KR20080087301A - 형광염료로 표지된 글루코스 유사체, 이의 합성방법 및 그 용도 - Google Patents

형광염료로 표지된 글루코스 유사체, 이의 합성방법 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형광염료로 표지된 글루코스 유사체, 이의 합성방법 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 O-1-글리코실화를 통해 형광염료를 표지한 새로운 글루코스 알파 또는 베타 아노머, 상기 아노머의 비대칭 합성방법 및 상기 아노머의 분자영상과 글루코스 대사 관련 질병 치료 또는 예방용 약물 검색에의 응용에 관한 것이다.
글루코스, 아노머, 싸이쓰리(Cy3), 형광염료, 바이오 프로브, 분자영상(molecular imaging), 약물 검색, 글루코스 대사 관련 질병, 암

Description

형광염료로 표지된 글루코스 유사체, 이의 합성방법 및 그 용도{Fluorescent dye-labeled glucose bioprobe, synthesis method and usage thereof}
도 1은 실시예 1에서 수득된 중간생성물인 (2-브로모에틸)-2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-글루코사이드(5a) 화합물의 1H NMR 데이터이다.
도 2는 실시예 1에서 수득된 중간생성물인 (2-브로모에틸)-2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-글루코사이드(5a) 화합물의 13C NMR 데이터이다.
도 3은 실시예 1에서 수득된 중간생성물인 (2-브로모에틸)-2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-글루코사이드(5b) 화합물의 1H NMR 데이터이다.
도 4는 실시예 1에서 수득된 중간생성물인 (2-브로모에틸)-2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-글루코사이드(5b) 화합물의 13C NMR 데이터이다.
도 5는 실시예 1에서 수득된 중간생성물인 2-(N-boc-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-글루코사이드(6a) 화합물의 1H NMR 데이터이다.
도 6은 실시예 1에서 수득된 중간생성물인 2-(N-boc-3,6-다이옥사옥탄-1,8- 다이아미노에틸)]-2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-글루코사이드(6a) 화합물의 13C NMR 데이터이다.
도 7은 실시예 1에서 수득된 중간생성물인 2-(N-boc-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-글루코사이드(6b) 화합물의 1H NMR 데이터이다.
도 8은 실시예 1에서 수득된 중간생성물인 2-(N-boc-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-글루코사이드(6b) 화합물의 13C NMR 데이터이다.
도 9는 실시예 1에서 수득된 최종 생성물인 [2-(N-Cy3-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-α-D-글루코스(3)의 1H NMR 데이터이다.
도 10은 실시예 1에서 수득된 최종 생성물인 [2-(N-Cy3-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-α-D-글루코스(3)의 13C NMR 데이터이다.
도 11은 실시예 1에서 수득된 최종 생성물인 [2-(N-Cy3-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-β-D-글루코스(4)의 1H NMR 데이터이다.
도 12는 실시예 1에서 수득된 최종 생성물인 [2-(N-Cy3-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-β-D-글루코스(4)의 13C NMR 데이터이다.
도 13은 알파 글루코스 아노머(Cy3-Glc-α)의 농도에 따른 A549 세포 내에서 의 흡수효율을 공초점 주사 현미경(CLSM)으로 촬영한 사진이다[a) 100 μM, b) 50 μM, c) 25 μM, d) 12.5 μM, e) 6 μM].
도 14는 알파 글루코스 아노머(Cy3-Glc-α)의 배양 시간에 따른 A549 세포 내에서의 흡수효율을 측정한 결과이다. 여기에서, A는 A549 세포에 의한 Cy3-Glc-α의 흡수를 보여주는 그래프인데, 이 때, 형광 세기는 편파적이지 않은 선별에 기초하여 B상에 표시된 5개의 독립적인 세포에서 ROIs(Region of Interest)를 연속적으로 측정하여 결정된 a.u.(arbitrary unit)로 표시하였다. B는 공초점 주사 현미경(CLSM)을 이용한 라이브-셀 영상화(live-cell imaging)에 의해 캡춰된 A549 세포 내에서의 위상대비 이미지(phase-contrast image) 및 형광 이미지의 병합된 이미지이다. 여기에서, a)는 Cy3-Glc-α 처리 직후의 A549 세포, b)는 60분 경과 후의 A549 세포를 보여준다. (scale bar = 20㎛)
도 15A는 A549 세포에 의한 Cy3-Glc-α 및 Cy3-Glc-β의 흡수를 보여주는 그래프이다. 형광 세기는 형광분광계에 의해 결정된 a.u.(arbitrary unit)로 표시하였으며, 데이터는 적어도 2개의 독립된 실험 중 대표적인 실험에 사용된 30-50개 세포의 평균값이다. 15B는 암세포(A549, HeLa) 및 정상 세포(WI-38, NIH/3T3)에서의 Cy3-Glc-α의 흡수 효율을 보여주는 그래프이다. 15C는 A549 세포(a, e), HeLa 세포(b, f), WI-38 세포(c, g) 및 NIH/3T3 세포(d, h)에 의한 Cy3-Glc-α의 흡수를 나타낸 사진이다. 이 때, a-d는 위상대비 이미지(phase-contrast image)이고, e-h는 형광 이미지이다. (a에서의 scale bar = 40 ㎛)
도 16은 D-글루코스 무함유, 10 mM 또는 50 mM의 D-글루코스 함유 하에서 A549 세포 내에서의 용량-의존적인 Cy3-Glc-α의 흡수 저해를 보여주는 그래프이다. D-글루코스에 의한 특이적 저해를 입증하기 위하여, 동일한 실험이 50 mM L-글루코스의 존재 하에 수행되었으며, 그 결과 흡수 저해는 관찰되지 않았다. 형광 세기는 형광분광계에 의해 결정된 a.u.(arbitrary units)으로 표시하였으며, 데이터는 적어도 2개의 독립된 실험 중 대표적인 실험의 35-50개 세포들의 평균값으로 나타내었다.
도 17은 55mM 알라닌의 결여 또는 존재 하에서의 A549에 의한 Cy3-Glc-α의 흡수결과를 보여주는 그래프이다.
도 18은 상이한 조건 하에서의 A549 세포에 의한 2-NBDG 및 Cy3-Glc-α의 흡수 이미지를 나타낸 것이다. a, d는 12.5 μM의 Cy3-Glc-α를 500 ms 동안 CCD 카메라의 렌즈에 노출시킨 사진; b, e는 12.5 μM의 2-NBDG를 500 ms 동안 CCD 카메라의 렌즈에 노출시킨 사진; c, f는 125 μM의 2-NBDG를 11000 ms 동안 CCD 카메라의 렌즈에 노출시킨 사진이다. 여기에서, a, b, c는 A549 세포에서의 위상대비 이미지(phase-contrast image)이고, d, e, f는 A549 세포에서의 형광 이미지이다. (a에서의 scale bar = 40㎛)
도 19A는 37℃에서 9.8 μM의 탁솔로 처리하고 각각 0, 3, 6, 12 및 24시간 후 A549 세포에 의한 Cy3-Glc-α의 흡수 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 이 때, 형광 세기는 형광분광계에 의해 결정된 a.u.(arbitrary units)로 표시하였으며, 데이터는 적어도 2개의 독립된 실험 중 대표적인 실험에서의 35-50개 세포들의 평균값을 나타내었다. 도 19B는 37℃에서 9.8 μM의 탁솔로 다음과 같은 시간 동안 처 리한 후 A549 세포에 의한 Cy3-Glc-α의 흡수 정도를 나타낸 이미지이다(a; 0시간, b; 3시간, c; 6시간, d; 12시간, e; 24시간, f; 6시간 배양 후의 위상대비 이미지). 탁솔로 처리하여 배양한 후, 30분간 Cy3-Glc-α을 처리하고, 형광 현미경으로 각각의 이미지를 캡쳐하였다. (a에서의 scale bar = 40㎛)
도 20은 12.5 μM의 Cy3-Glc-α 처리 후 CCK-8 키트를 이용하여 측정된 세포 생존 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 형광염료로 표지된 글루코스 유사체, 이의 합성방법 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 O-1-글리코실화를 통해 형광염료를 표지한 새로운 글루코스 알파 또는 베타 아노머, 상기 아노머의 비대칭 합성방법 및 상기 아노머의 분자영상과 글루코스 대사 관련 질병 치료 또는 예방용 약물 검색에의 응용에 관한 것이다.
글루코스는 세포 성장에 있어 가장 중요한 에너지원이다. 따라서 빠르게 성장하는 암세포는 정상세포보다 더 많은 글루코스를 필요로 한다. 글루코스 운반기(glucose transporters , GLUTs)의 과잉발현에 따른 해당작용(glycolysis)의 증가와 헥소키나아제(hexokinase, 육탄당의 인산화 촉매 효소) 활성의 증가가 악성 종양으로 규정짓는 하나의 생물학적 지표가 되고 있다[M. Zhang, Z. Zhang, D. Blessington, H. Li, T. M. Busch, V. Madrak, J. Miles, B. Chance, J. D. Glickson, G. Zheng, Bioconjugate Chem. 2003, 14, 709-714].
글루코스 이용의 시험관 내에서와 생체 내에서의 평가는 과학계 특히, 생물학과 생의학 분야에서 중요한 관심사가 되어 왔다. 이러한 평가의 성공적인 응용의 한 예는 양전자를 방출하는 동위원소로 18F(불소)를 사용한 2-플루오로-2-디옥시글루코스(2-fluoro-2-deoxyglucose; 18FDG)라는 글루코스 추적자를 이용한 양전자단층촬영(PET, positron emission tomography)을 이용하여 종양 진단을 하는 것이다[P. Som, H. L. Atkins, D. Bandoypadhyay, J. S. Fowler, R. R. MacGregor, K. Matsui, Z. H. Oster, D. F. Sacker, C. Y. Shiue, H. Turner, C. N. Wan, A. P. Wolf, S. V. Zabinski, J. Nucl. Med. 1980, 21, 670-675; H. Yorimitsu, Y. Murakami, H. Takamatsu, S. Nishimura, E. Nakamura, Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 2708-2711.]. 18FDG를 이용한 양전자단층촬영(PET)은 종양세포에서의 대사 교란을 모니터하는 분자 영상화 방법으로, 인체 내에서 종양의 위치를 정확하게 잡아낼 수 있도록 한다. 그러므로 이 기법은 다양한 종양의 진단 기법으로 널리 쓰이고 있다[P. S. Conti, D. L. Lilien, K. Hawley, J. Keppler, S. T. Grafton, J. R. Bading, Nucl, Med, Biol. 1996, 23, 717-735; J. Czernin, M. E. Phelps, Annu. Rev. Med. 2002, 53, 89-112.].
형광 2-디옥시글루코스 유사체(fluorescent 2-deoxyglucose analog), 예를 들어, 2-[N-(7-나이트로벤즈-2-옥사-1,3-다이아졸-4-일)아미노]-2-디옥시-D-글루코스(2-NBDG)가 Yoshioka 그룹에서 처음 개발된 이래로 널리 연구되고 있다[K. Yoshioka, H. Takahashi, T. Homma, M. Saito, K. B. Oh, Y. Nemoto, H. Matsuoka, Biochim. Biophys. Acta. 1996, 1289, 5-9.]. 2-NBDG는 다양한 연구, 특히 종양의 영상화와 GLUT와 연관된 세포 대사의 연구에 광범위하게 적용되었다[K. Yoshioka, H. Takahashi, T. Homma, M. Saito, K. B. Oh, Y. Nemoto, H. Matsuoka, Biochim. Biophys. Acta. 1996, 1289, 5-9.; K. Yoshioka, M. Saito, K. B. Oh, Y. Nemoto, H. Matsuoka, M. Natsume, H. Abe, Biosci. Biotech. Biochem. 1996, 60, 1899-1901; A. Natarajan, F. Srienc, J. Microbiol. Methods. 2000, 42, 87-96]. 아울러, 2-디옥시글루코스 유사체 몇 가지가 더 보고되었다[Z. Cheng, J. Levi, Z. Xiong, O. Gheysens, S. Keren, X. Chem, S. S. Gambhir, Bioconjugate Chem. 2006, 17, 662-669; Z. Zhang, H. Li, Q. Liu, L. Zhou, M. Zhang, Q. Luo, J. Glickson, B. Chance, G. Zheng, Biosensors and Bioelectonics. 2004, 20, 643-650; Y. Ye, S. Bloch, S. Achilefu, J. Am. Chem. Soc, 2004, 126, 7740-7741.].
그러나 이러한 유사체들은 모두 N-2-글리코실화 유사체로서 글루코스의 알파와 베타 아노머에 따른 차이를 알 수 없다는 단점이 있으며, 정상상태의 세포 배지에서 작용하는 것이 아니라 중요한 에너지원인 D-글루코스가 빠져 있는 배지에서만 세포내로 들어가기 때문에 실질적인 세포실험에서는 적용할 수 없다는 문제점이 있다. 따라서 기존에 알려진 2-NBDG 또는 N-2-글리코실화 유사체들은 항암물질, 비만과 관련된 연구 또는 관련된 질병들(예: 당뇨병)의 약물치료제를 검색하고자 하는 경우 실질적으로 적용이 불가능하다.
이에 본 발명자들은 지금까지 보고된 N-2-글리코실화 글루코스 유사체들과 달리 O-1-글리코실화를 통해 형광염료를 표지한 글루코스 유사체를 새로이 고안하 여 합성하고자 하였다.
따라서 본 발명의 목적은 지금까지 보고된 N-2-디옥시글루코스 유사체와 달리 O-1-글리코실화를 통해 형광염료를 표지한 새로운 글루코스 유사체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 글루코스 유사체의 알파와 베타 아노머의 비대칭 합성방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 글루코스 유사체를 프로브로 이용한 분자영상 (Molecular Bioimaging) 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 글루코스 유사체를 프로브로 이용한 글루코스 대사 관련 질병 치료 또는 예방용 약물의 검색방법을 제공하는데 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
구체적으로 본 발명이 제공하는 글루코스 유사체는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시된다:
[화학식 1]
Figure 112007023667601-PAT00001
[화학식 2]
Figure 112007023667601-PAT00002
상기 식들에서,
R1은 -(CH2)n-NH- 또는 -(CH2)n-NH-(C2H4X)m-NH-이고, 여기에서 n은 1 내지 10의 정수이고, m은 1 내지 100의 정수이고, X는 CH2, O 또는 단일결합으로 m이 2 이상인 경우 각각 서로 같거나 다를 수 있으며,
R2는 형광염료이고,
Y는 O 또는 S이다.
이 때, 상기 R2로서, 바람직하게는 싸이3(Cy3), 싸이5(Cy5), 플루오레세인 아이소티오시안산염(FITC), 테트라메틸로다민 아이소티오시안산염(RITC), 알렉사(Alexa), 4,4,-다이플루오로-4-보로-3a,4a-다이아자-s-인다센(BODIPY), 텍사스 레드(Texas Red) 등일 수 있다.
상기 화학식 1의 글루코스 유사체는 그 중에서도 알파 아노머(α anomer)이고, 상기 화학식 2의 글루코스 유사체는 베타 아노머(β anomer)이다.
보다 구체적으로, 상기의 글루코스 유사체는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시된다:
[화학식 3]
Figure 112007023667601-PAT00003
[화학식 4]
Figure 112007023667601-PAT00004
이러한 글루코스 유사체는 형광염료를 O-1-글리코실화를 통해 1번 탄소 위치에 표지함으로써 합성될 수 있는데, 구체적으로는,
(a) 글루코스(D-glucose)를 이온교환수지와 함께 2-브로모에탄올 에 용해시킨 후 60℃~70℃ 에서 환류시켜 상기 2-브로모에탄올이 알파와 베타 아노머 위치로 선택적으로 도입되도록 하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 얻어진 반응물을 피리딘 내에서 할로겐화벤조일과 반응시켜 벤조일기로 보호한 다음, 컬럼 크로마토그래피를 통해 알파와 베타 아노머로 분리하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 벤조일기로 보호된 알파와 베타 아노머 각각을 유기용매 내에서 하나의 박(Boc) 그룹으로 보호된 디아민 화합물과 40℃~50℃에서 반응시켜 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 생성물의 벤조일기를 비보호화하고, 이어서 박(Boc) 그룹을 비보호화한 다음, 염기화하여, 형광염료를 함유하는 용액과 반응시킨 후, HPLC로 분리하여 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체를 수득하는 단계;를 포함하는 방법에 의해 합성될 수 있다.
이러한 글루코스 유사체의 합성방법은 상기 화학식 1로 표시되는 알파 아노머와 상기 화학식 2로 표시되는 베타 아노머를 동시에 비대칭적으로 합성할 수 있는 방법이다.
상기 합성방법의 각 단계에 대하여 보다 자세히 설명하면 다음과 같다.
(a) 단계
: D-글루코스의 입체적 배치는 헤미 아세탈(hemiacetal) 고리인 피라노스(pyranose)로 인식되고 있다. 이에 1번 탄소(anomeric carbon)의 하이드록시기의 특이한 반응성에 따라, 2-브로모에탄올 (2-bromoethanol)은 산에 의해 촉매된 피셔 글리코실화반응에 의해 상기 아노머(anomeric) 위치에 2:1 비율의 알파와 베타 아노머로 위치 선택적으로 도입될 수 있다.
따라서, 먼저, 글루코스(D-glucose)를 이온교환수지와 함께 2-브로모에탄올에 용해시킨 후 50℃~70℃, 바람직하게는 60℃~70℃에서 환류시켜 상기 2-브로모에탄올을 알파와 베타 아노머 위치로 선택적으로 도입시킨다. 이 때, 알파와 베타의 비율은 핵자기공명장치(NMR, Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy)를 이용해 얻을 수 있다[F. Fazio, M. C. Bryan, O. Blixt, J. C. Paulson, C.-H. Wong, J. Am. Chem. Soc, 2002, 124, 14397-14402].
선택적으로, 상기에서 얻어진 반응 혼합물을 여과하여 이온교환수지를 제거 한 다음, 진공조건 하에서 농축시키고, 컬럼 크로마토그래피에 의해 글리코실화된 화합물을 정제할 수 있다. 이 때, 상기 컬럼 크로마토그래피는 실리카-겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트: 메탄올 = 10:1~5:1)를 사용한다.
(b) 단계
: 이어서, 상기 (a) 단계에서 얻어진 반응물을 피리딘 내에서 할로겐화벤조일, 바람직하게는 염화벤조일과 반응시켜 벤조일기로 보호한 다음, 컬럼 크로마토그래피를 통해 알파와 베타 아노머로 분리한다. 이 때, 알파 아노머와 베타 아노머는 2:1의 비율로 분리될 수 있다.
바람직하게는 상기 반응물을 벤조일기로 보호한 다음, 통상의 방법에 따라 알킬알콜(바람직하게는, 메틸알콜)을 첨가하여 켄치(quench)하고, 희석(바람직하게는 에틸 아세테이트 사용)시킨 후, 유기층을 세척 및 건조, 여과 및 감압 농축한 후 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 것이 좋다.
이 때, 상기 컬럼 크로마토그래피로는 통상의 것을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 실리카-겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트: n-헥산 = 1:3)를 사용한다.
(c) 단계
: 이어서, 상기 (b) 단계에서 얻어진 벤조일기로 보호된 알파와 베타 아노머 각각을 유기용매 내에서 박(Boc) 그룹을 함유하는 화합물과 40℃~60℃, 바람직하게는 40℃~50℃에서 반응시킨 후 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.
이 때, 상기 반응물을 정제하기 전에 얻어진 용액을 통상의 방법에 따라 희 석(바람직하게는 ddH2O 사용), 추출(바람직하게는 에틸아세테이트 사용), 세척(바람직하게는 브라인(brine) 사용) 및 감압농축하는 것이 바람직하다.
상기 유기용매로는 통상의 유기용매를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 다이메틸포름아마이드(DMF) 및 트라이에틸아민(TEA)이고, 박(Boc) 그룹을 함유하는 화합물은 아민 연결기와 박(Boc) 그룹을 함유하는 것으로서, 바람직하게는 아민 연결기를 갖는 N-박-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아민(N-Boc-3,6-dioxaoctane-1,8-diamine)이다. 그러나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 컬럼 크로마토그래피로는 통상의 크로마토그래피를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 실리카-겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:에탄올: 트라이에틸아민TEA = 87:8:5)를 사용한다.
(d) 단계
: 마지막으로, 상기 (c) 단계에서 얻어진 생성물의 벤조일기를 비보호화하고, 이어서 박(Boc) 그룹을 비보호화한 다음, 염기화하여 형광염료를 함유하는 용액과 반응시킨 후, HPLC로 분리하여 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체를 수득한다.
상기에서, 벤조일기의 비보호화의 경우, 바람직하게는 상기 (c) 단계에서 얻어진 생성물이 녹아있는 메틸알콜(MeOH) 용액에 소듐 메톡사이드를 첨가하여 반응시킴으로써 수행될 수 있다.
또한, 박(Boc) 그룹의 비보호화는, 바람직하게는 벤조일기가 비보호화된 화합물에 50% 트라이플루오로아세트산(TFA)을 함유하는 다이클로로메탄 용액을 첨가 한 다음 N2 치환(purging)에 의해 농축시킴으로써 수행될 수 있다.
한편, 박 그룹의 비보호화에 사용되고 반응 혼합물에 남아있는 트라이플루오로아세트산을 제거하기 위하여 염기화를 진행하는데, 이는 완전히 비보호화된 화합물이 녹아있는 다이메틸포름아마이드(DMF) 용액을 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA)과 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 염기화 처리를 통해 일차 아민을 가진 키랄 글루코사이드가 얻어진다.
본 발명에서 형광염료는 싸이3(Cy3), 싸이5(Cy5), 플루오레세인 아이소티오시안산염(FITC), 테트라메틸로다민 아이소티오시안산염(RITC), 알렉사(Alexa), 4,4,-다이플루오로-4-보로-3a,4a-다이아자-s-인다센(BODIPY), 텍사스 레드(Texas Red) 등을 사용할 수 있다. 그 중에서도 광, 레이저 등 강한 세기의 광원에 대해서도 안정하고, 여러 생물 분석 시스템에서 광범위하게 쓰이고 있는 싸이3(Cy3)를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 형광염료를 함유하는 용액은, 바람직하게는, 싸이3-COOH(Cy3-COOH) 및 반응 시약인 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카르보다이이미드(EDC)를 함유하는 다이메틸포름아마이드(DMF) 용액이다.
그러나, 그 외에도 비오틴 등과 같은 유기 화합물, 나노입자와 같은 무기 화합물 등을 용도에 따라 다양하게 사용할 수 있다.
싸이3는 상기 EDC에 의해 아미드 결합을 거쳐 글루코시드의 1번 탄소 위치에 표지되며, HPLC를 통해 분리되어, 최종적으로 본 발명의 형광염료로 표지된 글루코스 유사체(알파 아노머와 베타 아노머)가 수득된다. 상기 최종 생성물은 핵자기 공명 장치를 이용한 1H, 13C 스펙트럼, 말디-토프(MALDI-TOF) 질량분석기와 고해상도질량분석기 등을 통해 정확하게 확인될 수 있다.
이와 같은 합성방법에 의해 얻어진 본 발명의 글루코스 유사체는 D-글루코스의 유사체로 작용하여, 암세포, 예를 들어 강화된 글루코스-대사를 가진 폐암 등의 세포 내로 선택적으로 흡수되는 특성을 갖는다. 상기 글루코스 유사체는 다양한 농도의 D-글루코스의 결여 또는 존재 하에서 시간 및 용량 의존적인 방식으로 세포 내에 흡수되는 반면, L-글루코스로부터는 영향을 받지 않으며, 배지 내의 삼투압에 의해서도 영향을 받지 않는다. 이는 본 발명의 글루코스 유사체가 글루코스-특이적 수송 시스템에 의해 세포 내로 수송된다는 사실을 의미한다.
그 중에서도 상기 화학식 1로 표시되는 알파 글루코스 아노머는 이전에 공지되어 있는 하기 화학식 5의 화합물, 즉 형광염료인 NBD를 N-2-글리코실화시켜 표지한 2-NBDG에 비하여 글루코스 흡수 추적자로서 보다 우수한 성능을 나타낸다.
[화학식 5]
Figure 112007023667601-PAT00005
즉, 종래의 형광 글루코스 유사체인 2-NBDG가 125μM의 농도에서도 거의 탐 지되지 않는 반면, 상기 글루코스 유사체는 심지어 12.5μM의 낮은 농도에서도 탐지된다. 따라서 본 발명이 제공하는 글루코스 유사체는 바이오 프로브로서 기능하여 바이오 영상화, 분자영상, 생분석, 신약 검색 등의 기술에 효과적으로 적용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 글루코스 유사체는 암 또는 종양의 영상화, 글루코스 운반기(glucose transporters)와 연관된 세포 대사 연구를 위한 분자영상 방법에 사용될 수 있다.
이 때, 상기 분자영상 방법에서 측정 장치로는 특별히 제한되는 것은 아니나, 공초점 주사 현미경 (Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM), 도립 형광 현미경, 형광세포분리법 (Fluorsecent Activated Cell Sorter, FACS), 마이크로플레이트 리더(Microplate reader), 하이컨텐츠 스크리닝(High Content Screening) 등을 이용할 수 있다.
또한, 상기 유사체는 1μM~100μM의 농도 범위, 바람직하게는 10μM~20μM, 가장 바람직하게는 12.5μM에서 사용할 수 있으며, 배양시간은 35분 이하, 바람직하게는 25분 내지 35분 범위일 수 있다.
한편 본 발명은 상기 글루코스 유사체를 바이오 프로브로 사용하는 글루코스 대사 관련 질병의 치료 또는 예방용 약물의 검색방법을 제공한다.
위에서 언급한 바와 같이 글루코스 대사는 생명체의 가장 중요한 대사과정이며 이 과정에 문제가 생겼을 경우에 다양한 질환으로 나타나게 된다. 그러한 질환 중 하나로 암 또는 종양을 들 수 있으며, 본 발명의 글루코스 유사체는 항암제를 검색하는 스크리닝 방법에 사용될 수 있다.
상기 항암제의 비제한적인 예로서, 바람직하게는 폐암, 위암, 간암 또는 대장암의 예방 또는 치료제를 들 수 있다.
보다 중요하게 본 발명의 글루코스 유사체는 글루코스 대사에 직접적으로 관련이 있는 질환, 즉 글루코스 대사 및 세포내 흡수가 비효율적이기 때문에 생기는 질환인 당뇨병과, 글루코스 대사가 너무 활발해서 생기는 질환인 비만을 치료할 수 있는 효과적인 바이오 신약 검색을 위한 새로운 바이오 프로브로서 높은 가능성이 있다.
따라서 본 발명의 유사체는 이러한 새로운 검색방법을 활용하여 생리활성 조절물질 및 신약 후보물질의 효능평가에 사용될 수 있으며, 새로운 약물 후보 물질의 검색용으로도 사용될 수 있다.
이하 본 발명의 구성 및 작용을 실시예를 들어 설명하나, 이는 단지 예시를 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되지는 않는다.
[실시예 1]
Figure 112007023667601-PAT00006
a) 2-브로모에탄올, Dowex 50WX8-400 이온 교환 수지, 70℃ 환류; b) 염화벤조일, 피리딘, 다이메틸아미노피리딘(DMAP); c) N-Boc-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아민, 트라이에틸아민, 다이메틸포름아마이드(DMF), 50℃; d) (i) 소듐 메톡사이드(NaOMe) , 메탄올; (ii) 50% 트라이플루오로아세트산(TFA)/다이클로로메탄(DCM); (iii) Cy3-COOH, EDC, 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA), 다이메틸포름아마이드(DMF)
1. (2-브로모에틸)-2,3,4,6-테트라- O -벤조일-α-D-글루코사이드(5a) 및 (2-브로모에틸)-2,3,4,6-테트라- O -벤조일-β-D-글루코사이드(5b)의 제조
: 글루코스(1g, 5.55mmol)를 Dowex 50WX8-400 이온교환수지와 함께 2-브로모에탄올(6 mL, 85 mmol)에 용해시켰다. 그 반응 혼합물을 70℃에서 하룻밤 동안 환 류시킨 다음, 반응 완료물을 TLC[F. Fazio, M. C. Bryan, O. Blixt, J. C. Paulson, C.-H. Wong, J. Am. Chem. Soc, 2002 , 124, 14397-14402]로 모니터하였다. 이어서, 상기 반응 혼합물로부터 수지를 제거하기 위하여 여과를 한 다음, 진공조건에서 농축시켰다. 실리카-겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트: 메탄올 = 10:1 ~ 5:1)에 의해 글리코실화된 화합물을 정제한 후, 핵자기공명장치(NMR)에 의해 알파:베타 아노머가 2:1의 비율(총수율 74%)로 혼합되어 있는 목적 화합물이 수득되었음을 확인하였다. 상기 결과 얻어진 (2-브로모에틸)-D-글루코사이드(2.7g, 9.5mmol)의 자유 하이드록시기(free hydroxyl group)를 피리딘(60 mL) 내에서 0℃, 10분 동안 염화벤조일(8.8mL, 76mmol)을 방울방울 첨가하여 벤조일기로 보호한 다음, 다이메틸아미노피리딘(DMAP)(116mg, 0.952mmol)의 존재 하에 상온에서 하룻밤 동안 교반하였다[a) M. A. Maier, C. G. Yannopoulos, N. Mohamed, A. Roland, H. Fritz, V. Mohan, G. Just, M. Manoharan, Bioconjugate Chem. 2003 , 14, 1829; b) R. E. Campbell, M. E. Tanner, J. Org. Chem. 1999 , 64, 9487-9492]. 상기에서 얻어진 혼합물에 메탄올(10 mL)를 첨가하여 켄치(quench)한 후, 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시켰다. 유기층을 1N 염산(HCl) 및 포화 탄산수소나트륨(NaHCO3)으로 세척한 다음, 무수 황산마그네슘 (MgSO4)를 이용하여 건조시켰다. 그런 다음, 유기층을 여과 및 감압 하에 농축하고, 얻고자 하는 각 아노머를 실리카-겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래프(에틸 아세테이트: n-헥산 = 1:3)에 의해 알파:베타 = 2:1 비율로 성공적으로 분리하였다.
(1) 알파[(2-브로모에틸)-2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-글루코사이드(5a)]: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.097.89 (m, 8H), 7.547.31 (m, 12H), 6.23 (t, J = 9.9 Hz, 1H), 5.70 (t, J = 9.9 Hz, 1H), 5.44 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 5.33 (dd, J = 10.1, 3.7 Hz, 1H), 4.644.56 (m, 2H), 4.48 (dd, J = 11.9, 5.1 Hz, 1H), 4.164.03 (m, 1H), 3.943.85 (m, 1H), 3.763.70 (m, 2H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ166.20, 165.88, 165.78, 165.30, 133.48, 133.19, 129.98, 129.91, 129.76, 129.72, 129.63, 129.10, 128.93, 128.79, 128.45, 128.32, 96.31, 71.83, 70.30, 69.34, 68.92, 68.31, 62.95, 29.80; MALDI TOF MS calcd for C36H43O12 [M+H]+: 703.11; found: 703.05.
(2) 베타[(2-브로모에틸)-2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-글루코사이드(5b)]: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.047.81 (m, 8H), 7.447.28 (m, 12H), 5.91 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 5.67 (t, J = 9.7 Hz, 1H), 5.54 (dd, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H), 4.93 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.66 (dd, J = 9.1, 3.0 Hz, 1H), 4.48 (dd, J = 6.8, 5.3 Hz, 1H), 4.244.07 (m, 2H), 3.943.83 (m, 1H), 3.493.36 (m, 2H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ166.15, 165.82, 165.22, 133.56, 133.34, 129.86, 129.78, 129.55, 129.26, 129.09, 128.75, 128.49, 128.40, 128.37, 128.29, 101.54, 72.81, 72.40, 71.69, 69.89, 69.64, 63.03, 29.74; MALDI TOF MS calcd for C36H43O12[M+H]+: 703.11 ; found : 703.16.
한편, 상기 5a 및 5b 화합물의 각 1H NMR 및 13C NMR 데이터를 각각 도 1 내지 4에 나타내었다.
2. 2-( N -boc-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-2,3,4,6-테트라- O -벤조일-α-D-글루코사이드(6a) 및 2-( N -boc-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-2,3,4,6-테트라- O -벤조일-β-D-글루코사이드(6b)의 제조
(1) 2-(N-boc-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-글루코사이드(6a)
: 상기에서 얻어진 5a의 화합물(120mg, 0.170 mmol)이 녹아있는 1mL의 무수DMF 용액에 N-Boc-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아민[a) M. Trester-Zedlitz, K. Kamada, S. K. Burley, D. Fenyo, B. T. Chait, T. W. Muir, J. Am. Chem. Soc. 2003 ,125, 2416-2425; b) Y. Li, Y.-M. Zhu, H.-J. Jiang, J.-P. Pan, G.-S. Wu, J.-M. Wu, Y.-L. Shi, J.-D. Yang, B.-A. Wu, J. Med. Chem. 2000 , 43, 1635-1640](127mg, 0.512mmol) 및 TEA(71μL, 0.512mmol)를 첨가하고, 그 반응 혼합물을 50℃에서 교반하였다. 상기 반응 완료물을 TLC에 의해 모니터한 후, 그 결과 얻어진 용액을 ddH2O로 희석한 다음 에틸 아세테이트로 추출하였다. 결합된 유기층을 브라인(brine)으로 세척하고, 감압 하에 농축시킨 다음, 실리카-겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:에탄올:TEA = 87:8:5)에 의해 정제하여 노란색 오일 형태 로 원하는 화합물 6a를 수득하였다(114 mg, 76%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.067.86 (m, 8H), 7.527.28 (m, 12H), 6.19 (t, J = 9.8 Hz, 1H), 5.71 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 5.40 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.33 (dd, J = 10.1, 3.7Hz, 1H), 4.62 (d, J = 9.5Hz, 1H), 4.504.47 (m, 2H), 3.993.94 (m , 1H), 3.723.60 (m, 2H), 3.543.50 (m, 6H), 3.44 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.29 (d, J = 4.5 Hz, 2H), 2.922.86 (m, 2H), 2.782.73 (m, 2H), 2.32 (s, 2H), 2.20 (s, 1H), 1.42 (s, 9H); 13C NMR (75 MHz , CDCl3) δ166.17, 165.83, 165.69, 165.27, 156.03, 133.44, 133.13, 129.88, 129.85, 129.73, 129.67, 129.10, 128.97, 128.86, 128.49, 128.41, 128.30, 96.26, 79.09, 71.96, 70.47, 70.44, 70.18, 69.48, 68.41, 67.86, 67.08, 62.93, 49.00, 48.66, 40.35, 28.42; MALDI TOF MS calcd for C47H55N2O14[M+H]+: 871.36; found : 871.51
(2) 2-(N-boc-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-글루코사이드(6b)
: 5a의 화합물 대신 5b의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방식에 의해 원하는 화합물 6b를 수득하였다(104mg, 70%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.197.81 (m, 8H), 7.547.25 (m, 12H), 5.90 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 5.68 (t, J = 9.7 Hz, 1H), 5.52 (t, J = 8.0Hz, 1H), 4.89 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.65 (dd, J = 12.1, 2.9 Hz, 1H), 4.50 (dd, J = 12.1, 4.9 Hz, 1H), 4.184.15 (m, 1H), 4.064.00 (m, 1H), 3.753.68 (m, 1H), 3.503.46 (m, 6H), 3.36(t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.29 (d, J = 4.7 Hz, 2H), 2.822.66 (m, 4H), 1.98 (s, 2H), 1.42 (s, 9H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ191.84, 166.14, 165.80, 165.19, 165.10, 133.45, 133.29, 133.25, 133.15, 129.81, 129.75, 129.56, 129.22, 128.76, 128.41, 128.30, 101.43, 79.11, 72.89, 72.24, 71.92, 70.52, 70.19, 70.09, 69.90, 69.69, 63.12, 48.92, 40.34, 28.43; MALDI TOF MS calcd for C47H55N2O14 [M+H]+: 871.36; found : 871.59
한편, 상기 6a 및 6b 화합물의 각 1H NMR 및 13C NMR 데이터를 각각 도 5 내지 8에 나타내었다.
3. [2-( N -Cy3-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-α-D-글루코스(3) 및 [2-(N-Cy3-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-β-D-글루코스(4)의 제조
(1) [2-(N-Cy3-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-α-D-글루코스(3)
: 상기에서 얻어진 6a 화합물의 벤조일기의 비보호(debenzoylation)를 위해, 상기 6a 화합물(20mg, 0.023mmol)이 녹아 있는 1mL의 메탄올 용액에 소듐 메톡사이드(0.5 M in Metanol, 368μL, 0.184mmol)을 첨가하였다. 반응이 완료된 후, 상기 혼합물을 메탄올성 HCl(methanolic HCl)로 중화시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 이어서 1차 아민에 존재하는 Boc 그룹의 비보호화를 위하여, 상기 잔류물에 50% TFA를 함유하는 다이클로로메탄 용액을 첨가한 다음, N2 치환(purging)에 의해 농축시켰다. 그 결과 완전히 비보호화된 화합물이 녹아 있는 DMF(300μL) 용액을 DIPEA로 염기화한 후, 여기에 Cy3-COOH[15](10mg, 0.022mmol) 및 EDC(7mg, 0.046mmol)이 녹아있는 50μL DMF 용액을 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 상온에서 교반한 다음, 반응의 진행을 HPLC 분석에 의해 모니터하였다. 이 때, HPLC 분석을 위한 용출 프로토콜(elution protocol)은 다음과 같이 수행하였다: 95% 물, 5% 아세토나이트릴로 5분, 5% 물, 95% 아세토나이트릴로 35분간 선형 그레디언트(linear gradient), 이어서 0% 물, 100% 아세토나이트릴로 5분간 선형 그레디언트, 다시 0% 물, 100% 아세토나이트릴로 15분, 마지막으로 95% 물, 5% 아세토나이트릴로 10분. 프렙용 HPLC(prep-HPLC)에 의해 정제하여, 원하는 화합물 3(5.2mg, 30%)을 수득하였다(체류시간: 25분). 상기 화합물은 1H, 13C, MALDI-TOF MS 및 HRMS로 확인하였다.
1H NMR (500 MHz, MeOD) δ8.55 (t, J = 13 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.45 (q, J = 7 Hz, 2H), 7.377.29 (m, 5H), 6.43 (d, J = 13.5 Hz, 2H), 4.16 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 4.033.99 (m, 1H), 3.82 (dd, J = 11.5, 2.0 Hz, 1H), 3.75 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 3.69 (s, 5H), 3.663.59 (m, 7H), 3.53(t, J = 6.0 Hz, 3H), 3.48 (dd, J = 9.5, 3.5 Hz, 1H), 3.36 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 3.283.26 (m, 4H), 2.30 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.80 (s, 17H); 13C NMR (125 MHz, MeOD) δ175.56, 174.77, 174.36, 150.96, 142.84, 142.13, 140.97, 128.77, 125.61, 125.52, 122.33, 122.17, 111.17, 111.00, 102.60, 102.39, 99.05, 73.71, 73.11, 72.03, 70.35, 70.20, 70.01, 69.35, 65.63, 62.48, 61.43, 49.42, 43.71, 38.98, 35.04, 30.55, 27.11, 26.93, 26.73, 22.79; HRMS(FAB+): calcd for C43H63N4O9 [M]+: 779.4595; found, 779.4601.
(2) [2-(N-Cy3-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-β-D-글루코스(4)
: 6a 화합물 대신 6b 화합물을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방식에 의해 원하는 화합물 4(42) 7.6mg을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, MeOD) δ8.58 (t, J = 13.5 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 4.5 Hz, 2H), 7.397.34 (m, 4H), 6.46 (d, J = 13.5 Hz, 2H), 4.38 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 4.19 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 4.144.11 (m, 1H), 3.973.91 (m, 2H), 3.77 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.723.66 (m, 9H), 3.56 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.403.24 (m, 11H), 2.33 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.79 (s, 17H); 13C NMR (125 MHz, MeOD) δ175.56, 174.77, 174.36, 150.96, 142.83, 142.13, 140.97, 128.78, 125.62, 125.53, 122.33, 122.17, 111.18, 111.09, 102.97, 102.61, 102.39, 77.02, 76.71, 73.69, 70.33, 70.16, 70.01, 69.36, 65.53, 64.49, 61.36, 49.42, 43.71, 38.97, 35.05, 30.51, 27.11, 26.93, 26.73, 22.79; HRMS(FAB+) calcd for C43H63N4O9[M]+: 779.4589; found, 779.4609.
한편, 상기 3 및 4 화합물의 각 1H NMR 및 13C NMR 데이터를 각각 도 9 내지 12에 나타내었다.
[실험예]
재료구입
D-(+)-글루코스, 무수 아세트산 (acetic anhydride), 소듐 메톡사이드 (sodium methoxide; 0.5M solution in methanol), 플루오레세인 아이소티오시안산염(fluorescein isothiocyanate), 염화벤조일(benzoyl chloride), 피리딘, 다이메틸포름아마이드(DMF), 다이메틸술폭사이드(DMSO) 및 트라이플루오로아세트산(TFA)은 시그마-알드리치사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. N,N-다이아이소프로필에틸아민, 트라이에틸아민, 및 2-브로모에탄올은 TCI(Japan)로부터 구입하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 Bruker DRX-300(Bruker Biospin, Germany) 및 Varian Inova-500(Varian Assoc., Palo Alto, USA)를 사용하여 기록되었으며, 화학적 이동(chemical shift)은 내부 테트라메틸실란 표준의 ppm의 낮은 장(downfield) 범위를 측정하였다. 고안된 생성물은 Bruker Daltonicsⓡ(Germany)를 이용한 MALDI-TOF MS 분석으로 확인하였다. 최종 화합물은 고분해능 질량분석기(HRMS; high-resolution mass spectrometry)로 확인하였다. HRMS 분석은 서울대학교 기초과학 교육연구 공동기기원의 질량 분석기를 이용하여 수행되었다. 역상 HPLC 분석은, 분석의 경우 유속 1.0 mL/min로 VP-ODS C-18 컬럼(150×4.6 mm) 상에서, 프렙 (preparation)의 경우 유속 10.0 mL/min로 PRC-ODS C-18 컬럼(250×20 mm) 상에서, Shimadzu LC-6AD 펌프, SPD-10A 탐지기(Japan)를 이용하여 수행되었다. HPLC 용매는 0.1% TFA를 함유하는 물(용매 A) 및 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴(용매 B)로 구성하였다.
세포배양
A549 인간 폐암 선암 세포, HeLa 인간 자궁암 세포, NIH/3T3 마우스 섬유아세포 세포, WI-38 인간 폐 섬유아세포 세포는 ATCC 세포은행(ATCC, Manassas, VA, USA)으로부터 구입하였다. A549 세포, HeLa 세포 및 WI-38 세포는 열불활성화된 10%(v/v) 소혈청(FBS, United Search Partners, Austin, TX, USA) 및 1%(v/v) 항생제-항진균제 용액이 보충된 RPMI 1640(United Search Partners, Austin, TX, USA) 배지에서 배양되었다. NIH/3T3는 열불활성화된 10%(v/v) 우혈청 및 1%(v/v) 항생제-항진균제 용액이 보충된 DMEM 배지(United Search Partners, Austin, TX, USA)에서 배양되었다. 모든 셀라인은 37℃, 5% CO2 및 95% 공기의 축축한 분위기(humidified atmosphere)에서 유지되었으며, 공초점 주사 현미경(confocal laser scanning microscopy; CLSM)에 의한 형광 방출을 관찰하기 위해, T75 플라스크(Nalge Nunc International, Naperville, IN, USA) 내에서 배양하였다.
공초점 주사 현미경(CLSM)의 프로토콜(protocol)
1×104개의 세포를 35mm 세포 배양 접시 내의 랩-텍 유리 챔버 슬라이드(Lab-Tek glass chamber slide; Nalge Nunc International, Naperville, IN, USA)에서 배양하였다. 24시간 후, 상기 유리 챔버 슬라이드를 배양 접시에서 꺼내 챔버 상에 적재하였다. 그 다음, 상기 챔버를 현미경에 부착하였다. 챔버는 온도를 37℃로 유지하였다. 챔버 내의 RPMI 1640 배지에 Cy3-Glc-α 12.5 μM를 주입한 후, 매 60초마다 형광 이미지를 촬영하고, 디지털화하고, 추후 분석을 위하여 컴퓨터에 저장하였다.
도립 형광 현미경의 프로토콜
1×104개의 세포를 35mm 세포 배양 접시 내의 랩-텍 유리 챔버 슬라이드(Lab-Tek glass chamber slide; Nalge Nunc International, Naperville, IN, USA)에서 배양하였다. 24시간 후, 세포들을 각 실험 목적에 맞게 처리하였다. 그 후, 배지를 12.5 μM의 Cy3-Glc-α를 함유하는 RPIM 1640 배지로 교체하였다. 세포들을 40분 동안 Cy3-Glc-α에 노출한 후, PBS로 3회 세척하였다. 마지막으로, 상기 유리 챔버 슬라이드를 배양 접시에서 꺼내 형광 현미경(Axiovert 200, Carl Zeiss, Germany)에 적재하였다. 35-50개 세포들의 형광 이미지를 CCD 카메라(Axiocam MRm, Germany)로 촬영한 후, 각 세포들의 형광 세기를 데이터 분석 프로그램인 Axiovision으로 측정하였다. Axiovision을 이용하여, 위상대비 이미지 내의 세포를 함유하는 ROIs(regions of interest)와 같은 영역을 그렸다. Axiovision는 CCD 카메라의 이미지들을 분석하여 본 발명자들이 결정한 ROIs 내의 형광 세기의 디지털화된 평균값을 알려주었다. 본 발명자들은 세포가 함유하는 형광 세기값을 얻기 위하여, 상기 형광 세기로부터 배경 세기(background intensity)를 서브트랙(subtract) 하였다. 상기의 방법을 이용하여, 형광 세기를 디지털화한 다음 다양한 실험을 수행하였다.
실험예 1
(1) 상기 실시예 1에서 최종적으로 수득한 본 발명 글루코스 유사체의 바이오 프로브로서의 응용성을 평가하기 위하여, 먼저 공초점 주사 현미경(CLSM)을 이용하여 알파 글루코스 아노머([2-(N-Cy3-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-α-D-글루코스; 이하, Cy3-Glc-α)의 세포 내에서의 흡수(uptake) 효율을 측정하였다. 즉, 상기 아노머의 최적 농도를 결정하기 위하여, A549 세포(인간 폐암 중 비소세포 폐암 세포)에 상기 아노머를 각각 6 μM, 12.5 μM, 25 μM, 50 μM 및 100 μM의 농도로 삽입하였다.
그 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서 볼 수 있듯이, 반복된 실험 결과에 기초하여, 세포내 흡수 실험에 있어서, 최적화된 농도를 12.5 μM로 선별할 수 있었다.
(2) 또한, 상기 아노머, Cy3-Glc-α의 최대 흡수를 달성하기 위해 요구되는 최적 배양 시간을 측정하기 위하여, 역시 공초점 주사 현미경을 이용하여 실험하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에서 보여지는 바와 같이, A549 세포에 의한 Cy3-Glc-α의 흡수는 35분 이내에 최대치에 도달하였다.
이러한 최적화된 조건 하에서 상기 본 발명의 프로브가 글루코스 유사체로 작용하는지 여부에 대해 다음과 같이 실험하였다.
실험예 2
(1) 2-NBDG에 비교하였을 때, 본 발명의 바이오 프로브는 1번 탄소 위치에서 O-1-글리코실화된 글루코스 유사체이다. 따라서, Cy3-Glc-α와 베타 글루코스 아노머(이하, Cy3-Glc-β)의 분자 구조가 매우 구별되기 때문에 상기 아노머들의 행동이 상이할 것이라는 가정 하에, 상기 2개의 아노머를 동시에 비대칭으로 합성하였다.
상기 가정이 맞는지를 확인하기 위하여, Cy3-Glc-α의 실시간 흡수(real-time uptake)를 측정하였으며, 그 결과를 도립 형광 현미경(inverted fluorescent microscope)을 이용한 A549 세포의 라이브 영상화(live imaging)에 의해 Cy3-Glc-β의 결과와 비교하였다.
그 결과 도 15A에서 볼 수 있듯이, Cy3-Glc-α가 Cy3-Glc-β에 비하여 40% 우수한 결과를 나타내었다. 이러한 결과로부터, 1번 탄소 위치(anomeric position)에서의 입체화학이 글루코스의 모방율에 명백히 영향을 미치며, 그 원인은 GLUTs에서의 D-글루코스의 결합 방향 때문일 것이라는 결론을 내릴 수 있었다[P. W. Hruz, M.M. Mueckler, Mole. Memb. Biol. 2001, 18, 183-193].
(2) 상기의 관찰결과에 기초하여, 바이오 프로브로서 오직 α 아노머(anomer)만을 대상으로, 추가의 분자영상 및 바이오 응용성(bioapplicability)을 시험하였다. 즉, Cy3-Glc-α의 흡수효율을 측정하였는데, 특히 정상 세포 대신(WI-38; 폐 정상 셀라인, NIH/3T3; 마우스의 섬유아세포 셀라인) GLUT-과다발현 암세포(A549; 폐암 셀라인, HeLa; 자궁암 셀라인)의 분화에 대해 집중 실험하였다.
그 결과 도 15B에서 볼 수 있듯이, NIH/3T3에서의 Cy3-Glc-α의 흡수는 A549 세포의 결과에 비하여 겨우 30%에 불과하였다. 이로부터 강화된 글루코스-대사를 가진 암 세포에서의 Cy3-Glc-α의 선택적인 흡수를 확인할 수 있었다. 이러한 데이터는, Cy3-Glc-α의 세포흡수가 암 세포 내에서의 더 높은 글루코스 대사에 의존하며, 차례로 빨리 복제되는 조직의 에너지 요구를 만족시키기 위하여 해당작용으로부터 생성되는 ATP에 의존함을 입증하였다. 따라서, 글루코스 대사는 GLUT/헥소키나아제의 발현 수준과 밀접한 관련이 있다. 이러한 데이터로부터 본 발명의 Cy3-Glc-α를 암연구와 관련한 분자영상 및 생분석에 적용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
한편, 도 15C는 A549 세포(a, e), HeLa 세포(b, f), WI-38 세포(c, g) 및 NIH/3T3 세포(d, h)에 의한 Cy3-Glc-α의 흡수를 나타낸 사진이다.
실험예 3
글루코스 유사체의 세포내 흡수 경로가 D-글로코스의 경로와 관련이 있는지 를 확인하기 위하여, 종래 많은 연구들에서 직접 비교 실험(direct competition experiment)이 수행되어 왔다[M. Zhang, Z. Zhang, D. Blessington, H. Li, T. M. Busch, V. Madrak, J. Miles, B. Chance, J. D. Glickson, G. Zheng, Bioconjugate Chem. 2003, 14, 70-97; K. Yamada, M. Nakata, N. Horimoto, M. Saito, H. Matsuoka, N. Inagaki, J. Biol. Chem. 2000, 275, 22278-22283]. 만약 어떤 글루코스 유사체의 세포내 흡수가 D-글루코스의 농도에는 의존하나 L-글루코스의 농도에는 의존하지 않는다면, 그 특정한 글루코스 유사체는 GLUT-매개 글루코스 흡수 시스템(GLUT-mediated glucose uptake system)을 통하여 세포 내로 들어갈 수 있을 것이다.
따라서 이전의 실험 결과에 기초하여, Cy3-Glc-α의 세포내 흡수과정을 실험하였다. 상기 실험은 글루코스를 함유하지 않는 RPMI 1640, 10 mM의 D-글루코스를 함유하는 RPMI 1640, 50 mM의 D-글루코스를 함유하는 RPMI 1640, 및 50 mM L-글루코스를 함유하는 RPMI 1640 배지 내에서의 A549 세포에 의한 Cy3-Glc-α의 흡수효율을 측정함으로써 수행되었다(37℃).
도 16에서 볼 수 있듯이, Cy3-Glc-α의 흡수는 배지 내의 D-글루코스의 농도가 증가할수록 감소되었다. 그러나, Cy3-Glc-α의 흡수는 배지 내 L-글루코스의 농도에는 영향을 받지 않았다. 이러한 결과는 Cy3-Glc-α가 수동확산(passive diffusion)에 의해서가 아니라 글루코스-특이적 수송 시스템을 통해 세포로 흡수된다는 사실을 시사한다. 따라서, Cy3-Glc-α는 D-글루코스 유사체으로 작용할 수 있으며, 글루코스 대사 연구 분야에서 연구 수단(research tool)으로 적용될 수 있 다.
실험예 4
또한 배지 내의 삼투압이 Cy3-Glc-α의 흡수에 영향을 미치지 않는다는 사실을 확실히 하기 위해, 55 mM 알라닌을 함유하는 배지를 이용하여 A549에 의한 Cy3-Glc-α의 흡수를 측정하였다. 그 결과 도 17에서 볼 수 있듯이, 상기 흡수 효율은 55 mM 알라닌이 있든 없든 차이가 없었다. 이러한 결과는 삼투압이 A549에 의한 Cy3-Glc-α의 흡수에 영향을 미치지 않는다는 사실을 증명해준다.
실험예 5
Cy3-Glc-α가 D-글루코스 유사체로서 기능한다는 사실을 확인하고, 이를 2-디옥시글루코스, 예를 들어 2-NBDG의 형광 유사체와 비교하였다[M. Zhang, Z. Zhang, D. Blessington, H. Li, T. M. Busch, V. Madrak, J. Miles, B. Chance, J. D. Glickson, G. Zheng, Bioconjugate Chem. 2003, 14, 7097; K. Yoshioka, H. Takahashi, T. Homma, M. Saito, K. B. Oh, Y. Nemoto, H. Matsuoka, Biochim. Biophys. Acta. 1996, 1289, 5-9; K. Yoshioka, M. Saito, K. B. Oh, Y. Nemoto, H. Matsuoka, M. Natsume, H. Abe, Biosci. Biotech. Biochem. 1996, 60, 1899-1901].
2-NBDG의 세포내 흡수는 Cy3-Glc-α와 동일한 실험 조건 하에서는 검출되지 않았다. 심지어, 125 μM 농도의 2-NBDG를 500 ms 동안 CCD 카메라의 렌즈에 노출 시킨 경우에도 형광이 탐지되지 않았다. 2-NBDG의 형광 세기를 Cy3-Glc-α의 80% 수준으로 끌어올리기 위해서는, 2-NBDG의 농도를 10배로 증가시키고, D-글루코스가 소모된 배지 내에서의 렌즈 노출 시간을 20배로 증가할 것이 요구되었다.
또한, 정상 배지(10 mM D-글루코스 함유)에서의 2-NBDG의 세포내 흡수는 매우 낮았으며(정상 배지에서 >60% 흡수 감소), 형광 기초 영상화 방법(fluorescent based imaging method)으로는 거의 검출할 수 없었다[R. G. O'Neil, L. Wu, N. Mullani, Mol. Imaging Biol. 2005, 7, 388-392]. 2-NBDG는 오직 글루코스가 소모된 배지에서만 검출할 수 있으며, 이러한 사실은 생물학적으로 중요한 환경에서 상기 2-NBDG의 응용성이 제한적이라는 것을 의미한다. 2-NBDG와 비교하여, 글루코스 함유 배지에서의 Cy3-Glc-α 흡수는 글루코스가 소모된 배지에서의 흡수에 비해 단지 5%만 감소되었다(도 18). 따라서, Cy3-Glc-α는 글루코스 결핍과 관계없이 생분석 시스템(bioassay system)에서 자유로이 적용될 수 있음을 확인하였다.
실험예 6
(1) Cy3-Glc-α가 정상적인 글루코스 함유 배지에서 D-글루코스 특이적 수송 메카니즘을 통해 D-글루코스 유사체로서 세포에 의해 흡수될 수 있다는 사실에 기초하여, 이를 세포 대사와 관련한 작은 분자 조절자(molecular modulator)의 스크리닝에 적용하였다. 항암제에 의해 암세포의 교란된 세포 대사(perturbed cellular metabolism)가 저하될 것이고, 이것은 글루코스 흡수의 감소와 밀접한 관련이 있다고 추측하였다.
본 발명자들은 이러한 현상을 본 발명의 형광 바이오 프로브, 즉 Cy3-Glc-α를 이용하여 모니터하였다. 상기 원리를 증명하기 위한 실험(proof-of-principle experiment)으로서, A549 암세포를 항암제인 탁솔(taxol, 9.8 μM)로 처리한 후, 3, 6, 12, 24시간 경과 후의 Cy3-Glc-α의 흡수율을 측정하였다.
그 결과 도 19에서 볼 수 있듯이, 배양시간이 길어짐에 따라 상기 프로브의 세포내 흡수는 감소되었다. 이러한 결과는, Cy3-Glc-α가 생리학적인 조건 하에서 살아있는 세포 내의 생활성인(bioactive) 작은 분자들에 의해 일어나는 대사 교란(metabolic perturbation)을 평가하기 위한 수단으로 가능성이 있음을 명백히 시사한다.
(2) 따라서, Cy3-Glc-α는 세포의 생존에 영향을 주어서는 안 된다. CCK-8 키트(Cell Counting Kit-8, Dojindo, Japan)를 이용하여 Cy3-Glc-α(12.5 μM)로 처리된 세포의 생존을 ELISA 플레이트 리더(plate reader) (ELx800TM, BioTex, USA)DP 의해 측정하였다. CCK-8은 세포 증식 및 세포독성 분석에서 생존하는 세포의 개수를 결정하는 비색분석법(colorimetric assay)이다. CCK-8의 세포 생존을 측정하는 원칙은 MTT의 원칙과 동일하다. 그러나, CCK-8은 MTT에 비해 좀 더 감지력이 높으며, 따라서 본 발명자들은 세포 생존 시험을 위해 CCK-8을 선택하였다. 그 결과, 도 20에서 볼 수 있듯이, Cy3-Glc-α 처리가 본 배양 조건 하에서 세포의 생존에 영향을 미치지 않는다고 결론을 내릴 수 있었다.
(3) 또한 탁솔의 농도를 490 nM 내지 49 nM로 다양하게 변화시킨 후, A549 세포에 의한 8시간 및 12시간 경과 후의 Cy3-Glc-α의 흡수율을 측정하였으며, 다른 항암제인 콤브레타스타틴(combretastatin)(2μM)을 A549 세포에 처리한 후 A549 세포에 의한 8시간 및 12시간 경과 후의 Cy3-Glc-α의 흡수율을 측정하였다.
그 결과 하기 표 1에서 볼 수 있듯이, A549 세포에 의한 Cy3-Glc-α의 흡수는 용량 의존적인 결과를 보여주었다. 또한 콤브레타스타틴(combretastatin)도 세포 대사를 방해함으로써 세포 증식을 저해하였는데, 이는 Cy3-Glc-α의 세포내 흡수의 감소에 의해 알 수 있었다.
Figure 112007023667601-PAT00007
이러한 실험결과에 기초해 볼 때, Cy3-Glc-α는 미토콘드리아의 기능을 평가하는데 사용되는 MTT 분석[T. Mosmann, J. Immunol. Methods. 1983, 65, 55-63]과 유사한 방식으로 세포 내의 생활성인 작은 분자들의 행동을 평가하는데 사용될 수 있을 것으로 생각되었다. MTT 분석과 비교했을 때 Cy3-Glc-α를 이용한 검색(screening) 시스템의 이점은 다음과 같다: 첫째, 측정시간이 짧다. MTT 분석은 일반적으로 많은 경우, 예를 들어 탁솔 및 콤브레타스타틴을 사용했을 때, 24-72시간 정도가 걸리는 반면, Cy3-Glc-α를 이용한 스크리닝 시스템은 6시간에서 최대 12시간 정도의 상당한 차이를 보였다. 둘째, Cy3-Glc-α를 이용한 검색 시스템의 관찰 채널은 세포-생존 분석의 관찰 채널과는 상당히 다르다; 즉, 전자는 글루코스-흡수 효율의 측정과 관련이 있지만, 후자는 미토콘드리아의 기능 측정과 관련이 있다. 따라서, 상기 2가지의 시스템은 서로 각각의 한계를 보완할 수 있을 것으로 생각된다.
이상 실시예를 통하여 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 글루코스 유사체는 기존의 2-NBDG에 비하여 글루코스 흡수 추적자로서 보다 우수한 성능을 나타내며, 2-NBDG 또는 N-2-글리코실화 유사체와는 달리 정상적인 배지 상태에서 글루코스의 흡수를 모니터링할 수 있는 신규 물질이므로, 분자영상, 생분석, 글루코스 대사 관련 질병의 치료 또는 예방용 약물의 검색 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (21)

  1. 하기 화학식 1 또는 하기 화학식 2로 표시되는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체:
    [화학식 1]
    Figure 112007023667601-PAT00008
    [화학식 2]
    Figure 112007023667601-PAT00009
    상기 식들에서,
    R1은 -(CH2)n-NH- 또는 -(CH2)n-NH-(C2H4X)m-NH-이고, 여기에서 n은 1 내지 10의 정수이고, m은 1 내지 100의 정수이고, X는 CH2, O 또는 단일결합으로 m이 2 이상인 경우 각각 서로 같거나 다를 수 있으며,
    R2는 형광염료이고,
    Y는 O 또는 S이다.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 형광염료(R2)는 싸이3(Cy3), 싸이5(Cy5), 플루오레세인 아이소티오시안산염(FITC), 테트라메틸로다민 아이소티오시안산염(RITC), 알렉사(Alexa), 4,4,-다이플루오로-4-보로-3a,4a-다이아자-s-인다센(BODIPY),텍사스 레드(Texas Red), 비오틴을 포함하는 유기 화합물, 또는 나노입자를 포함하는 무기 화합물인 것을 특징으로 하는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 글루코스 유사체는 하기 화학식 3 또는 하기 화학식 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체.
    [화학식 3]
    Figure 112007023667601-PAT00010
    [화학식 4]
    Figure 112007023667601-PAT00011
  4. 형광염료로 표지된 글루코스 유사체의 합성방법에 있어서, O-1-글리코실화를 통해 형광염료를 표지하는 것을 특징으로 하는, 하기 화학식 1 또는 하기 화학식 2로 표시되는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체의 합성방법:
    [화학식 1]
    Figure 112007023667601-PAT00012
    [화학식 2]
    Figure 112007023667601-PAT00013
    상기 식들에서,
    R1은 -(CH2)n-NH- 또는 -(CH2)n-NH-(C2H4X)m-NH-이고, 여기에서 n은 1 내지 10의 정수이고, m은 1 내지 100의 정수이고, X는 CH2, O 또는 단일결합으로 m이 2 이상인 경우 각각 서로 같거나 다를 수 있으며,
    R2는 형광염료이고,
    Y는 O 또는 S이다.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 합성방법은 상기 화학식 1로 표시되는 알파 아노머와 상기 화학식 2로 표시되는 베타 아노머를 비대칭으로 합성하는 방법인 것을 특징으로 하는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체의 합성방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 합성방법은
    (a) 글루코스(D-glucose)를 이온교환수지와 함께 2-브로모에탄올에 용해시킨 후 50℃~70℃에서 환류시켜 상기 2-브로모에탄올이 알파와 베타 아노머 위치로 선택적으로 도입되도록 하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 얻어진 반응물을 피리딘 내에서 할로겐화벤조일과 반응시켜 벤조일기로 보호한 다음, 컬럼 크로마토그래피를 통해 알파와 베타 아노머로 분리하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 벤조일기로 보호된 알파와 베타 아노머 각각을 유기용매 내에서 박(Boc) 그룹을 함유하는 화합물과 40℃~60℃에서 반응시켜 박(Boc) 그룹으로 보호한 후 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 생성물의 벤조일기를 비보호화하고, 이어서 박(Boc) 그룹을 비보호화한 다음, 염기화하여 형광염료를 함유하는 용액과 반응시킨 후, HPLC로 분리하여 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체의 합성방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 (c) 단계에서 유기용매는 다이메틸포름아마이드(DMF) 및 트라이에틸아민(TEA)이고, 박(Boc) 그룹을 함유하는 화합물은 N-박-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아민 (N-Boc-3,6-dioxaoctane-1,8-diamine)인 것을 특징으로 하는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체의 합성방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 (d) 단계에서 벤조일기의 비보호화는, 상기 (c) 단계에서 얻어진 생성물이 녹아있는 메틸알콜(MeOH) 용액에 소듐 메톡사이드를 첨가하여 반응시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체의 합성방법.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 (d) 단계에서 박(Boc) 그룹의 비보호화는, 벤조일기가 비보호화된 화합물에 50% 트라이플루오로아세트산(TFA)을 함유하는 다이클로로메탄 용액을 첨가한 다음 N2 치환(purging)에 의해 농축시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체의 합성방법.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 (d) 단계에서 염기화는 비보호화된 화합물이 녹아있는 다이메틸포름아마이드(DMF) 용액과 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA)을 반응시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체의 합성방법.
  11. 청구항 6에 있어서, 상기 (d) 단계에서 형광염료를 함유하는 용액은 싸이3-COOH(Cy3-COOH) 및 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카르보다이이미드(EDC)가 녹아있는 다이메틸포름아마이드(DMF) 용액인 것을 특징으로 하는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체의 합성방법.
  12. 청구항 6에 있어서, 상기 컬럼 크로마토그래피는 실리카-겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체의 합성방법.
  13. 청구항 6에 있어서, 상기 (a) 단계와 (b) 단계 사이에, (a) 단계에서 얻어진 반응물을 여과하여 이온교환수지를 제거한 다음, 진공 농축시키고, 실리카-겔 플래 쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 글리코실화된 화합물을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체의 합성방법.
  14. 청구항 6에 있어서, 상기 (b) 단계에서 알파 아노머와 베타 아노머는 2:1의 비율로 분리되는 것을 특징으로 하는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체의 합성방법.
  15. 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체를 바이오 프로브로 사용하는 것을 특징으로 하는 분자영상 방법:
    [화학식 1]
    Figure 112007023667601-PAT00014
    [화학식 2]
    Figure 112007023667601-PAT00015
    상기 식들에서,
    R1은 -(CH2)n-NH- 또는 -(CH2)n-NH-(C2H4X)m-NH-이고, 여기에서 n은 1 내지 10의 정수이고, m은 1 내지 100의 정수이고, X는 CH2, O 또는 단일결합으로 m이 2 이상인 경우 각각 서로 같거나 다를 수 있으며,
    R2는 형광염료이고,
    Y는 O 또는 S이다.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 분자영상 방법은 측정장치로 공초점 주사 현미경 (Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM), 도립 형광 현미경, 형광세포분리법 (Fluorsecent Activated Cell Sorter, FACS), 마이크로플레이트 리더(Microplate reader) 또는 하이컨텐츠 스크리닝 (High Content Screening)을 이용하는 것을 특징으로 하는 분자영상 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 분자영상 방법은 암 또는 종양의 영상화, 또는 글루코스 운반기(glucose transporters)와 연관된 세포 대사 연구를 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 분자영상 방법.
  18. 청구항 15에 있어서, 상기 글루코스 유사체는 1μM~100μM의 농도 범위로 사용되고, 35분 이하로 배양하는 것을 특징으로 하는 분자영상 방법.
  19. 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 형광염료로 표지된 글루코스 유사체를 프로브로 사용하는 것을 특징으로 하는 글루코스 대사 관련 질병 치료 또는 예방용 약물의 고효율 검색방법:
    [화학식 1]
    Figure 112007023667601-PAT00016
    [화학식 2]
    Figure 112007023667601-PAT00017
    상기 식들에서,
    R1은 -(CH2)n-NH- 또는 -(CH2)n-NH-(C2H4X)m-NH-이고, 여기에서 n은 1 내지 10의 정수이고, m은 1 내지 100의 정수이고, X는 CH2, O 또는 단일결합으로 m이 2 이상인 경우 각각 서로 같거나 다를 수 있으며,
    R2는 형광염료이고,
    Y는 O 또는 S이다.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 약물은 항암제, 비만 예방 또는 치료용 약물, 또는 당뇨병 예방 또는 치료용 약물인 것을 특징으로 하는 고효율 검색방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 항암제는 폐암, 위암, 간암, 또는 대장암에 대한 것임을 특징으로 하는 고효율 검색방법.
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