도를 증가시켜, 표면 증강 라만 산란 신호를 보다 향상시킬 수 있었다.
이뿐만 아니라, 본 발명자들은, GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO가 생물학적 검출에 유용하게 적용될 수 있는지를 확인하고자, SERS 나노 프로브인 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO, 및 자성 기반의 분리를 위한 자성 비드(MB)로 이루어진 샌드위치형 면역복합체를 제조하였다. 이들은 라만 신호의 강도와 IgG 농도간 선형 비례 관계를 보여주었으며, 이 역시 하한 임계 용액 이상의 조건 (45℃)에서 라만 신호 강도가 크게 증폭되었다. 따라서, 이러한 온도 반응성을 지닌 SERS 기반 나노 프로브 또는 샌드위치형 면역복합체는, 스마트 바이오센싱 및 바이오이미징 분야의 새로운 가능성을 제시하였다.
이에, 본 발명의 목적은, 온도 반응성을 갖는 SERS 기반 바이오센싱 및/또는 바이오이미지 측정용 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은, 온도 반응성을 갖는 SERS 기반 바이오센싱 및/또는 바이오이미지 측정용 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터 구조의 SRES 나노 프로브 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은, 상기 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터를 이용한 바이오센싱 및/또는 바이오이미징 방법을 제공하는데 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 음전하성 고분자 및 온도 반응성 고분자로 이루어지는 공중합체로 표면 개질된 그래핀 옥사이드; 및 상기 공중합체의 음전하성 고분자와 정전기적 상호작용으로 결합되며, 라만 리포터가 부착되어 있는 금속 나노로드 (Gold nanorod)를 포함하는, 표면 증강 라만 산란 (SERS) 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "바이오센싱 또는 바이오이미지"은 생물학적 물질을 감지 또는 검출하고, 이를 이미지화시키는 것을 의미한다. 본 발명자들은, 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정을 위한 새로운 SERS 나노구조체를 개발하기 위하여, 나노 크기의 그래핀 옥사이드의 표면에 음전하를 띄는 온도 반응성 공중합체를 도입한 뒤, 상기 음전하 구획에 라만 리포터가 부착되어 있는 금속 나노로드를 결합시킴으로써, 표면 증강 라만 산란 신호가 향상된, 고감도 나노프로프 또는 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터를 개발하였다.
본 발명에서 사용되는 용어, "금속 나노로드 클러스터"는, 다수의 금속 나노로드들이 모여서 형성된 응집물 (aggregates)을 일컫는 것으로서, 이 기술 분야에서 통용되고 있는 용어이다. 본 발명에서, 나노 크기란, 이 기술 분야의 통상의 기술자들이 이해하는 정도의 크기 범위를 포함한다. 구체적으로 나노 크기는 0.1 내지 1000 nm일 수 있고, 바람직하게 10 내지 1000 nm, 더욱 바람직하게는 20 내지 500 nm, 가장 바람직하게는 50 내지 250 nm 일 수 있다.
본 발명에서, "음전하성 고분자"는, 공중합체의 특정 부분 또는 구획에 음전하를 부여하는 역할을 하며, 양전하를 띄는 금 나노로드가 공중합체에 결합될 수 있는 정전기적 상호작용의 근원이 된다.
상기 음전하성 고분자는, 폴리(아크릴릭 액시드)[poly(acrylic acid)], 폴리(메타크릴릭 액시드)[poly(metacrylic acid)], 폴리(이타코닉 액시드)[poly(itaconic acid)], 및 폴리(말레익 액시드)[poly(maleic acid)]일 수 있으며, 바람직하게 폴리(아크릴릭 액시드)일 수 있으나, 공중합체에 음전하를 부여할 수 있는 고분자라면, 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에서, "온도 반응성 고분자"는 온도에 반응하여 그 특성이 변화되며, 상기 온도는 하한 임계 용액온도 이상의 조건을 의미하며, 상기 특성은 하한 임계 용액 온도 이상에서 상 전이에 따른 응집 또는 수축을 의미한다. 온도 반응성 고분자의 응집 또는 수축이 발생하게 되면, 상기 음전하성 고분자에 결합되어 있는 금속 나노로드와 그래핀 옥사이드의 표면간 거리가 가까워지고, 이에 따라 그래핀 옥사이드 표면 상에 위치하는 금속 나노로드의 밀도가 증가하게 된다. 궁극적으로, 이러한 일련의 변화는 표면 증강 라만 산란 (SERS) 신호의 강도 향상으로 이어진다. 상기 온도 반응성 고분자는, 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)[poly(N-isopropylacrylamide): polyNIPAM], 폴리(N-디에틸 아크릴아마이드)[poly (N,N'-diethyl acrylamide): polyDEAAm], 폴리(디메틸아미노 에틸 메타크릴레이트)[poly (dimethylamino ethyl methacrylate): polyDMAEMA], 폴리(N-하이드록시메틸 프로필 메타아크릴아마이드)[poly (N-(L)-(1-hydroxymethyl) propyl methacrylamide)], 폴리[올리고(에틸렌글리콜)메틸에테르메타크릴레이트] [Poly[oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate]: POEGMA], 폴리(2-비닐 피리딘)[poly(2-vinyl pyridine): P2VP], 또는 폴리(4-비닐 피리딘) [poly(4-vinyl pyridine): P4VP]일 수 있으며, 바람직하게 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)(본 명세서에서는 poly(NIPAA) 또는 poly(NIPAM)로 기재함.)일 수 있으나, 온도에 반응하여 구조가 변화될 수 있는 고분자라면, 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 공중합체는 1) 그래핀 옥사이드 표면에 브러쉬 형태로 배치되어 있을 수 있고, 2) 상기 음전하성 고분자 및 온도 반응성 고분자로 이루어지는 랜덤 공중합체, 또는 블록 공중합체 형태로 마련될 수 있다. 특히, 블록 공중합체의 경우, 정전기적 상호작용에 의해 금 나노로드와 결합되는, 음전하성 고분자가 특정 부위에 조밀하게 배치되므로, 표면 증강 라만 산란 (SERS) 신호의 강도 향상에 보다 더 기여할 수 있을 것이다.
본 발명에서, "라만 리포터"는, 라만 활성 유기 화합물을 의미하며, 전술한 금 나노로드에 부착되어 그 기능을 발휘한다. 이 기술분야에서 널리 사용되는 것이라면 어느 것이나 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게, 로다민 6G, 로다민 B 이소티오시아네이트(RBITC), 아데닌, 4-아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 4-머캅토피리딘, 6-머캅토퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리민딘, 8-머캅토아데닌, 9-아미노-아크리딘 및 이들의 혼합물로부터 선택하여 사용될 수 있다. 상기 라만 리포터의 농도는 바람직하게, 10-8 내지 10-3M일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "금속"은, 바람직하게 금, 은, 구리 및 이들의 혼합물로부터 선택하여 사용될 수 있으나, 이 기술분야에서 널리 사용되고 있는 금속은 어느 것이나 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은, 음전하성 고분자 및 온도-반응성 고분자로 이루어지는 공중합체로 그래핀 옥사이드의 표면을 개질하는 단계; 및
상기 표면이 개질된 그래핀 옥사이드와 라만 리포터가 부착된 금속 나노로드를 혼합하는 단계를 포함하는, 표면 증강 라만 산란 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 표면 증강 라만 산란 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터의 제조방법은, 전술한 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터에서 기술한 바 있는 기술적 구성을 이용하기 때문에 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명에서, 상기 그래핀 옥사이드의 표면을 개질하는 단계는, 원자이동 라디컬 중합을 통해, 그래핀 옥사이드의 표면에 음전하성 고분자 및 온도-반응성 고분자로 이루어지는 공중합체를 결합시키는 것일 수 있다.
또한, 음전하성 고분자 및 온도-반응성 고분자로 이루어진 블록 공중합체의 경우, 상기 그래핀 옥사이드의 표면을 개질하는 단계는, 가역적 사슬 전달 중합을 통해 그래핀 옥사이드의 표면에 온도 반응성 고분자를 합성하고, 뒤이어, 가역적 사슬 전달 중합을 통해 그래핀 옥사이드의 표면에 결합된 온도 반응성에 음전하성 고분자를 합성하는 것일 수 있고 ("Grafting from" 방법); 또는 말레이미드기로 기능기화된 그래핀 옥사이드; 및 말단에 티올기가 도입된, 음전하성 고분자 및 온도-반응성 고분자로 이루어지는 공중합체를 반응시키는 것 ("Grafting to" 방법)일 수 있다.
상기 원자이동 라디컬 중합 및 가역적 사슬 전달 중합은 이 기술분야에서 널리 사용되고 고분자 합성 또는 중합 기술로서, 필요에 따라 적의 변경하여 실시할 수 있다.
한편, "Grafting from" 방법은 그래핀 옥사이드의 표면에 사슬 연쇄이동반응제 (chain transfer agent)를 먼저 도입한 뒤, 온도 반응성 고분자와 음전하성 고분자를 순차적으로 도입하는 것으로서, 그래핀 옥사이드 표면에 결합되는 공중합체의 밀도를 용이하게 조절할 수 있다는 장점이 있다. 반면, "Grafting to" 방법은, 말단에 티올기가 도입된, 온도 반응성 고분자와 음전하성 고분자로 이루어진 공중합체와 말레이드기로 기능기화된 그래핀 옥사이드간 말레이미드-티올 클릭 반응을 유도하는 것으로서, 그래핀 옥사이드 표면에 결합되는 공중합체의 사슬 길이를 용이하게 조절할 수 있다는 장점이 있다. 여기서 티올기의 도입은 아미노 분해를 통해 트리카보닐티오 기로부터 생성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은, 항원에 특이적인 항체가 컨쥬게이션된 자성 나노입자와 상기 항원을 반응시켜 자성 나노입자-항원 면역 복합체를 제조하는 단계;
상기 자성 나노입자-항원 면역 복합체와 상기 항원에 특이적인 항체가 컨쥬게이션된 상기 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터를 혼합하여 샌드위치형 면역 복합체를 제조하는 단계; 및
상기 샌드위치 면역복합체에 레이저광을 조사하여 표면 증강 라만 산란 신호를 측정하는 단계를 포함하는, 표면 증강 라만 산란 기반 바이오센싱 또는 바이오이미징방법을 제공한다.
본 발명에 따른 표면 증강 라만 산란 기반 바이오센싱 또는 바이오이미징 방법은, 전술한 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터에서 기술한 바 있는 기술적 구성을 이용하기 때문에 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
SERS 나노프로브로서 본 발명에 따른 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터와 자기장 기반 분리 도구인 자성 입자, 구체적으로 자성 비드(MB)를 포함하여 구성된 샌드위치형 면역복합체를 이용하여 다양한 생물학적 분자들을 검출할 수 있는 바이오센싱 응용을 증명하였다. 구체적으로, 항-인간 모노클론 항체(mAbs)가 -COOH기를 이용하여 MB와 화학적으로 컨쥬게이션되는 동안 항-인간 IgG 폴리클론 항체(pAbs)와 GNR-(NIPAAm-co-AAc)-NGO를 화학적으로 컨쥬게이션되었다. 항원으로 IgG가 존재하면서 GNR-(NIPAAm-co-AAc)-NGO-항원-MB 복합체가 형성되었다. 이들의 라만 세기와 IgG 농도 사이는 선형 상관관계를 나타내었으며, LCST 이상의 온도일 때의 신호가 LCST 이하일 때보다 더 낮은 농도의 항체를 측정할 수 있었고, 같은 농도에서는 더욱 강한 신호를 관찰할 수 있었다. 즉, 온도 반응성 고분자 도입에 따른 높은 온도에서의 검출 한계의 상승 및 SERS 신호의 증폭을 실험적으로 입증하였다.
한편, 상기 자성 나노입자에 컨쥬게이션된 항체는, 항원 특이적인 모노클론 항체일 수 있고, 상기 자성 나노입자에 컨쥬게이션된 항체는, 항원 특이적인 모노클론 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 SERS 기반 바이오센싱 및/또는 바이오이미지 측정용 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터는, 온도 반응성 고분자인 NIPAA의 상 전이에 의해, 그래핀 옥사이드와 금속 나노로드를 서로 가깝게 재배열시키고, 그래핀 옥사이드 표면에 존재하는 금속 나노로드의 밀도를 증가시켜, 라만 신호를 보다 향상시킬 수 있었다. 또한, 상기 클러스터에 기반한 샌드위치형 면역복합체는, 역시 상기와 마찬가지로 온도 반응성을 나타내며, 라만 신호의 강도와 검출 대상 분자의 농도간 선형 비례 관계를 보여주어 검출 민감도가 매우 우수함을 알 수 있었다. 따라서 본 발명은 스마트 바이오센싱 및 바이오이미징 분야의 핵심 기술로 이용될 수 있을 것이다.
도 1(A)는, 변형된 hummer 방법을 통해 천연 그래파이트로부터 NGOs를 제조하는 과정 및 상기 NGO의 표면을 poly(NIPAAm-co-AAc)로 개질하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이고, 도 1(B)는, GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO의 제조 과정 및 온도 자극에 따라 라만 신호가 향상되는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2(A)-(C)는, 초음파를 각각 1, 2, 또는 3시간 동안 처리한 후 NGO의 TEM 이미지이고, 도 2(D)는, 초음파 처리 시간에 따른 유체 내 NGO의 유체 역학 직경을 나타내는 것이다.
도 3은, 초음파 처리를 각각 1, 2, 또는 3시간 동안 처리한 후, NGOs의 UV-Vis 흡광도 프로파일 이다.
도 4(A)는, poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO의 TEM 이미지이고, 도 4(B)는, 비그래프트화된 NGO 및 poly(NIPAAM-co-AAc)로 그래프트화된 NGO의 DLS 프로파일이다.
도 5(A)는, 비그래프트화된 NGO 및 poly(NIPAAM-co-AAc)로 그래프트화된 NGO의 라만 스펙트럼이고, 도 5(B)는, NGO 및 poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO의 FTIR 플롯이며, 도 5(C) 및 도 5(D)는, 각기 다른 농도의 NIPAAm 및 AAc를 사용하여 제조된 poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO 내 poly(NIPAAm-co-AAc) 사슬에 대한 GPC 분석 및 UV-Vis 흡광도 프로파일이고, 도 5(E)는, DMSO-d6 상에서 그래핀 옥사이드로부터 분리된 사슬의 NMR 스펙트럼이다.
도 6은, (A) poly(NIPAAm-co-AAc)의 사슬 길이, (B) 라만 리포터의 농도, (C) 용액의 온도 변화에 따른 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO의 라만 스펙트럼이고, 도 6(D)는, GNR- poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO의 UV-Vis 흡광도 프로파일이다.
도 7은, GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO에서, MGITC 농도와 라만 신호의 강도간 상관 관계를 확인한 결과이다.
도 8 (A) 내지 (D)는, 제조된 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO의 SEM 및 TEM 이미지이고, 도 8(E) 및 (F)는, 각기 다른 배치 (N=5)를 사용한 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO의 라만 스팩트럼 및 시간에 따른 GNR-poly (NIPAAm-co-AAc)-NGO의 라만 스팩트럼이다.
도 9는, GNR-poly(NIPAAm-AAc)-NGO 및 MNP-봉입된 폴리머릭 자성 나노입자를 이용하여 제조된 샌드위치형 면역복합체의 형성과정 및 온도 자극에 따라 라만 신호가 향상되는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다
도 10(A) 및 (B)는, 자성 나노입자 및 5w/v% 자성 나노입자를 함유하는 용액의 TEM 이미지이고, 도 10(C)는, 자성 나노입자를 함유하는 폴리머릭 나노입자의 SEM 이미지이며, 도 10(D)는, 5w/v% 자성 나노입자를 함유하는 폴리머릭 나노입자를 함유하는 FITC-덱스트란에 대한 CLSM 이미지이다.
도 11(A)는, 각기 다른 배치 (N=5)를 사용하여 IgG 농도 및 온도에 따라 형성된 샌드위치형 면역복합체의 라만 스팩트럼이고, 도 11(B)는, 상기 샌드위형 면역복합체에서, IgG 농도와 라만 신호의 강도간 상관 관계를 확인한 결과이다.
도 12는, RAFT 폴리머화를 통해 그래핀 옥사이드 표면에 온도 반응성 및 음전하 블록을 지닌 poly(NIPAM-b-AAc)을 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 13(A)는, 그래핀 옥사이드의 표면에 사슬 연쇄이동반응제가 도입되었는지를 확인하기 위한 FT-IR의 스펙트럼이고, 도 13(B)는, 그래핀 옥사이드와 NGO-RAFT 및 poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 UV/Vis 흡광도 프로파일이며, 도 13(C)는, poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 TEM 이미지이다.
도 14(A)는, 고분자 브러시인 poly(NIPAM)과 poly(NIPAM-b-AAc)의 온도에 따른 UV/Vis 흡광도 프로파일이고, 도 14(B)는, pH에 따른 poly(NIPAM-b-AAc)의 하한 임계 용액온도 변화를 나타낸 것이며, 도 14(C)는, 그래핀 옥사이드로부터 절단된 사슬의 NMR 스펙트럼이다.
도 15는, GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 합성과 온도 의존적인 SERS 신호의 강도 향상 효과를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 16(A)는, MGITC의 농도와 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO로부터 발생하는 SERS 신호의 강도간 상관 관계를 확인한 결과이고, 도 16(B)는, MGITC의 농도 10-4 M에서, 금 나노로드와 poly(NIPAM-b-AAc)-NGO 질량 비율에 따른 SERS 신호를 측정한 것이며, 도 16(C)는, 하한 임계 용액온도 이하 또는 이상일 때 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 SERS 스펙트럼이다.
도 17(A) 및 (B)는, 각각 단일 금 나노로드와 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO 유무기 복합체의 TEM 이미지이다.
도 18(A) 및 (B)는, 각각 고분자 브러시의 하한 임계 용액온도 이상 또는 이하의 온도에서 IgG 농도에 따른 SERS 스펙트럼이고, 도 18(C)는 SERS 스펙트럼의 1650cm-1에서 IgG 항체 농도에 따른 SERS 신호의 변화를 확인한 결과이다.
도 19(A)는, RAFT 폴리머화를 통해 온도 반응성 및 음전하 블록을 지닌 poly(NIPAM-b-AAc)을 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이고, 도 19(B)는, 아미노 분해과정을 통해 트리카보닐티오 기가 티올기로 전환되는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 20은, EDC/NHC에 의해, 그래핀 옥사이드의 카르복시기가 말레이미드기로 기능기화되는 반응을 통한 poly(NIPAM-b-AAc)-NGO 합성 방법을 나타낸 것이다.
도 21(A)는, D2O에서 poly(AAc)의 1H NMR 스펙트럼이고, 도 21(B)는 DMSO-D6에서 poly(NIPAM-b-AAc)의 1H NMR 스펙트럼이며, 도 21(C) 및 (D)는 상기 poly(NIPAM230-AAc35) 및 poly(NIPAM260-AAc221)의 온도에 따른 UV/Vis 흡광도 프로파일이다.
도 22는, GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 합성과 온도 의존적인 SERS 신호의 강도 향상 효과를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 23(A)는, MGITC의 농도에 따른 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 SERS 신호의 강도간 상관 계를 확인한 결과이고, 도 23(B)는 MGITC의 농도 10-4 M에서, 금 나노로드와 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO 질량 비율에 따른 SERS 신호를 측정한 것이며, 도 23(C) 및 (D)는 하한 임계 용액온도 이하 및 이상일 때 고분자 블록 길이 조절에 따른 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 SERS 스펙트럼이다.
도 24(A) 및 (B)는, 각각 단일 금 나노로드와 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 TEM 이미지이다.
도 25(A) 및 (B)는, 각각 고분자 브러시의 하한 임계 용액온도 이상 또는 이하의 온도에서 IgG 농도에 따른 SERS 스펙트럼이고, 도 25(C)는, SERS 스펙트럼의 1650cm-1에서 IgG 항체 농도 및 온도에 따른 SERS 신호의 변화를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
Ⅰ.음전하를 지닌 온도 반응성 랜덤 공중합체 기반 나노구조 복합체
실시예 1. 실험 준비
1-1. 실험 재료
염화 금 (III) 수화물 (HAuCl4.3H2O), 그래파이트 파우더 황산 (H2SO4, 95-98%), 질산 나트륨 (98%), 과망간산 칼륨 (98%), 과산화수소 (H2O2, 30w/w%), 염산(HCl), 다이메틸포름아마이드(DMC), 무수 브롬화 구리 (CuBr), 2-브로모이소부틸브로마이드 N, N, N′, N′′, N′′-펜타메틸다이에틸렌트리아민 (PMDETA), 수산화 나트륨 (NaOH), N-이소프로필아크릴아마이드 (NIPAAm), 트리에틸아민 (TEA), 수소화 붕소나트륨 (순도 98.0%), 질산은, 및 아스코르빅 산이 사용되었다. 1-에틸-3-(3-다이에틸아미노프로필) 카르보다이이미드 (EDC), 무수 에틸렌 글라이콜 (EG) (99.8%), 수소화 붕소나트륨 (순도 98.0%), 염화 제2철 6수화물 (FeCl3·6H2O), 염화 제1철 4수화물 (FeCl2·4H2O), 수산화 나트륨 (NaOH), 수산화 암모늄 (NH4OH), 무수 시트릭 산 (CA) (≥99.0%), 염소로부터 생산된 항-인간 IgG (γ-chain specific) pAbs, 마우스로부터 생산된 항-인간 IgG (Fc-특이적) mAbs, 및 인간 혈청 유래 IgG는 Sigma-Aldrich로부터 수득하였다. Poly(acrylamide-co-acrylic acid), poly(AAm-co-AAc) (분자량 200 kDa, 10% 아크릴릭 산)은 Polysciences, U.S.로부터 수득하였다. A Millipore Milli-Q 탈 이온수가 모든 실험에 사용되었다.
1-2. 나노 크기의 그래핀 옥사이드 (NGO)의 제조
그래핀 옥사이드 (NGO)는 일부 변형시킨 개선된 hummer 방법에 의해 합성되었다. 대표적인 실험으로서, 0.5g의 그래파이트, 0.25g의 질산 나트륨 및 11.5ml의 황산을 둥근 바닥 플라스크에서 혼합하였다. 43.4mg/ml의 최종 그래파이트 농도에서 이를 10분 동안 강하게 교반시켰다. 반응 플라스크를 아이스 배스에 위치시키고, 과열되는 것을 방지하기 위하여 0.15g의 과망간산 칼륨을 약 15분에 걸쳐 점진적으로 첨가하여, 짙은 녹색 띄는 용액을 수득하였다. 온도를 35 ℃까지 상승시키고, 12시간 동안 격렬하게 교반시켰다. 아이스 배스를 워터 배스로 교체하고, 23ml의 증류수를 상기 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 1.21M의 HCl 산성 용액으로 3회 세척한 뒤, 다시 증류수로 3회 세척하였다. 다양한 크기의 NGO는 온/오프 펄스를 10/10초 간격, 30% 진폭 세기로 한 tip sonicator VC 505를 사용하여 0.5 내지 2시간 동안 초음파 처리를 수행하여 수득하였다 (Vibra-cell Sonics and Materials, Inc. U.S.). 대형 플레이크 및 비박리된 그래파이트를 분리하기 위하여, 생생된 산물을 8000g에서 5분동안 원심분리한 뒤, 침전물을 제거하였다. 100nm 크기의 NGO 단편을 수득하기 위하여, 2시간 동안 초음파 처리 후 수득한 0.2mg/ml의 NGO 용액을 아이스 배스에 위치시키고, 온/오프 펄스를 10/30초 간격, 40%의 진폭 세기로, 초음파 처리를 추가 1시간 동안 반복 실시되었다. 이 단계에서, 용액의 온도는 40 ℃ 이하가 되도록 유지하였고, 마지막으로 12000 rpm에서 10분 동안 고속 원심분리하였다. NGO를 포함하는 상층액을 추가 실험에 사용하였다.
1-3. 개시제로 기능기화된 그래핀 옥사이드 합성
0.1g의 NGOs, 15ml의 무수 DMF, 1ml의 TEA (7.16mm)를 함유하는 50ml의 2구 플라스크를 둥근 바닥 플라스크 내 위치시키고, 초음파 처리하여 균질한 분산액을 제조하였다. 1ml의 TEA (7.16mm)는 질소 가스로 2회 완전히 탈가스화시켰다. 이후, 3ml의 알파-브로모이소부티릴 브로마이드 (24mm)를 약 20분 동안 적가하였다. 생성된 용액을 2시간 동안 0℃에서 교반시켰고, 이후 실온에서 22시간 동안 다시 교반시켰다. 생성된 용액은 클로르포름 및 증류수로 세척하고, 비부착된 알파-브로모이소부틸 브로마이드를 제거하였으며, 이어서 밤새도록 동결 건조시켰다.
1-4. 원자이동 라디컬 중합 ( ATRP 중합)
Poly(NIPAAm-co-AAc)의 ATRP는 상기와 같이 제조된 개시제로 기능화된 그래핀 옥사이드를 사용하여 수행되었다. 전형적 과정으로서, 중합이 시작되기 전, 0.01 g의 개시제가 부착된 그래핀 옥사이드를 초음파 처리에 의해 5 ml의 무수 DMF에 균질하게 분산시켰고, 0.15 g의 CuBr (0.104 mM), 40 ul PMDETA (0.191mM), 10 ml의 DMF를 플라스크에 넣고 밀봉시켰다. 반응 플라스크를 3회 완전 탈가스화시키고, 격막으로 진공 밀봉한 다음, 25분간 질소로 퍼지시켜 산소를 제거하였다. 0.2 g의 NIPAAm 단량체 (1.76 mM), 20 ul의 아크릴릭 산 (0.277 mM), 10 ml의 DMF를 시린지를 이용하여 플라스크에 넣었다. 상기 플라스크를 65 ℃의 워터 배스에 24시간 동안 담가 보관하였다. 중합 반응을 정지시키기 위하여, 상기 혼합물은 에탄올 (20 ml)에 침전시키고, 세척하여 잔존하는 NIPAAm 단량체를 제거하였다.
1-5. 금 나노로드의 제조
금 나노막대 (GNR)는 기존의 프로토콜에 의해 제조되었다. 간단히 설명하면, 5.0 ml의 0.2 M CTAB 및 5.0 ml의 0.0005 M 염화 금 (III) 수화물을 유리 바이알 내에서 교반시키면서 혼합하였고, 이어서, 0.6 ml의 냉각된 0.01 M 수소화 붕소나트륨을 첨가하여 불그스름한 갈색을 띄는 용액을 수득하였다. 생성된 금 시드 (seeds) 현탁액을 2분 동안 교반시키고, 사용 전까지 보관하였다. 금 나노로드는, 5.0 ml의 0.2 M CTAB 및 0.250 ml의 0.004M 질산은을 혼합한 후, 5.0 ml의 0.001 M 염화 금 (III) 수화물 용액을 첨가하여 제조하였다. 계속적인 환원반응을 위하여, 0.07 ml의 0.0786 M L-아스코르빅 산을 적가하였다. 최종적으로, 0.012 ml의 시드 현탁액을 용액에 첨가하였다. 상기 반응은 27 ℃ 내지 30 ℃에서 20분 동안 계속 진행하였다.
1-6. 자성 비드의 제조
자성 비드의 제조는 2 단계로 이루어지며, 첫번째 단계는 자성 나노입자를 제조하는 단계, 두번째 단계는 전기유체 역학 분사에 의한 고분자 캡슐화 단계이다. 자성 나노입자는 기존에 보고된 방법에 의해 합성되었다. 간단히 설명하면, 3구 플라스크에서 0.86 g의 FeCl2 및 2.35 g의 FeCl3를 질소 조건 하 40 ml의 탈이온수에 혼합하였다. 온도를 80 ℃까지 상승시킨 뒤, 강하게 교반하면서 30분 동안 5 ml의 NH4OH를 30분 동안 첨가하였다. 물 20 ml 중 1 g의 CA를 혼합하고, 온도를 95 ℃까지 상승시킨 다음, 추가로 1시간 30분 동안 교반하였다. 고분자 캡슐화를 위하여, 준비된 자성 나노입자를 3회 세척하였다. 상기 자성 나노입자는 3:1 (v/v)의 비율의 탈이온수와 에틸렌 글리콜 (ethylene glycol; EG)의 혼합물에서 4.0w/v%의 poly(AAm-co-AAc)에 균질하게 현탁되었다. poly(NIPAAm-co-AAc)의 점도는 매우 높아서 EHD 분사 동안 안정적인 콘-제트 (Cone-jet) 모드를 유지할 수 있었고, EG는 평균 입자 직경을 증가시키지 않고, 용액의 점도가 증가되도록 하였다. 이후, 상기 자성 나노입자와 poly(AAm-co-AAc) 용액은 23 모세관 게이지를 지닌 1 ml 시린지(Becton-Dickinson, New Jersey, US)에 로딩되었다. 고전압 전원 NNC HV 30(Nano NC, Korea)의 양성 단자는 모세관에 연결되었고, 음성 단자는 알루미늄 호일(Fisherbrand, US)의 콜렉팅 기질(collecting substrate)에 연결되었다. 상기 두 전극 사이의 간격은 15-20 cm 범위였고, 마이크로 시린지 펌프 KDS-100 (Kd Scientific, U.S.)가 일정한 유속 유지를 위해 사용되었다. 전압은 10-15 kV로 설정되었고, 유량 (flow rate)은 0.08-0.13 ml/hr로 유지되었다. SEM(scanning electron microscopy) 및 공초점 레이저 스캔 현미경 이미지에 적합하도록, 건조 상태에서 작은 커버 글래스를 알루미늄 호일 위에 위치시켰다. 콜렉팅 기질 위의 자성 나노입자-캡슐화된 폴리머 나노입자를 175 ℃에서 6시간 동안 전기적으로 가열하여 폴리머 사슬의 열적 이미드화 (imidization)를 수행하면서 열적으로 가교시켰다. 상기 폴리머성 나노입자를 호일로부터 긁어낸 뒤, 증류수에 현탁시켰다.
1-7. GNR, poly(NIPAAm-co-AAc) -NGO 및 GNR - poly ( NIPAAm -co- AAc )-NGO의 특징 분석 방법
UV-Vis 흡광 분광법을 이용하여 GNR 및 poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO에 의해 매개되는 클러스터들의 광학적 성질을 분석하였다. 모든 UV-Vis 흡광 측정은, 실온에서 중간 스캔 속도인 싱글 10 스캔 모드로 너비 1 nm의 고정 슬릿을 가진 UV-1800 (Shimadzu, Japan)을 사용하여 300 내지 850 nm 파장의 범위에서 실시하였다. GNR, poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO 및 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO 콜로이드 용액의 특성을 이해하기 위하여, DLS (dynamic light scattering) 및 제타 전위 측정법 (zeta potential measurements)을, 633 nm의 파장, 90°의 스캐터링 각도를 지닌 Ne-He 레이저가 공급되는 Zetasizer Nano ZS instrument (Malvern Instruments, Malvern, UK)를 이용하여 수행하였다. 샘플은 10:1의 비율로 증류수에 희석되었다. TEM (transmission electron microscopy) 이미징은, 초박층 탄소로 코팅된 구리 그리드를 사용하여(Ted Pella Inc. U.S.) 200 kV 가속 전압에서 작동하는 투과 전자 현미경 JEM-2100F FE-STEM (JEOL, Germany)를 사용하여 개별 GNR 및 플라스몬 결합 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO를 조사하였다. 샘플 몇 방울을 실리콘 웨이퍼에 올려 두고 스캐닝 전자현미경을 이용하여 GNPs, poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO의 형태적 특징을 조사하였다. NGO의 절연 성질을 이용하여, 샘플을 K575X 터보 스퍼터 코터 (K575X Turbo Sputter Coater)를 사용한 백금 스퍼터링으로 코팅하고 0.5 내지 30 kV의 가속 전압에서 작동하는 SEM VEGA (TESCAN, USA)를 사용하여 이미지화하였다. TEM 이미지의 NGO 크기는 National Institutes of Health USA에서 개발한 Image-J 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 각각의 TEM 이미지는 노이즈를 최소화하기 위해 변형되었다. 수득한 TIF 이미지 포맷은 8비트 이미지 포맷으로 변환되어 바이크로매틱 이미지 (bichromatic image)가 되었다. 각각의 피사체를 더 정확하게 관찰하기 위하여, 임계값 (threshold)을 조정함으로써, 대비 (contrast)를 보다 강화시켰다. 최소 입자 크기는 노이즈를 피하기 위해 30 nm로 설정하였다. 또한, 라만 측정은 현미경 통합 시스템을 사용하여 라만 분광법(Raman Reinshaw 2000, Reinshaw, UK)으로 수행하였고, 홀로그래픽 노치 필터(holographic notch filter)를 사용하여, 수집된 스펙트럼으로부터 레일레이 선 (Rayleigh lines)을 제거하였다. 633 nm에서 여기된 He/Ne 레이저 빔으로 최고 레이저 파워에서 10초 노출로 라만 리포터인 MPY를 여기시켰다. 레이저 스팟은 20X 대물렌즈에서 가시광선을 이용하여 모세관에 집중시켰다.
1-8. 항체 부착
항원(Ags)으로 IgG 존재하는 경우, 샌드위치형 면역복합체를 형성하기 위하하여, SERS 나노 프로브인 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO를 항-인간 IgG-pAb와 결합시켰고, 반면에 자성 나노입자는 항-인간 IgG mAb와 결합시켰다. Poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO의 -COOH를 사용하여 종래에 알려진 방법으로 IgG 결합을 실시하였다. 간단히 설명하면, 상기 poly(NIPAAm-co-AAc)-NGOs는 최종 농도 0.01 mg/ml에서 PBS 완충액에 현탁되었으며, 10μl의 1.917mg/ml EDC가 상기 poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO용액에 첨가되었고, 이어서, 이를 한 시간 동안 계속 교반하였다. 10μl의 1.0mg/ml 항-인간 IgG pAbs가 EDC-활성화된 poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO에 첨가되었고, 이를 한 시간 동안 계속 교반하였다. 마지막으로, 항-인간 IgG pAb-결합 poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO는 4,000 rpm에서 원심분리되었고, PBS 버퍼로 세척되었다. 이와 유사하게, 자성 비드는 밤새도록 175℃에서 열적 안정화 이후, 폴리머 사슬에 남아 있는 모이어티-COOH기를 사용하여 항-인간 IgG mAb와 화학적으로 결합시켰다. 간단히 설명하면, 1.25 mg 자성 비드는 2.0 ml의 PBS 버퍼에서 현탁되었고 30 % 진폭의 팁 초음파 분산기를 사용하여 1분 동안 초음파 처리하였다. 균일하게 분산된 자성 비드는 pH 7.4, PBS 버퍼에서, EDC와 sulfo-NHS의 최종 농도 1.766 M로, 100 μl의 3.5 mg/ml EDC 및 100 μl의 3.5 mg/ml sulfo-NHS와 혼합하였다. 결합되지 않은 항-인간 IgG mAb는 자기장을 사용하여 세척하였고 상기 용액은 IgG Ag의 바이오센싱을 위해 PBS 완충액에 재현탁되었다.
실시예 2. NGO의 크기 분석
도 1(A)는, 강한 교반 하, 강력한 산화제 (농축된 H2SO4 및 KMnO4)에 의한 그래파이트의 화학적 박리 과정을 포함하는, 변형된 Hummer 방법을 통해 천연 그래파이트로부터 NGO를 제조하는 과정를 보여준다. 상기 생성물은 여과 및 증류수로 세척하였고, 이어서 원심분리를 실시하여 잔존하는 비박리 그래파이트 및 산화제를 제거하였다. 생성된 그래파이트 산화물은 초음파 처리를 통해 박리시켜 그래핀 옥사이드을 수득하였다.
도 2는 poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO의 어셈블리를 위한 과정으로, 초음파 처리 시간에 따른 다양한 크기의 NGO를 TEM 이미지 및 DLS 프로파일로 확인한 결과이다. 변형된 Hummer 방법에 의해 제조된 그래핀 옥사이드는 다분산 크기 분포를 갖는다. 일관되고 균일한 SERS 신호를 얻기 위해서는, SERS 나노브로브 크기는 균질하고 단분산 분포를 나타내야 할 필요가 있다. 이에, 본 발명자들은, 그래핀 옥사이드의 크기에 영향을 미치는 초음파 처리를 보다 체계적으로 평가하고자, 다양한 크기의 NGO를 1 내지 3 시간 동안의 초음파 처리를 통해 합성하였다.
도 2(A) 및 (B)는 초음파를 각각 1 또는 2시간 동안 처리한 후, NGOs의 TEM 이미지를 나타낸 것으로, 1시간 초음파 처리 후 NGO의 평균 크기는 약 465 nm (표준편차 (SD)= 87 nm)였던 반면, 2시간 초음파 처리 후 NGO의 평균 크기는 223 nm (표준편차 (SD)= 51 nm)로 감소되었다. 또한, 도 2(C)는 3시간의 초음파 처리 후 획득한 NGO의 TEM 이미지로서, NGO의 평균 크기는 약 105 nm (표준편차: 18 nm)였다. 한편, TEM 이미지에서 각기 다른 NGO의 평균 크기는 Image J 소프트웨어를 사용하여 샘플 당 30 개의 항목의 결과에 따라 산출되었다. 특히, 도 2(A-C)에서 TEM 이미지는 초음파 처리 시간이 증가함 따라, 크기에 기초한 NGO의 다 분산도가 표준 편차에 대하여 4배 가량 크게 감소함을 보여주었다.
아울러, 도 2(D)는 초음파 처리 시간에 따른 유체 내 NGO의 유체 역학 직경을 나타내는 것으로서, 그래파이트 박리 후 GO의 평균 유체 역학 직경은 약 2.0 μm이었고, 상기 직경은 초음파 처리 시간이 증가함에 따라 점진적으로 감소하였다. 초음파 처리 시간이 증가함에 따라 NGO의 평균 유체 역학 직경과 다분산도는 감소되었지만, GO의 제타 전위 크기는 약 -35.0 mV로 유지되었다 (미도시). NGO의 크기와 관계없이 NGO의 제타 전위는 지속적으로 음의 값을 나타내었으며, 이를 통해 초음파 처리 과정에서 NGO 표면에 존재하는 산소 기능기의 손실이 없음을 확인할 수 있었다. 산소 기능기의 유지는 초음파 처리 시간에 관계없이 동일한 피크 위치를 나타내는 도 3에 나타난 UV-Vis 측정 결과에 의해 추가로 확인되었다. 즉, 본 발명에 따른 초음파 처리 및 조절된 원심분리를 통해, 단분산 분포 갖는 약 100 내지 500 nm의 균질한 크기 NGO를 제작할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. Poly ( NIPAAm -co- AAc )-NGO의 제조 및 특성 분석
도 1(A)는, 실시예 2에서 제조한 NGO를 이용하여 poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO를 제조하는 단계를 보여준다. ATRP 개시제의 부착을 통해 NGO의 표면을 기능기화한 후, NIPAAm 및 아크릴릭 산 (AAc)으로 표면 개시 ATRP 중합을 실시하여 poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO를 수득하였다.
도 4(A)는 poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO의 TEM 이미지로서, 여러 회색 영역을 통해 NGO에 poly(NIPAAM-co-AAc) 사슬이 성공적으로 그래프트화되었음을 확인할 수 있었다. 도 4(B)는 비그래프트화된 NGO 및 poly(NIPAAM-co-AAc)로 그래프트화된 NGO의 DLS 프로파일로서, 비그래프트화된 NGO에서 126 nm였던 DLS 크기는, poly(NIPAAM-co-AAc)로 그래프트화된 후 153 nm로 크기가 증가한 것을 확인할 수 있다. 즉, poly(NIPAAM-co-AAc)가 마찰력을 추가로 부여함으로써, NGO의 브라운 운동에 상당한 영향을 미치고 나노구조체의 확산성을 감소시켜, 크기의 증가를 야기하였는바, 이러한 결과를 통해, NGO 표면이 poly(NIPAAM-co-AAc)에 의해 성공적으로 개질되었음을 알 수 있었다.
그래핀 옥사이드의 라만 스팩트럼은 일반적으로 G 밴드와 D 밴드로 표시되며, 상기 밴드들의 위치와 강도는 표면의 기능기화 후, 형태학적 결함에 대한 정보를 얻는데 유용하다. 도 5(A)는 비그래프트화된 NGO 및 poly(NIPAAM-co-AAc)로 그래프트화된 NGO의 라만 스펙트럼으로서, NGO의 D 및 G 밴드는 각각 1350 cm-1 및 1661 cm-1에서 관찰되었던 반면, 폴리머 사슬의 테더링 후, 즉 poly(NIPAAM-co-AAc)에서는, 개질된 표면의 구조적 결함 형성에 의해 보다 강한 밴드가 관찰되었다. 또한, 도 5(B)는 NGO 및 poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO의 FTIR 플롯으로서, NGO의 FTIR 플롯은 OH 기의 존재로 인해 약 3500 cm-1 부근에서 넓은 밴드가 관찰되었다. 반면, poly(NIPAAM-co-AAc)-NGO의 FTIR 플롯은, NIPAAM의 amide-I (-C=O) 및 amide-II (-NH-)의 두 개의 기능기와 AAc의 카보닐 그룹의 존재로 인해, NGO의 FTIR 플롯에서 관찰되지 않았던 1529 cm-1 및 1620 cm-1에서의 밴드가 관찰되었다. 이를 통해서, 본 발명에 따른 일련의 고정을 통해, NGO의 표면이 효과적으로 기능화 되었음을 재차 확인할 수 있었다.
한편, NGO의 표면으로부터 성장한 폴리머 사슬의 길이를 조절하는 능력을 조사하기 위하여, NGOs-Br의 농도를 유지한 채, 각각 다른 농도로 로딩된 NIPAAM-AAc 단량체를 도입한 일련의 ATRP 반응을 진행하였으며, 구체적인 조건은 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112017059153982-pat00001
이후, 테더링된 poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO의 특성을 분석하기 위하여, 수산화 나트륨으로 비누화 반응을 통해 표면에 부착된 poly(NIPAAm-co-AAc) 사슬을 그래핀 옥사이드로부터 분리시켜 분석을 실시하였다.
도 5(C)는 각기 다른 농도의 NIPAAm 및 AAc를 사용하여 제조된, poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO내 poly(NIPAAm-co-AAc) 사슬에 대한 GPC 분석으로서, 로딩된 단량체들의 농도에 따라 사슬의 길이가 증가되었다. 상기 분리된 사슬은 상대적으로 낮은 다분산도를 보여주었으며, 이를 통하여, 그래핀 옥사이드의 표면으로부터 유도된, 상기 ATRP 중합 반응을 통해 사슬의 길이를 각 단량체들의 농도 변화를 통해 조절할 수 있음을 알 수 있었다. 도 5(D)는 각기 다른 농도의 NIPAAm 및 AAc를 사용하여 제조된, poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO 내 poly(NIPAAm-co-AAc) 사슬에 대한 UV-Vis 흡광도 프로파일로서, 수용액에서 분리된 poly(NIPAAM-co-AAc) 사슬의 형태와 용해도는, 사슬 길이와 관계없이 모두 온도에 반응하였다.
끝으로, 도 5(E)는 DMSO-d6 상에서 분리된 사슬의 NMR 스펙트럼으로서, NIPAAM의 메틸 양성자를 의미하는 1.16 ppm 단일선 (singlet)이 관찰되었다. 또한, AAc 또는 NIPAAM 단량체의 메틸렌 양성자를 나타내는 1.60 ppm 또는 2.29 ppm에서의 넓은 피크, 이프로필 메틴 양성자를 나타내는 4 ppm의 피크, 및 NIPAAM의 아마이드 양성자를 나타내는 6.5 ppm에서 넓은 피크를 통해, 상기와 같은 특성을 갖는 사슬은 poly(NIPAAm-co-AAc)임을 재차 확인할 수 있었다.
실시예 4. GNR - poly ( NIPAAm -co- AAc )-NGO의 제조 및 특성 분석
도 1(B)는 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO의 제조 과정 및 온도 자극에 따라 라만 신호 (SERS 신호)가 향상되는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다. 본 발명에 따른 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO은 p(NIPAAm-co-AAc)-NGO와 MGITIC-encoded GNR을 함께 인큐베이션시켜 이들간 비공유 정전기적 상호 작용을 통해 제조되었다. 아울러, SERS 나노 프로브로서 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO의 바이오센싱 응용을 평가하기 위하여, SERS 나노 프로브로서 제조된 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO, 및 자성 비드로서 MNP-봉입 폴리머 NPs를 이용하여 샌드위치형 바이오센싱 나노구조체를 제조하였다. SERS 나노 프로브로인 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO은 poly(NIPAAm-co-AAc) 및 NGO 표면에 존재하는 -COOH 기에 의해 항-인간 IgG 항체와 화학적으로 결합되었다. 유사하게, 분리를 위한 자성 비드는 IgG Ags를 갖는 샌드위치-형 면역복합체의 발달을 위한 열적 안정화 이후, 폴리머 사슬 상에 머물러 있는 -COOH 기에 의해 항-인간 IgG mAb와 화학적으로 결합되었다. 중요한 점은, poly(NIPAAm-co-AAc)는 팽창된 수화 상태에서 수축된 탈수화 상태로의 가역적인 LCST 상전이로 인해 이의 부피가 감소되므로, GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO는, 스마트 SERS 나노 프로브로서, 온도 의존성 전자기적 결합이 유도된다는 것이다. 따라서, poly(NIPAAm-co-AAc) 상에 도입된 GNR 및 NGO는 서로 가깝게 위치하도록 재배치되고, 이는 한계값 (LOD)이 낮아진 고강도의 SERS 신호를 생성하게 된다.
도 6은 (A) poly(NIPAAm-co-AAc)의 사슬 길이, (B) 라만 리포터의 농도, (C) 용액의 온도 변화에 따른 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO의 라만 스펙트럼으로서, 상기 파라미터들에 따라 라만 신호는 조절되었다. 구체적으로, 가장 긴 길의 poly(NIPAAm-co-AAc) 사슬이 결합된 경우, 라만 신호가 가장 높게 관찰되었으며, 이는 조밀한 배치로 인해 GNR간 간격이 줄어들고, 이로 인해 SERS 신호를 증진시키는 강한 전자기장이 발생한 것으로 판단된다. 또한, 라만 리포터인 MGITC 피크 강도는 농도가 증가함에 따라 강화되었고, 도 7에 나타낸 바와 같이, MGITC 농도와 라만 신호의 강도 사이에는 선형 비례관계에 있는바, 이는 바이오센싱 응용을 위한 SERS 나노 프로브서 GNR-poly(NIPAAM-AAc)-NGO의 유용성을 확인할 수 있었다. 아울러, LCST 이상인 40 ℃에서의 라만 신호는 실온 (25 ℃)에서의 신호보다 약 2배이상 높았으며, 이는 poly(NIPAAM-co-AAc)으로 인해 온도가 증가함에 따라, GNR과 그래핀 옥사이드간 수직 간격 및 NGO상에 도입된 GNR간의 간격이 감소하게 되고, 이로 인해 샌드위치형 SERS 신호의 강도가 증가된 것이다. 또한, 도 6(D)는 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO의 UV-Vis 흡광도 프로파일로서, 제조된 GNR의 표면 플라스몬 흡수는, 전자의 세로 진동으로 인한 근적외선 영역 (780 nm)의 장파장과, 전자의 가로 진동에 의한 가시 영역 (520 nm) 주변의 약한 단파장의 두 가지 밴드를 보여주며, 적색 시프트는 클러스터 형성이후 관찰되었다. 이러한 결과는 상기의 결과를 재차 검증하는 것이다.
도 8 (A) 내지 (D)는 제조된 GNR-poly(NIPAAM-co-AAc)-NGO의 SEM 및 TEM 이미지로서, 온도 반응성 나노 크기의 그래핀 옥사이드와 함께 인큐베이션된, 라만 리포터가 부착된 GNR 클러스터를 보여준다. 또한, 제조된 poly(NIPAAM-co-AAc)-NGO는 단분산 분포를 지니며, 콜로이드 안정성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 도 8(E) 및 (F)는 각기 다른 배치 (N=5)를 사용한 poly(NIPAAM-co-AAc)-NGO의 라만 스팩트럼으로서, 시간에 대한 함수로서 콜로이드 안정성, 및 배치간 SERS 신호의 가변성을 보여주었고, 이들은 라만 강도를 유지한 채 며칠 동안, GNR-poly(NIPAAM-co-AAc)-NGO의 SER 신호의 우수한 재현성을 보여주었다.
실시예 5. SERS 기반 바이오센싱 플렛폼 제조
마지막으로, 본 발명자들은 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO이 SERS 나노 프로브로서의 역할을 수행할 수 있다는 가설을 증명하기 위하여, 제조된 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO를 SERS-기반 바이오센싱 나노구조체로, MNP-봉입된 (embedded) 폴리머릭 자성 입자를 자성 비드로 사용하여, 샌드위치형 면역복합체를 제조하였다.
도 9의 상단에 나타낸 바와 같이 GNR-poly(NIPAAM-AAc)-NGO 표면에 존재하는 활성화된 -COOH 기에 의하여, GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO와 항-인간 IgG pAb는 화학적으로 결합되었다. 유사하게, 분리용 자성 비드인 MNP-봉입된 폴리머릭 자성 입자는 IgG 존재하에 샌드위치 면역 복합체 형성을 위해 175℃에서 밤새도록 열적 안정화된 후에 폴리머 사슬에 잔존하는 -COOH 기에 의해 항-인간 IgG mAb와 결합되었다. 한편, 도 10은 상기의 과정에서 제조된, (A) 자성 나노입자 및 (B) 5 w/v% 자성 나노입자를 함유하는 용액에 대한 TEM 이미지, (C) 자성 나노입자를 함유하는 폴리머릭 나노입자의 SEM 이미지, (D) 5w/v% 자성 나노입자를 함유하는 폴리머릭 나노입자를 함유하는 FITC-덱스트란에 대한 CLSM 이미지를 보여준다.
또한, 도 9의 하단은 면역 복합체를 형성하는 두 단계의 과정을 보여준다. 우선, 첫번째 단계로, 항-인간 IgG mAb-결합 MB가 인간 IgG가 함유된 PBS 버퍼에 첨가되어 특이적으로 IgG를 포획하도록 하였다. 그리고, 상기 항-인간 IgG mAb-결합 MB 및 IgG으로 이루어진 복합체를 자기장을 사용하여 분리한 다음, 상기 용액을 세척하고 재현탁하였다. 두번째 단계로, 제조된 복합체와 SERS 나노 프로브인 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO를 추가로 혼합하였다. 항-인간 IgG pAb-결합 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO 및 항-인간 IgG mAb-결합 자성 비드는 특정 분자의 상호작용을 통해 항-IgG, pAb, IgG, 및 항-IgG mAb 사이에서 샌드위치형 면역 복합체를 형성하였다. 샌드위치형 면역 복합체는 자기장을 이용하여 분리하고 분석에 이용하였다.
도 11(A)는 각기 다른 배치 (N=5)를 사용하여 형성된 샌드위치형 면역복합체의 라만 스팩트럼으로서, IgG의 양이 증가함에 따라 면역 복합체의 라만 신호 강도는 증폭되었고, 하한 임계 용액 이상의 조건 (45℃)에서도 라만 신호 강도는 크게 증가됨을 확인할 수 있었다. 한편, 대조군 실험에서는, 매우 낮은 라만 신호가 검출되었는데, 이는 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO 및 자성비드에 IgG 항원과 Ab 모이어티가 없으면 면역 복합체가 형성되지 않음에 기인하는 결과이다. 또한, 도 11(B)에 나타낸 바와 같이, 상기 샌드위치형 면역복합체의 라만 신호 강도는 첨가된 IgG 농도와 선형 관계임을 보여주는데, 이는 SERS 신호가 IgG의 농도와 정비례함을 의미한다. 즉, 본 발명에 따른 GNR-poly(NIPAAm-co-AAc)-NGO를 SERS 나노 프로브로 이용될 수 있다. 또한, 이를 이용한 샌드위치형 면역복합체는 SERS 나노 프로브, 생체 분자, 및 자성 비드간 신속한 상호작용으로, 어떠한 광 퇴색을 보이지 않고, 짧은 분석 시간 내 높은 민감도를 나타낼 수 있는바, SERS 기반 바이오센싱 분야에 폭넓게 적용할 수 있을 것이다.
Ⅱ. 음전하를 지닌 온도 반응성 블록 공중합체 기반 나노구조 복합체
1. "Grafting from" 방법에 따른 블록 공중합체 기반 나노구조 복합체
실시예 1. 실험 준비
1-1. 실험 재료
N-이소프로필 아크릴아미이드 (NIPAM)는 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd로부터 수득하였고, 헥세인 (hexane)으로부터 재결정화시킨 후 사용되었다. 아크릴릭 산 (AAc) 및 N, N-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트 (DMAEMA)는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 제공되었고, 감압 조건에서 정제시킨 후 사용되었다. 2,2'-아조비스 (2-메틸프로피오나이트릴) (AIBN)은 Thermo Fisher Scientific로부터 수득하였고, 메탄올로부터 재결정화시킨 후 사용되었다. 4-시아노-4-[(도데실설파닐티오카르보닐)설파닐]펜탄 산 (CDTPA), 인산완충생리식염수 (PBS), 트리스(2-카르복시에틸)포스파인 하이드로클로라이드 (TCEP, Sigma-Aldrich로부터 수득)는 추가 정제 과정없이, 제공받은 그대로 사용되었다. 1,4-다이옥산 (Kanto Chemical Co., Inc., Japan), 다이에틸 에터 (Samchun), 테트라하이드로퓨란 (THF, Daejung, Korea), N-헥세인 (Daejung, Korea), 트리에틸아민 (Junsei Chemical Co., Ltd), 및 다이메틸설폭사이드 (DMSO, Junsei Chemical Co., Ltd) 역시 추가 정제 과정없이, 제공받은 그대로 사용되었다.
1-2. 그래핀 옥사이드의 제조
0.5 g의 그래파이트, 0.25 g의 질산 나트륨, 및 11.5 ml의 황산을 500 ml의 둥근 바닥 플라스크에 혼합한 후, 이를 교반시켰다. 질산 나트륨을 용해시킨 후, 상기 플라스크를 교반하면서 아이스 배스에서 냉각시켰다. 이후, 과열을 방지하고자 1.5 g의 과망간산 칼륨을 10분에 걸쳐 천천히 첨가하여 즉각적으로 녹색의 현탁액을 생성하였다. 상기 플라스크를 워터 배스에 옮긴 뒤, 35 ℃로 가열하였다. 상기 용액을 12시간 동안 교반하였고, 이에 따라 점차 점도가 높아지고 어두운 갈색을 띄었다. 상기 반응 플라스크는 아이스 배스 내에서 냉각되었고, 23 ml의 증류수가 서서히 용액에 첨가되었으며, 온도는 40 ℃ 이하로 유지되었다. 이후, 희석된 혼합물에 70 mL의 증류수를 첨가한 후, 1.2 mL의 과산화수소로 퀀칭시켜 담황색의 그래핀 옥사이드 현탁액을 수득하였다. 생성된 그래핀 옥사이드는 8,230 g에서 5분간 원심분리, 경사 분리(decantation), 및 4 wt% HCl 수용액 내 재현탁의 3단계 과정을 통해 정제되었다. 또한, 증류수를 이용하여 상기 3단계의 정제 과정을 반복하였다. 잔존하는 정제된 그래파이트 산화물은 50 mL의 증류수에 현탁시켰다. 상기 현탁된 그래파이트 산화물은, 30 % 강도, 10s/10s 주기, 2시간 작동으로 설정된, 티타늄-합금 고체 프로브 초음파 분쇄기를 사용하여, 그래핀 옥사이드 나노-시트로 박리되었다. 박리되지 않은 그래파이트 산화물은 8,230 g에서 5분간 원심분리하여 제거되었다. 이후, 그래핀 옥사이드 용액을 증류수로 투석하여 잔류하는 염을 제거하였다.
1-3. RAFT 시약으로 변형된 그래핀 옥사이드의 합성
100 mg의 그래핀 옥사이드 파우더를 초음파 처리를 통해 15 mL의 DMF에 분산시켰다. 이후, 상기 용액에 3 mL의 2-브로모이소부틸일 브로마이드 (BIBB) 및 1 mL의 트리메틸아민 (TEA)를 첨가하고, 이를 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물은 클로로포름 및 탈이온수로 3회 세척되었다. 건조 후, 10 mg의 NGO-Br은 초음파 처리를 통해 10 mL의 DMF에 분산되었다. 53 mg의 CuBr, 53 mg의 Cu, 0.15 mL의 PMPETA, 및 100 mg의 비스(도데실설파닐티오카르보닐) 다이설파이드는 NGO-Br 용액에 첨가되었다. 상기 반응는 85 ℃에서 72 시간 동안 수행되었다. 반응 후, 상기 용매는 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리되었고, 정제된 산물은 초음파 처리를 통해 다이클로로메탄 및 메탄올 (부피비 1:1) 용액에 분산되었으며, 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리되었다. 이러한 과정은 3회 반복 실시되었고, 수득된 NGO-RAFT는 밤새도록 오븐에 건조시켰다.
1-4. 그래핀 옥사이드로부터 poly(NIPAM- b -AAc)의 합성
상기 제조된 NGO-RAFT 파우더를 초음파 처리를 통해 DMF에 분산시켰다. 이후, NIPAM 및 AIBN을 NGO-RAFT 용액에 첨가하고, 질소 가스로 20분 동안 탈가스화시켰다. 중합 반응은 70 ℃에서 48 시간 동안 수행되었다. 중합 이후, 상기 혼합 용액을 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여, 잔존하는 NIPAM 및 AIBN을 제거하였다. 이후, AAc 및 AIBN을 poly(NIPAM)-NGO에 첨가하고, 질소 가스로 20분 동안 탈가스화시켰다. 중합 반응은 70 ℃에서 48 시간 동안 수행되었다.
1-5. 금 나노로드의 합성
첫째로, 금 나노로드 (GNR)의 시드 용액을 제조하였다. 30 ℃의 조건에서, 0.324g의 CTAB를 5 mL의 증류수에 용해시키고, 5 mL의 0.5 mM HAuCl4 용액을 교반시키면서 첨가하였다. 이후, 상기 용액에 0.60 mL의 냉각된 10 mM NaBH4 용액을 첨가한 뒤, 이를 2분 동안 교반하였고, 25 ℃로 온도를 유지시켰다. 두번째로, 성장 용액을 제조하였다. CTAB 용액과 동량을 준비하고, 250 μL의 4 mM AgNO3 용액을 첨가하였다. 이후, 5 mL의 1 mM HAuCl4 용액을 서서히 교반시키면서 첨가하였다. 이후, 여기에 70 μL의 0.0788 M 아스코빅 산을 첨가한 뒤, 다시 12 μL의 시드 용액을 첨가하였다. 상기 혼합 용액을 4시간 동안 교반시킨 후, 불그스름한 청색을 띄는 용액을 수득하였다.
1-6. 특성 분석
그래핀 옥사이드로부터 poly(NIPAM) 및 poly(NIPAM-b-AAc)는 1M KOH-에탄올 처리에 의해 분리되었고, 이어서, 수 평균 분자량 분석을 실시하였다. 1H NMR (AVANCE III 400, Bruker BioSpin AG, Fallanden, Switzerland)을 통해 폴리머의 블록 길이를 확인하였다. Poly(NIPAM) 단일 블록 또는 poly(NIPAM-b-AAc)를 각각 D2O 또는 DMSO-D6에 5mg/ml의 농도로 용해시켰다. 트리에틸아민 (TMS)을 표준 용액으로 상기 시료 용액에 첨가하였다. poly(NIPAM-b-AAc)의 블록 길이는 아크릴릭 산의 카르복시기 및 NIPAM의 아마이드 기를 각각 나타내는 12.5 ppm 및 7 ppm 피크의 적분 값을 통해 산출하였다.
하한 임계 용액 온도 (LCST)는 UV-Vis 분광계 (Cary-100 Bio, Varian Biotech, US)를 사용하여, 1 ℃/분의 가열 속도 조건 하, 350nm에서의 흡광도 분석을 통해 확인하였다. 상기 실험을 위한 샘플은, 각기 다른 pH 조건 하, 0.05 %(w/v)로 PBS 용액에 블록 공중합체를 용해시켜 제조하였다.
UV-Vis 흡광 분석법은 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO나노 복합체로부터 GNR과 이들의 클러스터에 대한 광학적 성질을 확인하기 위하여 사용되었다. UV 흡광도는 1 nm의 슬릿 너비, 실온에서 중간 스캔 속도로 설정된 UV-1800 (Shimadzu, Japan)을 사용하여 300 내지 850 nm 파장의 범위에서 측정되었다.
투과 전자 현미경(TEM)을 통한 이미징은 GNR-poly(NIPAAm-b-AAc)-NGO 복합체로부터 단일의 GNR, poly(NIPAM-b-AAc)-NGO 및 클러스터화된 GNR을 조사하기 위하여 실시하였다. 구체적으로, 초박막 탄소 (Ted Pella Inc. U.S.)로 코팅된 구리 그리드 상에 200 kV의 작동 전압으로 작동되는 투과 전자 현미경 JEM-2100F FE-STEM (JEOL, Germany)을 사용하여, 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 수득하였다.
실시예 2. Poly ( NIPAM - b - AAc )-NGO의 제조 및 특성 분석
도 12는 poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 제조 과정을 화학적 반응식으로 나타낸 것이다. 사슬 연쇄이동반응제(chain transfer agent)가 도입된 그래핀 옥사이드의 표면에 온도 반응성의 NIPAM과 음전하를 띄는 acrylic acid가 순차적으로 결합된 고분자 브러시를 RAFT 중합을 통해 제조하였다..
도 13(A)는 그래핀 옥사이드의 표면에 사슬 연쇄이동반응제가 도입되었는지를 확인하기 위한 FT-IR의 스펙트럼이다. 1190 cm-1 부근의 peak은 사슬 연쇄이동반응제의 C=S 결합을 의미하며, 이를 통해 사슬 연쇄이동반응제가 그래핀 옥사이드의 표면에 성공적으로 도입되었음을 알 수 있었다. 도 13(B)는 그래핀 옥사이드와 GO-RAFT 및 poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 UV-Vis 흡광도 프로파일로서, RAFT를 통해 poly(NIPAM-b-AAc)-NGO가 성공적으로 제조되었음을 확인하였다. 또한, 도 13(C)는 poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 투과전자현미경 (transmission electron microscope, TEM) 이미지로, 회색 부분에 있는 검은색 부분은 그래핀 옥사이드의 표면에 부착된 고분자 브러시를 나타낸다.
도 14(A)는 고분자 브러시인 poly(NIPAM)과 poly(NIPAM-b-AAc)의 온도에 따른 UV/Vis 흡광도 프로파일로서, poly(AAc) 블록의 음전하에 의해 친수성이 증가한 poly(NIPAM-b-AAc)이 좀 더 높은 하한 임계 용액온도 (lower critical solution temperature, LCST)를 보여주고 있다. 도 14(B)는 pH에 따른 poly(NIPAM-b-AAc)의 하한 임계 용액온도 변화를 나타내는 것으로서, 주변 환경 조건의 변화를 통해 온도 자극성 고분자의 상 전이를 용이하게 조절할 수 있을 것으로 판단된다. 한편, 도 14(C)는 그래핀 옥사이드로부터 분리된 사슬의 NMR 스펙트럼으로서, 3.83 ppm과 12.2 ppm 부근의 peak로 poly(NIPAM)과 poly(AAc) 블록이 합성되어 이중블록 공중합체를 형성하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. GNR - poly ( NIPAM - b - AAc )-NGO의 제조 및 특성 분석
도 15는 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 합성과 온도 의존적인 SERS 신호의 향상 효과를 보여준다. 사슬 연쇄이동반응제(chain transfer agent)를 그래핀 옥사이드 상에 결합시킨 후, 아크릴릭 산 및 NIPAM을 RAFT 중합반응을 통해 그래핀 옥사이드 표면으로부터 폴리머화시켰다. 이후, 양전하를 띄는 GNR은 음전하를 띄는 poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 poly(AAc) 블록에 전하간 상호작용을 통해 결합된다. 이들은 고분자 브러쉬 내 온도 반응성 poly(NIPAM) 블록의 존재로 인해, 고분자 브러시의 하한 임계 용액온도 (lower critical solution temperature, LCST) 이상에서, poly(NIPAM) 블록이 소수성이 증가하여 응집이 되고 이로 인해 금 나노로드와 그래핀 옥사이드의 표면 간의 거리가 감소하여 SERS 신호가 증가하게 된다.
그림 16(A)는 라만 리포터인 MGITC의 농도에 따른 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 라만 신호의 강도 변화를 보여준다. MGITC 농도가 증가함에 따라 SERS 신호도 증가하지만, 10-4 M 이상은 금 나노로드에 부착된 MGITC가 포화 상태여서 더 이상 SERS 신호가 증가하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 도 16(B)는 MGITC의 농도 10-4 M에서 금 나노로드와 poly(NIPAM-b-AAc)-NGO 질량 비율에 따른 SERS 신호를 측정한 것이다. 금 나노로드와 결합하는 poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 양이 증가함에 따라 SERS 신호도 증가를 하지만 1:10 이후는 금나노로드와 poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 결합이 포화 상태가 되어 더 이상 눈에 띄는 SERS 신호 증폭을 확인할 수 없었다. 도 16(C)는 하한 임계 용액온도 이하 또는 이상일 때 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 SERS 스펙트럼으로, 하한 임계 용액온도 이상일 때, poly(NIPAM) 블록의 응집으로 SERS 신호가 증폭된 것을 확인할 수 있었다.
도 17(A) 및 (B)는 각각 단일 금 나노로드와 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 투과전자현미경의 이미지이다. 두 이미지를 비교해 보면, 단일 금 나노로드일 때보다 poly(NIPAM-b-AAc)-NGO와 결합한 금 나노로드에서 클러스터 (cluster)가 형성되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. SERS 기반 바이오센싱 플렛폼 제조
GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO와 자성 비드를 사용하여 SERS 기반의 바이오센싱을 제조하였다. 상기 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO는 SERS 나노프로브로서, anti-human IgG pAbs와 화학적으로 결합하였고, 상기 자성 비드는는 anti-human IgG mAbs와 결합하여, IgG에 대한 샌드위치형 면역복합체를 형성하였다. 도 18(A) 및 18(B)는 각각 고분자 브러시의 하한 임계 용액온도 이상 또는 이하의 온도에서 IgG 농도에 따른 SERS 스펙트럼이다. 같은 농도의 항체 조건에서 LCST 이상일 때 SERS 신호가 증가한 것을 확인할 수 있었다. 도 18(C)는 SERS 스펙트럼의 1650cm-1에서 IgG 항체 농도에 따른 SERS 신호의 변화를 나타낸 것이다. LCST 이상의 온도일 때의 신호가 LCST 이하일 때 보다 더 낮은 농도의 항체를 측정할 수 있었고, 같은 농도에서는 더욱 강한 신호를 관찰할 수 있었다. 이를 통해 온도 반응성의 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 SERS 나노프로브는 높은 온도에서 SERS 신호의 증폭을 유도하여 검출한계 (limit of detection, LOD) 값이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.
2. "Grafting to" 방법에 따른 이중블록 공중합체 기반 나노구조 복합체
실시예 1. 실험 준비
1-1. 실험 재료
N-이소프로필 아크릴아미이드 (NIPAM)는 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd로부터 수득하였고, 헥세인 (hexane)으로부터 재결정화시킨 후 사용되었다. 아크릴릭 산 (AAc) 및 N, N-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트 (DMAEMA)는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 제공되었고, 감압 조건에서 정제시킨 후 사용되었다. 2,2'-아조비스 (2-메틸프로피오나이트릴) (AIBN)은 Thermo Fisher Scientific로부터 수득하였고, 메탄올로부터 재결정화시킨 후 사용되었다. 4-시아노-4-[(도데실설파닐티오카르보닐)설파닐]펜탄산 (CDTPA), 인산완충생리식염수 (PBS), 트리스(2-카르복시에틸)포스파인 하이드로클로라이드 (TCEP, Sigma-Aldrich로부터 수득)는 추가 정제 과정없이, 제공받은 그대로 사용되었다. 1,4-다이옥산 (Kanto Chemical Co., Inc., Japan), 다이에틸 에터 (Samchun), 테트라하이드로퓨란 (THF, Daejung, Korea), N-헥세인 (Daejung, Korea), 트리에틸아민 (Junsei Chemical Co., Ltd), 및 다이메틸설폭사이드 (DMSO, Junsei Chemical Co., Ltd) 역시 추가 정제 과정없이, 제공받은 그대로 사용되었다.
1-2. 그래핀 옥사이드의 제조
0.5 g의 그래파이트, 0.25 g의 질산 나트륨, 및 11.5 ml의 황산을 500 ml의 둥근 바닥 플라스크에 혼합한 후, 이를 교반하였다. 질산 나트륨을 용해시킨 후, 상기 플라스크를 교반하면서 아이스 배스에서 냉각시키고, 과열을 방지하고자 1.5 g의 과망간산 칼륨을 10분에 걸쳐 천천히 첨가하여 즉각적으로 녹색의 현탁액을 생성하였다. 상기 플라스크를 워터 배스에 옮긴 뒤, 35 ℃로 가열하였다. 상기 용액은 12시간 동안 교반되었고, 이에 따라 점차 점도가 높아지고 어두운 갈색을 띄었다. 상기 반응 플라스크는 아이스 배스 내에서 냉각되었고, 23 ml의 증류수가 서서히 용액에 첨가되었으며, 온도는 40 ℃ 이하로 유지되었다. 이후, 희석된 혼합물에 70 mL의 증류수를 첨가한 후, 1.2 mL의 과산화수소로 퀀칭시켜 담황색의 그래핀 옥사이드 현탁액을 수득하였다. 생성된 그래핀 옥사이드는 8,230 g에서 5분간 원심분리, 경사 분리(decantation), 및 4 wt% HCl 수용액 내 재현탁의 3단계 과정을 통해 정제되었다. 또한, 증류수를 이용하여 상기 3단계의 정제 과정을 반복하였다. 잔존하는 정제된 그래파이트 산화물은 50 mL의 탈이온수에 현탁시켰다. 상기 현탁된 그래파이트 산화물은, 30 % 강도, 10s/10s 주기, 2시간 작동으로 설정된, 티타늄-합금 고체 프로브 초음파분쇄기를 사용하여, 그래핀 옥사이드 나노-시트로 박리되었다. 박리되지 않은 그래파이트 산화물은 8,230 g에서 5분간 원심분리하여 제거되었다. 이후 그래핀 옥사이드 용액을 증류수로 투석하여 잔류하는 염을 제거하였다.
1- 3. 말레이미드 기로 기능기화된 그래핀 옥사이드의 합성
그래핀 옥사이드 파우더를 초음파 처리를 통해 MES 완충액 (pH 5)에 분산시켰다. 이후, 상기 용액에 EDC를 첨가하고, 이를 실온에서 2시간 동안 교반시켜 그래핀 옥사이드의 카르복시기를 활성화시켰다. 이후, 상기 용액에 n-(2-아미노에틸)말레이미드 트리플루오로아세테이트 (AEM)를 첨가하고, 이를 24 시간 동안 교반시켜 그래핀 옥사이드 표면에 말레이미드 기를 기능화하였다. 상기 말레이미드기로 기능기화된 그래핀 옥사이드 용액은 탈이온수로 2일 동안 투석되었고, 이를 동결 건조시켰다.
1-4. poly(NIPAM- b -AAc)의 합성
2구 둥근 바닥 플라스크 (100 ml)에 1 mL의 아크릴릭 산 (14.5 mmol) 및 2.86 ml의 1,4-dioxane을 교반하면서 첨가하였다. 아크릴릭 산이 완전이 용해되었을 때, 4-시아노-4-[(도데실설파닐티오카르보닐)설파닐]펜탄 산 (4.83x10- 2 mmol, 0.02 g/mL)을 함유하는, 1 mL의 1-4-다이옥산 용액을 첨가하였다. 상기 용액은 질소 가스로 20분 동안 탈가스화되었고, 여기에 AIBN (1.2 x 10- 2 mmol, 0.002 g/mL)을 함유하는 1 mL의 1,4-다이옥산 용액을 첨가하였으며, 이후, 다시 질소로 20분 동안 탈가스화를 실시하였다. 이후, 상기 혼합 용액을 교반하면서, 70 ℃에서 15분 동안 반응시켰다. 반응 후, 상기 폴리머 혼합물은 밝은 노란색을 띄는 점성의 용액을 수득하였다. 상기 혼합 용액을 과량의 에틸 아세테이트 조건에서 침전시키고, 이를 반복 실시하였다. 침전된 폴리머는 후드 내에서 건조시켰고, 이후, 상기 폴리머는 물에 용해시키고 3일 동안 투석을 실시하였다. 투석 후, 상기 폴리아크릴릭 산-CDTPA (poly(AAc)-CDTPA) 용액을 동결건조시켰다. 0.5 g의 poly(AAc)-CDTPA (2.8 x 10- 2 mmol)를 2구 둥근 바닥 플라스크에 첨가하고, 교반하면서 1.7 mL의 물을 용해시켰다. 이후, 상기 플라스크에 0.9 g의 NIPAM (8.3 mmol) 및 4 mL의 에탄올을 첨가하여 완전히 용해시킨 뒤, 상기 용액은 질소 가스로 20분 동안 탈가스화되었다. 여기에 AIBN (7.0 x 10- 3 mmol, 0.0011 g/mL)을 함유하는 1 mL의 에탄올 용액을 첨가하였으며, 이후, 다시 질소로 20분 동안 탈가스화를 실시하였다. 이후, 상기 혼합 용액을 70 ℃에서 15분 동안 반응시켰다. 상기 혼합 용액을 과량의 에틸 아세테이트 조건에서 침전시키고, 이를 반복 실시하였다. 침전된 폴리머 혼합물을 인산 완충액 (pH 10)에 용해시키고, 3일 동안 투석을 실시하였다. 마지막으로, 상기 폴리머 용액을 동결건조시켰다.
1-5. poly(NIPAM- b -AAc)의 아미노분해
45 mg의 poly(NIPAM-b-AAc)을 둥근 바닥 플라크에 첨가한 뒤, 37 ℃에서 24시간 동안 교반하면서, 3 μL의 MTS, 38 μL의 헥실아민, 및 40 μL의 TEA를 첨가하였다. 상기 폴리머 용액을 과량의 에틸 아세테이트 조건에서 침전시키고, 9,000 rpm에서 10분 동안 원심분리시켰으며, 상기 정제 단계는 한번 더 반복 실시되었다. 정제 후, 상기 폴리머는 밤새도록 오븐에서 건조되었고, 질소 대기 하, 4 mg의 TCEP를 함유하는 트리스 완충액 (pH 7)에 용해되었다. 상기 반응은 24시간 동안 진행되었으며, 생성물은 NaCl 용액에 의해 침전시킨 뒤, 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 수득하였다.
1-6. poly(NIPAM- b -AAc)로 그래프트화된 그래핀 옥사이드의 합성
고르게 분산된 NGO-말레이미드 용액을 정제된 poly(NIPAM-b-AAc)-SH 용액에 첨가하였다. NGO-말레이미드 용액과 티올기로 기능기화된 폴리머 용액의 비율은 각각 1:1. 1:5, 1:10, 및 1:20이었다. 이후, 상기 혼합 용액을 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
1- 7. 금 나노로드의 합성
첫째로, 30℃의 조건에서, 5 mL의 0.20 M CTAB 용액을 5 mL의 0.5 mM HAuCl4 용액과 혼합하여 시드 용액을 제조하였다. 상기 용액을 교반하면서, 0.6 mL의 냉각된 0.010 M NaBH4 용액을 첨가하였으며, 이를 통해 옅은 갈색을 띈 노란색 용액을 수득하였다. 상기 용액을 2분 동안 교반시키고, 25 ℃로 온도를 유지시켰다. 30 ℃의 조건에서, 5 mL의 0.20 M CTAB 용액을 0.25 mL의 4 mM AgNO3 용액과 혼합하여 성장 용액을 제조하였고, 여기에 다시 5 mL의 1 mM HAuCl4 용액을 첨가하였다. 70 μL의 78.8 mM 아스코빅 산을 상기 성장 용액에 서서히 첨가하였으며, 이를 통해 어두운 노란색의 용액을 수득하였다. 30 ℃의 조건에서, 12 μL의 시드 용액을 상기 성장 용액에 첨가하였고, 20분 이내에 상기 용액은 불그스름한 청색을 띄었다. 금 나노로드 용액을 13,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하여, 과량의 CTAB를 제거하였다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고, 금 나노로드 펠릿을 증류수로 재현탁하였고, 상기 단계는 3회 반복 실시되었다.
1- 8. 특성 분석
그래핀 옥사이드로부터 poly(NIPAM) 및 poly(NIPAM-b-AAc)은 1 M KOH-에탄올 처리에 의해 분리되었고, 이어서, 수 평균 분자량 분석을 실시하였다. 1H NMR (AVANCE III 400, Bruker BioSpin AG, Fallanden, Switzerland)을 통해 폴리머의 블록 길이를 확인하였다. Poly(NIPAM) 단일 블록 또는 poly(NIPAM-b-AAc)를 각각 D2O 또는 DMSO-D6에 5 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 트리에틸아민 (TMS)을 표준 용액으로 상기 시료 용액에 첨가하였다. poly(NIPAM-b-AAc)의 블록 길이는 아크릴릭 산의 카르복시기 및 NIPAM의 아마이드 기를 각각 나타내는 12.5 ppm 및 7 ppm 피크의 적분 값을 통해 산출하였다.
하한 임계 용액 온도 (LCST)는 UV-Vis 분광계 (Cary-100 Bio, Varian Biotech, US)를 사용하여, 1 ℃/분의 가열 속도 조건 하, 350 nm에서의 흡광도 분석을 통해 확인하였다. 상기 실험을 위한 샘플은, 각기 다른 pH 조건 하, 0.05 %(w/v)로 PBS 용액에 블록 공중합체를 용해시켜 제조하였다.
UV-Vis 흡광 분석법은 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO 나노 복합체로부터 GNR과 이들의 클러스터에 대한 광학적 성질을 확인하기 위하여 사용되었다. UV 흡광도는 1nm의 슬릿 너비, 실온에서 중간 스캔 속도로 설정된 UV-1800 (Shimadzu, Japan)을 사용하여 300 내지 850nm 파장의 범위에서 측정되었다.
투과 전자 현미경(TEM)을 통한 이미징은 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO 나노 복합체로부터 단일의 GNR, poly(NIPAM-b-AAc)-NGO 및 클러스터화된 GNR을 조사하기 위하여 실시하였다. 구체적으로, 초박막 탄소 (Ted Pella Inc. U.S.)로 코팅된 구리 그리드 상에 200 kV의 작동 전압으로 작동되는 투과 전자 현미경 JEM-2100F FE-STEM (JEOL, Germany)을 사용하여, 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 수득하였다.
실시예 2. Poly ( NIPAM - b - AAc )- NGO 의 제조 및 특성 분석
도 19(A)는 RAFT 폴리머화를 통해 온도 반응성 및 음전하 블록을 지닌 poly(NIPAM-b-AAc)을 제조하는 과정을 보여준다. 우선, 연쇄 이동제 및 개시제로 각각 CDTPA 및 AIBN을 사용하여, 아크릴릭 산을 폴리머화시켰다. 이후, NIPAM은 macro CTA로서, poly(AAc)-CDTPA와 폴리머화되었다. Poly(AAc) 블록 및 poly(NIPAM) 블록은 각각 블록에 음전하 및 온도 반응성을 부여한다. 특히, poly(AAc)는, 양전하를 띄는 GNR에 대하여, 비-공유 정전기적 상호작용에 의한 결합 부위를 제공하고, poly(NIPAM)은 NGO 상에 위치한 폴리머 브러쉬를 LCST 온도 이상에 수축시킨다. 이중블럭 공중합체의 중합화 이후, 도 19(B)에 나타낸 바와 같이, 아미노 분해과정을 통해 상기 공중합체의 트리카보닐티오 기는 티올기로 전환되었다. 상기의 변형은 티올-마이클 첨가 클릭 반응을 통해, 기능기화된 NGO의 말레이미드 기와 결합되도록 하였다
또한, 도 20은 EDC/NHC에 의해, 그래핀 옥사이드의 카르복시기가 말레이미드기로 기능화되는 반응을 보여준다. 티올기를 갖는 이중블록 공중합체는 티올-마이클 첨가 클릭 반응에 의해, 말레이미드기로 기능기화된 NGO와 결합하게 된다.
도 21(A)는 D2O에서 poly(AAc)의 1H NMR 스펙트럼으로, 1.78 ppm 및 2.41 ppm 부근에서 관찰된 피크는 각각 poly(AAc) 상의 메탄다이일 기(methanediyl) 및 메틴(methine) 기의 양성자를 의미한다. 도 21(B)는 DMSO-D6에서 poly(NIPAM-b-AAc)의 1H NMR 스펙트럼으로, 12.13 ppm 및 3.84 ppm 부근에서 관찰된 피크는 각각 poly(AAc) 블록 상의 카르복시기의 양성자 및 poly(NIPAM) 블록 상의 알킬기의 양성자를 의미한다. Poly(AAc)-CDTPA는 각각 두개의 다른 길이를 갖는 블럭으로 중합되었다. 하기 표 2에는 각 반응 조건과, 2.41 ppm 및 1.30 ppm에서 각각 관찰된 AAc의 메틴기와 메탄다이일 사슬 [(-CH2)9-] CDTPA의 1H NMR 피크의 적분값을 비교하여 산출한, 수 평균 분자량을 나타내었다. 또한, 표 3은 poly(NIPAM) 블록 각각의 길이를 나타내었다.
Figure 112017059153982-pat00002
Figure 112017059153982-pat00003
한편, 도 21(C) 및 (D)는 상기 poly(NIPAM230-b-AAc35) 및 poly (NIPAM260-b-AAc221)의 온도에 따른 UV/Vis 흡광도 프로파일로서, 사슬의 길이가 증가함에 따라, 좀 더 높은 하한 임계 용액온도를 보여주고 있다.
실시예 3. GNR - poly ( NIPAM - b - AAc )-NGO의 제조 및 특성 분석
도 22은 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 합성과 온도 의존적인 SERS 신호의 향상 효과를 모식화한 것이다. 구체적으로, 말레이미드가 기능기화된 나노 크기의 그래핀 옥사이드 및 티올기로 기능기화된 poly(NIPAM-b-AAc) 브러쉬는 말레이미드-티올 클릭 반응을 통해 결합된다. 이후, 양전하를 띄는 GNR은 음전하를 띄는 poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 poly(AAc) 블록에 전하간 상호작용을 통해 결합된다. 폴리머 브러쉬 내 온도 반응성 poly(NIPAM) 블록의 존재로 인해, 고분자 브러시의 하한 임계 용액온도 (lower critical solution temperature, LCST) 이상에서, poly(NIPAM) 블록이 소수성이 증가하여 응집이 되고 이로 인해 금 나노로드와 그래핀 옥사이드의 표면 간의 거리가 감소하여 SERS 신호가 증가하게 된다.
도 23(A)는 라만 리포터인 MGITC의 농도에 따른 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 SERS 신호를 보여준다. MGITC 농도가 증가함에 따라 SERS 신호도 증가하지만, 10-5 M 이상은 금 나노로드에 부착된 MGITC가 포화 상태여서 더 이상 SERS 신호가 증가하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 도 23(B)는 MGITC의 농도 10-4 M에서 금 나노로드와 poly(NIPAM-b-AAc)-NGO 질량 비율에 따른 SERS 신호를 측정한 것이다. 금 나노로드와 결합하는 poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 양이 증가함에 따라 SERS 신호도 증가를 하지만 1:20 이후는 금나노로드와 poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 결합이 포화 상태가 되어 더 이상 눈에 띄는 SERS 신호 증폭을 확인할 수 없었다. 도 23(C) 및 (D)는 하한 임계 용액온도 이하 또는 이상일 때 GNR-poly(NIPAM265-AAc62)-NGO 및 GNR-poly(NIPAM332-AAc162)-NGO의 SERS 스펙트럼으로, 모두 하한 임계 용액온도 이상일 때, poly(NIPAM) 블록의 응집으로 SERS 신호가 증폭된 것을 확인할 수 있었다.
도 24(A) 및 (B)는 각각 단일 금 나노로드와 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 투과전자현미경의 이미지이다. 두 이미지를 비교해 보면, 단일 금 나노로드일 때보다 poly(NIPAM-b-AAc)-NGO와 결합한 금 나노로드에서 클러스터 (cluster)가 형성되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. SERS 기반 바이오센싱 플렛폼 제조
GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO와 자성 비드를 사용하여 SERS 기반의 바이오센싱을 제조하였다. 상기 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO는 SERS 나노프로브로서, anti-human IgG pAbs와 화학적으로 결합하였고, 상기 자성 비드는는 anti-human IgG mAbs와 결합하여, IgG에 대한 샌드위치형 면역복합체를 형성하였다. 도 25(A) 및 (B)는 각각 고분자 브러시의 하한 임계 용액온도 이상 또는 이하의 온도에서 IgG 농도에 따른 SERS 스펙트럼이다. 같은 농도의 항체 조건에서 LCST 이상일 때 SERS 신호가 증가한 것을 확인할 수 있었다. 도 25(C)는 SERS 스펙트럼의 1650cm-1에서 IgG 항체 농도에 따른 SERS 신호의 변화를 나타낸 것이다. LCST 이상의 온도일 때의 신호가 LCST 이하일 때 보다 더 낮은 농도의 항체를 측정 할 수 있었고, 같은 농도에서는 더욱 강한 신호를 관찰 할 수 있었다. 이를 통해 온도 반응성을 지닌 GNR-poly(NIPAM-b-AAc)-NGO의 SERS 나노프로브는 높은 온도에서 SERS 신호의 증폭을 유도하여 검출한계 (limit of detection, LOD) 값이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (20)

  1. 음전하성 고분자 및 온도 반응성 고분자로 이루어지는 공중합체로 표면 개질된 그래핀 옥사이드; 및
    상기 공중합체의 음전하성 고분자와 정전기적 상호작용으로 결합되며, 라만 리포터가 부착되어 있는 금속 나노로드 (Gold nanorod)를 포함하며 콜로이드 안정성을 가지는, 표면 증강 라만 산란 (SERS) 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 음전하성 고분자는, 폴리(아크릴릭 액시드)[poly(acrylic acid)], 폴리(메타크릴릭 액시드)[poly(metacrylic acid)], 폴리(이타코닉 액시드)[poly(itaconic acid)], 및 폴리(말레익 액시드)[poly(maleic acid)] 중 어느 하나인 것인, 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 온도 반응성 고분자는, 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)[poly(N-isopropylacrylamide): polyNIPAM], 폴리(N-디에틸 아크릴아마이드)[poly (N,N'-diethyl acrylamide): polyDEAAm], 폴리(디메틸아미노 에틸 메타크릴레이트)[poly (dimethylamino ethyl methacrylate): polyDMAEMA], 폴리(N-하이드록시메틸 프로필 메타아크릴아마이드)[poly (N-(L)-(1-hydroxymethyl) propyl methacrylamide)], 폴리[올리고(에틸렌글리콜)메틸에테르메타크릴레이트] [Poly[oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate]: POEGMA], 폴리(2-비닐 피리딘)[poly(2-vinyl pyridine): P2VP], 및 폴리(4-비닐 피리딘) [poly(4-vinyl pyridine): P4VP] 중 어느 하나인 것인, 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 공중합체는, 음전하성 고분자 및 온도 반응성 고분자로 이루어지는, 랜덤 공중합체 또는 블록 공중합체인 것인, 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 공중합체는, 그래핀 옥사이드 표면에 브러쉬 형태로 배치되는 것인, 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 라만 리포터는, 로다민 6G, 로다민 B 이소티오시아네이트(RBITC), 아데닌, 4-아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 4-머캅토피리딘, 6-머캅토퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리민딘, 8-머캅토아데닌, 9-아미노-아크리딘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 라만 리포터의 농도는 10-8 내지 10-3M인 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 금속은, 금, 은, 구리 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터의 크기는, 10 내지 1000 nm의 범위인 것인, 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터는 온도 반응성을 나타내며,
    상기 온도 반응성은, 하한 임계 용액 온도 (LCST) 이상에서, 라만 리포터가 부착된 금속 나노로드와 그래핀 옥사이드간 거리가 감소됨에 따라 표면 증강 라만 산란 신호의 강도가 증가되는 것인, 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터.
  11. 음전하성 고분자 및 온도 반응성 고분자로 이루어지는 공중합체로 그래핀 옥사이드의 표면을 개질하는 단계; 및
    상기 표면이 개질된 그래핀 옥사이드와 라만 리포터가 부착된 금속 나노로드를 혼합하는 단계를 포함하며 콜로이드 안정성을 가지는, 표면 증강 라만 산란 기반 바이오센싱 또는 바이오이미지 측정용 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 그래핀 옥사이드의 표면을 개질하는 단계는,
    원자이동 라디컬 중합을 통해, 그래핀 옥사이드의 표면에 음전하성 고분자 및 온도 반응성 고분자로 이루어지는 공중합체를 결합시키는 것인, 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터의 제조방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 그래핀 옥사이드 표면을 개질하는 단계는,
    가역적 사슬 전달 중합을 통해, 그래핀 옥사이드의 표면에 온도 반응성 고분자를 결합시키고, 뒤이어, 가역적 사슬 전달 중합을 통해, 상기 그래핀 옥사이드의 표면에 결합된 온도 반응성 고분자에 음전하성 고분자를 결합시키는 것인, 그래핀 옥사이드-금속나노로드 클러스터의 제조방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 그래핀 옥사이드의 표면을 개질하는 단계는,
    말레이미드기로 기능기화된 그래핀 옥사이드; 및 말단에 티올기가 도입된, 음전하성 고분자 및 온도 반응성 고분자로 이루어지는 공중합체를 반응시키는 것인, 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터의 제조방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 음전하성 고분자는, 폴리(아크릴릭 액시드)[poly(acrylic acid)], 폴리(메타크릴릭 액시드)[poly(metacrylic acid)], 폴리(이타코닉 액시드)[poly(itaconic acid)], 및 폴리(말레익 액시드)[poly(maleic acid)] 중 어느 하나이고,
    상기 온도 반응성 고분자는, 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)[poly(N-isopropylacrylamide): polyNIPAM], 폴리(N-디에틸 아크릴아마이드)[poly (N,N'-diethyl acrylamide): polyDEAAm], 폴리(디메틸아미노 에틸 메타크릴레이트)[poly (dimethylamino ethyl methacrylate): polyDMAEMA], 폴리(N-하이드록시메틸 프로필 메타아크릴아마이드)[poly (N-(L)-(1-hydroxymethyl) propyl methacrylamide)], 폴리[올리고(에틸렌글리콜)메틸에테르메타크릴레이트] [Poly[oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate]: POEGMA], 폴리(2-비닐 피리딘)[poly(2-vinyl pyridine): P2VP], 및 폴리(4-비닐 피리딘) [poly(4-vinyl pyridine): P4VP] 중 어느 하나인 것인, 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터의 제조방법.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 공중합체는, 음전하성 고분자 및 온도 반응성 고분자로 이루어지는, 랜덤 공중합체 또는 블록 공중합체인 것인, 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터의 제조방법.
  17. 제11항에 있어서,
    상기 라만 리포터는, 로다민 6G, 로다민 B 이소티오시아네이트(RBITC), 아데닌, 4-아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 4-머캅토피리딘, 6-머캅토퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리민딘, 8-머캅토아데닌, 9-아미노-아크리딘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 금속은, 금, 은, 구리 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터의 제조방법.
  18. 항원에 특이적인 항체가 컨쥬게이션된 자성 나노입자와 상기 항원을 반응시켜 자성 나노입자-항원 면역 복합체를 제조하는 단계;
    상기 자성 나노입자-항원 면역 복합체와 상기 항원에 특이적인 항체가 컨쥬게이션된 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터를 혼합하여 샌드위치형 면역 복합체를 제조하는 단계; 및
    상기 샌드위치 면역복합체에 레이저광을 조사하여 표면 증강 라만 산란 신호를 측정하는 단계를 포함하는, 표면 증강 라만 산란 기반 바이오센싱 또는 바이오이미징 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 자성 나노입자에 컨쥬게이션된 항체는, 항원 특이적인 모노클론 항체인 것인, 바이오센싱 또는 바이오이미징 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 그래핀 옥사이드-금속 나노로드 클러스터에 컨쥬게이션된 항체는 항원 특이적인 폴리클론 항체인 것인, 바이오센싱 또는 바이오이미징 방법.
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