KR20080093486A - 동물의 면역능을 증강시키는 신규한 청피 추출물 및 그용도 - Google Patents

동물의 면역능을 증강시키는 신규한 청피 추출물 및 그용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물의 면역능을 증강시키는 신규한 청피 (Citrus unshiu Markovich) 추출물 및 그 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 동물의 주요 면역세포인 호중구 및 대식구의 각종 활성을 증강시키고 병원세균의 공격접종에 대한 강력한 방어능을 유발하는 청피 추출물을 정제하고, 정제된 청피 추출물을 유효성분으로 함유하여 동물의 질병을 효율적으로 치료, 예방할 수 있는 동물용 면역증강제, 백신 보좌제 (adjuvants), 치료 효능을 증강시킬 수 있는 보조치료제 등의 동물성 의약품, 및 사료첨가제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 청피 추출물은 국내외에서 아직 면역증강 효능이 알려져 있지 않은 신규한 물질로서 동물의 각종 면역능을 증진시키는 것으로 확인됨으로써 기존 백신의 효능을 개선할 수 있을 것으로 기대되는 바, 양축농가의 가축질병으로 인한 경제적 피해를 크게 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 외국 수입품에 의존하고 있는 동물용 의약품을 국산화하는 잇점도 갖는다. 또한, 본 발명은 상기 청피의 재배가 국내에서 가능함으로써 농가의 부수입원 개발이라는 측면에서도 유용한 효과를 갖는다.
청피 추출물, 무작위유주, 과산화물 산생, 비장세포 증생, 싸이토카인, 비특이적 방어

Description

동물의 면역능을 증강시키는 신규한 청피 추출물 및 그 용도{An extract from Citrus unshiu Markovich having improved immunity capability of animals and its use}
본 발명은 동물의 면역능을 증강시키는 신규한 청피 (Citrus unshiu Markovich) 추출물 및 그 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 동물의 주요 면역세포인 호중구 및 대식구의 각종 활성을 증강시키고 병원세균의 공격접종에 대한 강력한 방어능을 유발하는 청피 추출물, 이를 유효성분으로 함유하여 동물의 질병을 효율적으로 치료, 예방할 수 있는 동물용 면역증강제, 백신의 효능을 향상시킬 수 있는 보좌제 (adjuvants) 및 치료 효능을 증강시킬 수 있는 보조치료제 등의 동물성 의약품, 및 사료첨가제에 관한 것이다.
동물에서 각종 병원미생물 침입에 1차적으로 저항할 수 있는 면역을 담당하는 것은 체내에 있는 주요 면역세포인 호중구 (neutrophil), 대식구 (macrophages), 림프구 (lymphocytes) 등이며 이들의 활성이 비정상적일 때 병원미생물이 감염, 증식하여 발병하게 된다. 면역증강물질은 이러한 질병방어에 주요 역 할을 담당하고 있는 각종 면역세포의 기능을 증강시켜 질병 감염에 대한 저항성을 높여준다. 이러한 면역증강물질은 동물, 식물, 미생물 등 다양한 생물체에 존재하는 것으로 알려져 있으며 이들로부터 추출한 많은 물질이 사람 및 동물의 면역증강제로서 개발되어 사용되고 있다.
자연에서 추출한 면역증강물질 관련 종래 기술로는 한국특허공개 제2001-0037497호 (보체계 활성화 기능을 가지는 백리향 추출물 및 그의 제조방법)에서 백리향 열수 추출물로부터 30-75%의 에탄올 침전분획, 분자량 30만 이상의 한외여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 겔 크로마토그래피를 수행하여 보체계 활성화 다당류를 제공함으로써 암환자나 면역저하 환자용의 기능성 식품이나 약물에 유용하게 사용될 수 있는 백리향 추출물의 면역 증강 효능을 찾아볼 수 있다.
또한, 한국특허 공개 제2002-0004083호 (작약 또는 육두구 추출물을 함유하는 가공식품)에서 인공보존제가 아닌 천연 생약 추출물인 작약 및/또는 육두구 추출물을 사용하여 수분보유력을 향상시키고 pH 저하를 억제하며, 식품의 보존효과를 높인 가공 식품에 대하여 개시하고 있다.
나아가, 한국특허 공개 제2003-0091665호 (신규한 인삼잎 및 줄기 다당체, 그 제조방법 및 그를 활성성분으로 함유하는 항암제 및 항암보조제 조성물)에서 인 삼잎 및/또는 줄기로부터 분리한 다당체 성분을 활성성분으로 함유하는 항암제,암전이 억제제 및/또는 조혈촉진작용, 골수방어작용, 방사선 민감 작용이 탁월한 항암제 또는 항암보조제 조성물이 개시되어 있다.
일반적으로, 청피의 주 성분은 노비레틴 (Nobiletin), 5-하이드록시오라네틴 (5-hydroxyauranetin)으로 알려져 있다. 현재까지 상기 청피의 약리작용은 소화 촉진, 항알러지, 항균작용이 있어 한방에서는 위와 간의 동통, 식체, 유방 종통 등과 간기능 개선에 도움을 주는 약으로 사용되고 있으나, 식물인 청피에서 유용물질을 추출하고, 이들로부터 시험관 내 (in vitro) 및 실험동물 내 (in vivo)에서 면역증강 효능 등에 관하여 보고된 바는 없다.
따라서, 본 발명자들은 천연물질인 청피로부터 물리적인 방법으로 신규한 유용물질을 추출해낸 다음, 추출물의 각종 면역세포 활성 증강효능 및 실험동물에서 병원미생물 공격접종에 대한 비특이적인 방어능 향상효능을 시험한 결과, 청피 추출물의 면역증강활성을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
상기와 같은 종래의 문제점을 해소하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 천연물질을 이용한 면역증강물질 개발연구의 일환으로 특히, 면역증강 활성이 우수한 신규한 청피 추출물의 정제방법을 제공하려는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 정제된 청피 추출물을 동물용 면역증강제, 백 신보좌제 및 보조치료제, 사료첨가제 등으로서 사용하는 새로운 용도를 제공하려는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 청피 추출물 정제 방법은 청피로부터 가열처리, 농축을 수행하는 것을 특징으로 한다. 특히 가열처리로는 열수 추출을 수행하는 것이 성분의 파괴를 방지하는 측면에서 볼 때 바람직하다.
또한, 본 발명의 청피 추출물은 동물의 주요 면역세포인 호중구 및 대식구에 대한 유주능, 마우스 비장세포 증생능, 싸이토카인 산생능 향상 및 병원미생물 공격접종에 대한 마우스 방어효과를 확인하고 추출물의 면역증강물질로서의 효능을 입증하고, 이를 유효 성분으로 하는 조성물을 동물용 면역증강제, 백신 보좌제 및 치료보조제, 사료첨가제의 용도로 각각 제공하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명의 청피 추출물의 정제 방법 및 그 용도의 기술적 사상을 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 청피에 3-10배의 물을 넣어 열탕하면서 물이 1/2 정도까지 줄어들도록 가열 추출한다. 이때 가열 조건은 80-120℃에서 2-3시간동안, 바람직하게는 100℃ 내외에서 3-4시간동안 수행하는 것이 좋다.
열수 추출액을 잔사를 제거하기 위하여 추출액과 잔사를 여과지를 이용하여 분리시킨 후 부유하고 있는 작은 입자까지 제거하기 위하여 정밀 여과 공정을 거친다.
그런 다음 0.45㎛ 세균 여과지를 사용하여 2차 여과하면 멸균 처리까지 함께 수행할 수 있으므로 더욱 바람직하다.
또는 일반적으로 천연물의 열수 추출물에는 알카로이드, 플라보노이드, 테르페노이드와 같은 저분자 물질과 다당류, 단백질, 탄닌 등과 같은 고분자 물질이 다양하게 혼재하게 되므로, 다당체(polysaccharide)를 회수하기 위하여 추출물에 3-4배 정도의 에탄올을 첨가하게 되면, 다당체들이 침전되고 침전물을 회수함으로서 조다당 분획을 수득할 수 있다.
그런 다음 용액을 회수하여 동결건조시킨다. 이때 건조방법은 일반적인 열풍, 진공 건조, 동결 건조, 분무 건조 중 하나를 택하여 건조한다. 목적하는 제제 또는 용도에 따라 보다 효과적이고 부가적인 분리방법 혹은 정제방법을 채택할 수 있다.
얻어진 추출물의 건조 농축량은 0.67g/5ml, 추출 효율은 13.3%임이 측정되었다. 또한, 상기 추출물은 청피 다당체로서, 상기 다당체의 당으로는 단백질이 포함된 단백 다당을 포함하는 것을 특징으로 하며, 특히 단백질 함량은 0.0001 내지 2%로 구성됨을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 다당체의 당 구성은 람노스, 퓨코스, 아라비노스, 크실로스, 만노스, 글루코스, 갈락토스, 푸락토즈, 갈락투론산, 글루큐론산 및 KDO를 포함하는 것을 특징으로 하며, 다당체의 분자량은 250,000 Da 내지 6,000 Da 정도를 지니며, 140,000Da에서 main peak가 검측된다. 이것을 이온 크로마토그라피로 분석할 때 단당류인 글루코스 4.89mg/ml 이상, 푸락토즈 4.01mg/ml 이상을 함유하고 있다.
상기와 같이 수득한 청피 추출물을 활성성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물에 대하여 다음과 같은 다양한 실험을 통하여 면역증강 작용을 규명하였다:
1. 산양 혈중 호중구 (neutrophil)의 무작위 유주능 (Random migration) 증강효과를 살펴본 결과, 청피 추출물을 10배, 100배, 1000배로 희석 처리한 것의 유주 면적이 무처리 대조군의 유주 면적보다 통계적으로 1-5% 수준의 유의한 차이를 나타내었으며 1000배로 희석 처리한 호중구도 대조군에 비하여 유의한 차이 (p<0.05)를 나타낸 것을 확인하였다.
2. 청피 추출물의 마우스 비장세포 증생 (proliferation)능에 미치는 효과를 살펴본 결과, 청피 추출물을 100배로 희석 처리한 것의 광학적 밀도 (O.D)가 0.2843으로 통계적으로 유의한 수준은 아니었으나 대조군의 광학적 밀도 0.2683보다는 현저히 높은 분아 능을 자극한 것을 확인하였다.
3. 청피 추출물 접종 마우스 혈중 싸이토카인 생성량을 살펴본 결과, 청피 추출물 접종 마우스 혈중 인터루킨-2의 검출량은 62.5피코그람 (pg/ml)으로 비 접종 대조군에 비하여 현저히 많은 양의 인터루킨-2가 생성되었으며 감마인터페론의 경우도 15.6 피코그람 (pg/ml)이 검출되어 <7.81pg이하의 감마인터페론을 나타낸 비접종 대조 마우스보다 많은 싸이토카인 생성량을 나타낸 것을 확인하였다.
4. 병원성 포도상구균 (Staphylococcus aureus) 공격접종에 대한 방어능 향상효과를 살펴본 결과, 청피 추출물을 100배 희석 접종한 마우스는 공격접종에서 80% 생존하였으나 대조군 마우스는 모두 폐사하여 매우 양호한 비특이적 방어능을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
결과적으로, 본 발명에 의한 열수, 농축으로 이루어진 정제 공정에 따르면, 동물의 각종 면역세포의 활성을 증진시키고 병원미생물에 대한 비특이 방어능을 향상시키는 청피 조성물을 얻을 수 있다.
이렇게 하여 얻어진 청피 조성물은 다양한 동물용 의약품 제조에 활용될 수 있다. 이때 동물용 의약품으로는 동물의 질병을 효율적으로 치료, 예방할 수 있는 동물용 면역증강제, 백신의 효능을 향상시킬 수 있는 보좌제 및 치료효능을 증강시킬 수 있는 보조치료제, 사료첨가제 등으로서 사용할 수 있다.
이러한 목적을 위하여 본 발명의 조성물은 그 자체로 혹은 약제학적 분야에서 통상적으로 혀용되는 담체와 함께 배합하여 약제학적 분야에서 통상적인 제제, 예를 들면 정제, 캅셀제, 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제, 주사용 제제 또는 현탁액, 사료 첨가제 등의 다양한 제제로 제형화 할 수 있다. 또한, 경구투여시 약제가 위산에 의해 분해되는 것을 방지하기 위하여 제산제를 병용하거나 정제 등의 경구투여용 고형 제제를 장용피로 피복한 제제로 제형화하여 투여할 수도 있다.
본 발명에 따른 청피 추출물의 다당체 분획의 투여량은 동물의 체내에서 활성성분의 흡수도, 불 활성화율 및 배설속도, 동물의 나이, 성별, 상태에 따라 적절히 사용하여야 하나, 일반적으로 1kg당 10-100mg/일, 바람직하게는 20-50mg/일,의 양이 투여되도록 한다.
구체적으로, 본 발명에 의해 얻어진 청피 추출물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 단백 다당을 포함하는 다당체로 구성되고, 동결건조한 상태로 제작한 다음 사용시 멸균증류수에 희석시켜 주사하는 동물용 면역 증강제로서 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 얻어진 청피 추출물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 단백 다당을 포함하는 다당체로 구성되고, 불활화 백신의 항원 또는 백신의 보좌제로 사용되는 겔 혹은 오일류의 유성보좌제에 첨가하여 주사하는 백신 보좌제로 서 제공할 수 있다. 이때 백신의 보좌제로 사용되는 겔로는 이에 한정하는 것은 아니나, 통상 입수가능한 알루미늄 하이드록사이드 겔 등을 사용하면 충분하다.
또한, 본 발명에 의해 얻어진 청피 추출물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 단백 다당을 포함하는 다당체로 구성되고, 동결건조한 상태로 제작한 다음 사용시 멸균증류수에 희석시켜 주사하는 동물의 치료효능 증강용 보조 치료제로서 제공할 수 있다.
나아가, 본 발명에 의해 얻어진 청피 추출물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 단백 다당을 포함하는 다당체로 구성되고, 분말 형태로 제작하여 동물 사료에 추가로 포함하는 동물용 사료첨가제로서 제공할 수 있다. 이때 동물용 사료로는 동물용 분말사료, 송아지 대용유 또는 자돈의 입질사료 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있으며, 상기 분말형 추출물의 함량은 사료 1kg당 100-1000mg 범위 내이면 충분하다.
이하, 본 발명의 구성 및 효과를 나타내기 위하여 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명하고자 하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 이에 한정하고자 하는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1: 청피로부터 유용물질 추출
건조시킨 청피 50g을 증류수 200ml에 넣어 초자 약탕기에서 열탕하면서 액체의 양이 100ml가 되도록 농축하였다.
이 추출액을 여과지로 1차 여과 후 0.45㎛ 세균여과지로 여과 멸균 후 5ml씩 공병에 분주하여 동결건조하고 냉장보관하면서 시험에 사용하였다 (건조농축량; 0.67g/5ml, 추출효율; 13.3%).
또한, 이온 크로마토그라피로 분석한 결과, 단당류인 구루코스 4.89mg/ml, 푸락토즈 4.01mg/ml를 함유하고 있는 것을 확인할 수 있었으며, 단백다당을 포함하고 그 단백질의 함량은 0.0001 내지 2%로 구성된 것을 확인하였다.
실시예 2: 청피 추출물의 산양 혈중 호중구 ( neutrophil )의 무작위 유주능 ( Random migration ) 증강효과 규명
1) 산양 혈중 호중구 분리 및 청피 추출물로 혼합처리
산양의 경정맥으로부터 혈액을 채혈하여 항응고제인 에이시디액 (ACD, sodium citrate, citric acid, dextrose)과 혼합하고 2,500 x g, 20분 원심분리하여 연막 (buffy coat)을 제거 후 적혈구를 용혈시켜 1500 x g, 5분 원심분리하여 호중구를 수집후 알피엠아이 (RPMI1640) 배지에 호중구 수가 1x107/ml 되도록 부유하여 시험에 사용하였다.
청피 추출물로 호중구를 혼합처리하기 위하여 실시예 1에서 얻어진 청피 추 출물의 동결건조물을 알피엠아이 배지 5ml로 부유하여 10배, 100배, 1000배가 되도록 희석하고 동량의 호중구부유액 (1x107/ml)과 혼합하여 탄산가스배양기 (CO2 incubator)에서 37oC에서 1시간 동안 혼합처리하였다.
2) 무작위 유주능 ( Directional migration ) 증강효과
상기 실시예 2-1)에서 청피 추출물과 혼합처리한 호중구 10㎕를 아가로즈 프레이트 (agarose plate)에 직경 3mm가 되게 만든 홀 (hole)에 넣고 탄산가스 배양기에서 37oC, 18시간 적용후 8% 글루타알데하이드 액으로 고정하고 겔을 제거 후 세척, 건조하였다.
건조시킨 플레이트를 스타트 염색액 (Stat stain, Volu-Sol, Inc.)으로 염색하여 호중구가 유주한 거리를 현미경 (MC-50T, MEIJI/Japan)으로 측정하고 호중구의 유주 면적을 하기 수학식 1에 기초하여 계산하였다.
유주 면적 = πr2-π (홀 반지름)2
희석 배수별 청피 추출물로 처리한 산양 혈중 호중구의 무작위 유주능에 미치는 영향을 하기 표 1에 정리하였다.
청피 추출물로 처리한 산양 혈중 호중구의 무작위 유주능에 미치는 영향
구 분 처리농도 유주면적 (mm2) 비 고
청피 추출물 10배 희석 19.89±1.68**
100배 희석 27.49±7.61*
1000배 희석 25.23±3.80**
상업용 면역증강제 (양성대조) 10배 희석 7.13±1.47
100배 희석 5.36±1.37
1000배 희석 5.26±0.37
대조군 - 12.72±6.44
상기 표 1에서 보듯이, 청피 추출물을 10배, 100배, 1000배로 희석 처리한 경우의 유주 면적이 각기 19.89, 27.49, 25.23mm2으로서, 무처리 대조군의 유주면적 12.72mm2보다 현저히 넓었으며 통계적으로 1-5% 수준의 유의한 차이를 나타내었으며 1000배로 희석 처리한 호중구도 대조군에 비하여 유의한 차이(p<0.05)를 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
또한 고농도인 10배 희석 처리 군에서도 유주능의 증강을 나타낸 것으로 보아 호중구에 대하여 고농도에서도 독성을 나타내지 않는 것으로 보였다.
실시예 3: 청피 추출물의 마우스 비장 세포 (spleen cell) 증생능 (proliferation)에 미치는 효과
1) 비장 세포 분리
25g의 아이시알 (ICR, ♂) 마우스를 경추 탈골법으로 처리하고 복벽을 절개하여 비장을 분리하여 동망 마쇠법으로 비장 세포를 수집하였다.
얻어진 비장 세포에 혼재하여 있는 적혈구를 용혈시켜 제거하고 인산 완충식염수로 2회 세척하여 세포 수를 2x106/ml 되도록 알피엠아이 배지에 부유하고 조 배양용 마이크로플레이트 각 홀에 100㎕씩 분주하였다.
2) 증생능 조사
상기 실시예 3-1)에서 얻어진 비장 세포가 들어 있는 각 홀에 알피엠아이 배지로 10배, 100배, 1000배가 되도록 희석한 청피 추출물과 콘에이 (Con A, 15㎍/ml)를 각 홀에 50㎕씩 첨가하고 탄산가스배양기에서 37oC, 48시간 배양하였다.
배양이 끝난 프레이트 각 홀에 엠티티 시약 (MTT, 4mg/ml) 50㎕씩을 가하고 탄산가스배양기에서 37oC, 4시간 반응시킨 후에 상층액을 제거하고 200㎕의 디엠에스오액 (DMSO : EtOH=1:1) 200㎕와 소렌손 시액 (Sorenson`s buffer) 50㎕씩을 가하여 반응으로 생성된 포르마잔을 용해시켰다.
얻어진 용해액을 흡수파장 560nm에서 흡광도를 엘라이자 판독기 (ELISA reader, Titertec multiscan)로 판독하여 분아능을 측정하였다.
희석 배수별 청피 추출물로 처리한 마우스 비장 세포의 분아능에 미치는 영향을 하기 표 2에 정리하였다.
청피 추출물로 처리한 마우스 비장 세포의 증생능에 미치는 영향
구 분 처리농도 광학적 밀도 (O.D) 비 고
청피 추출물 10배 희석 0.2573±0.024
100배 희석 0.2843±0.028
1000배 희석 0.1953±0.034
대조군 - 0.2683±0.096
상기 표 2에서 보듯이, 청피 추출물을 100배로 희석 처리한 것의 광학적 밀도 (O.D)가 0.2843으로 통계적으로는 유의한 수준은 아니었으나 대조군의 0.2683보다는 현저히 높은 분아능을 자극한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 청피 추출물 접종 마우스 혈중 사이토카인 (인터루킨-2 및 감마인터페론) 산생량
1) 청피 추출물의 마우스 접종 및 채혈
청피를 멸균 증류수로 원액의 100배로 희석, 조제하고 25g의 아이시알 (ICR, ♂) 마우스 복강으로 0.2ml를 2수에 접종하고 3일 후 안와 동맥으로부터 채혈하여 혈청을 분리한 즉시 냉동보관하면서 혈청 중 사이토카인 양을 시험하였다.
2) 인터루킨-2 및 감마인터페론 생성량 조사
마우스 혈청 중 인터루킨-2 및 감마인터페론 생성량 조사는 인스턴트 엘라이자 킷트 (Bender MedSystems, Austria)를 이용하였다.
즉, 희석 액으로 2배로 희석한 혈청 50㎕와 100㎕의 증류수를 종류별 사이토카인 킷트의 마이크로플레이트 홀에 가하고 실온에서 3시간 반응시킨 후 세척액 (wash buffer)으로 6회 세척하였다.
여기에 티엠비기질액 (TMB substrate solution) 100㎕씩을 가하고 실온에서 10분 발색시킨 후에 100㎕씩의 반응중지액 (stop solution)을 가하고 흡수파장 450nm에서 흡광도를 엘라이자 판독기 (ELISA reader, Titertec multiscan)로 판독하여 표준품의 표준곡선을 이용하여 인터루킨-2 및 감마인터페론 생성 량을 측정하였다.
청피 추출물을 마우스에 접종하고 혈중의 싸이토카인 생성 량을 조사한 결과를 하기 표 3에 정리하였다.
청피 추출물 접종 마우스의 혈중 사이토카인 산생량
구 분 접종농도 인터루킨-2 (IL-2) 감마인터페론 (IFN-gamma) 비 고
광학적밀도 (O.D) 생성양 (pg/ml) 광학적밀도 (O.D) 생성양 (pg/ml)
청피 추출물 100㎍/ml 0.0905 62.5 0.1045 15.6
대조군 - 0.0685 <7.81 0.0790 <7.81
상기 표 3에서 보듯이, 인터루킨-2의 검출량은 62.5피코그람 (pg/ml)으로 비 접종 대조군에 비하여 현저히 많은 양의 인터루킨-2가 생성되었으며 감마인터페론의 경우도 15.6 피코그람 (pg/ml)이 검출되어 <7.81pg 이하의 감마인터페론을 나타낸 비접종 대조 마우스보다 많은 싸이토카인 생성 량을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 청피 추출물의 병원성 포도상구균 (pathogenic Staphylococcus aureus) 공격 접종에 대한 방어능 향상효과
청피 추출물의 마우스접종 및 공격접종
청피 추출물을 멸균증류수에 원액의 100배가 되도록 희석, 조제하고 25g의 아이시알 (ICR, ♂) 마우스 복강으로 0.2ml를 4수에 접종하고 3일 후 병원성 포도상구균 (Staphylococcusaureus, strain 289)으로 최소치사량의 10배 (10MLD/0.3ml)량을 복강으로 공격접종하였다.
5일간의 생존율로 방어효과를 조사한 결과를 하기 표 4에 정리하였다.
청피 추출물의 병원성 포도상구균 공격 접종에 대한 방어능
구 분 접 종 (0.2ml, 복강) 공 격 접 종 방어효과 (%) 비 고
청피 추출물 100배 희석액 0.3ml (10MLD), 복강 1/4 (75)
대조군 - “ 4/4 (0)
상기 표 4에서 보듯이, 청피 추출물을 100배 희석 접종한 마우스는 공격접종에서 75% 생존하였으나 대조군 마우스는 모두 폐사하여 매우 양호한 비특이적 방어능을 보였다.
제조예 1: 동물성 면역 증강제
동물성 면역 증강제로서 사용하기 위하여, 유리병에 실시예 1의 추출물을 동결건조한 상태로 제작하여 주사용으로 사용가능하게 하였다. 추후 사용시 멸균증류수에 적절히 희석시켜 사용하면 충분하다.
제조예 2: 백신 보좌제
불활화 백신의 항원 또는 백신의 보좌제로 사용되는 겔(알루미늄 하이드록사이드 겔) 혹은 유성보좌제(오일류)에 실시예 1의 추출물을 100㎍-1mg/ml로 첨가하여 주사함으로써 백신의 효능을 개선시킬 수 있다.
제조예 3: 보조치료제
항생제 등으로 동물의 질병을 치료할 때 사용하기 위하여, 유리병에 실시예 1의 추출물을 동결건조한 상태로 제작하여 주사용으로 사용가능하게 하였다. 추후 사용시 멸균증류수에 적절히 희석시켜 사용하면 충분하다.
제조예 4: 동물용 사료첨가제
동물용 분말사료, 송아지 대용유, 자돈의 입질사료 등에 분말형태로 생산한 실시예 1의 추출물을 사료 1kg당 100-1000mg(0.1% 수준)으로 첨가하여 급여하여 제조하였다.
본 발명에 따른 청피 추출물은 국내외에서 아직 면역증강 효능이 알려져 있지 않은 신규한 물질로서 국내에 널리 분포하고 있는 식물류이므로 손쉽게 다량의 추출물을 얻을 수 있고, 동물의 각종 면역능을 증진시키는 것으로 확인됨으로써 기 존 백신의 효능을 개선할 수 있을 것으로 기대되는 바, 양축농가의 가축질병으로 인한 경제적 피해를 크게 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 외국 수입품에 의존하고 있는 동물용 의약품을 국산화하는 잇점도 갖는다.
또한, 본 발명은 상기 청피의 재배가 국내에서 가능함으로써 농가의 부수입원 개발이라는 측면에서도 유용한 효과를 갖는다.

Claims (18)

  1. 청피(Citrus unshiu Markovich)를 가열처리하여 조 (crude) 추출물을 얻는 단계;
    상기 추출물을 농축하는 단계;
    상기 농축물을 여과하여 다당체 분획을 얻는 단계;를 포함하여 이루어지는 청피 추출물의 정제 방법
  2. 제1항에 있어서, 상기 가열처리는 80-120℃에서 2-3시간동안 열수 추출된 것을 특징으로 하는 청피 추출물의 정제 방법
  3. 제1항에 있어서, 상기 여과는 여과지와 세균 여과를 순차적으로 사용하는 것을 특징으로 하는 청피 추출물의 정제 방법
  4. 제1 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 정제된, 청피 추출물
  5. 제4항에 있어서, 상기 추출물은 청피 다당체로서, 상기 다당체의 당으로는 단백질이 포함된 단백다당을 포함하는 것을 특징으로 하는 추출물
  6. 제5항에 있어서, 상기 단백질 함량은 0.0001 내지 2%로 구성되고, 글루코스 함량은 4.89mg/ml 이상이고, 푸락토즈 함량은 4.01mg/ml 이상인 것을 특징으로 하는 추출물
  7. 제5항에 있어서, 상기 다당체의 당 구성은 람노스, 퓨코스, 아라비노스, 크실로스, 만노스, 글루코스, 갈락토스, 푸락토즈, 갈락투론산, 글루큐론산 및 KDO를 포함하는 것을 특징으로 하는 추출물
  8. 제5항에 있어서, 상기 다당체의 분자량은 250,000 Da 내지 6,000 Da임을 특징으로 하는 추출물
  9. 제4항 내지 제8항중 어느 한 항에 의한 청피 추출물을 활성성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물
  10. 제9항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물
  11. 제10항에 있어서, 제산제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물
  12. 제9항에 있어서, 식용음료 또는 식품의 형태로서 제제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물
  13. 제9항 내지 제12항의 어느 한 항에 의한 조성물을 활성성분으로 포함하고, 상기 조성물은 단백 다당을 포함하는 다당체로 구성되고, 동결건조한 상태로 제작한 다음 사용시 멸균증류수에 희석시켜 주사하는 동물용 면역 증강제.
  14. 제9항 내지 제12항의 어느 한 항에 의한 조성물을 활성성분으로 포함하고, 상기 조성물은 단백 다당을 포함하는 다당체로 구성되고, 불활화 백신의 항원 또는 백신의 보좌제로 사용되는 겔 혹은 오일류의 유성보좌제에 첨가하여 주사하는 백신 보좌제.
  15. 제9항 내지 제12항의 어느 한 항에 의한 조성물을 활성성분으로 포함하고, 상기 조성물은 단백 다당을 포함하는 다당체로 구성되고, 동결건조한 상태로 제작한 다음 사용시 멸균증류수에 희석시켜 주사하는 동물의 치료효능 증강용 보조 치료제.
  16. 제9항 내지 제12항의 어느 한 항에 의한 조성물을 활성성분으로 포함하고, 상기 조성물은 단백 다당을 포함하는 다당체로 구성되고, 분말 형태로 제작하여 동물 사료에 추가로 포함하는 동물용 사료첨가제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 동물용 사료로는 동물용 분말사료, 송아지 대용유 또 는 자돈의 입질사료로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 동물용 사료첨가제.
  18. 제17항에 있어서, 상기 분말형 활성성분의 함량은 사료 1kg당 100-1000mg의 범위 내인 것을 특징으로 하는 동물용 사료첨가제.
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