KR20130063525A - 베타-글루코시데이즈 또는 리덕테이즈 활성이 높은 코프로바실러스 속 미생물 - Google Patents

베타-글루코시데이즈 또는 리덕테이즈 활성이 높은 코프로바실러스 속 미생물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 β-글루코시데이즈(glucosidase) 및/또는 리덕테이즈(reductase)의 높은 활성을 가지는 신규한 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물에 관한 것이다. 상기 미생물은 인간의 배설물에서 분리한 장내 혐기성 미생물로서, 배당체 이소플라본 및 비배당체 이소플라본에 기질 특이성을 갖는다. 본 발명의 미생물은 β-글루코시데이즈 활성으로 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 대사하는 능력을 가지고, 리덕테이즈 활성으로 입체 특이적(stereospecific)으로 비배당체 이소플라본을 이소플라바논계 화합물로 대사하는 능력을 가지며 상기 이소프라바논계 화합물은 R-형태임을 그 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 미생물은 높은 효소적 활성으로 비배당체 이소플라본 및/또는 이소플라바논계 화합물의 전환율이 80% 이상의 높은 전환율을 보였다. 한편, 배당체 이소플라본으로부터 연속적으로 이소플라바논계 화합물을 대사하는 경우에, 생물전환 반응속도론 적 연구로부터 디글리코실레이션 단계가 율속 단계임을 확인하였다.

Description

베타-글루코시데이즈 또는 리덕테이즈 활성이 높은 코프로바실러스 속 미생물{Novel Microorganism of Coprobacillus sp. Having a High Activity of beta-Glucosidase or Reductase}
본 발명은 β-글루코시데이즈(glucosidase) 및/또는 리덕테이즈(reductase) 활성이 높은 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물에 관한 것이다.
건강-관련 이점에 대한 잠재적인 영향 때문에, 인간의 장내 미생물과 식이 폴리페놀성 화합물과의 상호작용에 대한 관심이 증대되고 있다[1-2]. 예컨대, 식물 리그난(lignan)은 장내 미생물균총(microbiota)에 의해 엔테로디올(enterodiol)과 엔테로락톤(enterolactone)으로 전환되고[3], 엘라긴산(ellagic acid)은 유로리친(urolithins) A 및 B로 전환된다[4]. 엔테로락톤은 세포사멸을 유도하고 인간의 대장암 세포를 억제하는 것으로 보고되었으며[5], 상기 유로리친은 인간 유방암 세포의 성장을 억제하는 것으로 나타났다[4].
콩에 함유되어 있는 이소플라본 성분인 다이드제인(daidzein)은 에쿠올(equol)로 전환되고, 이는 식용 대두 섭취로부터 얻어지는 농도에서 양성 및 악성의 전립선 상피 세포(prostate epithelial cell)의 성장을 in vitro 에서 억제하는 것으로 밝혀졌다[6]. 항-안드로겐 활성[7]과 함께, 에쿠올은 에스트로겐[8], 항암[9], 심장보호(cardioprotective)[10] 및 항산화 활성[11]을 보이는 것으로 보고 되었다. 다이드제인으로부터 에쿠올의 화학적 합성은 S-에쿠올및 R-에쿠올의 라세믹 혼합물(racemic mixture)을 생성한 반면에, 미생물 생합성은 생물학적으로 의미가 있는 이소플라보노이드인, S-에쿠올만을 생성하는 것으로 알려져 있다.
S-에쿠올은 에난티오머(enantiomer, 거울상 이성질체)인 R-에쿠올과는 다른 생물학적 활성을 보이기 때문에[12], 본 발명자들은 S-에쿠올의 입체 화학을 연구하였고[13-14], 인간의 장내에서 분리된 에그게르텔라 속(Eggerthella sp .) Julong 732에 의한 (3R,4S)-테트라하이드로다이드제인(tetrahydrodaidzein)의 (3S)-에쿠올로의 생합성 경로를 확립하였다[15]. DHD(dihydrodaidzein)의 에쿠올로의 생물전환이 Julong 732으로 부터 확립되었다는 것이 반론의 여지가 없을 지라도, 선행 반응인 다이드제인의 DHD로의 전환의 입체 화학은 아직 연구되어 지지 않았다.
종래, Hur et al(2000)[16]은 미생물 균주 HGH6는 다이드제인으로부터 DHD를 7 일 내에 생성시킬 수 있다고 보고하였고, 그 후 Tamura et al(2007)[17]은 클로스트리디움(Chlorstridium)-유사 혐기성 미생물에 의한 다이드진으로부터 DHD 생성을 보고하였다.
Wang et al(2005)[18]에 의한 소의 반추위(bovine rumen)로 부터의 Niu-O16에 대한 보고는 다이드제인으로부터 생성된 DHD 라세미체(racemate)의 입체 화학에 대해 논의한 유일한 연구 결과이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 β-글루코시데이즈(glucosidase) 및/또는 리덕테이즈(reductase) 활성을 가지는 신규한 장내 혐기성 미생물을 스크리닝한 결과, β-글루코시데이즈 활성으로 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로, 리덕테이즈 활성으로 비배당체 이소플라본을 이소플라바논계 화합물로 입체 특이적인(stereospecific) 방식으로 생물 전환하는 능력을 가지는 신규한 균주를 인간의 배설물로부터 분리하고 이를 동정함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 β-글루코시데이즈(glucosidase) 또는 리덕테이즈(reductase) 활성이 높은 신규한 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 비배당체 이소플라본의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 이소플라바논계 화합물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 β-글루코시데이즈(glucosidase) 및/또는 리덕테이즈(reductase) 활성이 높은 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물을 제공한다.
본 발명자들은 β-글루코시데이즈(glucosidase) 및/또는 리덕테이즈(reductase) 활성을 가지는 신규한 장내 혐기성 미생물을 스크리닝한 결과, β-글루코시데이즈 활성으로 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로, 리덕테이즈 활성으로 비배당체 이소플라본을 이소플라바논계 화합물로 입체 특이적인(stereospecific) 방식으로 생물 전환하는 능력을 가지는 신규한 균주를 인간의 배설물로부터 분리하고 이를 동정하였다.
본 발명의 미생물은 β-글루코시데이즈(glucosidase) 및/또는 리덕테이즈(reductase) 활성을 가지는 인간의 배설물로부터 분리된 균주이다.
본 발명에 따른 미생물의 분리 및 동정은 다음 방법에 의해 수행되었다. 인간의 배설물을 수득하여 이를 희석한 다음 아가 플레이트에서 배양하여 콜로니를 수득하였다. 상기 콜로니를 분리하여 이를 다이드진을 포함하는 배지에서 혐기적으로 배양하고 다이드진으로부터 DHD(dihydrodaidzin)을 생성하는, 즉 TLC 분석을 통해 다이드진의 디글리코실레이션 및 환원의 높은 활성을 보이는, 하나의 미생물 균주를 분리하고 이를 MRG-1으로 명명하였다. 그리고 상기 MRG-1 균주의 16S rDNA(ribosomal DNA)의 염기서열을 분석한 결과 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp.) 미생물로 동정되었으며, 상기 미생물을 2011년 3월 15일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하고, 기탁번호 KCTC11894BP를 부여 받았다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 미생물은 서열목록 제 1 서열의 염기서열을 포함하는 16s 라이보좀 DNA를 갖는다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 미생물은 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) MRG-1 균주(KCTC11894BP)이다.
본 발명의 신규한 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물은 β-글루코시데이즈의 활성으로 인해 비배당체 이소플라본을 생성하는 능력을 가진다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 미생물은 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 대사하는 능력을 가지고, 보다 바람직하게는 상기 배당체 이소플라본은 다이드진(daidzin) 또는 게니스틴(genistein)이고, 상기 비배당체 이소플라본은 다이드제인(daidzein) 또는 게니스테인(genistein)이며, 상기 배당체 이소플라본에서 그에 상응하는 비배당체 이소플라본으로 대사된다. 구체적으로 다이드진에 상응하는 대사산물은 다이드제인이고, 게니스틴에 상응하는 대사산물은 게니스테인이다.
본 발명의 미생물은 이소플라본의 C-7에 β-글루코시드 결합은 가수분해하였으나, C-글루코시드 결합 및 C-7 상의 메톡시는 가수분해하지 못하였으며, 기질특이적으로 플라본 글리코시드 및 플라바논 글리코시드와는 반응하지 않았다.
또한, 본 발명의 신규한 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물은 리덕테이즈의 활성으로 인해 이소플라바논계 화합물을 생성하는 능력을 가진다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 미생물은 비배당체 이소플라본을 환원하여 이소플라바논계 화합물로 대사하고, 보다 바람직하게는 상기 이소플라바논계 화합물은 R-형태이다.
본 발명의 보다 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 비배당체 이소플라본은 이소플라본, 7-하이드록시이소플라본, 다이드제인, 포르모노네틴(formononetin) 또는 게니스테인이고, 상기 이소플라바논계 화합물은 이소플라바논, 7-하이드록시이소플라바논, 디하이드로다이드제인(DHD), 디하이드로포르모노네틴(DHF) 또는 디하이드로게니스테인(DHG)이며, 상기 비배당체 이소플라본에서 그에 상응하는 이소플라바논계 화합물로 대사된다. 구체적으로, 이소플라본은 이소플라바논, 7-하이드록시이소플라본은 7-하이드록시이소플라바논, 다이드제인은 디하이드로다이드제인, 포르모노네틴은 디하이드로포르모노네틴, 그리고 게니스테인은 디하이드로게니스테인에 각각 상응한다.
종래 보고된 다른 혐기성 세균에 의한 생물 전환과 비교하여, 본 발명의 미생물에 의한 생물전환 반응속도는 매우 빨랐으며 전환율도 매우 높음을 확인하였다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 비배당체 이소플라본의 제조방법을 제공한다: (a) 상술한 본 발명의 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물을 배당체 이소플라본을 포함하는 배지에서 혐기적 조건으로 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배지에서 비배당체 이소플라본을 회수하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 이소플라바논계 화합물의 제조방법을 제공한다: (a) 상술한 본 발명의 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물을 비배당체 이소플라본을 포함하는 배지에서 혐기적 조건으로 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배지에서 이소플라바논계 화합물을 회수하는 단계.
본 발명의 비배당체 이소플라본 및 이소플라바논계 화합물의 제조방법은 상술한 본 발명의 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물의 대산 산물로서, 이 둘 사이에 공통된 내용(비배당체 이소플라본, 배당체 이소플라본, 이소플라바논계 화합물, 이소플라바논계 화합물의 형태 등)은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
상술한 본 발명의 제조 방법에서 배지에 배당체 이소플라본을 기질로 포함시키는 경우에는 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물의 β-글루코시데이즈의 활성으로 배당체 이소플라본(예컨대, 다이드진)으로부터 비배당체 이소플라본(예컨대, 다이드제인)이 생성되고 이후 리덕테이즈 활성으로 거울상 이성질체인 R-형태의 이소플라바논계 화합물(예컨대, R-디하이드로다이드제인(DHD))이 연속적으로 생성된다. 다만, 반응속도 연구로부터, β-글루코시데이즈 활성이 다이드진으로부터 DHD를 생성하는데 율속 단계이다.
본 발명에 이용 가능한 배지는 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물의 배양에 이용되는 어떠한 배지도 포함하나, 바람직하게는 MRS (deMan Rogosa Sharpe) 브로스 배지, APT (All Purpose with Tween) 배지, BHI (Brain Heart Infusion) 배지 또는 GAM(Gifu Anaerobic Medium) 브로스 배지이며, 보다 바람직하게는 GAM(Gifu Anaerobic Medium) 브로스 배지이다.
본 발명에 따른 미생물의 배양은 혐기적 조건 하에서 바람직하게는, 5-10 % CO2, 5-10 % H2 및 75-90 % N2의 조건으로 배양할 수 있으며, 보다 바람직하게는, 5 % CO2, 10 % H2 및 85 % N2의 조건으로 37 ℃의 온도에서 48시간 동안 배양할 수 있다.
본 발명의 방법의 배지에 있어서, 이용되는 탄소원은 다양한 탄수화물이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 수크로스, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 아라비노스 및 락토스이며, 보다 바람직하게는 수크로스, 글루코스 및 프럭토스이다.
본 발명의 방법이 배지에 이용되는 질소원은 유기 질소원이 이용되며, 바람직하게는 이스트 추출물, 프로테오스 펩톤 No.3 및 펩톤이다.
또한 배양이 완료된 후 배양물로부터 비배당체 이소플라본 및 이소플라바논계 화합물을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 분리 및 정제할 수 있다. 예를 들면, 멤브레인 여과법, 분별 침전법, 결정화법 또는 컬럼 크로마토그래피법 등을 들 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명의 신규한 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물은 높은 β-글루코시데이즈(glucosidase) 및/또는 리덕테이즈(reductase) 활성을 가진다.
(ⅱ) 상기 미생물은 인간의 배설물에서 분리한 장내 혐기성 미생물로서, 배당체 이소플라본 및 비배당체 이소플라본에 기질 특이성을 갖는다.
(ⅲ) 본 발명의 미생물은 β-글루코시데이즈 활성으로 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 대사하는 능력을 가지고, 리덕테이즈 활성으로 입체 특이적(stereospecific)으로 비배당체 이소플라본을 이소플라바논계 화합물로 대사하는 능력을 가지며 상기 이소프라바논계 화합물은 R-형태임을 그 특징으로 한다.
(ⅳ) 또한, 본 발명의 미생물은 높은 효소적 활성으로 비배당체 이소플라본 및/또는 이소플라바논계 화합물의 전환율이 80% 이상의 높은 전환율을 보였다.
(ⅴ) 한편, 배당체 이소플라본으로부터 연속적으로 이소플라바논계 화합물을 대사하는 경우에, 생물전환 반응속도론 적 연구로부터 디글리코실레이션 단계가 율속 단계임을 확인하였다.
도 1은 16S rDNA 염기 서열에 바탕을 둔 이웃-연결(neighbor-joining)법에 의한 MRG-1 균주의 계통도이다. 50% 이상의 부트스트랩(bootstrap) 비율은 마디(node)에 표시하였다. 그리고 바(bar)는 위치 당 0.02 뉴클레오타이드 치환을 나타낸다. 16S rDNA 시퀀스는 GenBank에 등록하였고, 접근번호 HQ687764를 부여받았다.
도 2는 TLC를 이용하여 다이드제인(daidzein)-대사 박테리아를 분리하기 위한 겔 사진이다. TLC 플레이트는 톨루엔 : 아세톤(2:1) 용매에서 전개하였고, 254 nm의 UV 광에서 가시화 하였다. 패널 A의 레인 1은 다이드제인 및 DHD 스탠다드(0.1 mM), 그리고 레인 2-13은 다이드제인으로 반응시킨 후의 멀티-콜로니 배양 추출물을 나타내고, 패널 B 레인 1은 다이드제인 및 DHD 스탠다드(0.1 mM), 그리고 레인 5-1 내지 11-2는 다이드제인으로 반응시킨 후의 단일-콜로니 배양 추출물을 나타낸다.
도 3은 혐기적 조건하에서 MRG-1의 GAM 브로스 배지에서의 증식에 대하여 600 nm에서의 OD(optical density) 값의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 4는 MRG-1 균주에 의한 다이드진(daidzin)의 생물전환 경로를 보여준다.
도 5는 MRG-1 균주에 의한 다이드제인(daidzein)의 생물전환 과정을 시간에 따라 보여주는 키랄 컬럼을 이용한 HPLC 크로마트그램을 보여준다.
도 6a-6d는 MRG-1 균주의 생물전환 반응속도를 보여주는 그래프이고, 도 6a는 다이드진(Dzin), 도 6b는 게니스틴(genistin, Gntin), 도 6c는 다이드제인(daidzein, Dz), 게니스테인(genistein, Gn) 및 7-하이드록시이소플라본(hydroxyisoflavone), 그리고 도 6d는 포르모네틴(formononetin, FM)의 전환율을 보여준다.
도 7a-7b는 포르모네틴(formononetin)(도 7a) 및 7-하이드록시이소플라바논(hydroxyisoflavanone)(도 7b) 대사산물의 1H NMR 스펙트럼을 보여주는 그래프이다.
도 8a-8b는 포르모네틴(formononetin, FM)(도 8a) 및 7-하이드록시이소플라바논(hydroxyisoflavanone, 7-OH IF)(도 8b) 대사산물의 키랄 분리(chiral separation)를 보여주는 그래프이다.
도 9a-9b는 CD(circular dichroism) 스펙트럼을 보여주는 그래프이고, 도 9a는 디하이드로포르모노네틴(dihydroformononetin, DHF) 그리고 도 9b는 7-하이드록시이소플라바논(hydroxyisoflavanone) 에난티오머의 CD 분석 결과를 보여준다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실험 재료 및 실험방법
실험재료
시약
플라보노이드는 Indofine 케미칼 사(Hillsborough, NJ, 미국)로부터 구입하였고, 1,4-나프토퀴논(Naphthoquinone)은 Sigma-Aldrich Korea 사(용인. 한국)로부터 구입하였다. DHD 및 DHG(dihydrogenistein)는 공지된 방법에 따라 합성하였고[14], 분리 및 성장 배지로 이용한 GAM(Gifu Anaerobic Medium)은 Nissui Pharmaceutical 사(Tokyo, 일본)로부터 구입하였다. 아세토니트릴, 에틸 아세테이트 및 메탄올(HPLC 등급)은 Fisher 사(Pittsburgh, PA, 미국)로부터, TLC(thin layer chromatography) 실리카 겔 60 F254 플레이트는 Merck 사(Merck, Darmstadt, 독일)로부터 구입하여 이용하였다.
일반적인 실험방법
대사산물을 확인하기 위해서, 광다이오드 어레이(photodiode array)검출기(PDA Plus) 및 C18 역상 컬럼(Hypersil GOLD 5μm, 4.6 by 100 mm; Thermo Scientific, Waltham, MA)이 장착된 피니건 서베이어 플러스(Finnigan Surveyor Plus) HPLC 시스템(Thermo Scientific, Waltham, MA)을 이용하였고, 291 nm에서 측정하였다. 유속은 1 ml/min으로 설정하였고, 디메틸 술폭사이드(d6)에 화합물의 1H and 13C NMR(nuclear magnetic resonance) 스펙트럼은 296 K에서 Avance 600 NMR 스펙트로미터(Bruker, Germany)를 이용하여 각각 600 및 150 MHz에서 구하였다. 에탄올에서의 에난티오머의 CD 스펙트럼은 J-715 CD 스펙트로폴라리미터(spectropolarimeter)(Jasco Corp., Tokyo, 일본)를 이용하여 측정하였다.
미생물 분리 및 배양 조건
건강한 여성의 분변 시료를 멸균된 바이알에 담고 37℃의 혐기성 챔버(CO2 5%, H2 10%, N2 85%)에 보관하였다. 면봉을 이용하여 상기 시료를 생리 식염수(saline solution)에서 희석을 하고, 상기 용액을 멸균한 면직물(cheesecloth)을 통하여 여과하였다. 배지로 100 ml 증류수에 GAM(5.9 g)을 이용하였고, 1.5 g의 아가(agar)를 플레이트에 첨가하였다. 1 ml의 여과액을 GAM 브로스에서 10 ml로 희석하였고, 분리를 위해 영역-표시된 플레이트 상에 상기 희석된 브로스(0.1 ml)를 전개하였다. 각 영역의 단일 콜로니를 분리하고 이를 다이드진(daidzin)(200 μl/ml)을 포함하는 GAM 브로스 배지에 접종하였으며, 37℃에서 2일 동안 혐기성 챔버에서 혐기적으로 배양하였다. 활성 측정을 위해, 1 ml의 에틸 아세테이트를 첨가하였고 상기 혼합물을 20초간 볼텍싱하였다. 원심분리를 한 다음, 800 μl의 상등액을 진공 하에서 건조시키기 위해 분리하였다. TLC(thin layer chromatography) 분석을 위해, 10 μl의 각각의 메탄올 추출물 중에서 2 μl를 실리카 겔 TLC 플레이트 상의 다이드제인(daidzein), DHD(dihydrodaidzein), THD(tetrahydrodaidzein) 및 S-에쿠올의 기준 화합물에 적용하였다. 전개용매의 조성은 톨루엔 : 아세톤 = 2 : 1(v/v)이었다. 활성을 나타내는 S-에쿠올을 관찰하였으나, 다이드진으로부터 DHD를 생성하는 미생물 균주는 오직 하나였고, 이를 분리하여 MRG-1이라 명명하였다. 상기 분리된 MRG-1 균주를 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 2011년 3월 15일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC11894BP를 부여 받았다.
MRG-1 균주를 동정하기 위해서, 16S rRNA 유전자 시퀀스 분석을 실시하였다. 1일간 혐기성 챔버의 5 ml의 GAM 브로스 배지에서 MRG-1 균주를 증식시켰다. 유니버설 미생물 프라이머 27F(5′- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′, 서열번호 2), 1492R(5′- GGYTACCTTGTTACGACTT-3′, 서열번호 3) 및 783R(5′-ACCMGGGTATCTAATCCKG -3′, 서열번호 4)을 이용하여 PCR에서 16S rRNA 유전자를 증폭하였다. 증폭 반응, PCR 산물의 분리 및 정제, 그리고 16S rDNA의 부분 염기서열(1263 bp)의 시퀀싱은 Solgent 사(대전, 한국)의 시퀀싱 서비스를 이용하여 실시하였다. 16S rDNA의 염기서열은 진뱅크(GenBank)(접근 번호: HQ687764, 서열번호 1)에 등록하였다. 16S rDNA의 서열은 EzTaxon server (http://www.eztaxon.org/)을 이용하여 유사성을 비교하였다[28]. 계통도는 MEGA 4 프로그램을 이용하여 NJ(neighbor-joining)법으로 구축하였다[29]. 계통도의 신뢰성은 부트스트랩 분석(bootstrap analysis)을 1,000회 반복하여 확인하였다[30].
이소플라보노이드의 생물전환
기질 특이성 실험을 위하여, MRG-1 균주를 100 μM의 상기 시험 기질를 포함하는 GAM 브로스 배지에서 600 nm에서 OD 0.2가 되도록 증식시켰다. 하루 후, 1 ml의 에틸 아세테이트를 첨가하고 상기 혼합물을 20초간 볼텍싱하였다. 원심분리를 한 다음, 800 μl의 상등액을 진공 하에서 건조시키기 위해서 분리하였다. HPLC 분석을 하기 위해서, 100 μl 메탄올 추출물 중 10 μl를 주입하는데 이용 하였다. 광다이오드 어레이(photodiode array) 검출기(PDA Plus) 및 C18 역상 컬럼(Hypersil GOLD 5μm, 4.6 by 100 mm; Thermo Scientific, Waltham, MA)이 장착된피니건 서베이어 플러스(Finnigan Surveyor Plus) HPLC 시스템(Thermo Scientific, Waltham, MA)을 이용하였고 291 nm에서 측정하였다. 이동상은 0.1% 아세트산으로 완충된 10% 아세토니트릴 용액(A) 및 0.1% 아세트산으로 완충된 90% 아세토니트릴용액(B)을 이용하였다. 용리 프로그램은 3분간 80:20(v/v)에서 A/B 비율로 용리시키고 12분 동안 20:80 (v/v)까지 직선적으로 증가시켰다.
생물전환 반응속도( biotransformation kinetics )
생물전환 반응속도를 확인하기 위해서, 다이드제인, 게니스테인, 다이드진, 게니스틴, 포르모노네틴 및 7-하이드록시이소플라본의 이소플라보노이드를 기질로 이용하였다. 100 μM의 상기 각각의 기질을 포함하는 GAM 브로스 배지에 MRG-1 균주를 600 nm에서 OD 0.5가 되도록 증식시켰다. 미생물 배양물(100 μl)을 분리하고 반응시키기 위해서 분류하였다. 10분 마다 1 ml의 에틸 아세테이트를 상기 반응 혼합물에 첨가하였고 20초간 볼텍싱 하였다. 원심분리를 한 다음, 800 μl의 상등액을 분리하고 진공 건조시켰다. HPLC 분석을 하기 위해서, 100 μl 메탄올 추출물 중 10 μl를 주입하는데 이용하였다. 광다이오드 어레이(photodiode array) 검출기(PDA Plus) 및 수미 키랄(sumi chiral) OA-7000 컬럼(5 μm, 4.6 by 250 mm)이 장착된 피니건 서베이어 플러스(Finnigan Surveyor Plus) HPLC 시스템(Thermo Scientific, Waltham, MA)을 이용하였고 291 nm에서 측정하였다. 이동상은 0.1% 아세트산으로 완충된 10% 아세토니트릴 용액(A) 및 0.1% 아세트산으로 완충된 90% 아세토니트릴용액(B)을 이용하였다. 용리 프로그램은 3분간 80:20(v/v)에서 A/B 비율로 용리 시키고 12분 동안 20:80 (v/v)까지 직선적으로 증가시켰다.
생물전환 대사산물의 분리 및 확인
포르모노네틴 및 7-하이드록시이소플라본의 생물전환 산물을 확인하기 위해서, 분취 규모로의 생물전환을 실시하였다. 세포 배양(OD600 = 0.2, 220 mL)을 위해서, 220 의 포르모노네틴(100 mM)을 1 시간 마다 네 번씩 첨가하였고, 상기 용액을 190 시간 동안 반응시켰다. 대사산물을 추출하기 위해서 상기 반응 혼합물에 에틸 아세테이트(200 ml X 3)를 첨가하였다. 에틸 아세테이트 추출물을 건조시키고 분취용 HPLC를 위해 DMF(1 ml)에서 용해시켰다. 각 주입은 50 μl로 실시하였고 두 가지 대사산물은 세미-분취(semi-preparative) 수미-키랄 OA-7000 컬럼(5 μm, 8 by 250 mm) 크로마토그래피로부터 분리하였다. 포르모노네틴(5.5 mg) 뿐만 아니라 대사산물 1(7.1 mg) 및 대사산물 2(7.7 mg)는 용매 제거 후 분리하였다. 그리고 300 의 7-하이드록시이소플라본(100 mM)을 한 시간마다 세 번씩 상기 세포 배양물에 첨가하였고, 상기 용액을 24 시간 동안 반응시켰다. 대사산물을 추출하기 위해서 상기 반응 혼합물에 에틸 아세테이트(200 ml X 5)를 첨가하였다. 대사산물의 분리 방법은 상기 포르모노네틴에 대한 방법과 동일하다. 상기 모든 기질을 생물 전환시켰고 대사산물 1(2.9 mg) 및 대사산물 2(9.9 mg)는 용매 제거 후 분리하였다.
실험결과
MRG -1 균주의 분리 및 동정
TLC를 이용하여 다이드진을 대사하는 미생물의 활성-유도(guided) 스크리닝을 실시하였다. TLC에 의한 활성 확인은 종래 HPLC 분석 보다 훨씬 더 빨랐다. 비록 TLC 분석이 대사산물 생성과 관련하여 반-정량적이지만, 스크리닝을 위해서는 충분하였다. TLC 분석 결과, 멀티-콜로니 배양물이 다이드제인(Rf = 0.28)에서 DHD(Rf = 0.35)로 전환되었음을 알 수 있다(도 2, 패널 A). 상기 선택된 멀티-콜로니 배양물(도 2, 패널 A, 레인 5, 6, 7 및 11)을 단일 콜로니 배양물로 추가적으로 분리하고, 다이드제인의 생물전환과 관련된 미생물 콜로니를 분리하기 위해서 다이드제인과 각각 반응시켰다.(도 2, 패널 B, 레인 5-2, 6-1, 7-1 및 11-1). 마지막으로, 막대-모양의 그람-음성 절대 혐기성 미생물을 GAM 배지에서 배양시키고 상기 미생물을 MRG-1으로 명명하였으며, 미생물 동정을 위하여 16S rRNA를 시퀀싱하였다. 16S rDNA 부분 염기서열(1263 bp)은 코프로바실러스 카테니포르미스(Coprobacillus cateniformis) JCM 10604T (접근번호: AB030219)의 서열과 91.04%의 유사성을 보였다(도 1). 37℃의 혐기성 조건하에서 GAM 배지에서의 MRG-1 균주의 성장 곡선은 상기 세포 성장이 3 시간 배양 후, 7 시간이 지나서 정지기에 도달하였음을 보여주었다(도 3).
MRG -1 균주의 기질 범위
MRG-1 균주는 다이드진을 생물 전환하여 다이드제인 및 DHD를 생성하였다(도 4). 다이드진(DHD 글루코시드)의 환원 산물을 확인할 수 없었기 때문에, 다이드제인만이 DHD로 환원이 일어나는 것으로 결론을 내렸다. 다이드제인 환원은 한 시간 내에 완료되었고 다이드제인 2 mM의 농도까지 기질 억제는 없었다. 흥미롭게는, R-DHD 생성을 키랄 컬럼 HPLC 분석으로부터 관찰하였고, 이는 미리 준비한 어센틱(authentic) 화합물과 대조함으로써 확인하였다[20]. 토토머화 반응(tautomerization)을 통해서, 배지에서의 DHD의 라세미화(racemization)가 빠르게 일어나 종종 두 개의 에난티오머가 생물전환으로부터 관찰된다는 것은 잘 알려져 있다. 그러나, MRG-1에 의한 다이드제인의 미생물 환원이 이성질화 보다 훨씬 더 빨랐고, 입체 특이적인 R-DHD가 생성됨을 확인하였다(도 5).
MRG-1 균주가 β-글루코시데이즈 및 리덕테이즈의 두 가지 다른 활성을 보이기 때문에, MRG-1 균주의 기질 특이성을 루틴, 나리기닌(nariginin) 및 헤스페리딘(hesperidin), 플라본 및 C-3 과 C-7에 루티노실(rutinosyl) 기를 가지는 플라바논 글리코시드의 다양한 플라보노이드를 이용하여 시험하였다. β-글루코시데이즈 활성은 모든 플라보노이드 기질에서 관찰되지 않았다. 리덕테이즈 활성은 플라본, 7-하이드록시플라본 및 4’,7-디하이드록시플라본에서 발견되지 않았다.
한편, MRG-1 균주는 다양한 이소플라보노이드에 대한 반응성을 보였고 이는 하기 화학식 1 및 표 1에 정리하였다:
화학식 1
Figure pat00001
MRG-1의 기질 특이성
이소플라보노이드 R1 R2 R3 R4 대사산물
이소플라본 H H H H R-이소플라바논
7-하이드록시이소플라본 H OH H H R-7-하이드록시이소플라바논
7-메톡시이소플라본* H OCH3 H H No reaction in 3 days
다이드제인 H OH H OH R-DHD
다이드진 OH OGlc H OH 다이드제인, R-DHD
포르모노네틴 H OH H OCH3 R-DHF
게니스테인 OH OH H OH R-DHG
게니스틴 OH OGlc H OH 게니스테인, R-DHG
우선, MRG-1 균주는 이소플라본의 C-7에 β-글루코시드 결합을 가수분해하고 다이드진 및 게니스틴으로부터 각각 다이드제인 및 게니스테인을 생성하였다. 그러나, 푸에라린(puerarin)의 C-글루코시드는 대사 되지 않았고, C-7 상의 메톡시기도 가수분해되지 않았다. 두 번째로, MRG-1 균주는 이소플라본 C2-C3 이중 결합의 입체 특이적 환원 반응을 촉매하였다. 이소플라본, 7-하이드록시이소플라본, 다이드제인, 포르모노네틴 및 게니스테인은 비록 결과적으로 배지에서 라세믹 혼합물(racemic mixture)로 이성질화가 되기 하지만, 각각 그에 상응하는 R-이소플라바논들을 생성하였다.
생물전환 반응속도
MRG-1 균주는 0.1 mM의 다이드진 및 게니스틴을 100분 내에 완전히 생물 전환하였다(도 6a 및 6b). 디글리코실레이트된 대사산물인, 다이드제인 및 게니스테인은 10분이 지나서 각각의 기질로부터 먼저 생성되었다. 다이드제인 및 게니스테인의 환원은 10분 후에 관찰되었고, 환원 반응은 디글리코실레이션 반응 보다도 훨씬 빨랐다. 다이드제인, 게니스테인 및 7-하이드록시이소플라본의 환원은 30분이 지나서 완료되었다(도 6c). MRG-1 균주에 의한 포르모노네틴의 환원은 다른 이소플라본의 환원과는 다름을 확인하였는데, 단지 80% 전환율이 3 시간 반응 후에 관찰되었다(도 6d).
DHF ( dihydroformononetin ) 및 7- 하이드록시이소플라바논 에난티오머의 분리 및 확인
포르모노네틴 및 7-하이드록시이소플라본의 환원 산물을 반-분취(semi-preparative) 수미-키랄 HPLC를 이용하여 분리하였다. 분리된 대사산물의 구조는 1H and 13C NMR 스펙트로스코피로 확인하였고 그 결과는 하기 표 2 및 도 7a-7b에 정리하였고, 절대 구조는 CD 스펙트로스코피를 이용하여 결정하였다.
디하이드로포르모노네틴((CD3)2SO) 및 7-하이드록시이소플라바논(CDCl3)의 1H (400 MHz) and 13C (100 MHz) NMR 스펙트럼 데이터
디하이드로포르모노네틴 7-하이드록시이소플라바논 Assignment
δ of 13C δ of 1H δ of 13C δ of 1H
71.2 4.55 (dd, J H2 α,2β = 11.3Hz, J H2 α,3 = 4.2Hz, 1H, H-2α)
4.61 (dd, J H2 α,2β = 11.3Hz, J H2 β,3 = 8.8Hz, 1H, H-2β)		 71.8 4.62 (m, 2H) 2
50.2 3.96 (dd, J H2 α,3 = 4.2Hz, J H2β,3 = 8.8Hz) 51.9 3.91 (dd, J H2 α,3 = 2.8Hz, J H2 β,3 = 6.1Hz) 3
190.6 - 190.9 - 4
129.1 7.66 (d, J H5 ,6 = 8.8Hz) 130.1 7.87 (d, J H5 ,6 = 8.8Hz) 5
110.8 6.51 (dd, J H5 ,6 = 8.8Hz, J H6 ,8 = 2.1Hz) 110.6 6.51 (dd, J H5 ,6 = 8.8Hz, J H6 ,8 = 2.1Hz) 6
163.2 3.16 (s, OH) 162.5 - 7
102.4 6.34 (d, J H6 ,8 = 2.1Hz) 103.1 6.40 (d, J H6 ,8 = 2.1Hz) 8
113.6 - 115.3 - 4a
164.7 - 163.6 - 8a
128.0 - 135.1 - 1’
129.8 7.17 (d, J H2 ‘,3‘ = 8.8Hz, 2H) 128.8 7.26 - 7.32 (m) 2’,6’
113.9 6.89 (d, J H2 ‘,3‘ = 8.8Hz, 2H) 128.6 7.26 - 7.32 (m) 3’,5’
158.5 - 127.7 7.26 - 7.32 (m) 4’
55.1 3.72 (s, 3H) - - 4’-OMe
이소플라본 기질과 비교하여, 환원 대사산물은 1H NMR 스펙트럼의 업필드(upfield)에 H-2 및 H-3에 상응하는 특징적인 피크를 보여주고 있다. 사실, 모든 환원 대사산물의 C-고리 이중 결합 수소 원자는 4.0 ppm 및 4.6 ppm 범위 내에서 매우 유사한 1H NMR 피크를 나타내었다. 디하이드로포르모노네틴은 3.72 ppm에서 특징적인 메톡시 피크를 보여주는 데 반해, 7-하이드록시이소플라바논은 7.26 ppm 과 7.32 사이 영역에서 B-고리 양성자의 다중선을 나타내었다.
또한, 기질의 환원은 전형적인 UV-Vis 스펙트럼 변화를 발생시켰고, 디하이드로포르모노네틴은 231 nm, 276 nm 및 313 nm에서 흡착 밴드를 나타내었다. 상기 포르모노네틴은 249 nm 및 302 nm에서 두 개의 흡착 밴드를 보였다. 유사하게, 247 nm 및 301 nm에서의 7-하이드록시이소플라본의 UV-흡착 밴드는 7-하이드록시이소플라바논으로 환원 된 이후 235 nm, 276 nm 및 312 nm로 변화하였다. 키랄 컬럼 크로마토그래피로부터 두 개의 에난티오머의 절대 구조를 결정하기 위해서(도 8a-8b), 에탄올에서의 CD 스펙트럼을 측정하였다(도 9a-9b). 스펙트럼의 특징은 종래 보고된 DHD 및 DHG의 특징과 비슷하였다[18]. 320 및 350 nm의 영역에서 확인되는 가장 긴 파장의 CD 전이(transition)는 n →π* 전이 때문이다. R-이소플라바논 및 S-이소플라바논은 상기 영역에서 각각 양성 및 음성의 코튼(Cotton) 효과를 나타낸다고 보고되었다[19]. 따라서, 키랄 분리로부터 수득된 첫 번째 및 두 번째 분획인, DHF1 및 DHF2은 각각 S-DHF 및 R-DHF2로 결정하였다(도 9a). 또한, 7-하이드록시이소플라바논 에난티오머의 절대 입체구조는 비슷하게 결정하였다(도 9b).
논의사항
건강기능식품으로서의 플라보노이드의 다양한 유익한 생물학적 활성 때문에, 특히 미생물 생명공학과 관련하여, 플라보노이드에 대한 보고는 그 수가 크게 증가하고 있다. 예컨대, 특정 플라보노이드의 생합성에 대한 대장균(E. coli)의 대사 공학과 함께[21], 플라보노이드의 디글리코실레이션[22], 글리코실레이션[23] 및 산화[24-26]는 보고되어 왔다. 그러나, 플라보노이드의 입체 특이적 미생물 환원에 대한 보고는 거의 없었고, S-에쿠올 생합성과 관련하여, 오직 몇 가지만 보고되었다[13]. 활성-유도 스크리닝을 이용하여 인간의 장내로부터 막대-모양의 그람-음성 MRG-1 균주를 분리하였다. MRG-1 균주의 16s rDNA(1263 pb)의 부분 염기서열은 공지의 종과 비교하여 낮은 유사성을 보였다(도 1).
절대 혐기성 미생물 MRG-1은 다이드진 및 게니스틴에 대한 β-글루코시데이즈 활성 및 다이드제인을 포함하는 이소플라본에 대한 리덕테이즈 활성을 나타내었다. 비록 장내 미생물의 β-글루코시데이즈 활성이 일반적이라 할지라도, 이소플라본 리덕테이즈 활성은 입체 선택적인 산물 생성 때문에 특별하고 큰 관심을 가질 만 하다. HGH6[16], TM-40[17] 및 Niu-16[18]은 유사한 활성을 가지고 있다고 보고 되어 왔다. 보고된 바에 의하면, 미생물 HGH6 및 TM-40 균주는 다이드진을 DHD로 불완전하게 전환하였다. Niu-O16 균주는 R- 및 S-DHD 에난티오머 모두를 생성하는 것으로 보고되었다. 그러나, MRG-1 균주는 기질을 완전하게 생물 전환하였고, 2 시간 내에 다이드진으로부터, 그리고 40 분 내에 다이드제인으로부터 오직 R-DHD를 생성하였다(도 5). 반응속도 연구로부터(도 6a-6d), MRG-1의 보다 느린 β-글루코시데이즈 활성이 다이드진으로부터 DHD를 생성하는데 율속 단계임이 명확해졌다.
상기 표 1의 기질 특이성 연구 결과에서 확인 할 수 있듯이, MRG-1은 플라본이 아닌 이소플라본을 입체 특이적인 방식으로 환원할 수 있음을 알 수 있다. 이소플라본, 7-하이드록시이소플라본, 다이드제인, 포르모노네틴 및 게니스테인은 그에 상응하는 R-이소플라바논으로 환원되었다. 하이드록실 기의 위치에도 불구하고, 리덕테이즈에 대한 기질의 범위는 이소플라본 화합물에서 상대적으로 광범위함을 알 수 있었다. MRG-1은 1,4-나프토퀴논 뿐만 아니라 어떠한 플라본 화합물도 환원시킬 수 없었다.
따라서, 본 발명자들은 리덕테이즈는 활성을 위해 C-3 위치에 방향족 B-고리를 필요로 한다고 결론을 내렸다. 또한, DHD를 포함하는, 이소플라본 환원 대사 산물의 입체 화학은 연구되었다. MRG-1 균주에 의해 대사되는, 이소플라본, 7-하이드록시이소플라본, 다아드제인, 게니스테인 및 포르모노네틴을 포함하는 모든 이소플라본 기질들은 상응하는 환원 대사산물인 R-이소플라바논을 생성하였다. 특히, 7-하이드록시이소플라바논 및 디하이드로포르모노네틴은 지금까지 확인 되지 않았었다.
결론적으로, 본 발명자들은 신규한 혐기성 미생물 MRG-1을 분리하였고 생물전환 특성을 확인하였다. 이소플라본 환원의 매우 높은 전환율은 입체 선택적이었고, 에난티오퓨어 이소플라바논 생성의 생물 공학적 적용이 가능하다는 것이 명백해졌다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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한국생명공학연구원 KCTC11894BP 20110315

Claims (10)

  1. β-글루코시데이즈(glucosidase) 또는 리덕테이즈(reductase) 활성을 가진 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물로서,
    상기 미생물은 코프로바실러스 속 MRG-1 균주(KCTC11894BP)이고,
    상기 미생물은 서열목록 제 1 서열의 염기서열을 포함하는 16s 라이보좀 DNA를 갖고, 및
    상기 미생물은 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 대사하는 능력을 가지는 것을 특징으로 하는 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물..
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 배당체 이소플라본은 다이드진 또는 게니스틴이고, 상기 비배당체 이소플라본은 다이드제인 또는 게니스테인이며, 상기 배당체 이소플라본에서 이에 상응하는 비배당체 이소플라본으로 대사되는 것을 특징으로 하는 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 미생물은 비배당체 이소플라본을 환원하여 이소플라바논계 화합물로 대사하는 것을 특징으로 하는 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp.) 미생물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 이소플라바논계 화합물은 R-형태인 것을 특징으로 하는 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 비배당체 이소플라본은 이소플라본, 7-하이드록시이소플라본, 다이드제인, 포르모노네틴 또는 게니스테인이고, 상기 이소플라바논계 화합물은 이소플라바논, 7-하이드록시이소플라바논, 디하이드로다이드제인, 디하이드로포르모노네틴 또는 디하이드로게니스테인이며, 상기 비배당체 이소플라본에서 이에 상응하는 이소플라바논계 화합물로 대사되는 것을 특징으로 하는 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물.
  6. 다음의 단계를 포함하는 비배당체 이소플라본의 제조방법:
    (a) 상기 제 1 항의 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물을 배당체 이소플라본을 포함하는 배지에서 혐기적 조건으로 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배지에서 비배당체 이소플라본을 회수하는 단계.
  7. 다음의 단계를 포함하는 이소플라바논계 화합물의 제조방법:
    (a) 상기 제 1 항의 코프로바실러스 속(Coprobacillus sp .) 미생물을 비배당체 이소플라본을 포함하는 배지에서 혐기적 조건으로 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배지에서 이소플라바논계 화합물을 회수하는 단계.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 배지는 GAM(Gifu Anaerobic Medium) 브로스 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 6항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 배양은 5-10 % CO2, 5-10 % H2 및 75-90 % N2의 조건으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 이소플라바논계 화합물은 R-형태인 것을 특징으로 하는 방법.
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KR102010834B1 (ko) * 2018-07-05 2019-08-16 서울대학교 산학협력단 베타-글루코시다아제 활성이 우수한 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 ldtm8102 신균주[kctc13392bp]

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