KR20080088799A - 생변환 시스템을 이용한 오르토-디하이드록시이소플라본의제조방법 - Google Patents

생변환 시스템을 이용한 오르토-디하이드록시이소플라본의제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생변환 시스템을 이용한 오르토-디하이드록시이소플라본의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항산화 기능이 우수하고 미백 효과를 가지는 오르토-디하이드록시이소플라본을 효율적으로 제조하기 위하여 다이드제인과 제니스테인을 방선균 유래의 미생물, 특히 스트렙토마이세스 에버미틸리스, 노카르디아 파르키니카( Nocardia farcinica ) 또는 스트렙토마이세스 린콜네시스(Streptomyces lincolnesis)로 생변환시키는 오르토-디하이드록시이소플라본의 제조방법에 관한 것이다.
오르토-디하이드록시이소플라본, 미백용 화장료, 항산화

Description

생변환 시스템을 이용한 오르토-디하이드록시이소플라본의 제조방법{Method for preparing ortho-dihydroxyisoflavones using a biotransformation system}
도 1은 각 시험물질들의 HPLC 분석 결과이다(피크 (1), 대사산물(metabolite)로서 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본(7,3',4'-trihydroxyisoflavone); 피크 (2), 기질인 다이드제인; 피크 (3), 대사산물로서 7,5,3',4'-테트라하이드록시이소플라본(7,5,3',4'-tetrahydroxyisoflavone); 피크 (4), 기질인 제니스테인. HPLC 분석조건은, UV 254 nm, 유속, 1ml/min, 사용된 용매 ACN:DW=3:7, TFA 1% 함유).
도 2a는 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본의 NMR 분석 결과이며, 도 2b는 7,5,3',4'-테트라하이드록시이소플라본의 NMR 분석 결과이다.
도 3은 스트렙토마이세스 에버미틸리스를 이용한 다이드제인에 대한 반응용기로서 기존의 반응용기(A)와 산소 공급을 원활하게 하기 위하여 본 발명에서 사용한 회분식 반응기(B)를 보여주는 사진이다.
도 4는 GC-MS 분석, 기질인 다이드제인과 반응물들의 BSTFA의 유도체화를 이용한 분석 결과이다( 1): 다이드제인, 상온, 18.5min, MS, 398; 2) 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본, 상온, 24.4min, MS, 486; 3) 7,8,4'-트리하이드록시이소플라본, 상온, 25.1min, MS, 486; 4) 7,6,4'-트리하이드록시이소플라본, 상온, 26.8min, MS, 486).
도 5는 다이드제인을 스트렙토마이세스 에버미틸리스로 생변환하여 생성되는 여러 변형된 이소플라본들의 구조식이다.
도 6은 스트렙토마이세스 에버미틸리스의 다이드제인에 대한 반응 및 GC 분석 결과이다(반응 조건, 코일(coil) 사용. rpm 220, 반응시간-1달, R2YE 배지 사용).
도 7은 분석을 위한 BSTFA를 이용한 유도체화 과정을 보여주는 모식도이다.
도 8a 및 도 8b는 시험물질들의 MS 스펙트럼 결과이다.
본 발명은 생변환 시스템을 이용한 오르토-디하이드록시이소플라본의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항산화 기능이 우수하고 미백 효과를 가지는 오르토-디하이드록시이소플라본을 효율적으로 제조하기 위하여 다이드제인과 제니스테인을 방선균 유래의 미생물, 특히 스트렙토마이세스 에버미틸리스, 노카르디아 파르키니카( Nocardia farcinica ) 또는 스트렙토마이세스 린콜네시스(Streptomyces lincolnesis)로 생변환시키는 오르토-디하이드록시이소플라본의 제조방법에 관한 것이다.
이소플라본은 주로 콩에 함유된 식물성 화합물로서, 이소플라본을 아글리 콘(aglycon)으로 하는 배당체(glucosides)로 존재하다 발효과정 중 미생물의 대사에 의해 비당질 형태로 전환된다. 이러한 이소플라본은 항암, 항산화, 항동맥경화, 혈당강하 및 골다공증 예방 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있어 이에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 특히 이소플라본 중 7,8,4'-트리하이드록시이소플라본, 7,6,4'-트리하이드록시이소플라본, 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본 및 7,5,3',4'-테트라하이드록시이소플라본은 오르토-디하이드록시이소플라본(ortho-dihydroxyisoflavone, ODI)으로서 항산화 효과가 다른 이소플라본에 비해 높고 화학적 합성이 어려워 그 가치가 높다.
다이드제인과 제니스테인은 수많은 식물(plant)과 대두(soybean)에서 발견되는 다이페놀(diphenol)의 파이토에스트로겐(phytoestrogen) 화합물이다. 이 화합물들은 항산화제, 항균제 및 금속 킬레이트제의 효과가 있다고 보고되고 있다 (Middleton et al., 1992; Dixon et al., 2002). 더욱이, 인류의 건강을 위해서 의약용이나 화학치료제로 사용되고 있다(Foti et al., 2005). 최근에는 항산화제로서 다이드제인이나 제니스테인의 위치특이적인 수산화된 형태의 화합물들에 대한 관심이 증가하고 있다. 오르토-특이적 수산화된(Ortho-specific hydroxylated) 형태의 이소플라본들이 기존의 다이드제인과 제니스테인 보다 높은 생물학적 영향성이 있다고 보고되고 있으며(Rufer and Kulling, 2006), 항-염증(anti-inflammatory)과 항-알러지(anti-allergenic) 활성을 가지고 있다고 알려져 있다(Rufer and Kulling, 2006). 또한 단백질 타이로신 키나아제(tyrosine kinase)의 억제제로서 항암(anticarcinogenic) 성질을 가지고 있으며(Akiyama et al., 1987), 강력한 타 이로시나아제(tyrosinase) 억제제와 리폭시게나아제(lipoxygenase)의 억제제로 이용된다(Chang et al., 2005; Voss et al., 1992). 또 암에 관련된 질병의 원인을 낮추는 화합물로서 이용된 사례도 보고되었다(Klus and Barz, 1995; Coward et al., 1993). 이러한 수산화된 형태(hydroxylated form)의 화합물들은 유기화학적 방법으로 합성이 어렵기 때문에 천연물 추출이나 생합성 방법으로만 생산이 가능하다.
상기한 바와 같이, 수산화된 형태의 이소플라본의 경우 천연물로부터의 추출이나 미생물을 이용한 생합성을 통해서만 분리 및 정제가 가능하다. 천연물 추출 시에 다이드제인과 제니스테인은 이소플라본의 주요 성분으로서 얻기가 용이하지만, 수산화된 형태는 그렇지 못하다. 다시 말해서, 대두 또는 식물에 함유되어 있는 오르토-디하이드록시이소플라본 같은 경우 그 수득율이 높지 않으며, 미생물을 이용한 생합성 또한 그다지 많이 연구되어 있지 않은 상황이다.
종래의 기술은 천연물 추출에서 얻은 낮은 수율의 수산화된 형태의 화합물 회수와 반응성이 낮은 미생물을 이용한 수산화된 형태의 화합물을 분석하였으나, 미생물을 이용한 오르토-디하이드록시이소플라본의 생산성에 대한 보고는 없다. 또한 동물유래의 간세포를 이용한 오르토-디하이드록시이소플라본의 반응성에 대한 보고는 있지만 낮은 반응성으로 인하여 생산성이 낮은 문제점이 있었다(Kulling et al, 2001).
이에 본 발명자들은 다이드제인과 제니스테인을 방선균 유래의 미생물, 특히 스트렙토마이세스 에버미틸리스, 노카르디아 파르키니카 ( Nocardia farcinica ) 또는 스트렙토마이세스 린콜네시스(Streptomyces lincolnesis)로 생변환시킴으로써 항산화 기능이 우수하고 미백 효과를 가지는 오르토-디하이드록시이소플라본을 효율적으로 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 다이드제인과 제니스테인을 생변환시켜 오르토-디하이드록시이소플라본을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 다이드제인과 제니스테인을 방선균 유래의 미생물, 특히 스트렙토마이세스( Streptomyces ) 속 및 노카르디아 ( Nocardia ) 속 미생물로 생변환시켜 오르토-디하이드록시이소플라본을 제조하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 방선균 유래의 미생물을 이용하여 목적 화합물 즉, 오르토-특이적으로 수산화된 형태의 이소플라본을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 먼저 본 발명에서는 다이드제인과 제니스테인을 기질로 사용하여 오르토-디하이드록시이소플라본을 제조할 수 있는 균주를 스크리닝하였다.
본 발명에 의하여 선별된 균주로는 스트렙토마이세스 에버미틸리스, 노카르 디아 파르키니카 ( Nocardia farcinica ) 및 스트렙토마이세스 린콜네시 스(Streptomyces lincolnesis) 등을 들 수 있다. 이들 균주 중 스트렙토마이세스 에버미틸리스가 가장 높은 오르토-디하이드록시이소플라본 생산성을 보였으며, 또한 제니스테인의 3' 위치에서 위치특이적으로 수산화반응(hydroxylation)을 시키는 것을 확인하였다.
본 발명에서 사용되는 용어는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것으로 당업자라면 그 의미를 누구나 이해할 수 있을 것이나, 본 명세서에서 간략히 설명하면 다음과 같다:
1) ODI: 오르토-디하이드록시이소플라본(ortho-dihydroxyisoflavone)
2) ISP2 배지(1l 기준): 맥아 추출물 5g, 효모 추출물 2g 및 글루코오스 2g.
3) YEME 배지 (1l 기준): 맥아 추출물 3g, 효모 추출물 3g, 펩톤 5g, 수쿠로우스 300g, MgCl2.6H2O (2.5M) 2ml 및 글라신 (20%) 25ml.
4) R2YE 배지: 수크로오스 103g, 글루코오스 10g, 10.12g, K2SO4 0.25g, 효모 추출물 5g, 디프코 카사미노산(Difco casamino acid) 0.1g, TES 완충액(5.73%, pH 7.2) 100ml, KH2PO4 (0.5%) 10ml, CaCl2.2H2O (3.68%) 80ml, L-프롤린(20%) 15ml, 미량 원소 용액(Trace element solution) 2ml 및 NaOH(1N) 5ml.
5) HPLC: 고성능액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography).
6) GC-MS: 가스크로마토그래피-질량 분석기(Gas Chromatography-Mass Spectrometry).
7) NMR: 핵자기공명 분광법(Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy).
8) BSTFA: GC 분석을 위한 유도체. N,O-비스(트리메틸실리)트리플루오로아세트아미드(N,O-bis(trimethylsily)trifluoroacetamide).
9) rpm: 분당 회전수 또는 디스크의 분당 회전속도.
본 발명에서는 다이드제인과 제니스테인을 상기 선별된 균주로 생변환시키는 단계를 포함한다. 즉, 본 발명에서는 상기 선별된 균주를 통하여 다이드제인(daidzein)과 제니스테인(genistein)으로부터 3' 위치에 특이적으로 수산화(hydroxylation)된 화합물을 제조하는 하기 반응식 1의 생변환 과정을 거치게 된다:
Figure 112007025058427-PAT00001
하기 반응식 2는 이소플라본의 대표적인 구성화합물인 다이드제인(daidzein)으로부터 오르토-특이적(ortho-specific) 위치에 특이적으로 수산화(hydroxylation)된 화합물이 생성되는 과정을 보여준다:
Figure 112007025058427-PAT00002
본 발명에 의하여 생산된 오르토-디하이드록시이소플라본으로는 7,8,4'-트리하이드록시이소플라본, 7,6,4'-트리하이드록시이소플라본, 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본 및 7,5,3',4'-테트라하이드록시이소플라본 등을 들 수 있다.
본 발명은 기질특이적으로 반응성이 높은 균주를 사용함으로써 목적 화합물의 생산성과 4가지의 원하는 위치특이적 수산화된 형태, 즉, 7,8,4'-트리하이드록시이소플라본, 7,6,4'-트리하이드록시이소플라본, 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본 및 7,5,3',4'-테트라하이드록시이소플라본(Orobol)을 생산할 수 있었다(Orobol 같은 경우 미생물을 이용한 생합성은 처음이다).
본 발명에서는 변화된 반응 용기와 반응 시간에 따라 오르토-디하이드록시이소플라본을 생합성할 수 있었다.
본 발명에 의한 반응조건은 다음과 같다: 회분식 반응조 안에 반응시 균주에 원활한 산소공급을 위하여 코일(coil) 또는 글라스 비드(glass bead)를 사용한다. 시험관에서 일차 배양한 균주를 1 리터의 원뿔형 플라스크(conical flask)에 균주를 계대배양하여 48시간 배양한 다음 새로운 배지를 이용하여 반응성을 조사한다. 이때 사용하는 배지는 ISP2, YEME 또는 R2YE이 바람직하다. 이 중 영양분이 많은 R2YE를 사용하였을 때 균주의 성장과 더불어 반응성이 좋다. 반응시간은 12시간 간격으로 확인한다. 24시간 반응시킨 경우에 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본 및 7,5,3',4'-테트라하이드록시이소플라본(Orobol)의 생산량이 증가하였고, 36시간 이후에는 7,8,4'-트리하이드록시이소플라본 및 7,6,4'-트리하이드록시이소플라본의 생산량이 증가하였으며, 48시간 이후에는 변형된 이소플라본을 얻을 수 있었다(도 7). 사용된 기질의 농도(반응부피당)는 10 mM로 하고 균주배양과 반응온도는 28℃로 한다.
본 발명에 의한 오르토-디하이드록시이소플라본은 항산화제 또는 미백효과를 가지는 극성의 화합물이다.
본 발명은 대부분의 이소플라본의 구성요소인 다이드제인이나 제니스테인을 원료로 하여 식물성 재료내에 부족하게 존재하는 오르토-디하이드록시이소플라본과 변형된 이소플라본의 양을 생합성으로 크게 증가시킬 수 있다.
본 발명에서 기질로서 사용한 다이드제인 및 제니스테인은 국내 (주) 바이오랜드로부터 구입하였다. .
본 발명에서는 방선균 유래의 미생물인 스트렙토마이세스 에버미틸리스를 배양하여 다이드제인에 대한 반응성을 조사한 결과, 배양물로부터 에틸아세테이트(EA)의 비중차를 이용하여 오르토-디하이드록시이소플라본 화합물을 회수하여 분리 정제한다. 다시 말해 방선균 유래의 스트렙토마이세스 에버미틸리스로부터 다이드제인의 반응성을 조사하여 오르토-디하이드록시이소플라본의 생산을 축적하고 이 배양물로부터 항산화제물질인 오르토-디하이드록시이소플라본을 제조할 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.
[실시예 1] 그람양성균인 스트렙토마이세스 에버미틸리스(Streptomyces Avermitilis)로부터 다이드제인과 제니스테인의 반응성을 확인
다이드제인의 6 또는 8, 3' 위치에서 위치특이적으로 -OH기를 붙이는 수산화반응을 수행하는 미생물을 스크리닝하고 그 효소를 확인하였다.
먼저, 각기 다른 조성의 효모(yeast), 곰팡이(fungi) 및 박테리아(bacteria)를 가지고 다이드제인과 제니스테인에 대한 기질 특이성을 조사하였다. 조사된 균 주 중에서 스트렙토마이세스 에버미틸리스, 노카르디아 파르키니카( Nocardia farcinica) 및 스트렙토마이세스 린콜네시스(Streptomyces lincolnesis)가 다이드제인에 대한 반응성을 보였다. 그 중에서 스트렙토마이세스 에버미틸리스가 다이드제인과 제니스테인에 가장 높은 기질 특이성을 보였다.
반응 배지는 ISP2 배지를 사용하였고 반응 시 에펜돌프(Eppendorf) 대신에 도 3에 도시된 회분식 반응기(batch reactor)를 사용하였다. 24시간동안 반응시킨 후에 반응물을 에틸아세테이트로 추출하여 진공원심분리기(vacuum centrifuge)를 이용해 증발시킨 다음 분석하였다. HPLC와 NMR 분석 장비를 이용하여 구조를 분석하였으며, 그 결과를 도 1, 도 2a 및 도 2b에 나타내었다. 반응시 사용된 기질의 최종농도는 10 mM이었다. 1H NMR 스펙트럼 결과는 하기와 같다.
7,3',4'-트리하이드록시이소플라본: δ 8.37 (s, H-2), δ 7.97 (d, J=8.5 Hz, H-5), δ 7.56 (d,d, J=8.0 and 2.5 Hz, H-6'), δ 7.53 (d, J=2.5 Hz, H-2'), δ 7.42 (d, J=8.0 Hz, H-5'), δ 6.95 (d,d, J=8.5 and 2.5 Hz, H-6), and δ 6.87 (d, J=2.5 Hz, H-8). 7,5,3',4'-테트라하이드록시이소플라본: δ 7.97 (s, H-2), δ 6.22 (d, J=2 Hz, H-6), 6.95 (d, J=2Hz, H-2'), 6.86 (d, J=8Hz, H-5'), 6.91 (d,d, J=2 and 8Hz, H-6').
[실시예 2] 그람양성균, 스트렙토마이세스 에버미틸리스(Streptomyces Avermitilis)로부터 다이드제인의 변화된 반응성을 확인
3' 위치에 수산화시키는 반응뿐만 아니라, 6, 8 위치에 수산화시키는 반응성 을 스트렙토마이세스 에버미틸리스를 이용하여 조사하였다. 미생물의 원만한 산소공급을 위하여 코일(coil)을 넣어 주었고 원뿔형 플라스크(conical flask)를 사용하여 반응성을 조사하였다(도 3의 (B)). 균주 배양을 위해 R2YE 배지를 사용하였고, 반응속도는 220rpm이었다. 24시간동안 반응시킨 후 에틸아세테이트(EA)를 이용하여 추출한 다음 GC-MS를 이용하여 분석하였다. GC 크로마토그램(Chromatogram)에서 다른 체류 시간(Retention time)을 통해서 생산물의 참시료(Authentic sample)를 분석할 수 있었다. BSTFA로 유도체화된 MS 스펙트럼을 통하여 각 분자량을 확인할 수 있었으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다(다이드제인, 상온, 18.5min, MS, 398; 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본, 상온, 24.4min, MS, 486; 7,8,4'-트리하이드록시이소플라본, 상온, 25.1min, MS, 486; 7,6,4'-트리하이드록시이소플라본, 상온, 26.8min, MS, 486).
[실시예 3] 그람양성균, 스트렙토마이세스 에버미틸리스(Streptomyces Avermitilis)로부터 다이드제인의 추정된 반응성을 확인
실시예 2에서 확인한 바와 같이 스트렙토마이세스 에버미틸리스는 ODI에 대한 반응성을 가지는 균주임을 알 수 있다. 반응시간을 1달로 하였을 경우, 여러 형태의 변화된 모노수산화된 형태, 모노메톡시화된 형태, 디수산화된 형태, 디메톡시화된 형태, 트리수산화된 형태 및 트리메톡시화된 형태의 화합물을 GC-MS로 분석할 수 있었다. 가능한 반응물의 변형도 및 분석에 대한 결과를 도 5 내지 도 8b에 나타내었다. 다이드제인, 다이드제인의 B-링(B-ring)의 탄소 4번 위치에 수산화 대신 메틸화된 포르모노네틴, 제니스테인 및 제니스테인의 B-링(B-ring)의 탄소 4번 위치에 수산화 대신 메틸화된 바이오체닌 A인 경우 항산화 효과뿐만 아니라 UV에 노출 시 산화방지에 대한 보고가 있다(Widyarini et al. 2001).
[실시예 4] 쥐의 색소세포를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정
쥐의 색소세포를 이용하여　실시예 1~2로부터 수득한 ODI 의 멜라닌 생성 억제 효과를 측정하였다.
먼저, C57BL/6 마우스 유래의 쥐의 색소세포(Mel-Ab cell)(Dooley, T.P. et al, Skin pharmacol, 7, pp 188-200)를 DMEM(Dulbeccos modified Eagles media)에 10% 우태반 혈청, 100nM 2-O-테트라데카노일포르빌(tetradecanoyphorbol)-13-아테이트 및 1nM 콜레라 독소(cholera toxin)를 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다. 배양된 Mel-Ab세포를 0.25% 트립신-EDTA로 떼어내고, 24-웰 플레이트에 105 세포/웰(cells/well)의 농도로 세포를 배양하여 이틀째부터 3일 연속으로 10ppm의 하이드로퀴논 및 상기 실시예 1~2로부터 수득한 각 ODI를 첨가하여 배양하였다. 이때, 상기 하이드로퀴논은 양성대조군으로 사용하였다. 그 다음 배양액을 제거하고, PBS로 세척한 후, 1N 수산화나트륨으로 세포를 녹여 400nm에서 흡광도를 측정한 다음, 하기 수학식 1에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다(Dooley의 방법).
Figure 112007025058427-PAT00003
시험물질 멜라닌 생성 억제율(%)
7,3',4'-트리하이드록시이소플라본 38.7
7,5,3',4'-테트라하이드록시이소플라본 40.8
7,8,4'-트리하이드록시이소플라본 39.8
7,6,4'- 트리하이드록시이소플라본 38.8
하이드로퀴논(양성대조군) 41.1
상기 표 1에 나타낸 바와 같이,　본 발명에 의해 수득한 상기 실시예 1~2의 ODI 들은 하이드로퀴논과 유사한 정도의 멜라닌 생성 억제 효율을 보이는 것을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 방성균 유래의 미생물을 이용하여 항산화제 물질 또는 미백 물질인 ODI를 특이적으로 생성 축적시키고, 더 나아가 변화된 형태의 화합물을 생합성하는 제조방법을 제공할 수 있었으며, 이는 앞으로의 학문적 연구와 산업적 활용 시 고부가가치의 발명이 될 것으로 보인다.

Claims (5)

  1. 다이드제인 또는 제니스테인을 방선균 유래의 미생물로 생변환시키는 단계를 포함하는 오르토-디하이드록시이소플라본의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 생변환은 다이드제인 또는 제니스테인의 3' 위치에서 위치특이적으로 수산화반응(hydroxylation)을 시키는 것을 특징으로 하는 오르토-디하이드록시이소플라본의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 방선균 유래의 미생물은 스트렙토마이세스 에버미틸 리스, 노카르디아 파르키니카 ( Nocardia farcinica ) 및 스트렙토마이세스 린콜네시스(Streptomyces lincolnesis)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 오르토-디하이드록시이소플라본의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 생변환 과정은 산소공급이 가능한 회분식 반응기(batch reactor)에서 이루어짐을 특징으로 하는 오르토-디하이드록시이소플라본의 제조방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오르토-디하이드록시이소플라본은 7,8,4'-트리하이드록시이소플라본, 7,6,4'-트리하이드록시이소플라본, 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본 및 7,5,3',4'-테트라하이드록시이소플라본으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 오르토-디하이드록시이소플라본의 제조방법.
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