KR101150967B1 - 형광 글루코스 유사체 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 형광 글루코스 유사체 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다양한 링커를 통해 형광염료를 표지한 새로운 형광 글루코스 유사체 및 상기 유사체를 바이오프로브로서 이용하는 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

형광 글루코스 유사체 및 그 용도 {Fluorescent glucose analogue and usage thereof}

본 발명은 신규한 형광 글루코스 유사체 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다양한 링커를 통해 형광염료를 표지한 새로운 형광 글루코스 유사체 및 상기 유사체를 바이오프로브로서 이용하는 방법 및 용도에 관한 것이다.

글루코스는 생체 시스템에서 매우 중요한 역할을 한다. 글루코스 항상성은 에너지 대사와 임계적으로(critically) 연관되어 있고, 인슐린-매개 신호 경로에 의해 조절된다. 인슐린은 PI3K-AKT, Cbl 및 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 경로를 활성화시키고, GLUT4(glucose transporter 4)를 원형질막(plasma membrane)으로 전위(translocation)시킴으로써 글루코스 흡수(intake)를 증가시키는 핵심 호르몬이다. 비정상적으로 높은 혈중 글루코스 수준은 인슐린 분비 또는 인슐린 작용 중 어느 하나의 결함에 의해 발생한다. 따라서, 글루코스 대사(metabolism), 즉 세포에 의한 글루코스 섭취를 모니터링하는 것은 생물의학 연구의 첫 단계이며, 다수의 질환, 특히 대사성 질환의 진단에 유용하다.

대부분의 선진국에서, 당뇨병은 가장 중요한 만성질환으로 여겨진다. 따라서, 신규한 항당뇨제의 개발은 생물의학적 과학계에서 점점 더 많은 관심을 얻고 있으며, AMPK(Adenosine Monophosphate Protein Kinase) 및 PPAR(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor)과 같은 인슐린 신호 경로에서의 핵심 조절자는 생활성 소분자(bioactive small molecule)의 확인을 위한 분자 표적이 되어 왔다.

항당뇨제의 특징적인 효과는 세포 내 글루코스 유입율의 증가인데, 이는 방사성 동위원소(¹⁴C 또는 ³H)로 표지된 2-디옥시글루코스 유사체에 의해 모니터될 수 있다. [¹⁸F]-2-플루오로-2-디옥시글루코스(¹⁸FDG)는 PET(positron emission tomography)에 의한 암진단에 널리 사용된다. 세포의 글루코스 섭취의 방사성 동위원소-기반 탐지에 비해, 형광-기반 탐지는 적용 가능성이 보다 높다.

이와 관련하여 2-디옥시글루코스의 형광 유사체인 2-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)-아미노]-2-디옥시-D-글루코스(2-NBDG)가 Yoshioka 등에 의해 개발되었으며 널리 연구되었다. 2-NBDG는 여러 다양한 분야에서, 특히 종양 이미징(tumor imaging) 및 GLUT와 관련한 세포 대사 작용의 검사(examination)에 사용된다. 그러나, 2-NBDG는 비생리적인 당 결핍 환경에서만 사용 가능한 단점이 있다. 따라서 기존에 알려진 2-NBDG 또는 N-2-글리코실화 유사체들은 항암물질, 비만과 관련된 연구 또는 글루코스 대사와 관련된 질병들, 예로서 당뇨병의 약물치료제를 검색하고자 하는 경우 실질적으로 적용이 불가능하다.

이러한 한계를 극복하기 위해서 본 발명자들은 세포 내 글루코스 섭취를 모니터링할 수 있는 신규한 형광 글루코스 유사체를 개발한 바 있다(특허출원번호: 10-2007-0029334). 그러나 여전히 당업계에서는 보다 새롭고 유용한 형광 글루코스 유사체를 필요로 하고 있다.

본 발명은 상기한 바와 같은 업계의 요구를 만족시키기 위해서 고안된 것으로, 본 발명의 목적은 세포내 글루코스 흡수의 분석을 위한 새로운 형광 글루코스 유사체를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형광 글루코스 유사체를 바이오프로브로 이용하는 방법 및 용도를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지환족 또는 방향족 고리나 그 헤테로 고리를 포함하는 다양한 링커에 의해 형광염료로 표지된 형광 글루코스 유사체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 형광 글루코스 유사체를 포함하는 바이오프로브를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 형광 글루코스 유사체를 바이오 프로브로 사용하는 분자 영상(molecular imaging) 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 형광 글루코스 유사체를 바이오 프로브로 사용하는 형광 이용 세포 분류(FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting)법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 형광 글루코스 유사체를 바이오 프로브로 사용하는 글루코스 대사 관련 질병 치료 또는 예방용 약물의 검색방법을 제공한다.

본 발명의 형광 글루코스 유사체는 기존의 글루코스 유사체 2-NBDG보다 적은 농도의 사용으로 보다 원활히 세포 내로 유입되는 GLUT-특이적 글루코스 유사체로서, 글루코스와의 경쟁적 세포 섭취를 기반으로 바이오프로브로서 작용하여 분자 영상에 의한 글루코스의 세포 내 유입에 대한 모니터링, 글루코스 대사 관련 질환 치료 또는 예방용 약물의 검색을 위해 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 수득된 최종 생성물인 형광 글루코스 유사체 [2-(N-Cy3-피페라지노에틸)]-α-D-글루코스 (GB2-Cy3)의 ¹H NMR 데이터이고,
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 수득된 최종 생성물인 형광 글루코스 유사체 [2-(N-Cy3-피페라지노에틸)]-α-D-글루코스 (GB2-Cy3)의 ¹³C NMR 데이터이며,
도 3은 본 발명의 실시예 2에서 수득된 최종 생성물인 형광 글루코스 유사체 [2-(N-Cy3-시클로헥산-1,4-디아미노에틸)]-α-D-글루코스(GB5-Cy3)의 ¹H NMR 데이터이고,
도 4는 본 발명의 실시예 3에서 수득된 최종 생성물인 형광 글루코스 유사체 [2-(N-Cy3-아미노벤질아미노에틸)]-α-D-글루코스(GB6-Cy3)의 ¹H NMR 데이터이고,
도 5는 D-글루코스의 존재 또는 부재 하에서 GB2-Cy3(5 μM), GB1-Cy3(5 μM), 및 2-NBDG(5 μM 및 50 μM)) 각각으로 처리된 NIH/3T3세포의 형광 강도를 유세포분석한 그래프 a), GBs-Cy3 또는 2-NBDG로 처리된 세포의 형광 강도를 히스토그램화한 것 b), 및 D-글루코스 결핍된 세포의 형광강도를 100으로 하여 노멀라이즈한 것 c)이며 (흑색선: 글루코스 부재 환경/적색선: 11mM D-글루코스 존재 환경),
도 6은 세포 a) NIH/3T3 및 b) A549에서, 다양한 농도의 D-글루코스의 존재 하에서 GB2-Cy3 (10 μM)의 경쟁적 섭취를 나타내는 형광 현미경 이미지 (스케일 바(scale bar)는 20 μm를 나타냄)이고,
도 7은 폐 흑색종 세포주 A549에서, 다양한 농도의 D-글루코스의 존재하에서 형광 글루코스 유사체(a:GB1-Cy3, b:GB2-Cy3, 각 12.5 μM)의 경쟁적 섭취를 나타내는 형광 현미경 이미지이며,
도 8은 상기 도 7에서 세포 내에 유입된 형광 글루코스 유사체의 형광 강도를 비교하는 히스토그램이고,
도 9는 상기 도 7에서 각 실험군의 11 mM D-글루코스 존재하의 형광 강도를 100으로 하여 노멀라이즈한 형광 강도 그래프(a:GB1-Cy3, b:GB2-Cy3)이고,
도 10은 지방전구세포 3T3/L1의 분화 과정 동안, GB2-Cy3의 섭취 변화를 나타내는 광학 현미경 이미지 (좌측도), 및 3T3/L1의 형광 강도를 유세포분석한 그래프 (우측도)이며,
도 11은 GB2-Cy3 처리된 C2C12 근육세포에서 글루코스 경쟁 및 인슐린 반응을 나타내는 그래프로서, a) 유세포분석에 의해 분석된 형광 강도, b) D-글루코스 및 인슐린 없이 배양된 C2C12 세포를 100으로 노멀라이즈 하여 나타낸 각 실험군의 형광 강도이고,
도 12는 GB2-Cy3에 의한 인슐린, AICAR, 및 덱사메타존의 세포 흡수의 모니터링을 나타내는 히스토그램으로서, 무처리된 세포의 형광 강도를 100으로 하여 노멀라이즈하였다. a) 3T3/L1 비만세포; b) C2C12 근육세포
도 13은 공초점 현미경을 이용하여 C2C12 근육세포에서의 인슐린, AICAR의 세포 흡수를 모니터링하여 나타낸 그래프 및 그 현미경 이미지로서, 무처리된 세포의 형광 강도를 100으로 하여 노멀라이즈하였다. a) 무처리세포; b) 인슐린 처리세포; c) AICAR 처리세포

구체적으로 본 발명이 제공하는 형광 글루코스 유사체는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시된다:

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 식들에서,

R₁은 -(CH₂)_n-A- 또는 -(CH₂)_n-NH-(CH₂)_x1-B-(CH₂)_x2-NH-이고, 여기에서 A는 1개 이상의 질소원자, 산소원자 또는 황원자를 헤테로 원자로 포함하는 C2-C20의 헤테로시클로알킬렌 또는 C2-C20의 헤테로아릴렌이고, B는 C3-C20의 시클로알킬렌 또는 C6-C20의 아릴렌이고, n은 1 내지 10의 정수이고, x1 및 x2는 0 내지 10의 정수이고, x1 및 x2는 각각 서로 같거나 다를 수 있으며,

R₂는 형광염료 또는 형광 염료가 표지된 물질과 선택적으로 결합할 수 있는 저분자 유기 화합물이고,

Y는 O 또는 S이다.

본원에서 사용된 용어 "형광 염료(fluorescent dye)"는, 형광 염료 자체를 나타내거나, 또는 상기 형광 염료가 표지된 물질과 선택적으로 결합할 수 있는 저분자 유기 화합물, 예컨대 형광 염료가 표지된 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 선택적으로 결합할 수 있는 비오틴과 같은 화합물을 나타내는 것으로, 특별히 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 형광 염료 자체로서는 싸이3(Cy3), 싸이5(Cy5), 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(RITC), 알렉사(Alexa), 4,4,-다이플루오로-4-보로-3a,4a-다이아자-s-인다센(BODIPY), 텍사스 레드(Texas Red) 또는 이광자 염료(two-photon dye)인 2-아세틸-6-다이메틸아미노나프탈렌 (2-acetyl-6-dimethylaminonaphthalene, Acedan)를, 또는 형광 염료가 표지된 물질로는 아비딘 또는 스트렙트아비딘, 상기 형광 염료가 표지된 물질과 선택적으로 결합하는 저분자 유기 화합물로서는 비오틴을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 글루코스 모체에 결합된 링커에 아미드결합을 통해 결합된 저분자 유기화합물(일례로서 비오틴)과 선택적 결합, 즉 화학결합할 수 있는, 바람직하게는 고도의 친화도로 화학결합할 수 있는 물질(일례로서 아비딘 또는 스트렙트아비딘)에는 본 발명에서 사용가능한 형광물질이 결합되어 표지됨이 바람직하며, 이때 상기 아비딘 또는 스트렙트아비딘과 형광물질은, 당업자에게 공지된 고정화수단(예를 들어 링커)을 통해 결합되거나 또는 상호간의 표면에 존재하는 기능기들의 화학결합에 의해 직접적으로 결합하여 표지될 수 있다.

이때, 상기 화학식 1의 화합물에 포함된 형광 글루코스 유사체는 알파 아노머(α anomer)이며, 상기 화학식 2의 화합물에 포함된 형광 글루코스 유사체는 베타 아노머(β anomer)이다.

상기 식에서, 질소원자, 산소원자 또는 황원자 등의 헤테로 원자는 고리 내에 1개 이상 포함될 수 있고, 서로 같은 종류의 원자뿐만 아니라 다른 종류의 헤테로 원자(예를 들어, 질소원자와 산소원자)가 한 고리 내에 동시에 포함될 수도 있다.

상기 식에서 바람직하게는, 상기 R₁이 -(CH₂)_n-A- 이고, 여기서 A가 1개 이상의 질소원자 또는 산소원자를 헤테로 원자로 포함하는 C2-C20의 헤테로시클로알킬렌이다.

상기 식에서 특히 바람직하게는, 상기 R₁이

이고, 여기에서 n, m₁ 및 m₂는 각각 1 내지 10의 정수이며, m₁ 및 m₂는 각각 서로 같거나 다를 수 있다.

또한, 상기 식에서 특히 바람직하게는, 상기 R₁이 -(CH₂)_x1-NH-(CH₂)_x2-B-NH-이고, 여기에서 B는 C3-C20의 시클로알킬렌 또는 C6-C20의 아릴렌이며, x1 및 x2는 0 내지 10의 정수이고, x1 및 x2는 각각 서로 같거나 다를 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 형광 글루코스 유사체는 이에 제한되는 것은 아니나 하기의 화학식 3 내지 5로 표시될 수 있다.

[화학식 3]

(GB2-Cy3)

[화학식 4]

(GB5-Cy3)

[화학식 5]

(GB6-Cy3)

한편 이러한 형광 글루코스 유사체는 형광염료를 O-1-글리코실화를 통해 1번 탄소 위치에 표지함으로써 합성될 수 있다. 예를 들어, 상기 형광 글루코스 유사체는 다음과 같은 단계를 포함하는 방법에 의해 제조가능하다:

(a) 글루코스(D-glucose)를 이온교환수지와 함께 2-브로모에탄올에 용해시킨 후 60℃~70℃에서 환류시켜 상기 2-브로모에탄올이 알파와 베타 아노머 위치로 선택적으로 도입되도록 하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 얻어진 반응물을 피리딘 내에서 할로겐화벤조일과 반응시켜 벤조일기로 보호한 다음, 컬럼 크로마토그래피를 통해 알파와 베타 아노머로 분리하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 벤조일기로 보호된 알파와 베타 아노머 각각을 유기용매 내에서 하나의 박(Boc) 그룹으로 보호된 디아민 화합물과 70℃~80℃에서 반응시켜 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계; 및

(d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 생성물의 박(Boc) 그룹을 비보호화한 다음, 염기화하고, 형광염료를 함유하는 용액과 반응시킨 후, 생성물의 벤조일기를 비보호화하고, HPLC로 분리하여 얻어진 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 형광염료로 표지된 형광 글루코스 유사체를 수득하는 단계;를 포함하는 방법에 의해 합성될 수 있다.

이러한 형광 글루코스 유사체의 합성방법은 상기 화학식 1로 표시되는 알파 아노머와 상기 화학식 2로 표시되는 베타 아노머를 동시에 비대칭적으로 합성할 수 있는 방법이다.

상기 합성방법의 각 단계에 대하여 보다 자세히 설명하면 다음과 같다.

(a) 단계

: D-글루코스의 입체적 배치는 헤미 아세탈(hemiacetal) 고리인 피라노스(pyranose)로 인식되고 있다. 이에 1번 탄소(anomeric carbon)의 하이드록시기의 특이한 반응성에 따라, 2-브로모에탄올 (2-bromoethanol)은 산에 의해 촉매된 피셔 글리코실화반응에 의해 상기 아노머(anomeric) 위치에 2:1 비율의 알파와 베타 아노머로 위치 선택적으로 도입될 수 있다.

따라서, 먼저, 글루코스(D-glucose)를 이온교환수지와 함께 2-브로모에탄올에 용해시킨 후 50℃~70℃, 바람직하게는 60℃~70℃에서 환류시켜 상기 2-브로모에탄올을 알파와 베타 아노머 위치로 선택적으로 도입시킨다. 이때, 알파와 베타의 비율은 핵자기공명장치(NMR, Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy)를 이용해 얻을 수 있다 [F. Fazio, M. C. Bryan, O. Blixt, J. C. Paulson, C.-H. Wong, J. Am. Chem . Soc, 2002, 124, 14397-14402].

선택적으로, 상기에서 얻어진 반응 혼합물을 여과하여 이온교환수지를 제거한 다음, 진공조건 하에서 농축시키고, 컬럼 크로마토그래피에 의해 글리코실화된 화합물을 정제할 수 있다. 이 때, 상기 컬럼 크로마토그래피는 실리카-겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트: 메탄올 = 10:1~5:1)를 사용한다.

(b) 단계

: 이어서, 상기 (a) 단계에서 얻어진 반응물을 피리딘 내에서 할로겐화벤조일, 바람직하게는 염화벤조일과 반응시켜 벤조일기로 보호한 다음, 컬럼 크로마토그래피를 통해 알파와 베타 아노머로 분리한다. 이때, 알파 아노머와 베타 아노머는 2:1의 비율로 분리될 수 있다.

바람직하게는 상기 반응물을 벤조일기로 보호한 다음, 통상의 방법에 따라 알킬알콜(바람직하게는, 메틸알콜)을 첨가하여 켄치(quench)하고, 희석(바람직하게는 에틸 아세테이트 사용)시킨 후, 유기층을 세척 및 건조, 여과 및 감압 농축한 후 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 것이 좋다.

이때, 상기 컬럼 크로마토그래피로는 통상의 것을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 실리카-겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트: n-헥산 = 1:3)를 사용한다.

(c) 단계

: 이어서, 상기 (b) 단계에서 얻어진 벤조일기로 보호된 알파와 베타 아노머 각각을 유기용매 내에서 박(Boc) 그룹을 함유하는 화합물과 50℃~80℃, 바람직하게는 70℃~80℃에서 반응시킨 후 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.

이때, 상기 반응물을 정제하기 전에 얻어진 용액을 통상의 방법에 따라 희석(바람직하게는 증류수 사용), 추출(바람직하게는 에틸아세테이트 사용), 세척(바람직하게는 브라인(brine) 사용) 및 감압농축하는 것이 바람직하다.

상기 유기용매로는 통상의 유기용매를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 다이메틸포름아마이드(DMF) 또는 트라이에틸아민(TEA)이고, 상기 박(Boc) 그룹을 함유하는 화합물은 아민 연결기와 박(Boc) 그룹을 함유하는 것으로서, 바람직하게는 아민 연결기를 갖는 N-박-피페라진(N-Boc-Piperazine)이다. 그러나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 컬럼 크로마토그래피로는 통상의 크로마토그래피를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 실리카-겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:에틸아세테이트 및/또는 디클로로메탄:메탄올을, 순차적으로, 1:10 ~ 10:1의 비율로)를 사용한다.

(d) 단계

: 마지막으로, 상기 (c) 단계에서 얻어진 생성물의 박(Boc) 그룹을 비보호화한 후, 염기화하여 형광염료를 함유하는 용액과 반응시킨 후, 벤조일기를 비보호화하고, HPLC로 분리하여 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 형광염료로 표지된 형광 글루코스 유사체를 수득한다.

상기에서 박(Boc) 그룹의 비보호화는, 바람직하게는 벤조일기가 보호화된 화합물에 50% 트리플루오로아세트산(TFA)을 함유하는 디클로로메탄 용액을 첨가한 다음 N2 퍼징(purging)에 의해 농축시킴으로써 수행될 수 있다.

한편, 박 그룹의 비보호화에 사용되고 반응 혼합물에 남아있는 트리플루오로아세트산을 제거하기 위하여 염기화를 진행하는데, 이는 완전히 비보호화된 화합물이 녹아있는 디메틸포름아미드(DMF) 용액을 디이소프로필에틸아민(DIPEA)과 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 염기화 처리를 통해 일차 또는 이차 아민을 가진 키랄 글루코사이드가 얻어진다.

또한, 벤조일기의 비보호화의 경우, 바람직하게는 상기 글루코사이드 생성물이 녹아있는 메틸알콜(MeOH) 용액에 소듐 메톡사이드를 첨가하여 반응시킴으로써 수행될 수 있다.

본 발명에서 형광염료는 싸이3(Cy3), 싸이5(Cy5), 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(RITC), 알렉사(Alexa), 4,4,-다이플루오로-4-보로-3a,4a-다이아자-s-인다센(BODIPY), 텍사스 레드(Texas Red), 이광자 염료 등을 사용할 수 있다. 그 중에서도 광, 레이저 등 강한 세기의 광원에 대해서도 안정하고, 여러 생물 분석 시스템에서 광범위하게 쓰이고 있는 점에서 Cy3를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 형광염료를 함유하는 용액은, 바람직하게는, Cy3-COOH(Cy3-COOH) 및 반응 시약인 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드(EDC) 혹은 (7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스피늄 헥사플로로포스페이트 (PyAOP)를 함유하는 디메틸포름아미드(DMF) 용액이다. 그러나, 상기 예시된 형광염료 외에도 비오틴 등과 같은 유기 화합물 등을 용도에 따라 다양하게 사용할 수 있다. 여기서, 비오틴 자체는 형광을 띄지 않지만, 비오틴과의 결합정도가 높은 아비딘 혹은 스트렙트아비딘에 형광을 표지한 뒤에 글루코스 유사체에 존재하는 비오틴과 결합시켜 간접적으로 확인할 수 있다.

Cy3와 같은 형광염료는 상기 EDC에 의해 아미드 결합을 거쳐 글루코시드의 1번 탄소 위치에 표지되고, 이와 같이 표지된 형광 글루코스 유사체는 HPLC를 통해 분리되어, 최종적으로 본 발명의 형광염료로 표지된 형광 글루코스 유사체(알파 아노머)가 수득된다. 상기 최종 생성물은 핵자기 공명 장치를 이용한 ¹H, ¹³C 스펙트럼, 말디-토프(MALDI-TOF) 질량분석기와 고해상도질량분석기 등을 통해 정확하게 확인될 수 있다.

이와 같은 합성방법에 의해 얻어진 본 발명의 형광 글루코스 유사체는 D-글루코스의 유사체로 작용하여, 시간 및 용량 의존적인 방식으로 D-글루코스와 경쟁하며 세포 내에 흡수되는 반면, L-글루코스는 본 발명의 유사체의 흡수에 영향을 주지 않는다. 또한, 본 발명의 형광 글루코스 유사체는, 일반 세포에 비해 강화된 글루코스-대사를 갖는 세포, 예컨대 폐 흑색종 세포와 같은 암세포 내로의 유입율이 보다 높은 것으로 나타난다. 이는, 본 발명의 형광 글루코스 유사체가 글루코스-특이적 수송 시스템(예를 들면, GLUT4)에 의해 세포 내로 수송되는 것을 나타내는 것이며, 본 발명의 형광 글루코스 유사체가 글루코스 대사 모니터링 시 모니터링 수단으로 적용될 수 있음을 시사하는 것이다.

그 중에서도 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은, 공지되어 있는 하기 화학식 6 및 7의 화합물, 즉 형광염료인 NBD를 N-2-글리코실화시켜 표지한 화학식 6의 화합물인 2-NBDG 및 본 발명자들에 의한 한국등록특허 874761에 개시된 화학식 7의 화합물 [2-(N-Cy3-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-α-D-글루코스 (본원에서는 GB1-Cy3로도 기재되는 경우가 있음)에 비하여 글루코스 흡수 추적자로서 보다 우수한 성능을 나타낸다.

[화학식 6]

[화학식 7]

즉, 종래의 형광 글루코스 유사체인 2-NBDG는 5μM의 농도에서는 세포 내에 거의 흡수되지 않아 검출강도가 낮은 반면, 상기 화학식 3으로 표시되는 형광 글루코스 유사체는 5μM의 농도에서도 D-글루코스와 경쟁적으로 흡수되는 것으로 검출된다.

또한, 본 발명자들이 이전에 발표한 상기 화학식 7의 화합물, 즉 GB1-Cy3는 D-글루코스의 농도 변화, 예컨대 10 mM에서 55 mM로의 D-글루코스의 농도변화에도 세포 내로의 유입 정도의 변화가 미미한데 반해, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 글루코스 농도 변화에 따라 세포 내로의 유입 정도의 변화가 확연하여, 세포 내 글루코스 섭취를 보다 민감하게 모니터링할 수 있는 것으로 나타났다.

또한, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은, 3T3/L1 비만전구세포의 분화가 진행됨에 따라 유세포 분석에 따른 세포의 형광 강도가 증가하여, 3T3/L1 세포의 성숙 비만세포로의 분화를 성공적으로 모니터링할 수 있었다. 또한, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은, 3T3/L1 비만세포 및 C2C12 근육세포 모두에서 인슐린- 및 AICAR-자극된 조건 하에서 글루코스의 개선된 세포 섭취를 증명하였으며, 덱사메타존으로의 처리 하에서 글루코스의 세포 섭취가 효과적으로 감소되는 것을 증명하였다.

따라서 본 발명이 제공하는 형광 글루코스 유사체는 바이오 프로브로서 기능하여 분자 영상, 생분석, 신약 검색 등의 기술에 효과적으로 적용될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 형광 글루코스 유사체는 암 또는 종양의 영상화, 또는 글루코스 운반기(glucose transporters)와 연관된 세포 대사의 모니터링을 위한 분자 영상 방법에 사용될 수 있다. 이때, 상기 분자 영상 방법에 사용가능한 측정 장치로는 특별히 제한되는 것은 아니나, 공초점 주사 현미경(Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM), 형광 현미경 마이크로플레이트 리더(microplate reader), 하이 컨텐츠 스크리닝(High Content Screening, HCS) 장치 등을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 형광 글루코스 유사체는 바이오프로브로서 사용되어 형광 이용 세포 분류(Fluoroscence Activated Cell Sorting)법을 이용하는 글루코스 대사 관련 질병 치료제 및 예방제의 검색에 이용될 수 있다. 상기 형광 이용 세포 분류법에 사용가능한 측정 장치로는 특별히 제한되는 것은 아니나, BD 바이오 사이언스사의 FACSCalibur^TM와 같은 유세포 분석기 등을 이용할 수 있다. 이와 같은 유세포 분석기를 이용함으로써, 분자 영상 방법으로는 정확한 판단이 어려운 정량적 평가가 가능해질 수 있다.

종래의 형광 글루코스 유사체인 2-NBDG는 형광 이용 세포 분류법을 이용했을 때 11mM의 글루코스 배지와 글루코스 결핍 배지에서의 세포 유입 형광 세기 차이가 30%정도로 탐지되었다 [C. Zou, Y. Wang, Z. Shen, J. Biochem . Bioph . Meth . 2005, 64, 207-215]. 그에 반해 본 발명의 형광 글루코스 유사체는 11mM의 글루코스 배지에서의 세포 유입이 글루코스 결핍 배지에서의 세포 유입보다 약 60% 정도로 감소되는 것이 형광 세기 차이를 통해 관찰되었다. 따라서, 실질적인 세포 환경에서 글루코스 대사 관련 질병 치료제 및 예방 약물의 검색시 보다 민감한 프로브로서 작용할 수 있다.

또한, 세포 내 흡수를 위한 상기 유사체의 최적 농도는 1μM~100μM의 범위, 바람직하게는 1μM~20μM, 가장 바람직하게는 3μM~10μM에서 사용할 수 있으며, 세포 내 최대 흡수를 달성하기 위해 요구되는 인큐베이션(incubation) 시간은 40분 이하, 바람직하게는 20분 내지 35분의 범위일 수 있다.

한편 본 발명은 상기 형광 글루코스 유사체를 바이오 프로브로 사용하는 글루코스 대사 관련 질환의 치료 또는 예방용 약물의 검색방법을 제공한다. 위에서 언급한 바와 같이 글루코스 대사는 생명체의 가장 중요한 대사과정이며 이 과정에 문제가 생겼을 경우에 다양한 질환으로 나타나게 된다. 그러한 질환 중 하나로 암 또는 종양을 들 수 있으며, 본 발명의 형광 글루코스 유사체는 항암제를 검색하는 스크리닝 방법에 사용될 수 있다. 상기 항암제의 비제한적인 예로서, 바람직하게는 폐암, 위암, 간암 또는 대장암의 예방 또는 치료제를 들 수 있다. 보다 중요하게 본 발명의 형광 글루코스 유사체는 글루코스 대사에 직접적으로 관련이 있는 질환, 즉 글루코스 대사 및 세포내 흡수가 비효율적이기 때문에 생기는 질환인 당뇨병과, 글루코스 대사가 너무 활발해서 생기는 질환인 비만을 치료할 수 있는 효과적인 바이오 신약 검색을 위한 새로운 바이오 프로브로서 사용될 수 있는 높은 가능성이 있다. 본 발명에서는 상기 검색방법의 일례로써, 3T3/L1 지방세포 및 C2C12 근육세포 모두에 인슐린 및 AICAR를 각각 처리한 후 본 발명의 형광 글루코스 유사체를 프로브로 하여 세포 내 글루코스의 유입 증가를 분석하는 것을 기재하고 있어, 본 발명의 형광 글루코스 유사체를 당뇨병 치료제의 검색에 사용할 수 있음을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 형광 글루코스 유사체는 글루코스 대사 관련 생리활성 조절물질 및 신약 후보물질의 효능평가에 사용될 수 있으며, 새로운 약물 후보 물질을 검색하기 위해서도 사용될 수 있다.

이하 본 발명의 구성 및 작용을 실시예를 들어 설명하나, 이는 단지 예시를 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되지는 않는다.

참조예 1. 시약 및 실험기기

D-(+)-글루코스, 무수 아세트산 (acetic anhydride), 소듐 메톡사이드(0.5M solution in methanol), 염화 벤조일(benzoyl chloride), 피페라진, 디메틸포름아미드(DMF), 디클로로메탄(DCM), 디메틸술폭사이드(DMSO), 피리딘, 및 트라이플루오로아세트산(TFA)은 시그마-알드리치사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. N,N-디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, 및 2-브로모에탄올은 TCI(Japan)로부터 구입하였다. ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 기준물질(references)로 테트라메틸실란을 이용하는 Bruker DRX-300 MHz(Bruker Biospin, Germany) 및 Varian Inova-500 MHz(Varian Assoc., Palo Alto, USA) 기구 상에 기록되었다.

화학적 이동(chemical shift)은 내부 테트라메틸실란 표준의 ppm의 낮은 장(downfield) 범위를 측정하였다. 고안된 생성물은 Bruker Daltonicsⓡ(Germany)를 이용한 MALDI-TOF MS 및 LC-MS 분석으로 확인하였다. 최종 화합물은 고분해능 질량분석기(HRMS; high-resolution mass spectrometry)로 확인하였다. HRMS 분석은 서울대학교 기초과학 교육연구 공동기기원의 질량 분석기를 이용하여 수행되었다.

농도구배 역상 HPLC 분석은, 분석의 경우 유속 1.0 mL/min로 VP-ODS C-18 컬럼 (150×4.6 mm) 상에서, 프렙(preparation)의 경우 유속 10.0 mL/min로 PRC-ODS C-18 컬럼 (250×20 mm) 상에서, Shimadzu LC-6AD 펌프, SPD-10A 검출기(Shimadzu, Japan)를 이용하여 수행되었다. HPLC 용매는 0.1% TFA를 함유하는 탈이온수(용리액 A) 및 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴(용리액 B)로 구성하였다.

고 글루코스 DMEM, 저 글루코스 DMEM, 글루코스-고갈된 DMEM, RPMI1640, 글루코스-고갈된 RPMI1640, 우태아혈청(FBS), 말혈청, 열불활성화된 우혈청, 항생제-항진균제 용액은 GIBCO[Carlsbad, CA, USA]로부터 구입하였다. PBS 및 글루코스 용액은 Welgene Inc.[Seoul, South Korea]에서 구입하였다. 로시글리타존은 Alexis (USA)에서 구입하였다. AICAR(aminoimidazole carboxamide ribonucleotide)은 토론토 리서치 케미칼사(Canada)로부터 구입하였다. 현미경 커버 글래스는 Marlenfeld GmbH&Co., KG(Germany)로부터 구입하였다. 형광 현미경의 이미지는 Olympus IX71 형광 현미경(Japan)을 이용하여 수득하였다. 공초점 현미경(CLSM)의 이미지는 Carl Zeiss-LSM510 현미경을 이용하여 수득하였다. FACS 튜브는 BD Biociences(USA)로부터 구입하였다. 유세포 분석은 BD Biosciences의 FACSCalibur^TM으로 수행하였다.

참조예 2. 세포주 배양

NIH/3T3 (마우스 섬유아세포), A549 (인간 폐 흑색종 세포), 3T3/L1 (마우스 섬유아세포: 지방전구세포), 및 C2C12 (마우스 근육모세포 세포)는 ATCC(American Type Culture Collections, USA)로부터 구입하였다.

NIH/3T3 세포는 10%(v/v) 우태아혈청(FBS) 및 1%(v/v) 항생제-항진균제 용액이 보충된 DMEM 배지에서 유지하였다. A549 세포는 10% 우태아혈청 및 1% 항생제-항진균제 용액이 보충된 RPMI 1640 배지에서 유지하였다. 3T3/L1 마우스 섬유아세포는 10% 열불활성화된 우혈청 및 1% 항생제-항진균제 용액이 보충된 DMEM 배지에서 유지하였다. C2C12 세포는 10% FBS 및 1% 항생제-항진균제 용액이 보충된 DMEM 배지에서 유지하였다. 모든 세포주는 ATCC 배양 가이드 라인에 따라 5 X 10⁵ 내지 1 X 10⁶ cells/mL로 유지하였다.

참조예 3. 세포주 분화

지방전구세포(preadipocyte)를 성숙한 지방세포로 분화시키기 위하여, 3T3/L1 섬유아세포를 상기한 배양 프로토콜을 이용하여 배양하였다. 3T3/L1 섬유아세포가 100% 합류(confluency)에 도달하면, 배지를 10% FBS, 5 ㎍/mL 인슐린, 10 μM 로시글리타존(rosiglitazone) 및 1 μM 덱사메타손을 함유하는 DMEM으로 교체하여 성숙한 지방세포로의 분화를 유도하였다. 2일간 배양한 후, 이틀마다 배양배지를 FBS와 인슐린만을 함유하는 DMEM으로 교체하였다. 성숙한 지방세포로의 분화의 증거로서 세포가 지질 소적(lipid drop)을 생성하기 시작하면, 인슐린을 배양 배지로부터 제거하였다. 성숙한 지방세포는 8 내지 12일간의 분화에 의해 수득할 수 있고, 유세포 분석 및 형광 현미경에 의한 바이오이미징에 사용될 수 있다.

근육모세포를 성숙한 근육 세포로 분화시키기 위하여, C2C12 마우스 근육모세포를 10% FBS 및 1% 항생제-항진균제 용액이 보충된 DMEM 배지에서 유지하였다. 세포가 100% 합류에 도달하면, 이틀마다 배지를 2% 말혈청을 함유하는 DMEM으로 교체하였다. 유세포 분석을 위한 실험 및 유세포 분석은 3 내지 5일간의 분화 후 얻어진 세포를 이용하여 수행하였다.

참조예 4. 공초점 주사 현미경( CLSM ) 프로토콜

6×10⁴ 개의 C2C12 세포 및 3T3/L1 세포를 35mm 세포 배양 접시 내의 현미경 커버 글래스[Marlenfeld GmbH&Co., KG (Germany)]에서 배양 및 분화시켰다. 분화 세포 배양 배지를 제거하고, 5.5mM 글루코스가 포함되고 우태아혈청(FBS)이 결핍된 DMEM 배지를 첨가하여 4시간 동안 혈청 결핍 조건을 유지하였다. 그 후, 인슐린(100nM) 또는 AICAR(1mM)를 첨가하였다. 이때, 우태아혈청(FBS)이 결핍된 5.5mM 글루코스가 포함된 DMEM 배지 또는 우태아혈청 및 글루코스가 결핍된 DMEM 배지를 사용하였다. 세포를 37℃에서 30분 동안 배양한 뒤, 상기 유리 챔버 슬라이드를 배양 접시에서 꺼내 챔버 상에 적재하였다. 그 다음, 상기 챔버를 현미경에 부착하였다. 챔버는 온도를 37℃로 유지하였다. 챔버 내의 배지를 GB2-Cy3를 함유하는 글루코스-결핍 배지(glucose-depleted media)(DMEM, 無글루코스, GIBCO)로 교체하고, 매 7초마다 형광 이미지를 촬영하고, 디지털화하고, 추후 분석을 위하여 컴퓨터에 저장하였다.

참조예 5. 도립 형광 현미경 프로토콜

4×10⁴개의 NIH/3T3 세포, A549 세포, C2C12 세포 및 3T3/L1세포를 35mm 세포 배양 접시(BD Falcon^TM Cell Culture Dish; BD Bioscience, CA, USA)에서 현미경 커버 글래스 상에 배양하였다. 이틀 후, 세포 배양 배지를 제거하고, 0 mM, 11 mM 또는 55 mM D-글루코스로 보충된, 10 μM GB2-Cy3를 함유하는 글루코스-결핍 배지(glucose-depleted media)(DMEM, 無글루코스, GIBCO)로 교체하였다. 37℃에서 30분간 배양한 후, 35-mm 세포 배양 접시에서 커버 슬립 상의 세포를 차가운 PBS로 두번 씻고, 상기 커버 슬립을 형광 현미경(Olympus IX71)의 캐스터 상에 적재하였다. 형광 현미경으로 관찰하는 동안, 세포들은 37℃의 온도로 유지되는 챔버 내에 두었다. 35-50개 세포들의 형광 이미지를 CCD 카메라(Axiocam MRm, Germany)로 촬영한 후, 각 세포들의 형광 세기를 이미지 데이터 분석 프로그램인 Image-Pro^® Plus(MediaCybernetics, USA)으로 측정하였다. Image-Pro^® Plus를 이용하여, 위상대비 이미지 내의 세포를 함유하는 ROIs(Regions of interest)와 같은 영역을 그렸다. Image-Pro^® Plus는 CCD 카메라의 이미지들을 분석하여 본 발명자들이 결정한 ROIs 내의 형광 세기의 디지털화된 평균값을 알려주었다. 본 발명자들은 세포가 함유하는 형광 세기값을 얻기 위하여, 상기 형광 세기로부터 배경 세기(background intensity)를 서브트랙(subtract) 하였다. 상기의 방법을 이용하여, 형광 세기를 디지털화한 다음 다양한 실험을 수행하였다.

실시예 1. [2-(N- Cy3 - 피페라지노에틸 )]-α-D- 글루코스 ( GB2 - Cy3 )의 제조

[반응식 1]

a) 2-브로모에탄올, Dowex 50WX8-400 이온 교환 수지, 70℃ 환류; b) 염화벤조일, 피리딘, 디메틸아미노피리딘(DMAP); c) N-Boc-피페라진, 트리에틸아민, 디메틸포름아미드(DMF), 80℃; d)(i) 50% 트리플루오로아세트산(TFA), 디클로로메탄(DCM) (ii) Cy3-COOH, EDC (또는 PyAOP, PyBOP과 같은 커플링시약으로 대체 가능함), 디이소프로필에틸아민(DIPEA), 디메틸포름아미드(DMF) (iii) 소듐 메톡사이드(NaOMe), 메탄올

1-1. (2- 브로모에틸 )-2,3,4,6- 테트라 - O - 벤조일 -α-D- 글루코사이드(2)의 제조

: 글루코스(1g, 5.55mmol)를 Dowex 50WX8-400 이온교환수지와 함께 2-브로모에탄올(6 mL, 85 mmol)에 용해시켰다. 그 반응 혼합물을 70℃에서 하룻밤 동안 환류시킨 다음, 반응 완료물을 TLC[F. Fazio, M. C. Bryan, O. Blixt, J. C. Paulson, C.-H. Wong, J. Am . Chem . Soc , 2002 , 124, 14397-14402]로 모니터하였다. 이어서, 상기 반응 혼합물로부터 수지를 제거하기 위하여 여과를 한 다음, 진공조건에서 농축시켰다. 실리카-겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트: 메탄올 = 10:1 ~ 5:1)에 의해 글리코실화된 화합물을 정제한 후, 핵자기공명장치(NMR)에 의해 알파:베타 아노머가 2:1의 비율(총수율 74%)로 혼합되어 있는 목적 화합물이 수득되었음을 확인하였다. 상기 결과 얻어진 (2-브로모에틸)-D-글루코사이드(2.7g, 9.5mmol)의 자유 하이드록시기(free hydroxyl group)를 피리딘(60 mL) 내에서 0℃, 10분 동안 염화벤조일(8.8mL, 76mmol)을 적가하여 벤조일기로 보호한 다음, 디메틸아미노피리딘(DMAP)(116mg, 0.952mmol)의 존재 하에 상온에서 하룻밤 동안 교반하였다 [a) M. A. Maier, C. G. Yannopoulos, N. Mohamed, A. Roland, H. Fritz, V. Mohan, G. Just, M. Manoharan, Bioconjugate Chem . 2003 , 14, 1829; b) R. E. Campbell, M. E. Tanner, J. Org . Chem . 1999 , 64, 9487-9492]. 상기에서 얻어진 혼합물에 메탄올(10 mL)을 첨가하여 반응을 중단한(quench) 후, 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시켰다. 유기층을 1N 염산(HCl) 및 포화 탄산수소나트륨(NaHCO₃)으로 세척한 다음, 무수 황산마그네슘 (MgSO₄)를 이용하여 건조시켰다. 그런 다음, 유기층을 여과 및 감압 하에 농축하고, 얻고자 하는 각 아노머를 실리카-겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래프(에틸 아세테이트: n-헥산 = 1:3)에 의해 알파:베타 = 2:1 비율로 성공적으로 분리하여, 원하는 화합물 (2)를 수득하였다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ8.097.89 (m, 8H), 7.547.31 (m, 12H), 6.23 (t, J = 9.9 Hz, 1H), 5.70 (t, J = 9.9 Hz, 1H), 5.44 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 5.33 (dd, J = 10.1, 3.7 Hz, 1H), 4.644.56 (m, 2H), 4.48 (dd, J = 11.9, 5.1 Hz, 1H), 4.164.03 (m, 1H), 3.943.85 (m, 1H), 3.763.70 (m, 2H);

¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ166.20, 165.88, 165.78, 165.30, 133.48, 133.19, 129.98, 129.91, 129.76, 129.72, 129.63, 129.10, 128.93, 128.79, 128.45, 128.32, 96.31, 71.83, 70.30, 69.34, 68.92, 68.31, 62.95, 29.80; MALDI TOF MS calcd for C₃₆H₄₃O₁₂ [M+H]⁺: 703.11; found: 703.05.

1-2. [2-( N - boc - 피페라지노에틸 )]-2,3,4,6- 테트라 - O - 벤조일 -α-D- 글루코사이드(3)의 제조

: 상기에서 얻어진 (2) 화합물(230mg, 0.327 mmol)이 녹아있는 1mL의 무수DMF 용액에 N-Boc-피페라진 (183mg, 0.981mmol) 및 TEA(182μL, 1.308mmol)를 첨가하고, 그 반응 혼합물을 80℃에서 교반하였다. 상기 반응 완료물을 TLC에 의해 확인한 후, 그 결과 얻어진 용액을 증류수로 희석한 다음 에틸 아세테이트로 추출하였다. 모은 유기층을 브라인(brine)으로 세척하고, 감압 하에 농축시킨 다음, 실리카-겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(n-헥산 : 에틸아세테이트 = 1 : 1 → 디클로로메탄 : 메탄올 = 10 : 1)에 의해 정제하여 노란색 오일 형태로 원하는 화합물 (3)을 수득하였다(185 mg, 70%).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ8.05-7.86 (m, 8H), 7.57-7.28 (m, 12H), 6.18 (t, J = 10 Hz, 1H), 5.68 (t, J = 9.5 Hz, 1H), 5.43 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.29 (dd, J = 10.0, 3.5Hz, 1H), 4.63-4.59 (m, 1H), 4.49-4.45 (m, 2H), 3.89 (ddd, J = 11.0, 5.5, 5.0 Hz, 1H), 3.67 (ddd, J = 11.0, 6.0, 5.0 Hz, 1H), 3. 23 (bs, 4H), 2.65-2.58 (m, 2H), 2.35 (bs, 4H), 1.44 (s, 9H);

¹³C NMR (125 MHz , CDCl₃) δ166.62, 166.30, 166.16, 165.78, 155.11, 133.99, 133.92, 133.64, 130.33, 130.20, 130.16, 130.13, 129.62, 129.44, 129.34, 128.97, 128.90, 128.78, 96.38, 96.32, 80.01, 72.42, 70.88, 70.00, 68.73, 66.73, 63.51, 57.92, 53.87, 28.91; LC MS calcd for C₄₅H₄₉N₂O₁₂[M+H]⁺: 809; found : 809

1-3. [2-( N - Cy3 - 피페라지노에틸 )]-α-D- 글루코스(4)의 제조

: 상기에서 얻어진 (3) 화합물 (45mg, 0.056mmol)의 아민기에 존재하는 Boc 그룹의 비보호화를 위하여, 상기 잔류물에 50% TFA를 함유하는 디클로로메탄 용액을 첨가한 다음 질소 기류 하에서 농축시켰다. 그 결과 완전히 비보호화된 화합물이 녹아 있는 DMF(300μL) 용액을 DIPEA로 염기화한 후, 여기에 Cy3-COOH (17mg, 0.037mmol) 및 EDC(17mg, 0.112mmol) 또는 PyAOP (58mg, 0.112mmol)이 녹아있는 100μL DMF 용액을 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 상온에서 교반한 다음, 반응의 진행을 HPLC 분석에 의해 모니터하였다. 이어서 감압 하에 농축시킨 후, 벤조일기의 비보호 (debenzoylation)를 위해, 1mL의 메탄올 용액에 녹인 후, 소듐 메톡사이드(0.5 M in Metanol, 290μL, 0.145mmol)를 첨가하였다. 반응이 완료된 후, 상기 혼합물을 메탄올성 HCl(methanolic HCl)로 중화시키고, HPLC를 이용하여 생성물을 분취하였다. 이때, HPLC 분석을 위한 용출 프로토콜(elution protocol)은 다음과 같이 수행하였다: 95% 물, 5% 아세토나이트릴로 1분, 60% 물, 40% 아세토나이트릴로 4분간 선형 그레디언트(linear gradient), 50% 물, 50% 아세토나이트릴로 10분간 선형 그레디언트, 이어서 0% 물, 100% 아세토나이트릴로 5분간 선형 그레디언트, 다시 0% 물, 100% 아세토나이트릴로 10분, 마지막으로 95% 물, 5% 아세토나이트릴로 10분. 프렙용 HPLC(prep-HPLC)에 의해 정제하여, 원하는 화합물 (4)(22mg, 85%)을 수득하였다(분석 체류시간: 12분).

¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) δ8.55 (t, J = 13.5 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.47-7.30 (m, 6H), 6.45 (dd, J = 13.4, 9.0 Hz, 2H), 4.20-4.17 (m, 2H), 4.08-4.05 (m, 1H), 3.83-3.80 (m, 3H), 3.67 (s, 3H) 3.63-3.42 (m, 12H), 2.57-2.54 (m, 2H), 1.97-1.79 (m, 6H), 1.78 (s, 6H), 1.77 (s, 6H);

¹³C NMR (125 MHz, CD₃OD) δ175.56, 174.86, 172.06, 151.01, 142.88, 142.20, 141.03, 140.90, 128.80, 125.64, 125.58, 122.35, 122.21, 111.28, 111.11, 102.60, 102.51, 99.20, 73.71, 73.32, 71.96, 70.35, 61.46, 60.82, 56.16, 55.35, 49.48, 49.45, 43.87, 38.37, 31.68, 30.57, 27.14, 26.98, 26.98, 26.90, 21.91; HRMS (FAB⁺): calcd for C₄₁H₅₇N₄O₇ [M]⁺: 717.4227; found: 717.4235.

한편, 상기 화합물 (4)의 ¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터를 각각 도 1 및 2에 나타내었다.

실시예 2. GB5 - Cy3 의 제조

[반응식 2]

a) 2-브로모에탄올, Dowex 50WX8-400 이온 교환 수지, 70℃ 환류; b) 염화벤조일, 피리딘, 디메틸아미노피리딘(DMAP); e) N-Boc-시클로헥산-1,4-디아민, 트리에틸아민, 디메틸포름아미드(DMF), 80℃; d)(i) 50% 트리플루오로아세트산(TFA), 디클로로메탄(DCM) (ii) Cy3-COOH, EDC, 디이소프로필에틸아민(DIPEA), 디메틸포름아미드(DMF) (iii) 소듐 메톡사이드(NaOMe), 메탄올

2-1. (2- 브로모에틸 )-2,3,4,6- 테트라 - O - 벤조일 -α-D- 글루코사이드(2)의 제조

: (2) 화합물은 상기 실시예 1-1과 동일하게 수행하여 제조하였다.

2-2. [2-( N - boc -시클로헥산-1,4- 디아미노에틸 )]-2,3,4,6- 테트라 - O - 벤조일 -α-D-글 루코사이드(5 )의 제조

: 상기에서 얻어진 (2) 화합물(75mg, 0.107 mmol)이 녹아있는 1mL의 무수DMF 용액에 N-Boc-시클로헥산-1,4-디아민(69mg, 0.322mmol) 및 TEA(60μL, 0.428mmol)를 첨가하고, 그 반응 혼합물을 80℃에서 교반하였다. 상기 반응 완료물을 TLC에 의해 확인한 후, 그 결과 얻어진 용액을 증류수로 희석한 다음 에틸 아세테이트로 추출하였다. 모은 유기층을 브라인(brine)으로 세척하고, 감압 하에 농축시킨 다음, 실리카-겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(n-헥산 : 에틸아세테이트 = 1 : 1 → 디클로로메탄 : 메탄올 = 10 : 1)에 의해 정제하여 노란색 오일 형태로 원하는 화합물 (5)을 수득하였다(45 mg, 50%).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ8.10-7.87 (m, 8H), 7.57-7.28 (m, 12H), 6.19 (dd, J = 10.0, 10.0 Hz, 1H), 5.69 (dd, J = 10.0, 9.5 Hz, 1H), 5.38 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.30 (dd, J = 10.0, 3.5Hz, 1H), 4.61-4.59 (m, 1H), 4.99-4.43 (m , 2H), 3.95-3.93 (m, 1H), 3.62-3.59 (m, 1H), 2.87-2.78 (m, 2H), 2.33-2.31 (m, 1H), 2.03-2.02 (m, 2H), 1.96-1.87 (m, 2H), 1.73-1.68 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.30-1.21(m, 3H), 1.05-0.96 (m, 3H); LC/MS calcd for C₄₇H₅₃N₂O₁₂ [M+H]⁺: 837; found: 837.

2-3. [2-( N - Cy3 -시클로헥산-1,4- 디아미노에틸 )]-α-D- 글루코스(6)의 제조

: 상기에서 얻어진 화합물 (5)를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1-3과 동일하게 수행하여 화합물(6)을 수득하였다 (수득량: 3mg, 수율: 16%).

¹H NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 8.58 (t, J = 13.4 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.51-7.44 (m, 2H), 7.40-7.31 (m, 4H), 6.47 (dd, J = 13.4, 2.0 Hz, 2H), 4.22-4.17 (m, 2H), 4.05-4.01 (m, 1H), 3.88-3.83 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.71-3.50 (m, 7H), 3.28-3.21 (m, 2H), 2.32-2.27 (m, 2H), 2.21-2.20 (m, 2H), 2.05-2.01 (m, 3H), 1.97-1.79 (m, 14H), 1.58-1.31 (m, 6H); HRMS (FAB⁺): calcd for C₄₃H₆₁N₄O₇ [M]⁺: 745.4540; found: 745.4545.

한편, 상기 화합물 (6)의 ¹H NMR 데이터를 도 3에 나타내었다.

실시예 3. GB6 - Cy3 의 제조

[반응식 3]

a) 2-브로모에탄올, Dowex 50WX8-400 이온 교환 수지, 70℃ 환류; b) 염화벤조일, 피리딘, DMAP; g) 4-Boc-아미노벤질아민, 트리에틸아민, DMF, 80℃; d)(i) 50% TFA, DCM (ii) Cy3-COOH, EDC, DIPEA, DMF (iii) NaOMe, 메탄올

3-1. (2- 브로모에틸 )-2,3,4,6- 테트라 - O - 벤조일 -α-D- 글루코사이드(2)의 제조

: (2) 화합물은 상기 실시예 1-1과 동일하게 수행하여 제조하였다.

3-2. [2-(4- Boc - 아미노벤질아미노에틸 )]-2,3,4,6- 테트라 - O - 벤조일 -α-D- 글루코사이드(7)의 제조

: 상기에서 얻어진 (2) 화합물(50mg, 0.072 mmol)이 녹아있는 1mL의 무수 DMF 용액에 4-Boc-아미노벤질아민 (48mg, 0.216mmol) 및 TEA(40μL, 0.288mmol)를 첨가하고, 그 반응 혼합물을 80℃에서 교반하였다. 상기 반응 완료물을 TLC에 의해 확인한 후, 그 결과 얻어진 용액을 증류수로 희석한 다음 에틸 아세테이트로 추출하였다. 모은 유기층을 브라인(brine)으로 세척하고, 감압 하에 농축시킨 다음, 실리카-겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(n-헥산 : 에틸아세테이트 = 1 : 1 → 디클로로메탄 : 메탄올 = 10 : 1)에 의해 정제하여 노란색 오일 형태로 원하는 화합물 (7)을 수득하였다(30 mg, 56%).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ8.05-7.86 (m, 8H), 7.56-7.28 (m, 12H), 7.03-7.01 (m, 2H), 6.59-6.57(m, 2H), 6.19 (dd, J = 10.0, 10.0 Hz, 1H), 5.69 (dd, J = 10.5, 10.0 Hz, 1H), 5.39-5.32 (m, 2H), 4.58 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.48-4.43 (m, 2H), 3.97-3.95 (m, 1H), 3.65-3.63 (m, 3H), 2.92-2.82 (m, 2H);

¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 167.77, 166.42, 166.08, 165.96, 165.50, 133.91, 133.65, 133.36, 130.52, 130.26, 130.13, 130.08, 129.98, 129.94, 129.89, 129.63, 129.36, 129.13, 129.11, 128.72, 128.66, 115.38, 96.49, 72.12, 70.72, 69.68, 68.12, 63.14, 53.07, 47.76; LC/MS calcd for C₄₃H₄₀N₂O₁₀ [M+H]⁺: 745; found: 745.

3-3. [2-(4- Cy3 - 아미노벤질아미노에틸 )]-α-D- 글루코스(8)의 제조

: 상기에서 얻어진 화합물 (7)를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1-3과 동일하게 수행하여 화합물(8)을 수득하였다 (수득량: 6 mg, 수율: 35%).

¹H NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 8.58 (t, J = 13.4 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.47-7.28 (m, 10H), 6.48-6.43 (m, 2H), 4.80-4.67 (m, 3H), 4.20-4.17 (m, 2H), 3.96-3.92 (m, 1H), 3.83-3.76 (m, 2H), 3.71-3.67 (m, 4H), 3.65-3.54 (m, 5H), 3.48-3.43 (m, 3H), 2.73-2.70 (m, 1H), 1.93-1.77 (m, 2H), 1.77 (bs, 12H); HRMS (FAB+): calcd for C₄₄H₅₇N₄O₇ [M]+: 753.4227; found: 753.4209.

한편, 상기 화합물 (8)의 ¹H NMR 데이터를 도 4에 나타내었다.

상기 실시예에서 합성된 형광 글루코스 유사체 중 대표로서 실시예 1의 형광 글루코스 유사체를 사용하여 이하의 실험예를 수행하였으며, 이로써 세포 내 글루코스 흡수 분석을 위한 바이오프로브로서의 유용성을 평가하였다.

실험예 1. 글루코스의 세포 내 유입 모니터링

본 발명의 형광 글루코스 유사체가 세포 내 글루코스 유입에 대한 바이오프로브로서 효과적으로 작용하는지 여부를 알아보기 위해, 본 발명의 형광 글루코스 유사체의 세포 내 흡수 시 통상적인 글루코스 유입 루트의 사용에 따른 생체 내 글루코스와의 경쟁이 일어나는지 여부 및 그 흡수 효율을 측정하였다.

1-1. 유세포 분석

상기 실시예 1에서 합성한 최종 생산물 [2-(N-Cy3-피페라지노에틸)]-α-D-글루코스 (이하, GB2-Cy3로 칭함)의 NIH/3T3 세포 내 흡수율을, 형광 이용 세포 분류법(FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting)-기반 유세포 분석(Flow Cytometric Analysis)을 이용하여, 통상적으로 사용되는 형광 글루코스 프로브인 2-NBDG 및 본 발명자들에 의한 한국등록특허 874761의 [2-(N-Cy3-3,6-다이옥사옥탄-1,8-다이아미노에틸)]-α-D-글루코스 (이하, GB1-Cy3로 칭함)의 NIH/3T3 세포 내 흡수율과 비교하였다.

NIH/3T3 세포를 10cm 배양접시에서 수확하여 3 X 10⁵ 세포를 각 FACS 튜브(5mL, BD) 로 옮겼다. 상기 세포를 차가운 PBS로 한 번 씻은 후 11 mM D-글루코스를 함유하는 PBS 및 글루코스 무함유 PBS에서 상기 바이오프로브[GB2-Cy3(5μM), 2-NBDG(5μM 또는 50μM) 또는 GB1-Cy3(5μM)]와 함께 37℃에서 30분간 배양하였다. 바이오프로브를 처리하지 않은 세포를 음성대조군으로 하였다. 차가운 PBS로 씻은 후, 1 X 10⁴ NIH/3T3 세포를 FACSCalibur^TM(FACS-기반 유세포 분석기)로 분석하였다. GBs-Cy3가 FL2 채널에 의해 검출되었다. 1 X 10⁴ 세포의 미가공 데이터(raw data)는 히스토그램으로 나타내었고, 그 평균값은 그래프로 변환하여 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, NIH/3T3 세포는 11 mM D-글루코스의 존재 또는 부재 하에 5μM의 3가지 글루코스 프로브(GB1-Cy3, GB2-Cy3, 및 2-NBDG)로 각각 처리하였다. 유세포분석 히스토그램 플롯으로부터 수득된 수치는 2-NBDG가 D-글루코스와 세포 섭취에 대해 경쟁하지 않았으며, 또한 2-NBDG의 형광 강도가 기저치에서 일정하게 잔류함을 나타내었다. 2-NBDG의 형광 강도는 GBs-Cy3의 농도(5 μM) 보다 10배 더 높은 2-NBDG의 농도(50 μM)를 이용함으로써 본 발명자들의 GBs-Cy3 프로브의 형광 강도에 비교될 수 있었다. 글루코스-결핍된 조건 하의 GB1-Cy3, GB2-Cy3 (5 μM) 및 2-NBDG (50 μM)의 세포 섭취에 상응하는 평균 형광 강도는 히스토그램으로부터 수득되었으며 100으로 노멀라이즈(normalize)하여 도 5(c)에 나타내었다; 11 mM D-글루코스의 경쟁 효과에 의한 2-NBDG의 세포 섭취에서의 감소는 단지 30%인 것으로 인지되었다. 그러나, GB2-Cy3의 세포 섭취는 약 60%의 격렬한 감소를 나타내었으며, 이는 본 발명자에 의한 GB1-Cy3의 세포 섭취 감소분 (약 50%)보다도 뛰어난 것이다(도 7(c)참조). 따라서, 본 발명자의 GB2-Cy3의 민감도는 일반적으로 통용되는 2-NBDG의 민감도에 비해 10배 이상 높은 것이다.

이를 통해 본 발명의 글루코스 프로브인 GB2-Cy3는, 기존의 2-NBDG에 비해 더 적은 농도를 사용했을 때도 D-글루코스에 의해 경쟁적으로 저해되는 정도가 뚜렷하게 관찰되었으며, 낮은 농도의 사용에도 높은 형광 강도를 나타내므로, 글루코스-흡수 시스템을 통한 글루코스의 세포 유입을 관찰하는데 매우 효과적인 프로브라고 할 수 있다.

1-2. 형광 이미징 분석

NIH/3T3 세포 및 A549 세포를 35mm 세포 배양 접시에서 현미경 커버 글래스 상에 배양하여 참조예 5와 같은 프로토콜에 따라 형광 이미징 분석을 수행하여 형광을 관찰하고 형광이미지를 촬영하여 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, D-글루코스 농도 의존적으로 GB2-Cy3의 세포유입율이 낮아진 것을 알 수 있었다. 또한, 강화된 글루코스-대사를 갖는 폐 흑색종 세포주 A549에서의 GB2-Cy3의 세포유입율이 높은 것 또한 알 수 있었다 (도 6(b) 참조). 이는 본 발명의 GB2-Cy3의 세포 내 유입이, D-글루코스의 유입 통로를 이용하며 D-글루코스와 경쟁하여 이루어짐을 나타내는 것으로, 본 발명의 형광 글루코스 유사체가 글루코스-흡수 시스템을 통한 글루코스의 세포 유입을 관찰하는데 매우 효과적인 프로브임을 나타낸다.

또한, 폐 흑색종 세포주 A549를 사용하고, 형광 글루코스 유사체로는 12.5 μM GB1-Cy3 및 GB2-Cy3를 사용하는 것을 제외하고는, 상기와 동일하게 하여 형광 이미징 분석을 수행하여 형광을 관찰하고 형광이미지를 촬영하여 도 7 내지 도 9에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, GB1-Cy3 및 GB2-Cy3를 각각 처리한 두 세포군 모두 D-글루코스 농도 의존적으로 상기 글루코스 유도체들의 세포유입율이 낮아졌으나, GB2-Cy3를 처리한 세포에서의 형광 강도가 훨씬 높은 것을 시각적으로도 확인할 수 있었으며, 도 8에 나타난 바와 같이, GB2-Cy3를 처리한 세포에서의 형광 강도를 100으로 환산했을 때 GB1-Cy3를 처리한 세포에서의 형광 강도는 단지 4 정도인 것으로 나타났다. 또한, 도 9에 나타난 바와 같이, GB1-Cy3는 D-글루코스의 농도 변화, 즉 10 mM에서 55 mM로의 D-글루코스의 농도변화에도 ROIs의 형광 강도의 변화가 미미한데 반해 (약 5%), GB2-Cy3는 D-글루코스의 농도 변화에 따라 ROIs의 형광 강도의 변화가 확연하여(약 27%), 본 발명의 형광 글루코스 유사체인 GB2-Cy3는 A549의 글루코스 섭취를 보다 민감하게 모니터링할 수 있는 것으로 나타났다.

따라서, 본 발명의 글루코스 프로브인 GB2-Cy3는, 본 발명자들에 의해 이전에 발표된 글루코스 프로브인 GB1-Cy3에 비해, 글루코스-흡수 시스템을 통한 글루코스의 세포 유입, 특히 글루코스의 암세포 내 유입을 모니터링하는데 더욱 민감하고 효과적인 프로브라고 할 수 있다.

실험예 2. 지방전구세포 분화 모니터링

일반적으로, 비만전구세포의 비만세포로의 완전한 분화를 위해 세포는 글루코스 흡수를 증가시킨다. 본 실험예에서는, 본 발명의 형광 글루코스 유사체가 비만세포 내 글루코스 유입에 대한 바이오프로브로서 작용하여 분화를 효과적으로 모니터링하는지 여부를 알아보기 위해, 본 발명의 형광 글루코스 유사체의 세포 내 흡수 효율을 측정하였다.

지방전구세포인 3T3/L1 세포(분화 0일째)로부터 50% 초과된 분화가 진행된 성숙한 지방세포(분화 8일째)까지의 세포내 글루코스 흡수에서의 변화는, GB2-Cy3를 이용한 FACS-기반 유세포 분석에 의해 측정되었다. 분화 과정은 참조예 3에 기재한 바와 같이 수행하였다. 1 X 10⁴ 개의 세포를 유세포 분석기의 FL2 채널에서 분석하였다. 분화가 진행됨에 따라, FL2 채널에 의해 검출된 형광 강도는 증가되었고, 이는 형광 글루코스 유사체인 GB2-Cy3에 의해 모니터된 글루코스의 세포내 흡수가 개선되었음을 확인시켜준다 (도 10 참조). 상기와 같이, 본 발명의 GB2-Cy3는, 3T3/L1 세포의 성숙 비만세포로의 분화를 성공적으로 모니터링할 수 있었다.

실험예 3. 세포 내 글루코스 섭취의 인슐린-의존적 개선 모니터링

본 발명의 형광 글루코스 유사체가 세포 내 글루코스 유입에 대한 바이오프로브로서 효과적으로 작용하는지 여부를 알아보기 위해, 본 발명의 형광 글루코스 유사체의 세포 내 흡수 시 글루코스와의 경쟁이 일어나는지 여부 및 흡수 효율을 측정하였다.

본 발명자들은 C2C12 세포를 분화시키고 또한 인슐린 자극시키기 위한 이하 논문에 보고된 방법를 이용하여 C2C12 근육 세포 상에서 인슐린 반응 테스트와 조합하여 D-글루코스의 경쟁적 억제 효과를 시험하였다 [G. Portier, A. Benders, A. Oosterhof, J. Veerkamp, T. van Kuppevelt, In Vitro Cell . Dev . Biol .- Animal 1999, 35, 219-227; C. Wilson, Y. Mitsumoto, F. Maher, A. Klip, FEBS Lett . 1995, 368, 19-22].

인슐린-자극 이전에, 세포는 저 글루코오스 DMEM을 이용하여 혈청기아상태로 24시간 동안 배양하고, 인슐린(170 nM)으로 30분간 배양하였다. 결과 세포를 11 mM D-글루코오스의 존재/부재 하에 5 μM GB2-Cy3를 넣고 15분간 배양하였다. 상기 세포들을 차가운 PBS로 씻은 후 수합하여 FACSCalibur^TM으로 분석하였다. GB2-Cy3를 FL2 채널에 의해 검출한 후, 그 평균값을 구하였다. 형광 강도는 직접 비교를 위해 D-글루코스 및 인슐린 없이 배양된 C2C12 세포로 노멀라이즈하여 도 11(b)에 나타내었다.

인슐린 처리에 의한 글루코스 섭취의 증가는 도 11(b)에 나타낸 바와 같이 C2C12 세포 내 GB2-Cy3의 경쟁적 세포 섭취에서의 변화로서 관찰되었다. GLUTs의 여러 서브타입 중, GLUT4는 이들 세포 내에서 인슐린 반응을 초래하고, 이의 세포내 구획으로부터 원형질막으로의 이동은 인슐린 자극에 의해 주로 제어된다. 대조적으로, GLUT1은 인슐린 자극의 부재에도 세포질막 상에 구조적으로 발현되고, 이는 비만세포 및 근유세포뿐만 아니라 다른 많은 세포 유형의 세포질 내에 기저 수준의 글루코스 농도를 유지한다.

D-글루코스(GB2-Cy3의 경쟁적 억제자)의 농도의 증가 및 인슐린 처리에 응하는 C2C12 근육세포에 의한 GB2-Cy3의 개선된 세포내 흡수의 관찰에 의해 GB2-Cy3의 GLUT4-특이적 섭취를 확인하였다.

실험예 4. 세포 내 글루코스 섭취의 인슐린- 비의존적 개선 모니터링

또한, 본 발명자들은 GB2-Cy3가 세포 내에서 글루코스 섭취의 인슐린-비의존적 개선을 모니터하는데에 사용될 수 있는지 평가하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 인슐린-비의존적 메커니즘을 연구하기 위해 AMPK(AMP-activated kinase)의 소분자 활성제(small-molecule activator)를 선택하였다. AMPK는 ATP/AMP 비율을 모니터링함으로써 세포질 내 ATP 농도를 조절한다. 만약 ATP/AMP 비율이 교란되면, AMPK는 Thr172에서 인산화된다; 이 인산화는 GLUT4의 원형질막으로의 이동을 경유한 ATP 생산을 위해 세포 글루코스 섭취를 증가시킬 수 있다. 따라서, AMPK는 당뇨병 치료를 위한 잠재적 표적으로서 작용하고, AMPK의 소분자 활성제는 당뇨 치료제의 개발을 위해 연구되어왔다. GB2-Cy3-기반 유세포 분석의 시스템 검증을 위해, 본 발명자들은 인슐린-비의존성 방식에서 글루코스 섭취를 향상시키는 AMPK의 소분자 활성제로서 5-아미노이미다졸-4-카르복스아미드 리보뉴클레오시드(AICAR)를 선택하였다. AICAR는 AMP의 합성 유사체로서 알려져 있으며 또한 실제로 ATP/AMP 비율을 변화시키지 않고 세포 AMP를 흉내냄으로써 AMPK를 활성화시킬 수 있다. 덱사메타존은 비만세포 및 근육세포 내에서 GLUT4의 이동을 억제하는 것으로도 알려져 있으며, 1mM 덱사메타존으로 3T3/L1 비만세포를 24시간 동안 인큐베이션하면 기저 수준에서 및 인슐린-자극된 조건 하 모두에서 2-디옥시글루코스(2-DG)의 세포 섭취의 50% 감소를 유발하는 것으로 보고되어 있다. 덱사메타존은 2-mM AICAR에 의해 인슐린-비의존적 자극 하에서 2-DG의 세포 섭취를 억제하는 것도 보고되어 있다.

따라서, 본 발명자들은 인슐린 및 AICAR의 존재 하에 글루코스의 개선된 세포 섭취 또는 덱사메타존(1 μM)의 존재하에 글루코스의 감소된 세포 섭취를 모니터하는데 GB2-Cy3가 사용될 수 있는지를 테스트하였다. 3T3/L1 지방세포 및 C2C12 섬유아세포를 24-웰 플레이트에서 배양하였다. 상기 세포들은 합류에 도달한 후, 100% 분화가 시작되었다. 분화가 충분히 진행되면, 상기 세포들을 저(low) 글루코스(5.5mM) DMEM으로 혈청기아처리(serum-starved) 하였으며, 1μM 덱사메타손을 첨가하였다. 37℃에서 24시간 후, 170 nM 인슐린 또는 1 mM AICAR을 첨가하고, 1시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 10 μM(3T3/L1 세포) 또는 5 μM(C2C12 세포) GB2-Cy3를 첨가하고, 11 mM D-글루코스를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 15분간 배양하였다. 상기 세포들을 차가운 PBS로 씻은 후 수합하였다. 2 X 10⁵ (3T3/L1) 또는 1 X 10⁵ (C2C12) 세포를 FACSCalibur^TM 및 공초점 주사 현미경으로 분석하였다. GB2-Cy3를 FL2 채널에 의해 검출한 후, 그 평균값을 구하여 도 12에 나타내었으며, 공초점 주사 현미경 이미지를 도 13에 나타내었다.

도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 형광 바이오프로브로서 GB2-Cy3의 사용은 3T3/L1 비만세포 및 C2C12 근육세포 모두에서 인슐린- 및 AICAR-자극된 조건 하에서 개선된 세포 섭취를 명확하게 증명하였다; 덱사메타존으로의 처리는 모든 경우에서, 즉, 기저 수준에서, 또한 인슐린- 및 AICAR-자극된 조건 하에서 GB2-Cy3에 의해 증명된 바와 같이 글루코스의 세포 섭취를 효과적으로 감소시켰다.

상기 실험예의 FACS-기반 유세포 분석 및 형광 현미경 분석의 결과를 통해, 본 발명의 형광 글루코스 유사체 GB2-Cy3는 기존의 글루코스 유사체 2-NBDG 및 본 발명자가 이전에 발표한 형광 글루코스 유사체 GB1-Cy3보다 나은 효과를 가지는 GLUT-특이적 글루코스 유사체로서 확인되었다. GB2-Cy3는 다양한 세포주, 특히 암세포, 비만세포 및 근육세포 등과 같은 세포 시스템에서 유세포 분석에 의해 확인된 바와 같은 글루코스의 세포 섭취를 모니터하기 위해 성공적으로 사용되었다. 또한 소분자-유도된 글루코스 섭취의 세포 개선/감소가 유세포 히스토그램으로 나타난 바와 같이 GB2-Cy3의 경쟁적 세포 섭취를 기반으로 모니터될 수 있음을 증명하였다. 상기 결과는, 본 발명의 GB2-Cy3는 생체활성 소분자의 발견을 위한 하이 컨텐츠 스크리닝에도 적용할 수 있음을 명백히 시사하는 것이다.

Claims (13)

1. 하기 화학식 1 또는 하기 화학식 2로 표시되는 형광 글루코스 유사체:
   [화학식 1]
   

   

   
   [화학식 2]
   

   

   
   상기 식들에서,
   R₁은 -(CH₂)_n-A- 또는 -(CH₂)_n-NH-(CH₂)_x1-B-(CH₂)_x2-NH-이고, 여기에서 A는 1개 이상의 질소원자, 산소원자 또는 황원자를 헤테로 원자로 포함하는 C2-C20의 헤테로시클로알킬렌 또는 C2-C20의 헤테로아릴렌이고, B는 C3-C20의 시클로알킬렌 또는 C6-C20의 아릴렌이고, n은 1 내지 10의 정수이고, x1 및 x2는 0 내지 10의 정수이고, x1 및 x2는 각각 서로 같거나 다를 수 있으며,
   R₂는 형광염료 또는 비오틴이고,
   Y는 O 또는 S이다.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 R₁은 -(CH₂)_n-A-이고, 여기서 A는 1개 이상의 질소원자 또는 산소원자를 헤테로 원자로 포함하는 C2-C20의 헤테로시클로알킬렌인 것을 특징으로 하는, 형광 글루코스 유사체.
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 R₁은

   

   이고, 여기에서 n, m₁ 및 m₂는 각각 1 내지 10의 정수이며, m₁ 및 m₂는 각각 서로 같거나 다를 수 있는 것을 특징으로 하는, 형광 글루코스 유사체.
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 R₁은 -(CH₂)_x1-NH-(CH₂)_x2-B-NH-이고, 여기에서 B는 C3-C20의 시클로알킬렌 또는 C6-C20의 아릴렌이며, x1 및 x2는 0 내지 10의 정수이고, x1 및 x2는 각각 서로 같거나 다를 수 있는 것을 특징으로 하는, 형광 글루코스 유사체.
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 형광염료는 싸이3(Cy3), 싸이5(Cy5), 플루오레세인 아이소티오시안산염(FITC), 테트라메틸로다민 아이소티오시안산염(RITC), 알렉사(Alexa), 4,4,-다이플루오로-4-보로-3a,4a-다이아자-s-인다센(BODIPY), 텍사스 레드(Texas Red) 또는 이광자 염료(two-photon dye)인 2-아세틸-6-다이메틸아미노나프탈렌 (2-acetyl-6-dimethylaminonaphthalene, Acedan)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는, 형광 글루코스 유사체.
6. 청구항 1에 있어서,
   상기 형광 글루코스 유사체는 하기 화학식 3 내지 5로 표시되는 것을 특징으로 하는, 형광 글루코스 유사체:
   [화학식 3]
   

   

   
   [화학식 4]
   

   

   
   [화학식 5]
   

   
7. 청구항 1의 형광 글루코스 유사체를 바이오프로브로 사용하는 것을 특징으로 하는 분자 영상 (molecular imaging) 방법.
8. 청구항 7에 있어서,
   상기 분자 영상 방법은 측정 장치로 공초점 주사 현미경(Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM), 형광 현미경, 마이크로플레이트 리더(microplate reader) 또는 하이컨텐츠 스크리닝(High Content Screening) 장치를 이용하는 것을 특징으로 하는, 분자 영상 방법.
9. 청구항 7에 있어서,
   상기 분자 영상 방법은 암 또는 종양의 영상화, 또는 글루코스 운반기(glucose transporter, GLUT)와 연관된 세포 대사의 모니터링(monitoring)에 사용되는 것을 특징으로 하는, 분자 영상 방법.
10. 청구항 1의 형광 글루코스 유사체를 바이오프로브로 사용하는 것을 특징으로 하는 형광 이용 세포 분류(Flouorescence Activated Cell Sorting)법.
11. 청구항 1의 형광 글루코스 유사체를 바이오프로브로 사용하는 것을 특징으로 하는 글루코스 대사 관련 질환 치료 또는 예방용 약물의 검색 방법.
12. 청구항 11에 있어서,
    상기 약물은 항암제, 비만 예방 또는 치료용 약물, 또는 당뇨병 예방 또는 치료용 약물인 것을 특징으로 하는, 검색 방법.
13. 청구항 12에 있어서,
    상기 항암제는 폐암, 위암, 간암, 또는 대장암에 대한 것임을 특징으로 하는, 검색방법.

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